NEW DRUG FOR INHIBITING, PREVENTING OR TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS

WIPO Patent Application WO/2008/065304

The present invention pertains to the use of at least one interleukin 17F inhibitor and/or at least one TIL17 receptor inhibitor, for the preparation of a drug for the inhibition, the prevention or the treatment of rheumatoid arthritis. The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising, as active ingredient, at least one interleukine 17F inhibitor and/or at least one TIL17 receptor inhibitor in association with an adequate pharmaceutical carrier, as well as its use for the inhibition, the prevention or the treatment of rheumatoid arthritis.

Miossec, Pierre (16 rue de Reims, Bron, F-69500, FR)
Toh, Ling (53 cours de la Liberté, Lyon, F-69003, FR)
Zrioual, Saloua (27 avenue Lacassagne, Les Florentines - Allée 51, Lyon, F-69003, FR)

PCT/FR2007/052409

06/05/2008

11/28/2007

Download PDF WO/2008/065304       PDF help

Click for automatic bibliography generation

Biomã‰rieux (Chemin de l'Orme, Marcy L'etoile, F-69280, FR)
Hospices, Civils de Lyon (3 quai des Célestins, Lyon, F-69002, FR)
Miossec, Pierre (16 rue de Reims, Bron, F-69500, FR)
Toh, Ling (53 cours de la Liberté, Lyon, F-69003, FR)
Zrioual, Saloua (27 avenue Lacassagne, Les Florentines - Allée 51, Lyon, F-69003, FR)

Sprugnoli, Claude (BIOMERIEUX, Chemin de l'Orme, Marcy L'étoile, F-69280, FR)

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'au moins un inhibiteur de l'interleukine 17F et/ou d'au moins un inhibiteur d'un récepteur de TIL17, pour la préparation d'un médicament destiné à l'inhibition, la prévention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoïde Utilisation d'au moins un inhibiteur de l'interleukine 17F et/ou d'au moins un inhibiteur d'un récepteur de TIL17 en combinaison avec un traitement contre le TNF alpha pour la préparation d'un médicament destiné à l'inhibition, la prévention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoïde Utilisation selon la revendication 1 ou 2 selon laquelle ledit récepteur de TIL17 est le récepteur A de TIL17 ou le récepteur C de TIL17.

2. Utilisation selon la revendication 2 ou 3 selon laquelle ledit traitement contre le TNF alpha est choisi parmi l'etanercept, l'Infliximab®, l'adalimumab Utilisation selon la revendication 4 selon laquelle ledit traitement contre le TNF alpha est l'etanercept.

3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 selon laquelle l'inhibiteur de l'interleukine 17F est un anticorps dirigé contre TIL17F et/ou l'inhibiteur dudit récepteur de TIL17 est un anticorps dirigé contre le récepteur de TIL17, préférentiellement contre le récepteur A ou C de TIL17.

4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 selon laquelle l'inhibiteur de l'interleukine 17F est un ARN interfèrent avec IL17F et/ou l'inhibiteur dudit récepteur de TIL17 est un ARN interfèrent avec le récepteur de TIL17, préférentiellement contre le récepteur A ou C de TIL17.

5. Composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active au moins un inhibiteur de l'interleukine 17F et/ou d'au moins un inhibiteur d'un récepteur de l' IL 17 en association avec un véhicule pharmaceutiquement approprié.

6. Composition pharmaceutique selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'elle comprend en outre un traitement contre le TNF alpha Composition selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que ledit récepteur de TIL17 est le récepteur A de TIL17 ou le récepteur C de TIL17.

7. Composition selon la revendication 8 a 10 caractérisé en ce que ledit traitement contre le TNF alpha est choisi parmi l'etanercept, l'Infliximab®, l'adalimumab Composition selon la revendication 11 caractérisé en ce que ledit traitement contre le TNF alpha est l'etanercept.

8. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 a 12 caractérisé en ce que l'inhibiteur de l'interleukine 17F est un anticorps dirigé contre TIL17F et/ou l'inhibiteur dudit récepteur de TIL17 est un anticorps dirigé contre le récepteur de TIL17, préférentiellement contre le récepteur A ou C de TIL17.

9. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 a 12 caractérisé en ce que l'inhibiteur de l'interleukine 17F est un ARN interfèrent avec IL17F et/ou l'inhibiteur dudit récepteur de TIL17 est un ARN interfèrent avec le récepteur de TIL17, préférentiellement contre le récepteur A ou C de TIL17.

10. Utilisation de la composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 8 a 14 pour l'inhibition, la prévention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoïde.

11. Procédé in vitro pour déterminer, à partir d'un échantillon biologique, le diagnostic précoce d'une polyarthrite rhumatoïde, la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie et/ou le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps caractérisé en ce qu'on détermine l'expression du gène codant TIL17A, TIL17F, l'IL17RA et/ou l'IL17RC.

12. Procédé in vitro selon la revendiction 16 selon lequel la mesure de l'expression du gène codant l'IL17A, l'IL17F, l'IL17RA et/ou l'IL17RC comprend les étapes suivantes : a) on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique, b) on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique du gène codant l'IL17A, l'IL17F, l'IL17RA et/ou l'IL17RC; c) on détermine l'expression du gène codant TIL17A, TIL17F, l'IL17RA et/ou l'IL17RC Utilisation d'au moins réactif spécifique du gène codant TIL17A, TIL17F, l'IL 17RA et/ou TIL17RC pour déterminer le diagnostic précoce d'une polyarthrite rhumatoïde, la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie et/ou le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps Kit de diagnostic précoce d'une polyarthrite rhumatoïde, de pronostic de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie et/ou de pronostic pour le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps comprenant au moins un réactif spécifique du gène codant l'IL17A, l'IL17F, l'IL17RA et/ou l'IL17RC.

Nouveau médicament destiné à l'inhibition, la prévention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoïde

La présente invention concerne la polyarthrite rhumatoïde, et notamment l'utilisation d'au moins un inhibiteur de l'interleukine 17F et/ou d'au moins un inhibiteur d'un récepteur de TIL17, pour la préparation d'un médicament destiné à l'inhibition, la prévention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active au moins un inhibiteur de l'interleukine 17F et/ou d'au moins un inhibiteur d'un récepteur de TIL17 en association avec un véhicule pharmaceutiquement approprié, ainsi que son utilisation pour l'inhibition, la prévention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoïde.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une affection chronique qui se caractérise par l'inflammation et la déformation de plusieurs articulations avec, en outre, un risque de complications extra- articulaires. La connaissance concernant le rôle de cytokines dans des interactions de cellule-cellule a mené au développement raisonnable de traitements avec des agents anticytokine.

La gravité de l'affection varie d'un sujet à l'autre, mais elle est associée à long terme à une augmentation de la morbidité et de la mortalité. Le traitement symptomatique fait appel à des anti-inflammatoires non stéroïdiens, et éventuellement à des corticostéroïdes. Actuellement, le méthotrexate apparaît comme le traitement de référence. Des traitements inhibiteurs des cytokines proinflammatoires sont également proposés en association avec les DMARDs pour le traitement de fond de la polyarthrite rhumatoïde. On peut citer à ce titre, l'étanercept et l'infliximab, qui sont deux inhibiteurs dirigés contre le TNF (Tumor Necrosis Factor), une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la polyarthrite rhumatoïde. De telles molécules sont qualifiées d'anti-TNF. D'une manière plus générale, le facteur TNF alpha est apparu comme une cible principale thérapeutique basée sur des études cliniques avec des inhibiteurs biologiques comme des anticorps monoclonaux ou des récepteurs solubles. A ce titre, l'infliximab® est prescrit pour réduire l'inflammation

mais également pour ralentir l'évolution de la polyarthrite rhumatoïde lorsque d'autres médicaments sont insuffisants.

On peut également citer d'autres traitements, mettant en œuvre l'utilisation d'antagoniste d'interleukines (IL) tel que HL- 1 (Anakinra), CTLA4Ig (blocage CD80-86), les anticorps monoclonaux anti-IL-6 Récepteur (MRA), les anti-CD20 (Rituximab).

