Title:
Zellpopulationsanalyse
Kind Code:
U1


Abstract:

Vorrichtung zur Durchführung eines Analyseverfahrens unter Verwendung von Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometrie, wobei die Vorrichtung eingerichtet ist zum:
(a) Verwenden einer ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Rauch, Aerosol oder Dampf aus einer In-vitro- oder Ex-vivo-Zielzellpopulation und/oder einem davon abgeleiteten Kulturmedium;
(b) zum Durchführen einer Massenanalyse und/oder Ionenmobilitätsanalyse des Rauchs, Aerosols oder Dampfs oder davon abgeleiteter Ionen, um spektrometrische Daten zu erhalten; und
(c) zum Analysieren der spektrometrischen Daten, um die Zielzellpopulation oder eine oder mehrere Zellen und/oder Verbindungen, die in der Zielzellpopulation und/oder in dem davon abgeleitetem Kulturmedium vorhanden sind, zu identifizieren und/oder charakterisieren, wobei die Zellpopulation mutierte und/oder transgene Zellen aufweist oder aus mutierten und/oder transgenen Zellen besteht.




Application Number:
DE202016008460U
Publication Date:
01/22/2018
Filing Date:
03/07/2016
Assignee:
(MICROMASS UK LIMITED, Wilmslow, GB)
International Classes:



Foreign References:
GB1503876A1978-03-15
GB1503864A1978-03-15
GB1518369A1978-07-19
GB1503877A1978-03-15
GB1503867A1978-03-15
GB1503863A1978-03-15
GB1503878A1978-03-15
GB1503879A1978-03-15
GB1516003A1978-06-28
Other References:
Strittmatter et al. Anal. Chem. 2014, 86, 6555–6562
Robert H. Shoemaker „The NCI60 human tumour cell line anticancer drug screen”, Nature Reviews Cancer 6, 813–823, Oktober 2006
Weinstein „Integromic analysis of the NCI-60 cancer cell lines”, Breast Dis. 2004; 19: 11–22
Gholami, Amin M., et al., Global Proteome Analysis of the NCI-60 Cell Line Panel. Cell Reports, 2013. 4(3): S. 609–620
Shamir und Ewald, Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 647–664 (2014)
„LipidBlast – in-silico tandem mass spectrometry database for lipid identification” von Kind et al., Nat Methods. August 2013; 10(8): 755–758; „LipidXplorer: A Software for Consensual Cross-Platform Lipidomics” von Herzog et al. PLoS ONE 7(1): e29851
„Lipid classification, structures and tools” von Fahy et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids, Band 1811, Ausgabe 11, November 2011, Seite 637–647, Lipidomics and Imaging Mass Spectrometry
Gholami et al., supra
Attorney, Agent or Firm:
Dehns Germany, 80333, München, DE
Claims:
1. Vorrichtung zur Durchführung eines Analyseverfahrens unter Verwendung von Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometrie, wobei die Vorrichtung eingerichtet ist zum:
(a) Verwenden einer ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Rauch, Aerosol oder Dampf aus einer In-vitro- oder Ex-vivo-Zielzellpopulation und/oder einem davon abgeleiteten Kulturmedium;
(b) zum Durchführen einer Massenanalyse und/oder Ionenmobilitätsanalyse des Rauchs, Aerosols oder Dampfs oder davon abgeleiteter Ionen, um spektrometrische Daten zu erhalten; und
(c) zum Analysieren der spektrometrischen Daten, um die Zielzellpopulation oder eine oder mehrere Zellen und/oder Verbindungen, die in der Zielzellpopulation und/oder in dem davon abgeleitetem Kulturmedium vorhanden sind, zu identifizieren und/oder charakterisieren, wobei die Zellpopulation mutierte und/oder transgene Zellen aufweist oder aus mutierten und/oder transgenen Zellen besteht.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Analysierens das Analysieren der spektrometrischen Daten umfasst, um (i) die Fähigkeit einer Zellpopulation, eine therapeutische Substanz herzustellen, zu analysieren; (ii) den Genotyp und/oder Phänotyp der Zellpopulation oder eines oder mehrerer darin vorhandener Zelltypen zu analysieren; (iii) einen Prozess zu analysieren, der die Zellpopulation oder einen oder mehrere darin vorhandene Zelltypen umfasst; (iv) die Wirkung einer Manipulation des Genotyps und/oder Phänotyps der Zellpopulation oder eines oder mehrerer darin vorhandener Zelltypen zu analysieren; (v) die Wirkung einer Substanz auf die Zellpopulation oder einen oder mehrere darin vorhandene Zelltypen zu analysieren; (vi) die Herstellung einer Substanz zu analysieren; (vii) die Lebensfähigkeit der Zellpopulation zu analysieren.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, welche eingerichtet ist um zu bewirken, dass das Aerosol, der Rauch oder der Dampf oder der Analyt darin auf eine Kollisionsfläche aufprallt, die sich innerhalb einer Vakuumkammer eines Spektrometers befindet, um eine Mehrzahl von Analytionen zu erzeugen.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, die ferner eingerichtet ist zum Hinzufügen einer Matrix zum Aerosol, Rauch oder Dampf.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Matrix aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (i) einem Lösungsmittel für das Aerosol, den Rauch oder den Dampf oder den Analyt darin; (ii) einem organischem Lösungsmittel; (iii) einer flüchtigen Verbindung; (iv) polaren Molekülen; (v) Wasser; (vi) einem oder mehreren Alkoholen; (vii) Methanol; (viii) Ethanol; (ix) Isopropanol; (x) Aceton; (xi) Acetonitril; (xii) 1-Butanol; (xiii) Tetrahydrofuran; (xiv) Ethylacetat; (xv) Ethylenglykol; (xvi) Dimethylsulfoxid; einem Aldehyd; (xviii) einem Keton; (xiv) nichtpolaren Molekülen; (xx) Hexan; (xxi) Chloroform; und (xxii) Propanol.

6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Schritt des Verwendens der ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Aerosol, Rauch oder Dampf aus einer oder mehreren Regionen des Ziels ferner das Bestrahlen des Ziels mit einem Laser umfasst.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die erste Vorrichtung eine Ionenquelle umfasst oder einen Teil dieser bildet, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (i) einer Schnelle-Verdunstungsionisations-Massenspektrometrie-(REIMS)-Ionenquelle; (ii) einer Desorptionselektrosprayionisation-(DESI)-Ionenquelle; (iii) einer Laserdesorptionsionisations-(LDI)-Ionenquelle; (iv) einer Wärmedesorptionsionenquelle; (v) einer Laserdiodenwärmedesorptions-(LDTD)-Ionenquelle; (vi) einer Desorptionselektroflussfokussierungs-(DEFFI)-Ionenquelle; (vii) einer Dielektrische-Barriere-Entladungs-(DBD)-Plasmaionenquelle; (viii) einer Atmosphärenfeststoffanalysesonde-(ASAP)-Ionenquelle; (ix) einer Ultraschallgestützte-Sprayionisation-Ionenquelle; (x) einer Einfache-Umgebungs-Schallspray-Ionisations-(EASI)-Ionenquelle; (xi) einer Desorptionsatmosphärendruckphotoionisations-(DAPPI)-Ionenquelle; (xii) einer Papierspray-(PS)-Ionenquelle; (xiii) einer Strahldesorptionsionisations-(JeDI)-Ionenquelle; (xiv) einer Touchspray-(TS)-Ionenquelle; (xv) einer Nano-DESI-Ionenquelle; (xvi) einer Laserablationselektrospray-(LEASI)-Ionenquelle; (xvii) einer Direkte-Analyse-in-Echtzeit-(DART)-Ionenquelle; (xviii) einer Sondenelektrosprayionisations-(PESI)-Ionenquelle; (xix) einer Feststoffsondengestützte-Elektrosprayionisations-(SPA-ESI)-Ionenquelle; (xx) einer Cavitron-chirurgischer Ultraschallaspirator-(CUSA)-Vorrichtung; (xxi) einer CUSA-Diathermie-Hybridvorrichtung; (xxii) einer Fokussierte- und Unfokussierte-Ultraschallablationsvorrichtung; (xxiii) einer Fokussierte- und Unfokussierte-Ultraschallablations- und Diathermie-Hybridvorrichtung; (xxiv) einer Mikrowellenresonanzvorrichtung; (xxv) einer gepulsten Plasma-HF-Seziervorrichtung; (xxvi) einer Argonplasmakoagulationsvorrichtung; (xxvi) einer Gepulste-Plasma-HF-Sezier- und Argonplasmakoagulations-Hybridvorrichtung; (xxvii) einer Gepulste-Plasma-HF-Sezier- und JeDi-Hybridvorrichtung; (xxviii) einer chirurgischen Wasser/Saline-Strahlvorrichtung; (xxix) einer Elektrochirurgie- und Argonplasmakoagulations-Hybridvorrichtung; und (xxx) einer Argonplasmakoagulations- und Wasser/Saline-Strahl-Hybridvorrichtung.

8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Zellpopulation auf Basis der spektrometrischen Daten als humane und/oder nicht-humane tierische Zellen umfassend oder aus diesen bestehend identifiziert, bestätigt oder authentifiziert wird.

9. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das durchzuführende Verfahren an einer Zellpopulation durchgeführt wird, die authentifiziert werden muss, und das Verfahren das Analysieren der spektrometrischen Daten umfasst, um (i) die Authentizität der Zellpopulation zu bestätigen; (ii) eine Mutation in der Zellpopulation nachzuweisen; oder (iii) eine unerwünschte Variation in der Zellpopulation nachzuweisen.

10. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das durchzuführende Verfahren das Analysieren der spektrometrischen Daten umfasst, um (i) zu ermitteln, ob oder nicht die Zellpopulation an einer Infektion leidet; (ii) zu ermitteln, ob oder nicht die Zellpopulation infektionsfrei ist; (iii) zu ermitteln, ob oder nicht die Zellpopulation von einer Infektion geheilt wurde; (iv) das Fortschreiten oder Stadium einer Infektion einer Zellpopulation zu ermitteln; und/oder (v) das Fortschreiten oder Stadium einer Behandlung gegen eine Infektion einer Zellpopulation zu ermitteln.

11. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das durchzuführende Verfahren das Analysieren der spektrometrischen Daten umfasst, um die Wirkung einer Genotyp- und/oder Phänotypmanipulation auf einen zellulären Prozess, eine Krankheit, eine Arzneimittelherstellung durch eine Zellpopulation und/oder die Reaktion einer Zellpopulation auf eine Substanz und/oder Umgebungsbedingung zu analysieren.

12. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das durchzuführende Verfahren das Analysieren der spektrometrischen Daten umfasst, um die Wirkung einer Mutagenese auf die Zellpopulation zu analysieren.

13. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das durchzuführende Verfahren ein Screeningverfahren, insbesondere ein Hochdurchsatz-Screeningverfahren ist.

14. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das durchzuführende Verfahren für die Arzneimittelentdeckung und/oder Arzneimittelanalyse verwendet wird.

15. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Ziel eine erste Zielprobe ist und die spektrometrischen Daten erste spektrometrische Daten sind; und wobei das Verfahren ferner das Erzeugen von Aerosol, Rauch oder Dampf aus einer zweiten, unterschiedlichen Zielprobe; eine Massenanalyse und/oder Ionenmobilitätanalyse des Aerosols, des Rauchs oder des Dampfs, wie aus der zweiten Zielprobe erzeugt, oder von Ionen, die davon abgeleitet sind, um zweite spektrometrische Daten zu erhalten; und das Vergleichen der ersten und der zweiten spektrometrischen Daten, um Unterschiede zwischen der ersten und der zweiten Zielprobe zu ermitteln, umfasst.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei die erste Zellpopulation eine erste genetische Modifikation umfasst und die zweite Zellpopulation die erste genetische Modifikation nicht umfasst, und wobei das Verfahren das Analysieren der ersten und der zweiten spektrometrischen Daten umfasst, um die Wirkung der ersten genetischen Modifikation zu analysieren.

17. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei die erste Zellpopulation eine erste genetische Modifikation umfasst und die zweite Zellpopulation eine zweite genetische Modifikation umfasst, und wobei das Verfahren das Analysieren der ersten und der zweiten spektrometrischen Daten umfasst, um die Wirkung der zweiten genetischen Modifikation zu analysieren.

18. Gerät, umfassend:
eine erste Vorrichtung zum Erzeugen von Rauch, Aerosol oder Dampf aus einer In-vitro- oder Ex-vivo-Zielzellpopulation;
ein Massenspektrometer und/oder Ionenmobilitätsspektrometer zum Analysieren des Rauchs, Aerosols oder Dampfs oder davon abgeleiteter Ionen, um spektrometrische Daten zu erhalten; und
einen Prozessor, der zum Analysieren der spektrometrischen Daten ausgelegt ist, um die Zielzellpopulation oder eine oder mehrere Zellen und/oder Verbindungen, die in der Zielzellpopulation vorhanden sind, zu identifizieren und/oder charakterisieren, wobei die Zellpopulation mutierte und/oder transgene Zellen aufweist oder aus mutierten und/oder transgenen Zellen besteht

19. Gerät nach Anspruch 18, wobei der Prozessor zur Analyse der spektrometischen Daten eingerichtet ist, um (i) die Fähigkeit einer Zellpopulation, eine therapeutische Substanz herzustellen, zu analysieren; (ii) den Genotyp und/oder Phänotyp der Zellpopulation oder eines oder mehrerer darin vorhandener Zelltypen zu analysieren; (iii) einen Prozess zu analysieren, der die Zellpopulation oder einen oder mehrere darin vorhandene Zelltypen umfasst; (iv) die Wirkung einer Manipulation des Genotyps und/oder Phänotyps der Zellpopulation oder eines oder mehrerer darin vorhandener Zelltypen zu analysieren; (v) die Wirkung einer Substanz auf die Zellpopulation oder einen oder mehrere darin vorhandene Zelltypen zu analysieren; (vi) die Herstellung einer Substanz zu analysieren; (vii) die Lebensfähigkeit der Zellpopulation zu analysieren.

Description:
QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität und Begünstigung der GB-Patentanmeldung Nr. 1503876.3, eingereicht am 6. März 2015, der GB-Patentanmeldung Nr. 1503864.9, eingereicht am 6. März 2015, der GB-Patentanmeldung Nr. 1518369.2, eingereicht am 16. Oktober 2015, der GB-Patentanmeldung Nr. 1503877.1, eingereicht am 6. März 2015, der GB-Patentanmeldung Nr. 1503867.2, eingereicht am 6. März 2015, der GB-Patentanmeldung Nr. 1503863.1, eingereicht am 6. März 2015, der GB-Patent Nr. 1503878.9, eingereicht am 6. März 2015, der GB-Patentanmeldung Nr. 1503879.7, eingereicht am 6. März 2015, und der GB-Patentanmeldung Nr. 1516003.9, eingereicht am 9. September 2015. Der gesamte Inhalt dieser Anmeldungen ist hier durch Bezugnahme berücksichtigt.

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Massenspektrometer und/oder Ionenmobilitätsspektrometer und insbesondere auf Verfahren zur Massenanalyse und/oder Ionenmobilitätsanalyse von Ex-vivo- oder In-vitro-Zellpopulationen oder Medium, das davon abgeleitet ist, unter Verwendung eines Umgebungsionisationsmassenspektrometrieverfahrens wie z. B. einer Schnelle-Verdunstungsionisations-Massenspektrometrie-(REIMS)-Ionenquelle. Besondere Anwendungen umfassen Zellidentifikation, Zellcharakterisierung, Zellprozessanalyse, Entdeckung pharmazeutischer Verbindungen und Produktion pharmazeutischer Verbindungen.

HINTERGRUND

Die Schnelle-Verdunstungsionisations-Massenspektrometrie (REIMS) ist ein Umgebungsmassenspektrometrieverfahren, das kürzlich für die intraoperative Gewebeidentifikation entwickelt wurde. Bei einer REIMS-Analyse werden biologische Proben durch Joule-Erhitzung schnell erhitzt und das entstehende Aerosol wird direkt in das Massenspektrometer übertragen. Es wurde herausgefunden, dass elektrochirurgische Werkzeuge wie z. B. monopolare Elektroskalpelle oder die bipolare Pinzette, wie sie für gewöhnlich in der Hirnchirurgie verwendet werden, als Ionenquellen nach dem REI-(Schnelle Verdunstungsionisation)-Mechanismus dienen können. Ein chemischer Fingerabdruck der Probe wird durch die Massenspektrometrieanalyse der geladenen Partikel aufgezeichnet, die von dem während der Ionisation erzeugten Aerosol getragen werden. REIMS-Profile zeigen vorwiegend komplexe Phospholipidspezies, die aus den Zellmembranen stammen, und ihre hohe Spezifizität in Bezug auf den histologischen oder histopathologischen Typ der Gewebe wurde gezeigt. Erst vor kurzem wurde die REIMS-Methodik entwickelt, um Mikroorganismen, darunter Bakterien und Pilze, mit ausgezeichneter Genauigkeit auf Spezies-, Gattung- und Gramebene zu charakterisieren und identifizieren.

REIMS-Profile ermöglichen die Differenzierung von sieben Escherichia-coli-Stämmen auf Stammebene mit einer allgemeinen Genauigkeit von 88 % unabhängig von Kultivierungsbedingungen oder Alter der Kolonien. Es wird auf Strittmatter et al. Anal. Chem. 2014, 86, 6555–6562, verwiesen.

Ein wesentliches Ziel ist die Verknüpfung von Lipidomprofil mit Phänotyp. Die übliche Technik der Wahl zur Lipidomprofilerstellung ist die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS). Sogar unter Verwendung von moderner Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (UPLC-MS) liegt die Laufzeit pro Probe jedoch immer noch im Bereich von 10–20 Minuten und erfordert die Analyse eine umfassende Probenvorbereitung (Homogenisierung, Extraktion usw.).

In der jüngeren Vergangenheit wurden diverse massenspektrometrische Profilerstellungsmethodiken entwickelt. Umgebungsmassenspektrometrieverfahren wie z. B. die am häufigsten verwendete Desorptionselektrosprayionisations-Massenspektrometrie (DESI-MS) bietet die Möglichkeiten, Proben in deren nativem Zustand ohne jedwede signifikante Probenvorbereitungsschritte zu analysieren. Diese Umgebungslipidprofilerstellungstechnologien wurden vor Kurzem in Krebsgewebestudien unter anderem verwendet, um die Lipidzusammensetzung von Brustkrebs im Vergleich zu normalem Brustgewebe zu charakterisieren, die Identifikation der Krebsmetastasenbildung innerhalb Lymphknoten, Kolorektalkrebs im Vergleich zu normaler Schleimhaut und Hirnkrebs. Ein komplementärer Ansatz zur Untersuchung des molekularen Hintergrunds von histologisch spezifischen Lipidprofilen würde die Verwendung von Zelllinien umfassen, wodurch die Probenverfügbarkeit und Standardisierung der Probennahme behandelt, die meisten ethischen Einschränkungen aufgehoben und auch funktionelle Tests ermöglicht werden würden, darunter Gen-Silencing oder Stoffwechselflussanalyse.

Zelllinien sind ein beliebtes Mittel zur Untersuchung diverser biochemischer und Krankheitsprozess in vitro. Bei Krebsstudien liefern die Zelllinien ein Mittel zur Untersuchung der Krebsentwicklung und -progression sowie zur Untersuchung pathobiochemischer Prozesse so nah am humanen Körper wie möglich, während immer noch eine freie Manipulation von Experimentparametern möglich ist.

Eine der am umfassendsten charakterisierten Zellliniensammlungen ist das NCI-60-Zelllinienfeld, das vom National Cancer Institute als Teil des In Vitro Cell Line Screening Project (Robert H. Shoemaker „The NCI60 human tumour cell line anticancer drug screen”, Nature Reviews Cancer 6, 813–823, Oktober 2006) zusammengestellt wurde. Das Feld umfasst 60 humane kanzeröse Zelllinien aus neun unterschiedlichen Ursprungsorganen, und zwar Leukämie, Melanom, Lungenkrebs, Kolonkrebs, Hirnkrebs, Eierstockkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs und Nierenkrebs.

Daten, die für diese Zelllinien zur Verfügung stehen, umfassen Arzneimittelempfindlichkeitsmuster für mehr als 100.000 Verbindungen und natürliche Produkte, allgemeine Daten zur Protein- und Genexpression und übliche Mutationen, die mit Krebs assoziiert sind (Weinstein „Integromic analysis of the NCI-60 cancer cell lines”, Breast Dis. 2004; 19: 11–22). Die assoziierten Metabolomik- und Lipidomikdaten sind jedoch vergleichsweise dürftig. Dies stellt eine gewaltige Lücke in den krebsbezogenen biochemischen Daten dar.

Komplexe Lipide sind die Hauptbestandteile von Zellmembranen und spielen wichtige funktionelle, strukturelle und metabolischen Rollen, indem sie als signalgebende Moleküle (z. B. PI-Phosphate, Ceramide, Lysophosphatidsäuren (LPA)) oder als Vorläufer für sekundäre Messenger (z. B. Inositoltriphosphat (IP3)/Diacylglycerol (DAG)) agieren. Änderungen in der Membranlipidzusammensetzung können die Funktion und Verfügbarkeit intrinsischer Membranproteine regulieren und Zellsignalgebungsmechanismen beeinflussen.

Krebs zählt weltweit zu den Hauptursachen für Morbidität und Mortalität, wobei es 2012 ungefähr 14 Millionen neue Fälle und 8,2 Millionen krebsbedingte Todesfälle gab. Die Weltgesundheitsorganisation erwartet einen Anstieg der Anzahl neuer Fälle von ungefähr 70 % in den nächsten 2 Jahrzehnten.

Magen-Darm-Krebse sind eine Hauptursache für Mortalität und sind für 23 % der krebsbedingten Todesfälle weltweit verantwortlich. Um den Ausgang von Krebs und anderen Krankheiten zu verbessern, sind neue Zellcharakterisierungsverfahren erforderlich, so dass eine genaue Diagnose erleichtert wird.

Die Schnelle-Verdunstungsionisations-Massenspektrometrie (REIMS) ist eine Technologie, die kürzlich für die Echtzeit-Identifikation von Geweben während chirurgischer Eingriffe entwickelt wurde. Die Verknüpfung der REIMS-Technologie mit handgehaltenen Probennahmevorrichtungen hat zur iKnife-Probennahmetechnologie geführt, die eine intraoperative Gewebeidentifikation mit einer Genauigkeit von 92–100 % bereitstellen kann.

Die iKnife-Probennahmetechnologie ermöglicht Chirurgen, Tumoren intraoperativ effizienter zu resezieren, indem die entfernte Menge an gesundem Gewebe minimiert und gleichzeitig gewährleistet wird, dass das gesamte kanzeröse Gewebe entfernt wird.

Es wurde gezeigt, dass die REIMS-Analyse von biologischem Gewebe Phospholipidprofile hervorbringt, die eine hohe histologische und histopathologische Spezifität zeigen – ähnlich Techniken unter Verwendung von matrixgestützter Laserdesorptionsionisation (MALDI), Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS), Desorptionselektrosprayionisation-(DESI)-Bildgebung, Strahldesorptionsionisation (JeDI), Laserdesorptionsionisation (LDI), plasmagestützte Desorptionsionisation (PADI), Desorptionsatmosphärendruckphotoionisation (DAPPI) und einfache Umgebungsschallsprayionisation (EASI). Ein massenspektrometrisches Signal wird erhalten, indem die Zellbiomasse elektrischem Wechselstrom bei einer Funkfrequenz ausgesetzt wird, die eine lokalisierte Joule-Erhitzung und die Disruption von Zellen in Kombination mit der Desorption von geladenen und neutralen Partikeln verursacht. Das entstehende Aerosol oder der entstehende chirurgische Rauch wird danach zur On-line-Massenspektrometrieanalyse in ein Massenspektrometer übertragen.

Die bekannte REIMS-Technik wird für gewöhnlich an externen Geweben oder durch Chirurgie zugängliche Geweben durchgeführt.

Herkömmliche Verfahren zum Screenen auf potenzielle therapeutische Mittel, die mit Zelllinien interagieren, sind bekannt.

Es ist erwünscht, verbesserte Verfahren zur Umgebungsionisations-Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometrie und ein Gerät zum Durchführen einer Umgebungsionisations-Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometrie bereitzustellen.

KURZDARSTELLUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein Analyseverfahren unter Verwendung von Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometrie bereit, umfassend:

  • (a) Verwenden einer ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Rauch, Aerosol oder Dampf aus einer In-vitro- oder Ex-vivo-Zielzellpopulation und/oder einem davon abgeleiteten Medium;
  • (b) Durchführen einer Massenanalyse und/oder Ionenmobilitätsanalyse des Rauchs, Aerosols oder Dampfs oder davon abgeleiteter Ionen, um spektrometrische Daten zu erhalten; und
  • (c) Analysieren der spektrometrischen Daten, um eine oder mehrere Zellen und/oder Verbindungen, die in der Zielzellpopulation und/oder in dem davon abgeleitetem Medium vorhanden sind, zu identifizieren und/oder charakterisieren.

Optionale weitere Details der Erfindung sind in der ausführlichen Beschreibung und in den Ansprüchen gegeben.

Diverse Ausführungsformen werden in Betracht gezogen, wobei Analytionen aus dem Ziel, dem Rauch, dem Aerosol oder dem Dampf erzeugt werden, z. B. durch eine Umgebungsionisationsionenquelle. Die Analytionen oder davon abgeleiteten Ionen können unterzogen werden entweder: (i) einer Massenanalyse durch einen Massenanalysator wie z. B. einen Quadrupol-Massenanalysator oder einen Flugzeit-Massenanalysator; (ii) einer Ionenmobilitätsanalyse (IMS) und/oder einer differenziellen Ionenmobilitätsanalyse (DMA) und/oder Feld-Asymmetrische-Ionenmobilität-Spektrometrie-(FAIMS)-Analyse; und/oder (iii) einer Kombination aus zunächst Ionenmobilitätanalyse (IMS) und/oder differenzieller Ionenmobilitätsanalyse (DMA) und/oder Feld-Asymmetrische-Ionenmobilität-Spektrometrie-(FAIMS)-Analyse, gefolgt von zweitens einer Massenanalyse durch einen Massenanalysator wie z. B. einen Quadrupol-Massenanalysator oder einen Flugzeit-Massenanalysator (oder umgekehrt). Diverse Ausführungsformen beziehen sich auch auf ein Ionenmobilitätsspektrometer und/oder einen Massenanalysator und ein Ionenmobilitätsspektrometrieverfahren und/oder ein Massenanalyseverfahren.

Das Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometer können Daten nur im Negativ-Ionenmodus, nur im Positiv-Ionenmodus oder sowohl im Positiv- als auch Negativ-Ionenmodus erhalten. Spektrometrische Daten im Positiv-Ionenmodus können mit spektrometrischen Daten im Negativ-Ionenmodus kombiniert oder verkettet werden. Der Negativ-Ionenmodus kann besonders nützliche Spektren zum Klassifizieren von Aerosol-, Rauch- oder Dampfproben wie z. B. Aerosol-, Rauch- oder Dampfproben aus lipidumfassenden Zielen bereitstellen.

Ionenmobilitätsspektrometrische Daten können unter Verwendung unterschiedlicher Ionenmobilitäts-Driftgase erhalten werden oder Dotierungsmittel können zum Driftgas hinzugefügt werden, um eine Änderung der Driftzeit einer oder mehrerer Spezies zu induzieren. Diese Daten können danach kombiniert oder verkettet werden.

Andere Ausführungsformen werden in Betracht gezogen, wobei die erste Vorrichtung zum Erzeugen von Aerosol, Rauch oder Dampf aus dem Ziel eine Argonplasmakoagulations-(APC)-Vorrichtung umfassen kann. Eine Argonplasmakoagulationsvorrichtung umfasst die Verwendung eines Strahls ionisierten Argongases (Plasma), der durch eine Sonde gelenkt wird. Die Sonde kann durch ein Endoskop geführt werden. Die Argonplasmakoagulation ist im Wesentlichen ein kontaktloser Prozess, da die Sonde in einem gewissen Abstand zum Ziel platziert wird. Argongas wird aus der Sonde emittiert und danach durch eine Hochspannungsentladung (z. B. 6 kV) ionisiert. Elektrischer Hochfrequenzstrom wird danach durch den Gasstrahl geleitet, was zu einer Koagulation des Ziels am anderen Ende des Strahls führt. Die Koagulationstiefe ist für gewöhnlich nur ein paar Millimeter.

