Title:
Nukleosid-Perlenketten-Sequenzierung
Kind Code:
U1
Abstract:

Ein Apparat zur DNA Sequenzierung mittels Hindurchleiten eines einzelsträngigen DNA bzw. RNA Strangs mit anhybridisierten, chemisch modifizierten (Nukleo-)Basen, Nukleosiden bzw. Nukleotiden durch eine biologische oder nicht-biologische (z. B. halbleiterbasierte solid state Nanopore oder z. B. auch ein DNA Transistor) Nanopore hindurch, gekennzeichnet dadurch, daß zuvor der einzelsträngige DNA- oder RNA-Strang mit chemisch modifizierten (Nukleo-)Basen, Nukleosiden oder chemisch modifizierten Nukleotiden hybrisiert wurde bzw. reagiert hat.



Application Number:
DE202017002052U
Publication Date:
06/13/2017
Filing Date:
04/19/2017
Assignee:
Arneth, Borros, 61348 (DE)
International Classes:
Claims:
1. Ein Apparat zur DNA Sequenzierung mittels Hindurchleiten eines einzelsträngigen DNA bzw. RNA Strangs mit anhybridisierten, chemisch modifizierten (Nukleo-)Basen, Nukleosiden bzw. Nukleotiden durch eine biologische oder nicht-biologische (z. B. halbleiterbasierte solid state Nanopore oder z. B. auch ein DNA Transistor) Nanopore hindurch, gekennzeichnet dadurch, daß zuvor der einzelsträngige DNA- oder RNA-Strang mit chemisch modifizierten (Nukleo-)Basen, Nukleosiden oder chemisch modifizierten Nukleotiden hybrisiert wurde bzw. reagiert hat.

2. Chemisch modifizierte (Nukleo-)Basen, Nukleoside oder Nukleotide bei welchen Markermoleküle (z. B. Nanospheren oder, aber auch nur geringe, kleine chemische Modifikationen) über einen Linker (oder auch ohne Linker) an die Base, an das Nukleosid bzw. Nukleotid gebunden wurden zum Einsatz in einem Apparat nach Schutzanspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß jede Base durch ein spezifisches Markermolekül bzw. durch eine spezifische chemische Modifikation (z. B. durch eine spezifische Nanosphere, einen Nanobead oder auch nur kleine chemische Modifikation) codiert ist, so daß anhand der Signaländerung bei Durchtritt der einzelsträngigen DNA bzw. RNA mit anhybridiertem Nukleosid bzw. Nukleotid durch die Nanopore auf die entsprechende Base rückgeschlossen werden kann.

3. Chemisch modifizierte (Nukleo-)Basen, Nukleoside oder Nukleotide bei welchen Markermoleküle (z. B. Nanospheren, aber auch geringe chemische Modifikationen) über einen Linker an die (Nukleo-)Base, an das Nukleosid bzw. Nukleotid gebunden wurde zum Einsatz in einem Apparat nach Schutzanspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß jede Base durch mehrere spezifische Markermoleküle bzq. durch mehrere chemische Modifikationen (z. B. durch eine spezifische Nanosphere, einen Nanobead, oder aber auch durch geringe chemische Modifikationen) codiert ist, so daß anhand der Signaländerung bei Durchtritt der DNA/RNA mit anhybridiertem Nukleosid bzw. Nukleotid durch die Nanopore auf die entsprechende Base rückgeschlossen werden kann. Die Verwendung mehrerer Marker für dieselbe Base verbessert die Sequenzierung und ermöglicht dabei eine bessere Detektion an solchen Stellen an welchen sich dieselbe Base mehrmals wiederholt (sogenannte Polynukleotid-Sequenzen).

4. Chemisch modifizierte Nukleoside bzw. chemisch modifizierte Nukleotide zur Verwendung nach Schutzanspruch 1 bzw 2, zusätzlich gekennzeichnet dadurch, daß diese Nukleoside bzw. Nukleotide am Ribosemolekül bzw. am Desoxyribosemolekül über einen Linker mit einem basenspezifischen Markermolekül (z. B. mit einer Nanosphere oder aber auch mit einer geringen chemischen Modifikation) verbunden sind, bzw. versehen wurden, so daß anhand der Signaländerung bei Durchtritt der modifizierten Nukleoside bzw. Nukleotide durch die Nanopore auf die entsprechende Base rückgeschlossen werden kann.

5. Chemisch modifizierte Nukleoside bzw. chemisch modifizierte Nukleotide zur Verwendung nach Schutzanspruch 1 bzw 2, zusätzlich gekennzeichnet dadurch, daß diese Nukleoside bzw. Nukleotide kein freies OH Molekül besitzen (kein freies 3'OH am Zuckermolekül), so daß eine Polymerisation der makierten Basen aneinander ausgeschlossen ist.

6. Abweichend von Schutzanspruch 1 bis 3 eine Methode zur DNA-Sequenzierung mittels vieler paralleler Sensoren, die jeweils biologischen oder nicht-biologischen Nanoporen, also z. B. auf einem Halbleiter gelegenen Nanoporen bzw. Öffnungen in der Halbleiteroberfläche, entsprechen, und die jeweils mit Elektroden auf beiden Seiten der Nanopore bzw. Öffnung versehen sind, wobei die Nanoporen mit jeweils einem zu sequenzierendem Molekül DNA- oder RNA bestückt werden, welches durch diese Nanopore hindurchgeführt wird, wobei markierte, chemisch modifizierte (Nukleo-)Basen, Nukleoside oder Nukleotide an den jeweils einzelsträngigen DNA bzw. RNA Strang anhybridiert werden, gekennzeichnet dadurch, daß jeweils chemisch modifizierte (Nukleo-)Basen, Nukleoside bzw. Nukleotide an jeden der einzelsträngigen DNA bzw. RNA Stränge anhybridiert werden und somit gebunden werden und durch die biologischen bzw. halbleiterbasierten Nanoporen hindurch geführt werden und bei Passage der Nanopore jeweils eine Leitfähigkeitsänderung nach dem Coulter Prinzip hervorrufen, die jeweils durch die entsprechende Elektroden Kombination detektiert wird. Dieser Anspruch betrifft die Skalierung der Nanopore zum Zweck der massiven parallelen Sequenzierung.

