Title:
Reagens zur qualitativen Beurteilung einer durchflusszytometrischen Analyse
Kind Code:
U1


Abstract:

Reagens zur qualitativen Beurteilung einer durchflusszytometerischen Analyse,
wobei das Reagens monoklonale, mit einem Fluoreszenz-Farbstoff versehene Antikörper enthält
sowie als Beads bezeichnete, ebenfalls mit einem Fluoreszenz-Farbstoff versehene Standardpartikel,
deren Licht-Abstrahlungsverhalten sich von dem Licht-Abstrahlungsverhalten der Antikörper unterscheidet.




Application Number:
DE202017101723U
Publication Date:
05/04/2017
Filing Date:
03/24/2017
Assignee:
Göhde, Wolfgang, 48301 (DE)
International Classes:



Attorney, Agent or Firm:
Habbel & Habbel, 48151, Münster, DE
Claims:
1. Reagens zur qualitativen Beurteilung einer durchflusszytometerischen Analyse,
wobei das Reagens monoklonale, mit einem Fluoreszenz-Farbstoff versehene Antikörper enthält
sowie als Beads bezeichnete, ebenfalls mit einem Fluoreszenz-Farbstoff versehene Standardpartikel,
deren Licht-Abstrahlungsverhalten sich von dem Licht-Abstrahlungsverhalten der Antikörper unterscheidet.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens in getrockneter Form vorliegt.

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens eine bestimmte Menge an Beads enthält.

4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens monoklonale, mit einem Fluoreszenz-Farbstoff versehene CD4-Antikörper enthält.

Description:

Die Neuerung betrifft das Gebiet der Durchflusszytometrie, nämlich ein Reagens zur qualitativen Beurteilung einer durchflusszytometrischen Analyse.

Durchflusszytometrische Analyseverfahren sind aus der Praxis bekannt. Sie können zur Analyse vieler unterschiedliche Zelltypen oder ggf. auch Viren angewandt werden. Durchflusszytometrische Analyseverfahren werden beispielsweise zur HIV (Aids)-Diagnostik verwendet, wobei nachfolgend der vorliegende Vorschlag am Beispiel der durchflusszytometrischen Analyse von CD4-positiven Lymphozyten im Rahmen der HIV-Diagnostik erläutert wird, ohne jedoch auf diesen Anwendungsfall beschränkt zu sein.

Im Vergleich dazu, die Anzahl der HIV-Erreger unmittelbar zu bestimmen („viral load“), kann erheblich preisgünstiger die Bestimmung der Anzahl von CD4-Zellen erfolgen. Mit zunehmender Schwere der Erkrankung vernichten die HI-Viren die Immunabwehr im Körper, was mit einem Rückgang an CD4-positiven Lymphozyten im Blut des Patienten einhergeht. Die Bestimmung der Menge an CD4-positiven Lymphozyten (auch kurz: CD4-Zellen) im Blut ermöglicht daher einen Rückschluss auf die Menge an HIV-Erregern und somit auf die Schwere der Erkrankung. Auf diese Weise lassen sich durch regelmäßige Bestimmungen der CD4-Zellen Therapiefortschritte erkennen bzw. Therapien optimal an den jeweiligen Patienten anpassen.

Aufgrund der wirtschaftlichen Vorteile wird die Bestimmung der CD4-Zellen insbesondere in ökonomisch schwächeren Ländern angewendet, insbesondere weit verbreitet in afrikanischen Staaten.

Die Auswertung der mit dem Durchflusszytometer erhaltenen Ergebnisse erfolgt vielfach in Form einer grafischen Darstellung, nämlich eines Histogramms. Dabei wird auf eine Achse, typischerweise auf der X-Achse, die Strahlungsintensität aufgetragen, mit welcher die fluoreszierende Strahlung auf den Detektor trifft. Auf der anderen, typischerweise der Y-Achse des Histogramms wird die Anzahl der Ereignisse aufgetragen, nämlich die Anzahl der Zellen, die durch die Küvette des Zytometers geströmt sind und dabei vom Lichtstrahl, typischerweise einem Laserlichtstrahl, angestrahlt worden sind, was dann zur Abgabe des auf dem Detektor auftreffenden fluoreszierenden Lichts geführt hat.