Die erste Vorrichtung, das/die erste chirurgische oder elektrochirurgische Werkzeug, Vorrichtung oder Sonde oder andere Probennahmevorrichtung oder -sonde, wie unter einem beliebigen der vorliegenden Aspekte oder Ausführungsformen offenbart, kann eine kontaktlose chirurgische Vorrichtung wie z. B. eines oder mehreres einer hydrochirurgischen Vorrichtung, einer chirurgischen Wasserstrahlvorrichtung, einer Argonplasmakoagulationsvorrichtung, einer Hybrid-Argonplasmakoagulationsvorrichtung, einer Wasserstrahlvorrichtung und einer Laservorrichtung umfassen.

Eine kontaktlose chirurgische Vorrichtung kann als chirurgische Vorrichtung definiert sein, die so ausgelegt und ausgestaltet ist, dass sie biologisches Gewebe seziert, fragmentiert, verflüssigt, ansaugt, verschorft oder anderweitig disruptiert, ohne das Gewebe dabei physisch zu berühren. Beispiele umfassen Laservorrichtungen, hydrochirurgische Vorrichtungen, Argonplasmakoagulationsvorrichtungen und Hybrid-Argonplasmakoagulationsvorrichtungen.

Da die kontaktlose Vorrichtung ggf. nicht dem Gewebe physisch in Kontakt gelangt, kann die Verfahrensweise als relativ sicher angesehen und verwendet werden, um heikles Gewebe mit geringen intrazellulären Bindungen zu behandeln, wie z. B. Haut oder Fett.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Diverse Ausführungsformen werden nun lediglich beispielhaft und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen:

die 1A1C einen experimentellen Aufbau zeigen, der für die REIMS-Analyse einer Zellpopulation und/oder eines davon abgeleiteten Mediums verwendet wird, das in einem hierin bereitgestellten Verfahren verwendet werden kann, 1D eine Schnittstelle zum Ionisieren von Aerosol aus den Zielzellen und/oder dem Medium zeigt und die 1E1F ein DESI-Verfahren zum Analysieren von Zielzellen und/oder Medium zeigen;

2 das experimentelle Schema zeigt, das für die Bewertung der spektralen REIMS-Reproduzierbarkeit verwendet wurde;

3 eine PCA-Graphik des NCI-60-Zelllinienfelds, m/z 150–1000, zeigt, wobei Replikate hervorgehoben sind;

4 die Ergebnisse eines Vergleichs von Zelllinien- und Bulk-Krebsgewebespektren zeigt. Es sind m/z-Werte gezeigt, die als in kanzerösem Bulk-Gewebe oder Krebszelllinien signifikant erhöht befunden wurden. M/z-Werte wurden unter Verwendung einer einfaktorielle ANOVA analysiert. Die m/z, die im kanzerösen Bulk-Gewebe oder Krebszelllinien signifikant erhöht sind, sind m/z 644,44 (p = 1,3919e-05), m/z 659,46 (p + 1,2662e-05), m/z 766,54 (p = 1,4088e-05), m/z 768,55 (p = 1,4088e-05), m/z 794,57 (p = 1,4088e-05), m/z 885,54 (p = 1,4088e-05), m/z 750,54 (p = 1,4088e-05), m/z 790,53 (p = 2,1978e-05) und m/z 750,54 (p = 1,4088e-05);

5A das PE(38:3)/PE(38:2)-Peakintensitätsverhältnis zeigt und 5B die PE(38:3)-Peakintensität als Funktion der FADS2-Proteinexpression zeigt (für die FADS2-Proteinexpression wird auf Gholami, Amin M., et al., Global Proteome Analysis of the NCI-60 Cell Line Panel. Cell Reports, 2013. 4(3): S. 609–620, verwiesen);

6A repräsentative massenspektrale Profile zwischen m/z 600–900 zeigt, wie für HeLa-, MES-SA- bzw. SNB-Zelllinienpellet erhalten; und 6B eine dreidimensionale PCA-Graphik gemittelter REIMS-Daten zeigt, die aus mehreren unabhängigen Kulturen von HeLa-, MES-SA- und SNB-19-Zellen über den spektralen Massenbereich von m/z 600–900 gesammelt wurden, wobei Kreise, Quadrate und Dreiecke unterschiedliche Messzeiten darstellen (Tag 1, Tag 2 oder Tag 3) und Schatten Passage-Zahlen (p4 für 4 Passages und p6 für 6 Passages) widergeben;

7 eine hierarchische Clusteranalyse zeigt und zeigt, wie durch die REIMS erhaltene Lipidomprofile Zelllinien des NCI-60-Felds unterscheiden, das aus Eierstock-(OV)-, Nieren-(RE)-, Melanom-(ME)-, Zentrales-Nervensystem-(CNS)-, Brust-(BR)-, Lungen-(LC)-, Kolon-(CO), Leukämie-(LE)- und Prostata-(PR)-Ursprung bestehen, wobei das Clusterdendrogramm des NCI-60-Felds unabhängig kultivierte Replikate (durch Sternchen hervorgehoben) oder biologisch verwandte Zelllinien (Pfeile) umfasst, und wobei ein Abstand unter Verwendung der Pearson-Korrelation und Agglomeration über die Ward-Metrik berechnet wurde;

8 eine zweidimensionale PCA-Graphik von gemittelten REIMS-Daten zeigt, die aus den NCI-60-Zellen (Quadrate) und Krebsgewebeproben (Kreise) gesammelt wurden, wobei das Ursprungsgewebe Kolon oder Eierstock ist;

die 9A9D einen Vergleich von spektralen Profilen für Bulk-Gewebeproben und Zelllinien des entsprechenden Ursprunggewebetyps zeigen. 9A das massenspektrale Profil für Bulk-Eierstockkrebsgewebe zeigt, 9B ein entsprechendes massenspektrales Profil für die Eierstockkrebszelllinie OVCAR-3 zeigt, 9C ein massenspektrales Profil für Bulk-Kolorektalkrebsgewebe zeigt und 9D ein massenspektrales Profil für die Kolonkrebszelllinie HCT-15 zeigt;

10A ein Histogramm der Korrelationswerte zwischen dem fads2-Genexpressionsprofol und gruppierter m/z-Peakintensitäten zeigt und 10B Korrelationswerte mit fads2-Genexpression als Funktion von m/z-Werten zeigt, und die putativen Lipide, die den hochkorrelierten m/z-Signalen entsprechen;

11A eine gruppierte Peakintensität von m/z 786,54 in Korrelation mit skalierter fads2-Genexpression zeigt; 11B ein Verhältnis von Intensitätswerten von Peaks bei 768,55 und 770,57 in Korrelation mit skalierter fads2-Genexpression zeigt und 11C eine relative Abundanz der Spitzen m/z 768,55 und 770,57 in den unbearbeiteten REIMS-Daten zeigt, wie in HL-60-Zellen (Leukämie, links) und HT-29-Zellen (Kolon, rechts) erhalten;

12A ein Histogramm der Korrelationswerte zwischen ugcg-Genexpressionshöhen und m/z-Peakintensitäten zeigt und 12B Korrelationswerte mit ugcg-Genexpression als Funktion von m/z-Werten zeigt;

13 MS/MS-Spektren für Ausgangsionen von m/z = 842, 844 und 846 zeigt, die als glykosylierte Ceramide identifiziert wurden;

14A die massenspektrometrische Signalintensität (TIC-normalisiert und log-transformiert) als Funktion der ugcg-Genexpression für m/z = 842,63 zeigt, 14B für m/z = 844,65 zeigt, 14C für m/z = 846,65 zeigt, 14D für m/z = 735,53 zeigt, 14E für m/z = 818,63 zeigt und 14F für m/z = 872,66 zeigt;

15 ein Analyseverfahren, das das Erstellen eines Klassifizierungsmodells umfasst, gemäß diversen Ausführungsformen zeigt;

16 einen Satz von Referenzprobenspektren, wie anhand von zwei Klassen bekannter Referenzproben erhalten zeigt;

17 einen multivariaten Raum mit drei Dimensionen zeigt, die durch Intensitätsachsen definiert sind, wobei der multivariate Raum mehrere Referenzpunkte umfasst, wobei jeder Referenzpunkt einem Satz von drei Peakintensitätswerten entspricht, wie von einem Referenzprobenspektrum abgeleitet;

18 eine allgemeine Beziehung zwischen kumulativer Varianz und der Anzahl von Komponenten eines PCA-Modells zeigt;

19 einen PCA-Raum mit zwei Dimensionen zeigt, der durch Hauptkomponentenachsen definiert ist, wobei der PCA-Raum mehrere transformierte Referenzpunkte oder -punktewerte umfasst, wobei jeder transformierte Referenzpunkt oder -punktewert einem Referenzpunkt von 17 entspricht;

20 einen PCA-LDA-Raum mit einer einzelnen Dimension oder Achse zeigt, wobei die LDA auf Basis des PCA-Raums von 19 durchgeführt wird, wobei der PCA-LDA-Raum mehrere weitertransformierte Referenzpunkte oder Klassenpunktewerte umfasst, wobei jeder weitertransformierte Referenzpunkt oder Klassenpunktewert einem transformierten Referenzpunkt oder -wert von 19 entspricht.

21 ein Analyseverfahren, das das Verwenden eines Klassifizierungsmodells umfasst, gemäß diversen Ausführungsformen zeigt;

22 ein Probenspektrum zeigt, das anhand einer unbekannten Probe erhalten wurde;

23 den PCA-LDA-Raum von 20 zeigt, wobei der PCA-LDA-Raum ferner einen projizierten PCA-LDA-Probenpunkt umfasst, der von den Peakintensitätswerten des Probenspektrums von 22 abgeleitet wurde;

24 ein Analyseverfahren, das das Erstellen einer Klassifizierungsbibliothek umfasst, gemäß diversen Ausführungsformen zeigt;

25 ein Analyseverfahren, das das Verwenden einer Klassifizierungsbibliothek umfasst, gemäß diversen Ausführungsformen zeigt;

26 Peakintensitäten für m/z = 747,52 in mycoplasmainfizierten und mycoplasmafreien Zelllinien während der Dauer der Behandlung mit Plasmocin® zeigt, wobei Tag 1 der Ursprungsprobe (mycoplasmapositiv oder -negativ) entspricht, Tag 2 der Zugabe von Plasmocin® entspricht, Tag 3 dem entspricht, dass Plasmocin® immer noch vorhanden ist, Tag 4 dem Entfernen von Plasmocin® entspricht und wobei Tag 5 dem entspricht, dass alle Proben mycoplasmafrei sind;

27A eine Anzahl von signifikant höheren m/z-Signalen in mycoplasmainfizierten versus mycoplasmafreien Proben in HEK- und HeLa-Zelllinien zeigt. Für 27B waren mycoplasmainfizierte (+) und mycoplasmafreie (–) HEK-Zellen (Rechteck) und HeLa-Zellen (Dreieck) entweder behandelt (t) oder unbehandelt (u). Proben sind als Funktion von PC1 und PC2 von PCA-transformierten Proben im Raum von 18 überlappenden m/z-Signalen gezeigt. und

28A und 28B Intensitäten von TIC-normalisierten und log-transformierten Signalen bei m/z = 819,52 (entspricht PG(40:7)) in mycoplasmafreien, mycoplasmainfizierten und mit PlasmocinTM behandelten Proben in HeLa-Zelllinien (28A) und HEK-Zelllinien (28B) zeigen.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Auch wenn die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, wird der Fachmann verstehen, dass diverse Änderungen an Form und Details vorgenommen werden können, ohne sich vom Umfang der Erfindung, wie er in den beiliegenden Ansprüchen definiert ist, zu entfernen.

Identifikationsverfahren auf Basis von Massenspektrometrie (MS) wie z. B. Umgebungsionisations-Massenspektrometrie sind bekannt. Die direkte Umgebungsionisations-Massenspektrometrie wie z. B. REIMS hat sich als Technologie entwickelt, die eine Echtzeit-Analyse von Zielen ermöglicht.

Die hierin beschriebene Erfindung kann z. B. in oder mit einem robusten Echtzeit-Charakterisierungswerkzeug verwendet werden, das Umgebungsionisationstechnologien wie z. B. REIMS verwendet.

Diverse Ausführungsformen sind nachstehend ausführlicher beschrieben und beziehen sich im Allgemeinen auf das Erzeugen von Rauch, Aerosol oder Dampf aus einem Ziel (diesbezügliche Details sind hierin andernorts zu finden, z. B. eine In-vitro- oder Ex-vivo-Zellpopulation oder davon abgeleitetes Zielmaterial) unter Verwendung einer Umgebungsionisations-Ionenquelle. Das Aerosol, der Rauch oder der Dampf kann danach mit einer Matrix vermischt und in eine Vakuumkammer eines Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometers gesaugt werden. Es kann bewirkt werden, dass die Mischung auf eine Kollisionsfläche auftrifft, wodurch das Aerosol, der Rauch oder der Dampf durch Stoßionisation ionisiert wird, was zur Erzeugung von Analytionen führt. Die entstehenden Analytionen (oder Fragment- oder Produktionen, die von den Analytionen abgeleitet sind) können danach einer Massen- und/oder Ionenmobilitätsanalyse unterzogen werden und die entstehenden massen- und/oder ionenmobilitätsspektrometrischen Daten können einer multivariaten Analyse oder anderen mathematischen Behandlung unterzogen werden, um eine oder mehrere Eigenschaften des Ziels in Echtzeit zu ermitteln.

Umgebungsionisations-Ionenquellen

Bei beliebigen der Verfahren der Erfindung kann eine Vorrichtung verwendet werden, um ein Aerosol, einen Rauch oder einen Dampf aus einer oder mehreren Regionen eines Ziels zu erzeugen (diesbezügliche Details sind hierin andernorts zu finden, z. B. eine In-vitro- oder Ex-vivo-Zellpopulation). Die Vorrichtung kann eine Umgebungsionisations-Ionenquelle umfassen, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, Analytaerosol, -rauch oder -dampf aus einem Ziel zu erzeugen, optional mit einer geringen oder keiner Vorbereitung des Ziels zur Analyse. Im Gegensatz dazu erfordern andere Typen von Ionisationsionenquellen wie z. B. Matrixgestützte-Laserdesorptionsionisations-(MALDI)-Ionenquellen, dass eine Matrix oder ein Reagens vor Ionisation zur Probe hinzugefügt wird.

Es ist offensichtlich, dass die Anforderung, eine Matrix oder ein Reagens direkt zu einer Probe hinzuzufügen, die Fähigkeit, eine In-vivo-Analyse des Gewebes durchzuführen, verhindern kann und außerdem – allgemeiner gesprochen – die Fähigkeit, eine schnelle einfache Analyse von Zielmaterial bereitzustellen, verhindert.

Umgebungsionisationstechniken sind besonders nützlich, da sie eine schnelle einfache Analyse von Zielmaterial ermöglichen. Auch wenn es nicht erforderlich ist, eine Matrix oder ein Reagens zur Probe hinzuzufügen, um Umgebungsionisationstechniken durchzuführen, kann das Verfahren optional einen Schritt des Hinzufügens einer Matrix oder eines Reagens zum Ziel (z. B. direkt zum Ziel) vor Analyse umfassen. Die Matrix oder das Reagens kann zum Ziel hinzugefügt werden, z. B. um die Zellen des Ziels zu lysieren oder das Signal aus diesen während der Analyse zu verbessern.

Eine Anzahl unterschiedlicher Umgebungsionisationstechniken ist bekannt und diese sollen in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen. Ein Auszug aus der Geschichte: Die Desorptionselektrosprayionisation (DESI) war die erste entwickelte Umgebungsionisationstechnik und wurde 2004 offenbart. Seit 2004 wurde eine Anzahl anderer Umgebungsionisationstechniken entwickelt. Diese Umgebungsionisationstechniken unterscheiden sich in ihrem präzisen Ionisationsverfahren, aber sie haben die gleiche allgemeine Fähigkeit, Gasphasenionen direkt aus Proben zu erzeugen (z. B. ohne Vorbereitung der Probe zur Analyse). Die diversen Umgebungsionisationstechniken, die in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen sollen, erfordern ggf. keine Probenvorbereitung zur Analyse. Folglich ermöglichen die diversen Umgebungsionisationstechniken, dass Ziele ohne den Zeit- und Kostenaufwand und die Probleme, die mit dem Hinzufügen einer Matrix oder eines Reagens zum Zielmaterial assoziiert sind, analysiert werden.

Eine Liste von Umgebungsionisationstechniken, die in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen sollen, ist in der nachstehenden Tabelle zu finden:

AbkürzungIonisationstechnikDESIDesorptionselektrosprayionisationDeSSIDesorptionsschallsprayionisationDAPPIDesorptionsatmosphärendruckphotoionisationEASIEinfache Umgebungsschallsprayionisation JeDIStrahldesorptionselektrosprayionisationTM-DESIÜbertragungsmodus-DesorptionselektrosprayionisationLMJ-SSPLiquid-Microjunction-OberflächenprobennahmesondeDICEDesorptionsionisation durch Ladungsaustausch Nano-DESINanospray-DesorptionselektrosprayionisationEADESIElektrodengestützte DesorptionselektrosprayionisationAPTDCIChemische Atmosphärendruck-WärmedesorptionsionisationV-EASIEinfache Venturi-UmgebungsschallsprayionisationAFAILuftstromgestützte Ionisation LESAFlüssigextraktionsoberflächenanalysePTC-ESIPipettenspitzen-SäulenelektrosprayionisationAFADESI Luftstromgestützte DesorptionselektrosprayionisationDEFFIDesorptionselektroflussfokussierungsionisationESTASIElektrostatische Sprayionisation PASITPlasmabasierte UmgebungsprobennahmeionisationsübertragungDAPCI Chemische DesorptionsatmosphärendruckionisationDART Direkte Analyse in Echtzeit ASAP Atmosphärendruckfeststoffanalysesonde APTDI Atmosphärendruck-WärmedesorptionsionisationPADI Plasmagestützte Desorptionsionisation DBDI Dielektrische-Barriere-EntladungsionisationFAPA Fließendes Atmosphärendruck-Nachleuchten HAPGDI Helium-Atmosphärendruck-Glimmentladungsionisation APGDDI Atmosphärendruck-Glimmentladungsdesorptionsionisation LTP NiedrigtemperaturplasmaLS-APGD Flüssigprobennahme-Atmosphärendruck-Glimmentladung MIPDIMikrowelleninduzierte Plasmadesorptionsionisation MFGDP Mikrofabriziertes Glimmentladungsplasma RoPPI Roboter-Plasmasondenionisation PLASI Plasmasprayionisation MALDESIMatrixgestützte Laserdesorptionselektrosprayionisation ELDI Elektrospray-LaserdesorptionsionisationLDTD LaserdiodenwärmedesorptionLAESI LaserablationselektrosprayionisationCALDI Ladungsgestützte Laserdesorptionsionisation LA-FAPA Fließendes Laserablation-Atmosphärendruck-Nachleuchten LADESI Lasergestützte DesorptionselektrosprayionisationLDESI LaserdesorptionselektrosprayionisationLEMS Laserelektrospray-MassenspektrometrieLSI LasersprayionisationIR-LAMICI Metastabil induzierte chemische Infrarot-Laserablations-IonisationLDSPI Laserdesorptionsspray-Post-IonisationPAMLDI Plasmagestützte Mehrwellenlängen-Laserdesorptionsionisation HALDI Hochspannungsgestützte Laserdesorptionsionisation PALDI Plasmagestützte Laserdesorptionsionisation ESSIExtraktive Elektrosprayionisation PESI Sondenelektrosprayionisation ND-ESSINeutrale extraktive Desorptionselektrosprayionisation PS Papierspray DIP-APCI Chemische Direkte-Einlasssonden-Atmosphärendruck-Ionisation TS Touchspray Holzspitze Holzspitzenelektrospray CBS-SPME Beschichteter-Klingenspray-Festphasenmikroextraktion TSI Gewebesprayionisation RADIO Akustische Funkfrequenzdesorptionsionisation LIAD-ESILaserinduzierte akustische Desorptionselektrosprayionisation SAWN Akustische Oberflächenwellenzerstäubung UASI Ultraschallgestützte Sprayionisation SPA-nanoESI Feststoffsondengestützte Nanoelektrosprayionisation PAUSI Papiergestützte Ultraschallsprühionisation DPESI Direkte Sondenelektrosprayionisation ESA-Py Elektrospraygestützte Pyrolyseionisation APPIS Pyroelektrische Umgebungsdruckionenquelle RASTIRRemote-Analyt-Probennahmetransport- und -Ionisations-Relay SACI Oberflächenaktivierte chemische Ionisation DEMIMetastabil induzierte Desorptionselektrosprayionisation REIMSSchnelle-Verdunstungsionisations-Massenspektrometrie SPAM Einzelpartikel-Aerosolmassenspektrometrie TDAMSWärmedesorptionsbasierte Umgebungsmassenspektrometrie MAII Matrixgestützte Einlassionisation SAII Lösungsmittelgestützte Einlassionisation SwiFERR Geschalteter ferroelektrischer Plasmaionisator LPTD Leidenfrostphänomengestützte Wärmedesorption

Gemäß einer Ausführungsform kann die Umgebungsionisationsionenquelle eine Schnelle-Verdunstungs-Ionisations-Massenspektrometrie-(REIMS)-Ionenquelle umfassen, wobei eine HF-Spannung an eine oder mehrere Elektroden angelegt wird, um Rauch, Aerosol oder Dampf durch Joule-Erhitzung zu erzeugen.

Es wird jedoch verstanden, dass andere Umgebungsionenquellen, darunter die oben erwähnten, ebenfalls verwendet werden können. Beispielsweise kann die Umgebungsionisationsionenquelle gemäß einer weiteren Ausführungsform eine Laserionisationsionenquelle umfassen. Gemäß einer Ausführungsform kann die Laserionisationsionenquelle eine Mittel-IR-Laserablations-Ionenquelle umfassen. Beispielsweise gibt es mehrere Laser, die eine Strahlung nahe oder bei 2,94 µm emittieren, was dem Peak im Wasserabsorptionsspektrum entspricht. Gemäß diversen Ausführungsformen kann die Umgebungsionisationsionenquelle eine Laserablationsionenquelle mit einer Wellenlänge nahe 2,94 µm auf Basis des hohen Absorptionskoeffizienten von Wasser bei 2,94 µm umfassen. Gemäß einer Ausführungsform kann die Laserablationsionenquelle einen Er:YAG-Laser umfassen, der eine Strahlung bei 2,94 µm emittiert.

Andere Ausführungsformen werden in Betracht gezogen, wobei ein optischer parametrischer Mittel-Infrarot-Oszillator (OPO) verwendet werden kann, um eine Laserablationsionenquelle mit einer längeren Wellenlänge als 2,94 µm herzustellen. Beispielsweise kann ein Er:YAG-gepumpter ZGP-OPO verwendet werden, um eine Laserstrahlung mit einer Wellenlänge von z. B. 6,1 µm, 6,45 µm oder 6,73 µm herzustellen. In einigen Situationen kann es vorteilhaft sein, eine Laserablationsquelle mit einer kürzeren oder längeren Wellenlänge als 2,94 µm zu verwenden, da nur die Oberflächenschichten ablatiert werden und ggf. ein geringerer Wärmeschaden verursacht wird. Gemäß einer Ausführungsform kann ein Co:MgF2-Laser als Laserablationsionenquelle verwendet werden, wobei der Laser auf 1,75–2,5 µm eingestellt werden kann. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann ein System mit optischem parametrischem Oszillator (OPO), das mit einem Nd-YAG-Laser gepumpt wird, verwendet werden, um eine Laserablationsionenquelle mit einer Wellenlänge zwischen 2,9–3,1 µm herzustellen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann ein CO2-Laser mit einer Wellenlänge von 10,6 µm verwendet werden, um das Aerosol, den Rauch oder den Dampf zu erzeugen.

Gemäß anderen Ausführungsformen kann die Umgebungsionisationsionenquelle eine Ultraschallablationsionenquelle oder eine elektrochirurgische Ultraschall-Hybridablationsquelle umfassen, die eine Flüssigprobe erzeugt, die danach als Aerosol angesaugt wird. Die Ultraschallablationsionenquelle kann fokussierten oder unfokussierten Ultraschall umfassen.

Gemäß einer Ausführungsform kann die erste Vorrichtung zum Erzeugen von Aerosol, Rauch oder Dampf aus dem Ziel ein Werkzeug umfassen, das eine HF-Spannung verwendet, wie z. B. eine kontinuierliche HF-Wellenform. Gemäß anderen Ausführungsformen kann ein Funkfrequenzsystem verwendet werden, das so ausgelegt ist, dass es gepulste Plasma-HF-Energie an ein Werkzeug liefert. Das Werkzeug kann z. B. ein PlasmaBlade® umfassen. Gepulste Plasma-HF-Werkzeuge arbeiten bei niedrigeren Temperaturen als herkömmliche elektrochirurgische Werkzeuge (z. B. 40–170 °C vers us 200–350 °C), wodurch die Tiefe des Wärmeschadens verringert wird. Gepulste Wellenformen und Duty Cycles können sowohl für Schneid- als auch Koagulationsbetriebsmodi verwendet werden, indem elektrisches Plasma entlang des einen oder der mehreren Schneidkanten einer dünnen isolierten Elektrode induziert wird.

Gemäß einer Ausführungsform umfasst die erste Vorrichtung eine chirurgische Wasser/Saline-Strahlvorrichtung wie z. B. eine Reseziervorrichtung, einen Hybrid einer solchen Vorrichtung mit beliebiger der anderen Vorrichtungen hierin, eine elektrochirurgische Argonplasmakoagulationsvorrichtung, eine Argonplasmakoagulations- und Wasser/Saline-Strahl-Hybridvorrichtung.

Gemäß einer Ausführungsform umfasst die erste Vorrichtung eine Umgebungsionen- oder Umgebungsionisationsquelle oder bildet einen Teil dieser; oder erzeugt die erste Vorrichtung das Aerosol, den Rauch oder den Dampf aus dem Ziel und enthält Ionen und/oder wird danach durch eine Umgebungsionen- oder Umgebungsionisationsquelle oder andere Ionisationsquelle ionisiert.

Optional umfasst die erste Vorrichtung eine Vorrichtung oder eine Ionenquelle oder bildet einen Teil davon, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (i) einer Schnelle-Verdunstungsionisations-Massenspektrometrie-(REIMS)-Ionenquelle; (ii) einer Desorptionselektrosprayionisation-(DESI)-Ionenquelle; (iii) einer Laserdesorptionsionisations-(LDI)-Ionenquelle; (iv) einer Wärmedesorptionsionenquelle; (v) einer Laserdiodenwärmedesorptions-(LDTD)-Ionenquelle; (vi) einer Desorptionselektroflussfokussierungs-(DEFFI)-Ionenquelle; (vii) einer Dielektrische-Barriere-Entladungs-(DBD)-Plasmaionenquelle; (viii) einer Atmosphärenfeststoffanalysesonde-(ASAP)-Ionenquelle; (ix) einer Ultraschallgestützte-Sprayionisation-Ionenquelle; (x) einer Einfache-Umgebungs-Schallspray-Ionisations-(EASI)-Ionenquelle; (xi) einer Desorptionsatmosphärendruckphotoionisations-(DAPPI)-Ionenquelle; (xii) einer Papierspray-(PS)-Ionenquelle; (xiii) einer Strahldesorptionsionisations-(JeDI)-Ionenquelle;(xiv) einer Touchspray-(TS)-Ionenquelle; (xv) einer Nano-DESI-Ionenquelle; (xvi) einer Laserablationselektrospray-(LEASI)-Ionenquelle; (xvii) einer Direkte-Analyse-in-Echtzeit-(DART)-Ionenquelle; (xviii) einer Sondenelektrosprayionisations-(PESI)-Ionenquelle; (xix) einer Feststoffsondengestützte-Elektrosprayionisations-(SPA-ESI)-Ionenquelle; (xx) einer Cavitron-chirurgischer Ultraschallaspirator-(CUSA)-Vorrichtung; (xxi) einer CUSA-Diathermie-Hybridvorrichtung; (xxii) einer Fokussierte- und Unfokussierte-Ultraschallablationsvorrichtung, (xxiii) einer Fokussierte- und Unfokussierte-Ultraschallablations- und Diathermie-Hybridvorrichtung; (xxiv) einer Mikrowellenresonanzvorrichtung, (xxv) einer gepulsten Plasma-HF-Seziervorrichtung; (xxvi) einer Argonplasmakoagulationsvorrichtung; (xxvi) einer Gepulste-Plasma-HF-Sezier- und Argonplasmakoagulations-Hybridvorrichtung; (xxvii) einer Gepulste-Plasma-HF-Sezier- und JeDi-Hybridvorrichtung; (xxviii) einer chirurgischen Wasser/Saline-Strahlvorrichtung; (xxix) einer Elektrochirurgie- und Argonplasmakoagulations-Hybridvorrichtung; und (xxx) einer Argonplasmakoagulations- und Wasser/Saline-Strahl-Hybridvorrichtung.

