Title:
New procaspase 1 expression inhibitor, useful for preventing and/or treating inflammatory diseases, which are autoinflammatory diseases
Kind Code:
A1


Abstract:
Procaspase 1 expression inhibitor, is new. Independent claims are included for: (1) a small hairpin RNA (shRNA), which is processable to a small interfering RNA (siRNA); (2) a vector, which contains a nucleic acid sequence, which is encoded for the inhibitor or shRNA; (3) a host cell comprising the inhibitor, shRNA and/or the vector; and (4) inhibiting the expression of the procaspase 1 comprising introducing the inhibitor into a cell, which contains an expressionable gene coded for the procaspase 1. ACTIVITY : Antiinflammatory. MECHANISM OF ACTION : Procaspase 1 expression inhibitor.



Inventors:
WINKLER STEFAN (DE)
ROESEN-WOLFF ANGELA (DE)
Application Number:
DE102011118024A
Publication Date:
02/07/2013
Filing Date:
08/01/2011
Assignee:
UNIV DRESDEN TECH (DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE10313636A1N/A2004-10-14



Foreign References:
200401320232004-07-08
201001359512010-06-03
201101770652011-07-21
WO2007064846A22007-06-07
200402592472004-12-23
200701119342007-05-17
WO2010097414A12010-09-02
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Vaishnaw et al. (2010, Silence (1) 14-26)
Attorney, Agent or Firm:
Habermann, Hruschka & Schnabel (München, DE)
Claims:
1. Inhibitor der Expression der Pro-Caspase 1.

2. Inhibitor nach Anspruch 1, der eine gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtete Nukleinsäure ist.

3. Inhibitor nach Anspruch 2, wobei die Nukleinsäure eine gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtete siRNA oder eine gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtete miRNA, pri- oder pre-miRNA oder ein gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtetes Antisense-Oligonukleotid ist.

4. Inhibitor nach Anspruch 3, wobei die siRNA und/oder die miRNA, pri- oder pre-miRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid Sequenz-spezifisch gegen den 3'-untranslatierten Bereich, die CARD-Domäne oder die p20-Domäne der Pro-Caspase 1-mRNA gerichtet ist/sind.

5. Inhibitor nach Anspruch 4, wobei die Zielsequenz der sRNA einer der folgenden Sequenzen entspricht:

6. Inhibitor nach Anspruch 3, wobei die sRNA und/oder die miRNA, pri- oder pre-miRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid Sequenz-spezifisch gegen einen Bereich der mRNA einer mutierten Pro-Caspase 1 gerichtet ist, der die Mutation enthält.

7. Inhibitor nach Anspruch 6, der gegen eine mRNA gerichtet ist, die für eine mutierte Pro-Caspase 1 codiert, die aus der Gruppe, bestehend aus den Mutanten R221C, R2400, N263S, L265S, T2671, K319R und A329T, ausgewählt ist.

8. Inhibitor nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Zielsequenz der siRNA einer der folgenden Sequenzen entspricht:

9. shRNA, welche zu einer siRNA nach einem der Ansprüche 3 bis 8 prozessierbar ist.

10. Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für einen Nukleinsäure-Inhibitor nach einem der Ansprüche 2 bis 8 oder eine shRNA nach Anspruch 9 codiert.

11. Vektor nach Anspruch 10, der die Expression eines Nukleinsäure-Inhibitors nach einem der Ansprüche 2 bis 8 oder einer shRNA nach Anspruch 9 vermittelt.

12. Wirtszelle, enthaltend einen Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder eine shRNA nach Anspruch 9 und/oder einen Vektor nach Anspruch 10 oder 11.

13. Verfahren zur Inhibition der Expression der Pro-Caspase 1, umfassend den Schritt der Einbringung des Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in eine Zelle, die ein expressionsfähiges, für die Pro-Caspase 1 codierendes Gen enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zelle eine humane Zelle ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Zelle mit einem Vektor nach Anspruch 10 oder 11 transfiziert wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Vektor die Expression einer shRNA nach Anspruch 9 vermittelt.

17. Verwendung eines Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder einer shRNA nach Anspruch 9 und/oder eines Vektors nach Anspruch 10 oder 11 als Medikament.

18. Verwendung eines Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder einer shRNA nach Anspruch 9 und/oder eines Vektors nach Anspruch 10 oder 11 zur Prävention und/oder Therapie einer inflammatorischen Erkrankung.

19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die inflammatorische Erkrankung autoinflammatorisch ist.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder eine shRNA nach Anspruch 9 und/oder einen Vektor nach Anspruch 10 oder 11 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Inhibitor der Expression der Pro-Caspase 1 sowie ein Verfahren zur Inhibition der Expression der Pro-Caspase 1. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die medizinische Verwendung des Inhibitors zur Prävention und/oder Therapie einer inflammatorischen Erkrankung. Zudem stellt die vorliegende Erfindung eine shRNA, also eine Varläuferform eines Nukleinsäure-Inhibitors der Pro-Caspase 1, einen Vektor, der die Expression eines Nukleinsäure-Inhibitors der Pro-Caspase 1 oder der genannten shRNA vermittelt, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den Nukleinsäure-Inhibitor der Pro-Caspase 1 und/oder die genannte shRNA und/oder den beschriebenen Vektor zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, bereit.