Unterschiedliche Fluoreszenzfarben sind handelsüblich, so dass je nach Bauart des Durchflusszytometers und der dort verwendeten Lichtquelle die CD4-Zellen mit einer geeigneten Fluoreszenzfarbe markiert werden, die bei Anregung durch das jeweilige Licht optimal hohe und zuverlässige Erkennungsraten des Detektors sicherstellen.

Dementsprechend ergibt sich bei dem erwähnten Histogramm in einem relativ scharf begrenzten Bereich ein Peak dort, wo das von den fluoreszierend markierten CD4-Zellen auf den Detektor eingestrahlte Licht repräsentiert ist. Durch diesen relativ scharfen Peak lässt sich die Menge der bei der Analyse ermittelten CD4-positiven Lymphozyten mit guter Genauigkeit bestimmen.

In der Praxis können jedoch aus unterschiedlichen Gründen Abweichungen von dieser idealtypischen Darstellung auftreten:

  • • Die Qualität der verwendeten monoklonalen Antikörper kann beeinträchtigt sein, beispielsweise durch falsche Lagerung bei zu hohen Temperaturen über einen zu langen Zeitraum, oder dadurch, dass das Ablaufdatum für die Reagenzien überschritten wurde.
  • • Auch wenn die monoklonalen Antikörper oder die mit den monoklonalen Antikörpern markierten CD4-Zellen einer zu starken Lichteinwirkung ausgesetzt waren, kann ihre Verwendbarkeit erheblich beeinträchtigt sein.
  • • Die Handhabung der Blutprobe selbst kann zu unbrauchbaren Ergebnissen im Durchflusszytometer führen, beispielsweise wenn eine zu große Zeitspanne zwischen der Probennahme und der Durchführung der Analyse liegt, oder wenn die Blutprobe zu hohen Temperaturen ausgesetzt war, beispielsweise während des Transports von dem Ort ihrer Probennahme zum Labor, wo die Analyse durchgeführt wird.
  • • Weiterhin kann eine falsche Handhabung der Probe, sei es bei der Handhabung der Blutprobe oder bei der Handhabung der monoklonalen Antikörper oder bei der Handhabung dieser beiden zur Schaffung einer zu analysierenden Probe die Ergebnisse der Analyse beeinträchtigen bzw. die Analyse unbrauchbar machen.
  • • Ein möglicher Einflussfaktor, der die Analysenergebnisse unbrauchbar macht, kann auch darin liegen, dass stark verunreinigtes Wasser als Verdünnungspuffer verwendet wurde, um die Probe zu verdünnen, damit sie problemlos durch die Küvette des Durchflusszytometers geführt werden kann.
  • • Und schließlich können auch technische Probleme des Durchflusszytometers die durchgeführte Analyse unbrauchbar machen, z. B. wenn die optischen Einrichtungen des Durchflusszytometers nicht präzise ausgerichtet sind oder die Funktion der Lichtquelle beeinträchtigt ist.

In den Fällen, in denen das Histogramm keine zuverlässige Aussage über die Menge bzw. Anzahl der in der Probe enthaltenen CD4-Zellen ermöglicht, besteht die übliche Reaktion des Laborpersonals darin, das verwendete Durchflusszytometer zu manipulieren, da erfahrungsgemäß die Neigung besteht, Probleme bei der Präparation oder der Handhabung der Proben auszuschließen und einen Fehler vielmehr im Durchflusszytometer zu suchen. Die zur Fehlerbehebung erfolgende Manipulation des Durchflusszytometers führt nicht selten dazu, dass das an sich intakte Durchflusszytometer verstellt wird. Anschließende Versuche, das Zytometer wieder korrekt zu justieren, schlagen in etlichen Fällen fehl, so dass mit erheblichem Aufwand Servicepersonal des Herstellers zum Labor anreisen muss. Wenn es sich dabei um vergleichsweise entlegene Regionen auf dem afrikanischen Kontinent handelt, können allein die Reisekosten im fünfstelligen Eurobereich liegen.

Der Neuerung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reagens anzugeben, welches bei der Durchführung einer durchflusszytometrischen Analyse eine Aussage darüber ermöglicht, ob deren Ergebnis brauchbar ist, und wo bei Unbrauchbarkeit die Probleme gelegen haben.

