Title:
Vorrichtungen zum Detektieren von Analyten
Kind Code:
U1


Abstract:

Testeinrichtung (100) zum Detektieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Analyts in einer flüssigen Probe, aufweisend:
eine Mobilisationszone (K) mit einem mobilisierbaren Ligand und einem mobilisierbaren Antikörper, wobei der mobilisierbare Antikörper spezifisch das Analyt und/oder den mobilisierbaren Ligand bindet;
eine Blockierzone (D), die stromabwärts von der Mobilisationszone angeordnet ist, wobei die Blockierzone einen immobilisierten Fallenrezeptor aufweist, der den mobilisierbaren Ligand bindet; und
eine Detektionszone (F), die stromabwärts von der Blockierzone angeordnet ist, wobei die Detektionszone einen immobilisierten Detektionsrezeptor aufweist, der den mobilisierbaren Antikörper bindet.




Application Number:
DE212008000023
Publication Date:
12/31/2009
Filing Date:
03/17/2008
Assignee:
Inverness Medical Switzerland GmbH (Zug, CH)
International Classes:



Foreign References:
42356011980-11-25
44422041984-04-10
52290731993-07-20
50285351991-07-02
50893911992-02-18
56275261997-05-06
51438521992-09-01
54807921996-01-02
54515041995-09-19
66997222004-03-02
Attorney, Agent or Firm:
HOFFMANN & EITLE (München, 81925)
Claims:
1. Testeinrichtung (100) zum Detektieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Analyts in einer flüssigen Probe, aufweisend:
eine Mobilisationszone (K) mit einem mobilisierbaren Ligand und einem mobilisierbaren Antikörper, wobei der mobilisierbare Antikörper spezifisch das Analyt und/oder den mobilisierbaren Ligand bindet;
eine Blockierzone (D), die stromabwärts von der Mobilisationszone angeordnet ist, wobei die Blockierzone einen immobilisierten Fallenrezeptor aufweist, der den mobilisierbaren Ligand bindet; und
eine Detektionszone (F), die stromabwärts von der Blockierzone angeordnet ist, wobei die Detektionszone einen immobilisierten Detektionsrezeptor aufweist, der den mobilisierbaren Antikörper bindet.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, wobei der mobilisierbare Antikörper angepasst ist, um durch die Probe kontaktiert zu werden, bevor der mobilisierbare Ligand von der Probe kontaktiert wird.

3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der mobilisierbare Ligand angepasst ist, um räumlich von dem mobilisierbaren Antikörper separiert zu werden, so dass die Probe den mobilisierbaren Antikörper vor dem Kontaktieren der mobilisierbaren Liganden kontaktiert.

4. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die eingerichtet ist, um ein Lateralflussstreifen-Format anzunehmen, das einen Fluss der flüssigen Probe über die Mobilisationszone, die Blockierzone und die Detektionszone unterstützt.

5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der mobilisierbare Ligand und der mobilisierbare Antikörper angepasst sind, um durch eine Lücke separiert zu sein.

6. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der mobilisierbare Ligand ein Element eines Bindungspaars umfasst, das unterschiedlich von dem Analyt ist, und wobei der immobilisierte Fallenrezeptor ein anderes Element des Bindungspaars umfasst.

7. Einrichtung nach Anspruch 6, wobei das Bindungspaar aus der Gruppe von Biotin und Avidin, Biotin und Streptoavidin und Rhodamin und Anti-Rhodamin ausgewählt ist.

8. Einrichtung nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Bindungspaar aus Biotin und Streptoavidin besteht.

9. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der mobilisierbare Ligand und der mobilisierbare Antikörper angepasst sind, um voneinander über einen vertikalen oder horizontalen Abstand separiert zu sein.

10. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der mobilisierbare Ligand und der mobilisierbare Antikörper angepasst sind, um voneinander über einen horizontalen Abstand separiert zu sein.

11. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der mobilisierbare Antikörper in einem trockenen Zustand vorliegt und in einem ersten saugfähigen Streifen enthalten ist, und der mobilisierbare Ligand in einem trockenen Zustand vorliegt und in einem zweiten saugfähigen Streifen enthalten ist; und wobei der erste Streifen von dem zweiten Streifen physikalisch separiert ist.

12. Einrichtung nach Anspruch 11, wobei die Blockierzone und Detektionszone auf dem zweiten saugfähigen Streifen stromabwärts von dem mobilisierbaren Ligand angeordnet sind.

13. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der mobilisierbare Antikörper und der mobilisierbare Ligand eine erste Bindungsaffinität aufzeigen und der Analyt und der mobilisierbare Antikörper eine zweite Bindungsaffinität aufzeigen, wobei die erste Bindungsaffinität höher als die zweite Affinitätskonstante ist.

14. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der mobilisierbare Antikörper ferner ein Farbpartikel aufweist.

15. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der mobilisierbare Ligand und mobilisierbare Antikörper so auf der Mobilisationszone eingerichtet sind, dass eine Kontaktzeit, während der die Probe den mobilisierbaren Antikörper kontaktiert, länger als eine Kontaktzeit ist, während der die Probe den mobilisierbaren Ligand kontaktiert.

16. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der mobilisierbare Antikörper eine detektierbare Markierung aufweist.

Description:
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Immuntests zum Detektieren eines Analyts in einer Probe werden in verschiedenen Gebieten weitreichend verwendet. Immuntests können verwendet werden, um Analyte in verschiedenen Proben (wie zum Beispiel Speichel, Blut, Urin, Serum und Schweiß) zu detektieren und bei einer Diagnose, Prognose und/oder Behandlung von Krankheiten zu helfen. Zum Beispiel werden Immuntests routinemäßig zum Anzeigen von Anzeichen von früher Schwangerschaft, dem Vorhandensein von Tumoren, infektiösen Krankheiten und Medikamentmissbrauch durchgeführt. Ein Immuntest wird bewirkt durch die spezifischen Verbindungsstellen, die zwischen Immunmolekülen, wie zum Beispiel Antigen/Antikörper, Hapten/Antikörper und Biotin/Antibiotin enthalten sind. Die meisten Immuntests werden auf einer Festkörperphase, wie zum Beispiel auf Lateralflussteststreifen, mehrfach porösen Scheiben aus Glas oder Kunststoff oder Immunchromatographieeinrichtungen durchgeführt.

Es gibt zwei herkömmliche Formate von Immuntests, nämlich der Sandwichtest und der Vergleichstest. In einem Vergleichsimmuntest konkurriert das Analyt mit einem markierten Analyt um sich mit Antikörpern zu verbinden. Dieses Format wurde herkömmlich verwendet, um kleine Analyte, wie zum Beispiel Hapten in einer Probe zu detektieren. Die verwendete Markierung kann eine sein, die ihr Vorliegen als ein Farbband in der Detektions- oder Ergebnis-Ablesezone anzeigt. Die Reagenze und Einrichtungen, die das Vergleichsprinzip verwenden, wurden im Detail in den US-Patenten Nr. 4,235,601, 4,442,204, 5,229,073 im Detail beschrieben. Für Einrichtungen, die Vergleichsprinzipien verwenden, wird, wenn sich die Farbe der Detektionszone nicht verändert oder wenn kein Farbband in der Detektionszone oder der Ergebnis-Ablesezone erscheint, ein positives Ergebnis indiziert und damit suggeriert, dass ein Analyt in der Probe vorliegen kann. Umgekehrt kann es als ein negatives Ergebnis interpretiert werden, wenn in der Detektionszone bereits eine Farbe vorhanden ist oder sich eine Ergebnis-Ablesezone verändert oder wenn ein Farbband erscheint, was ferner suggeriert, dass das Analyt in der Probe nicht vorliegen könnte.

Andere Einrichtungen, bei denen ein positives Ergebnis direkt angezeigt wird, wurden zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5,028,535, 5,089,391, 5,627,526, 5,143,852, 5,480,792 und 5,985,579 beschrieben. Wenn eine solche Einrichtung verwendet wird, um zum Beispiel Hapten zu detektieren, suggeriert die Farbe, die in der Testzone erscheint, ein positives Ergebnis, wenn das Analyt vorliegt oder wenn seine Konzentration höher als eine vorgesehene Schwelle ist. Umgekehrt suggeriert ein negatives Ergebnis, dass ein Analyt nicht vorliegen könnte oder dass die Analytkonzentration niedriger als eine vorgesehen Schwelle ist. Obwohl die oben genannten Einrichtungen und Verfahren verschiedene Analyte gleichzeitig detektieren können, gibt es immer noch viele Nachteile der zurzeit verfügbaren Einrichtungen. Zum Beispiel müssen Proben und mehrere Antikörper zum Binden von Analyten für etwa 10–15 Minuten in einen Probenschacht eingebracht werden, um zu reagieren, bevor sie auf die Nitrozellulose(NC)-Membran aufgetragen werden. Darüber hinaus muss die NC-Membran wiederholt gewaschen werden, bevor die Ergebnisse abgelesen werden. Daher sind solche Einrichtungen zeitaufwändig, unbequem zu benutzen und erfordern Mehrschrittreaktionen.