Optional umfasst der Schritt des Verwendens der ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Aerosol, Rauch oder Dampf das Inkontaktbringen des Ziels mit einer oder mehreren Elektroden.

Optional umfassen die eine oder mehreren Elektroden entweder: (i) eine monopolare Vorrichtung, wobei optional eine separate Neutralelektrode bereitgestellt ist; (ii) eine bipolare Vorrichtung; oder (iii) eine Mehrphasen-HF-Vorrichtung, wobei optional zumindest eine separate Neutralelektrode bereitgestellt ist.

Optional umfassen die eine oder mehreren Elektroden eine Schnelle- Verdunstungsionisations-Massenspektrometrie-(REIMS)-Vorrichtung oder bildet einen Teil davon.

Optional umfasst das Verfahren ferner das Anlegen einer AC- oder HF-Spannung an die eine oder mehreren Elektroden, um das Aerosol, den Rauch oder den Dampf zu erzeugen.

Optional umfasst der Schritt des Anlegens der AC- oder HF-Spannung an die eine oder mehreren Elektroden ferner das Anlegen eines oder mehrerer Impulse der AC- oder HF-Spannung an die eine oder mehreren Elektroden.

Optional bewirkt der Schritt des Anlegens der AC- oder HF-Spannung an die eine oder mehreren Elektroden, dass Wärme ist das Ziel abgeleitet wird.

Optional umfasst der Schritt des Verwendens der ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Aerosol, Rauch oder Dampf aus einer oder mehreren Regionen des Ziels ferner das Bestrahlen des Ziels mit einem Laser.

Optional erzeugt die erste Vorrichtung Aerosol aus einer oder mehrerer Regionen des Ziels durch direkte Verdunstung oder Verdampfung von Zielmaterial aus dem Ziel durch Joule-Erhitzung oder Diathermie.

Optional umfasst der Schritt des Verwendens der ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Aerosol, Rauch oder Dampf aus einer oder mehreren Regionen des Ziels ferner das Lenken von Ultraschallenergie in das Ziel.

Optional umfasst das Aerosol ungeladene wässrige Tropfen. Die Tropfen können Zellmaterial umfassen.

Optional können zumindest 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % oder 95 % der Masse oder Materie, die durch die erste Vorrichtung erzeugt wird und die das Aerosol bildet, in Form von Tropfen vorliegen.

Die erste Vorrichtung kann so ausgelegt und ausgestaltet sein, dass sie Aerosol erzeugt, wobei der mittlere Sauterdurchmesser (SMD, d32) des Aerosols in einem Bereich liegt: (i) < 5 µm; (ii) 5–10 µm; (iii) 10–15 µm; (iv) 15–20 µm; (v) 20–25 µm; oder (vi) > 25 µm.

Das Aerosol kann eine Flussregion überqueren, mit einer Reynolds-Zahl (Re) im Bereich: (i) < 2000; (ii) 2000–2500; (iii) 2500–3000; (iv) 3000–3500; (v) 3500–4000; oder (vi) > 4000.

Das Aerosol kann im Wesentlichen an dem Punkt des Erzeugens des Aerosols Tropfen mit einer Weber-Zahl (We) umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (i) < 50; (ii) 50–100; (iii) 100–150; (iv) 150–200; (v) 200–250;(vi) 250–300; (vii) 300–350; (viii) 350–400; (ix) 400–450; (x) 450–500; (xi) 500–550; (xii) 550–600; (xiii) 600–650; (xiv) 650–700; (xv) 700–750; (xvi) 750–800; (xvii) 800–850; (xviii) 850–900; (xix) 900–950; (xx) 950–1000; und (xxi) > 1000.

Das Aerosol kann im Wesentlichen an dem Punkt des Erzeugens des Aerosols Tropfen mit einer Stokes-Zahl (Sk) umfassen im Bereich: (i) 1–5; (ii) 5–10; (iii) 10–15; (iv) 15–20; (v) 20–25; (vi) 25–30; (vii) 30–35; (viii) 35–40; (ix) 40–45; (x) 45–50; und (xi) > 50.

Das Aerosol kann im Wesentlichen an dem Punkt des Erzeugens des Aerosols Tropfen mit einer mittleren axialen Geschwindigkeit umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (i) < 20 m/s; (ii) 20–30 m/s; (iii) 30–40 m/s; (iv) 40–50 m/s; (v) 50–60 m/s; (vi) 60–70 m/s; (vii) 70–80 m/s; (viii) 80–90 m/s; (ix) 90–100 m/s; (x) 100–110 m/s; (xi) 110–120 m/s; (xii) 120–130 m/s; (xiii) 130–140 m/s; (xiv) 140–150 m/s; und (xv) > 150 m/s.

Optional umfasst das Aerosol ungeladene wässrige Tropfen. Die Tropfen können Zellmaterial umfassen.

Optional umfasst das Verfahren das Ionisieren zumindest manches des Aerosols, des Rauchs oder des Dampfs oder Analyts darin, um Analytionen zu erzeugen; wobei die Analytionen analysiert werden, um die spektrometrischen Daten zu erhalten.

Optional umfasst das Verfahren das Lenken oder Ansaugen zumindest manches des Aerosols, des Rauchs oder des Dampfs in eine Vakuumkammer eines Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometers; und/oder das Ionisieren zumindest manches des Aerosols, Rauchs oder Dampfs oder des Analyts darin innerhalb einer oder der Vakuumkammer des Spektrometers, um eine Mehrzahl von Analytionen zu erzeugen.

Optional umfasst das Verfahren das Bewirken, dass das Aerosol, der Rauch oder der Dampf oder der Analyt darin auf eine Kollisionsfläche aufprallt, die sich optional innerhalb einer oder der Vakuumkammer des Spektrometers befindet, um die Mehrzahl von Analytionen zu erzeugen.

Optional kann die Kollisionsfläche erhitzt werden. Die Kollisionsfläche kann auf eine Temperatur erhitzt werden, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (i) ungefähr < 100 °C; (ii) ungefähr 100–200 °C; (iii) ungefähr 20 0–300 °C; (iv) ungefähr 300–400 °C; (v) ungefähr 400–500 °C; (vi) ungefähr 500–600 °C; (vii) ungefähr 600–700 °C; (viii) ungefähr 700–800 °C; (ix) ungefähr 800–900 °C; (x) ungefähr 900–1000 °C; (xi) ungefähr 1000–1100 °C); und (xii) ungefähr > 1100 °C.

Optional umfasst das Verfahren das Hinzufügen einer Matrix zum Aerosol, Rauch oder Dampf;
optional wobei die Matrix aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (i) einem Lösungsmittel für das Aerosol, den Rauch oder den Dampf oder den Analyt darin; (ii) einem organischem Lösungsmittel; (iii) einer flüchtigen Verbindung; (iv) polaren Molekülen; (v) Wasser; (vi) einem oder mehreren Alkoholen; (vii) Methanol, (viii) Ethanol, (ix) Isopropanol; (x) Aceton; (xi) Acetonitril; (xii) 1-Butanol; (xiii) Tetrahydrofuran; (xiv) Ethylacetat; (xv) Ethylenglykol; (xvi) Dimethylsulfoxid; einem Aldehyd; (xviii) einem Keton; (xiv) nichtpolaren Molekülen; (xx) Hexan; (xxi) Chloroform; und (xxii) Propanol.

Optional kann das Verfahren unter Verwendung eines Negativ-Ionenmodus durchgeführt werden, so optional umfasst das Verfahren das Analysieren spektrometrischer Daten, die unter Verwendung eines Negativ-Ionenmodus erhalten wurden. Optional kann das Verfahren unter Verwendung eines Positiv-Ionenmodus durchgeführt werden, so optional umfasst das Verfahren das Analysieren spektrometrischer Daten, die unter Verwendung eines Positiv-Ionenmodus erhalten wurden. Optional umfasst das Verfahren das Analysieren spektrometrischer Daten, die unter Verwendung eines Negativ-Ionenmodus erhalten wurden, und das Analysieren von spektrometrischen Daten, die unter Verwendung eines Positiv-Ionenmodus erhalten wurden.

Das Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometer können Daten nur im Negativ-Ionenmodus, nur im Positiv-Ionenmodus oder sowohl im Positiv- als auch Negativ-Ionenmodus erhalten. Spektrometrische Daten im Positiv-Ionenmodus können mit spektrometrischen Daten im Negativ-Ionenmodus kombiniert werden. Ionenmobilitätsspektrometrische Daten können unter Verwendung unterschiedlicher Ionenmobilitäts-Driftgase erhalten werden. Diese Daten können danach kombiniert werden.

Die Matrix und/oder das Aerosol, der Rauch oder der Dampf können mit einem oder mehreren Zusatzstoffen dotiert sein, z. B. um die Solvatisierung oder Verdünnung von Analyt mit der Matrix zu verbessern oder die Ionisation des Analyts innerhalb des Aerosols, Rauchs oder Dampfs zu verbessern.

Die Dotierungsverbindung kann z. B. ein saurer oder basischer Zusatzstoff wie z. B. Ameisensäure oder Diethylamin sein.

Die Matrix und/oder Dotierverbindung können eine Derivatisierung des Analyts im Aerosol, Rauch oder Dampf bewirken. Beispielsweise kann die Verbindung die Derivatisierung von Cholesterin oder Steroiden im Analyt bewirken. Dadurch wird der Analyt ggf. einfacher ionisiert.

Schnelle-Verdunstungsionisations-Massenspektrometrie (REIMS)

Auch wenn diverse unterschiedliche Umgebungsionisationsionenquellen bei der Erfindung verwendet werden können, um eine Vielzahl von Zielen zu analysieren, wird nun ein Verfahren der REIMS-Analyse an einer Zellpopulation beschrieben, um die Ausführungsformen besser verstehen zu können.

1A zeigt ein Gerät, das verwendet werden kann, um eine Zellpopulation zu analysieren. Das Gerät umfasst ein Paar handgehaltener Elektroden 106, 108 in Form einer Pinzette 102 (d. h. die erste Vorrichtung); eine HF-Energieversorgung 103 zum Speisen einer HF-Spannung zu den Elektroden 106, 108; einen Einlass in ein Massenspektrometer 105; und eine Verschlauchung 104, die eine Öffnung 112 am hinteren Ende der Pinzette 102 mit dem Einlass des Spektrometers 105 verbindet. Die Pinzette 102 und die HF-Energieversorgung 103 können so konfiguriert sein, dass die Pinzette 102 eine bipolare Pinzette ist. Wie in 1B gezeigt, ist eine offene Eintrittsöffnung 110 in der Spitze einer der Elektroden 106 vorne an der Pinzette 102 bereitgestellt. Diese Eintrittsöffnung 110 öffnet sich in eine Leitung 111 innerhalb der Elektrode 106. Die Leitung 111 erstreckt sich durch die Elektrode 106 zu einer Austrittsöffnung 112 im hinteren Bereich der Pinzette 102, wie in 1C gezeigt.

Wie in 1A gezeigt, kann die zu analysierende Probe/das zu analysierende Ziel in Form eines Zellpellets 101 bereitgestellt sein. Das Zellpellet kann in einem Behälter 107 wie z. B. einem Eppendorf-Röhrchen bereitgestellt sein. Die Pinzette 102 kann in Kontakt mit dem Zellpellet 101 eingeführt werden, so dass Biomasse an den Spitzen der Elektroden 106, 108 aus dem Zellpellet 101 erhalten wird. Die zwei Elektroden 106, 108 können danach eng aneinander gebracht werden, z. B. durch Zwicken der Biomasse zwischen den Spitzen der Pinzette 102. Die HF-Energieversorgung 103 kann z. B. unter Verwendung eines Fußschalters ausgelöst werden, um die Elektroden 106, 108 mit Energie zu versorgen. Dies bewirkt, dass die Zelllinienbiomasse durch ihre Nicht-Null-Impedanz schnell erhitzt wird (z. B. durch Joule- oder Diathermieerhitzung) und Rauch, Aerosol oder Dampf aus der Biomasse emittiert wird. Der Rauch, das Aerosol oder der Dampf können geladene Molekülspezies von Analyten in der Biomasse enthalten.

Der Rauch, das Aerosol oder der Dampf können durch die Eintrittsöffnung 110 und in die Leitung 111 in der Pinzette 102 eingefangen oder anderweitig angesaugt werden. Der Rauch, das Aerosol oder der Dampf wird danach durch die Leitung 111, aus der Austrittsöffnung 112 entlang der Verschlauchung 104 und in den Einlass des Massenspektrometers 105 gezogen. Das inhärente Vakuumsystem des Massenspektrometers kann verwendet werden, um den Rauch, das Aerosol oder den Dampf aus der Eintrittsöffnung 110 zum Einlass des Spektrometers 105 zu ziehen. Alternativ kann eine Venturi-Vorrichtung verwendet werden, um den Rauch, das Aerosol oder den Dampf aus der Eintrittsöffnung 110 zum Einlass des Spektrometers 105 zu ziehen.

1D zeigt eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer Schnittstelle zwischen der ersten Vorrichtung (z. B. Pinzette 102) und dem Massenspektrometer. Das Instrument kann einen Ionenanalysator 207 mit einem Einlass 206 (der dem Einlass 5 in 1A entsprechen kann), eine Vakuumregion 208, eine Kollisionsfläche 209 und eine Ionenoptik 212 (wie z. B. einen StepWave®-Ionenleiter), innerhalb der Vakuumregion 208 angeordnet, umfassen. Das Instrument umfasst außerdem einen Probentransferschlauch 202 (entspricht der Verschlauchung 4 in 1) und eine Matrixeinbringungsleitung 203. Der Probentransferschlauch 202 hat einen Einlass zum Aufnehmen der Rauch-, Aerosol- oder Dampfprobe 201 (die der in Bezug auf 1 beschriebenen entsprechen kann) aus einer zu untersuchenden Probe/einem zu untersuchenden Ziel, und einen Auslass, der mit dem Einlass 206 des Ionenanalysators 207 verbunden ist. Die Matrixeinbringungsleitung 203 hat einen Einlass zum Aufnehmen einer Matrixverbindung und einen Auslass, der sich mit dem Probentransferschlauch 202 schneidet, um zu ermöglichen, dass die Matrix 204 mit der Aerosolprobe 201 im Probentransferschlauch 202 vermischt wird. Eine T-Verzweigungskomponente kann an der Verbindungsstelle zwischen Schläuchen 202, 203 und 206 bereitgestellt sein. Die Schläuche 202, 203 und 206 können entnehmbar in die T-Verzweigung eingesetzt werden.

Ein Verfahren zum Betreiben des Instruments, das in 1D gezeigt ist, wird nun beschrieben. Eine Probe/ein Ziel, wie z. B. Zellpopulationsmaterial, kann der REIMS-Technik unterzogen werden. Beispielsweise kann eine erste Vorrichtung (z. B. Pinzette 102) verwendet werden, um ein Aerosol zu erzeugen, z. B. wie oben unter Bezugnahme auf die 1A1C beschrieben. Die Aerosolpartikel 201 werden danach in den Einlass des Probentransferschlauchs 202 eingebracht. Eine Matrixverbindung 204 wird in den Einlass der Matrixeinbringungsleitung 203 eingebracht. Die Aerosolpartikel 201 und die Matrixverbindung 204 werden durch einen Druckunterschied in Richtung des Einlasses 206 des Ionenanalysators 207 gezogen, der dadurch erzeugt wird, dass die Vakuumkammer 208 einen niedrigeren Druck als die Einlässe zu den Schläuchen 202, 203 aufweist. Die Aerosolpartikel 201 können in der Region, in der sich der Probentransferschlauch 202 mit der Matrixeinbringungsleitung 203 schneidet, und dieser auf die Moleküle der Matrixverbindung 204 nachgeschaltet treffen. Die Aerosolpartikel 201 vermischen sich mit der Matrix 204, um Aerosolpartikel zu bilden, die Matrixmoleküle 205 enthalten, in denen sowohl die molekularen Bestandteile der Aerosolprobe 201 als auch der Matrixverbindung 204 vorhanden sind. Die Matrixmoleküle 204 können im Vergleich zu den molekularen Bestandteilen der Aerosolpartikel 201 im Überschuss vorhanden sein.

Die Partikel 205 können aus dem Probentransferschlauch 202 austreten und in den Einlass 206 des Ionenanalysators 207 gelangen. Die Partikel 205 gelangen sodann in die Region 208 mit verringertem Druck und erhalten durch die adiabatische Ausdehnung von Gas, das aus dem Probentransferschlauch 202 in die Vakuumregion 208 eintritt, und durch die assoziierte freie Strahlbildung eine im Wesentlichen lineare Geschwindigkeit. Die beschleunigten Partikel 205 können auf die Kollisionsfläche 209 aufprallen, wo das Aufprallereignis die Partikel 205 fragmentiert, was zur schließlichen Bildung von Gasphasenionen 210 der molekularen Bestandteile der Aerosolprobe 201 und der Bildung von Matrixmolekülen 211 führt. Die Kollisionsfläche 209 kann auf einer Temperatur geregelt und gehalten werden, die im Wesentlichen höher als die Umgebungstemperatur ist.

Die Matrix 204 umfasst ein Lösungsmittel für den Analyt 201, so dass sich der Analyt 201 durch die Matrix 204 auflöst, wodurch eine intermolekulare Bindung zwischen den Analytmolekülen 201 eliminiert wird. Wenn der aufgelöste Analyt 205 sodann mit der Kollisionsfläche 209 kollidiert ist, fragmentiert der aufgelöste Analyt 205 somit in Tropfen und ein beliebiger bestimmter Tropfen enthält wahrscheinlich weniger Analytmoleküle als wenn die Matrix nicht vorhanden sein würde. Dies führt wiederum zu einer effizienteren Erzeugung von Analytionen 210, wenn die Matrix in jedem Tropfen verdampft wird. Die Matrix kann ein Lösungsmittel für das Aerosol, den Rauch oder den Dampf oder den Analyt darin; ein organisches Lösungsmittel; eine flüchtige Verbindung; polare Moleküle; Wasser; einen oder mehrere Alkohole; Methanol, Ethanol, Isopropanol; Aceton; Acetonitril; 1-Butanol; Tetrahydrofuran; Ethylacetat; Ethylenglykol; Dimethylsulfoxid; ein Aldehyd; ein Keton; nichtpolare Moleküle; Hexan; Chloroform; oder (xxii) Propanol umfassen. Isopropanol ist von besonderem Interesse.

Die Matrixmoleküle 211 können frei in das Vakuum diffundieren. Im Gegensatz dazu können die Gasphasenionen 210 der molekularen Bestandteile der Aerosolprobe 201 durch die Ionenoptik 212 zu einer Analyseregion (nicht gezeigt) des Ionenanalysators 207 transferiert werden. Die Ionen 210 können durch Anlegen von Spannungen an die Ionenoptik 212 zur Analyseregion geführt werden.

Die Ionenoptik 212 kann ein StepWave®-Ionenleiter sein. Die Kollisionsfläche kann entlang der Mittelachse der großen Öffnung eines StepWave®-Ionenleiters und dieser benachbart positioniert sein. Wie der Fachmann verstehen wird, umfasst ein StepWave®-Ionenleiter zwei miteinander verbundene Ionentunnelionenleiter. Jeder Ionenleiter umfasst eine Mehrzahl von Ring- oder anderen Elektroden, wobei Ionen durch den zentralen Durchlass gelangen, der von den Ring- oder anderen Elektroden bereitgestellt wird. Ionen treten in einen ersten der Ionenleiter ein, gemeinsam mit beliebigen Neutralen, die vorhanden sein können, und bewegen sich durch den ersten Ionenleiter. Ionen werden danach orthogonal in einen zweiten der Ionenleiter gelenkt und durch diesen gesendet. Transiente DC-Spannungen oder -Potenziale werden an die Elektroden angelegt, um die Ionen durch diese zu treiben. Der StepWave®-Ionenleiter basiert auf einer Gestapelter-Ringionenleiter-Technologie und ist so konzipiert, dass er die Ionensendung aus der Quelle zum Massenanalysator maximiert. Die Vorrichtung ermöglicht das aktive Entfernen von neutralen Kontaminanten, da die Neutralen nicht orthogonal in den zweiten Ionenleiter gelenkt werden, wodurch das allgemeine Signal-zu-Rauschen verbessert wird. Das Design ermöglicht das effiziente Einfangen der diffusen Ionenwolke, die in eine erste untere Stufe eintritt, die danach in einen oberen Ionenleiter fokussiert werden kann, für einen Transfer zum Ionenanalysator. Die Ionen werden danach durch den Ionenanalysator analysiert, der ein Massenspektrometer oder ein Ionenmobilitätsspektrometer oder eine Kombination der beiden umfassen kann. Als Ergebnis der Analyse können chemische Informationen zur Probe 201 erhalten werden.

Eine Flüssigkeitsfalle oder ein Flüssigkeitsabscheider kann zwischen der ersten Vorrichtung (z. B. Pinzette 2) und dem Analysator bereitgestellt sein, die bzw. der ungewünschten Flüssigkeiten einfängt und verwirft, die von der Sonde angesaugt werden, während gleichzeitig das relativ ungehinderte Passieren des Rauchs, des Aerosols oder des Dampfs selbst zum Massenspektrometer ermöglicht wird. Dies verhindert, dass unerwünschte Flüssigkeit den Analysator erreicht, ohne dass die Messung des Rauchs, des Aerosols oder des Dampfs beeinflusst wird. Die Flüssigkeitsfalle oder der Flüssigkeitsabscheider kann so ausgelegt sein, dass er die Flüssigkeit für eine spätere Entsorgung einfängt.

Wie oben beschrieben, können, auch wenn Ausführungsformen beschrieben wurden, bei denen REIMS verwendet wird, um den Rauch, das Aerosol oder den Dampf zur Analyse zu erzeugen, anderen Umgebungsionisationstechniken verwendet werden, wie z. B. Desorptionselektrosprayionisation (DESI).

Desorptionselektrosprayionisation (DESI)

Die Desorptionselektrosprayionisation (DESI) hat sich ebenfalls ein besonders nützliches und praktisches Verfahren für die schnelle und direkte Echtzeit-Analyse von biologischem Material, z. B. einer Zellpopulation, herausgestellt. DESI-Techniken ermöglichen eine direkte und schnelle Analyse von Oberflächen, ohne dass die Probe zuvor vorbereitet werden muss. Die Technik wird nun unter Bezugnahme auf die 1E1F ausführlicher beschrieben.

Wie in den 1E1F gezeigt, ist die DESI-Technik ein Umgebungsionisationsverfahren, das das Lenken eines Sprays (primärer) elektrisch geladener Tropfen 301 auf ein Ziel 304 umfasst. Der Elektrospraynebel wird durch eine Sprüheinheit 300 pneumatisch auf das Ziel 304 gelenkt, wo darauffolgende gespritzte (sekundäre) Tropfen 305 desorbierte ionisierte Analyten (z. B. desorbierte Lipidionen) tragen. Die Sprüheinheit 300 kann mit einem Lösungsmittel 306, einem Gas 307 (wie z. B. Stickstoff) und einer Spannung von einer Hochspannungsquelle 308 versorgt werden. Nach der Ionisation bewegen sich die Ionen durch Luft in eine Atmosphärendruckschnittstelle 309 eines Massenspektrometers und/oder Massenanalysators (nicht gezeigt), z. B. über eine Transferkapillare 310. Die Ionen können mit den unter Bezugnahme auf 1D beschriebenen oder mit anderen Verfahren analysiert werden. Beispielsweise kann die Transferkapillare 310 von 1E dem Probentransferschlauch 202 von 1D entsprechen. Die Transferkapillare 310 kann erhitzt werden, z. B. auf eine Temperatur von bis zu 500 °C.

Die DESI-Technik ermöglicht z. B. eine direkte Analyse von biologischen Materialien wie z. B. einer Zellpopulation, ohne dass für die Analyse vorab eine Probenvorbereitung erforderlich ist.

Allgemeine Verfahren der Erfindung

Diverse Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung beziehen sich im Allgemeinen auf die Anwendung von Massenspektrometrie und/oder Ionenmobilitätsspektrometrie bei der Analyse einer In-vitro- oder Ex-vivo-Zielzellpopulation und/oder eines davon abgeleiteten Mediums. Diverse Ausführungsformen der Erfindung stellen außerdem Verfahren zum Entdecken, Testen und/oder Herstellen von Arzneimitteln bereit.

Eine Anzahl optionaler Merkmale wird nachstehend ausführlicher beschrieben. Die Erfindung stellt ein Analyseverfahren unter Verwendung von Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometrie bereit, das umfasst:

  • (a) Verwenden einer ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Rauch, Aerosol oder Dampf aus einer In-vitro- oder Ex-vivo-Zielzellpopulation und/oder einem davon abgeleiteten Medium; und
  • (b) Durchführen einer Massenanalyse und/oder Ionenmobilitätsanalyse des Rauchs, Aerosols oder Dampfs, davon abgeleiteter Ionen, um spektrometrische Daten zu erhalten; und optional
  • (c) Analysieren der spektrometrischen Daten, um die Zielzellpopulation oder eine oder mehrere Zellen und/oder Verbindungen, die in der Zielzellpopulation und/oder in dem davon abgeleitetem Medium vorhanden sind, zu identifizieren und/oder charakterisieren.

Somit kann das Verfahren optional einen Schritt des Identifizierens und/oder Charakterisierens der Zielzellpopulation oder einer oder mehrerer Zellen und/oder Verbindungen, die in der Zielzellpopulation und/oder in dem davon abgeleitetem Medium vorhanden sind, auf Basis der spektrometrischen Daten umfassen. Es sei verstanden, dass jedwede Erwähnung von „Analysieren“ eines Ziels bedeuten soll, dass das Ziel auf Basis der spektrometrischen Daten analysiert wird. Somit wird z. B. unter einem Ausdruck wie z. B. „Analysieren von spektrometrischen Daten, um zu ermitteln, ob eine Zellpopulation an einer Infektion leidet“ verstanden, dass auf Basis der spektrometrischen Daten ermittelt wird, ob eine Zellpopulation an einer Infektion leidet.

Das Verfahren kann optional ein Screeningverfahren sein, z. B. zum Zwecke der Arzneimittelentwicklung. Somit kann das Verfahren optional einen Schritt des Analysierens der Reaktion einer Zellpopulation auf ein Testmittel oder eine Testbedingung umfassen.

Optional kann die Identität einer Zellpopulation oder eines oder mehrerer Zelltypen, die darin vorhanden sind, analysiert werden. Optional kann die Infektion einer Zellpopulation analysiert werden. Optional können die Homogenität und/oder Heterogenität einer Zellpopulation analysiert werden. Optional können der Genotyp und/oder Phänotyp einer Zellpopulation oder eines oder mehrerer Zelltypen, die darin vorhanden sind, analysiert werden. Optional kann der Zustand einer Zellpopulation oder eines oder mehrerer Zelltypen, die darin vorhanden sind, analysiert werden. Optional kann ein Prozess analysiert werden, der eine Zellpopulation oder einen oder mehrere Zelltypen umfasst, die darin vorhanden sind. Optional kann die Wirkung des Manipulierens des Genotyps und/oder Phänotyps einer Zellpopulation oder eines oder mehrerer Zelltypen, die darin vorhanden sind, analysiert werden. Optional kann die Wirkung des Manipulierens der Umgebungsbedingungen einer Zellpopulation analysiert werden. Optional kann das Verfahren verwendet werden, um zwischen zwei oder mehreren unterschiedlichen Zelltypen innerhalb einer Zellpopulation zu unterscheiden. Optional kann der Krankheitszustand einer Zellpopulation analysiert werden. Optional kann die Wirkung einer Substanz auf eine Zellpopulation analysiert werden. Optional können die Verwendung, Herstellung und/oder Aufschlüsselung einer Substanz analysiert werden. Optional kann eine Mehrzahl von Zellpopulationen analysiert werden, um ihre Fähigkeit zu analysieren, eine Substanz zu verwenden, herzustellen und/oder aufzuschlüsseln. Somit kann optional eine Mehrzahl von Zellpopulationen gescreent werden, um ihre Produktivität oder Effizienz in Bezug auf Herstellung, Aufschlüsselung und/oder Verwendung einer Substanz zu analysieren. Optional kann die Lebensfähigkeit einer Zellpopulation analysiert werden.

Unter einem Aspekt kann das Verfahren ein Verfahren zum Analysieren einer Krankheit, einer erkrankten Zelle und/oder eines Biomarkers einer Krankheit sein. Somit kann das Verfahren optional einen Schritt des Analysierens einer Krankheit, einer erkrankten Zelle und/oder eines Biomarkers einer Krankheit umfassen.