Diese Aufgabe wird durch ein Reagens nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Die Neuerung schlägt mit anderen Worten vor, in der Probe nicht nur die fluoreszierend ausgerüsteten monoklonalen Antikörper zu verwenden, sondern auch so genannte Beads, die ebenfalls mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehen sind und als so genannte Standardpartikel ein sehr gleichmäßiges Fluoreszenzlicht abgeben. Der Blutprobe, die zur Ermittlung der CD4-positiven Lymphozyten zu untersuchen ist, wird daher das vorschlagsgemäße Reagens zugegeben, welches die Beads enthält – üblicherweise sehr kleine Kügelchen aus Kunststoff. Derartige Beads sind in unterschiedlichsten Ausgestaltungen handelsüblich und können in Anpassung an das im Durchflusszytometer jeweils verwendete Licht ausgewählt werden, um optimale Ergebnisse sicherzustellen.

Das Lichtabstrahlungsverhalten der Beads unterscheidet sich vorschlagsgemäß vom Lichtabstrahlungsverhalten der fluoreszierend ausgerüsteten Antikörper, so dass im Detektor unterschiedliche Detektorsignale einerseits von den Beads und andererseits von den Antikörpern bewirkt werden. Dementsprechend können die Detektorsignale in der Weise ausgewertet werden, dass anhand der von den Beads bewirkten Detektorsignale der Zustand des Durchflusszytometers ermittelt werden kann. Diese Auswertung kann bei entsprechend ausgestatteten Durchflusszytometern automatisch erfolgen, oder sie kann in einer zusätzlichen, automatischen Auswertungsstation ebenfalls automatisch erfolgen, beispielsweise, wenn anhand einer Bildauswertungssoftware ein anhand der Analyse erstelltes Histogramm automatisch ausgewertet wird.

Zu Gunsten einer besonders preisgünstigen Handhabung des Analyseverfahrens kann jedoch auch vorgesehen sein, dass die Auswertung durch das Personal erfolgt, indem das Histogramm dementsprechend ausgewertet wird, so dass die Vorteile des vorliegenden Vorschlags genutzt werden können, ohne apparative Änderungen oder eine zusätzliche apparative Ausstattung in den Labors. Hierzu ist lediglich das vorschlagsgemäß ausgestaltete Reagens zu verwenden.

Vorteilhaft kann in an sich bekannter Weise vorgesehen sein, dass die Detektorsignale als Histogramm dargestellt werden, so dass eine dem Fachmann geläufige Darstellung der Analyseergebnisse eine einfache Beurteilung ermöglicht.

Zur Herstellung des Reagens werden in der aus der Praxis bekannten üblichen Arbeitsweise monoklonale, mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehene CD4-Antikörper in einer wässrigen Suspension bereitgestellt. Vorschlagsgemäß werden diese Antikörper mit den Beads vermischt, die ebenfalls in einer wässrigen Suspension bereitgestellt werden. Das so erhaltene flüssige Reagens kann unmittelbar für die Durchführung der Durchflussytometrie verwendet werden.

Besonders vorteilhaft allerdings kann dieses flüssige Reagens getrocknet und anschließend gelagert werden. Erst vor Durchführung der Analyse im Durchflusszytometer wird das getrocknete Reagens mit der Blutprobe vermischt. Durch die Trocknung ist das Reagens problemlos lagerfähig und in hohem Maße unempfindlich gegen hohe Temperaturen, Lichteinwirkungen und andere Umwelteinflüsse, die ansonsten zur Denaturierung eines herkömmlichen Reagens führen würden. Dementsprechend kann ein solches getrocknetes Reagens über längere Zeit gelagert werden, während die Analysen auf herkömmliche Art und Weise durchgeführt werden. Treten jedoch unbrauchbare Analyseergebnisse auf, kann ein vorschlagsgemäßes Reagens zur Durchführung des Analyseverfahrens genutzt werden, um auf diese Weise einen Hinweis darauf zu erhalten, wo die Probleme liegen, die zur Unbrauchbarkeit der Analysenergebnisse geführt haben. Das vorschlagsgemäße Reagens kann jedoch auch ohne zusätzlichen zeitlichen und apparativen Aufwand bei jeder durchzuführenden Analyse angewendet werden, was eine Qualitätskontrolle bei jeder zu analysierenden Blutprobe gewährleistet.