Autoinflammatorische Krankheiten werden durch eine Deregulation des angeborenen Immunsystems verursacht. Im Gegensatz zur Autoimmunität sind hierbei keinerlei Autoantikörper oder autoreaktive T-Zellen vorhanden (Masters et al. (2006) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. (6) 428–433). Bei erblichen Fiebersyndromen treten die Fieberschübe häufig grundlos auf, werden aber manchmal auch durch banale Infektionen, Veränderungen des Hormonspiegels, körperliche Belastung oder aber Emotionen ausgelöst. Wiederkehrendes Fieber wird häufig begleitet von Symptomen wie Abdominalschmerzen, Gelenkschmerzen und -entzündungen, sowie Muskelschmerzen und verschiedenen, für die jeweilige Erkrankung spezifischen Anzeichen. Die Unterschiede in den Auswirkungen sind bei verschiedenen Individuen, auch wenn sie dieselben Mutationen aufweisen, sehr groß, sogar innerhalb einer Familie. Fieber kann dabei unregelmäßig, selten oder auch niemals auftreten, trotz Anwesenheit anderer schwerer Entzündungssymptome (Kallinich et al. (2006) Ann. Rheum. Dis. (65) 958–960, Touitou et al. (2007) Arthritis Rheum. (56) 1706–1712). Die Amyloidose, eine Ablagerung von fibrillärem Protein (Amyloid), die eine eingeschränkte Funktionsfähigkeit oder auch den Funktionsverlust des betroffenen Organs zur Folge haben kann, ist eine der möglichen Komplikationen dieser Erkrankungen.

Die Caspase 1 (Interleukin-1 converting enzyme, ICE) ist ein proinflammatorisches Enzym, das im Rahmen inflammatorischer Zustände und bei periodischen Fiebersyndromen eine zentrale Rolle einnimmt. Die klassische inflammatorische Reaktion wird dabei durch die enzymatische Aktivierung von Interleukin-1β(IL-1β) und Interleukin-18(IL-18) vermittelt. Um die volle enzymatische Funktion zu erlangen, muss die als Zymogen exprimierte Caspase 1 durch Autoproteolyse in die aktive Form überführt werden. Diese besteht aus einem Heterotetramer aus zwei p10- und zwei p20-Einheiten. Jeweils ein p10/p20-Dimer bildet direkte Bindungen, Wasserstoffbrückenbindungen sowie hydrophobe Wechselwirkungen zu seinem Nachbarmolekül aus.

Die bisherigen Untersuchungen fokussierten im Wesentlichen auf die enzymatische Aktivität der Caspase 1. Allerdings gibt es Hinweise, dass auch die Pro-Caspase 1 eine wichtige regulatorische Funktion während der Inflammation hat. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur die mature Caspase 1, sondern auch die Pro-Caspase 1 mit RIP 2 (Receptor-interacting serine/threonine-Protein kinase 2) interagiert (Sarkar et al. (2006) J. Immunol. (176) 4979–4986). Durch eine RIP 2-abhängige Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB und der Signaltransduktion über MAPK p38 wird schließlich eine proinflammatorische Antwort ausgelöst. Offensichtlich ist die NFκB-Aktivierung allerdings unabhängig von der enzymatischen Aktivität der Caspase 1 (Lamkanfi et al. (2004) J Biol. Chem. (279) 24785–24793).

Bislang zielten therapeutische Ansätze im Rahmen inflammatorischer Erkrankungen auf eine Hemmung der Caspase 1-Enzymaktivität mittels chemischer Inhibitoren und konsekutiv verminderter Prozessierung von IL-1β und IL-18 ab. Dabei wird jedoch die oben beschriebene Aktivierung von NFκB nicht beeinflusst.

Die US 2007/0111934 A1 beschreibt ein Verfahren und ein Mittel zur Inhibition der Oligomerisierung der Pro-Caspase 1, ein Verfahren und ein Mittel zur Inhibition der Aktivierung der Pro-Caspase 1, ein Verfahren und ein Mittel zur Inhibition der Produktion der Caspase 1, und ein Verfahren sowie ein Mittel zur Prävention und/oder Therapie von inflammatorischen Erkrankungen. Der dabei zu Grunde liegende Mechanismus ist jeweils die Inhibition der Bindung von NOD2 an die Pro-Caspase 1. Die Menge der vorhandenen Pro-Caspase 1 wird dabei nicht beeinflusst.

Die DE 10313636 A1 betrifft die Verwendung zumindest eines Caspase-Inhibitors, insbesondere eines Caspase 3-Inhibitors, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer viralen Infektion, insbesondere einer Infektion mit einem RNA-Negativstrang-Virus, vorzugsweise einer Influenza-Infektion, sowie ein Testsystem zur Identifizierung geeigneter Wirkstoffe. Die in dieser Druckschrift wiedergegebenen Lehren beziehen sich jedoch spezifisch auf eine Inhibition der Caspase 3.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues System zur Hemmung proinflammatorischer Prozesse bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen Inhibitor der Expression der Pro-Caspase 1 bereit. Durch diesen Inhibitor wird spezifisch die Transkription des Pro-Caspase 1-Gens und/oder die Translation der Pro Caspase 1-mRNA gehemmt.

Überraschenderweise konnte durch Forschungsarbeiten im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass eine CARD-CARD Caspase activation and recruitment domain)-vermittelte Interaktion zwischen der Pro-Caspase 1 und RIP 2 die Aktivierung von NFκB verursacht (siehe Beispiel 1). Dieser Effekt wird durch eine Hemmung der Enzymaktivität der Caspase 1 sogar verstärkt. Beispielsweise wird die NFκB-Aktivierung durch Zugabe des Caspase 1-Inhibitors zYVAD-fmk deutlich erhöht.

Weiterhin konnte durch diese Forschungsarbeiten gezeigt werden, dass mutierte Formen der Caspase 1, bei denen aufgrund von Punktmutationen einzelne Aminosäuren ausgetauscht wurden, eine im Vergleich zum Wildtyp reduzierte enzymatische Aktivität aufweisen und gleichzeitig eine signifikant erhöhte Ausschüttung von NFκB zur Folge haben. Es konnte erfindungsgemäß gezeigt werden, dass innerhalb einer Gruppe von Patienten, die unter regelmäßig auftretenden Fieberschüben und Anthralgie leiden, die Anzahl an Missense-Mutationen im Caspase 1-Gen erhöht ist. Der Großteil der Patienten mit mutierter Caspase 1 ist heterozygot in Bezug auf die entsprechende Mutation.