In US-Patent Nr. 5,451,504 ist ein Teststreifen offenbart, der drei spezifische Zonen aufweist, eine Mobilisationszone, eine Fallenzone und eine Detektionszone. Ein Antikörper, der an eine Farbmarkierung in der Mobilisationszone gebunden ist, kann sich mit einem Analyt verbinden, um einen Komplex (einen Farbmarkierungs-Antikörper-Analyt-Komplex) zu bilden. Der Komplex kann durch eine Flüssigkeit zu einer Fallenzone bewegt werden, wo ein Ligand immobilisiert ist. Der immobilisierte Ligand ist nicht dazu in der Lage, sich mit einem Antikörper zu verbinden, der bereits einen Komplex mit einem Analyt gebildet hat. Ein solcher Komplex ist stabil und kann nicht durch den immobilisierten Ligand beeinflusst werden. Der Ligand kann sich nur mit einem Antikörper verbinden, der frei fließend ist und nicht bereits an ein Analyt gebunden ist. Der Analyt-Antikörper-Komplex kann dann durch einen immobilisierten Detektionsrezeptor eingefangen werden, um ein direktes positives Ergebnis zu zeigen. Die Vorrichtung, die in diesem Patent beschrieben ist, erfordert jedoch, dass die Affinität zwischen dem Antikörper und dem Analyt höher ist als die Affinität zwischen dem Antikörper und dem Ligand. In der Praxis ist es sehr schwierig, den Antikörper mit diesen eingeschränkten Merkmalen auszuwählen, um ihn auf diese Erfindung anzuwenden.

In US 6,699,722 wird ein Teststreifen beschrieben, der aus einer Probenaufbringungszone, einer Mobilisationszone, einer ersten Einfangzone und einer zweiten Einfangzone besteht. In dieser Einrichtung sind diese Zonen entlang einem Verlaufsweg einer fließenden Flüssigkeit angeordnet, so dass die Flüssigkeit nacheinander durch jede Zone fließt. Die erste Einfangzone ist mit einem ersten Einfang-Antikörper beschichtet und die zweite Einfangzone ist mit einem zweiten Einfang-Antikörper beschichtet. Das Molekulargewicht eines markierten Analytanalogons ist schwerer als das Gewicht des Analyts in der Probe. Wenn ein Analyt in der Probe vorhanden ist, werden sich das markierte Analytanalogon und der Analyt dem Verlaufsweg der fließenden Flüssigkeit entlang folgend weiter bewegen, wobei sich der Analyt schneller bewegt als das Analytanalogon. Als Ergebnis wird der Analyt die erste Einfangzone früher erreichen als das markierte Analytanalogon. Der Analyt wird eingefangen und befestigt durch den ersten Einfang-Antikörper, bevor das markierte Analytanalogon die Einfangzone erreicht. Das markierte Analytanalogon wird weiter hinter die erste Einfangzone fließen und mit der zweiten Einfangzone mit einem zweiten Einfang-Antikörper in Kontakt kommen. Die Farbe in der zweiten Einfangzone wird sich dann als Folge des Verbindens des markierten Analytanalogons verändern und zeigt ferner ein positives Ergebnis an. In der Praxis ist ein solcher Teststreifen unbequem und die Ergebnisse von einem solchen Teststreifen sind nicht genau.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine Testeinrichtung zum Detektieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Analyts in einer Flüssigkeitsprobe zur Verfügung. Die Testeinrichtung weist typischerweise eine Mobilisationszone mit einem mobilisierbaren Ligand und einem mobilisierbaren Antikörper, wobei sich der mobilisierbare Antikörper spezifisch mit dem Analyt und/oder dem mobilisierbaren Ligand verbindet, eine Blockierzone, die stromabwärts von der Mobilisationszone angeordnet ist, wobei die Blockierzone einen immobilisierten Fallenrezeptor aufweist, der sich mit dem mobilisierbaren Ligand verbindet, und eine Detektionszone auf, die stromabwärts von der Blockierzone angeordnet ist, wobei die Detektionszone einen immobilisierten Detektionsrezeptor aufweist, der sich mit dem mobilisierbaren Antikörper verbindet. In einer Ausführungsform ist der mobilisierbare Antikörper angepasst, um durch die Probe kontaktiert zu werden, bevor der mobilisierbare Ligand durch die Probe kontaktiert wird. In einer anderen Ausführungsform ist der mobilisierbare Ligand angepasst, um räumlich von dem mobilisierbaren Antikörper separiert zu sein, so dass die Probe den mobilisierbaren Antikörper kontaktiert, bevor sie die mobilisierbaren Liganden kontaktiert. Wo gewünscht, kann die beanspruchte Einrichtung eingerichtet sein, um ein Lateralflussstreifen-Format anzunehmen, das einen Fluss der Flüssigkeitsprobe über die Mobilisationszone, die Blockierzone und die Detektionszone hinweg unterstützt. In einigen Ausführungsformen sind der mobilisierbare Ligand und der mobilisierbare Antikörper angepasst, um durch eine Lücke separiert zu sein. In einigen Ausführungsformen sind der mobilisierbare Ligand und der mobilisierbare Antikörper angepasst, um über eine vertikale oder horizontale Entfernung voneinander separiert zu sein. In anderen Ausführungsformen weist der mobilisierbare Ligand ein Element eines Bindungspaars auf, das von dem Analyt unterschiedlich ist und wobei der immobilisierte Fallenrezeptor ein anderes Element des Bindungspaars aufweist. Das Bindungspaar kann aus der Gruppe aus Biotin und Avidin, Biotin und Streptoavidin und Rhodamin und Anti-Rhodamin ausgewählt sein. In noch anderen Ausführungsformen existiert der mobilisierbare Antikörper in einem trockenen Zustand und wird in einem ersten saugfähigen Streifen aufgenommen, und der mobilisierbare Ligand existiert in einem trockenen Zustand und wird in einem zweiten saugfähigen Streifen aufgenommen; und wobei der erste Streifen physikalisch von dem zweiten Streifen separiert ist. In noch anderen Ausführungsformen sind die Blockierzone und die Detektionszone auf dem zweiten saugfähigen Streifen angeordnet, stromabwärts von dem mobilisierbaren Ligand.

In einigen Ausführungsformen weisen der mobilisierbare Antikörper und der mobilisierbare Ligand eine erste Bindungsaffinität auf und der Analyt und der mobilisierbare Antikörper weisen eine zweite Bindungsaffinität auf, wobei die erste Bindungsaffinität höher als die zweite Affinitätskonstante ist. Der mobilisierbare Antikörper kann ferner ein Farbpartikel aufweisen. In einigen anderen Ausführungsformen sind der mobilisierbare Ligand und der mobilisierbare Antikörper so auf der Mobilisationszone eingerichtet, dass eine Kontaktzeit, während der die Probe den mobilisierbaren Antikörper kontaktiert, länger ist als eine Kontaktzeit, während der die Probe den mobilisierbaren Liganden kontaktiert. Wo gewünscht, umfasst der mobilisierbare Antikörper eine detektierbare Markierung.

Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Verwendung der betreffenden Einrichtung zur Verfügung. In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Analyts in einer Flüssigkeitsprobe durch Kontaktieren der Flüssigkeitsprobe mit einer betreffenden Testeinrichtung (irgendeiner von denen, die hierin beschrieben werden) zur Verfügung, um ein Detektieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von diesem Analyt zu bewirken. In einer Ausführungsform verfährt das betreffende Verfahren weiter mit einem Kontaktieren der Flüssigkeitsprobe mit einem mobilisierbaren Antikörper auf der Testeinrichtung, um eine erste Mischung zu bilden, gefolgt von einem Kontaktieren der ersten Mischung mit dem mobilisierbaren Ligand, um eine zweite Mischung zu bilden, wobei die zweite Mischung ferner einen Kontakt mit der Blockierzone herstellt.