L'évolutivité de la PR peut-être déterminé à l'aide de plusieurs éléments : la douleur, l'inflammation, la mobilité articulaire, l'impotence fonctionnelle, la qualité ou la durée de vie. En clinique, l'étude de l'évolutivité de la réponse au cours d'un traitement est basée sur l'emploi d'indices de réponse standardisés intégrant les éléments cités ci-dessus et parmi lesquels le critère DAS (Disease Activity Score) ou ses variants (Van der Heijde D.M. et al, J Rheumatol, 1993, 20(3) : 579-81 ; Prevoo M.L. et al, Arthritis Rheum, 1995, 38 : 44-8) et le critère ACR ( (Felson D.T. et al, 1993, Arthritis Rheum, 36 : 729-40) sont les plus utilisés. Ainsi, les traitements actuels présentent des limites puisque qu'environ 30% des malades ne répondent pas aux biothérapies. De plus, quel que soit le traitement, la maladie reste récurrente. Par exemple, tous les patients ne répondent pas d'une manière comparable à un traitement par l'Infliximab®. Ainsi, des radiographies d'articulations de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et traités par l'Infliximab®, prises après un an ont révélé que, si un nombre important de patients a bénéficié d'amélioration, un plus petit nombre avait subi une détérioration articulaire.

Il est donc important d'un point de vue clinique de proposer de nouvelles alternatives de traitement au clinicien. De plus, il est également important d'un point de vue clinique de déterminer, avant toute prescription, si le patient répond ou non au traitement proposé par le médecin.

La présente invention se propose de résoudre les inconvénients de l'état de la technique en présentant de nouveaux outils biologiques pour améliorer le traitement d'un patient contre la polyarthrite rhumatoïde.

La présente invention présente en effet de nouveaux médicaments pour améliorer le traitement d'un patient contre la polyarthrite rhumatoïde. De plus, la présente invention permet de déterminer la réponse d'un patient atteint de polyarthrite rhumatoïde à un traitement tel que l'Infliximab®. La présente invention est également très pertinente pour le suivi de réponse d'un patient soumis à un traitement tel que l'Infliximab®.

Les inventeurs ont mis en évidence que l'interleukine 17 F (IL17 F), tout comme l'interleukine 17 A (IL17 A), joue un rôle très important dans la physiologie de la polyarthrite rhumatoïde, et que le blocage des récepteurs A et C de TIL17 potentialise l'effet d'un traitement anti TNF alpha.

A ce titre, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un inhibiteur de l'interleukine 17F et/ou d'au moins un inhibiteur d'un récepteur de TIL17, pour la préparation d'un médicament destiné à l'inhibition, la prévention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoïde.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins un inhibiteur de l'interleukine 17F et/ou d'au moins un inhibiteur d'un récepteur de TIL17 en combinaison avec un traitement contre le TNF alpha pour la préparation d'un médicament destiné à l'inhibition, la prévention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoïde.

Préférentiellement, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un inhibiteur du récepteur A de TIL17 et d'au moins un inhibiteur du récepteur C de TIL17. L'invention concerne en outre une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active au moins un inhibiteur de l'interleukine 17F et/ou d'au moins un inhibiteur d'un récepteur de TIL17 en association avec un véhicule pharmaceutiquement approprié, ainsi que l'utilisation d'une telle composition pour l'inhibition, la prévention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Préférentiellement, la composition comprend en outre un traitement contre le TNF alpha. Préférentiellement, la composition comprend au moins un inhibiteur du récepteur A de TIL17 et au moins un inhibiteur du récepteur C de TIL17.

Préférentiellement, ledit récepteur de TIL17 est le récepteur A de TIL17 ou le récepteur C de TIL17.

Préférentiellement, ledit traitement contre le TNF alpha est choisi parmi l'etanercept, l'Infliximab®, l'adalimumab et encore plus préférentiellement l'etanercept. Selon un mode particulier, ledit traitement contre le TNF alpha est en combinaison avec un composé cytostatique inhibant la prolifération cellulaire tel que le méthotrexate.

Préférentiellement, l'inhibiteur de l'interleukine 17F est un anticorps dirigé contre TIL17F et/ou l'inhibiteur dudit récepteur de TIL17 est un anticorps dirigé contre le récepteur de TIL17, préférentiellement contre le récepteur A ou C de TIL17.

Préférentiellement, l'inhibiteur de l'interleukine 17F est un ARN interfèrent avec IL17F et/ou l'inhibiteur dudit récepteur de TIL17 est un ARN interfèrent avec le récepteur de TIL17, préférentiellement contre le récepteur A ou C de TIL17.

Les définitions suivantes permettront de mieux comprendre l'invention.

Par inhibiteur de l'interleukine 17F, on entend une molécule (ou un ensemble de molécules) qui bloque l'activité inflammatoire et/ou immuno stimulante de TIL17F. L'inhibiteur peut être notamment un anticorps dirigé contre TIL17F. Par anticorps, on entend tant un anticorps entier qu'un fragment d'anticorps. Les anticorps recombinants peuvent être obtenus selon des procédés classiques connus de l'homme du métier, à partir d'organismes procaryotes, tels que bactéries, ou à partir d'organismes eucaryotes, tels que levures, cellules de mammifères, de plantes, d'insectes ou d'animaux, ou par des systèmes de production extra-cellulaire. Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés selon les techniques classiques connues de l'homme du métier telles que la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après.

Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro) avec un antigène cible d'intérêt, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner lieu

à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de l'antigène d'intérêt pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité. Des fragments d'anticorps peuvent par exemple être obtenus par protéolyse. Ainsi, ils peuvent être obtenus par digestion enzymatique, résultant en des fragments de type Fab (traitement à la papaïne ; Porter RR, 1959, Biochem. J., 73 : 119-126) ou de type F(ab)'2 (traitement à la pepsine ; Nisonoff A. et al., 1960, Science, 132 : 1770- 1771). Ils peuvent également être préparés par voie recombinante (Skerra A., 1993, Curr. Opin. Immunol., 5 : 256-262). Un autre fragment d'anticorps qui convient aux fins de l'invention comprend un fragment Fv qui est un dimère constitué de l'association non covalente du domaine variable léger (VL) et du domaine variable lourd (VH) du fragment Fab, donc de l'association de deux chaînes polypeptidiques. Afin d'améliorer la stabilité du fragment Fv due à la dissociation des deux chaînes polypeptidiques, ce fragment Fv peut être modifié par génie génétique en insérant un lien peptidique adapté entre le domaine VL et le domaine VH (Huston P. et al., 1988, Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 85 : 5879-5883). On parle alors de fragment scFv (« single chain Fragment variable ») car il est constitué d'une seule chaîne polypeptidique. L'utilisation d'un lien peptidique composé préférentiellement de 15 à 25 acides aminés permet de relier l'extrémité C-terminale d'un domaine à l'extrémité N-terminale de l'autre domaine, constituant ainsi une molécule monomérique dotée de propriétés de liaison similaires à celles de l'anticorps sous sa forme complète. Les deux orientations des domaines VL et VH conviennent (VL- lien-VH et VH-lien-VL) car elles présentent des propriétés fonctionnelles identiques. Bien entendu, tout fragment connu de l'homme du métier et présentant les caractéristiques immunologiques définies ci-dessus convient aux fins de l'invention.

L'inhibiteur peut être également un ARN interfèrent avec IL17F.

Par ARN interfèrent, on entend un acide ribonucléique qui bloque l'expression d'un gène prédéterminé (Dallas A. et al, 2006, Med Sci Monit, 12(4) : RA67-74). Par récepteur de l'IL17, on entend une molécule de la famille des récepteurs IL- 17, ceux-ci étant définis par leur apparenté avec le récepteur IL- 17RA (Moseley T. A. Et al, 2003, Cytokine Growth Factor Rev, 14(2) : 155-74).

Par récepteur IL- 17RA on entend la molécule initialement découverte pour son implication dans l'activité inflammatoire et/ou immuno stimulante de TIL-17A (Yao Z. et al, 1997, Cytokine, 9(11) : 794-800).

Par récepteur IL- 17RC, on entend une molécule apparentée au récepteur IL- 17RA

(Haudenschild D. et al, 2002, J Biol Chem, 277 : 4309-4316).

Par inhibiteur d'un récepteur de l'IL17, on entend une molécule qui bloque l'action d'un récepteur de TIL17. L'inhibiteur peut être notamment un anticorps, tel que défini précédemment dirigé contre le récepteur de TIL17, préférentiellement contre le récepteur A ou C de l'IL17.