Das Verfahren kann ein Verfahren sein zum:

  • (i) Diagnostizieren einer Krankheit;
  • (ii) Überwachen des Fortschreitens oder der Entwicklung einer Krankheit;
  • (iii) Prognostizieren einer Krankheit;
  • (iv) Prognostizieren der Wahrscheinlichkeit, dass eine Krankheit auf eine Behandlung anspricht;
  • (v) Überwachen des Ansprechens einer Krankheit auf eine Behandlung; und/oder
  • (vi) Stratifizieren von Subjekten;
    oder ein Verfahren zum Erhalten von diesbezüglich relevanten Informationen.

Das Verfahren kann somit optional einen Schritt umfassen:

  • (i) Diagnostizieren einer Krankheit;
  • (ii) Überwachen des Fortschreitens oder der Entwicklung einer Krankheit;
  • (iii) Prognostizieren einer Krankheit;
  • (iv) Prognostizieren der Wahrscheinlichkeit, dass eine Krankheit auf eine Behandlung anspricht;
  • (v) Überwachen des Ansprechens einer Krankheit auf eine Behandlung; und/oder
  • (vi) Stratifizieren von Subjekten.

Das Verfahren kann ein Verfahren zum Prognostizieren der Lebensfähigkeit einer Zellpopulation in Bezug auf deren langfristige Lebensfähigkeit, Robustheit und/oder Effizienz oder ein Verfahren zum Erhalten diesbezüglich relevanter Informationen sein.

Details zu geeigneten Krankheiten sind hierin andernorts zu finden.

Unter einem Aspekt kann das Verfahren ein Verfahren zum Analysieren einer Mikrobe, einer mikrobiellen Interaktion und/oder eines mikrobiellen Biomarkers sein. Somit kann das Verfahren optional einen Schritt des Analysierens einer Mikrobe, einer mikrobiellen Interaktion und/oder eines mikrobiellen Biomarkers umfassen.

Unter einem Aspekt kann das Verfahren ein Verfahren zum Analysieren des Genotyps und/oder Phänotyps einer Zelle sein. Somit kann das Verfahren optional einen Schritt des Analysierens des Genotyps und/oder Phänotyps einer Zelle umfassen.

Unter einem Aspekt kann das Verfahren ein Behandlungsverfahren sein. Somit kann das Verfahren optional einen Schritt des Verabreichens einer therapeutisch wirksamen Menge eines therapeutischen Mittels an ein Subjekt, das einer solchen bedarf, umfassen.

Unter einem Aspekt kann das Verfahren ein Verfahren zum Analysieren einer Verbindung sein. Somit kann das Verfahren optional einen Schritt des Analysierens einer Verbindung und/oder eines Biomarkers für eine Verbindung umfassen.

Optionale Merkmale beliebiger dieser Verfahren werden nachstehend erörtert. Falls nicht anderweitig angeführt, soll somit jedwede Erwähnung „eines Verfahrens“ oder „des Verfahrens“ eine Erwähnung beliebiger der Verfahren der Erfindung sein, die hierin aufgelistet sind. Es ist explizit angedacht, dass beliebige dieser Merkmale in einer beliebigen Kombination in beliebigen dieser Verfahren vorhanden sein können.

Der Fachmann wird verstehen, dass beliebige der hierin bereitgestellten Verfahren optional mit einem oder mehreren der anderen hierin bereitgestellten Verfahren und/oder einem oder mehreren weiteren Verfahren kombiniert werden können.

Beispielsweise wird ein Verfahren bereitgestellt, das eine Kombination aus zwei oder mehr, z. B. drei oder mehr, vier oder mehr oder fünf oder mehr, der hierin offenbarten Verfahren ist.

Zielzellpopulationen

Das Verfahren kann an einer Zielzellpopulation und/oder einem davon abgeleiteten Medium durchgeführt werden. Unter „Zellpopulation“ versteht sich eine In-vitro- oder Ex-vivo-Sammlung von Zellen. Somit kann die Zellpopulation als „In-vitro- oder Ex-vivo-Zellpopulation“ bezeichnet werden. Somit soll der Ausdruck „Zellpopulation“ sich nicht auf ganze Organismen wie z. B. Tiere oder Menschen erstrecken.

Die Zellpopulation kann optional eine primäre Zellkultur, eine sekundäre Zellkultur, eine Zelllinie, eine xenotransplantatabgeleitete Zellpopulation und/oder ein Organoid sein.

Eine „primäre Zellkultur“ ist eine Kultur von Zellen, die unter Verwendung mechanischer oder enzymatischer Verfahren vom Ausgangsgewebe getrennt wurden. Eine primäre Zellkultur kann z. B. eine adhärente Zellkultur oder eine Zellsuspensionskultur sein.

Eine „sekundäre Zellkultur“ ist eine Kultur von Zellen, die z. B. durch mehrere Zellpassagen von einer primären Zellkultur abgeleitet sein kann.

Eine „Zelllinie“ ist eine Zellpopulation, die für gewöhnlich einheitlich ist und die für mehrere Passagen in vitro gezüchtet werden kann. Eine Zelllinie kann z. B. von einer sekundären Zellkultur, einem Tumor und/oder einem Embryo abgeleitet sein. Eine Zelllinie kann optional „immortalisiert“ sein, wobei sie sodann unbegrenzt kultiviert werden kann. Immortalisierte Zelllinien haben für gewöhnlich eine oder mehrere Mutationen, die die natürliche Wachstumssteuerung der Zellen aufheben.

Eine „xenotransplantatabgeleitete Zellpopulation“ ist eine Zellpopulation, die von einem Xenotransplantat abgeleitet ist. Ein „Xenotransplantat“ bezieht sich auf ein Zellmaterial wie z. B. Gewebe, das aus einem ersten Subjekt stammte und in ein zweites Subjekt eingesetzt wurde. Optional kann das Xenotransplantat Tumorzellen umfassen oder aus diesen bestehen. Beispielsweise können Zellen oder kann Gewebe, wie aus einem humanen Tumor erhalten, in ein Wirtstier xenotransplantiert werden. Optional können Zellen aus einem Xenotransplantat erhalten werden, um eine xenotransplantatabgeleitete Zellpopulation zu bilden.

Weitere Details zu Zelllinien und Organoiden sind hier andernorts zu finden. Eine Zellpopulation ist eine Mehrzahl von Zellen, die optional extrazelluläre Verbindungen und/oder extrazelluläres Medium umfassen kann. Somit bezieht sich der Ausdruck „Zellpopulation“, außer wenn eine „gewaschene“ Zellpopulation verwendet wird, auf Zellen und extrazelluläre Verbindungen innerhalb der Zellpopulation. Jedwede Erwähnung eines Analysierens einer Verbindung „in“ einer Zellpopulation sollte hierin so verstanden werden, dass die Verbindung intrazellulär und/oder extrazellulär sein kann.

Wie oben erwähnt, kann das Verfahren an Medium durchgeführt werden, das von einer Zellpopulation abgeleitet ist. Darunter versteht sich Medium, das mit der Zellpopulation in Kontakt war. Optional kann das von einer Zellpopulation abgeleitete Medium das Medium sein, in dem die Zellpopulation kultiviert wurde, d. h. das extrazelluläre Medium, für einen geeigneten Zeitraum, z. B. zumindest 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 45, 50 oder 55 Minuten, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 oder 24 Stunden und/oder 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 oder 24 Tage. Während der Kultivierung können Zellen eine oder mehrere Substanzen in das extrazelluläre Medium freisetzen, somit kann das Medium als „konditioniertes Medium“ bezeichnet werden.

Das extrazelluläre Medium kann optional die Zellpopulation umfassen oder kann eine oder mehrere Zellen umfassen oder kann zellfrei sein. Zellfreies extrazelluläres Medium kann durch Entfernen der Zellen, z. B. durch Filtration und/oder Zentrifugation, hergestellt werden, wie hier andernorts beschrieben.

Somit kann das Ziel optional Medium sein, das von einer Zellpopulation abgeleitet ist, und kann das Verfahren optional das Analysieren des Mediums zum Analysieren einer oder mehrerer Verbindungen umfassen. Beispielsweise kann das Medium analysiert werden, um die Verwendung, Herstellung und/oder Aufschlüsselung einer Substanz zu analysieren.

Jedwede Erwähnung eines Durchführens eines Verfahrens an einer Zellpopulation sollte hierin so verstanden werden, dass das Durchführen des Verfahrens an der Zellpopulation und/oder an dem von der Zellpopulation abgeleiteten Medium umfasst ist.

Die Zellpopulation kann optional eine humane oder nicht humane tierische Zellpopulation sein. Optional kann sie vom Säugetier stammen, z. B. vom Nutzvieh, Haus- oder Labortier, z. B. eine Nagetierzellpopulation sein. Optional kann sie murin, von Meerschweinchen, Hamster, Ratte, Ziege, Schwein, Katze, Hund, Schaf, Kaninchen, Kuh, Pferd, Alpaka, Frettchen, Geflügel, Büffel und/oder Affen sein.

Die Zellpopulation kann einen oder mehrere unterschiedliche Zelltypen umfassen oder aus diesen bestehen.

Falls hierin nicht anderweitig angegeben, sollte jede Erwähnung einer „Zelle“ hierin als eine Erwähnung einer Zelle verstanden werden, die Teil einer Zellpopulation ist.

Optional kann die Zellpopulation adulte, embryonale und/oder fötale Zellen, z. B. humane embryonale Zellen oder humane adulte Zellen, umfassen oder aus diesen bestehen.

Optional kann die Zellpopulation Stammzellen und/oder differenzierte Zellen umfassen oder aus diesen bestehen. Optional können Stammzellen totipotente Stammzellen, pluripotente Stammzellen, multipotente Stammzellen und/oder oligopotente Stammzellen sein.

Optional kann die Zellpopulation Fibroblasten, Epithelzellen, Lymphozyten und/oder Makrophagen umfassen oder aus diesen bestehen.

Optional kann die Zellpopulation Zellen, die aus Zellen von Nebennierengewebe, Blinddarmgewebe, Blasengewebe, Knochen, Eingeweidengewebe, Hirngewebe, Brustgewebe, Bronchien, Ohrgewebe, Speiseröhrengewebe, Augengewebe, endometrioidem Gewebe, Gallenblasengewebe, Genitalgewebe, Herzgewebe, Hypothalamusgewebe, Nierengewebe, Dickdarmgewebe, Darmgewebe, Kehlkopfgewebe, Lebergewebe, Lungengewebe, Lymphknoten, Mundgewebe, Nasengewebe, Bauchspeicheldrüsengewebe, Nebenschilddrüsengewebe, Hirnanhangdrüsengewebe, Prostatagewebe, Rektalgewebe, Speicheldrüsengewebe, Skelettmuskelgewebe, Hautgewebe, Dünndarmgewebe, Rückenmark, Milzgewebe, Magengewebe, Thymusdrüsengewebe, Luftröhrengewebe, Schilddrüsengewebe, Harnleitergewebe, Harnröhrengewebe, Weich- und/oder Bindegewebe, peritonealem Gewebe, Blutgefäßgewebe und/oder Fettgewebe; kanzerösem Gewebe Stadium I, Stadium II, Stadium III oder Stadium IV; metastatischem kanzerösem Gewebe; kanzerösem Gewebe mit gemischtem Stadium; kanzerösem Gewebe mit Substadium; gesundem oder normalem Gewebe; oder kanzerösem oder anomalem Gewebe stammen oder deren Charakteristika aufweisen, umfassen oder aus diesen bestehen.

Optional kann die Zellpopulation Adipozyten, Endothelzellen, epidermale Zellen, Epithelzellen, Fibroblasten, Gliazellen, Keratinozyten, mesenchymale Zellen, Myoblasten, neuronale Zellen, Plattenepithelzellen, Stromazellen und/oder Trophoblasten umfassen oder aus diesen bestehen.

Optional kann die Zellpopulation Zellen mit der Identität beliebiger der nachstehend angeführten Zelllinien umfassen oder aus diesen bestehen.
Lungenkrebs – NCI-H23; NCI-H226; NCI-H322M; NCI-H460; NCI-H522; A549/ATCC; EK VX; HOP-18; HOP-62; HOP-92; LXFL 529; DMS 114; DMS 273;
Nierenkrebs – UO-31; SN12C; A498; CAKI-1; RXF 393; RXF 631; ACHN; 786-0; TK-10;
Kolonkrebs – HT29; HCC-2998; HCT-116; SW-620; COLO 205; DLD-1; HCT-15; KM12; KM20L2;
Melanom – LOX IMVI; MALME-3M; SK-MEL-2; SK-MEL-5; SK-MEL-28; M19-MEL; UACC-62; USACC-257; M14;
Krebs des zentralen Nervensystems(CNS)-SNB-19 (Glioblastom); SNB-75; SNB-78; U251; SF-268; SF-295; SF-539; XF 498;
Eierstockkrebs – OVCAR-3; OVCAR-4; OVCAR-5; OVCAR-8; IGR-OV-1; SK-OV-3;
Leukämie – CCRF-CEM; K-562; MOLT-4; HL-60; RPMI-8226; SR.

Optional kann die Zellpopulation gesunde und/oder erkrankte Zellen umfassen oder aus diesen bestehen. Erkrankte Zellen können optional eine Krankheit aufweisen, die aus beliebigen der hierin andernorts aufgelisteten Krankheiten ausgewählt sind, optional Krebs. Optional kann die Zellpopulation einen oder mehrere der folgenden Zelltypen umfassen oder aus diesen bestehen. 3T3, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), BHK, HEK293 (embryonale Nierenzellen), SKNBE2 (Neuroblastom), SW480 (Kolonkarzinom), Hela (zervikales Adenokarzinom), PC3M, HOP62, T24, MES_SA (Uterussarkom) und/oder HepG2.

Optional kann die Zellpopulation mutiert und/oder transgen sein.

Optional kann die Zellpopulation immortalisiert sein.

Optional kann die Zellpopulation eine oder mehrere Eigenschaften aufweisen, die aus Auxotrophie, Herstellung einer gewünschten Verbindung und/oder Sekretion einer gewünschten Verbindung ausgewählt sind, oder so genetisch manipuliert werden oder worden sein, dass sie diese aufweist. Optional kann die Zellpopulation genetisch manipuliert werden oder worden sein, z. B. um transgen zu sein und/oder einen Knock-out-Genotyp und/oder -Phänotyp aufzuweisen.

Details zu genetischer Manipulation und Zellpopulationseigenschaften sind hierin andernorts zu finden.

Optional kann das Verfahren das Analysieren einer oder mehrerer isogener Zellpopulationen umfassen.

Jedwede Erwähnung auf das Analysieren einer „Zellpopulation“ sollte hierin so verstanden werden, dass die gesamte Zellpopulation oder eine Probe davon analysiert werden kann.

Optional kann eine Zellpopulation über ein hierin bereitgestelltes Verfahren für eine Analyse optimiert werden, z. B. für eine Analyse, bei der die Umgebungsionisationsquelle eine REIMS-Ionisationsquelle ist. In dieser Hinsicht kann eine Zellpopulation optional dahingehend optimiert werden, dass sie einen spezifischen Rezeptor exprimiert. Die Zellpopulation kann einen solchen Rezeptor ggf. natürlich exprimieren oder kann genetisch manipuliert worden sein, um einen solchen Rezeptor zu exprimieren. Die optimierte Zellpopulation kann optional einem Subjekt verabreicht werden. Dies kann eine darauffolgende Analyse des Subjekts über ein hierin bereitgestelltes Verfahren erleichtern.

Das Verfahren kann optional an einer gesamten Zellpopulation oder einer Probe davon oder einer Region davon durchgeführt werden, insbesondere wenn die Zellpopulation ein Organoid ist. Es sei verstanden, dass jedwede Erwähnung auf eine „Zellpopulation“ hierin optional eine „Probe einer Zellpopulation“ sein kann. Das Verfahren kann optional an einem Medium durchgeführt werden, das von einer Zellpopulation abgeleitet ist, oder an einer Probe davon. Bevor das hierin bereitgestellte Verfahren durchgeführt wird, kann die Zellpopulation oder Probe davon oder Medium oder Probe davon optional getrocknet, mit einem Tupfer gesammelt und/oder auf einen absorbierenden Träger, z. B. ein Filter oder Papier, ausgegeben werden. Optional kann die Zellpopulation oder Probe davon als Pellet bereitgestellt werden. Ein Pellet kann z. B. durch Zentrifugieren eines Fluids, das die Zellpopulation enthält, z. B. eine Flüssigkultur, bei einer geeigneten Kraft und für einen geeigneten Zeitraum zum Sedimentieren jedweder Zellen, großer Strukturen und/oder Makromoleküle, um ein Pellet zu bilden, hergestellt werden. Der Rest des Fluids, d. h. der Überstand, kann danach verworfen werden, z. B. durch Ausleeren oder Ansaugen.

Das Pellet kann direkt vom Boden des Zentrifugenröhrchens gesamplet werden oder es kann von einem Träger, auf dem es übertragen wurde, gesamplet werden. Beispielsweise kann ein Pellet vor dem Sampling optional auf einen Glas- oder Kunststoffträger wie z. B. einen Objektträger oder auf einen Tupfer wie z. B. einen Baumwolltupfer übertragen werden.

Die Zellpopulation, z. B. ein Pellet, kann optional einem oder mehreren Waschschritten unterzogen werden, z. B. um das Kulturmedium zu entfernen. Das Waschen kann mit einem geeigneten Puffer durchgeführt werden. Somit kann das Verfahren optional an einer gewaschenen Zellpopulation durchgeführt werden.

Das Verfahren kann optional das Analysieren eines oder mehrerer unterschiedlicher Ziele umfassen. Optional können zwei oder mehr Ziele unterschiedlicher Zellpopulationen aus unterschiedlichen Stellen innerhalb eines Organoids und/oder aus der gleichen Zellpopulation zu unterschiedlichen Zeitpunkten analysiert werden. Optional können die Ziele an zwei oder mehr unterschiedlichen Stellen vorliegen, z. B. an zwei oder mehr Stellen in einem Organoid.

Optional kann ein Ziel an einer oder mehreren Stellen eines Organoids, die bekannterweise oder mutmaßlich gesund sind; und an einer oder mehreren Stellen eines Organoids, die bekannterweise oder mutmaßlich erkrankt sind, vorliegen.

Optional kann das Verfahren das Analysieren von zwei oder mehr Stellen eines Ziels umfassen. Optional können unterschiedliche Stellen eines Ziels analysiert werden, z. B. eine Reihe von Punkten kann gesamplet werden, optional mit oder ohne Raumcodierungsinformation zu Bildgebungszwecken.

Das Verfahren kann optional an einem Ziel durchgeführt werden, das nativ ist. Unter „nativ“ versteht sich, dass das Ziel vor Durchführung des hierin bereitgestellten Verfahrens nicht modifiziert wurde. Insbesondere kann das Ziel dahingehend nativ sein, dass die Zellpopulation keinem Schritt einer Lyse oder Extraktion, z. B. Lipidextraktion, unterzogen wird, bevor das hierin bereitgestellte Verfahren durchgeführt wird. Somit kann ein Ziel dahingehend nativ sein, dass alle oder im Wesentlichen alle Zellen in der Zellpopulation intakt sind. Somit wird unter „nativ“ verstanden, dass das Ziel nicht chemisch oder physisch modifiziert wurde und somit chemisch und physisch nativ ist. Optional kann das Ziel chemisch nativ sein, d. h. es kann chemisch unmodifiziert sein, was bedeutet, dass es nicht mit einem chemischen Mittel in Kontakt gebracht wurde, um seine Chemie zu ändern. Das Inkontaktbringen eines Ziels mit einer Matrix ist ein Beispiel für eine chemische Modifikation.

Optional kann das Ziel physisch nativ sein, d. h. es kann physisch unmodifiziert sein, was bedeutet, dass es nicht physisch modifiziert wurde. Das Gefrieren und/oder Auftauen sind Beispiele für physische Modifikationen. Der Fachmann wird verstehen, dass, auch wenn physische Aktionen wie z. B. Gefrieren die Chemie einer Prüfprobe beeinflussen können, eine solche Aktion zum Zweck dieser Erfindung nicht als chemische Modifikation angesehen wird.

Somit kann das Ziel optional chemisch nativ, aber nicht physisch nativ sein, z. B. da es gefroren wurde.

Optional kann das Ziel gefroren, zuvor gefroren und danach aufgetaut und/oder anderweitig vorbereitet sein. Optional kann das Verfahren an einem Ziel durchgeführt werden, das keinem Schritt der spezifischen Vorbereitung für eine Massenspektrometrieanalyse unterzogen wurde.

Das Ziel wurde ggf. nicht einem Lösungsmittel oder einem anderen Lösungsmittel als Wasser in Kontakt gebracht, bevor der Rauch, das Aerosol oder der Dampf aus dem Ziel erzeugt wird.

Außerdem oder alternativ wird das Ziel ggf. nicht mit einer Matrix in Kontakt gebracht, bevor der Rauch, das Aerosol oder der Dampf aus dem Ziel erzeugt wird. Beispielweise wird das Ziel ggf. nicht mit einer MALDI-Matrix oder anderen Matrix zum Bewerten der Ionisation von Material im Ziel in Kontakt gebracht.

Alternativ kann das Ziel mit einer Matrix, z. B. einer MALDI-Matrix oder anderen Matrix, zum Bewerten der Ionisation von Material im Ziel in Kontakt gebracht werden. Die Matrix kann zum Aerosol, Rauch oder Dampf hinzugefügt werden, bevor das Aerosol, der Rauch oder der Dampf ionisiert wird und/oder auf die Kollisionsfläche aufprallt.

Das Verfahren kann optional an einem Ziel durchgeführt werden, das für eine bestimmten Massenspektrometrieanalyse vorbereitet wurde; und/oder das für ein beliebiges der hierin andernorts erwähnten Analyseverfahren vorbereitet wurde.

Die Zielvorbereitung (für beliebige der Verfahren der Erfindung und/oder beliebige der hierin offenbarten Analyseverfahren) kann optional eines oder mehrere des Folgenden umfassen.

Die Zellpopulation kann optional auf einer festen Oberfläche wie z. B. einem Glas- oder Kunststoffobjektträger abgeschieden werden.

Das Ziel kann optional chemisch fixiert werden, z. B. um Zellen vor Abbau zu schützen und die Struktur der Zelle und von subzellulären Komponenten wie z. B. Zellorganellen, z. B. Kern, endoplasmatisches Retikulum und/oder Mitochondrien, aufrechtzuerhalten. Das Fixierungsmittel kann z. B. 10 % neutrales gepuffertes Formalin sein.

Ein Gefrieren kann optional durchgeführt werden, z. B. durch Inkontaktbringen der Zellpopulation mit einem geeigneten Kühlmedium wie z. B. Trockeneis, Flüssigstickstoff oder einem Mittel, das in Trockeneis oder Flüssigstickstoff gekühlt wurde, z. B. Isopentan (2-Methylbutan). Gefrorene Zellpopulationen können optional bei z. B. zwischen –80 und –4 Grad Celsius, z. B. bei –70 oder –20 Grad Celsius, gelagert werden.

Die Zellpopulation kann optional gefärbt und/oder markiert werden.

Der Ausdruck „Sampling“ bzw. „Probennahme“ wird hierin verwendet, um die Verwendung einer Vorrichtung zum Erzeugen von Rauch, Dampf oder Aerosol aus einem Ziel zu bezeichnen. Beliebige der Verfahren können optional ein automatisches Sampling umfassen, das optional z. B. unter Verwendung einer REIMS-Vorrichtung durchgeführt werden kann. Beliebige der Verfahren können optional das Verwenden einer Einweg-Sampling-Spitze umfassen.

Identität- oder Authentizitätsanalyse

Fehler durch den Menschen und/oder andere Umstände können zu Fehlidentifikation, Fehlmarkierung, Verwechslungen und dergleichen von Zellpopulationen führen. Somit kann die Identität einer bestimmten Zellpopulation unbekannt, ungewiss und/oder unbestätigt sein. Optional kann das Verfahren verwendet werden, um eine Zellpopulation zu identifizieren und/oder die Identität einer Zellpopulation zu bestätigen.

Unter „Identifizieren“ einer Zellpopulation versteht sich, dass zumindest manche Informationen zu dem einen oder den mehreren Typen von Zellen, die in der Zellpopulation vorhanden sind, erhalten werden. Dies kann optional das Ermitteln der Identität und/oder das Bestätigen der Identität eines oder mehrerer Zelltypen in der Zellpopulation umfassen. Das Bestätigen der Identität einer Zellpopulation kann auch als Bestätigen der Authentizität einer Zellpopulation bezeichnet werden.

Somit kann das Verfahren optional an einer Zellpopulation durchgeführt werden, deren Identität unbekannt ist, um die Identität der Zellpopulation zu ermitteln.

Optional kann das Verfahren an einer Zellpopulation durchgeführt werden, die mutmaßlich eine bestimmte Identität hat, um die Identität der Zellpopulation zu bestätigen oder widerlegen.

Optional kann das Verfahren an einer Zellpopulation durchgeführt werden, die authentifiziert werden muss, um die Authentizität der Zellpopulation zu bestätigen.

Optional kann die Zellpopulation als adulte, embryonale und/oder fötale Zellen umfassend oder aus diesen bestehend identifiziert werden.

Optional kann die Zellpopulation als Stammzellen und/oder differenzierte Zellen umfassend oder aus diesen bestehend identifiziert werden. Optional können Stammzellen totipotente Stammzellen, pluripotente Stammzellen, multipotente Stammzellen und/oder oligopotente Stammzellen sein.

Optional kann die Zellpopulation als Fibroblasten, Epithelzellen, Lymphozyten und/oder Makrophagen umfassend oder aus diesen bestehend identifiziert werden.

Optional kann die Zellpopulation als Zellen, die aus Zellen von Nebennierengewebe, Blinddarmgewebe, Blasengewebe, Knochen, Eingeweidengewebe, Hirngewebe, Brustgewebe, Bronchien, Ohrgewebe, Speiseröhrengewebe, Augengewebe, endometrioidem Gewebe, Gallenblasengewebe, Genitalgewebe, Herzgewebe, Hypothalamusgewebe, Nierengewebe, Dickdarmgewebe, Darmgewebe, Kehlkopfgewebe, Lebergewebe, Lungengewebe, Lymphknoten, Mundgewebe, Nasengewebe, Bauchspeicheldrüsengewebe, Nebenschilddrüsengewebe, Hirnanhangdrüsengewebe, Prostatagewebe, Rektalgewebe, Speicheldrüsengewebe, Skelettmuskelgewebe, Hautgewebe, Dünndarmgewebe, Rückenmark, Milzgewebe, Magengewebe, Thymusdrüsengewebe, Luftröhrengewebe, Schilddrüsengewebe, Harnleitergewebe, Harnröhrengewebe, Weich- und Bindegewebe, peritonealem Gewebe, Blutgefäßgewebe und/oder Fettgewebe; kanzerösem Gewebe Stadium I, Stadium II, Stadium III oder Stadium IV; metastatischem kanzerösem Gewebe; kanzerösem Gewebe mit gemischtem Stadium; kanzerösem Gewebe mit Substadium; gesundem oder normalem Gewebe; oder kanzerösem oder anomalem Gewebe stammen oder deren Charakteristika aufweisen, umfassend oder aus diesen bestehend identifiziert werden.

Optional kann die Zellpopulation als Adipozyten, Endothelzellen, epidermale Zellen, Epithelzellen, Fibroblasten, Gliazellen, Keratinozyten, mesenchymale Zellen, Myoblasten, neuronale Zellen, Plattenepithelzellen, Stromazellen und/oder Trophoblasten umfassend oder aus diesen bestehend identifiziert werden.

Optional kann die Zellpopulation als beliebige der hierin andernorts aufgelisteten Zelllinien umfassend oder aus diesen bestehend identifiziert werden, z. B. als die Identität beliebiger der hierin andernorts aufgelisteten Zelllinien aufweisend.

Optional kann die Zellpopulation als gesunde und/oder erkrankte Zellen umfassend oder aus diesen bestehend identifiziert werden, wobei erkrankte Zellen optional eine Krankheit haben können, die aus beliebigen der hierin andernorts aufgelisteten Krankheiten ausgewählt sind.

Optional kann die Zellpopulation als mutierte und/oder transgene Zellen umfassend oder aus diesen bestehend identifiziert werden.

Optional kann die Zellpopulation analysiert werden, um (i) die Identität oder Authentizität der Zellpopulation zu bestätigen; (ii) eine Mutation in der Zellpopulation nachzuweisen; und/oder (iii) eine ungewünschte Variation in der Zellpopulation nachzuweisen.

Infektionsanalyse

Für eine Zellpopulation kann das Risiko einer Infektion mit einem anderen Zelltyp und/oder einer Mikrobe bestehen. Eine „Infektion“ mit einem anderen Zelltyp und/oder einer Mikrobe kann hier auch als „Kontamination“ bezeichnet werden. Ein besonders hohes Risiko stellt die Kontamination mit Mycoplasma dar.