EINBINDUNG DURCH BEZUGNAHME

Alle Publikationen, Patente und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung genannt sind, werden hierein durch Bezugnahme in gleichem Ausmaß eingebunden, wie wenn jede einzelne Publikation, jedes Patent oder jede Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch Bezugnahme eingefügt angezeigt würde.

KURZE FIGURENBESCHREIBUNG

Die neuen Merkmale der Erfindung werden mit Genauigkeit in den beigefügten Ansprüchen dargelegt. Ein besseres Verständnis der Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung wird durch Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung, die illustrative Ausführungsformen darlegt, in denen die Prinzipien der Erfindung verwendet werden, und auf die begleitenden Zeichnungen erhalten, von denen:

1 eine Illustration eines Teststreifens der Einrichtung ist.

2A & 2B einen Teststreifen der Einrichtung illustrieren, umfassend zwei Streifen, die um eine vertikale Entfernung separiert sind.

3A & 3B eine alternative Ausführungsform eines Teststreifens mit zwei um einen horizontalen Abstand separierten Abschnitten illustriert.

4 eine Einrichtung illustriert, die ein Gehäuse für den Teststreifen aufweist.

5A5F die Ergebnisse illustrieren, die durch die Einrichtung beim Detektieren von verschiedenen Analyten angezeigt werden.

DETAILBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die beschriebenen Einrichtungen und Verfahren sind angepasst und eingerichtet, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von einem Analyt durch direktes zur Verfügung Stellen eines positiven oder negativen Ergebnisses zu detektieren. Typischerweise ist eine Testeinrichtung ein Teststreifen mit einer Mobilisationszone K, einer Blockierzone D und einer Detektionszone F, wie zum Beispiel in 1 gezeigt ist. Die Mobilisationszone weist einen mobilisierbaren Ligand und einen mobilisierbaren Antikörper zum spezifischen Binden an entweder einen Zielanalyt oder den mobilisierbaren Ligand auf. Ein Fallenrezeptor zum Einfangen des mobilisierbaren Liganden liegt in der Blockierzone D vor. Typischerweise kann der Fallenrezeptor die Liganden einfangen, aber nicht direkt irgendeinen Analyt-Verbindungs-Antikörper einfangen. Die Detektionszone der Einrichtung weist ferner einen immobilisierten Detektionsrezeptor auf, der sich mit dem mobilisierbaren Antikörper, zum Beispiel nachdem der Antikörper in einer Lösung gelöst wurde, verbinden kann. In einigen Ausführungsformen weist der Teststreifen ein saugfähiges Material auf, um eine Flüssigkeitsprobe, die darauf fließt, zu tragen. Ein saugfähiges Material bezieht sich auf diejenigen Materialien, die ein Fluid stabil absorbieren können und das Fluid dazu bringen, durch Kapillarkräfte durch das Material zu gelangen. In einigen Ausführungsformen kann ein saugfähiges Material ein Material sein, das die Bewegung und den Transport von Fluiden entlang seiner Länge unterstützt. In einer anderen Ausführungsform ist das saugfähige Material ein Material, um eine Fluidbewegung durch die Einrichtung über Kapillarkräfte anzutreiben. Der Teststreifen kann einen einzigen Typ von saugfähigem Material aufweisen, auf dem die Antikörper und Liganden angeordnet sind. Alternativ kann der Teststreifen aus mehreren Arten von saugfähigen Materialien aufgebaut sein, die gegenseitig mit einer Fluidprobe zusammenwirken können. Saugfähige Materialien enthalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Nitrozellulose, Filterpapier, Glasfaser, Polyester. Zusätzlich enthält die saugfähige feste Phase in einigen Ausführungsformen ferner andere geeignete Reagenzien, um den Test auf der Einrichtung durchzuführen. Nur als Beispiel kann die feste Phase ferner eine Pufferlösung enthalten, um den pH-Wert einzustellen.

Der Teststreifen der Testeinrichtung weist ferner eine Probenauftragungszone A zum Aufnehmen der Probe auf. Die Auftragungszone A ist stromaufwärts einer Blockierzone D, einer Absorptionszone H zum Absorbieren der Probe, nachdem sie durch den Teststreifen gelangt ist, und einer Testkontrollzone G angeordnet. Die Testkontrollzone weist eine Menge von Reagenz auf, um zu bestimmen, ob die Probe genügend Zeit hatte, um über die Detektionszone zu gelangen, oder ob genug Zeit verstrichen ist, um den Test zu vervollständigen. Wenn die Testeinrichtung verwendet wird, sind eine Menge Antikörper, die sich spezifisch an entweder ein Zielanalyt oder eine Menge Liganden binden, auf der Analytbindungszone der Mobilisationszone enthalten. Die Antikörper können in einem trockenen Zustand sein. Die Mobilisationszone hat ferner eine Menge von Liganden, die in der Regulationszone der Mobilisationszone angeordnet sind. Die Liganden sind stromabwärts von den Analyt-Bindungs-Antikörpern angeordnet.

Die Antikörper und Liganden können durch die Probe aufgelöst werden. In ihrem aufgelösten Zustand bewegen sich die Antikörper und Liganden durch die Zonen der Testeinrichtung mit der Probe, wenn die Probe durch die entsprechenden Zonen gelangt. In einigen Ausführungsformen kontaktiert eine Probe in der Testeinrichtung zuerst die Antikörper, die in der Antikörper-Bindezone der Mobilisationszone angeordnet sind. Die Antikörper werden in der Probe aufgelöst und kommen in Kontakt mit dem Analyt in der Probe. Die Probe bleibt über einen Zeitraum in Kontakt mit den Antikörpern in der Antikörper-Bindungszone. Der Zeitraum ist ausreichend, um eine erste Flüssigkeitsmischung zu bilden, die aus dem Analyt, der an Antikörper gebunden ist, oder einem Analyt-Antikörper-Komplex besteht. In einigen Ausführungsformen sind alle der Analyt-Bindungs-Antikörper in der Probe aufgelöst. In einigen Ausführungsformen ist zumindest ein Teil der Analyt-Bindungs-Antikörper in der Probe aufgelöst. Die erste Flüssigkeitsmischung gelangt dann zu der Regulationszone, die nachfolgend an die Analyt-Bindungszone angeordnet ist, wo die erste Flüssigkeitsmischung in Kontakt mit den Liganden kommt, die in der Regulationszone angeordnet sind. Die Liganden werden dann durch die erste Flüssigkeitsmischung aufgelöst, wodurch ferner eine zweite Flüssigkeitsmischung gebildet wird. In einigen Ausführungsformen enthält die Probe gar kein Zielanalyt. In einer solchen Ausführungsform können die mobilisierten Antikörper, die in der ersten Mischung getragen werden, durch die mobilen Liganden gebunden werden, die in der zweiten Flüssigkeitsmischung gelöst sind, um Antikörper-Liganden-Komplexe zu bilden. Diese Antikörper-Liganden-Komplexe können dann durch eine Menge von Fallenrezeptoren eingefangen werden, die in der Blockierzone angeordnet sind. Die Fallenrezeptoren sind Liganden, die in der Blockierzone angeordnet sind, die spezifische Bindungspositionen zur direkten Bindung der mobilisierten Liganden aufweisen. Die Fallenrezeptoren sind auf der Blockierzone immobilisiert, die stromabwärts der Mobilisationszone angeordnet ist. Weil die Antikörper-Liganden-Komplexe durch die Fallenrezeptoren gebunden sind, gelangen die mobilisierten Antikörper im Allgemeinen nicht durch die Blockierzone. Typischerweise werden alle ungebundenen Liganden, die in der zweiten Flüssigkeitsmischung gelöst sind, nachfolgend durch die Fallenrezeptoren auf der Blockierzone ebenfalls gebunden werden.

Wenn ein Analyt oder eine Menge von Analyt in der Probe vorhanden ist, kann zumindest ein Teil des Analyts durch die mobilisierbaren Antikörper auf der Analyt-Bindungszone gebunden werden. Wenn vorhanden, bilden die Analyte typischerweise einen ersten Komplex, einen Antikörper-Analyt-Komplex, um eine erste Flüssigkeitsmischung zu erzeugen. In einigen Ausführungsformen wird nur ein Teil der Analyt-Bindungs-Antikörper durch das Zielanalyt gebunden. In einer solchen Ausführungsform können die Antikörper, die in der ersten Flüssigkeitsmischung gelöst sind, aber die nicht an ein Analyt gebunden verbleiben, dann durch die Liganden gebunden werden, die in der Regulationszone angeordnet sind. Wenn die erste Flüssigkeitsmischung die Liganden kontaktiert, die stromabwärts von der Antikörper-Bindungszone angeordnet sind, wird eine zweite Mischung gebildet. Die zweite Mischung enthält typischerweise erste Antikörper-Analyt-Komplexe und die Liganden, die durch die erste Flüssigkeitsmischung gelöst sind.