L'inhibiteur peut être également un ARN interfèrent tel que défini précédemment avec le récepteur de TIL17, préférentiellement contre le récepteur A ou C de TIL17. Par traitement contre le TNF alpha (ou traitement anti-TNF alpha), on entend un traitement, un composé ou médicament bloquant l'action du TNF (tumor necrosis factor), tels que notamment l'infliximab, l'étanercept, et l'adalimumab.

Par médicament ou composition pharmaceutique, on entend toute substance ou composition présentées comme possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines ou animales, ainsi que tout produit pouvant être administré à l'homme ou à l'animal en vue d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leurs fonctions organiques.

Par substance active, on entend un composant reconnu comme possédant des propriétés thérapeutiques. Dans les compositions pharmaceutiques selon l'invention, pour l'administration orale, sublingale, sous cutanée, intra musculaire, intra veineuse, topique,

intratrachéale, rectale, transdermique, les substances actives peuvent être administrées sous formes unitaires d'administration ou en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, et destinés à une administration par voie orale, par exemple sous la forme d'un comprimé, d'une gélule, d'une solution buvable, etc, ou par voie rectale, sous la forme d'un suppositoire, par voie parentérale, en particulier sous la forme d'une solution injectable, notamment par voie intraveineuse, intradermique, sous cutanée, etc, selon des protocoles classiques bien connus de l'homme du métier. Pour l'application topique, on peut utiliser les substances actives dans des crèmes, pommades, lotions. Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange les substances actives avec un excipient pharmaceutiquement acceptable également nommé véhicule pharmaceutiquement approprié, tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique ou d'autres matières appropriées. On peut également les traiter de telles sortes qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de substances actives. On peut également obtenir une préparation en gélules en mélangeant les substances actives avec un diluant et en versant le mélange dans des gélules molles ou dures. On peut également obtenir une préparation sous forme de sirop ou pour l'administration sous forme de gouttes, dans laquelle les substances actives sont présents conjointement avec un édulcorant, un antiseptique, tel que notamment du méthylparaben et du propylparaben, ainsi qu'un agent donnant du goût ou un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir les substances actives en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, bien connus de l'homme du métier. Pour une administration parentérale, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion, des mouillants pharmacologiquement compatibles, tels que notamment le propyléneglycol ou le butylèneglycol. Le médicament ou la composition pharmaceutique selon l'invention peut comprendre en outre un agent d'activation qui induit les effets d'une médication ou

renforce ou complète les effets de la médication principale, en augmentant notamment la biodisponibilité de la médication principale.

La posologie dépend de la gravité de l'affection. Dans le cas d'une composition pharmaceutique comprenant un anticorps, l'administration peut être notamment administrée une fois toutes les 2 à 8 semaines, de préférence de 50 à 100 mg de d'anticorps, en combinaison avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans le cas d'une composition pharmaceutique comprenant un ARN interfèrent, l'administration peut être notamment administrée une fois toutes les 2 à 8 semaines, de préférence de 1 à 10 mg/Kg d'ARN interfèrent, en combinaison avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.

L'invention concerne également un procédé in vitro pour déterminer, à partir d'un échantillon biologique,

> le diagnostic précoce d'une polyarthrite rhumatoïde > la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie

> le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps caractérisé en ce qu'on détermine l'expression du gène codant TIL-17A, TIL-17F, l'IL-17RA et/ou l'IL-17RC.

La mesure de l'expression du gène codant TIL-17A, TIL-17F, TIL-17RA et/ou l'IL-

17RC comprend les étapes suivantes : a) on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique, b) on met en contact le matériel biologique avec au moins un réactif spécifique du gène codant FIL17-A, l'IL17-F, l'IL17-RA et/ou l'IL17RC; c) on détermine l'expression du gène codant TIL17-A, TIL17-F, TIL17- RA et/ou l'IL17RC

Le matériel biologique extrait lors de l'étape a) peut comprendre des acides nucléiques ou des protéines.

Ledit réactif spécifique de l'étape b) peut comprendre une sonde d'hybridation ou un anticorps spécifique du gène codant l' IL- 17 A, l'IL-17F, l'IL-17RA et/ou l'IL-17RC. Au sens de la présente invention, on entend par échantillon biologique, tout échantillon prélevé chez un patient, et susceptible de contenir un matériel biologique tel que défini ci après. Cet échantillon biologique peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de tissu, de liquide synovial, de synoviocytes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique prélevé chez le patient est un échantillon sanguin. Lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, on extrait le matériel biologique de l'échantillon biologique par tous les protocoles d'extraction et de purification d'acides nucléiques ou de protéines connus de l'homme du métier. Au sens de la présente invention, on entend par matériel biologique, tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène cible. Le matériel biologique peut comprendre notamment des protéines, ou des acides nucléiques tels que notamment les acides desoxyribonucléiques (ADN) ou les acides ribonucléiques (ARN). L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique extrait lors de l'étape a) comprend des acides nucléiques, préférentiellement, des ARN, et encore plus préférentiellement des ARN totaux. Les ARN totaux comprennent les ARN de transfert, les ARN messagers (ARNm), tel que les ARNm transcrits du gène cible, mais également transcrit de tout autre gène et les ARN ribosomaux. Ce matériel biologique comprend du matériel spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits du gène cible ou les protéines issues de ces ARNm mais peut comprendre également du matériel non spécifique d'un gène cible, tel que notamment les ARNm transcrits d'un gène autre que le gène cible, les ARNt, les ARNr issus d'autres gènes que le gène cible. A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut être réalisée par :

- une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les cellules du patient. A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrites dans les demandes de brevet WO 00/05338, WO 99/53304, WO 99/15321. L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US 5,234,809).

- une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques, et peut être adaptée à la purification d'ADN ou d'ARN. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US 4,672,040 et US 5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet: WO-A-97/45202 et WO-A-99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes ou magnétiques. D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique. Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique.

Dans le cas de l'extraction de protéines, la première étape consiste généralement, comme pour les acides nucléiques en la lyse des cellules. Un choc osmotique peut suffire à briser la membrane cellulaire de cellules fragiles, qui peut être réalisé en présence d'un détergent. Une action mécanique peut aussi être ajoutée au processus (homogénéisateur à piston par exemple). La lyse peut être induite également par ultrasons, par une lyse mécanique utilisant des billes de verre. L'extraction des

protéines d'intérêt peut s'effectuer ensuite par chromatographie, telle que notamment sur colonne de chromatographie sur gel, remplie d'une résine consistant en des billes creuses et poreuses. La taille des pores de ces billes est telle que les protéines sont séparées en fonction de leur taille. On peut citer également la chromatographie sur colonne à échange d'ions, qui permet l'extraction de protéines selon leur affinité électrostatique à des groupements chargés de la résine.

Lors de l'étape b), et au sens de la présente invention, on entend par réactif spécifique, un réactif qui, lorsqu'il est mis en contact avec du matériel biologique tel que défini précédemment, se lie avec le matériel spécifique dudit gène cible. A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine nucléique, la mise en contact du réactif spécifique et du matériel biologique permet l'hybridation du réactif spécifique avec le matériel spécifique du gène cible. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A-T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison G-C). L'hybridation de deux fragments nucléotidiques peut être totale (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A-T et des liaisons C-G. Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences suffisamment complémentaires), c'est à dire que le complexe double brin obtenu comprend des liaisons A-T et des liaisons C-G permettant de former le complexe double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux fragments nucléotidiques dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et notamment de la stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux fragments nucléotidiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux fragments nucléotidiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans

la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des fragments nucléotidiques que l'on souhaite hybrider, la température d'hybridation est comprise entre environ 20 et 7O ⁰ C, en particulier entre 35 et 65 ⁰ C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Une séquence, ou fragment nucléotidique, ou oligonucléotide, ou polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphoriques, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo- 5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide, soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 motifs nucléiques permettant

l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes :

- PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US 4,683,195, US 4,683,202 et US 4,800,159,

- LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 0 201 184, - RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO

90/01069,

- 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO 90/06995,

- NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO 91/02818, et

- TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US 5,399,491.

Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification, spécifiques du gène cible, afin de permettre l'amplification du matériel spécifique du gène cible. Le matériel spécifique du gène cible comprend alors préférentiellement un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse d'ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible) ou un ARN complémentaire obtenu par transcription des ADNc spécifiques d'un gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible). Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR.

Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'étape b) comprend au moins une sonde d'hybridation. Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant au moins 5 motifs nucléotidiques, tel que de 5 à 100 motifs nucléiques, notamment de 10 à 35

motifs nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec le matériel spécifique d'un gène cible. Dans la présente invention, le matériel spécifique du gène cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ARNm spécifique du gène cible), une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible), ou encore une séquence nucléotidique comprise dans un ARN complémentaire obtenu par transcription dudit ADNc tel que décrit précédemment (on parlera alors d'ARNc spécifique du gène cible). La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al, Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Keller G.H. et al, DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 1251. Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. La sonde de détection peut être notamment

une sonde de détection « molecular beacons » telle que décrite par Tyagi & Kramer (Nature biotech, 1996, 14 :303-308). Ces "molecular beacons" deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige-boucle et contiennent un fluorophore et un groupe "quencher". La fixation de la séquence de boucle spécifique avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors de l'excitation à la longueur d'onde qui convient.

Pour la détection de la réaction d'hybridation, on peut utiliser des séquences cibles marquées, directement (notamment par l'incorporation d'un marqueur au sein de la séquence cible) ou indirectement (notamment par l'utilisation d'une sonde de détection telle que définie précédemment) la séquence cible. On peut notamment réaliser avant l'étape d'hybridation une étape de marquage et/ou de clivage de la séquence cible, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué lors de la réaction d'amplification enzymatique. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. La séquence cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde de détection selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO 91/19812. Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR2 780 059. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la sonde de détection comprend un flurophore et un quencher.

La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz,

des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO- A-94/12670, d'une particule. Ces étapes d'hybridation sur support peuvent être précédées d'une étape de réaction d'amplification enzymatique, telle que définie précédemment, pour augmenter la quantité de matériel génétique cible.

A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine protéique, la mise en contact du réactif spécifique et du matériel biologique permet la formation d'un complexe dit antigène-anticorps entre le réactif spécifique et matériel spécifique du gène cible.

Lors de l'étape c) la détermination de l'expression du gène cible peut être réalisée par tous les protocoles connus de l'homme du métier. D'une manière générale, l'expression d'un gène cible peut être analysée par la détection des ARNm (ARN messagers) qui sont transcrits du gène cible à un instant donné ou par la détection des protéines issues de ces ARNm.

L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression d'un gène cible par la détection des ARNm issus de ce gène cible. Lorsque le réactif spécifique comprend une ou des amorces d'amplification, on peut, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:

1) après avoir extrait comme matériel biologique, les ARN totaux (comprenant les ARN de transfert (ARNt), les ARN ribosomaux (ARNr) et les ARN messagers (ARNm)) d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse afin d'obtenir les

ADN complémentaires (ou ADNc) desdits ARNm. A titre indicatif, cette réaction de transcription reverse peut être réalisée à l'aide d'une enzyme reverse transcriptase qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment d'ADN complémentaire. On peut utiliser notamment l'enzyme reverse transcriptase provenant de l'AMV (Avian Myoblastosis Virus) ou de

MMLV (Moloney Murine Leukaemia Virus). Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADNc des ARNm, on réalise cette étape de transcription reverse en présence de fragments nucléotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription reverse réalisée par l'enzyme reverse transcriptase. On obtient alors des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible).

2) on met en contact la ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible avec les ADNc spécifique du gène cible et les ADNc non spécifique du gène cible. La ou les amorces d'amplification spécifiques d'un gène cible s'hybrident avec les ADNc spécifique du gène cible et on amplifie spécifiquement une région prédéterminée, de longueur connue, des ADNc provenant des ARNm issus du gène cible. Les ADNc non spécifiques du gène cible ne sont pas amplifiés, alors qu'on obtient alors une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible. Au sens de la présente invention, on parle indifféremment d' « ADNc spécifiques du gène cible » ou d' « ADNc provenant des ARNm issus du gène cible ». Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par toute autre technique d'amplification telle que définie précédemment.

3) on détermine l'expression du gène cible en détectant et quantifiant les ADNc spécifiques du gène cible obtenus lors de l'étape 2) ci dessus. Cette détection peut être réalisée après migration par électrophorèse des ADNc spécifiques du gène cible en fonction de leur taille. Le gel et le milieu de migration peuvent comprendre du bromure d'éthydium afin de permettre la détection directe des ADNc spécifiques du gène cible lorsque le gel est placé, après un temps de migration donné, sur une table lumineuse à rayons UV (ultra violet) par l'émission d'un signal lumineux. Ce signal est d'autant plus lumineux que la quantité des ADNc spécifiques du gène cible est importante. Ces

techniques d'électrophorèse sont bien connues de l'homme du métier. Les ADNc spécifiques du gène cible peuvent également être détectés et quantifiés par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficacité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription reverse, PCR...), on peut normaliser l'expression d'un gène cible de différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, c'est à dire en réalisant un rapport entre la quantité d'ADNc spécifiques du gène cible, et la quantité d'ADNc spécifiques du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notamment aux publications suivantes : Bustin SA, J Mol Endocrinol , 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401.

Lorsque le réactif spécifique comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:

1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir des ADNc complémentaires des ARNm issus d'un gène cible (ADNc spécifique du gène cible) et des ADNc complémentaires des ARNm issus d'autres gènes que le gène cible (ADNc non spécifique du gène cible). 2) on met en contact tous les ADNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ADNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ADNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux tels qu'indiqués précédemment. Selon un mode préféré de

réalisation, la sonde d'hybridation est immobilisée sur un support. La réaction d'hybridation peut être précédée d'une étape d'amplification enzymatique des ADNc spécifique du gène cible telle que décrite précédemment pour obtenir une grande quantité d'ADNc spécifiques du gène cible et augmenter la probabilité qu'un ADNc spécifiques d'un gène cible s'hybride sur une sonde de capture spécifique du gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ADNc spécifiques du gène cible telle que décrite précédemment, par exemple en utilisant un désoxyribonucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le clivage peut être réalisé notamment par l'action de l'imidazole et de chlorure de manganèse. L'ADNc spécifique du gène cible peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. D'autres modes particuliers préférentiels de marquage et/ou clivage d'acides nucléiques sont décrit dans les demandes

WO 99/65926, WO 01/44507, WO 01/44506, WO 02/090584, WO 02/090319.

3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridées les sondes de capture spécifiques du gène cible avec les ADNc spécifiques du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ADNc spécifique du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur.

Lorsque le au moins un réactif spécifique mis en contact l'étape b) du procédé selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:

1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que présenté précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les ADNc

des ARNm du matériel biologique. On réalise ensuite la polymérisation de l'ARN complémentaire du ADNc par l'utilisation d'une enzyme polymerase de type T7 polymerase qui fonctionne sous la dépendance d'un promoteur et qui permet d'obtenir, à partir d'une matrice d'ADN, l'ARN complémentaire. On obtient alors les ARNc des ADNc des ARNm spécifiques du gène cible

(on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible) et les ARNc des ADNc des ARNm non spécifiques du gène cible.

2) on met en contact tous les ARNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ARNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ARNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ARNc spécifiques du gène cible telles que décrites précédemment.

3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridées les sondes de capture spécifiques du gène cible avec l'ARNc spécifique du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ARNc spécifiques du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. L'utilisation d'ARNc est particulièrement avantageuse lorsqu'on utilise un support de type biopuce sur lequel est hybride un grand nombre de sondes.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les étapes B et C sont effectuées en même temps. Ce mode préféré peut être notamment mise en oeuvre par «NASBA en temps réel» qui regroupe en une étape unique la technique d'amplification NASBA et la détection en temps réel qui fait appel à des "molecular beacons". La réaction NASBA intervient dans le tube, produisant de l'ARN simple brin avec lequel les "molecular beacons" spécifiques peuvent s'hybrider

simultanément pour donner un signal fluorescent. La formation des nouvelles molécules d'ARN est mesurée en temps réel par contrôle continu du signal dans un lecteur fluorescent.

A titre indicatif, lorsque le réactif spécifique et le matériel biologique sont d'origine protéique, l'étape c) peut être notamment effectue par Western Blot ou ELISA, ou toute autre méthode connue de l'homme du métier.

A titre indicatif, la technique ELISA est une technique biochimique de référence utilisée en immunologie pour détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon. La technique utilise deux anticorps, l'un d'entre eux étant spécifique à l'antigène et l'autre étant couplé à une enzyme.