Vorteilhaft kann das vorschlagsgemäße Reagens mit der Blutprobe für wenigstens 15 Minuten inkubiert werden, vorteilhaft für 20 Minuten. Anschließend wird es vorzugsweise mit einem Verdünnungspuffer vermischt, so dass die so erhaltene verdünnte Probe in das Durchflusszytometer gegeben und analysiert werden kann. Durch den Verdünnungspuffer ist sichergestellt, dass die zu untersuchenden Zellen in der gewünschten Weise durch die Küvette des Durchflusszytometers geleitet werden können.

Das vorschlagsgemäße Reagens enthält monoklonale, mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehene Antikörper. Bezogen auf das beschriebene Anwendungsgebiet der HIV-Diagnostik und der Analyse von CD4-positiven Lymphozyten sind dies CD4-Antikörper. Weiterhin enthält das Reagens die als Beads bezeichneten Standardpartikel, die ebenfalls mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehen sind. Anstelle eines herkömmlichen Reagens kann das vorschlagsgemäß vorgesehene Reagens mit der Blutprobe vermischt werden, um dann in an sich bekannter Weise im Durchflusszytometer untersucht und analysiert zu werden.

Vorteilhaft kann, wie weiter oben bereits erläutert, das Reagens in getrockneter Form vorliegen, so dass es problemlos über längere Zeit gelagert werden kann und nur in Einzelfällen verwendet zu werden braucht, nämlich wenn bei auftretenden Problemen die Ursachenfindung mittels des Reagens erleichtert werden soll.

Vorteilhaft kann vorgesehen sein, dass das Reagens eine definierte Menge an Beads enthält. Die Anwesenheit der Beads in der Probe ergibt im Histogramm an einer bestimmten Stelle einen für die verwendeten Beads typischen Helligkeitswert und dementsprechend einen Peak in dem Histogramm. Die Lage des Peaks auf der Helligkeitsachse ist typisch für die verwendeten Beads, und die Höhe des Peaks, also die Anzahl der gezählten Ereignisse, also der analytisch erfassten Beads, kann einen weiteren Hinweis darauf geben, ob die Probe korrekt gehandhabt wurde.

Der vorliegende Vorschlag ermöglicht daher ein Untersuchungsverfahren zur Beurteilung der Funktion eines Durchflusszytometers: je nach den erhaltenen Analyseergebnissen kann eine Aussage darüber getroffen werden, ob das Durchflusszytometer intakt ist oder nicht. Eine weitergehende Aussage wird ermöglicht, indem fehlerhafte Analyseergebnisse bei intaktem Durchflusszytometer einen Hinweis auf anderweitige Fehlerquellen liefern. Insbesondere wenn mit einem Fluoreszenz-Farbstoff versehene CD4-Antikörper verwendet werden und die Anzahl von CD4-positiven Lymphozyten als durchflusszytometrisch analysierte Zellen bestimmt wird, kann der vorliegende Vorschlag dazu beitragen, teure und häufig unnötige Wartungsarbeiten an Durchflusszytometern im Rahmen der HIV-Diagnostik in ökonomisch schwachen Regionen zu vermeiden.

Der vorliegende Vorschlag wird anhand der rein schematischen Darstellungen nachfolgend näher erläutert. Dabei zeigt

1 ein typisches Histogramm einer herkömmlichen, verwertbaren Analyse,

2 ein untypisches Histogramm, nämlich einer nicht verwendbaren herkömmlichen Analyse,

3 ein typisches Histogramm einer vorschlagsgemäß durchgeführten, verwendbaren Analyse,

4 ein untypisches Histogramm einer vorschlagsgemäß durchgeführten Analyse mit einem ersten Hinweis auf die vorliegenden Problemquellen, und

5 ein ebenfalls untypisches Histogramm einer vorschlagsgemäß durchgeführten Analyse, mit einem zweiten Hinweis auf die vorliegende Fehlerquelle.