Optional kann das Verfahren verwendet werden, um zu analysieren, ob eine Infektion in einer Zellpopulation vorliegt.

Optional kann das Verfahren verwendet werden, um (i) zu ermitteln, ob die Zellpopulation an einer Infektion leidet; (ii) zu ermitteln, ob die Zellpopulation infektionsfrei ist; (iii) zu ermitteln, ob die Zellpopulation von einer Infektion geheilt wurde; (iv) das Fortschreiten oder Stadium einer Infektion einer Zellpopulation zu ermitteln; oder (v) das Fortschreiten oder Stadium einer Behandlung gegen eine Infektion einer Zellpopulation zu ermitteln.

Optional können, wenn eine Infektion ermittelt wird, der infizierende Zelltyp und/oder die infizierende Mikrobe identifiziert werden.

Das Verfahren kann optional, wenn eine Infektion ermittelt wird, einen Schritt des Behandelns/Eliminierens der Infektion durch Inkontaktbringen der Zellpopulation mit einer entsprechenden Substanz, die in Bezug auf eine selektive Tötung des infizierenden Zelltyps und/oder der infizierenden Mikrobe oder auf die Hemmung des Wachstums davon wirksam ist, umfassen. Beispielsweise wenn eine Infektion mit Mycoplasma ermittelt wird, kann ein geeignetes Antibiotikum verwendet werden.

Analyse von Phänotyp, Genotyp und/oder Homogenität

Ein wesentlicher Bereich der laufenden medizinischen Forschung liegt darin, die komplexen Interaktionen zwischen den 50.000 bis 100.000 Genen, die das humane Genom bilden, in Bezug auf Interaktionen zwischen unterschiedlichen Genen und Interaktionen zwischen Genen und der Umgebung besser verstehen zu lernen. Insbesondere ist es wünschenswert, die Beziehung zwischen einem bestimmten Gen und einem bestimmten Phänotyp oder beobachteten Charakteristikum besser verstehen zu lernen.

Es gibt diverse unterschiedliche Typen von genetischen Krankheiten.

Erstens gibt es Einzelgenstörungen, die über Familien hinweg zu verfolgen sind. Eine Einzelgenstörung ist das Ergebnis eines einzelnen mutierten Gens. Mehr als 4000 humane Krankheiten werden durch Einzelgendefekte verursacht und in vielen Fällen ist es möglich, die beteiligten Gene zu isolieren und die Mutationstypen, die diesen Zuständen zugrundeliegen, zu ermitteln.

Zweitens gibt es polygene oder multigene Krankheiten, die eine genetische Komponente zu haben scheinen, aber keinem einfachen Vererbungsmuster folgen. Diese Krankheiten spiegeln die Wirkung wider, die eine Variation der genetischen Zugänglichkeit für eine Vielzahl unterschiedliche Umgebungsmittel hat.

Drittens gibt es genetische Krankheiten, die aus Änderungen der Struktur oder Anzahl unserer Chromosome resultieren.

Genetische Mutationen können die Struktur eines Proteins ändern, z. B. durch Codieren für eine unterschiedliche Aminosäure und/oder dadurch, dass sie ein einem verkürzten oder verlängerten Protein resultieren. Genetische Mutationen können alternativ oder zusätzlich zu einem verringerten Output oder Abwesenheit eines Genprodukts führen.

Eines der besten Beispiele für eine genetische Mutation ergibt sich aus vererbten Störungen von Hämoglobin (Hb). Die Struktur von humanem Hämoglobin ändert sich während des embryonalen, fötalen und adulten Lebens. Alle normale Hämoglobine sind Tetramere von zwei Paaren ungleicher Globinketten. Adulte und fötale Hämoglobine haben α-Ketten in Kombination mit β-Ketten (HBA α2β2) oder γ-Ketten (HbF α2γ2). Mehr als 400 strukturelle Hämoglobinvarianten wurden identifiziert, viele dieser führen jedoch nicht zu einer klinischen Behinderung.

Anderen Varianten, die durch Aminosäuresubstitution bedingt sind, verändern die Stabilität oder Funktion des Hämoglobinmoleküls, wodurch sich ein Krankheitsphänotyp ergibt. Beispielsweise bewirkt die Substitution von Valin durch Glutaminsäure in der sechsten Position der β-Kette, dass die Hämoglobinmoleküle lineare Stapel in der Desoxy-Konfiguration bilden, wodurch wiederum bewirkt wird, dass die roten Blutkörperchen eine Sichelkonfiguration annehmen. Die entstehende Krankheit (Sichelzellanämie) führt aufgrund einer Blockade des Mikrokreislaufs mit gesichelten roten Blutkörperchen zu chronischer Anämie und Gewebeschaden. Andere Mutationen beeinflussen den Sauerstofftransport oder binden Sauerstoff eifriger als normal, was zu Sauerstoffmangel führt. Auch wenn die unterschiedlichen Phänotypen, die mit diesen unterschiedlichen genetischen Mutationen assoziiert sind, ungefähr gleich sind, kann mit einer identischen Mutation eine beträchtliche individuelle Variation assoziiert sein. Beispielsweise kann die Sichelzellanämie von lebensbedrohlich bis zu symptomlos und wenig Behinderung verursachend variieren.

Die zystische Fibrose (CF) ist ein weiteres Beispiel für eine monogene Krankheit, die eine bemerkenswerte Phänotypvariabilität zeigt.

Der Ausdruck „Phänotyp“ wird verwendet, um sich auf die physikalischen und/oder biochemischen Charakteristika einer Zelle zu beziehen, der Ausdruck „Genotyp“ hingegen wird verwendet, um sich auf die genetische Konstitution einer Zelle zu beziehen.

Der Ausdruck „Phänotyp“ kann verwendet werden, um sich auf eine Sammlung physikalischer und/oder biochemischer Charakteristika einer Zelle zu beziehen, die optional die Sammlung aller physikalischer und/oder biochemischer Charakteristika der Zelle zu beziehen und/oder um sich auf ein oder mehrere physikalische und/oder biochemische Charakteristika einer Zelle zu beziehen. Beispielsweise kann eine Zelle als den Phänotyp eines bestimmten Zelltyps aufweisend bezeichnet werden, z. B. einer Brustzelle, und/oder als den Phänotyp der Expression eines spezifischen Proteins aufweisend bezeichnet werden, z. B. eines Rezeptors, z. B. HER2 (Rezeptor 2 des humanen epidermalen Wachstumsfaktors).

Der Ausdruck „Genotyp“ kann verwendet werden, um sich auf genetische Informationen zu beziehen, die Gene, regulatorische Elemente und/oder Junk-DNA umfassen können. Der Ausdruck „Genotyp“ kann verwendet werden, um sich auf eine Sammlung von genetischen Informationen einer Zelle zu beziehen, die optional die Sammlung aller genetischen Informationen einer Zelle sein können; und/oder um sich auf eine oder mehrere genetische Informationen einer Zelle zu beziehen. Beispielsweise kann eine Zelle als den Genotyp eines bestimmten Zelltyps aufweisend bezeichnet werden, z. B. einer Brustzelle, und/oder als den Genotyp der Codierung für ein spezifisches Protein aufweisend bezeichnet werden, z. B. einen Rezeptor, z. B. HER2 (humaner epidermaler Wachstumsfaktor).

Der Genotyp einer Zelle kann deren Phänotyp beeinflussen, wie nachstehend erläutert.

Die Beziehung zwischen Genotyp und Phänotyp kann direkt sein. Beispielsweise wenn eine Zelle ein funktionelles Gen umfasst, das für ein bestimmtes Protein codiert, wie z. B. HER2, dann ist sie für gewöhnlich phänotypisch HER2-positiv, d. h. hat das HER2-Protein auf ihrer Oberfläche, wenn eine Zelle hingegen kein funktionelles HER2-Gen aufweist, weist sie einen HER2-negativen Phänotyp auf.

Ein mutierter Genotyp kann zu einem mutierten Phänotyp führen. Beispielsweise wenn eine Mutation die Funktion eines Gens zerstört, kann der Verlust der Funktion dieses Gens sodann zu einem mutierten Phänotyp führen. Faktoren wie z. B. genetische Redundanz können jedoch verhindern, dass eine genotypische Eigenschaft zu einer entsprechenden phänotypischen Eigenschaft führt. Beispielsweise haben humane Zellen für gewöhnlich zwei Kopien jedes Gens, eines von jedem Elternteil. Beim Beispiel einer genetischen Krankheit kann eine Zelle eine mutierte (erkrankte) Kopie eines Gens und eine nichtmutierte (gesunde) Kopie des Gens umfassen, was zu einem mutierten (erkrankten) Phänotyp führen kann, abhängig davon, ob das mutierte Gen rezessiv oder dominant ist. Rezessive Gene beeinflussen den Phänotyp einer Zelle nicht oder nicht signifikant, dominante Gene hingegen beeinflussen den Phänotyp einer Zelle.

Es muss außerdem berücksichtigt werden, dass viele genotypischen Veränderungen ggf. keine phänotypische Wirkung aufweisen, z. B. da sie in Junk-DNA vorhanden sind, d. h. DNA, die keinen sequenzabhängigen Zweck zu erfüllen scheint, oder da sie stille Mutationen sind, d. h. Mutationen, die die Codierungsinformationen der DNA aufgrund der Redundanz des genetischen Codes nicht ändern.

Der Phänotyp einer Zelle kann anhand deren Genotyps dahingehend ermittelt werden, da eine Zelle genetische Informationen benötigt, um Zellprozesse durchzuführen, und ein beliebiges bestimmtes Protein nur innerhalb einer Zelle erzeugt werden kann, wenn die Zelle die relevante genetische Information enthält. Der Phänotyp einer Zelle kann jedoch auch durch Umgebungsfaktoren und/oder Belastungen wie z. B. Temperatur, Nährstoff- und/oder Mineralienverfügbarkeit, Toxine und dergleichen beeinflusst werden. Solche Faktoren können beeinflussen, wie die genetische Information verwendet wird, z. B. welche Gene exprimiert werden und/oder in welcher Höhe. Umgebungsfaktoren und/oder Belastungen können auch andere Charakteristika einer Zelle beeinflussen, Wärme z. B. kann Membranen fluider machen.

Wenn ein funktionelles Gen in der korrekten genomischen Position in eine Zelle insertiert wird, kann dies sodann zu einem entsprechenden Phänotyp führen.

Das Insertieren eines Transgens kann den Phänotyp einer Zelle beeinflussen, ein veränderter Phänotyp kann jedoch optional nur unter den geeigneten Umgebungsbedingungen beobachtet werden. Beispielsweise führt das Insertieren eines Transgens, das für ein an einer Synthese einer bestimmten Substanz beteiligtes Protein codiert, nur zu Zellen, die diese Substanz herstellen, wenn die Zellen mit den erforderlichen Ausgangsmaterialien versorgt sind.

Optional kann das Verfahren das Analysieren des Phänotyps und/oder Genotyps einer Zellpopulation umfassen.

Der Genotyp und/oder Phänotyp einer Zellpopulation kann manipuliert werden, z. B. um einen Zellprozess zu analysieren, eine Krankheit wie z. B. Krebs zu analysieren, eine Zellpopulation für das Screening und/oder die Herstellung von Arzneimitteln besser geeignet zu machen und dergleichen. Optional kann das Verfahren das Analysieren der Wirkung einer solchen Genotyp- und/oder Phänotypmanipulation auf die Zellpopulation umfassen, z. B. auf den Genotyp und/oder Phänotyp der Zellpopulation.

Das Verfahren kann optional verwendet werden, um eine Zellpopulation nach Mutagenese zu analysieren. Herkömmliche Verfahren zum Bestätigen, ob eine Zelle mutiert wurde, können schwierig und/oder zeitaufwendig sein. Optional kann das Verfahren verwendet werden, um zu analysieren, ob eine Zelle mutiert wurde. Eine Mutation kann z. B. das Einbringen eines neuen Gens, das Silencen eines Gens, eine Änderung der Expression eines Gens sein oder ein verändertes Protein hervorbringen. Das Silencen kann z. B. durch Gen-Knockout erzielt werden.

Optional kann das Verfahren verwendet werden, um die Wirkung einer Mutagenese auf eine Zellpopulation zu analysieren, z. B. auf den Genotyp und/oder Phänotyp einer Zellpopulation.

Optional kann das Verfahren eine Zellpopulation zu zwei oder mehr Zeitpunkten analysieren, z. B. vor und nach Mutagenese, und/oder zu zwei oder mehr Zeitpunkten nach Mutagenese.

Optional kann die Zellpopulation homogen oder heterogen sein. Unter „homogen“, „Homogenität“ und Ableitungen dieser Ausdrücke versteht sich, dass die Population einheitlich ist, und unter „heterogene“, „Heterogenität“ und Ableitungen dieser Ausdrücke versteht sich, dass die Population nicht einheitlich ist.

Unter „Homogenitätsgrad“ oder „Heterogenitätsgrad“ versteht sich das Ausmaß, in dem eine Zellpopulation homogen oder heterogene ist, wobei dieses als Prozentsatz ausgedrückt werden kann. Beispielsweise kann eine Zellpopulation als einen hohen Homogenitätsgrad aufweisend angesehen werden, wenn zumindest 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 100 % der Zellen homogen sind. Eine Zellpopulation kann als einen hohen Heterogenitätsgrad aufweisend angesehen werden, wenn zumindest 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 100 % der Zellen heterogen sind.

Die Homogenität und/oder Heterogenität kann sich auf ein oder mehrere genotypische und/oder phänotypische Merkmale beziehen, z. B. zumindest 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 genotypische und/oder phänotypische Merkmale, sich optional auf den gesamten Genotyp und/oder Phänotyp der Zellen beziehen.

Optional kann das Verfahren das Analysieren des Homogenitätsgrads und/oder Heterogenitätsgrad der Zellpopulation umfassen.

Während des Kultivierens einer Zellpopulation können Zellen wachsen und sich replizieren. Die Replikation kann eine Selbsterneuerung umfassen, d. h. die Herstellung einer Tochterzelle mit dem gleichen Genotyp und/oder Phänotyp wie die Mutterzelle, und/oder eine Differenzierung umfassen, d. h. die Herstellung einer Tochterzelle mit einem anderen Genotyp und/oder Phänotyp als die Mutterzelle.

Alternativ oder zusätzlich können Zellen eine oder mehrere Mutationen erwerben und somit einen unterschiedlichen Genotyp erwerben, der sich selbst als unterschiedlicher Phänotyp manifestieren kann.

Bei einer heterogenen Zellpopulation kann ein Typ besser oder anders als ein anderer Zelltyp wachsen und/oder sich replizieren und/oder kann ein Zelltyp inaktiv werden und/oder sterben.

Aus diesen und/oder anderen Gründen kann eine Zellpopulation stärker oder schwächer heterogen werden, somit kann das Verfahren das Überwachen auf Änderungen der Homogenität und/oder Heterogenität der Zellpopulation umfassen.

Wenn der Homogenitäts- und/oder Heterogenitätsgrad der Zellpopulation höher oder niedriger als erwünscht ist, kann das Verfahren optional einen Schritt des Beeinflussens des Homogenitäts- und/oder Heterogenitätsgrads umfassen. Dies kann z. B. das Einstellen der Kulturbedingungen und/oder das Hinzufügen einer Substanz umfassen, um z. B. die Wachstums- und/oder Differenzierungsrate eines oder mehrerer der Zelltypen zu beeinflussen, die in der Zellpopulation vorhanden sind.

Manipulation von Genotyp und/oder Phänotyp

Optional kann eine Zellpopulation manipuliert werden, z. B. können der Phänotyp und/oder Genotyp mancher oder aller Zellen, die die Zellpopulation bilden, manipuliert werden.

Die Manipulation kann optional das Aussetzen einer Zellpopulation oder eines Teilbereichs davon gegenüber einer Verbindung und/oder Strahlung umfassen.

Die Manipulation kann optional eine genetische Manipulation sein.

Die genetische Manipulation kann eine oder mehrere genomische Regionen einer Zelle verändern, wobei die genomische Region in der codierenden Region eines Gens, der nichtcodierenden Region eines Gens, einer regulatorischen Region, z. B. Promotor oder Enhancer, und/oder in einer Region, die „Junk-DNA“ genannt wird, vorhanden sein kann.

Eine genetische Manipulation kann optional eine willkürliche Mutagenese umfassen. Beispielsweise können Zellen einem Mutagen ausgesetzt werden, z. B. ausgewählt aus einem chemischen Mutagen und/oder Strahlung.

Eine Verbindung, die optional ein chemisches Mutagen sein kann, kann optional aus z. B. einem Alkylierungsmittel, einem Vernetzungsmittel und/oder polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAHs) ausgewählt sein. Alkylierungsmittel agieren durch Addieren von molekularen Komponenten zu DNA-Basen, wodurch das Proteinprodukt verändert wird. Vernetzungsmittel schaffen kovalente Bindungen mit DNA-Basen, während PAHs vom humanen Körper in andere potenziell mutagene Moleküle verstoffwechselt werden.

Die Strahlung kann optional z. B. aus Licht mit einer geeigneten Wellenlänge, Wärme und/oder ionisierender Strahlung ausgewählt sein. Ionisierende Strahlung kann Zellen durchdringen und Ionen im Zellinhalt erzeugen. Diese Ionen können dauerhafte Änderungen der DNA bewirken. Ionisierende Strahlung kann optional aus z. B. Röntgenstrahlen, Gammastrahlen, Neutronen, Elektronen („Betapartikeln“) und/oder Alphapartikeln (Heliumkerne) ausgewählt sein. Ionisierende Strahlung kann die Weise, wie zwei DNA-Stränge interagieren, verändern. Sie kann gesamte Abschnitte der Chromosome umordnen, wodurch relativ lange DNA-Stücke verändert werden. Licht kann optional z. B. UV-Licht sein. Dies kann bewirken, dass sich kovalente Bindungen zwischen benachbarten Thyminbasen in der DNA bilden, wodurch die DNA an dieser Stelle verändert wird.

Alternativ oder zusätzlich zur willkürlichen Mutagenese kann eine genetische Manipulation optional eine gezielte Mutagenese umfassen, die optional z. B. der Knockout, die Veränderung und/oder die Insertion einer genetischen Information sein kann. Eine Zelle, die durch gezielte Mutation manipuliert wurde, kann als „transformierte“ Zelle bezeichnet werden, insbesondere wenn ein neues Gen oder eine Genvariante, d. h. ein „Transgen“, insertiert wurde. Gleichermaßen kann eine Zellpopulation, die Zellen, die durch gezielte Mutation manipuliert wurden, umfasst oder aus diesen besteht, als „transformierte“ Zellpopulation bezeichnet werden. Gleichermaßen kann Organoid, das Zellen, die durch gezielte Mutation manipuliert wurden, umfasst oder aus diesen besteht, als „transformiertes“ Organoid bezeichnet werden.

Die Mutagenese kann optional z. B. eine oder mehrere der folgenden Techniken zum Einbringen des gewünschten genetischen Materials wie z. B. eines Transgens in eine Zelle umfassen: Mikroinjektion in den Kern einer Zelle; einen viralen Vektor, z. B. einen Adenovirus- oder Lentivirusvektor; ein Liposom; Calciumphosphat; ein Dendrimer; ein kationisches Polymer wie z. B. DEAE-Dextran und/oder Polyethylenimin; Beschallung; Elektroporation; magnetgestützte Transfektion mit magnetischen Partikeln; und/oder Partikelbeschuss.

Die Mutagenese kann optional eine Genombearbeitung umfassen, z. B. unter Verwendung von programmierbaren Nukleasen wie z. B. Zinkfingernukleasen (ZFNs), transkriptionsaktivator-like Effektornukleasen (TALENs) und/oder Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-assoziiertem Protein 9 (Cas9).

Optional kann das Verfahren einen Schritt der willkürlichen und/oder gezielten Mutagenese umfassen, z. B. über beliebige der hierin erwähnten Verfahren.

Eigenschaften von Zellpopulationen

Das Verfahren kann an einer Zellpopulation mit einer gewünschten Eigenschaft durch Auswählen einer bestehenden Zellpopulation mit der gewünschten Eigenschaft durchgeführt werden. Alternativ oder zusätzlich kann eine Zellpopulation so manipuliert werden, dass die Zellpopulation eine gewünschte Eigenschaft erhält. Das Verfahren kann optional das Analysieren einer oder mehrerer Eigenschaften einer Zellpopulation umfassen.

Eigenschaften einer Zellpopulation, die ausgewählt, manipuliert, analysiert oder dergleichen werden können, können optional aus beliebigen der nachstehend aufgelisteten Eigenschaften ausgewählt sein.

Die Zellpopulation kann in Bezug auf eine oder mehrere Substanzen auxotroph sein. Auxotrophie ist die Unfähigkeit oder verringerte Fähigkeit einer Zelle oder eines Organismus, eine bestimmte Substanz zu synthetisieren, die für deren bzw. dessen Wachstum erforderlich ist. Ein Auxotroph ist ein Organismus, der dieses Charakteristikum zeigt; auxotroph ist das entsprechen Adjektiv. Beispielsweise kann ein Auxotroph einen Mangel an einem Stoffwechselenzym aufweisen, das aus Adeninphosphoribosyltransferase (APRT) und/oder Dihydrofolatreduktase (DHFR) ausgewählt ist.

Die Zellpopulation kann optional die Fähigkeit aufweisen, eine gewünschte Substanz herzustellen, z. B. ein Arzneimittel. Somit kann die Zellpopulation optional die Fähigkeit aufweisen, eine Substanz zu verwenden, z. B. ein Substratmolekül zu verstoffwechseln, um eine gewünschte Verbindung oder einen gewünschten Vorläufer zu bilden. Die Verwendung einer ersten Substanz kann das Verwenden einer ersten Substanz als Substrat zum Herstellen einer zweiten Substanz; das Verwenden einer ersten Substanz als allgemeiner Nährstoff; und/oder das Aufschlüsseln einer ersten Substanz umfassen.

Die Zellpopulation kann optional eine hohe spezifische Produktivität in Bezug auf die Herstellung einer gewünschten Substanz aufweisen. Die Zellpopulation kann optional eine hohe Effizienz in Bezug auf die Verwendung und/oder Aufschlüsselung einer gewünschten Substanz aufweisen. Sie kann optional hohe Mengen eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten, die mit Energieerzeugung, Regulierung des zellulären Redoxpotenzials und Vorläufern für die Glykosylierung verknüpft sind, umfassen oder die Fähigkeit aufweisen, hohe Mengen dieser zu erzeugen. Das Verfahren kann optional verwendet werden, um zu ermitteln, ob eine Zellpopulation mit geringer Produktivität/Effizienz ein anderes Stoffwechselprofil als sein Gegenstück mit hoher Produktivität/Effizienz aufweist. Das Verfahren kann optional verwendet werden, um das spezifische Produktivitätspotenzial und/oder oder die Effizienz in Bezug auf die Verwendung und/oder Aufschlüsselung einer gewünschten Substanz einer Zellpopulation zu analysieren.

Die Zellpopulation kann optional die Fähigkeit aufweisen, eine hergestellte Substanz zu sekretieren.

Die Zellpopulation kann optional die Fähigkeit aufweisen, sich schnell zu replizieren.

Der Lactatverbrauch kann bei der Steuerung von pH-Werten helfen, was wiederum die Zelllebensfähigkeit verbessern kann. Die Zellpopulation kann optional einen hohen Lactatverbrauch aufweisen oder die Fähigkeit zu diesem aufweisen.

Das Verfahren kann optional verwendet werden, um das Metabolom, Lipidom und/oder Proteom einer Zellpopulation zu analysieren.

Das Metabolom ist eine Sammlung mancher oder aller kleinmolekularen Metaboliten, die in einer Zelle vorhanden sind. Das Lipidom ist eine Sammlung mancher oder aller Lipide, die in einer Zelle vorhanden sind. Das Proteom ist eine Sammlung mancher oder aller Proteine, die in einer Zelle vorhanden sind. Auch wenn viele Proteine und manche Metaboliten ggf. nicht notwendigerweise direkt über das hierin bereitgestellte Verfahren analysiert werden, können sie optional indirekt durch Analyse eines indirekten Biomarkers für diese analysiert werden.

Das Verfahren kann optional das Analysieren des Status einer Zellpopulation oder eines oder mehrerer Zelltypen, wie darin vorhanden, umfassen. Unter „Status“ versteht sich der Zustand einer Zellpopulation oder einer oder mehrerer Zelltypen, wie darin vorhanden, die z. B. gesund und wachsend; gesund und nicht wachsend; gestresst und wachsend; gestresst und nicht wachsend; sterbend; oder tot sein können.

Das Verfahren kann optional das Analysieren der Lebensfähigkeit einer Zellpopulation umfassen. Unter „Lebensfähigkeit“ versteht sich die Mindestzeitdauer, für die die Zellpopulation weiterlebt. Die Lebensfähigkeit kann auch als „Robustheit“ bezeichnet werden, da robuste Zellpopulationen wahrscheinlich länger als nicht robuste Zellpopulationen leben.

Das Verfahren kann optional das Analysieren eines zellulären Prozesses umfassen. Ein zellulärer Prozess kann z. B. das Herstellen einer Substanz; das Verwenden eines Nährstoffs; eine Reaktion auf ein Aussetzen gegenüber einer Substanz; eine Reaktion auf ein Aussetzen gegenüber einer Umgebungsbedingung und dergleichen sein.

Das Verfahren kann optional das Identifizieren eines spektrometrischen Biomarkers für einen Zelltyp, einen Phänotyp, einen Genotyp und/oder eine Eigenschaft umfassen. Wie oben erwähnt, sind die Identität und Charakteristika vieler Zellpopulationen, z. B. Zelllinien, bekannt. Insbesondere umfassen Daten, die für die NC60-Zelllinien zur Verfügung stehen, Arzneimittelempfindlichkeitsmuster für mehr als 100.000 Verbindungen und natürliche Produkte, allgemeine Daten zur Protein- und Genexpression und übliche Mutationen, die mit Krebs assoziiert sind. Das hierin bereitgestellte Verfahren ermöglicht das Identifizieren von spektrometrischen Biomarkern dieser Zelltypen oder Zellcharakteristika. Somit kann das Verfahren verwendet werden, z. B. um ein Charakteristikum mit spektrometrischen Daten zu korrelieren, z. B. einem spektrometrischen Biomarker. Das Charakteristikum kann z. B. ein Genotyp und/oder ein Phänotyp sein, z. B. die Empfindlichkeit in Bezug auf eine bestimmte Substanz. Wie nachstehend erörtert, wurden vom Erfinder beispielsweise Korrelationen zwischen spektralen REIMS-Merkmalen und Genexpressionsprofilen identifiziert und sind im Fall von fads2- und ugcg-Genen beispielhaft veranschaulicht.

Arzneimittelentdeckung und Screening von Mitteln, z. B. zytotoxischen Mitteln.

Es ist bekannt, zellbasierte Plattformen zu verwenden, um die Arzneimittelentdeckung voranzutreiben, z. B. die Entdeckung von Antikrebsarzneimitteln, und der Fachmann wird verstehen, dass zellbasierte Verbindungsscreens und Bioassays für eine solche Arzneimittelentdeckung wesentlich sind.

Es ist bekannt, ein Nicht-Massenspektrometrie-Hochdurchsatzzytotoxizitätsscreening unter Verwendung eines Felds von Zellpopulationen durchzuführen, die diverse humane Krebstypen abdecken. Die Informationen, die aus dem Prozess des Durchführens eines solchen Zytotoxizitätsscreenings erhalten werden, können sodann für die Auswahl potenzieller therapeutischer Mittel und/oder geeigneter In-vivo-Modelle für eine Wirksamkeitsstudie verwendet werden.

Optional kann das hierin bereitgestellte Verfahren für die Arzneimittelentdeckung und/oder Arzneimittelanalyse verwendet werden. Somit kann es z. B. als Screeningverfahren zum Screenen potenzieller therapeutischer Mittel; oder Screenen bekannter Therapeutika zum Analysieren deren Wirkungen verwendet werden. Beispielsweise kann das Verfahren verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Substanz; den Wirkmechanismus einer Substanz; und/oder die Sicherheit einer Substanz zu analysieren. Die Wirksamkeit kann optional die therapeutische Wirksamkeit sein. Die Sicherheit kann optional die pharmakologische Sicherheit sein.

Optional kann das Screening ein Hochdurchsatzscreening sein. Optional kann das Screening auf ein therapeutisches Mittel, das gegen beliebiger der hierin andernorts aufgelisteten Krankheiten wirksam ist, z. B. Krebs oder einen oder mehrere spezifische Krebstypen, oder ein Screening dieses sein.