A titre indicatif, la technique Western Blot est un test pour détecter une protéine spécifique dans un échantillon à l'aide d'un anticorps spécifique de cette protéine comprenant les étapes suivantes : La première étape est une électrophorèse sur gel, qui permet de séparer les protéines de l'échantillon selon leur taille

Les protéines dans le gel sont alors transférées sur une membrane (nitrocellulose, PVDF...) par pression ou par application d'un courant électrique, les protéines se fixant à la membrane grâce à des interactions hydrophobes et ioniques. Après saturation des sites d'interactions non spécifiques, un premier anticorps, spécifique de la protéine à étudier (anticorps primaire) est incubé avec la membrane. La membrane est ensuite rincée afin d'enlever les anticorps primaires non liés, puis incubée avec des anticorps dits secondaires, qui vont se lier aux anticorps primaires. Cet anticorps secondaire est habituellement lié à une enzyme qui permet l'identification visuelle de la protéine étudiée sur la membrane.

Comme pour les techniques ELISA, l'ajout d'un substrat de l'enzyme engendre une réaction colorée qui est visible sur la membrane.

L'invention concerne également l'utilisation d'au moins réactif spécifique du gène codant l'IL-17A, l'IL-17F, l'IL-17RA et/ou l'IL-17RC pour déterminer > le diagnostic précoce d'une polyarthrite rhumatoïde

> la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie

> le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps L'invention concerne également un kit

> de diagnostic précoce d'une polyarthrite rhumatoïde

> de pronostic de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie

> de pronostic pour le suivi de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie au cours du temps comprenant au moins un réactif spécifique du gène codant TIL-17A, TIL-17F, l'IL- 17RA et/ou l'IL-17RC.

L'analyse de l'expression des gènes de l'IL-17A, l'IL-17F, l'IL-17RA et/ou l'IL- 17RC permet alors de disposer d'un outil pour le diagnostic / pronostic de la réponse d'un patient atteint d'une polyarthrite rhumatoïde à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie. On peut par exemple analyser l'expression du gène cible chez un patient dont on ne connaît pas sa réaction à un traitement dirigé contre une cytokine impliquée dans le processus inflammatoire de la maladie, et comparer avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients répondant audit traitement et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients non répondant audit traitement. Ceci permet de déterminer si le patient est répondant ou non répondant, ce qui permet de lui proposer un traitement adapté ou d'adapter son traitement tout au long de sa thérapie.

Les figures permettront de mieux comprendre l'invention.

La figure 1 représente l'effet de IL17A et IL17F, seul ou en combinaison avec le TNF-α sur la sécrétion d'IL-6. La figure IA représente les résultats obtenus sur synoviocytes de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde PR, stimulés pendant 48 h a des concentration de IL17A ou IL17F (0.1-100 ng/ml). La figure IB représente les résultats obtenus sur synoviocytes de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde PR, stimulés pendant 12, 24 ou 48h avec de l' IL- 17 A et IL- 17F (50 ng/ml), seul ou en combinaison avec du TNF-α (0.5 ng/ml). L'IL-6 était quantifiée par ELISA. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM sur triplicat. * = P < 0.05 selon le test Dunnett. NS = non significatif. La figure 2 représente les effets de IL17A et IL17F, seul ou en combinaison avec le TNF-α sur l'expression des ARNmessagers de médiateurs proinflammatoires. Les synoviocytes de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde PR étaient stimulés pendant 12h avec de TIL17-A ou de TIL17-F (50 ng/ml), seul ou en combinaison avec du TNF-α (0.5 ng/ml). Les ARN totaux étaient extraits et transcrits de façon reverse. L'expression des ARNm de l'IL-6 (figure 2A) et l'IL-8 (figure 2B) étaient quantifiés par RT-PCR en temps réel. Les valeurs, normalisées par l'expression des ARNm de GAPDH étaient exprimées par le rapport entre les données obtenus avec des synoviocytes PR et celles obtenues dans des conditions contrôles. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM sur quadriplicat. * = P < 0.05 selon le test Dunnett. NS = non significatif.

La figure 3 représente les effets des ARNi de l'IL-17RA et des ARNi de l'IL-17RC sur la sécrétion d'IL6 induite par TIL17A et IL17F par des synoviocytes de PR. Les synoviocytes PR étaient transfectés avec des ARNi de TIL-17RA et des ARNi de l'IL-17RC, a respectivement 0,5 et 0,005 μg. Un ARNi siCONTROL était utilisé comme contrôle négatif. L'efficacité du blocage (knockdown) a été étudiée par RT- PCR après 24h et 48h de transfection. La figure 3 A représente l'expression des ARNm de IL- 17RA et IL- 17RC mRNA 24h après la transfection. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM sur triplicat. * = P < 0.05 selon le test Dunnett. NS = non significatif. La figure 3B représente les résultats obtenus 48h après transfection, sur des synoviocytes PR transfectés avec des ARNsiCONTROL, ARNsi de IL- 17RA, ou ARNsi IL- 17RC et stimulés pendant 12h avec de IL-17A ou

IL-17F (50 ng/ml). L'IL-6 était quantifiée par ELISA. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM sur triplicat. * = P < 0.05 selon le test Dunnett. NS = non significatif.

La figure 4 représente les effets des anticorps anti-IL-17RA sur la sécrétion d'IL6 induite par TIL17A et IL17F ainsi que l'effet potentialisateur/bénéfique du blocage de TIL-17RA en présence de l'étanercept. Les synoviocytes de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde PR étaient preincubés pendant 2h (37 ⁰ C, 5% CO2) avec différents inhibiteurs: anticorps anti-IL-17RA (10 μg/ml) seul ou en combinaison avec l'Etanercept (10 μg/ml). Les synoviocytes étaient stimulés avec IL-17A ou IL- 17F (50 ng/ml), seul ou en combinaison avec TNFα (0,5 ng/ml). L'IL-6 était quantifiée par ELISA. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM sur triplicat. * = P < 0.05 selon le test Dunnett. NS = non significatif.

La figure 5 représente l'expression de TIL17RA et de TIL17RC dans le sang de patients PR et de volontaires sains (HV). La figure 5A représente l'expression des ARNm IL 17RA et IL 17RC dans le sang périphérique de 40 patients PR (31 patients sévères et 9 patients modérés) et 19 volontaires sains, déterminée à l'aide de puces ADN. Les résultats sont exprimés en fluorescence d'intensité (P < 0.05; **, P < 0.005; ***P < 0.0005 par le test de Mann-Whithney). La figure 5B représente l'expression protéique de TIL17RA et de TIL17RC dans le sang périphérique de patients PR (n=6) et de volontaires sains (n=3). La quantification a été effectuée par western blotting. Les données densitométriques d'expression de TIL17RA et de TIL17RC ont été normalisées par l'actine et exprimées en unités arbitraires (AU). (*, P < 0.05 by Mann-Whitney-test).

La figure 6 représente l'expression de TIL17RA et de TIL17RC dans la membrane synoviale. L'analyse immunohistochimique a été effectuée sur coupes sériées en utilisant des anticorps monoclonaux murins anti-IL7RA (A et B, respectivement x 200 and x 400) et des anticorps polyclonaux de chèvres anti-IL-17RC (C et D respectivement x 200 et x 400). Des marquages contrôles ont été effectués avec des IgGl murins et du sérum de chèvre (x 200) (Insets en A et C respectivement). L'immunodétection de TIL17RA et de TIL17RC a aussi été effectuée dans de la

synoviale d'arthrose (E et F respectivement; x 200). L'expression de TIL-17A a été étudiée comme contrôle (Inset en D, x 600).

Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.

MATERIELS & METHODES

A - Patients et volontaires sains. 40 patients atteints de PR (RA) selon les critères

ACR (American Collège of Rheumatology, 1987) et 19 volontaires sains (HV) ont été inclus dans une étude visant à déterminer les profils d'expression génique dans le sang périphérique à l'aide de puces ADN U 133 A (Affymetrix, UK Ltd). Les indices cliniques et les marqueurs biologiques recueillis comprennent l'âge, le sexe, la durée de la maladie, le score de Larsen, le facteur rhumatoïde (RF), la protéine C réactive (CRP) et le nombre de DMARDs. Les patients ont été divisés en deux groupes en fonction du score de Larsen : PR destructive (score de Larsen >2), et PR non- destructive (score de Larsen <2). Sur la base du DAS 28 (modified disease activity score (DAS) 28 joint index), 31 patients PR furent évalués comme sévères (DAS 28 > 3,2) et 9 comme modérés (DAS28 ≤ 3,2). Tous les participants ont signé un consentement écrit. Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité Consultatif de Protection des Personnes dans la Recherche Biomédicale (CCPPRB).