In einigen Ausführungsformen bleiben alle der Antikörper-Analyt-Komplexe durch die gelösten Liganden ungestört. In einigen Ausführungsformen werden einige der gelösten Liganden mit dem an die Bindungsstellen auf den Antikörpern des ersten Komplexes zu bindenden Analyt konkurrieren. In einem solchen Fall kann die erste Flüssigkeitsmischung sowohl Analyt-Antikörper-Komplexe als auch Antikörper-Ligand-Komplexe enthalten. Die zweite Mischung kommt dann in Kontakt mit der Blockierzone. Die Blockierzone enthält typischerweise eine Menge von immobilisierten Fallenrezeptoren. Die Fallenrezeptoren können sich entweder an den Ligand-Antikörper-Komplex, wenn ein Teil der Antikörper durch die Analyte ungebunden ist, oder an ungebundene Liganden binden, wenn nur ein Teil der Liganden an die mobilisierten Antikörper gebunden ist. Die Fallenrezeptoren fangen typischerweise nicht die Antikörper-Analytkomplexe ein.

Die Probe gelangt dann zu der Detektionszone, die stromabwärts von der Blockierzone angeordnet ist. Die Analyt-Antikörper-Komplexe können in einigen Ausführungsformen durch eine Menge von Detektionsmolekülen eingefangen werden, die auf der Detektionszone der Testeinrichtung immobilisiert sind, wenn die zweite Flüssigkeitsmischung an der Detektionszone eintrifft. Die Detektionszone weist eine Menge von immobilisierten Rezeptoren zum spezifischen Binden der Analyt-Bindungs-Antikörper auf. Die Rezeptoren sind typischerweise Antikörper. In einigen Ausführungsformen sind die Analyt-Bindungs-Antikörper mit einer entfernbaren Markierung konjugiert. Das Bestimmen der Menge von entfernbaren Markierungen korreliert zu der Menge der Analyte in der Testprobe. Typischerweise sind die entfernbaren Markierungen Farbpartikel. Die Menge des Analyts kann dann direkt durch Bestimmen mit dem bloßen Auge durch Detektieren der Farbpartikel, die auf der Detektionszone eingefangen sind, bestimmt werden.

Wenn die zweite Flüssigkeitsmischung in Kontakt mit der Detektionszone kommt, werden spezifische Bindungsstellen an dem Antikörper typischerweise freigelegt, wenn sie in der Probe aufgelöst sind. Die freigelegten Bindungsstellen der Antikörper sind typischerweise durch das Analyt erkennbar, um eine Reaktion in einem wesentlich kurzen Zeitraum zu ermöglichen. Die zweite Flüssigkeitsmischung enthält die Liganden, die in der Probe aufgelöst sind. In einigen Ausführungsformen konkurrieren die Liganden, die in der Probe aufgelöst sind, mit dem Analyt für die Antikörper, die bereits einen Komplex mit dem Analyt gebildet haben. Alternativ können sich die Liganden direkt mit jedem ungebundenen Analyt-Bindungs-Antikörper verbinden, da die Verbindungsstellen der Liganden auch freigelegt sind, wenn die Liganden in der ersten Mischung gelöst sind. Ferner wird der Ligand in einigen anderen Ausführungsformen direkt oder indirekt mit einem Mitglied eines Bindungspaars von spezifischen Molekülen, die nicht auf den Analyt-Bindungs-Antikörper bezogen sind, angeschlossen, verbunden oder konjugiert. In einer solchen Ausführungsform werden einige der Bindungsstellen der Liganden durch ein Mitglied des Paars bedeckt. Diese Konfiguration reduziert die Konkurrenz um die Bindungsstelle an den Antikörpern in dem Antikörper-Analyt-Komplex zwischen dem Ligand und dem Analyt. In einigen Ausführungsformen weist der Ligand einen Abschnitt eines Konjugats auf, das Biotin enthält. Der Ligand bildet ferner ein Biotin/Avidin-Konjugat, wobei das Avidin auf der Blockierzone zum Einfangen der zweiten Komplexe (Antikörper-Ligand-Biotin) immobilisiert ist, wenn die zweite Mischung durch die Blockierzone gelangt. In noch einer anderen Ausführungsform sind die Liganden ein Teil eines Konjugats mit einem Partner eines Paars spezifischer Verbindungsmoleküle, die mit einem Protein konjugiert sind.

In modernen Tests für kleine Moleküle, besonders für die Detektion von Medikamentenmissbrauch, sollte die niedrigste Konzentration oder der Grenzwert verändert werden, um Medikamente Missbrauchende von Patienten zu unterscheiden, die eine normale medizinische Behandlung durchlaufen. Wenn zum Beispiel das Blut eines Patienten auf das Vorhandensein eines Analyts analysiert wird, kann das Blut des Patienten eine Konzentration eines Analyts enthalten, die höher ist als der Standardgrenzwert. Wenn die Konzentration des Zielanalyts in einer Probe höher als der Standardgrenzwert ist, muss das nicht notwendigerweise bedeuten, dass der Patient ein Drogenkonsument ist. Der Patient kann einfach eine höhere Konzentration eines Analyts haben, einfach aufgrund der Tatsache, dass er/sie den Analyt als Teil einer Behandlung einnimmt. In einer solchen Situation kann die Konzentration des Analyts durch die Einrichtung nicht detektiert und mit dem Standardniveau des Analyts in der allgemeinen Bevölkerung verglichen werden. Es wäre genauer, eine Einrichtung mit einem erhöhten Grenzwert zu verwenden, um einen möglichen Drogenkonsumenten zu identifizieren. In einigen Ausführungsformen weist die Einrichtung einen Analyt-Bindungs-Antikörper auf, der in der Mobilisationszone angeordnet ist, wobei der Antikörper eine niedrigere Affinität K1 zum Binden an ein Zielanalyt als seine Affinität K2 zum Binden an den Liganden aufweist. Wenn K1 niedriger als K2 ist, wird eine höhere Konzentration von Analyt benötigt, um mit dem mobilisierbaren Liganden um die Verbindungsstellen zu konkurrieren, die an dem mobilisierbaren Antikörper in der zweiten Flüssigkeitsmischung angeordnet sind. Daher kann ein korrektes negatives Ergebnis, nicht ein falsches positives Ergebnis als Ergebnis auf der Detektionszone entstehen, selbst wenn die Analytkonzentration höher ist als ein Standardniveau in dem Körperfluid des Patienten. Ein Antikörper mit einer Affinität von K1, die niedriger als oder gleich K2 ist, wird typischerweise verwendet.

Der Antikörper zum spezifischen Binden eines Analyts und der Ligand können beide in einer trockenen Phase vorliegen, bevor sie mit der Flüssigkeitsprobe in Kontakt treten. Alternativ kann der Antikörper in der flüssigen Phase sein, bevor er durch eine Probe kontaktiert wird. Der Antikörper und Ligand sind typischerweise auf dem einzigen Streifen der Testeinrichtung in dem trockenen Zustand enthalten. Wenn eine Flüssigkeitsprobe sich durch die Mobilisationszone bewegt, können die Antikörper und Liganden in der Flüssigkeitsprobe aufgelöst und davon getragen werden.

Der mobilisierbare Antikörper, der spezifisch dazu geeignet ist, sich an einen Analyt zu binden, kann mit einer erkennbaren Markierung konjugiert werden. Die Markierung kann ausgewählt werden aus einem Enzym, einem nicht wasserlöslichen Partikel, einem kolloidalen Goldpartikel, einem Latexpartikel oder einer Kombination davon, ohne darauf beschränkt zu sein. In einigen Ausführungsformen ist die Markierung eine wasserlösliche Substanz oder eine fluoreszierende Substanz. Die Markierung kann jede Markierung sein, die zum Markieren des Antikörpers geeignet ist.

Die Testeinrichtung kann verwendet werden, um einen Analyt unter Verwendung des Vergleichsprinzips zu detektieren, das in Immuntests verwendet wird, um das Vorliegen oder die Abwesenheit eines Zielanalyts in einer Probe durch Anzeigen eines direkten positiven oder negativen Ergebnisses aufzuzeigen. Insbesondere kann die betreffende Einrichtung elektronische Leseeinrichtungen aufweisen, die optische Signale detektieren, die in einem Immuntest erzeugt werden.