Somit kann das Verfahren optional das Aussetzen einer Zellpopulation gegenüber einer ersten Substanz und das Verwenden des Verfahrens zum Analysieren der Wirkung der Substanz auf die Zellpopulation umfassen. Details zu geeigneten Substanzen werden hierin andernorts erörtert.

Optional kann eine zweite Substanz verwendet werden, z. B. zu Vergleich- oder Kontrollzwecken. Beispielsweise kann das Verfahren das Aussetzen einer ersten Zellpopulation gegenüber einer ersten Substanz und eine zweite Zellpopulation kann einer zweiten Substanz ausgesetzt werden, das Analysieren der ersten und der zweiten Zellpopulation über Massenspektrometrie, wie hierin andernorts erörtert, und das Analysieren jedweder Unterschiede zwischen den zwei Zellpopulationen umfassen. Optional kann die zweite Substanz eine Kontrollsubstanz sein, die z. B. eine Negativkontrolle wie z. B. Wasser oder Puffer oder eine Positivkontrolle wie z. B. ein Mittel mit bekannter Wirkung, z. B. einer bekannten zytotoxischen Wirkung, sein kann. Optional können die erste und die zweite Zellpopulation vor Durchführung des Verfahrens identisch sein. Beispielsweise können zwei Proben aus einer einzelnen Zellpopulation genommen werden, um zwei Zellpopulationen zu erzeugen. Optional können die erste und die zweite Zellpopulation isogen sein. Optional können die erste und die zweite Zellpopulation sich phänotypisch und/oder genotypisch unterscheiden, z. B. sie können unterschiedliche Zelltypen sein.

Das Analysieren der Wirkung der Substanz auf die Zellpopulation kann das Analysieren einer Änderung einer oder mehrerer Eigenschaften der Zellpopulation umfassen, wobei diesbezügliche Details hierin andernorts erörtert sind.

Somit kann das Verfahren optional das Analysieren der spektrometrischen Daten umfassen, um zu ermitteln, ob die Zellpopulation auf potenziell interessante Weise mit der Substanz interagiert hat.

Eine „Interaktion auf potenziell interessante Weise“ bedeutet, dass die Interaktion zu einer phänotypischen und/oder genotypischen Änderung führt. Optional kann die phänotypische und/oder genotypische Änderung einer Änderung einer oder mehrerer Eigenschaften der Zellpopulation sein, wobei diesbezügliche Details hierin andernorts zu finden sind.

Optional kann die EC50 einer Testsubstanz getestet werden. Die EC50 ist die Konzentration eines Arzneimittels, das eine halbmaximale Reaktion auslöst.

Beispielsweise kann die Zytotoxizität einer Testsubstanz getestet werden, z. B. kann der Prozentsatz an überlebenden Zellen als Funktion der Konzentration der Testsubstanz gemessen werden und können Zellpopulationen, die in Bezug auf die Testsubstanz empfindlich und/oder resistent sind, identifiziert werden.

Optional kann das Verfahren das Analysieren der Zugänglichkeit einer Zellpopulation für eine Substanz umfassen, z. B. die Zugänglichkeit einer erkrankten Zellpopulation für ein bekanntes oder potenzielles therapeutisches Mittel. Beispielsweise kann die Zugänglichkeit einer Zellpopulation eines bestimmten Krebstyps für ein Antikrebsarzneimittel analysiert werden.

Optional kann das Verfahren auch einen Schritt des Analysierens der Wirkung einer Umgebungsbedingung der Zellpopulation auf die Reaktion einer Zellpopulation auf die Substanz umfassen. Details zu Umgebungsbedingungen der Zellpopulation sind hierin andernorts zu finden. Somit kann das Verfahren optional die Schritte des (i) Aussetzen der Zellpopulation gegenüber einer Substanz; und (ii) Ändern einer Umgebungsbedingung der Zellpopulation umfassen.

Optional können die Schritte des (i) Aussetzens der Zellpopulation gegenüber einer Substanz; und (ii) Ändern einer Umgebungsbedingung der Zellpopulation gleichzeitig oder sequentiell in einer beliebigen Reihenfolge durchgeführt werden. Beliebige dieser Schritte können allein oder in Kombination wiederholt werden, z. B. zumindest 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Mal.

Somit kann eine Zellpopulation optional einer Substanz ausgesetzt werden und eine Umgebungsbedingung der Zellpopulation kann danach geändert werden; eine Umgebungsbedingung der Zellpopulation kann geändert werden und eine Zellpopulation kann danach einer Substanz ausgesetzt werden; und/oder eine Zellpopulation kann einer Substanz ausgesetzt werden und eine Umgebungsbedingung der Zellpopulation kann gleichzeitig verändert werden.

Es wird verstanden, dass optional eine oder mehrere unterschiedliche Substanzen und/oder eine oder mehrere unterschiedliche Umgebungsbedingungen in beliebigen dieser Verfahren verwendet werden können. Beispielsweise kann ein Feld unterschiedlicher Substanzen optional verwendet werden. Das Feld kann z. B. Mitglieder einer einzelnen Arzneimittelklasse und/oder Mitglieder von zwei oder mehr Arzneimittelklassen, z. B. bekannter und unbekannter Arzneimittel, umfassen oder aus diesen bestehen.

Beispielsweise kann die Substanz optional ein zytotoxisches und/oder zytostatisches Arzneimittel sein. Somit können z. B. eine oder mehrere Zellpopulationen mit einem oder mehreren bekannten zytotoxischen/zytostatischen Arzneimitteln getestet werden, z. B. einem zugelassenen nichtchemotherapeutischen zytotoxischen/zytostatischen Arzneimittel. Optional können eine oder mehrere Zellpopulationen z. B. getestet werden, unter Verwendung einer oder mehrerer potenziell neuer therapeutischer Mittel und/oder zytotoxischer/zytostatischer Arzneimittel.

Optional können eine oder mehrere Zellpopulationen genetisch modifiziert werden und die modifizierte Zellpopulation kann getestet werden, z. B. mit einem bekannten zytotoxischen/zytostatischen Arzneimittel und/oder gegen ein Feld potenziell neuer therapeutischer Mittel oder zytotoxischer/zytostatischer Arzneimittel.

Optional können eine oder mehrere Zellpopulationen gegen eine erste Substanz getestet werden und danach gegen eine zweite Substanz und optional eine oder mehrere weitere Substanzen getestet werden.

Analyse einer Änderung

Die optionale Analyse einer Änderung kann auf eine oder mehrere unterschiedliche Weisen durchgeführt werden.

Optional kann eine Zellpopulation über das hierin bereitgestellte Verfahren zu einem ersten Zeitpunkt und zu einem darauffolgenden weiteren Zeitpunkt, z. B. einem zweiten Zeitpunkt, dritten, vierten, fünften, sechsten, siebten, achten, neunten usw. Zeitpunkt, analysiert werden.

Somit kann das Verfahren optional das Erzeugen des Aerosols, des Rauchs oder des Dampfs aus dem Ziel zu einem ersten Zeitpunkt, um die ersten spektrometrischen Daten zu erhalten;
das Erzeugen von Aerosol, Rauch oder Dampf aus dem Ziel zu einem darauffolgenden Zeitpunkt;
die Massenanalyse und/oder Ionenmobilitätsanalyse des Aerosols, des Rauchs oder des Dampfs, das bzw. der zum darauffolgenden Zeitpunkt erzeugt wurde, oder von davon abgeleiteten Ionen, um zweite spektrometrische Daten zu erhalten; und
das Vergleichen der ersten und darauffolgenden spektrometrischen Daten umfassen, um Änderungen des Ziels zu ermitteln. Der darauffolgende Zeitpunkt kann ein zweiter Zeitpunkt, dritter, vierter, fünfter, sechster, siebter, achter, neunter, zehnter usw. Zeitpunkt sein.

Optional kann die Zellpopulation zwischen dem ersten und einem darauffolgenden Zeitpunkt manipuliert und/oder einer Substanz ausgesetzt werden, die optional aus beliebigen der hierin aufgelisteten Mittel ausgewählt sein kann, wie z. B. einem Testmittel.

Optional können zwei oder mehr, z. B. zumindest 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 oder 10.000, identische und/oder nichtidentische Zellpopulationen gleichzeitig und/oder sequentiell analysiert werden. Wenn eine Gruppe von drei oder mehr Zellpopulationen analysiert wird, kann die Gruppe sodann optional z. B. zwei oder mehr Zellpopulationen, die miteinander identisch sind, sowie zwei oder mehr Zellpopulationen, die miteinander nicht identisch sind, umfassen.

Optional können ein oder mehrere weitere Testmittel und/oder Referenz- oder Kontrollmittel verwendet werden. Beispielsweise kann eine erste Zellpopulation einem ersten Testmittel ausgesetzt werden und kann eine zweite Zellpopulation einem weiteren Testmittel, einem Referenzmittel oder einem Kontrollmittel ausgesetzt werden.

Umgebungsbedingungen

Das Verfahren ermöglicht das Analysieren einer Zellpopulation unter einer definierten Umgebungsbedingung. Dies kann optional z. B. ermöglichen, dass eine Zellpopulation unter Bedingungen analysiert wird, die In-vivo-Bedingungen nachahmen, z. B. die Bedingungen eines Tumors oder einer Tumormikroumgebung. Solide Tumoren entwickeln für gewöhnlich feindliche Mikroumgebungen, die durch eine unregelmäßige Vaskularisation, schlechte Sauerstoffversorgung (O2) und/oder schlechte Nährstoffversorgung gekennzeichnet sind.

Unter „definierter Umgebungsbedingung“ versteht sich, dass zumindest ein Umgebungsfaktor kontrolliert wird. Beispielsweise kann eine geregelte Temperatur oder ein geregelter Temperaturbereich oder eine kontrollierte Höhe eines bestimmten Nährstoffs als definierte Umgebungsbedingung bezeichnet werden.

Optional kann das Verfahren das Analysieren der Wirkung einer oder mehrerer definierter Umgebungsbedingungen auf eine Zellpopulation umfassen. Optional kann die Analyse die Wirkung einer Änderung einer oder mehrerer Umgebungsbedingungen auf eine Zellpopulation betreffen.

Die Umgebungsbedingung kann optional eine Bedingung sein, die das Wachstum; die Differenzierung; die Migration; den Zellstatus; und/oder den Phänotyp und/oder Genotyp einer Zellpopulation beeinflussen kann. Somit kann die Umgebungsbedingung z. B. die Art und/oder Konzentration von Kulturmedienkomponenten, insbesondere Nährstoff- und/oder Mineralienkonzentrationen; die Art und das Ausmaß von Zell-Zell-Kontakten; Temperatur; pH-Wert; Flüssigkeitshaushalt; Druck; Durchflussvolumen; und/oder Sauerstoffdruck sein. Beispielsweise kann die Zellpopulation Hypoxie ausgesetzt werden.

Die Umgebungsbedingung kann optional durch Einbringen der Zellpopulation in einen Wirtsorganismus verändert werden. Somit kann die Zellpopulation optional in einen Wirtsorganismus eingebracht werden, der optional aus einem humanen oder nicht humanen Tier ausgewählt sein kann. Optional kann er Nutzvieh, ein Haus- oder Labortier, z. B. ein Nagetier, sein. Optional kann er murin, von Meerschweinchen, Hamster, Ratte, Ziege, Schwein, Katze, Hund, Schaf, Kaninchen, Kuh, Pferd, Alpaka, Frettchen, Geflügel, Büffel und/oder Affen sein. Somit kann optional die Zellpopulation der In-vivo-Umgebung eines Wirtsorganismus ausgesetzt werden, z. B. darin gehalten und/oder gezüchtet werden. Die Wirkung einer solchen Aussetzung kann optional mit dem hierin bereitgestellten Verfahren analysiert werden. Vor und/oder nach einer Analyse einer Zielzellpopulation können eine oder mehrere dieser Bedingungen optional entsprechend modifiziert werden. Eine solche Modifikation liegt im Wissen des Durchschnittsfachmanns.

Somit kann optional das Verfahren eines oder mehrere des Folgenden umfassen: Ändern oder Variieren der Konzentration eines Nährstoffs, der einer Zellpopulation zugeführt wird; Ändern oder Variieren der Konzentration eines Minerals, das einer Zellpopulation zugeführt wird; Ändern oder Variieren eines pH-Werts, bei dem die Zellpopulation gehalten wird; Ändern oder Variieren einer Temperatur, bei der die Zellpopulation gehalten wird; Ändern oder Variieren eines Sauerstoff-, Kohlendioxids- oder anderen Gasspiegels, dem die Zellpopulation ausgesetzt wird; Ändern oder Variieren der Konzentration einer Kontaminationskontrollsubstanz oder eines Antibiotikums, der bzw. dem die Zellpopulation ausgesetzt wird; Ändern oder Variieren der Konzentration eines Katalysators, Induktors oder Mittels, der bzw. das die Zellpopulation dazu veranlasst, ein therapeutisches oder anderes Produkt zu erzeugen; und/oder Ändern oder Variieren einer Lichtmenge, der die Zellpopulation ausgesetzt wird. Optional kann die Wirkung beliebiger dieser Änderungen analysiert werden.

Beispielsweise kann die Umgebungsbedingung ein Kulturmedium sein, das eine geringe Konzentration eines oder mehrerer Lipide und/oder eine allgemein geringe Lipidkonzentration, wie nachstehend erörtert, aufweist.

Analyse von Lipidanforderungen

Im Vergleich zu nichtkanzerösen Zellen zeigen Krebszellen signifikante Stoffwechseländerungen in Bezug auf mehrere wichtige Nährstoffe und Substrate, z. B. den Stoffwechsel von Glukose und Glutamin. Krebszellen zeigen auch einen erhöhten Bedarf an Fettsäuren, die sie aus Kohlenhydraten endogen synthetisieren können, wie z. B. Citrat, oder aus exogenen Quellen aufnehmen. Die Lipoproteinlipase (LPL) und/oder das Fettsäurekanalprotein CD36 können an der Aufnahme von Fettsäuren beteiligt sein, die Fettsäuresynthase (FASN) hingegen kann an der Fettsäuresynthese beteiligt sein. Die erhöhten Raten der Lipidsynthese treten durch eine erhöhte Expression diverser lipogener Enzyme auf. Eine erhöhte Lipidproduktion scheint für das Überleben von Krebszellen entscheidend zu sein und die Expression von lipogenen Schlüsselenzymen kann mit dem Fortschreiten von Krebs stark korrelieren. Fettsäuren können in Membranen als Phospholipide integriert, in Lipidtropfen gespeichert und/oder für die Herstellung von signalgebenden Lipiden verwendet werden.

Die De-novo-Synthese von Lipiden, die Lipogenese genannt werden kann, umfasst die Umwandlung von Acetyl-CoA in Fettsäuren, die danach zu Lipiden assembliert werden können. Acetyl-CoA kann von einer Vielzahl von Quellen, z. B. Kohlenhydraten, abgeleitet werden, z. B. über den glykolytischen Pathway.

Eine erhöhte Lipogenese ist ein Charakteristikum einer großen Vielzahl von Krebsen, somit sind Lipogenesepathways ein potenzielles Antikrebsziel. Um das therapeutische Potenzial von Lipidsynthesehemmern zu analysieren, ist es von entscheidender Wichtigkeit, die Beziehung zwischen einer De-novo-Lipidsynthese und exogenen Lipiden und deren jeweiliger Rolle bei der Krebszellproliferation und dem therapeutischen Ansprechen auf Lipogenesehemmer besser zu verstehen.

Somit brauchen Krebszellen Fettsäuren. Sie können Fettsäuren aus Kohlenhydraten synthetisieren und/oder Fettsäuren aus ihrer Umgebung aufnehmen, d. h. exogene Fettsäuren. Manche Typen von Krebszellen scheinen in ihrem Überleben von exogenen Fettsäuren abzuhängen, andere Krebstypen hingegen sind in der Lage, ohne exogene Fettsäuren zu überleben.

Optional kann das Verfahren daher verwendet werden, um zu analysieren, ob eine Zellpopulation exogene Lipide, z. B. Fettsäuren, erfordert, und/oder das Ausmaß zu analysieren, in dem eine Zellpopulation exogene Lipide, z. B. Fettsäuren, erfordert. Somit kann das Verfahren z. B. ermöglichen, zu ermitteln, ob eine bestimmte Zellpopulation exogene Fettsäuren braucht. Das Verfahren kann z. B. ermöglichen, zu ermitteln, dass eine bestimmte Zellpopulation zu einer hohen Lipogenesehöhe in der Lage ist. Eine solche Population kann als einen „lipogenen“ oder „hochlipogenen“ Phänotyp und/oder Genotyp aufweisend bezeichnet werden.

Somit kann das Verfahren optional das Kultivieren einer Zellpopulation in einem Kulturmedium umfassen, das eine geringe Konzentration eines oder mehrerer Lipide und/oder eine allgemein geringe Lipidkonzentration aufweist. Optional kann das Verfahren das Kultivieren einer Zellpopulation in einem Wirtsorganismus umfassen. Eine solche Umgebungsbedingung kann In-vivo-Bedingungen von Tumorzellen simulieren, insbesondere von Zellen in der Mitte eines Tumors. Die Wirkung einer solchen Umgebungsbedingung kann mithilfe des hierin bereitgestellten Verfahrens analysiert werden, und/oder die Wirkung einer Substanz auf eine Zellpopulation, die unter dieser Umgebungsbedingung kultiviert wurde, kann analysiert werden.

Wenn eine Zellpopulation über ihr Kulturmedium nicht mit ausreichenden Lipidmengen versorgt wird, kann eines oder mehrere des Folgenden eintreten: Das Wachstum der Zellpopulation kann sich verlangsamen und/oder stoppen; ein Anteil der Zellpopulation und/oder die gesamte Zellpopulation kann sterben; und/oder die Zellen können Lipide synthetisieren.

Krebszellen mit einem lipogenen Phänotyp und/oder Genotyp können sich in ihrer Zugänglichkeit für eine Substanz unterscheiden. Wie oben erwähnt, kann das hierin bereitgestellte Verfahren verwendet werden, um zu ermitteln, ob eine Zellpopulation einen lipogenen Phänotyp und/oder Genotyp aufweist, und/oder ob sie für eine Substanz zugänglich ist, wie z. B. ein Antikrebsmittel, z. B. einen Hemmer eines lipogenen Pathways.

Gemäß diversen Ausführungsformen kann eine REIMS-Analyse auf Krebsphänotypisierungsstudien ausgedehnt werden.

Isotopstudien

Optional kann das Verfahren in oder mit Isotopstudien verwendet werden.

Isotope sind Varianten eines bestimmten chemischen Elements, die sich zwar in der Neutronenzahl unterscheiden, jedoch die gleiche Anzahl von Protonen in jedem Atom aufweisen. Isotopstudien können z. B. die Verwendung von stabilen Isotopen, d. h. nichtradioaktiven Isotopen, umfassen. Beispielsweise können Isotope von Wasserstoff (H), Kohlenstoff (C), Stickstoff (N), Sauerstoff (O), Fluor (F) und/oder Schwefel (S) verwendet werden. Der Ausdruck „unterschiedliche Typen von Isotopen“ wird verwendet, um sich auf Isotope unterschiedlicher Elemente zu beziehen, somit ist ein Isotop von C ein anderer Isotoptyp als ein Isotop von N.

In der Natur ist ein Isotop jedes Elements für gewöhnlich am abundantesten und beliebige andere stabile Isotope des Elements, die vorhanden sein können, sind für gewöhnlich weitaus weniger abundant. Beispielsweise ist 1H weitaus abundanter als 2H, ist 12C weitaus abundanter als 13C, ist 14N weitaus abundanter als 15N, ist 16O weitaus abundanter als 17O oder 18O und ist 32S weitaus abundanter als 34S. Die weniger abundanten Isotope sind die schwereren, somit können sie als ein „schweres Isotop“ bezeichnet werden. In Isotopstudien können Zellen einem oder mehreren schweren Isotopen ausgesetzt werden und zelluläre Prozesse können durch Analysieren des Schicksals des einen oder der mehreren schweren Isotope analysiert werden.

Unterschiedliche nicht radioaktive stabile Isotope können durch Massenspektrometrie unterschieden werden, somit kann das hierin bereitgestellte Verfahren optional in oder mit Isotopstudien verwendet werden.

Somit kann die Zellpopulation optional einem oder mehreren schweren Isotopen ausgesetzt werden, z. B. einer oder mehreren Substanzen, die ein oder mehrere schwere Isotope umfassen oder daraus bestehen. Die Substanz kann optional aus beliebigen der hierin andernorts aufgelisteten Substanzen ausgewählt sein, z. B. beliebigen Nährstoffen, z. B. Glukose, Glutamin oder dergleichen. Eine Substanz, die ein oder mehrere schwere Isotope umfasst oder daraus besteht, kann als „Schwerisotopsubstanz“ bezeichnet werden. Eine Schwerisotopsubstanz kann optional ein einzelnes schweres Isotop, zwei oder mehr schwere Isotope umfassen oder aus schweren Isotopen bestehen. Eine Schwerisotopsubstanz kann optional einen einzelnen Typ von schwerem Isotop oder zwei oder mehr, z. B. zumindest 2, 3, 4, 5 oder 6 unterschiedliche Typen von schweren Isotopen umfassen.

Eine Substanz kann optional isotopisch definiert sein, d. h. es kann möglich sein, eine Substanz zu verwenden, bei der ein oder mehrere spezifische Atome durch ein oder mehrere schwere Isotope ersetzt sind, was eine Analyse des Schicksals spezifischer Teile einer Substanz ermöglicht. Optional kann eine Analyse mit einer Substanz, bei der ein erstes Atom durch ein schweres Isotop ersetzt ist, mit einer Analyse mit der entsprechenden Substanz, bei der ein anderes Atom durch ein schweres Isotop ersetzt ist, verglichen werden.

Beispielsweise kann eine Schwerisotopsubstanz wie z. B. ein Nährstoff, z. B. eine Kohlenstoffquelle, verwendet werden und kann das Verfahren optional verwendet werden, um zu analysieren, ob und/oder wie der Nährstoff von der Zellpopulation verwendet werden. Somit kann optional der Lipidstoffwechsel, z. B. Anabolismus und/oder Katabolismus, analysiert werden. Insbesondere kann das Verfahren optional verwendet werden, um die Abreicherung oder Anreicherung eines Typs eines schweren Isotops in einem oder mehreren Metaboliten wie z. B. einem oder mehreren Fettsäuretypen zu analysieren. Somit können z. B. das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein und/oder die relative Abundanz einer bzw. eines oder mehrerer Metaboliten, Fettsäuren, Lipide und/oder Biomarker vor und/oder nach Aussetzen einer Zellpopulation gegenüber einem schweren Isotop analysiert werden. Optional kann die Analyse zu zwei oder mehr Zeitpunkten durchgeführt werden, z. B. um eine Änderung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins und/oder der relativen Abundanz eines bzw. einer oder mehrerer Metaboliten, Fettsäuren, Lipide und/oder Biomarker über die Zeit hinweg zu überwachen.

Optional kann eine Zellpopulation zumindest zwei Typen von schweren Isotopen und/oder zumindest zwei Typen von Schwerisotopsubstanzen gleichzeitig und/oder sequentiell ausgesetzt werden. Optional kann eine Zellpopulation einem ersten Typ von schwerem Isotop zu einem ersten Zeitpunkt und einem zweiten Typ von schweren Isotop zu einem zweiten Zeitpunkt ausgesetzt werden. Optional kann eine Zellpopulation einem ersten Typ von Schwerisotopsubstanz zu einem ersten Zeitpunkt und einem zweiten Typ von Schwerisotopsubstanz zu einem zweiten Zeitpunkt ausgesetzt werden. Beispielsweise kann eine Zellpopulation einer Schwerisotopglukose zu einem ersten Zeitpunkt und einem Schwerisotopglutamin zu einem zweiten Zeitpunkt ausgesetzt werden.

Analyse von Radiotracern

Die Positronenemissionstomographie (PET) ist eine Radiotracer-Bildgebungstechnik, bei der Tracerverbindungen, die mit positronenemittierenden Radionukliden markiert sind, in das Subjekt der Studie injiziert werden. Diese Radiotracer-Verbindungen können danach verwendet werden, um biochemische und physiologische Prozesse in vivo zu verfolgen. Einer der Hauptgründe, warum die PET in der medizinischen Forschung und Praxis wichtig ist, ist das Vorhandensein von positronenemittierenden Isotopen von Elementen wie z. B. Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Fluor, die verarbeitet werden können, um einen Bandbreite von Radiotracer-Verbindungen zu erzeugen, die natürlich auftretenden Substanzen im Körper ähneln.

Optional kann der Radiotracer eine Verbindung sein, die mit 11C, 13N, 15O und/oder 18F markiert ist. Optional kann er aus den Verbindungen ausgewählt werden, die in der nachstehenden Tabelle aufgelistet sind.

Isotop Tracer-Verbindung Physiologischer Prozess oder Funktion Typische Anwendung 11C Methionin Proteinsynthese Onkologie 11C Flumazenil Benzodiazepinrezeptorantagonist Epilepsie 11C Racloprid D2-Rezeptoragonist Bewegungsstörungen 13N Ammoniak Blutperfusion Myokardperfusion 15O Kohlendioxid Blutperfusion Hirnaktivierungsstudien 15O Wasser Blutperfusion Hirnaktivierungsstudien 18F Fluor-desoxyglukose Glukosestoffwechsel Onkologie, Neurologie, Kardiologie 18F Fluoridion Knochenstoffwechsel Onkologie 18F Fluormizonidazol Hypoxie Onkologie – Ansprechen auf Strahlentherapie

Beispielsweise wenn das ausgewählte biologisch aktive Molekül Fluordesoxyglukose (FDG), ein Analogon von Glukose ist, indizieren somit die Tracer-Konzentrationen die Gewebestoffwechselaktivität, da diese der regionalen Glukoseaufnahme entspricht. Die Verwendung dieses Tracers zum Erforschen der Möglichkeit einer Krebsmetastasenbildung (d. h. Verbreitung an andere Stellen) ist bei der medizinischen Standardbetreuung der häufigste Typ des PET-Scans (90 % der derzeitigen Scans).

Optional kann eine Zellpopulation einem Radiotracer ausgesetzt werden und kann das Verfahren verwendet werden, um die Stelle und/oder die Konzentration eines Radiotracers zu analysieren. Somit kann das Verfahren optional verwendet werden, um den Stoffwechsel einer mit einem positronenemittierenden Radionuklid markierten Verbindung zu analysieren.

Isogene Zellpopulationen

Optional kann das Verfahren das Verwenden von zwei oder mehr Zellpopulationen umfassen, die isogen sind, mit Ausnahme von einer oder mehreren genetischen Regionen von Interesse. Der Ausdruck „isogen“ wird auf dem Gebiet verwendet, um zu indizieren, dass zwei Zellpopulationen genetisch identisch sind oder im Wesentlichen die gleiche genetische Information teilen, mit Ausnahme einer oder mehrerer genetischer Regionen von Interesse. Für gewöhnlich unterscheiden sich zwei isogene Zellpopulationen in einem einzelnen Gen, das optional mit einem Reportergen verknüpft sein kann, bei dem sich die isogenen Zellpopulationen ebenfalls unterscheiden können.

Optional können isogene Zellpopulation sich in Bezug auf ein endogenes Gen unterscheiden, z. B. kann eine Zellpopulation ein endogenes Wildtypgen aufweisen und kann eine andere Zellpopulation eine mutierte Version des Gens aufweisen. Optional kann die mutierte Version eine veränderte Funktionalität aufweisen oder ein Knockout sein.

Optional können sich isogene Zellpopulationen in Bezug auf ein exogenes Gen unterscheiden, z. B. kann eine Zellpopulation eine erste Version eines exogenen Gens umfassen und kann eine andere Zellpopulation eine zweite Version des exogenen Gens umfassen; oder kann eine Zellpopulation ein erstes exogenes Gen umfassen und kann eine andere Zellpopulation ein zweites exogenes Gen aufweisen.

Das Verfahren kann somit optional verwendet werden, um Unterschiede zwischen zwei oder mehr isogenen Zellpopulationen zu analysieren. Die Verwendung von isogenen Zellpopulationen kann beispielsweise nützlich sein, um die Wirkung einer Modifikation oder Änderung zu analysieren, z. B. um die Wirkung einer Substanz auf eine Zellpopulation zu analysieren; die Wirkung einer Umgebungsänderung auf eine Zellpopulation zu analysieren; und/oder die Herstellung einer Substanz durch eine Zellpopulation zu analysieren.

Isogene Zellpopulationen können z. B. durch Transfizieren einer ersten Zellpopulation mit einem ersten Vektor, der für ein erstes Transgen codiert, und einem ersten Marker und Transfizieren einer zweiten Zellpopulation mit einem zweiten Vektor, der für ein zweites Transgen codiert, und einem zweiten Marker, wobei sich der zweite Marker vom ersten unterscheidet.