B - Cytokines et anticorps Le TNFα recombinant humain utilisé provenait de Sigma- Aldrich (St Louis, MO) alors que les protéines recombinantes humaines IL-17A et IL-17F provenaient de R&D Systems (Mineapolis, MN). Les différents anticorps utilisés (anticorps monoclonal anti-IL17RA et anticorps polyclonaux anti-IL17RC) provenaient également de R&D Systems. Le récepteur soluble TNFRII (etanercept) était fourni par Wyeth (Louvain La Neuve, Belgique).

C - Culture cellulaire Les synoviocytes ont été obtenus à partir de tissus synoviaux issus de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (synoviocytes PR) ayant subi une chirurgie articulaire, ces patients répondant aux critères de l'ACR (American Collège of Rheumatology). Brièvement, les tissus synoviaux ont été coupés en petits fragments puis incubés durant 2h à 37 ⁰ C en présence d'un mélange d'enzymes

protéolytiques contenant de la collagénase et de la hyaluronidase (Sigma-Aldrich) à 1 mg/ml. Les cellules résultantes ont été cultivées (37 ⁰ C, 5% CO ₂ ) dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) supplémenté avec du sérum de veau fœtal (10% v/v), de la L- glutamine (2 mM) et un mélange d'antibiotiques (pénicilline et streptomycin 100 U/ml). Les différentes expériences ont été effectuées avec des synoviocytes rhumatoïdes de type fibroblastiques qui correspondent aux cellules cultivées pendant plus de 3 passages. D - ARN interférant (ARNi) Un mélange de quatre duplexes d'ARM (siGENOME SMARTPool siRNA) spécifiques de l'IL17RA (n° d'accès Genbank : NM_014339) et de FIL17RC (n° d'accès Genbank : NM_032732) ont été obtenu de Dharmacon (Lafayette, CO). Des expériences dose-effet ont été effectuées pour déterminer la plus faible quantité d'ARNi nécessaire pour une diminution significative des taux d'ARNm d'intérêt (0.5 et 0.05 μg pour les ARNi IL17RA et les ARNi IL17RC respectivement). Des synoviocytes PR ont été ensemencés à une densité cellulaire de 5 X 10 ⁵ par boite de pétri (60 mm). Les synoviocytes PR (70-80 % de confluence) ont été transfectées avec des ARNi contrôles (ARNi siCONTROL comme contrôle négatif et ARNi siGLO PPIB (Cyclophiline B) comme contrôle positif) ou avec des ARNi d'intérêt (ARNi SMARTPool IL17RA et/ou ARNi SMARTPool IL17RC) par électroporation (Amaxa, Cologne, Allemagne) selon les recommandations d'usage (réactifs Human Dermal Fibrobalst Nucleofector, programme U23). Dans un délai de 48h après la transfection, les synoviocytes PR ont été stimulées pendant 12h avec de TIL-17A ou de TIL-17F (50 ng/ml), seuls ou en combinaison avec du TNFα (0.5 ng/ml). L'IL-6 et l'IL-8 ont été quantifiés dans les surnageants de culture par ELISA. Les résultats de 3 expériences indépendantes effectuées avec les ARNi siGENOME SMARTPool ont été confirmés avec les nouveaux ARNi ON-TARGETplus SMARTPool reagents (Dharmacon) optimisés pour réduire les effets non spécifiques. E - Anticorps bloquants Des synoviocytes PR ensemencés sur plaque 96 puits (1X10 ⁴ cellules/puits) ont été pré-incubés (2h, 37 ⁰ C) avec les anticorps monoclonaux anti-IL17RA (10 μg/ml), seuls ou avec de l'étanercept (10 μg/ml). Les synoviocytes

PR ont ensuite été stimulés avec de TIL-17A ou de TIL-17F (50 ng/ml), seuls ou en combinaison avec du TNFα (0.5 ng/ml) pendant 36h.

F - ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) Des synoviocytes PR ensemencés sur plaque 96 puits (IXlO ⁴ cellules/puits) ont été stimulés avec de l'IL- 17A ou de TIL-17F (50 ng/ml), seuls ou en combinaison avec du TNFα (0.5 ng/ml) pendant 12, 24 ou 36h. L'IL-6 et l'IL-8 ont été quantifiés dans les surnageants de culture par ELISA en utilisant des réactifs de chez eBiosciences (San Diego, CA) et Diaclone (Besançon, France) respectivement. G - Transcription inverse et PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitative Après 2h de déprivation sérique, les synoviocytes PR ensemencés dans des plaques 6 puits (5X10 ⁵ cellules/puits) ont été stimulés pendant 1, 3, 6 ou 12h avec de TIL-17A ou de TIL-17F (50 ng/ml), seuls ou en combinaison avec du TNFα (0.5 ng/ml). Les ARN totaux ont été isolés par extraction TRIzol (Invitrogen Life Technologies) selon les instructions recommandées. Les acides nucléiques ont été quantifiés par spectrophotométrie à 260 nm (SmartSpec™ 3000, BIO-RAD, Hercules, CA). 1 μg d'acides nucléiques ont été utilisés pour la transcription inverse (ThermoScript™ RT- PCR System, Invitrogen Life Technologies). Brièvement, les ARN totaux ont été dénaturés (65 ⁰ C, 5 min) en présence d'amorces oligo(dT). La transcription inverse a ensuite été effectuée en présence de dNTPs (0.5 mM), de RNase OUT (40 U/μl), de dithiothreitol (0.01 M) et de transcriptase inverse (10 U/μl ; ThermoScript™) . Après 60 min d'incubation à 5O ⁰ C, la réaction a été stoppée (85 ⁰ C, 5 min) et les ADN complémentaires (ADNc) obtenus ont été dilués (1 :10) dans de l'eau distillée. Un volume de 10 μl de solution d'ADNc ont été utilisés par amplification. Les amorces spécifiques de l'IL-6, de l'IL-8/CXCL8, de la GAPDH et de HPRTl proviennent de Search-LC (Heidelberg, Allemagne) alors que les amorces spécifiques de l'IL17RA (n° d'accès Genbank : NM_014339) et de l'IL17RC (n° d'accès Genbank : NM_153461) ont été synthétisées par la compagnie Eurogentec (San Diego, CA). IL17RA sens : SEQ ID NoI 5'-AGACACTCCA GAACCAATTC C-3', IL17RA anti-sens : SEQ ID No2 5'-TCTTAGAGTT GCTCTCCACC A-3', IL17RC sens : SEQ IDNo3 5'-ACCAGAACCT CTGGCAAGC-3',IL17RC anti-sens : SEQ ID No4 5'-GAGCTGTTCA CCTGAACACA-3'. Les réactions

d'amplification ont été effectuées par Light Cycler (Roche Molecular Biochemicals, Meylan, France) avec les réactifs spécifiques (LightCycler FastStart DNA Sybr Green I kit, Roche Molecular Biochemicals). Un protocole standard d'amplification a été utilisé pour amplifier l'IL-6, l'IL-8/CXCL8, l'IL17RA, la GAPDH et HPRTl (45 cycles d'amplification : dénaturation à 96 ⁰ C, hybridation de 68 ⁰ C à 58 ⁰ C, amplification à 72 ⁰ C), alors que l'amplification des transcrits IL17RC a été effectué avec un protocole optimisé (45 cycles d'amplification : dénaturation à 99 ⁰ C, hybridation de 68 ⁰ C à 58 ⁰ C, amplification à 72 ⁰ C). Le nombre de copies d'ARNm d'intérêt a été normalisé par la GAPDH et de HPRTl. H - Western blotting. L'expression de TIL-17RA et de TIL-17RC a été mesurée par Western blot à l'aide d'anticorps murins dirigés contre TIL17RA humain et d'anticorps de chèvre dirigés contre TIL17RC humain (R & D Systems). La concentration protéique a été mesurée à l'aide d'un kit BCA. 80 μg de protéines totales ont été séparées sur gel SDS-polyacrylamide à 10% et transférés sur membrane Hybond-C extra de nitrocellulose (Millipore, Bedford, MA). Les membranes ont été incubées en série avec des anticorps dirigés contre l'actine (Chemicon, Hampshire, United Kingdom), TIL17RA et l'IL17RC. Les blots ont été scannés, les données densitométriques de TIL17RA et de TIL17RC ont été normalisées par l'actine et exprimées en unités arbitraires (AU) (logiciel Image Gauge, version 3.46).