I. Einrichtungen

1 zeigt eine Ausführungsform der Testeinrichtung. Die gezeigte Testeinrichtung weist einen Teststreifen 100 mit einer Probenaufnahmezone A, einer Analyt-Bindungszone B, die typischerweise eine Menge von Antikörpern und Farbmarkierungen enthält, einer Regulationszone C mit einer Menge von Liganden als einem Teil von Konjugaten, die mit Biotin konjugiert sind, und eine Nitrozellulosemembran E auf. Die Nitrozellulosemembran umfasst ferner eine Blockierzone D mit einer Menge von immobilisiertem Avidin, eine Detektionszone F und eine Ergebniskontrollzone G. Typischweise ist eine Absorptionszone H zum Absorbieren der Flüssigkeit, die von der Mobilisationszone K zu der Kontrollzone G gelangt ist, vorhanden. Die Mobilisationszone K umschließt sowohl die Analyt-Bindungszone B als auch die Regulationszone C. Die Analyte und Liganden auf der Analyt-Bindungszone bzw. Regulationszone können durch die Probe gelöst und entlang dem Teststreifen getragen werden.

Die Probenaufnahmezone A ist typischerweise stromaufwärts von der Mobilisationszone angeordnet. Die Probenaufnahmezone A kann zusätzlich mit chemischen Reagenzien behandelt sein, welche die Reaktionsbedingungen zwischen dem Analyt und dem Antikörper verbessern oder regulieren können. Die verwendeten chemischen Reagenzien enthalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, reaktive pH-Werte, ionische Konzentrationen, Entfernung von einigen interferierenden Substanzen in den Proben oder irgendein anderes geeignetes chemisches Reagens oder irgendeine Kombination davon, die im Stand der Technik bekannt ist. Die Absorptionszone H ist typischerweise stromabwärts von der Detektionszone angeordnet, um den Flüssigkeitsfluss zu erleichtern und zu verbessern. Geeignete Materialien für die Absorptionszone enthalten, dürfen aber nicht darauf beschränkt sein, Filterpapier oder irgendein anderes Absorptionsmaterial.

Die Mobilisationszone K umfasst eine Menge Antikörper zum Binden an entweder ein Zielanalyt oder eine Menge Ligand. Die Antikörper sind in einem trockenen Zustand in der Mobilisationszone enthalten. Die Mobilisationszone enthält ferner stromabwärts von den Analyt-Bindungs-Antikörpern eine Menge von Liganden darauf. Die Antikörper und Liganden können in der Probe aufgelöst und davon bewegt werden, wenn die Probe durch die entsprechenden Zonen gelangt. Eine Menge Ligand kann auf der Regulationszone C enthalten sein, die stromabwärts von der Analyt-Bindungszone B angeordnet ist.

Zusätzlich kann eine Menge Antikörper zum besonderen Binden des Analyts in einem trockenen Zustand auf der Analyt-Bindungszone B enthalten sein. Eine Flüssigkeitsprobe wird typischerweise auf den Streifen 100 aufgetragen. Die Probe gelangt dann über einen Zeitraum in Kontakt mit dem Analyt-Bindungs-Antikörper, der auf der Analyt-Bindungszone B angeordnet ist. Die Probe gelangt dann über einen Zeitraum in Kontakt mit den Liganden auf der Regulationszone C, der kürzer ist als der Zeitraum, über den die Probe in Kontakt mit der Analyt-Bindungszone B war. Der Analyt und die Analyt-Bindungs-Antikörper bilden eine erste Mischung in der Antikörper-Bindungszone, die in der Antikörper-Bindungszone über einen Zeitraum gehalten werden kann, bevor die Liganden kontaktiert werden, die stromabwärts von den Analyt-Bindungs-Antikörpern angeordnet sind. Die Zeit, in der die erste Mischung typischerweise den Analyt-Bindungs-Antikörper kontaktiert, ist länger als die Zeit, in der die zweite Mischung den mobilisierten Liganden kontaktiert. In einigen Ausführungsformen ist die Zeit, in der die erste Mischung den Analyt-Bindungs-Antikörper kontaktiert, zwischen etwa einer Sekunde und etwa sechzig Sekunden. In einigen Ausführungsformen ist die Zeit zwischen etwa 10 Sekunden und etwa 30 Sekunden. In einigen Ausführungsformen ist der Zeitraum länger als 60 Sekunden.

Der Teststreifen enthält typischerweise ferner eine Analyt-Bindungszone B und eine Regulationszone C mit einer Lücke 102, welche die Analyt-Bindungszone B und die Regulationszone C separiert. Die Lücke 102 weist typischerweise ein saugfähiges Material auf. In einigen Ausführungsformen der Einrichtung, die hierin beschrieben ist, ist mehr als eine Lücke vorhanden. Eine Lücke kann zwischen der Regulationszone und der Blockierzone auf dem Teststreifen angeordnet sein. In einer solchen Ausführungsform ist die zweite Lücke kürzer als die erste Lücke. Daher ist der Zeitraum, in dem die Flüssigkeitsprobe zum Reagieren mit den Analyt-Bindungs-Antikörpern die Analyt-Bindungszone kontaktiert, länger als der Zeitraum, in dem die Probe die Liganden kontaktiert. Die Bindung zwischen dem Analyt-Bindungs-Antikörper und dem Analyt in der Flüssigkeitsprobe ist wegen der verschiedenen Zeitdauer vollständiger als die Bindung zwischen dem Liganden und den Analyt-Antikörpern in der zweiten Flüssigkeitsmischung.

In einem anderen Aspekt der hierin beschriebenen Einrichtung ist ein vertikaler Abstand zwischen dem Antikörper und dem Ligand vorhanden, wie in 2A gezeigt ist. In einer solchen Ausführungsform ist die Analyt-Bindungszone 201 auf einem ersten Stück von saugfähigem Streifen 20 angeordnet und die Regulationszone 203 ist auf einem zweiten saugfähigen Streifen 21 angeordnet. Eine Lücke 202 besteht zwischen den zwei Streifen 20, 21. Der erste Streifen 20 ist typischerweise oberhalb und physikalisch von dem zweiten Streifen 21 separiert angeordnet. Der erste Streifen kann relativ zu dem zweiten Streifen in jeder geeigneten Position angeordnet sein, solang der erste und zweite Streifen voneinander physikalisch separiert sind. Eine Probe wird an der Probenauftragungszone 200, die auf dem ersten Streifen 20 angeordnet ist, auf die Einrichtung aufgetragen. Die Probe kontaktiert den ersten Streifen 20 und löst die Analyt-Bindungs-Antikörper in der Analyt-Bindungszone 201 in eine flüssige Phase auf, um eine erste Analyt-Antikörpermischung zu bilden. Die Mischung kann in der Analyt-Bindungszone über einen Zeitraum gehalten werden. Der erste Streifen 20 wird dann neben und in Fluidverbindung mit den zweiten Streifen 21 positioniert, wie in 2B gezeigt ist. Die Probe fließt von dem ersten Streifen 20 zu dem zweiten Streifen 21 durch die Analyt-Bindungszone 201 zu der Regulationszone 203, wenn der erste Streifen 20 in Kontakt mit dem zweiten Streifen 21 ist. Nachdem sich der Kontakt zwischen dem ersten und zweiten Streifen 20, 21 einstellt, gelangt die Analyt-Antikörpermischung in Kontakt mit der Regulationszone 203, die auf dem zweiten Streifen 21 angeordnet ist. Die Antikörper-Analytmischung löst ferner die Liganden, die in der Regulationszone 203 enthalten sind, um eine zweite Mischung zu bilden. Die zweite Mischung wird typischerweise in einem Zeitraum gebildet, der kürzer ist als der Zeitraum, in dem die erste Mischung gebildet wurde.

Eine Blockierzone 204 ist typischerweise stromabwärts von der Regulationszone 203 in der Detektionseinrichtung angeordnet. Die zweite Flüssigkeitsmischung in der Regulationszone fließt dann entlang der Länge des Teststreifens zu der Blockierzone. In einer alternativen Ausführungsform ist der erste Streifen schon in Fluidverbindung mit dem zweiten Streifen. In einer solchen Ausführungsform kann die Flüssigkeitsmischung wegen der Gravitation der Flüssigkeitsprobe automatisch heruntertropfen, um in der Regulationszone 201 einzutreffen.