Darüber hinaus scheint die Caspase 1 offensichtlich an atypischer Proteinsekretion beteiligt zu sein. In diesem Zusammenhang haben sich erfindungsgemäß Hinwiese dafür ergeben, dass die Caspase 1 unabhängig von ihrer enzymatischen Aktivität an der Sekretion von IL-1β, aber auch von IL-1α beteiligt ist. Zudem ist anzunehmen, dass auch eine enzymatisch inaktive Caspase 1 als Gerüstprotein innerhalb des Inflammasoms fungieren könnte und somit auch ohne enzymatische Aktivität eine pro-inflammatorische Wirkung entfaltet. Deshalb ist erfindungsgemäß das Angriffsziel eines geeigneten Therapieansatzes nicht die Aktivität der Caspase-1, sondern die Menge an vorhandenem Caspase 1- bzw. Pro-Caspase-1-Protein, unabhängig von deren enzymatischer Aktivität.

Somit birgt die vorliegende Erfindung einen wichtigen Vorteil im Vergleich zur im Stand der Technik beschriebenen Hemmung der Caspase 1-Enzymaktivität mittels chemischer Inhibitoren. Die im Stand der Technik bekannten Methoden führen nicht zu einer Reduktion der Proteinmenge der Pro-Caspase 1 bzw. Caspase 1 und können deshalb die von der Pro-Caspase 1 vermittelte NFκB-Aktivierung bzw. die unabhängig von ihrer enzymatischen Aktivität vorhandene pro-inflammatorische Wirkung der Pro-Caspase 1 bzw. Caspase 1 nicht beeinflussen. Im Gegenteil resultiert die reduzierte Enzymaktivität der Caspase 1 in einer verminderten Autoproteolyse, wodurch die Proteinmenge der Pro-Caspase 1 erhöht und die von ihr vermittelte Inflammationsantwort verstärkt wird.

Ein geeigneter Inhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise eine gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtete Nukleinsäure. Derartige Nukleinsäuren binden üblicherweise Sequenz-spezifisch an eine für die Pro-Caspase 1 codierende mRNA und führen ggf. zu deren Abbau und/oder verhindern in anderer Weise eine effiziente Translation der mRNA in das Protein.

Bevorzugt ist diese Nukleinsäure eine gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtete siRNA oder eine gegen die Pro-Caspase 1 gerichtete miRNA, pri- oder pre-miRNA oder ein gegen die Pro-Caspase 1-mRNA gerichtetes Antisense-Oligonukleotid.

siRNAs (short interfering RNAs) sind kurze Ribonukleinsäure-Moleküle, die zur RNA-Interferenz (RNAi) führen. Der Begriff RNA-Interferenz wurde geprägt durch die Entdeckung, dass die Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) bei dem Nematoden C. elegans zur spezifischen Abschattung von Genen führt, wobei die Gen-Sequenzen große Homologien zur Sequenz der eingebrachten RNA aufweisen (Fire et al. (1998) Nature (6669) 806–811). Schließlich wurde auch die erfolgreiche Anwendung der RNA-Interferenz in humanen Zellen demonstriert (Eibashir et al. (2001) Nature (411) 494–498). Die durch dsRNA-Moleküle vermittelte RNA-Interferenz ist als Technik zur gezielten Abschattung von Genen sowohl in vitro als auch in vivo inzwischen gut etabliert (Kim et al. (2007) Nat. Rev. Gen. (8) 173–184 und darin zitierte Referenzen). Die siRNAs sind dabei gegen komplementäre RNAs gerichtet und führen durch Spaltung und Abbau der RNA zur post-transkriptionellen Abschaltung der Ziel-Gene, auch bekannt als „post-transcriptional gene silencing” (PTGS).

miRNAs (micro RNAs) sind nicht-codierende doppelsträngige Ribonukleinsäuren mit einer Länge Von ca. 10 bis 30 Nukleotiden und gehören zu den am häufigsten vorkommenden kleinen RNA-Molekülen in Tieren. Sie sind an der Genregulation beteiligt, auch sie lösen RNA-Interferenz aus. Die für miRNAs codierenden Sequenzen befinden sich an verschiedenen Stellen des Genoms. Die Transkription dieser Sequenzen durch die RNA-Polymerase II, seltener durch die RNA-Polymerase III liefert ein primäres Transkript, eine so genannte pri-miRNA, mit 5'-Cap und Poly-A-Schwanz. Die Prozessierung dieses Primärtranskripts durch eine nukleare RNAse III (Drosha) führt zur so genannten pre-miRNA, einer Haarnadelstruktur mit ca. 60 bis 80 Nukleotiden, die ins Cytoplasma exportiert und dort weiter prozessiert wird, wobei eine doppelsträngige Spezies aus dem Stamm der Haarnadelstruktur durch eine cytoplasmatische, Doppelstrang-spezifische RNase III (Dicer) ausgeschnitten wird. In weiteren Schritten binden die entstandenen RNA-Moleküle entweder an den 3'-untranslatierten Bereich der mRNA der zu regulierenden Gene und bewirken so eine Translations-Repression oder sie werden in den RISC-Komplex eingebaut und lösen Letztendlich eine Abschaltung der entsprechenden Gene über den siRNA-Pathway (siehe oben) aus. Demgemäß könnte eine Inhibition der Pro-Caspase 1 im Sinne der vorliegenden Erfindung auch durch ein miRNA-Molekül bewerkstelligt werden. Die Mechanismen der Genregulation durch miRNAs sind dem Fachmann bekannt und können ausführlich der Publikation Felekkis et al. (2010, Hippokratia (14,4) 236–240) entnommen werden. miRNAs sind in verschiedenen Tierzellen zu finden, werden inzwischen aber auch synthetisch hergestellt und könnten zur Genregulation in Zellen mit Hilfe von RNA-Interferenz benutzt werden.

Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird somit durch einen siRNA- oder miRNA-Ansatz ein Knock-Down der Pro-Caspase 1 auf mRNA-Ebene erzeugt. Dies führt zur verminderten Expression von Pro-Caspase 1 und maturer Caspase 1. Somit kann zusätzlich zur bislang angewandten Hemmung der enzymatischen Aktivität der Caspase 1 nun auch die von der Pro-Caspase 1 ausgehende proinflammatorische Wirkung ausgeschaltet oder mindestens herabgesetzt werden.

Die für die Auslösung von RNA-Interferenz verantwortlichen dsRNA-Moleküle enthalten einen Strang, der der Nukleotid-Sequenz der Ziel-RNA entspricht (d. h. der mRNA der Pro-Caspase 1). Dieser Strang wird als „Sense”- oder auch „Passenger”-Strang bezeichnet. Der zweite Strang ist in seiner Sequenz revers und komplementär zum „Sense”- oder „Passenger”-Strang sowie zur Ziel-RNA. Dieser Strang wird „Antisense”- oder „Guide”-Strang genannt und bildet mit dem „Sense”- oder „Passenger”-Strang ein Duplex-Molekül. Während der post-transkriptionellen Abschaltung von Genen mit Hilfe von siRNA-Molekülen wird nur der „Antisense”- oder „Guide”-Strang in den so genannten RISC-Komplex geladen. (Wird der „Passenger”-Strang in den RISC-Komplex geladen, wird die Ziel-RNA nicht erkannt, und es findet keine RNA-Interferenz statt) Die ersten zehn Nukleotide am 5'-Ende des „Guide”-Strangs enthalten die so genannte „Seed”-Region, die als zentrale Region für die Erkennung der mRNA im RISC-Komplex gilt. Deshalb sollte die Sequenz innerhalb der „Seed”-Region des „Guide”-Strangs im besten Fall zu 100% der Sequenz der Ziel-RNA, hier also einem entsprechenden Sequenzanteil der Pro-Caspase 1-mRNA, entsprechen.

Zumindest eine Vorauswahl geeigneter siRNA-Zielsequenzen der Pro-Caspase-1-mRNA bzw. von siRNA-Doppelsträngen, die gegen die Pro-Caspase-1-mRNA gerichtet sind, lässt sich durch im Stand der Technik bekannte Algorithmen wie bspw. dem Whitehead Institute siRNA Selection Web Server (http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA; vgl. Yuan et al. (2004) Nucl. Acids Res. 32, Web Server Ausgabe, W130–W134) treffen.

Im Stand der Technik sind unterschiedliche siRNA-Ausführungsformen beschrieben worden. So beschreibt die US 2004/259247 A1 die RNA-Interferenz mit Hilfe von dsRNA, wobei die Moleküle eine Länge von 19–23 Nukleotiden aufweisen und mindestens einer der Stränge am 3'-Ende einen Überhang von 1–5 Nukleotiden hat. Selbstverständlich können siRNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung das in der US 2004/259247 A1 beschriebene Design aufweisen. Besonders bevorzugte siRNA-Spezies der vorliegenden Erfindung mit einer wie in der US 2004/259247 A1 beschriebenen Ausgestaltung weisen an einem oder beiden Strängen an dem 3'-Ende einen Überhang von ein oder zwei U-, mehr bevorzugt ein oder zwei T-Nukleotiden auf.

In einer anderen Ausführungsform können siRNAs der vorliegenden Erfindung gemäß WO 2010/0997414 ausgestaltet sein. Diese beschreibt dsRNA-Moleküle mit einer Länge von 10 bis 26 Nukleotiden und zusätzlich 3 bis 10 G/C-Hasenpaaren am 5'-Ende des Sense- und am 3'-Ende des Antisense-Strangs. Zudem können derartige dsRNA-Moleküle einen 3'-Überhang von 1 bis 5 Nukleotiden am Sense-Strang aufweisen.

Die dsRNA-Moleküle zur Inhibition der Pro-Caspase 1-Expression gemäß der vorliegenden Erfindung können demgemäß eine gesamte Länge von beispielsweise 19–30 Nukleotiden, bevorzugt von 21–25 Nukleotiden haben.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorläuferform der oben dargestellten siRNA, eine entsprechende shRNA (short hairpin RNA). Die für die shRNA codierende Sequenz wird üblicherweise in einen Expressionsvektor kloniert, um nach Einbringen des Vektors in die Zelle so die Expression der shRNA, deren nachfolgende Prozessierung zur siRNA und dadurch die RNA-Interferenz auszulösen. Der bevorzugte Aufbau der üblicherweise ca. 50–60 Nukleotide langen shRNA ist dabei wie folgt: eine Nukleotidsequenz mit einer Länge von 19–29 Nukleotiden, entsprechend der Sequenz des Ziel-Gens, gefolgt von einer so genannten „Spacer-Region von 4–15 Nukleotiden und einer Sequenz, die revers und komplementär zur ersten Sequenz ist. Bei dieser Ausführungsform kann die für die shRNA codierende Sequenz zunächst beispielsweise über einen lentiviralen Vektor als DNA-Molekül in das Genom der Zelle integriert werden. Wird diese lineare Matrize durch die RNA-Polymerase III transkribiert, kommt es aufgrund der intramolekularen Komplementarität des Moleküls zur spontanen Ausbildung einer Haarnadel-Struktur, sodass sich Sense- und Antisense-Strang aneinanderlagern. Nach Export der shRNA aus dem Nukleus wird diese im Cytoplasma durch das Protein Dicer erkannt und prozessiert, sodass ein reifes siRNA-Molekül, ein Duplexmolekül mit einer Länge von 21–23 Nukleotiden und 2–3 Nukleotiden Überhang am 3'-Ende der jeweiligen Stränge, entsteht. Die oben angegebene erste Sequenz stellt dabei den Sense-Strang, die letzte den Antisense-Strang der siRNA dar. Die hier dargestellten Vorgänge sind dem Fachmann bekannt und des Weiteren beispielsweise in Sliva et al. (2010, Vir. J. (7) 248–258) und Paddison et al. (2002, Genes Dev. (16) 948–958) wiedergegeben. Die Möglichkeit, RNA-Interferenz, wie hier beschrieben, mit Hilfe von shRNA in einem lentiviralen Expressionsvektor auszulösen, birgt den Vorteil der stabilen Integration der shRNA im Genom der transduzierten Zelle, und somit einer permanenten Expression der siRNA, wodurch eine kontinuierliche Suppression des Ziel-Gens über einen längeren Zeitraum erreicht werden kann.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Nukleinsäure-Inhibitior wie beispielsweise die siRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid gegen alle Isoformen der Pro-Caspase 1 gerichtet. Hierzu sind die siRNA und/oder die miRNA und/oder die pri-miRNA und/oder die pre-miRNA und/oder die shRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid beispielsweise Sequenzspezifisch gegen den 3'-untranslatierten Bereich der Pro-Caspase 1-mRNA gerichtet.