Optional kann der Marker z. B. ein fluoreszierender Marker sein, wobei diesbezügliche Details hierin andernorts zu finden sind.

Das Kultivieren und Analysieren beider Zellpopulationen über das hierin bereitgestellte Verfahren ermöglicht z. B. das Screenen auf Verbindungen mit selektiver Aktivität, z. B. Toxizität, in Bezug auf ein Gen von Interesse. Ein solches Arzneimittelscreening ist für die Entwicklung von therapeutischen Mitteln, die auf spezifische genetische Änderungen abgezielt sind, die für eine Krankheitsentwicklung verantwortlich sind, breit anwendbar.

Substanzen wie z. B. Testmittel und/oder zytotoxische Antikrebsarzneimittel

Wie hierin andernorts erwähnt, kann das Verfahren optional verwendet werden, um die Wirkung einer Substanz auf eine Zellpopulation zu analysieren; und/oder die Herstellung einer Substanz zu analysieren.

Somit kann das Verfahren optional das direkte oder indirekte Analysieren einer oder mehrerer Substanzen umfassen. Falls nicht anderweitig angegeben, werden die Ausdrücke „Substanz“, „Verbindung“, „Molekül“ und „Biomolekül“ hierin miteinander austauschbar verwendet.

Wie hierin andernorts erwähnt, kann das Verfahren optional auch einen Schritt des Verabreichens einer Behandlung an ein Subjekt umfassen, bei dem die Zielzellpopulation ein Modell ist. Ein solcher Behandlungsschritt kann z. B. das Verabreichen eines therapeutischen Mittels, das optional beliebige der hierin erwähnten Substanzen umfassen oder aus diesen bestehen kann, umfassen.

Die Verbindung kann optional intrazellulär und/oder extrazellulär sein. Sie kann optional endogen sein, d. h. von der Zellpopulation hergestellt, und/oder exogen sein, d. h. zur Zellpopulation hinzugefügt.

Die Verbindung kann optional beliebige der hierin erwähnten Verbindungen oder Klassen von Verbindungen, z. B. beliebige der hierin erwähnten Biomarkerverbindungen, umfassen oder aus diesen bestehen. Optional kann sie z. B. ein Lipid wie z. B. ein Glykolipid oder Phospholipid; ein Kohlenhydrat; DNA; RNA; Protein, z. B. einen Antikörper, ein Enzym oder Hormon; Polypeptid wie z. B. ein ribosomales Peptid oder ein nichtribosomales Peptid; Oligopeptid; Lipoprotein; Lipopeptid; Aminosäure; und/oder chemisches Molekül, optional ein organisches chemisches Molekül, umfassen oder daraus bestehen.

Die Verbindung kann optional linear, cyclisch oder verzweigt sein.

Die Verbindung kann optional ein Metabolit wie z. B. ein primärer oder ein sekundärer Metabolit; ein Antibiotikum; ein Quorum-Sensing-Molekül; ein Fettsäuresynthaseprodukt; ein Pheromon; ein Protein; ein Peptid; und/oder ein Biopolymer sein. Sie kann optional ein Antikörper oder Hormon sein.

Die Verbindung kann optional durch eine oder mehrere der folgenden funktionellen Gruppen gekennzeichnet sein: Alkohol, Ester, Alkan, Alken, Alkyn, Ether, Keton, Aldehyd, Anhydrid, Amin, Amid, Nitril, aromatisch, Carbonsäure, Alkylhalid und/oder Carbonyl. Optional kann sie zusätzlich als primär, sekundär oder tertiär identifiziert werden, z. B. als primärer Alkohol, sekundäres Amin oder dergleichen.

Die Substanz kann optional ein Testmittel oder ein Arzneimittel sein.

Die Substanz kann optional ein bekanntes Arzneimittel, z. B. ein Antikrebsarzneimittel, z. B. ein zytostatisches und/oder zytotoxisches Mittel, sein, das optional aus beliebigen der nachstehend aufgelisteten Substanzen ausgewählt sein kann.

Die Substanz kann optional ein Aromatasehemmer; ein antiangiogenes Mittel; ein tubulinbindendes Mittel; ein Hemmer lipogener Pathways; und/oder ein zytostatisches Mittel sein; optional ausgewählt aus einem Alkylierungsmittel, einem Vernetzungsmittel, einem Interkalationsmittel, einem Nukleotidanalogon, einem Hemmer der Spindelbildung und/oder einem Hemmer von Topoisomerase I und/oder II, sein.

Sie kann z. B. ein Antikörper sein, der für einen Rezeptor spezifisch ist, der von Krebszellen exprimiert wird, der optional an ein chemotherapeutisches Arzneimittel oder einen radioaktiven Partikel konjugiert sein kann.

Der Antikörper kann optional z. B. aus einem HER-2/neu-spezifischen monoklonalen Antikörper wie z. B. Trastuzumab (Herceptin); Adecatumumab, Alemtuzumab, Blinatumomab, Bevacizumab, Catumaxomab, Cixutumumab, Gemtuzumab, Rituximab, Trastuzumab und/oder Ibritumomab ausgewählt sein.

Die Substanz kann optional z. B. ein Anthracyclin, ein Epipodophyllotoxin, ein Dactinomycin, ein Campthothecin, ein Taxan, ein Vincaalkaloid, Soraphen A und/oder Simvastatin sein.

Zytotoxische Antikrebsarzneimittel (manchmal als Antineoplastika bekannt) beschreiben eine Gruppe von Medikamenten, die Chemikalien enthalten, die für Zellen toxisch sind. Die zytotoxischen Arzneimittel verhindern das Replizieren und Wachsen von Zellen und sind somit bei der Behandlung von Krebs nützlich. Die meisten der üblicherweise verwendeten zytotoxischen Antikrebsarzneimittel wurden durch ein willkürliches Hochdurchsatzscreening von synthetischen Verbindungen und natürlichen Produktion in zellbasierten Zytotoxizitätsassays entdeckt. Die meisten der Verbindungen sind DNA-schädigende Mittel mit niedrigem therapeutischen Index.

Bei einem anfänglichen Hochdurchsatzscreen des National Cancer Institute (NCI) wurde die hochchemoempfindliche P388-Leukämiezelllinie verwendet. Dieser Screen konnte jedoch keine Arzneimittel identifizieren, die gegen übliche adulte solide Tumoren aktiv waren. Folglich implementierte das NCI einen neuen In-vitro-Screen, der aus 60 humanen Tumorzelllinien besteht, die neun übliche Krebsformen darstellen.

Die folgende Tabelle zeigt häufig verwendete Naturprodukt-Antikrebsarzneimittel und deren entsprechenden Wirkmechanismus:

Arzneimittelklasse Wirkmechanismus Anthracycline Topoisomerase-II-Hemmer Epipodophyllotoxine Topoisomerase-II-Hemmer Dactinomycin Topoisomerase-II-Hemmer Campthothecine Topoisomerase-I-Hemmer Taxane Tubulinbindende Mittel Vincaalkaloide Tubulinbindende Mittel

Die Substanz kann optional aus z. B. Anastrozol; Azathioprin; Bcg; Bicalutamid; Chloramphenicol; Ciclosporin; Cidofovir; kohlenteerhaltigen Produkten; Colchicin; Danazol; Diethylstilbestrol; Dinoproston; dithranolhaltigen Produkten; Dutasterid; Östradiol; Exemestan; Finasterid; Flutamid; Ganciclovir; Gonadotrophin, chorionisch; Goserelin; interferonhaltigen Produkten (einschließlich Peginterferon); Leflunomid; Letrozol; Leuprorelinacetat; Medroxyprogesteron; Megestrol; Menotropinen; Mifepriston; Mycophenolatmofetil; Nafarelin; östrogenhaltigen Produkten; Oxytocin (einschließlich Syntocinon und Syntometrin); Podophyllyn; progesteronhaltigen Produkten; Raloxifen; Ribavarin; Sirolimus; Streptozocin; Tacrolimus; Tamoxifen; Testosteron; Thalidomid; Toremifen; Trifluridin; Triptorelin; Valganciclovir; und/oder Zidovudin ausgewählt sein. Diese Substanzen können optional als zugelassene nichtchemotherapeutische zytotoxische/zytostatische Arzneimittel bezeichnet werden.

Alternativ oder zusätzlich kann die Substanz optional aus z. B. Aldesleukin; Alemtuzumab; Amsacrin; Arsetrioxid; Asparaginase; Bleomycin; Bortezomib; Busulphan; Capecitabin; Carboplatin; Carmustin; Cetuximab; Chlorambucil; Cisplatin; Cladribin; Cyclophosphamid; Cytarabin; Dacarbazin; Dactinomycin; Daunorubicin; Dasatinib; Docetaxel; Doxorubicin; Epirubicin; Estramustin; Etoposide; Fludarabin; Fluoruracil; Gemcitabin; Gemtuzumab; Hydroxycarbamid; Idarubicin; Ifosfamid; Imatinibmesylat; Irinotecan; Lomustin; Melphalan; Mercaptopurin; Methotrexat; Mitomycin; Mitotan; Mitoxantron; Oxaliplatin; Paclitaxel; Pentamidin; Pentostatin; Procarbazin; Raltitrexed; Rituximab; Temozolomid; Thiotepa; Topotecan; Trastuzumab; Vidaradin; Vinblastin; und/oder Vincristin ausgewählt sein. Diese Substanzen können optional als zugelassene nichtchemotherapeutische zytotoxische/zytostatische Arzneimittel bezeichnet werden.

Die Substanz kann optional z. B. aus Mescalin, PCP (Phencyclidin), Psilocybin, LSD, Heroin, Morphin, Kodein, Dextroamphetamin, Bupropion, Cathinon, Lisdexamfetamin, Allobarbital, Alphenal (5-Allyl-5-phenylbarbitursäure), Amobarbital, Aprobarbital, Brallobarbital, Butobarbital, Butalbital, Cyclobarbital, Methylphenobarbital, Mephobarbital, Methohexital, Pentobarbital, Phenobarbital, Secobarbital, Talbutal, Thiamylal und/oder Thiopental ausgewählt sein. Ranitidin, Phenylalanin-PKU, Dimethylamylamin, Kokain, Diazepam, Androstadiendion, Stigmastadienon, Androsteronhemisuccinat, 5α-Androstan-3β, 17β-diol-16-on, Androsteronglucuronid, Epitestosteron, 6-Dehydrocholestenon, Phenylalanin, Leucin, Valin, Tyrosin, Methionin, Sitamaquin, Terfenadin, Prazosin, Methadon, Amitripylin, Nortriptylin, Pethidin, DOPA, Ephedrin, Ibuprofen, Propranolol, Atenolol, Acetaminophen, Bezethonium, Citalopram, Dextrorphan, Paclitaxel, Proguanil, Simvastatin, Sunitinib, Telmisartan, Verapamil, Amitriptylin, Pazopanib, Tamoxifen, Imatinib, Cyclophosphamid, Irinotecan, Docetaxel, Topotecan, Acylcarnitinen (C2-C18), Nikotin, Cotinin, trans-3’-Hydroxycotinin, Anabasin, Amphetamin, amphetaminähnlichen Stimulanzien, Methamphetamin, MDA, MDMA, MDEA, Mmorphin, ∆9-THC, Tacrolimus, Benzethonium, Meprobamat, O-Desmethyl-cis-tramadol, Carisoprodol, Tramadol, Nordiazepam, EDDP, Norhydrocodon, Hydromorphon, Kodein, Temazepam, Noroxycodon, Alprazolam, Oxycodon, Buprenorphin, Norbuprenorphin, Fentanyl, Propoxyphen, 6-Monoacetylmorphin, Koffein, Carbadox, Carbamazepin, Digoxigenin, Diltiazem, Diphenhydramin, Propanolol, Sulfadiazin, Sulfamethazin, Sulfathiazol, Thiabendazol, Ketamin, Norketamin, BZE, AMP, MAMP und/oder 6-MAM.

Optional können eine oder mehrere Zellpopulationen mit einem bekannten zugelassenen nichtchemotherapeutischen zytotoxischen/zytostatischen Arzneimittel getestet werden. Optional können eine oder mehrere Zellpopulationen unter Verwendung potenziell neuer therapeutischer Mittel und/oder zytotoxischer/zytostatischer Arzneimittel getestet werden.

Optional können eine oder mehrere Zellpopulationen genetisch modifiziert werden und die modifizierten Zellpopulationen können mit einem bekannten zytotoxischen/zytostatischen Arzneimittel oder gegen ein Feld potenziell neuer therapeutischer Mittel oder zytotoxischer/zytostatischer Arzneimittel getestet werden.

Optional können eine oder mehrere Zellpopulationen mit einem bekannten zugelassenen chemotherapeutischen zytotoxischen/zytostatischen Krebsarzneimittel getestet werden. Optional können eine oder mehrere Zellpopulationen unter Verwendung potenziell neuer therapeutischer Mittel und/oder zytotoxischer/zytostatischer Arzneimittel getestet werden.

Optional können eine oder mehrere Zellpopulationen genetisch modifiziert werden und die modifizierte Zellpopulationen kann mit einem bekannten zugelassenen chemotherapeutischen zytotoxischen/zytostatischen Krebsarzneimittel oder gegen ein Feld potenziell neuer therapeutischer Mittel oder zytotoxischer/zytostatischer Arzneimittel getestet werden.

Die Substanz kann z. B. ein antimikrobielles Mittel sein. Der Ausdruck „antimikrobielles Mittel“ umfasst beliebige Mittel, gegen einen beliebigen Mikrobentyp aktiv sind. Somit kann das antimikrobielle Mittel optional aus einem antibakteriellen Mittel, einem antiviralen Mittel, einem Antipilzmittel und einem Antiprotozoenmittel ausgewählt sein. Mehr im Detail kann es optional aus Aminoglykosoliden, Beta-Lactam-Antibiotika, Chloramphenicol, Fluorchinolonen, Glykopeptiden, Lincosamiden, Makroliden, Polymixinen, Rifampinen, Streptograminen, Sulfonamiden, Tetracyclinen und/oder Diaminopyrimidinen ausgewählt sein.

Das Aminoglykosid kann optional aus Gentamicin, Tobramycin, Amikacin, Streptomycin, Kanamycin ausgewählt sein. Das Beta-Lactam-Antibiotikum kann optional aus einem Penicillin wie z. B. Methicillin, Penicillin, Amoxicillin, Ampicillin, Carbenicillin, Oxacillin oder Nafcillin; einem Cephalosporin wie z. B. Cephalothin, Cefamandol, Cefotaxim, Ceftazidim, Cefoperazon oder Ceftriaxon; einem Carbapenem wie z. B. Imipenem, Meropenem, Ertapenem oder Doripenem; oder einem Monobactam wie z. B. Aztreonam ausgewählt sein. Das Fluorchinolon kann opitonal aus Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Danofloxacin, Difloxacin, Ibafloxacin, Marbofloxacin, Pradofloxacin und Orbifloxacin ausgewählt sein. Das Glykopeptid kann optional aus Vancomycin, Teicoplanin und Avoparcin ausgewählt sein. Das Lincosamid kann optional aus Lincomycin, Clindamycin und Pirlimycin ausgewählt sein. Das Makrolid kann optional aus Erythromycin, Tylosin, Spiramycin, Tilmicosin und Tulathromycin ausgewählt sein. Das Polymixin kann optional aus Polymixin B und Colistin (Polymixin E) ausgewählt sein. Das Rifampin kann optional aus Rifampin, Rifabutin und Rifapentin ausgewählt sein. Das Streptogramin kann optional aus Virginiamycin ausgewählt sein. Das Sulfonamid kann optional aus Sulfadiazin, Sulfamethoxazol und Sulfadoxin ausgewählt sein. Das Tetracyclin kann optional aus Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Demethylchlortetracyclin, Rolitetracyclin, Limecyclin, Clomocyclin, Methacyclin, Doxycyclin und Minocyclin ausgewählt sein. Das Diaminopyrimidin kann optional aus Trimethoprim, Aditoprim, Baquiloprim und/oder Ormetoprim ausgewählt sein.

Die Substanz kann z. B. ein antivirales Mittel sein.

Die Substanz kann z. B. ein entzündungshemmendes Arzneimittel sein, optional ausgewählt aus z. B. Steroiden, Diclofenac, Ibuprofen, Naproxen, Celecoxib, Mefenaminsäure, Etoricoxib, Indomethacin und/oder Aspirin.

Zielbasierte Arzneimittelentdeckung

Das Identifizieren von gültigen molekularen Zielen hat zur zielbasierten Arzneimittelentdeckung auf Proteinebene geführt, wie durch die Entwicklung von Imatinib (INN) veranschaulicht. Imatinib ist ein Tyrosinkinasehemmer, der bei der Behandlung mehrerer Krebse verwendet wird, darunter Philadelphia-Chromosom positive (Ph+) chronische myeloische Leukämie (CML).

Gleevec ist die betakristalline Form von Imatinibmesilat, dem Mesylatsalz von Imatinib.

Um zu überleben, müssen Zellen durch Proteine signalisieren (Signalkaskade), um sich am Leben zu halten. Manche der Proteine in dieser Kaskade verwenden eine Phosphatgruppe als „Ein“-Schalter. Diese Phosphatgruppe wird durch ein Tyrosinkinaseenzym addiert. Bei gesunden Zellen werden diese Tyrosinkinaseenzyme nach Bedarf ein- und ausgeschaltet. Bei Ph-positiven CML-Zellen steckt ein Tyrosinkinaseenzym, BCR-Abl, in der „Ein“-Position fest und addiert weiterhin Phosphatgruppen. Imatinib blockiert dieses BCR-Abl-Enzym und stoppt, dass es Phosphatgruppen addiert. Folglich stoppen diese Zellen ihr Wachstum und die Zellen sterben durch einen Prozess des Zelltods (Apoptose). Da das BCR-Abl-Tyrosinkinaseenzym nur in Krebszellen und nicht in gesunden Zellen vorhanden ist, arbeitet Imatinib als eine Form von gezielter Therapie – nur Krebszellen werden durch die Wirkung des Arzneimittels getötet. In dieser Hinsicht war Imatinib eine der ersten Krebstherapien, die das Potenzial für eine solche gezielte Wirkung zeigten, und wird oft als Paradigma für die Forschung von therapeutischen Krebsmitteln herangezogen.

Imatinib wurde durch Screenen von Verbindungsbibliotheken auf Hemmer der Proteinkinaseaktivität in vitro entdeckt. Viele der Proteine, die an der Zellzyklusregulierung, Signaltransduktion und Apoptoseregulierung beteiligt sind, sind Enzyme oder Rezeptoren. Folglich sind sie potenziell für eine Hemmung durch kleine Moleküle zugänglich.

Nährstoffe

Zellpopulationen benötigen Nährstoffe, um zu überleben und/oder zu wachsen. Ein oder mehrere geeignete Nährstoffe können daher verwendet werden, um eine Zellpopulation zu kultivieren. Optional kann eine Mischung unterschiedlicher Nährstoffe verwendet werden, z. B. eine Mischung, die einen oder mehrere der nachstehend aufgelisteten Nährstoffe umfasst. Wie hierin andernorts erörtert, können der Typ und/oder Spiegel beliebiger Nährstoffe verändert werden, z. B. wenn die Wirkung von Umgebungsbedingungen analysiert wird.

Ein Nährstoff kann optional ein Schwerisotopnährstoff sein.

Geeignete Nährstoffe sind hinlänglich bekannt, ein Nährstoff kann optional jedoch z. B. ein Kohlenhydrat umfassen, das optional aus Monosacchariden, Disacchariden, Oligosacchariden und/oder Polysacchariden ausgewählt ist, oder daraus bestehen. Er kann optional aus Saccharose, Glukose, Fruktose, Maltose, Stärke, Laktose, Galaktose, Laktulose und/oder Trehalose ausgewählt sein.

Ein Nährstoff kann optional z. B. eine Aminosäure, ein Peptid, ein Polypeptid oder Protein, optional ausgewählt aus einer essentiellen Aminosäure, einer nichtessentiellen Aminosäure und/oder einem Peptid, und/oder ein Peptid, Polypeptid oder Protein, das eine oder mehrere essentielle und/oder nichtessentielle Aminosäuren umfasst, umfassen oder daraus bestehen. Essentielle Aminosäuren können aus Phenylalanin, Valin, Threonin, Tryptophan, Methionin, Leucin, Isoleucin, Lysin und/oder Histidin ausgewählt sein. Optional kann ein Nährstoff Glutamin sein.

Ein Nährstoff kann optional ein Vitamin, z. B. Vitamin A, B, C, D oder E, umfassen oder daraus bestehen.

Ein Nährstoff kann optional ein Lipid, z. B. eine Fettsäure, Lecithin und/oder ein Sterol, umfassen oder daraus bestehen.

Kulturmedien

Die Zellpopulation kann in einem Zellkulturmedium gehalten werden. Das Zellkulturmedium kann optional eine komplexe Komponente wie z. B. Blut oder ein Derivat davon, z. B. Serum, umfassen oder ein als serumfrei definiertes Medium sein. Außer wenn es erwünscht ist, einen Umgebungsfaktor in Zusammenhang mit dem Zellkulturmedium zu testen, kann das Zellkulturmedium optional steril sein, isotonisch sein, einen physiologischen pH-Wert aufweisen und/oder alle Mineralien und Nährstoffe umfassen, die die Zellpopulation benötigt.

Eine oder mehrere der folgenden Kulturmedienkomponenten können optional optimiert oder verändert werden: (i) Nährstoffe, die optimiert werden können, so dass sie alle essentiellen Nährstoffe in ausreichenden Mengen umfassen, oder die verändert werden können, z. B. auf nicht ausreichende Mengen eines oder mehrerer Nährstoffe; Mineralien, die optimiert werden können, so dass sie alle essentiellen Mineralien in ausreichenden Mengen umfassen, oder die verändert werden können, z. B. auf nicht ausreichende Mengen eines oder mehrere Mineralien;

  • (ii) pH-Wert, der optimiert werden kann, so dass er physiologisch ist, z. B. zwischen 6,5 und 7,5, z. B. ungefähr 6,8, 7, 7,2 oder 7,4, oder der verändert werden kann, z. B. auf über oder unter physiologisch, z. B. unter 6,5 oder ungefähr 7,5;
  • (iii) Temperatur, die optimiert werden kann, so dass sie eine physiologische Temperatur von ungefähr 37 °C ist, oder verändert werden kann, um über physiologisch zu liegen, z. B. auf zumindest 37,5, 38, 38,5, 39, 39,5, 40, 40,5, 41, 41,5, 42, 42,5, 43, 44 oder 45 und/oder bis zu 70, 60, 55, 50, 45, 40° C, oder unter physiologisch zu liegen, z. B. ungefähr 36, 35, 34, 33, 32, 31 oder 30 °C;
  • (iv) Spiegel von Gasen, z. B. Sauerstoff und/oder CO2, denen die Zellpopulation ausgesetzt wird, die optimiert werden können, so dass sie auf physiologischen Spiegeln liegen, oder verändert werden können, um über physiologisch oder unter physiologisch zu liegen, z. B. hypoxische Bedingungen wie z. B. < 2 % Sauerstoff. Beispielsweise können Sauerstoffspiegel auf ungefähr 20 % oder ungefähr 2–8 % eingestellt werden und/oder können CO2-Spiegel auf ungefähr 5 % eingestellt werden.

Optional kann die Zellpopulation auf oder mit Feederzellen kultiviert werden, z. B. auf einer Schicht von Feederzellen, oder kann die Zellpopulation ohne Feederzellen kultiviert werden.

Optional kann die Zellpopulation in Gegenwart eines oder mehrerer Hormone, Zytokine, Chemkine und dergleichen kultiviert werden.

Oxidativer Stress

Das Verfahren kann optional verwendet werden, um oxidativen Stress zu analysieren. Beispielsweise kann die Zellpopulation einer Substanz und/oder Umgebungsbedingung ausgesetzt werden, die oxidativen Stress verursacht oder induziert. Optional kann ein Biomarker von oxidativem Stress analysiert werden. Der Biomarker kann z. B. aus beliebigen der nachstehend erwähnten Substanzen ausgewählt sein.

Oxidativer Stress, der als Ungleichgewicht zwischen der Herstellung und der Entfernung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) definiert werden kann, ist an vielen Typen von Nervenzelltod im zentralen Nervensystem (CNS) und auch im Auge beteiligt.

Das Vorhandensein von hohen Konzentrationen von ROS kann die natürlichen Abwehrmechanismen eine Zelle überwältigen und Pathways aktivieren, die zu programmiertem Zelltod führen. Auch wenn die präzisen Mechanismen, die zu den ROS-Erhöhungen führen, von Zustand zu Zustand variieren können, scheinen die Zelltodpathways diverse Merkmale gemein zu haben. Zu diesen Merkmalen zählt, dass der Tod durch eine Reihe von Schritten fortschreitet, und dass die Hemmung beliebiger dieser Schritte Nervenzellen häufig vor dem Tod retten kann. Gewisse Mittel können den Zelltodprozess unter Umständen, die oxidativen Stress umfassen, abschwächen.

Bei einem Modell zum Induzieren von oxidativem Stress in Nervenzellen wird die Aminosäure Glutamat verwendet. Glutamat ist der primäre anregende Neurotransmitter im CNS und im Auge, er ist jedoch nach akuten neurologischen Insulten am Nervenzelltod und an mehreren unterschiedlichen Augenkrankheiten wie Glaukom, diabetischer Retinopathie und diversen Formen von Netzhautischämie beteiligt.

Auch wenn Glutamat in synaptischen Nervenendigungen in millimolaren Konzentrationen vorhanden ist, sind die extrazellulären Konzentration für gewöhnlich nur während der kurzen Zeiträume der synaptischen Übertragung hoch. Gewisse Verletzungsformen können jedoch zu verlängerten Zeiträumen mit erhöhten Spiegeln von extrazellulärem Glutamat führen. Es wurde gezeigt, dass hohe Spiegel von extrazellulärem Glutamat durch zwei eigenständige Prozesse in Kultur für Nervenzellen toxisch sind: Exzitotoxizität, die durch Aktivierung von ionotropen Glutamatrezeptoren auftritt, und einen Pathway programmierten Zelltods, oxidative Glutamattoxizität oder Oxydase genannt, der durch eine Reihe von Störungen des intrazellulären Redoxsystems vermittelt wird.

Erhöhungen der endogenen ROS-Spiegel sind bei beiden dieser Prozesse in der Zelltodkaskade Schlüsselelemente.

Bei der Glutamatexzitotoxizität führt die Aktivierung von ionotropen Glutamatrezeptoren zu einem übermäßigen Einstrom von Ca+2, das die Zelltodkaskade aktiviert, die das Ansammeln von mitochondrial erzeugter ROS umfasst.

Bei der oxidativen Glutamattoxizität hemmt Glutamat die Aufnahme von Cystin, das für die Biosynthese von Glutathion (GSH) wesentlich ist, was zur Abreicherung von GSH aus den Zellen führt. GSH ist das abundanteste intrazelluläre Thiol und das primäre intrazelluläre Antioxidationsmittel. Der glutamatinduzierte Verlust von GSH aus Zellen führt zu einer biphasischen Erhöhung mitochondrial abgeleiteter ROS, die schließlich Spiegel erreichen können, die um ein Vielfaches höher als jene von unbehandelten Zellen sind. Diese hohen ROS-Spiegel führen zu einem Ca+2-Einstrom, der durch einen kobaltempfindlichen, cGMP-gegateten Ca+2-Kanal vermittelt wird, und danach zum Zelltod.

Die zentrale Rolle von ROS in der Zelltodkaskade bei der oxidativen Glutamattoxizität wird durch den Schutz demonstriert, den exogene Antioxidantien wie z. B. Vitamin E und Propylgallat bereitstellen. Die Wichtigkeit der mitochondrialen ROS-Herstellung wird durch die Beobachtung, dass das mitochondriale Entkupplungsmittel Cyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) und andere mitochondriale Hemmer den Zelltod in diesem Modell durch Hemmen der ROS-Herstellung blockieren, weiter demonstriert.

Substanzherstellung und/oder -verwendung durch Zellpopulationen

Zellpopulationen können für die Herstellung von Substanzen wie z. B. Biopharmazeutika, z. B. Antikörpern, Hormonen und/oder Zytokinen, verwendet werden. Zellpopulationen können eine erste Substanz als Substrat zum Herstellen einer zweiten Substanz verwenden. Zellpopulationen können verwendet werden, um Substanzen aufzuschlüsseln, optional in nützliche und/oder weniger schädliche Substanzen. Sie können z. B. verwendet werden, um industrielle Abfallprodukte, Schadstoffe, Herbizide, Pestizide, Sprengmittel und dergleichen aufzuschlüsseln. Das Verfahren kann daher optional verwendet werden, um die Fähigkeit einer Zellpopulation, eine Substanz zu verwenden und/oder herzustellen, zu analysieren; und/oder um die Verwendung und/oder Herstellung einer Substanz durch eine Zellpopulation zu analysieren.