In einigen Ausführungsformen sind eine Menge von Fallenrezeptoren auf der Blockierzone immobilisiert. Die immobilisierten Fallenrezeptoren haben spezifische Stellen zum Binden des Liganden, aber verbinden sich nicht direkt mit irgendeinem der Analyt-Bindungs-Antikörper in der zweiten Flüssigkeitsmischung. Die Fallenrezeptoren können aus einem Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Partner einiger spezifischer Molekülpaare, unabhängig von dem mobilisierbaren Ligand, oder irgendeinem anderen geeigneten Fallenrezeptor ausgewählt werden. Wenn ein Partner eines Paars von spezifischen Molekülen auf der Blockierzone immobilisiert wird, kann ein anderer Partner des Paars von spezifischen Molekülen mit dem Ligand konjugiert und auf der Regulationszone enthalten sein. Die spezifischen Molekülpaare können ausgewählt sein aus Biotin und Avidin, Biotin und Streptavidin, Antikörper und einem Antigen (Antikörper zum Binden an ein Zielanalyt und das Analyt selbst sind ausgeschlossen), Rhodamin und Anti-Rhodamin, Maus-IgG und Anti-Maus-IgG oder irgendeinem anderen geeigneten Molekularpaar. Genauer, wenn der mobilisierbare Ligand angebracht, markiert oder gebunden ist mit Biotin in der Mobilisationszone, immobilisiert die Blockierzone die Liganden durch eine Menge Avidin zum spezifischen Binden des Biotins als einem Teil eines Konjugats, das mit den Liganden konjugiert ist.

In einer anderen Ausführungsform ist der mobilisierbare Ligand (Antigen-Ligand) mit einem Protein konjugiert. Allgemein kann ein Proteinmolekül mit verschiedenen kleinen Antigenen konjugiert sein, so dass sich ein molekularer Antigen-Ligand an verschiedene Rezeptoren für den Analyt binden kann. Der Antigen-Ligand kann sich auch mit Biotin verbinden. Im negativen Zustand reagiert der Antigen-Ligand mit dem Analyt-Antikörper, um einen Komplex zu bilden (Analyt-Antikörper-Biotin-Komplex). Wenn sich der Komplex zu der festen Phase mit der fließenden Flüssigkeit bewegt und sich an Streptadivin-IgG-Komplex bindet, kann sich ein monomolekularer Straptavidin-IgG-Komplex an vier molekulare Biotine binden. Diese Mehrstellenkonjugation hindert den Analyt und Antikörper daran, sich hinter die feste Phase zu bewegen. Die Fähigkeit, so wenige Antikörper oder Analyte wie möglich zu hindern, verringert folglich die Möglichkeit eines falschen Positivs. Andere Reagenzien zum Verbessern des Tests können auch auf oder stromaufwärts von der Blockierzone angeordnet sein. Zusätzlich wird die Blockierzone in einigen Ausführungsformen auf einem festen Material angeordnet, enthaltend, aber nicht darauf beschränkt, Filterpapier, Zellulosemembranen, Nylonmembranen oder irgendein anderes geeignetes Material. In einigen Ausführungsformen ist die Blockierzone auf einer Zellulosemembran angeordnet.

Eine Einrichtung, in der eine horizontale Lücke zwischen der Analyt-Bindungszone 301 und der Regulationszone 303 vorhanden ist, wird in 3A gezeigt. Die Analyt-Bindungszone 301 ist auf einem ersten Streifen 30 angeordnet und die Regulationszone 301 ist auf einem zweiten Streifen 31 enthalten. Der erste Streifen 30 ist von dem zweiten Streifen 31 entlang der horizontalen Achse durch eine Lücke 302 zwischen den zwei Streifen separiert. Die Probe wird auf den ersten Streifen 30 an der Probenauftragungszone aufgetragen. Die Probe kommt mit der Analyt-Bindungszone 301 auf dem ersten Streifen 30 in Kontakt. Die in der Analyt-Bindungszone 301 angeordneten Antikörper werden dann in der Probe gelöst und eine erste Probenmischung wird gebildet. Die erste Probenmischung kann in der Analyt-Bindungszone über einen Zeitraum gehalten werden. Der erste Streifen 30 kann dann neben dem zweiten Streifen 31 positioniert werden, wie in 3B gezeigt ist. Wenn die Analyt-Bindungszone 301 in Fluidverbindung mit der Regulationszone 303 platziert wird, fließt die Probe von der Analyt-Bindungszone 301 zu der Regulationszone, wobei eine zweite Flüssigkeitsmischung gebildet wird. Die Lücke zwischen der Analyt-Bindungszone 301 und der Regulationszone 303 kann gestaltet werden, um verschiedene Anforderungen zu erfüllen, inklusive, aber nicht darauf beschränkt, die besondere Sensibilität und besonderen Erfordernisse zum Testen eines Zielanalyts unter Verwendung der vorliegenden Einrichtung. In einigen Ausführungsformen ist die Breite der Lücke 302 zwischen etwa 1 und 100 Millimetern. In einigen Ausführungsformen ist die Breite der Lücke zumindest 1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Millimeter. In einigen Ausführungsformen ist die Lücke mehr als 100 Millimeter.

In einigen Ausführungsformen weist die Testeinrichtung ein Gehäuse 400 zum Aufnehmen des Teststreifens 100 auf, wie in 4 abgebildet ist. Das Gehäuse 400 weist einen Probenschacht 41 auf, durch den die Probe auf den Streifen 100 eingeführt wird. Wie in 4 gezeigt ist, weist das Gehäuse 400 einen Probenschacht 41, der mit der Probenauftragungszone A fluchtet, und ein Fenster 42 auf, das mit der Detektionszone F und der Kontrollzone G fluchtet. Das Ergebnis, das auf der Detektionszone F gezeigt wird, kann durch das transparente Betrachtungsfenster 42 abgelesen werden. Die Blockierzone D und mobilisierbare Zone K (wie in 1 zu sehen) sind typischerweise durch die undurchsichtige Wand des Gehäuses versteckt. In einigen Ausführungsformen sind die Blockierzone und die Mobilisationszone durch die Einrichtung sichtbar, wobei die Wände der Einrichtung transparent sind.

II. Verfahren

Ebenfalls hierin zur Verfügung gestellt sind Verfahren zur Verwendung der Testeinrichtung. Ein Verfahren zur Verwendung der Testeinrichtung umfasst das Detektieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Zielanalyts in einer Flüssigkeitsprobe mit einem direkten positiven oder negativen Ergebnis. Das Verfahren enthält ein Kontaktieren einer Probe mit einer Menge von Analyt-Bindungs-Antikörpern zum spezifischen Binden von Zielanalyten oder einer Menge von Liganden, um eine erste Flüssigkeitsmischung zu bilden. Die erste Mischung enthält Antikörper-Analyt-Komplexe, wenn das Zielanalyt vorliegt. Die erste Flüssigkeitsmischung enthält ferner eine Menge Antikörper, wenn die Menge Analyt kleiner als die Menge der Antikörper ist, oder eine Menge Analyt, wenn die Menge des Analyts größer als die Menge der Antikörper ist. Die erste Mischung wird typischerweise ausgebrütet oder über einen ersten Zeitraum gehalten, bevor sie mit einer Menge Ligand in Kontakt gerät, um eine zweite Flüssigkeitsmischung zu bilden. Die Liganden in der zweiten Flüssigkeitsmischung konkurrieren mit dem Analyt zum Binden der Antikörper der Antikörper-Analyt-Komplexe in einer im Wesentlichen flüssigen Phase. Die zweite Flüssigkeitsmischung wird typischerweise ausgebrütet oder über einen zweiten Zeitraum gehalten, wobei der zweite Zeitraum kürzer als der erste Zeitraum ist. Während des zweiten Zeitraums kontaktiert die zweite Flüssigkeitsmischung die feste Phase mit einer Blockierzone, die eine Menge von Fallenrezeptoren zum Extrahieren der Liganden inklusive der ungebundenen Liganden oder der Liganden-Antikörper-Komplexe aus der zweiten Flüssigkeitsmischung aufweist. Die Analyt-Bindungs-Antikörper sind in dieser zweiten Flüssigkeitsmischung nicht direkt gebunden. Das Testergebnis korreliert mit der Menge von Antikörper-Analyt-Komplexen.