In weiteren Ausführungsformen können die siRNA und/oder die miRNA und/oder die pri-miRNA und/oder die pre-miRNA und/oder die shRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid gegen die CARD-Domäne oder die p20-Domäne der Pro-Caspase 1-mRNA gerichtet sein.

In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die sRNA und/oder die miRNA und/oder die pri-miRNA und/oder die pre-miRNA und/oder die shRNA und/oder das Antisense-Oligonukleotid in einem Bereich der Pro-Caspase 1-mRNA binden, in dem sich beispielsweise bei Patienten mit autoinflammatorischen Krankheiten häufig Punktmutationen befinden. Besonders bevorzugt sind dabei die folgenden Mutationen der Caspase 1 (es wird der 1-Buchstabencode für Aminosäuren verwendet; der erste Buchstabe bezeichnet die Aminosäure im Wildtyp, die Zahl die Aminosäureposition in der Sequenz der Pro-Caspase-1 und der zweite Buchstabe die Aminosäure in der Mutante): R221 C, R240Q, N263S, L265S, T267I, K319R, A329T. Diesen Mutationen auf Proteinebene entsprechen auf mRNA-Ebene folgende Mutationen in der Zielsequenz für den erfindungsgemäßen Inhibitor: C661T, G719A, A788G, T149C, C900T, A956G bzw. G958A (die Ziffern beziehen sich auf die Konsensuscodierungssequenz (d. h. Start- bis Stopp-Codon) innerhalb der mRNA; vgl. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/CcdsBrowse.cgi?REQU EST=CCDS&GO=MainBrowse&DATA=CCDS8330.1). Dabei ist es besonders bevorzugt, dass sich die der Punktmutation entsprechende Sequenz im Bereich der Seed-Region des Guide-Strangs befindet, um eine im Vergleich zur Wildtyp-mRNA (also der nicht-mutierten Form) effizientere Bindung des Inhibitors an die mRNA von mutierten Pro-Caspase 1-Varianten und somit deren Degradation zu ermöglichen.

Der Vorteil dieser Ausführungsform liegt darin, dass dadurch gezielt die Expression der mutierten Caspase 1 bzw. Pro-Caspase 1 inhibiert wird, während die Expression der Wildtyp-Caspase 1 bzw. der Wildtyp-Pro-Caspase 1 weniger stark unterdrückt wird. Somit ist es – bei Patienten mit autoinflammatorischen Krankheiten, die heterozygot in Bezug auf die entsprechende Punktmutation sind – möglich, eine potentiell durch einen Caspase 1-Knock-Down vermittelte Immunsuppression zu verhindern und dennoch die durch die mutierte Pro-Caspase 1 bzw. mutierte Caspase 1 vermittelte proinflammatorische Anwort herabzuregulieren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entspricht die Zielsequenz der bevorzugten Nukleinsäure-Inhibitoren, insbesondere der siRNA einer der folgenden Sequenzen:

In dieser Darstellung sind die mutierten Codons der mRNA der (Pro-)Caspase 1-Varianten fett gedruckt.

Besonders bevorzugt sind die folgenden siRNAs: In dieser Darstellung sind in der oberen Zeile jeweils die Sequenzen der Sense-(= Passenger-) Stränge angegeben. Die entsprechenden, in der zweiten Zeile dargestellten, Antisense-(= Guide-) Stränge können schließlich an die mRNA binden und die RNA-Interferenz induzieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die obigen siRNAs gemäß der Erfindung am 3'-Ende mindestens eines Stranges (d. h., des Passenger- und/oder des Guide-Stranges) einen Überhang, beispielsweise aus 1, 2 oder 3 Nukleotiden aufweisen, z. B. Überhange aus Ribonukleotiden, beispielsweise U-Überhänge. Weiterhin bevorzugt sind Überhänge aus Desoxyribonukleotiden, beispielsweise T-Überhänge.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen weisen die obigen erfindungsgemäßen siRNAs mindestens 3 GC-Paare am 5'-Ende des Passenger-Stranges und am 3'-Ende des Guide-Stranges auf, wie in der WO 2010097414 (A1) dargestellt.

Die Stabilität von RNA-Molekülen gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen erhöht werden:
Falls vorhanden, kann der 3'-Überhang am Passenger-Strang einer erfindungsgemäßen siRNA durch die Auswahl eines Purin-Nukleotids, insbesondere eines Adenosin- oder Guanin-Nukleotids an dieser Stelle erhöht werden. Alternativ kann ein Pyrimidin-Nukleotid am 3'-Überhang durch ein modifiziertes Analogon ersetzt werden, im Fall von Uridin z. B. durch 2'-Deoxythymidin.

Zudem kann das RNA-Molekül mindestens ein modifiziertes Nukleotid-Analogon enthalten, insbesondere innerhalb der Region, die die dsRNA ausbildet.

