Title:
Nukleinsäureamplifikation auf Basis von Kügelchenemulsion
Kind Code:
C5
Abstract:

Verfahren zum Anreichern eines Amplikons, umfassend:
(a) Verteilen einer Amplifikationslösung, die ein ausreichendes Gemisch von Reagentien, die zur Durchführung einer Amplifikationsreaktion der Templat-DNA erforderlich sind, eine Mehrzahl von Kügelchen und eine Mehrzahl von Arten von Templat-DNAs umfasst, in einer Mehrzahl von wässrigen Mikroemulsionströpfchen in einer wärmestabilen Ölphase, wobei ein erster Teilsatz der Tröpfchen ein Kügelchen und eine oder mehrere der Arten von Templat-DNAs darin eingekapselt umfasst, und ein zweiter Teilsatz der Tröpfchen ein Kügelchen ohne irgendeine der Arten von Templat-DNA darin eingekapselt umfasst,
(b) Amplifizieren der Arten von Templat-DNAs innerhalb des ersten Teilsatzes von Tröpfchen, wobei das Kügelchen innerhalb des ersten Teilsatzes von wässrigen Tröpfchen ein daran immobilisiertes Amplikon aufweist,
(c) Aufbrechen der wässrigen Emulsionströpfchen zum Freisetzen der Kügelchen des ersten und des zweiten Teilsatzes,
(d) Hybridisieren eines biotinylierten Primers an das Kügelchen-immobilisierte Amplikon, der zu dem 3'-Ende des Amplikons komplementär ist und in Schritt (e)...



Inventors:
Srinivasan, Maithreyan (Mountain View, CA 94043, US)
Chen, Yi-Ju (New Haven, CT 06510, US)
Weiner, Michael (Guilford, CT 06437, US)
Lefkowitz, Steven (Branford, CT 06405, US)
Lohman, Kenton (Guilford, CT 06437, US)
Sarkis, Gary J. (Guilford, CT 06437, US)
Leamon, John H. (Guilford, CT 06437, US)
Berka, Jan (Guilford, CT 06437, US)
Rothberg, Jonathan (Guilford, CT 06437, US)
Makhijani, Vinod (Branford, CT 06405, US)
Application Number:
DE602004036672T
Publication Date:
11/29/2012
Filing Date:
01/28/2004
Assignee:
454 Life Sciences Corporation (Conn., Branford, US)
Attorney, Agent or Firm:
Patentanwälte Isenbruck Bösl Hörschler LLP, 81675, München, DE
Claims:
1. Verfahren zum Anreichern eines Amplikons, umfassend:
(a) Verteilen einer Amplifikationsl?sung, die ein ausreichendes Gemisch von Reagentien, die zur Durchf?hrung einer Amplifikationsreaktion der Templat-DNA erforderlich sind, eine Mehrzahl von K?gelchen und eine Mehrzahl von Arten von Templat-DNAs umfasst, in einer Mehrzahl von w?ssrigen Mikroemulsionstr?pfchen in einer w?rmestabilen ?lphase, wobei ein erster Teilsatz der Tr?pfchen ein K?gelchen und eine oder mehrere der Arten von Templat-DNAs darin eingekapselt umfasst, und ein zweiter Teilsatz der Tr?pfchen ein K?gelchen ohne irgendeine der Arten von Templat-DNA darin eingekapselt umfasst,
(b) Amplifizieren der Arten von Templat-DNAs innerhalb des ersten Teilsatzes von Tr?pfchen, wobei das K?gelchen innerhalb des ersten Teilsatzes von w?ssrigen Tr?pfchen ein daran immobilisiertes Amplikon aufweist,
(c) Aufbrechen der w?ssrigen Emulsionstr?pfchen zum Freisetzen der K?gelchen des ersten und des zweiten Teilsatzes,
(d) Hybridisieren eines biotinylierten Primers an das K?gelchen-immobilisierte Amplikon, der zu dem 3'-Ende des Amplikons komplement?r ist und in Schritt (e) durch ein Streptavidin-beschichtetes K?gelchen zur Bildung eines Biotin-Streptavidin-Einfang-Ziel-Paars immobilisiert wird,
(e) Bilden eines Komplex aus Amplikon-immobilisierten K?gelchen und Anreicherungsk?gelchen, wobei das Streptavidin-beschichtete Anreicherungsk?gelchen, welches f?r die Anziehungskraft eines Magnetfeldes empf?nglich ist, und der hybridisierte biotinylierte Primer ein Biotin-Streptavidin-Einfang-Ziel-Paar bilden, und
(f) Anwenden eines Magnetfeldes zum Isolieren des K?gelchen-Komplexes mit einer Anreicherung von Amplikon-immobilisierten K?gelchen von solchen K?gelchen, die kein gebundenes Amplikon aufweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem in dem Schritt des Amplifizierens ein Polymerasekettenreaktion-Amplifizierungsprozess eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Rezyklieren und Wiederverwenders der K?gelchen des zweiten Teilsatzes umfasst.

4. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner das Verl?ngern des an das 3'-Ende des Amplikons hybridisierten biotinylierten Primers von Schritt (d) durch Zusetzen von DNA-Polymerase und der vier nat?rlichen Desoxynukleotid-Triphosphate (dNTPs) zu dem K?gelchengemisch umfasst, wobei die Verl?ngerung die Bindung zwischen dem biotinylierten Primer und dem K?gelchen-immobilisierten Amplikon verst?rkt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren ferner umfasst: Trennen des biotinylierten Primers von dem K?gelchen-immobilisierten Amplikon zum Trennen der Streptavidin-beschichteten Anreicherungsk?gelchen von dem Amplikon-immobilisierten K?gelchen.

Description:

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