In anderen Ausführungsformen enthält das Verfahren ein Auftragen einer flüssigen Probe auf eine feste Phase, umfassend eine Analyt-Bindungszone, eine Regulationszone, die von der Analyt-Bindungszone separiert und stromabwärts davon vorhanden ist, eine Blockierzone und eine Detektionszone. Eine Menge Analyt-Bindungs-Antikörper wird auf der Analyt-Bindungszone in einem trockenen Zustand enthalten. Eine Menge Liganden ist auf der Regulationszone in einem trockenen Zustand enthalten. Die Analyt-Bindungs-Antikörper und die Liganden können in einer flüssigen Phase gelöst und von einer flüssigen Probe getragen werden. Die Blockierzone enthält eine Menge von immobilisierten Fallenrezeptoren zum Binden der Liganden, aber nicht direkten Binden irgendeines Analyt-Bindungs-Antikörpers.

Ebenso hierin zur Verfügung gestellt sind Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Analyts. Ein Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Analyts in einer Probe umfasst ein Kontaktieren der Probe mit einer Menge von Antikörpern zum spezifischen Binden einer Menge von entweder einem Zielanalyt oder einem Ligand, um eine erste Mischung zu bilden; Kontaktieren der ersten Mischung mit einer Menge Ligand, um eine zweite Mischung zu bilden; Kontaktieren der zweiten Mischung mit einer festen Phase, die eine Blockierzone aufweist, wobei die Blockierzone eine Menge immobilisierter Fallenrezeptoren aufweist, die spezifisch die Liganden bindet, aber nicht direkt die Antikörper der ersten Mischung bindet; und Bestimmen der Menge Antikörper in der zweiten Mischung, wobei die Menge detektierter Antikörper mit einer Menge des Analyts in der flüssigen Probe korrespondiert. In einigen Ausführungsformen umfasst die feste Phase einen Lateralflussstreifen. In einigen Ausführungsformen sind sowohl die Liganden als auch die Antikörper zum Binden der Analyte auf dem Lateralflussstreifen getrocknet und stromaufwärts von der Blockierzone angeordnet. Das Verfahren kann ferner die Bildung eines Molekularkonjugats bereitstellen, umfassend einen Ligand, der nicht auf das Analyt bezogen ist, und der Fallenrezeptor wird in der zweiten Mischung gebildet. Das Molekularkonjugat kann ausgewählt werden aus Biotin und Avidin, Biotin und Streptoavidin oder Rhodamin und Anti-Rhodamin. Zusätzlich weist das Molekularkonjugat ferner eine detektierbare Markierung auf. Die detektierbare Markierung kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus kolloidalem Gold, einem Latexpartikel oder einem Chromophor besteht. In einigen Ausführungsformen ist eine Affinitätskonstante zwischen dem mobilisierbaren Antikörper und dem mobilisierbaren Ligand höher als eine Affinitätskonstante zwischen dem Analyt und dem mobilisierbaren Antikörper vorhanden. In einigen Ausführungsformen ist die Zeitdauer, in der die Probe die Analyt-Bindungs-Antikörper kontaktiert, länger als die Zeitdauer, in der die erste Flüssigkeitsmischung die Liganden kontaktiert.

III. Beispiele

Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele illustriert, welche dazu gedacht sind, reine Beispiele der Erfindung und keine Beschränkungen der Erfindung zu sein.

Beispiel 1: Detektion von Kokain in UrinPräparieren eines mit Kokain konjugierten Antikörpers konjugiert mit kolloidalem Gold

3 L einer kolloidalen Goldlösung mit symmetrischen und geeigneten Partikeln (20–40 nm im Durchmesser) wurde in einem sauberen Glasbehälter präpariert. Die kolloidale Goldlösung wurde zuerst gemischt. Eine Phosphatpufferlösung mit einem pH = 7,0 wurde dann zu der kolloidalen Goldlösung zugefügt, um den pH der kolloidalen Goldlösung auf etwa 6,8 einzustellen. 25 mg von COC Monoklonal-Antikörper wurde dann der Mischung zugefügt. Die Lösung wurde kontinuierlich über etwa 1 Stunde gemischt. Nach dem Mischen der Lösung wurden 35 ml von 10% BSA zugefügt, um die Reaktion zu blockieren. Die Lösung wurde dann wieder über eine weitere Stunde gemischt. Im Anschluss wurde die Blocklösung dann zentrifugiert bei 11000 U/Min über 35 Minuten. Der Überstand wurde dann entfernt. Danach wurde die Deposition in 0,003 mol/L 0,02% BSA/Phosphatlösung (Waschpuffer) gelöst und die Lösung wurde wieder zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder dekantiert und die Deposition gesammelt. Danach kann die Konzentration der Kolloidgoldlösung wie benötigt eingestellt werden. Der OD-Wert der Lösung unter 540 nm Wellenlänge wurde dann bestimmt.

Präparieren eines Konjugats mit Kokain und Biotin (COC-BSA-Biotin)

2,5 mg/ml BSA-Kokain-Konjugat (erworben von Immunetic, Inc) wurde in 1000 ml NaHCO3-Pufferlösung (pH = 8,0) über 4 Stunden dialysiert, um eine Lösung (1) zu bilden. Nach dem Verdünnen von Biotin mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 10 mM wurden 47 μl Biotinlösung und Lösung (1) zusammengemischt und über 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, um die Lösung (2) zu bilden. Dieses bestimmend wurde die Lösung (2) in 1000 ml Phosphat-gepufferter Lösung (pH = 7,4) über 12 Stunden zu und von Lösung (3) dialysiert. Die Konzentration von Kokain-BSA-Biotin unter 655 nm Wellenlängen in einem Spektrophotometer wurde dann in Lösung (4) verdünnt, um die Schlusslösung in einer Konzentration von 0,5 mg/ml zu bilden.

Präparation des Teststreifens

Ein Teststreifen, wie in 1 gezeigt, wurde präpariert.

Präparation des Probenauftragungsfelds: Ein aus Glasfasern gemachtes Probenauftragungsfeld M wurde verwendet. Die Glasfasern wurden dann mit Pufferlösung (Borax 0,05 M, pH 9,3, Oberflächen-aktives Reagens: 2% S-17: (RHODASURF®ON-870)) behandelt und in einem Ofen bei 37°C getrocknet.

Präparation des Markierungsfelds B: Die Polyestermembran wurde dann mit einer Pufferlösung (PVA 5 g/L, Na2HPO4, 7,1 g/L, S-14 (Triton-X-100) 0,1%, BSA 5 g/L, NaN3 0,2 g/L) behandelt. Die Membran wurde in dem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Membran wurde zusätzlich mit Anti-COC behandelt, das mit Kolloidgoldpartikeln unter der Konzentration von 10 OD markiert und in dem Zustand von 1 ul/cm und einem automatischen Spraymikroprozessor war, um das Markierungsfeld 1 zu bilden. Das Markierungsfeld 1 wurde dann in einem Ofen bei 37°C getrocknet.

Präparation von Markierungsfeld C: Die Polyestermembran wurde mit Pufferlösung (PVA 5 g/L, Na2HPO4, 7,1 g/L, S-14 (Triton-X-100) 0,1%, BSA 5 g/L, NaN3 0,2 g/L) behandelt und wurde in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Membran wurde dann mit 0,5 mg/ml Biotin-BSA-COC-Lösung 4 nach dem Kriterium von 2,5 ul/cm und einem automatischen Spraymikroprozessor behandelt, um das Markierungsfeld 2 zu bilden. Das Markierungsfeld 2 wurde dann in einem Ofen bei 37°C getrocknet.

Präparation der Nitrozellulosemembran: Die Blockierzone D der Nitrozellulose(NC)-Membran E wurde mit Straptavidin-IgG (Yingkelong Biotechnology (Hangzhou) Co., Lid.) bei einer Konzentration von 0,6 mg/ml und in dem Zustand von 2,5 ul/cm und 3 Bändern automatischen Spraymikrospray-Membranprozessors behandelt. Die Detektionszone F wurde mit Ziegen-Anti-Maus-Antikörper IgG (erworben von Fitzgerald Inc) bei einer Konzentration von 0,6 mg/ml und in dem Kriteriumszustand von 1,0 ul/cm und 1 Band automatischen Spraymikrospray-Membranprozessors behandelt. Danach wurde die NC-Membran E in einem Ofen bei 37°C getrocknet.

Konstruktion des Teststreifens mit Probenfeld, markierten Feldern und NC-Membran: Die präparierten Teile wurden in Teststreifen von etwa 0,4 × 10 cm geschnitten. Die Probenauftragungszone A, das Markierungsfeld 1B, Markierungsfeld 2C, NC-Membran E und Absorptionsfilterpapier H wurden der Reihe nach zusammengesetzt. Markierungsfeld 1B und Markierungsfeld 2C verblieben isoliert von der Probenauftragungszone A, Markierungsfeld 1B, Markierungsfeld 2C und der NC-Membran über einen Abstand 102. All diese Teile wurden auf einem saugfähigen Material angeordnet.