Die chemische Modifikation der Nukleotid-Analoga kann an den Ribose-, Phosphatund/oder Basen-Resten erfolgen. Zur Produktion von Molekülen mit erhöhter Stabilität, insbesondere im Bezug auf RNA-abbauende Enzyme, sind Modifikationen am Rückgrat, also an den Ribose- und/oder Phosphat-Resten bevorzugt.

Bevorzugte Beispiele der Ribonukleotide mit modifizierten Ribose-Resten sind Analoga, bei denen die 2'-OH-Gruppe durch eine der folgenden Gruppen ersetzt wird: H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 oder CN, wobei R ein C1-C6-Alkyl, -Alkenyl oder -Alkylyl und halo F, Cl, Br oder I ist. Für den Fachmann steht es außer Frage, dass der Begriff „modifizierte Ribonukleotide” hier auch 2'-Deoxyderivate enthält, die in einigen Fällen auch als „Deoxynukleotide” bezeichnet werden. Diese 2'-O-modifizierten Analoga wie z. B. 2'-Methyl-Analoga können auch in der Seed-Region enthalten sein, beispielsweise an Position 2 des Guide-Strangs (vom 5'-Ende aus), um so genannte „off target”-, also unspezifische Effekte zu minimieren.

Wie bereits erwähnt, können modifizierte Ribonukleotide auch Analoga mit chemischen Modifikationen des Basen-Restes sein. Beispiele derartiger Analoga wären 5-Aminaallyl-Uridin, 6-Aza-Uridin, 8-Aza-Adenosin, 5-Bromo-Uridin, 7-Deaza-Adenosin, 7-Deaza-Guanin, N6-Methyl-Adenosin, 5-Methyl-Cytidin, Pseudo-Uridin und 4-Thio-Uridin. Dabei ist die Auswahl der möglichen Analoga nicht auf die hier angegebenen Bespiele begrenzt.

Beispiele für Rückgrat-modifizierte Ribonukleotide, bei denen die Phosphoester-Gruppe zwischen benachbarten Ribonukleotiden modifiziert ist, wären Phosphothioat-Gruppen.

Durch die vorliegende Erfindung wird außerdem ein Vektor bereitgestellt, der für einen Nukleinsäure-Inhibitor der Pro-Caspase 1 gemäß den obigen Darstellungen oder für die oben beschriebene shRNA codiert. In bevorzugten Ausführungsformen vermittelt der Vektor die Expression des Nukleinsäure-Inhibitors und/oder der shRNA. Zur Herstellung eines derartigen Vektors eignet sich beispielsweise der pLKO.1 TRC Cloning Vector der Firma addgene.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, die einen Nukleinsäure-Inhibitor der Pro-Caspase 1 und/oder eine shRNA und/oder einen Vektor, jeweils gemäß den Darstellungen dieser Beschreibung, enthält. Mögliche Wirtszellen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Wirtszellen, die zur Propagierung von Vektoren benutzt werden, die für einen Nukleinsäure-Inhibitor und/oder eine shRNA codieren, sind bevorzugt prokaryotische Zellen, besonders bevorzugt Bakterien, wie z. B. Escherichia coli-Zellen. Wirtszellen, die Vektoren enthalten, die die Expression des Nukleinsäure-Inhibitors oder der shRNA vermitteln, sind bevorzugt eukaryotische Zellen, noch mehr bevorzugt Säugetier-Zellen, besonders bevorzugt humane Zellen.

Weiterhin beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Inhibition der Expression der Pro-Caspase 1, bei dem mindestens ein erfindungsgemäßer Inhibitor in eine Zelle eingebracht wird, die ein expressionsfähiges, für die Pro-Caspase 1 codierendes Gen enthält. Vorzugsweise wird der Inhibitor in eine humane Zelle eingebracht.

Eine Möglichkeit zur Einbringung des Inhibitors in die Zelle stellt beispielsweise die Infektion der Zelle mit einem viralen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung dar, auch als virale Transduktion bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein lentiviraler Transfer vorgenommen. Weitere Vektoren der vorliegenden Erfindung sind Retroviren, Adeno- und Adeno-assoziierte Viren, Baculoviren und replizierende Viren. Alternative Einbringungsmethoden wären Elektroporation der Zelle oder die Transfektion mit Hilfe von Liposomen oder synthetischen, kationischen Polymer-Nanopartikeln als Trägersubstanz oder nach der Bindung des Inhibitors an eine hydrophobe Gruppe wie Cholesterol. Diese und weitere Einbringungsmöglichkeiten genetischer Vehikel oder allgemein von Nukleinsäuren in Zellen sind einem Fachmann bekannt und können der neuesten Ausgabe von Asubel et al. (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA entnommen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Zelle mit einem Vektor transfiziert, der die Expression eines erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Inhibitors der Pro-Caspase 1 oder, besonders bevorzugt, der erfindungsgemäßen shRNA vermittelt. Die verwendete Expressionskassette enthält vorzugsweise eine Antibiotika-Resistenz, besonders bevorzugt eine Puromycin-Resistenz, sodass positive Zellen durch Zugabe von Puromycin selektioniert werden können.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung des Nukleinsäure-Inhibitors und/oder der shRNA und/oder des Vektors und/oder der Wirtszelle, jeweils entsprechend den obigen Ausführungen, als Medikament bereit, wobei dieses bevorzugt zur Prävention und/oder Therapie einer inflammatorischen, besonders bevorzugt einer autoinflammatorischen Erkrankung eingesetzt wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen Inhibitor und/oder eine erfindungsgemäße shRNA und/oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält. Mögliche pharmazeutisch verträgliche Träger sind beispielsweise Wasser oder eine isotonische Kochsalzlösung. Diese und weitere Trägersubstanzen sowie andere üblicherweise in pharmazeutischen Formulierungen verwendete Hilfs- und Zusatzstoffe sind dem Fachmann bekannt und können z. B. der neuesten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA, USA) entnommen werden.

Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, vorzugsweise einer inflammatorischen, besonders bevorzugt einer autoinflammatorischen Erkrankung, bereit, wobei eine wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise einem Säugetier, besonders bevorzugt einem humanen Patienten verabreicht wird. Dabei ist beispielsweise lokale oder systemische Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung möglich, wie unter anderem in Vaishnaw et al. (2010, Silence (1) 14–26) beschrieben wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der pharmazeutischen/medizinischen Aspekte der vorliegenden Erfindung, insbesondere im Falle einer partiellen Herabregulierung der Pro-Caspase 1, ist es vorgesehen, den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Inhibitor und/oder die erfindungsgemäße shRNA und/oder der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung in Kombination mit beispielsweise einem Inhibitor der Caspase 1, vorzugsweise einem der bekannten chemischen Inhibitoren, oder einem Inhibitor gemäß US 2007/0111934 A1 einzusetzen.

Die Figuren zeigen:

1A zeigt eine schematische Darstellung des Aufbaus der Pro-Caspase 1 aus CARD, p20- und p10-Domäne sowie die Prozessierung der Pro-Caspase 1 durch Autoproteolyse zu reifer, aus einem Hetrotetramer aus zwei p10- und zwei p20-Einheiten aufgebauter Caspase-1.

1B zeigt eine schematische Darstellung der inflammatorischen Wirkung von Pro-Caspase 1 und Caspase 1 sowie die potentiellen therapeutischen Ansätze der RNAi und von chemischen Inhibitoren der Caspase 1-Enzymaktivität.

2A zeigt ein Diagramm, in dem die NFκB-Aktivierung von 293T-Zellen, die mit verschiedenen Varianten der Pro-Caspase 1 transfiziert wurden, dargestellt ist. Erkennbar ist eine verstärkte NFκB-Aktivierung verursacht durch mutierte Formen der Pro-Caspase 1.

2B zeigt ein Diagramm, in dem die NFκB-Aktivierung von 293T-Zellen, die mit verschiedenen Varianten der Pro-Caspase 1 und einem RIP-CARD-Plasmid (das für die CARD-Domäne von RIP 2 codiert) transfiziert wurden, dargestellt ist. Es wird eine kompetitive Hemmung der NFκB-Aktwierung durch die CARD-Domänen festgestellt. Besonders deutlich ist diese Hemmung bei den mutierten Formen der Pro-Caspase 1 erkennbar.

2C zeigt ein Diagramm, in dem die NFκB-Aktivierung von 293T-Zellen, die mit verschiedenen Varianten der Pro-Caspase 1 und Anti-RIP 2 shRNA transfiziert wurden. Erkennbar ist eine Abnahme der NFκB-Aktivierung durch den Knock-Down von RIP 2, der durch die Anti-RIP 2-shRNA verursacht wurde. Diese Abnahme wird besonders deutlich für die mutierten Formen der Pro-Caspase 1.

2D zeigt Abbildungen einer Western-Blut-Analyse, in der die Protein-Expressionsmuster von 293T-Zellen untersucht wurden, die mit verschiedenen Varianten der Pro-Caspase 1 und Anti-RIP-2 shRNA transfiziert wurden.

3 zeigt Abbildungen einer Western-Blot-Analyse zur Kontrolle der Knock-Down-Effizienz auf die Pro-Caspase 1-Expression durch siRNA in THP-1-Zellen jeweils 24, 48 und 72 Stunden nach Transfektion. Erkennbar ist eine Abnahme der Proteinmenge der Pro-Caspase 1, vermittelt durch siRNAs jeweils 48 bzw. 72 Stunden nach Transfektion.

4A zeigt Abbildungen einer Western-Blot-Analyse zur Kontrolle der Knock-Down-Effzienz auf die Pro-Caspase 1-Expression durch shRNA in THP-1-Zellen jeweils fünf bis sieben Tage nach Transduktion. Dabei ist deutlich eine erhebliche Reduktion der Proteinmenge bzw. die vollständige Eliminierung der Pro-Caspase 1, vermittelt durch shRNA 1, shRNA 2, shRNA 4 und shRNA 5, zu erkennen.

4B zeigt das Ergebnis einer Messung der IL-1β-Sekretion der mit shRNA 5 bzw. einer unspezifischen Kontroll-shRNA (shRNA 6) transfizierten TIP-1-Zellen nach Stimulation mit 1 μg LPS/ml für vier Stunden. in der Abbildung ist die relative IL-1β-Sekretion der Zellen dargestellt. Diese funktionelle Untersuchung belegt den erfolgreichen, durch shRNA 5 vermittelten Caspase-1-Knock-Down. Im Vergleich zu den Kontrollzellen (Expression des Kontrollkonstrukts shRNA 6) ist die IL-1β-Sekretion in Zellen, welche die erfindungsgemäße shRNA exprimieren, um ca. 90% vermindert.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden nicht-einschränkenden Beispiele näher erläutert.

BEISPIELE

Beispiel 1: Verstärkte Aktivierung des NFκB-Signalweges durch mutierte Pro-Caspasen 1, vermittelt durch CARD-CARD-Interaktionen mit RIP 2.

1.1: Verstärkte Aktivierung des NFκB-Signalweges durch mutierte Varianten der Pro-Caspase 1

293T-Zellen wurden in Kulturschalen mit sechs Vertiefungen mit einer Dichte von 0,16 × 106 Zellen/cm ausplattiert und 24 Stunden später mit den in 2A angegebenen Plasmiden, die verschiedene, mutierte Varianten der Pro-Caspase 1 enthielten, transfiziert. Gleichzeitig wurden die Zellen mit einem Leuchtkäfer-Luciferase-Reporter-Konstrukt (pGL3), das einen NFκB-Promotor enthält, transfiziert. Zur Transfektion wurden 6,75 μg/ml PEI statt Calcium-Phosphat eingesetzt. 24 Stunden nach der Transfektion wurde die Luciferase-Aktivität als Maßstab für die NFκB-Aktivierung gemessen. Dazu wurde ein Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Mannheim) eingesetzt. Die Zellen wurden in dem enthaltenen Lysepuffer lysiert und anschließend die Luciferase-Aktivität entsprechend den Anweisungen des Herstellers gemessen. Der in der 2A dargestellte Anstieg der NFκB-Aktivierung ist proportional zur Vervielfachung der Luciferase-Aktivität in den Ansätzen mit mutierten Varianten der Pro-Caspase 1 im Vergleich zum Ansatz mit der Wildtyp-Pro-Caspase 1, deren Wert gleich 1 gesetzt wurde.