Description:

Die Sequenzierung der DNA im großen Stil ist eines der großen Abenteuer, das die Menschheit in Kürze erwartet. Hierzu ist es jedoch notwendig große DNA Mengen in kurzer Zeit kostengünstig zu sequenzieren.

Eine Möglichkeit die DNA Sequenzierung durchzuführen besteht im Hindurchleiten des DNA bzw RNA Strangs durch eine Nanopore. Entsprechend dem Coulter Prinzip kommt es dabei zu einer Unterbrechung des Ionenflusses durch diese Nanopore hindurch. Diese Änderung des Ionenflusses lässt sich in Form einer Änderung eines elektrischen Messsignals (Spannung, Leitfähigkeit und/oder Widerstand) in einer entsprechenden Schaltung registrieren.

Ein wesentlicher Nachteil besteht in der strukturellen Ähnlichkeit der Basen, so daß die Unterbrechung des Ionenflusses bei allen Basen sehr ähnlich ist. Hier setzt die vorliegende Erfindung an (Schutzansprüche 1 bis 3). Durch Hybridisierung und Reaktion mit chemisch modifizierten Nukleosiden bzw. mit chemisch modifizierten Nukleotiden kann die Unterscheidung der Basen verbessert werden. Durch Anbringen einer Markierung an die Basen bzw. bevorzugt an die Ribosereste bzw Desoxyribosereste der Nukleotide werden diese deutlich unterschiedlich und somit leichter detektierbar. Anschließend sollen diese modifizierten Basen an den zu sequenzierenden DNA bzw. RNA Strang anhybridisiert werden. Hierzu werden die Basen schlicht zugegeben und können sich sodann an den einzelsträngigen DNA bzw. RNA Strang anlagern. Dabei soll die Markierung basenspezifisch erfolgen, d. h. jede Base erhält ihre eigene basenspezifische Markierung. Repetitive Basensequenzen lassen sich leichter und besser erfassen, wenn mehrere modifizierte Nukleotide bzw. Nukleotide zur Reaktion mit derselben Base zur Verfügung stehen. Die Nukleotide sind z. B. so markiert, daß über einen Linker Molekülgruppen (z. B. Nanosheren) an die Nukleotide (z. B. an die Ribose bzw an die Desoxyribosemolekül-Gruppe) gebunden werden, die zu deutlichen Signaländerungen bei Passage der dann modifizierten Nukleinsäure durch die Nanopore hindurch führen. Aber auch deutlich kleinere chemische Modifikationen reichen aus (z. B. Methylierung, Ethylierung der Nukleotide). um die hier erforderliche elektrochemische Unterscheidung der Basen mittels einer Nanopore zu erreichen. Zudem werden Molekülgruppen verwendet, die basenspezifisch sind, so daß auf diese Weise eine Unterscheidung der Basen möglich wird. Auf diese Weise wird die Sequenzierung des DNA bzw. RNA Strangs erreicht.

Hierzu wird eine biologische oder eine halbleiterbasierte Nanopore mit Elektroden auf beiden Seiten der Nanopore verwendet. Im einfachsten Fall handelt es sich um eine Öffnung der obersten Schicht des Halbleitermaterials mit einer darunter gelegenen Vertiefung des Halbleitermaterials mit Elektroden auf beiden Seiten der Öffnung.

Die Nanopore kann auch einer biologischen Nanopore in einer biologischen Lipid-Doppelmembran entsprechen.

Ferner kann die Nanopore eine halbleiterbasierte Nanopore bzw. Öffnung im Halbleitermaterial mit Elektroden auf beiden Seiten dieser Nanopore bzw. Öffnung sein.

Bislang wird hierbei meist das DNA Molekül selbst durch die halbleiter-basierte solid-state Nanopore hindurchbewegt. Auf diesem Weg kann dann die DNA Sequenz beim Transit ausgelesen. Dieser Prozess ist bislang sehr fehleranfällig, da sich die einzelnen Nukleotide nur sehr wenig in ihrer chemischen Struktur voneinander unterscheiden.

Hier setzt die vorliegende Erfindung an. Dem einzelsträngigen DNA bzw. RNA Strang werden Nukleotide bzw. Nukleoside anhybridisiert, die selbst chemisch modifiziert sind, so daß sie sich deutlicher voneinander unterscheiden und so daß bei Durchleiten der einzelsträngigen Nukleinsäure mit anhybridiserten modifizierten Basen bzw. Nukleosiden, bzw. Nukleotiden durch eine Nanopore eine direkte Sequenzierung möglich wird.

Beschreibung der Zeichnung

Zu sehen ist eine Öffnung im Halbleitermaterial. Die Nukleosidtriphosphate sind mit Mikrospheren an den Riboseresten markiert, in der Zeichnung als Kugeln gekennzeichnet. Die modifizierten Nukleoside werden an den einzelsträngigen Nukleinsäurestrang anhybridisiert. Beim Durchtritt durch die Nanopore gelangen sie so in die Sensing zone der Messanordnung und es erfolgt nach dem Coulter Prinzip ein Messsignal. Da die jeweilige Modifikation basenspezifisch ist, lässt das Messsignal postwendend einen Rückschluß auf das jeweilige Nukleotid und damit auf die Basenfolge zu.