Verdünnung von Kokaindetektionslösung

Verdünne Kokain mit dem negativen Urin in eine Detektionslösung unter der Konzentration von 0 ng/ml, 150 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 150 ng/ml, 450 ng/ml und 900 ng/ml.

Die Detektionsergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1

Kokain-DetektionslösungMengeErgebnisNegativPositivGenaue MengeGenaues EreignisNegative Detektionslösung1010010100%25 ng/ml1055550%50 ng/ml1001010100%100 ng/ml1001010100%150 ng/ml1001010100%450 ng/ml1001010100%900 ng/ml1001010100%

Das Ergebnis für den Kokainteststreifen ist in 5A gezeigt. Der Test zeigt die Ergebnisse in der Detektionszone J für verschiedene Konzentrationen von Kokain in den Urinproben. Die Kokainkonzentrationen der Probe sind 0 ng/ml, 150 ng/ml, 450 ng/ml und 900 ng/ml von links nach rechts. I: Absorptionszone; J: Detektionszone; K: Blockierzone; L: markierte Zone; M: Probenaufnahmezone.

Analyse des Ergebnisses:

Das Detektionsergebnis zeigt, dass eine Detektionssensibilität auf bis zum 50 ng/ml-Grad durch das Verfahren und die Einrichtung, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, verbessert werden kann. Falsche Negative wurden nicht aufgefunden.

Beispiel 2: Detektion von Phencyclidin (PCP) in Urin

Ein Teststreifen wurde wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert. Das nachgearbeitete Protokoll war dasselbe wie Beispiel 1 mit einigen Abweichungen: (1) COC wurde ersetzt durch PCP; (2) Pufferlösung zum Behandeln des Probenauftragungsfelds A war TRIS-Pufferlösung, wobei die konkrete Vorschrift 0,1 M TRIS-Salz (pH = 8,0), Oberflächenaktives Reagens mit 1% S-7 (RHODASURF®ON-870), 1% S-9 (RHODASURF®ON-870) und 1% BSA enthält; (3) die Konzentration von Biotin-BSA-PCP zum Behandeln des Markierungsfelds C war 1 mg/ml, das Behandlungskriterium ist 2,5 ul/cm und das Markierungsfeld C wurde in einem Ofen bei 37°C getrocknet; (3) wenn die NC-Membran E präpariert wird, wird die Detektionsergebsnis-Operationszone G, die stromabwärts von der Detektionszone F und in der Nähe des Absorptionsfelds H ist, mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG beschichtet. Das Beschichtungsverfahren ist dasselbe wie das für die Detektionszone F in Beispiel 1.

Verdünnung von PCP-Lösung: Verdünne PCP mit negativem Urin in die Detektionslösung unter der Konzentration von 0 ng/ml, 12,5 ng/ml, 37,5 ng/ml und 75 ng/ml.

Das Markierungsfeld 1 wurde mit Kaninchen-IgG und kolloidalen Goldpartikeln unter der Konzentration von 0,6 mg/ml und einem automatischen Spraymikroprozessor behandelt. Danach wurde das Markierungsfeld 1 in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Konzentration und das Verfahren anderer Reagenzien sind dieselben wie in Beispiel 1.

Detektionsergebnis:

5B illustriert, wie, wenn PCP nicht in der Urinprobe vorhanden ist, kein Band in der Detektionszone 5 erscheint, was direkt ein negatives Ergebnis aufzeigt (erste und zweite von links nach rechts). Wenn PCP vorliegt, erscheint ein Band in der Detektionszone und die Bandfarbe verdunkelt sich, wenn sich die Konzentration erhöht.

Beispiel 3: Detektion von Methyl-Amphetamin (MET) in Urin

Die verwendete Teststreifenprozedur ist dieselbe wie die, die in Beispiel 1 beschrieben wurde. Das nachgearbeitete Protokoll ist ähnlich zu dem, das in Beispiel 2 beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass PCP durch Methyl-Amphetamin (MET) ersetzt wird, wobei die MET-Verdünnung durch Verdünnen von MET mit dem negativen Urin in die Detektionslösung mit Konzentration 0 ng/ml, 150 ng/ml, 450 ng/ml und 900 ng/ml erreicht wird.

Detektionsergebnis:

5C illustriert, wie, wenn MET in der Urinprobe nicht vorhanden ist, kein Band in der Detektionszone 15 erscheint, was direkt ein negatives Ergebnis aufzeigt (erste und zweite von links nach rechts). Wenn MET vorliegt, erscheint ein Band in der Detektionszone und die Bandfarbe verdunkelt sich, wenn die Konzentration ansteigt.

Beispiel 4: Detektion von Morphin in Urin

Die verwendete Teststreifenprozedur ist dieselbe wie die, die in Beispiel 1 beschrieben wurde. Das nachgearbeitete Protokoll ist ähnlich zu dem, das in Beispiel 2 beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass PCP durch Morphin ersetzt wird. Die Morphinverdünnungslösung wird durch Verdünnen von MOP mit dem negativen Urin in eine Detektionslösung mit Konzentration 0 ng/ml, 105 ng/ml, 450 ng/ml und 900 ng/ml erzeugt.

Detektionsergebnis:

5D illustriert, wie, wenn MOP nicht in der Urinprobe vorhanden ist, kein Band in der Detektionszone 25 erscheint, was direkt ein negatives Ergebnis aufzeigt (erste und zweite von links nach rechts). Wenn MOP vorliegt, erscheint ein Band in der Detektionszone und die Bandfarbe verdunkelt sich, wenn die Konzentration ansteigt.

Beispiel 5: Detektion von Amphetamin (AMP) in Urin

Die verwendete Teststreifenprozedur ist dieselbe wie die, die in Beispiel 1 beschrieben ist. Das nachgearbeitete Protokoll ist ähnlich zu dem, das in Beispiel 2 beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass PCP mit Amphetamin (AMP) ersetzt wird. Die AMP-Verdünnung wird durch Verdünnen von AMP mit dem negativen Urin in eine Detektionslösung mit Konzentration 0 ng/ml, 150 ng/ml, 1500 ng/ml und 3000 ng/ml erzeugt.

Detektionsergebnis:

5E illustriert, wie, wenn AMP nicht in der Urinprobe vorhanden ist, kein Band in der Detektionszone 35 erscheint, was direkt ein negatives Ergebnis aufzeigt (erste und zweite von links nach rechts). Wenn AMP vorhanden ist, erscheint ein Band in der Detektionszone und die Bandfarbe verdunkelt sich, wenn die Konzentration ansteigt.

Beispiel 6: Die Detektion von Tetrahydrocannabinol (THC) in Urin

Die verwendete Teststreifenprozedur ist dieselbe wie die, die in Beispiel 1 beschrieben ist. Das Protokoll, das nachgearbeitet wurde, ist ähnlich zu dem, das in Beispiel 2 beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass PCP mit Tetrahydrocannabinol (THC) ersetzt wird. Die THC-Verdünnung wird durch Verdünnen von THC mit dem negativen Urin in eine Detektionslösung mit Konzentration 0 ng/ml, 17,5 ng/ml, 75 ng/ml und 150 ng/ml erzeugt.

Detektionsergebnis:

5F illustriert, wie, wenn THC nicht in der Urinprobe vorhanden ist, kein Band in der Detektionszone 45 erscheint, was direkt ein negatives Ergebnis aufzeigt (erste und zweite von links nach rechts). Wenn THC vorliegt, erscheint ein Band in der Detektionszone und eine Bandfarbe verdunkelt sich, wenn die Konzentration ansteigt.

Während bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hierin gezeigt und beschrieben wurden, wird es dem Fachmann offensichtlich sein, dass solche Ausführungsformen nur exemplarisch vorgesehen sind. Zahlreiche Variationen, Abänderungen und Ersetzungen werden dem Fachmann nun auffallen, ohne von der Erfindung abzuweichen. Es sollte verstanden werden, dass verschiedene Alternativen zu den Ausführungsformen der Erfindung, die hierin beschrieben sind, beim Praktizieren der Erfindung benutzt werden können. Es ist gedacht, dass die folgenden Ansprüche den Schutzbereich der Erfindung definieren und das Verfahren und Strukturen innerhalb des Schutzbereichs dieser Ansprüche und ihrer Äquivalente dadurch abgedeckt sind.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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