1.2: Abhängigkeit der NFκB-Aktivierung von der Interaktion der CARD-Domänen von Pro-Caspase 1 und RIP 2.

Zusätzlich zu dem unter 1.1 angegebenen Verfahren wurde jeweils 1 Ansatz in jedem parallelen Experiment mit einem RIP-CARD-Plasmid, das für die CARD-Domäne von RIP 2 codiert, co-transfiziert. Zur Messung der NFκB--Aktivierung wurde wie unter 1.1 angegeben verfahren. Dabei kannte, wie in 2B dargestellt ist, ein kompetitiver Effekt der zugegebenen RIP 2-CARD-Domäne und eine resultierende Suppression der Aktivierung von NFκB, abhängig von der zusätzlichen RIP 2-CARD-Domäne festgestellt werden.

1.3: Rückgang der NFκB-Aktivierung nach Knock-Down von RIP 2

293T-Zellen wurden mit lentiviralen Anti-RIP 2-shRNA-Partikeln (sc-37389-V, Santa Cruz, USA) sowie lentiviralen Kontroll-shRNA-Partikeln (sc-108080, Santa Cruz, USA) transduziert und mittels Zugabe von Puromycin selektioniert. Anschließend wurde, wie unter 1.1 beschrieben, verfahren, wobei festgestellt wurde, dass ein RIP 2 Knock-Down zum Rückgang der NFκB-Aktivierung führt. Dieser Effekt ist in einem Diagramm in 2C dargestellt.

1.4: Erfolgreiche Expression der transfizierten Pro-Caspase 1-Varianten und erfolgreicher Knock-Down von RIP 2

Nach Transfektion der Zellen, wie unter 1.1 bzw. 1.3 beschrieben, wurden die Protein-Expressionsmuster mit Hilfe von Western-Blot-Analysen untersucht. Als Ladekontrolle diente das Enzym Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase. Das Ergebnis der Western-Blot-Analyse ist in der Abbildung in 2D zu sehen.

Beispiel 2: Hemmung der Pro-Caspase 1-Expression durch siRNA in THP-1-Zellen

THP-1-Zellen wurden mit siRNA-Oligonukleotiden transfiziert. Es wurden zwei siRNA-Oligonukleotide verwendet, deren Zielsequenzen sich im 3'-untranslatierten Bereich der Pro-Caspase 1-mRNA befinden, sowie ein unspezifisches Kontroll-Oligonukleotid (Control). Die jeweiligen Sense-(= Passenger-) Stränge der dsRNA-Oligonukleotide wiesen die folgenden Sequenzen auf:

Nach Inkubation der Zellen für die Zeiträume 24, 48 und 72 Stunden wurden Proteinextrakte angefertigt und eine Western-Blot-Analyse mit einem spezifischen, gegen die p20-Untereinheit der Caspase 1 gerichteten Antikörper durchgeführt. Als Ladekontrolle diente das Enzym Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase. Der durch die siRNAs verursachte Knock-Down ist in 3 gezeigt.

Beispiel 3: Hemmung der Pro-Caspase 1-Expression durch lentivirale Expression von shRNA in THP-1-Zellen

Hier wurde zunächst eine shRNA-Expressionskassette mittels lentiviralem Gentransfer in die Zellen eingebracht. Dabei wurden 4 verschiedene shRNAs (shRNA 1, shRNA 2, shRNA 4, shrNA 5) verwendet, deren Zielsequenzen sich innerhalb der CARD- oder p20-Domäne oder im untranslatierten Bereich der Pro-Caspase 1-mRNA befinden. Entsprechend wurden durch die eingesetzten shRNAs verschiedene Isoformen der Pro-Caspase 1 herabreguliert. Zusätzlich wurde eine unspezifische shRNA (shRNA 6) eingesetzt und ein unbehandelter Ansatz verwendet (Kontrolle). Die jeweiligen shRNAs waren gegen die folgenden Zielsequenzen der Pro-Caspase 1-mRNA gerichtet (in Klammern sind die Lage der Zielsequenz sowie die herabregulierten Caspase-1-Isoformen angegeben):

Die verwendete Expressionskassette vermittelt eine Puromycin-Resistenz, sodass positive Zellen durch Zugabe von Puromycin selektioniert werden konnten.

Nach Selektion der Zellen mittels Puromycin wurden fünf bis sieben Tage nach der Transduktion mit dem shRNA-Lentivirus Proteinextrakte angefertigt und eine Western-Blot-Analyse mit einem spezifischen, gegen die p20-Untereinheit der Caspase 1 gerichteten Antikörper durchgeführt. Als Ladekontrolle diente das Enzym Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase. Die Ergebnisse sind in 4A dargestellt.

Beispiel 4: Erfolgreicher Knock-Down der Caspase 1 und daraus folgende Inhibition der IL-1β-Sekretion

In diesem Ausführungsbeispiel wurde, wie in Beispiel 3 angegeben, eine shRNA-Expressionskassette in die Zellen eingebracht. Nach Stimulation der Zellen mit 1 μg LPS 1 ml für vier Stunden wurde die Konzentration von IL-1β im Zellkulturüberstand mit Hilfe von eines IL-1β-spezifischen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) gemessen. Die Ergebnisse sind in 4B grafisch dargestellt.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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