In 1 ist ein Histogramm dargestellt, welches im Rahmen einer Analyse zur quantitativen Bestimmung von CD4-Zellen in einem Durchflusszytometer durchgeführt wurde. In an sich bekannter Weise ist bei dem Histogramm entlang der X-Achse die durch den Detektor des Durchflusszytometers erfasste Strahlungsintensität aufgetragen, und entlang der Y-Achse die Anzahl der im Detektor ermittelten Ereignisse, also die Anzahl der jeweils detektierten CD4-Zellen. Ein Normalbereich ist in 1 mit RN1 bezeichnet und durch zwei vertikale Linien begrenzt. In diesem Normalbereich liegt das von den CD4-Zellen abgestrahlte Licht, so dass der in diesem Normalbereich RN1 sichtbare Peak die Anwesenheit der detekorisch erfassten CD4-Zellen repräsentiert. Das Histogramm ist insofern ein typisches Diagramm, welches ein aussagekräftiges Ergebnis liefert.

In 2 ist demgegenüber ein Histogramm dargestellt, welches das Ergebnis einer unbrauchbaren Analyse darstellt. Die Messergebnisse sind über einen Bereich verteilt, die nicht klar im Normalbereich RN1 liegen, so dass diese Analyse keine aussagekräftigen Ergebnisse liefert.

In 3 ist ein Histogramm dargestellt, welches unter Einsatz eines vorschlagsgemäßen Reagens erhalten wurde. In diesem Diagramm sind zwei Normalbereiche eingetragen, nämlich einerseits der Normalbereich RN1, in welchem die Detektorsignale der CD4-Zellen liegen, und weiterhin ein Normalbereich RN2 bei größeren Helligkeiten, in welchem die Detektorsignale liegen, die von den Beads resultieren. Das Histogramm der 3 zeigt, dass Präparation und Handhabung der Probe und auch die technische Ausgestaltung des Durchflusszytometers in Ordnung sind, die Analyse also verwertbare Ergebnisse geliefert hat.

4 zeigt demgegenüber ein untypisches Histogramm, welches ebenfalls unter Einsatz eines vorschlagsgemäßen Reagens erhalten wurde. Wie in 2 sind im Normalbereich RN1 keine verwertbaren Ergebnisse erfasst worden, die eine Beurteilung der CD4-Zellen ermöglichen würden. Allerdings ist dadurch, dass ein vorschlagsgemäßes Reagens verwendet wurde, trotz dieses untypischen Ergebnisses die Analyse nicht vollkommen unbrauchbar: Der gut ausgeprägte Peak im Normalbereich RN2 zeigt, dass die Beads einen Peak im zu erwartenden Bereich geliefert haben, dass also die technische Ausgestaltung des Durchflusszytometers in Ordnung war. Durch dieses Analyseergebnis können dementsprechend unnötige Manipulationen am Durchflusszytometer vermieden werden, und damit auch die mit derartigen Manipulationen ggf. erheblichen wirtschaftlichen Folgen vermieden werden, die mit einer Überprüfung und neuen Justage des Durchflusszytometers verbunden sein können. Vielmehr kann anhand des Histogramms der 4 das Augenmerk auf die Präparation und Handhabung der Probe gerichtet werden, um in Zukunft auswertbare Ergebnisse zu ermöglichen.

5 schließlich zeigt ein weiteres untypisches Histogramm, welches ebenfalls unter Einsatz eines vorschlagsgemäßen Reagens erhalten wurde. Beide Peaks liegen teilweise oder gänzlich außerhalb der für die Zell- oder Beads-Anzahl markierten Normalbereiche RN1 und RN2, so dass dieses Analyseergebnis einen Hinweis auf eine Fehlfunktion des Durchflusszytometers gibt. Zunächst kann im Labor mit dem dortigen Personal eine Korrektur des Durchflusszytometers angestrebt werden. Sollte dies nicht möglich sein, muss die Reparatur durch ein werkseitig qualifiziertes Servicepersonal erfolgen. Der wirtschaftliche Aufwand, der mit einer solchen Reparatur verbunden ist, kann jedoch anhand der Aussagen, die mit Hilfe des vorschlagsgemäßen Reagens ermöglicht werden, auf die sehr wenigen Fälle reduziert werden, in denen erstens die Fehlerquelle überhaupt im Durchflusszytometer liegt, und bei denen zweitens eine Korrektur durch das Laborpersonal nicht zum Erfolg führt.