I - Immunohistochimie. Des fragments de synoviale ont été fixés dans 10% de formaldéhyde. Après inclusion en paraffine, les échantillons ont été coupés en sections de 4 μm, montés sur lames, et déparaffinés (OTTIX Plus, DiaPath, Martinengo, Italy). Un démasquage antigénique a été effectué par incubation dans du tampon citrate (pH 6) pendant 40 minutes à 99 ⁰ C. L'activité péroxidase endogène a été bloquée avec du peroxyde d'hydrogène à 3% pendant 5 minutes avant une incubation d'une heure avec l'anticorps primaire : 10 μg/ml d'anticorps monoclonal murin anti-IL-17A (IgG2b), 10 μg/ml d'anticorps monoclonal murin anti-IL17RA (IgGl) ou 10 μg/ml d'anticorps polyclonal de chèvre anti-IL17RC. Sur les sections contrôles, les mêmes concentrations d'anticorps irrelevant ont été utilisées (IgG2b de souris, IgGl de souris ou sérum de chèvre respectivement). Après lavage, les

sections ont été incubées avec des anticorps biotinylés anti-souris ou anti-chèvre pendant 15 minutes, suivi d'une incubation avec de la streptavidine péroxidase pendant 15 minutes puis de la solution chromogène 3,3' diaminobenzidine (DAB) (DAKO, Glostrup, Denmark). Les sections ont ensuite été contre-colorées avec de l'hematoxylin de Mayer.

J - Puces ADN. 5 μg d'ARN provenant de sang périphérique total (31 patients PR et 19 volontaires sains) et 2 μg d'ARN obtenus à partir d'expériences effectuées sur des synoviocytes PR ont été analysés en utilisant des puces HG-U133A (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) (protocole de marquage IVT). La qualité des ARN a été étudiée à l'aide de puces RNA 6000 nano et du bioanalyser Agilent 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Les ARN totaux ont été utilisés pour préparer des ADNc double-brins contenant une séquence promotrice T7. Des ARNc ont été synthétisés et marqués avec des ribonucléotides biotinylés (GeneChip IVT Labeling Kit, Affymetrix). Des ARNc fragmentés ont été hybrides sur des puces HG-U 133 A (22,283 probe sets). Les puces ont été lavées et marquées à l'aide d'une station fluidique FS450 (Affymetrix) (protocole EukGE-WS2v4), puis scannées avec le scanner Agilent G2500A. Les analyses statistiques ont été générées à l'aide du logiciel d'analyse d' Affymetrix (MAS 5.0). Analyse statistique Les niveaux protéiques sont exprimés en moyenne ± SEM. Les taux d'ARNm d'intérêt ont été normalisés avec les taux d'ARNm GAPDH et les données ont été exprimées en induction par rapport aux situations contrôles non traitées. Les valeurs statistiques des différences ont été déterminées grâce au test de Dunnett et les différences résultant dans une valeur P < 0.05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

RESULTATS

A - Effets de VIL-17A et VIL-17F sur la sécrétion d'IL-6 par les synoviocytes issus de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR) Pour comparer l'effet de ITL- 17A et de l'IL-17F sur la sécrétion IL-6, des synoviocytes issus de patients atteints de PR (synoviocytes PR) ont été stimulés avec des concentrations croissantes d'IL- 17A ou d'IL-17F (de 0,1 a 100 ng/ml) et la sécrétion d'IL-6 a été mesurée dans les

surnageants de culture par ELISA. Après 48h de traitement, TIL-17F induisait de manière do se- dépendante la sécrétion IL-6 (figure IA). Les effets coopératifs de TIL-17A ou de TIL-17F avec le TNFα ont été étudiés. Des synoviocytes PR ont été stimulés pendant 48h avec de TIL-17A ou de TIL-17F (50 ng/ml), seuls ou en combinaison avec une concentration sub-optimale de TNFα (0,5 ng/ml), et la sécrétion d'IL-6 a été dosée par ELISA (figure IB). Les synoviocytes PR traités avec de l'IL-17A (50 ng/ml), de l'IL-17F (50 ng/ml) ou du TNFα (0.5 ng/ml), seuls, induisaient respectivement 5.9 ± 0.4, 2.5 ± 0.1 ou 13.6 ± 1.6 ng/ml d'IL-6. En présence de TNFα, la sécrétion d'IL-6 induite par TIL-17A ou TIL-17F était synergiquement augmentée (43.4 ± 1.6, P < 0.05 et 30.8 ± 13.7, P < 0.05). L'IL-17F induisait des taux comparables à TIL-17A en présence de TNFα.

B - Effets de VIL-17A et VIL-17F sur l'expression d'ARNm de l'IL-6 et IL-8 issus de patients atteints de PR. L'effet de ITL- 17A et de TIL-17F a été étudié sur des synoviocytes PR en analysant l'effet induit sur les taux d'ARNm IL-6 et IL-8 (Figure

2). Des synoviocytes PR ont été stimulés avec de TIL-17A ou de TIL-17F (50 ng/ml), seuls ou en combinaison avec du TNFα. Après 12h de traitement, les ARN totaux ont été extraits et les taux d'ARNm IL-6 et IL-8 ont été mesurés par PCR quantitative. L'IL-17A, TIL-17F ou le TNFα, seuls, augmentaient significativement les taux d'ARNm IL-6 (Facteur d'induction par rapport à la situation sans traitement : 15.8 ± 4.1, 2.7 ± 0.5 et 17 ± 2.8 respectivement, P < 0.05) (Figure 2A). En présence de TNFα, TIL-17A et TIL-17F augmentaient synergiquement les taux d'ARNm IL-6 (Facteur d'induction par rapport à la situation sans traitement : 175.9 ± 57.7 et 72,3 ± 30.7, respectivement, P < 0.05). Les inventeurs ont également comparé la capacité de TIL-17A et de TIL-17F à réguler l'expression de l'IL-8, une chimiokine impliquée dans le recrutement des neutrophiles. Après 12h de stimulation avec TIL-17F, les taux d'ARNm IL-8 étaient augmentés (Facteur d'induction par rapport à la situation sans traitement : 3.2 ± 0.4 pour l'IL-17F, 47.1 ± 21.7 pour l'IL-17A, P < 0.05) (Figure 2B). En présence de TNFα, les taux d'ARNm IL-8 induits par TIL-17F étaient comparables à ceux

induits par TIL-17A (Facteur d'induction par rapport à la situation sans traitement : 829 ± 358.1 pour IL- 17 A plus TNFα et 584,8 ± 275 pour IL- 17F plus TNFα, P > 0.05).

C - Effet du blocage des récepteurs IL-17RA et IL-17RC sur les sécrétions d'IL-6 et d'IL-8 induites par VIL-17A. Comme démontré par PCR quantitative, une expression basale des deux récepteurs a été observée dans les synoviocytes PR, avec des taux d'ARNm IL-17RA 35 fois plus élevés que les taux d'ARNm IL-17RC (P < 0.05). La contribution fonctionnelle de ces deux récepteurs aux effets biologiques de l'IL- 17A et de TIL-17F a ensuite été étudiée grâce à la technique d'ARN interfèrent (ARNi). La transfection de synoviocytes PR avec des ARNi IL- 17RA (0.5 μg) ou des ARNi IL- 17RC (0.05 μg) induisait, 24h après, une réduction moyenne de 80% des taux d'ARNm IL-17RA et de 62% des taux d'ARNm IL-17RC, respectivement (figure 3A). Les synoviocytes PR ont ensuite été stimulés avec du TNFα (0.5 ng/ml), de TIL-17A ou de TIL-17F (50 ng/ml) pendant 12h, 48h après la transfection avec les ARNi IL- 17RA, les ARNi IL- 17RC ou avec les ARNi utilisés comme contrôle négatif (siCONTROL). L'IL-6 a ensuite été dosé dans les surnageants par ELISA. Comme représenté sur la figure 3B, la transfection avec les ARNi IL- 17RA ou avec les ARNi IL- 17RC diminuait significativement la sécrétion d'IL-6 induite par l'IL- 17A (moyenne ± SEM après transfection avec les ARNi IL- 17RA ou les ARNi IL- 17RC comparé aux ARNi siCONTROL : 1.3 ± 0.2 ou 1.6 ± 0.3 comparé à 3 ± 0.9 respectivement, P < 0.05). L'implication spécifique des deux récepteurs dans les effets de TIL-17A a par ailleurs été supportée par l'absence d'effet significatif des ARNi IL-17RA ou des ARNi IL-17RC dans la sécrétion d'IL-6 induite par le TNFα (moyenne ± SEM après transfection avec les ARNi IL- 17RA ou les ARNi IL- 17RC comparé aux ARNi siCONTROL : 2.9 ± 0.7 et 2.7 ± 0.7 comparé à 2.5 ± 4 respectivement, P > 0.9).

D - Effet du blocage des récepteurs IL- 17RA et IL-17RC par des inhibiteurs (ARN interfèrent ou Anticorps spécifique) sur la sécrétion d'IL-6 induite par VIL-17A ou VIL- 17F, en présence de TNFa

Le TNFα, cytokine surexprimée au sein de la synoviale rhumatoïde, est impliquée dans la physiopathologie de la PR. L'analyse de la contribution des récepteurs IL- 17RA et IL- 17RC, dans un contexte inflammatoire modélisé in vitro par la présence d'IL-17A ou d'IL-17F (50 ng/ml) et de TNFα (0.5 ng/ml) a été étudié.

ARNi : Les synoviocytes PR ont été transfectés avec des ARNi IL- 17RA, ARNi IL- 17RC ou ARNi contrôle siCONTROL, puis stimulés avec de l' IL- 17 A ou de TIL-17F, seul ou en combinaison avec du TNFα pendant 36h.

La diminution de l'expression des récepteurs IL-17RA ou IL-17RC seuls n'avait pas d'effet significatif sur la sécrétion d'IL-6 induite par TIL-17A en présence de TNFα (moyenne ± SEM après transfection avec les ARNi IL- 17RA ou les ARNi IL- 17RC comparé aux ARNi siCONTROL : 33.6 ± 5.1 et 36.1 ± 4.1 comparé à 32.6 ± 6.6 ; P > 0.9), alors que la diminution simultanée de l'expression des récepteurs IL-17RA et IL-17RC induisait une réduction de 20% de l'IL-6 sécrété. Par ailleurs, la sécrétion d'IL-6 induite par TIL-17F en présence de TNFα ne variait pas significativement après transfection avec les ARNi IL- 17RA ou les ARNi IL- 17RC (moyenne ± SEM après transfection avec les ARNi IL- 17RA et les ARNi IL- 17RC comparé aux ARNi siCONTROL , 12.8 ± 4.2 et 11.3 ± 4.1 comparé à 16.9 ± 1.7 ; P > 0.9), alors que la cotransfection avec les ARNi spécifiques des deux récepteurs diminuait la sécrétion d'IL-6 (moyenne ± SEM après transfection avec les ARNi IL- 17RA et les ARNi IL-

17RC comparé aux ARNi siCONTROL 12.1 ± 0.5 comparé à 16.9 ± 1.7 ; P < 0.05).

Anticorps spécifiques : Les inventeurs ont comparé l'effet de l'inhibition des récepteurs IL- 17RA et IL- 17RC par ARN interfèrent à une approche de blocage extracellulaire au moyen d'anticorps spécifiques. Les inventeurs ont ainsi testé l'effet d'anticorps neutralisants dirigés contre les récepteurs IL-17RA et/ou IL-17RC. Ces anticorps ont été testés seuls ou en combinaison avec l'etanercept®, une forme soluble du récepteur de type II (p75) du TNFα couramment utilisée en clinique. Des synoviocytes PR ont été pré-incubés avec le(s) inhibiteur(s) pendant 2h puis stimulés

pendant 36h avec de TIL-17A ou de TIL-17F (50 ng/ml), seul ou en combinaison avec du TNFα (0.5 ng/ml).

Le dosage de l'IL-6, utilisé pour déterminer l'incidence des différents inhibiteurs, a permis de démontrer que le blocage de TIL-17RA ou de TIL-17RC par anticorps avait un effet significatif en présence de TIL-17A seul (moyenne ± SEM en présence d'anticorps anti-IL-17RA ou d'anticorps anti-IL-17RC comparé à la situation sans inhibiteurs : 2.0 ± 0.7 et 3.0 ± 1.1 comparé à 5.2 ± 1.8 ; P < 0.05), alors que leurs blocages étaient insuffisants pour diminuer significativement l'effet de TIL-17A en présence de TNFα (moyenne ± SEM en présence d'anticorps anti-IL-17RA ou d'anticorps anti-IL-17RC comparé à la situation sans inhibiteurs : 34.7 ± 6.8 et 40.6 ± 9.1 comparé à 37.6 ± 6.3 ; P > 0.9).

Les inventeurs ont démontré que le blocage des récepteurs IL- 17RA ou IL- 17RC diminuait la sécrétion d'IL-6 induite par TIL-17F en présence de TNFα. Finalement, la combinaison des deux anticorps, anti-IL-17RA et anti-IL-17RC diminuait de 33% la sécrétion d'IL-6 induite par TIL-17A en présence de TNFα (moyenne ± SEM en présence d'anticorps anti-IL-17RA et d'anticorps anti-IL-17RC comparé à la situation sans inhibiteurs : 25,3 ± 8,6 comparé à 37,6 ± 6,3 ; P < 0.05) et de 19% la sécrétion d'IL-6 induite par TIL-17F en présence de TNFα. Les inventeurs ont également observé un effet significatif de l'Etanercept® sur la sécrétion d'IL-6 induite par le TNFα seul ou en présence d'IL-17A ou d'IL-17F (moyenne ± SEM en présence d'Etanercept® comparé à la situation sans inhibiteurs : induit par le TNFα seul, 1.2 + 0.2 comparé à 5.4 ± 1.1, P < 0.05 ; induit par le TNFα plus l'IL-17A, 8,5 ± 4,0 comparé à 37,6 ± 1,1 P < 0.05 ; induit par le TNFα plus IL- 17F, 1.9 ± 0.5 comparé à 15.2 ± 4.3, P < 0.05). Enfin, le blocage simultané des récepteurs IL- 17RA ou IL- 17RC et du TNFα diminuait dramatiquement la sécrétion d'IL-6 induite par TIL-17A ou TIL-17F en présence de TNFα (Figure 4). E - L'IL17RA et TIL17RC sont surexprimés dans le sang périphérique total des patients PR.

Les inventeurs ont également examiné l'expression des ARNm codant TIL17RA et TIL17RC dans le sang périphérique au moyen de puces ADN (Figure 5A). Une augmentation significative de l'expression des ARNm codant TIL17RA et TIL17RC a été observée chez les patients PR (n = 40) par rapport aux volontaires sains (HV) (n = 19) (Médiane IL17RA : 262,5 versus 237,2 ; P < 0,005 et médiane IL17RC: 50,5 versus 44,3 ; P <0,0005).

L'expression de TIL17RA et de TIL17RC a également été analysée au niveau protéique par western blotting (Figure 5B). Comme au niveau des ARNm, on retrouve une expression significativement plus élevée de TIL17RA par rapport à FIL17R.C (Médiane IL17RA versus IL17RC au niveau ARNm (n=59) ou protéique (n=9) : 253.7 versus 48.24 ; P< 0.0001 or 22.77 versus 2.45; P< 0.0001 respectivement).

F- L'IL17RA et TIL17RC sont exprimés dans la membrane synoviale issue de patients atteints de PR.

Les inventeurs ont également analysé l'expression de TIL17RA et de TIL17RC par immunohistochimie dans la membrane synoviale issue de patients atteints de PR et d'arthrose (OA) et montré que les deux récepteurs été exprimé de manière diffuse et superposable dans la synoviale de PR (Figure 6A, B, C, D). Un marquage diffus similaire a été observé dans la synoviale d'OA (Figure 6E, F). Cette expression diffuse confirme l'expression de ces récepteurs, dans les cellules stromales et les cellules infiltrantes. Comme contrôle, les inventeurs ont analysé l'expression de

TIL17A, qui a été détectée dans les infiltrats lymphocytaires, au sein de cellules de morphologie plasmocytaire (Inset of Figure 6D).