Optional kann das Verfahren das Reinigen einer Substanz umfassen, somit kann es einen Schritt des Reinigens einer Substanz umfassen. Ein Schritt des Reinigens der Substanz kann z. B. eines oder mehrere von Lyse von Zellen; Zentrifugation, z. B. um eine isopyknische Bandenbildung und/oder Nicht-Gleichgewicht-Absetzung zu erzielen; Filtration; Membrantrennung, die z. B. Mikrofiltration, Ultrafiltration und/oder Dialyse sein kann; Extraktion, die z. B. Fluidextraktion und/oder Flüssigkeit/Flüssigkeit-Extraktion sein kann; Ausfällung, die z. B. fraktionierte Ausfällung sein kann; Chromatographie, die z. B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydrophobe-Interaktion-Chromatographie, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und/oder Adsorptionschromatographie sein kann, umfassen. Optional kann er das Ausfällen einer freien Säureform der Substanz und optional das Umwandeln einer freien Säureform der Substanz in ein Salz der Verbindung umfassen.

Identifikation von Verwendungs-/Herstellungszellpopulationen

Optional kann das Verfahren als Screeningverfahren verwendet werden, z. B. um eine geeignete Verwendungs-/Herstellungszellpopulation zu identifizieren und/oder zwischen Zellpopulationen mit unterschiedlichen Verwendungs-/Herstellungseigenschaften zu unterscheiden.

Zellen können optional manipuliert werden, z. B. genetisch manipuliert werden, um eine Zellpopulation mit einer oder mehrere gewünschten Eigenschaften zu erzeugen. Optional kann das Verfahren eine Analyse zum Identifizieren/Auswählen einer Zellpopulation umfassen, die erfolgreich manipuliert wurde, z. B. um eine Zellpopulation mit dem gewünschten Genotyp und/oder Phänotyp zu identifizieren.

Herkömmliche Verfahren zum Ableiten einer geeigneten Verwendungs-/Herstellungszellpopulation, z. B. einer stark herstellenden Zelllinie aus einer Ausgangslinie, kann relativ zeitaufwendig und mühsam sein und kann im industriellen Bereich z. B. mehr als sechs Monate in Anspruch nehmen. Der erste Schritt kann genetische Manipulation sein, die in der nachstehenden Diskussion durch das Insertieren eines Transgens beispielhaft veranschaulicht ist. Nachdem das Transgen in den Kern eingetreten ist, kann die Integrationsstelle des Gens willkürlich sein und kann die Expression des Transgens teilweise durch die umgebende chromosomale Struktur vorgegeben werden. Eine hohe Expression des Transgens kann sehr wünschenswert sein. Optional kann das hierin bereitgestellte Verfahren verwendet werden, um den Prozess des Identifizierens/Auswählens einer geeigneten Herstellungszellpopulation zu beschleunigen.

Eine große Anzahl, z. B. ein Pool von zumindest ungefähr 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5000, 1000 oder 500 Zellpopulationen kann gescreent werden, um eine kleine Anzahl, z. B. ungefähr oder nicht mehr als 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100 oder 200 Kandidatenzellpopulationen auszuwählen.

Optional können eine oder mehrere Strategien verwendet werden, um das Erzeugen und/oder Auswählen von Zellen zu verbessern, bei denen ein Transgen in einer transkriptionell aktiven Stelle integriert ist. Beispielsweise kann das Transgenkonstrukt optional umfassen: ein mutiertes DHFR-Gen mit verringerter enzymatischer Aktivität oder ein DHFR-Gen, das von einem schwachen Promotor gesteuert wird; Chromatinöffnungselemente wie Gerüst- oder Matrixanbindungsregionen (SARs/MARs) und/oder ubiquitäre Chromatinöffnungselemente (UCOS), um die Zugänglichkeit von DNA für eine Transkription an der Integrationsstelle zu fördern; und/oder ein oder mehrere Antibiotikaresistenzgene.

Wenn das DHFR-System verwendet wird, können Zellen, die das Transgenprodukt und somit das DHFR-Enzym stabil exprimieren, nach Mutagenese optional unter Kultivierung in Abwesenheit von Glycin, Hypoxanthin und Thymidin ausgewählt werden. Optional können die Zellen MTX ausgesetzt werden, um den selektiven Druck zu erhöhen, was zu genomischen Umordnungen und zur Amplifikation des Transgenkonstrukts führen kann.

Wenn ein Antibiotikaresistenzgen verwendet wird, können Zellen, die das Transgenkonstrukt und somit den Antibiotikaresistenzfaktor stabil exprimieren, nach Mutagenese optional unter Verwendung des relevanten Antibiotikums ausgewählt werden.

Eine Auswahlstrategie, z. B. eine der hierin erwähnten, kann eine heterogene Population von Zellen mit unterschiedlichen Transgenkonstruktintegrationsstellen, Kopiezahlen und dergleichen hervorbringen.

Optional kann eine Reihe von Begrenzungsverdünnungen, z. B. in Multiwellplatten, durchgeführt werden, um einheitliche Zellpopulationen zu isolieren, die optional gescreent werden können, um Kandidatenzelllinien auszuwählen.

Optional können Kandidatenzellpopulationen genauer und/oder in größerem Maßstab beurteilt werden, um einen oder mehrere Endkandidaten auszuwählen.

Optional kann das hierin bereitgestellte Verfahren verwendet werden, um Zellen in einer beliebigen Stufe eines solchen Prozesses des Ableitens einer geeigneten Verwendungs-/Herstellungszellpopulation zu analysieren. Optional kann die Expression des Transgens und/oder einer oder mehrerer Faktoren, die das Wachstum, die Effizienz und/oder Produktivität einer Zelle beeinflussen, analysiert werden. Dies ermöglicht die schnelle Auswahl einer kleinen Anzahl von Kandidaten. Beispielsweise kann ein Zellpool um einen Faktor von ungefähr oder zumindest 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 oder 1000 verringert werden.

Somit kann das Verfahren optional das Analysieren einer Mehrzahl von Zellkulturen umfassen, wobei jede Zellkultur eine oder mehrere Zellpopulationen umfasst. Dies kann optional das Erzeugen einer Mehrzahl von spektrometrischen Daten und das Ermitteln einer ersten Teilmenge von Zellkulturen, die für eine Verwendung einer Substanz und/oder Herstellung einer biosynthetisierten Substanz potenziell von Interesse sind, anhand der Mehrzahl von spektrometrischen Daten umfassen.

Das Verfahren kann optional ferner die Verwendung einer flüssigkeitschromatographiebasierten Analyse umfassen, z. B. Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-(LCMS)-Analyse; Flüssigkeitschromatographie-Ionenmobilitätsspektrometrie-(LCIMS)-Analyse; Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-(LCMS/MS)-Analyse; Analyse mit Flüssigkeitschromatographie, gefolgt von MSE-Spektrometrie (LCMSE); eine Analyse mit Flüssigkeitschromatographie, gefolgt von Ionenmobilitätstrennung und danach Massenspektrometrie (LC-IMS-MS); und/oder eine Analyse mit Flüssigkeitschromatographie, gefolgt von Ionenmobilitätstrennung und danach MSE-Spektrometrie (LC-IMS-MSE). Eine solche flüssigkeitschromatographiebasierte Analyse kann optional verwendet werden, um eine erste Teilmenge von Zellkulturen zu analysieren, z. B. um eine zweite Teilmenge von Zellkulturen zu erzeugen. Optional kann das Verfahren das Klassifizieren oder Teilen von Zellpopulationen in Teilmengen auf Basis von spektrometrischen Daten, Daten aus einer flüssigkeitschromatographiebasierten Analyse oder einer Kombination von spektrometrischen Daten und/oder Daten aus einer flüssigkeitschromatographiebasierten Analyse umfassen.

Die hierin erwähnten Umgebungsionisationsmassenspektrometrieverfahren sind zwingend schneller als eine flüssigkeitschromatographiebasierten Analyse, optional umfasst das Verfahren optional somit keine Verwendung einer flüssigkeitschromatographiebasierten Analyse, z. B. einer beliebigen der oben erwähnten.

Somit kann das Verfahren optional im Prozess der Arzneimittelfertigung und -herstellung verwendet werden.

Für gewöhnlich kann eine sehr große Anzahl (z. B. ungefähr 50.000) von potenziellen Chargen einer Zellkultur hergestellt werden. Eine Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LCMS) kann sodann an jeder der Zellkulturen durchgeführt werden, um eine kleine Teilmenge von Zellkulturen zu ermitteln, die in Bezug auf eine Verwendung in der vollen Herstellung von größtem Interesse sind.

Es wird jedoch verstanden, dass das Durchführen einer LCMS-Analyse an ungefähr 50.000 getrennten Chargen von Zellpopulationen ein komplexer und zeitaufwendiger Prozess ist.

Ein besonderer Vorteil des hierin bereitgestellten Verfahrens ist, dass das hierin bereitgestellte Verfahren ermöglicht, experimentelle Ergebnisse im Wesentlichen sofort zu erhalten. Ferner eignet sich das hierin bereitgestellte Verfahren für eine Automatisierung und eine große Anzahl von Zellkulturen kann entweder sequentiell und/oder parallel in einem vergleichsweise kurzen Zeitraum analysiert werden. Natürlich ist es möglich, ungefähr 50.000 getrennte Chargen von Zellkulturen in einem Zeitrahmen zu analysieren, der um einiges schneller als herkömmliche LCMS-Ansätze ist.

Demgemäß liegt eine bestimmte Anwendung von REIMS und ähnlichen Ionisationstechniken darin, dass es möglich ist, eine große Anzahl von Zellkulturen in einem kurzen Zeitraum zu analysieren.

Diese Analyse ermöglicht, dass die große Anzahl von Zellkulturen, z. B. 50.000, auf eine sehr kleine Kandidatenliste von z. B. lediglich zehn Kulturen verringert wird, die danach in der vollständigen Herstellung/Verwendung verwendet werden können.

Alternativ werden andere Ausführungsformen in Betracht gezogen, wobei eine REIMS-Analyse an den ungefähr 50.000 Chargen durchgeführt werden kann, um die Bildung einer ersten Teilmenge von Zellkulturen zu ermöglichen. Die erste Teilmenge von Zellkulturen kann z. B. ungefähr 1000 Chargen umfassen. Eine LCMS kann danach an dieser verringerten Anzahl von 1000 Proben durchgeführt werden, um eine zweite Teilmenge von Zellkulturen (z. B. 10) zu ermitteln, die in Bezug auf eine Verwendung in der vollständigen Herstellung am vielversprechendsten sind. Auch wenn dieser alternative Ansatz immer noch die Verwendung von LCMS umfasst, führt dieser 2-Stufen-Prozess immer noch zu beträchtlichen Zeitersparnissen, da nur z. B. 1000 Chargen mittels LCMS analysiert werden müssen (im Vergleich zu ungefähr 50.000 beim herkömmlichen Ansatz).

Substanzverwendung/-herstellung und Qualitätskontrolle

Ein allgemeiner Prozess zum Verwenden und/oder Herstellen einer Substanz wie z. B. eines (bio-)therapeutischen Produkts über Zellkultur kann einen oder mehrere der folgenden Schritte umfassen:

  • 1. Vorbereiten eines Zellkulturgeräts mit geeigneten Zellkulturbedingungen;
  • 2. Inokulieren mit z. B. einer Starterkultur, die in kleinerem Maßstab gezüchtet wurde;
  • 3. Zulassen, dass die Zellen wachsen;
  • 4. Wenn eine Verwendung/Herstellung einer Substanz nicht automatisch erfolgt (z. B. wenn von einer bestimmten Temperatur oder einem bestimmten Nährstoff abhängig), Anpassen der Bedingungen, so dass eine Verwendung/Herstellung induziert wird;
  • 5. Überwachen von Kulturbedingungen und entsprechendes Anpassen;
  • 6. Überwachen der Substanzverwendung/-herstellung;
  • 7. Ernten von Substanz- oder Aufschlüsselungsprodukt
    – aus dem Kulturmedium, wenn die Substanz oder das Aufschlüsselungsprodukt sekretiert wird
    – aus den Zellen, wenn die Substanz oder das Aufschlüsselungsprodukt sich innerhalb von Zellen ansammelt
  • 8. Reinigen der Substanz oder des Aufschlüsselungsprodukts, z. B. durch Entfernen von Kontaminanten.

Während eines Prozesses der Verwendung und/oder Herstellung einer Substanz über Zellkultur kann eine Analyse durchgeführt werden, z. B. über das hierin beschriebene Verfahren, z. B. zum Überwachen der Kulturbedingungen und/oder der Verwendung/Herstellung. Dies kann optional das Erhalten einer Probe aus der Zellpopulation zur Analyse umfassen. Der Fachmann kennt geeignete Verfahren zum Erhalten von Proben wie z. B. Pipettieren, Verwendung eines Tupfers oder dergleichen. Die Probe kann optional verarbeitet werden, z. B. kann eine flüssige Probe filtriert oder verarbeitet werden, um ein Pellet zu erzeugen, wie hierin andernorts erwähnt. Optional kann ein Tupfer verwendet werden, der optional ohne weitere Verarbeitung unter Verwendung des Verfahrens mit einer REIMS-Ionenquelle analysiert werden kann.

Optional können die Kulturbedingungen beliebig angepasst werden, z. B. wenn die Analyse zeigt, dass eine Anpassung erforderlich ist. Der pH-Wert der Kultur kann gemessen werden, z. B. mit einem pH-Meter, und kann optional eingestellt werden, z. B. durch entsprechende Zugabe einer Säure oder einer Base. Die Nährstoffverwendung kann überwacht werden, z. B. durch Analyse der Respiration. Der Respirationsquotient, d. h. das Verhältnis der Kohlendioxidentwicklungsrate zur Sauerstoffaufnahmerate, kann analysiert werden. Stoffwechselprodukte, z. B. die Substanz von Interesse, ein Aufschlüsselungsprodukt und/oder Kontaminanten, können analysiert werden.

Somit kann das Verfahren optional das Analysieren, z. B. Überwachen, eines Prozesses des Verwendens und/oder Herstellens einer Substanz über Kultur einer Zellpopulation umfassen. Optional stellt die Erfindung ein Verfahren zum Verwenden und/oder Herstellen einer Substanz über Kultur einer Zellpopulation bereit, wobei das Verfahren einen Schritt des Analysierens des Verwendungs- und/oder Herstellungsprozesses über ein Analyseverfahren der Erfindung umfasst. Optional umfasst das Verfahren ferner einen Schritt des Anpassens der Kulturbedingungen auf Basis der Analyse.

Somit kann das Verfahren optional das Analysieren der Verwendung und/oder Herstellung einer Substanz durch eine Zellpopulation umfassen. Es wird ein Verfahren zum Herstellen einer Substanz bereitgestellt, das (a) das Verwenden einer ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Rauch, Aerosol oder Dampf aus einer In-vitro- oder Ex-vivo-Zielzellpopulation und/oder einem davon abgeleiteten Medium; (b) eine Massen- und/oder Ionenmobilitätsanalyse des Rauchs, des Aerosols oder Dampfs oder von davon abgeleiteten Ionen, um spektrometrische Daten zu erhalten; und (c) das Analysieren der spektrometrischen Daten, um die Herstellung einer Substanz durch die Zielzellpopulation zu analysieren, umfasst. Es wird außerdem ein Verfahren zum Identifizieren einer Zellpopulation bereitgestellt, die in der Lage ist, eine Substanz zu verwenden und/oder herzustellen, das (a) das Verwenden einer ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Rauch, Aerosol oder Dampf aus einer In-vitro- oder Ex-vivo-Zielzellpopulation und/oder einem davon abgeleiteten Medium; (b) eine Massen- und/oder Ionenmobilitätsanalyse des Rauchs, des Aerosols oder Dampfs oder von davon abgeleiteten Ionen, um spektrometrische Daten zu erhalten; und (c) das Analysieren der spektrometrischen Daten, um eine Zellpopulation zu identifizieren, die in der Lage ist, eine Substanz zu verwenden und/oder herzustellen, umfasst.

Beliebige dieser Verfahren können optional das Analysieren der spektrometrischen Daten, um (i) zu ermitteln, ob die Zellpopulation die Substanz verwendet und/oder herstellt; (ii) die Rate, mit der die Zellpopulation die Substanz verwendet und/oder herstellt, zu ermitteln; (iii) zu ermitteln, ob die Zellpopulation Nebenprodukte herstellt; und/oder (v) den Mechanismus, mit dem die Zellpopulation die Substanz verwendet und/oder herstellt, zu ermitteln. Optional können zwei oder mehr Zellpopulationen analysiert werden, um zu ermitteln, welche Zellpopulation die Substanz mit einer höheren Rate und/oder höheren Reinheit verwendet und/oder herstellt. Optional kann eine Mehrzahl von Zellpopulationen analysiert und auf Basis der Analyse in zwei oder mehr Teilmengen geteilt werden. Beispielsweise können Zellpopulationen auf Basis der Analyse in Teilmengen geteilt werden, und zwar basierend auf (i) ihrer Fähigkeit oder Unfähigkeit, die Substanz zu verwenden und/oder herzustellen; (ii) der Verwendungs- und/oder Herstellungsrate der Substanz; (iii) der Herstellung von Nebenprodukten; und/oder (iv) dem Verwendungs- und/oder Herstellungsmechanismus. Optional können Zellpopulationen auf Basis der Analyse unterteilt werden in (i) eine erste Teilmenge, die in der Lage ist, die Substanz zu verwenden und/oder herzustellen, und eine zweite Teilmenge, die nicht in der Lage ist, die Substanz zu verwenden und/oder herzustellen; (ii) eine erste Teilmenge und eine zweite Teilmenge, wobei die erste Teilmenge die Substanz mit einer höheren Rate als die zweite Teilmenge verwendet und/oder produziert; (iii) eine erste Teilmenge und eine zweite Teilmenge, wobei die erste Teilmenge keine Nebenprodukte herstellt oder weniger Nebenprodukte als die zweite Teilmenge herstellt; und/oder (iv) eine erste Teilmenge und eine zweite Teilmenge, wobei die erste Teilmenge die Substanz über einen anderen Mechanismus als die zweite Teilmenge verwendet und/oder herstellt.

Optional kann das Verfahren ferner einen Schritt des Unterziehens der Zellpopulation oder der Zellpopulationsteilmenge einer Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-(LCMS)-Analyse vor und/oder nach dem Analyseverfahren. Optional kann die Zellpopulation auf Basis der LCMS-Analyse in Teilmengen unterteilt werden oder kann eine die Zellpopulationsteilmenge, wie oben erwähnt, in weitere Teilmengen unterteilt werden.

Optional kann die Zellpopulation oder die Zellpopulationsteilmenge unter Bedingungen kultiviert werden, die sich für eine Verwendung und/oder Herstellung der Substanz eignen.

Optional umfasst das das Verfahren ferner keinen Schritt des Unterziehens einer Zellpopulation oder der Zellpopulationsteilmenge einer Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-(LCMS)-Analyse.

Optional kann das Verfahren verwendet werden, um die Verwendung und/oder Herstellung einer Substanz zu überwachen, insbesondere um die Herstellung von Nebenprodukten zu überwachen. Dies kann das Analysieren einer Probe aus einer Zellpopulation zu diversen Zeitpunkten umfassen, wie hierin andernorts erörtert.

Click-Chemie

„Click-Chemie“ ist ein Ausdruck, der 2001 von K. B. Sharpless eingeführt wurde, um Reaktionen zu beschreiben, die eine hohe Ausbeute hervorbringen, umfassend sind, nur Nebenprodukte erzeugen, die ohne Chromatographie entfernt werden können, stereospezifisch sind, einfach durchzuführen sind und in einfach entfernbaren oder benignen Lösungsmitteln durchgeführt werden können.

Eine typische Click-Chemie (Click-Reaktion) sind die kupferkatalysierten 1,3-dipolaren Cycloadditionen zwischen Aziden und Acetylenen.

Eine Click-Reaktion kann z. B. zwischen einer fluoreszierenden Sonde, die ein Alkyn umfasst, und einem Biomolekül, das ein Azid umfasst, auftreten.

Somit kann die Click-Chemie verwendet werden, um eine Sonde oder ein Substrat von Interesse an einem spezifischen Biomolekül anzubinden, ein Prozess, der Biokonjugation genannt wird. Durch die Möglichkeit, Fluorophore und andere Reportermoleküle anzubinden, ist die Click-Chemie zu einem sehr leistungsstarken Werkzeug zum Identifizieren, Lokalisieren und Charakterisieren sowohl alter als auch neuer Biomoleküle geworden.

Eines der frühesten und wichtigsten Verfahren der Biokonjugation war das Exprimieren eines Reporters auf dem gleichen offenen Leserahmen wie ein Biomolekül von Interesse. Erwähnenswerterweise wird grün fluoreszierendes Protein (GFP) auf diese Weise am N- oder C-Terminus vieler Proteine exprimiert. Dieser Ansatz ist jedoch mit diversen Schwierigkeiten verbunden. Beispielsweise ist das GFP eine sehr große Einheit und kann die Faltung des Proteins von Interesse häufig beeinflussen. Außerdem kann das GFP-Addukt, da es an jedem Terminus exprimiert wird, auch das Targeting und die Expression des gewünschten Proteins beeinflussen. Schließlich kann GFP unter Verwendung dieses Verfahrens nur an Proteine angebunden werden und nicht nach einer Translation, wodurch andere wichtige biomolekulare Klassen (Nukleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate usw.) nicht infrage kommen.

Um diese Herausforderungen zu bewältigen, versuchen Chemiker, durch Identifizieren von Paaren bioorthogonaler Reaktionspartner voranzukommen, wodurch die Verwendung kleiner exogener Moleküle als biomolekulare Sonden möglich wird. Ein Fluorophor kann an eine dieser Sonden angebunden werden, um ein Fluoreszenzsignal bei Bindung des Reportermoleküls an das Ziel zu geben – eben da GFP fluoresziert, wenn es mit dem Ziel exprimiert wird.

Optional kann das hierin bereitgestellte Verfahren das Überwachen einer Click-Chemiereaktion umfassen, z. B. um die Endprodukte und/oder beliebige Nebenprodukte einer Click-Chemiereaktion zu überwachen. Optional kann das Verfahren in Kombination mit Click-Chemie verwendet werden, z. B. vor oder nach einer Click-Chemiereaktion. Optional kann das Verfahren anstatt einer Click-Chemie verwendet werden. Beispielsweise kann das Verfahren die Analyse von Biomarkern ermöglichen, die für gewöhnlich unter Verwendung von Click-Chemie analysiert werden, wodurch keine Click-Chemiereaktion mehr erforderlich ist.

Weitere Definitionen

Das Verfahren kann an einem „Ziel“ durchgeführt werden, das eine Zellpopulation oder eine Probe davon und/oder ein von einer Zellpopulation abgeleitetes Medium sein kann. Der Ausdruck „Zielentität“ wird hierin verwendet, um sich auf die Entität zu beziehen, die es innerhalb des Ziels zu analysieren gilt. Somit sollte jede Erwähnung eines „Ziels“ als ein Ziel bedeutend verstanden werden, das eine oder mehrere unterschiedliche Zielentitäten umfasst. Somit kann die Zielentität beispielsweise ein bestimmter Zelltyp, eine bestimmte Mikrobe und/oder eine bestimmte Verbindung sein. Optional umfasst das Ziel nur einen Typ von Zielentitäten.

Jedwede Bezugnahme auf „Analyse“, „Analysieren“ und Ableitungen dieser Ausdrücke hierin sollten als Analyse auf Basis der spektrometrischen Daten verstanden werden, die über das hierin bereitgestellte Verfahren generiert wurden.

Die Ausdrücke „Analyse“, „Analysieren“ und Ableitungen dieser Ausdrücke werden hierin so verwendet, dass sie beliebiges des Folgenden umfassen: Nachweisen einer Zielentität oder eines Biomarkers dafür; Identifizieren eines Ziels oder einer Zielentität oder eines Biomarkers dafür; Charakterisieren eines Ziels oder einer Zielentität oder eines Biomarkers dafür; Ermitteln eines Status, z. B. eines Krankheitsstatus oder Biomarkers dafür und dergleichen.

Die Analyse kann qualitativ und/oder quantitativ sein. Somit kann ein beliebiger Analysetyp das Ermitteln der Konzentration, des Prozentsatzes, der relativen Abundanz oder dergleichen der Zielentität umfassen. Beispielsweise können der Prozentsatz von Zellen eines Typs innerhalb einer Zellpopulation und/oder die Konzentration einer Verbindung analysiert werden. Optional kann eine Erhöhung oder Verringerung einer Zielentität oder eines Biomarkers dafür analysiert werden.

Die Ausdrücke „Nachweis“, „Nachweisen“ und Ableitungen dieser Ausdrücke werden hierin miteinander austauschbar verwendet und bedeuten, dass das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Zielentität oder eines Biomarkers dafür ermittelt wird.

Die Ausdrücke „Identifizieren“, „Identifikation“ und Ableitungen dieser Ausdrücke werden hierin miteinander austauschbar verwendet und bedeuten, dass eine Information zur Identität eines Ziels, einer Zielentität oder eines Biomarkers dafür erhalten wird. Dies kann optional das Ermitteln der Identität und/oder das Bestätigen der Identität umfassen. Dies kann optional eine Information zur genauen Identität des Ziels, der Zielentität oder des Biomarkers dafür umfassen. Es kann alternativ jedoch eine Information umfassen, die ermöglicht, dass die Zielentität als in eine bestimmte Klassifizierung fallend identifiziert wird, wie hierin andernorts erörtert.

Unter „Identifizieren“ einer Mikrobe versteht sich, dass zumindest eine gewisse Information zur Identität erhalten wird, die z. B. auf taxonomischer Ebene.

Unter „Identifizieren“ einer Zelle versteht sich, dass zumindest eine gewisse Information zum Zelltyp erhalten wird. Unter „Identifizieren“ einer erkrankten Zelle versteht sich, dass ermittelt oder bestätigt wird, dass eine Zelle erkrankt ist.

Unter „Identifizieren“ einer Verbindung versteht sich, dass zumindest eine gewisse Information zur Struktur und/oder Funktion der Verbindung erhalten wird, z. B. die Information kann optional ermöglichen, dass eine Verbindung als eine Verbindung, die aus beliebigen der hierin offenbarten Typen ausgewählt ist, umfassend oder aus dieser bestehend und/oder als durch eine oder mehrere der hierin offenbarten funktionellen Gruppen gekennzeichnet seiend identifiziert wird.

Der Ausdruck „Überwachen“ und Ableitungen dieses Ausdrucks, wie hierin verwendet, beziehen sich darauf, zu ermitteln, ob Änderungen erfolgen/erfolgt sind. Für gewöhnlich wird ermittelt, ob Änderungen über die Zeit hinweg erfolgen, d. h. seit einem vorherigen Zeitpunkt. Die Änderung kann z. B. die Reaktion auf eine Substanz, die Herstellung einer Substanz und /oder die Entwicklung und/oder das Fortschreiten einer Krankheit sein, wie z. B. einer beliebigen der hierin erwähnten. Optional kann das Verfahren das Analysieren eines Ziels und – auf Basis eines oder mehrerer des Folgenden – das Überwachen einer Krankheit umfassen: Nachweisen einer Zielentität; Identifizieren einer Zielidentität; Nachweisen einer Erhöhung einer Zielentität; Nachweisen einer Verringerung einer Zielentität.

Der Ausdruck „Prognose“ und Ableitungen dieses Ausdrucks, wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine Risikoprognose des Schweregrads einer Krankheit oder des wahrscheinlichen Verlaufs und klinischen Ausgangs in Zusammenhang mit einer Krankheit. Somit bezieht sich der Ausdruck „Prognoseverfahren“, wie hierin verwendet, auf Verfahren, mit denen der Fachmann eine Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmter Ausgang eintritt, schätzen und/oder ermitteln kann. Der Ausgang, auf den sich die Prognose bezieht, kann sich auf Morbidität und/oder Mortalität beziehen. Insbesondere kann sich die Prognose auf „progressionsfreies Überleben“ (PFS) beziehen, wobei es sich um die Zeitdauer handelt, für die ein Subjekt lebt, ohne dass die Krankheit fortschreitet. Somit kann das PFS z. B. die Zeit vom Beginn einer Therapie bis zu dem Datum des Fortschreitens der Krankheit oder die Zeit vom Ende der Therapie bis zum Datum des Fortschreitens der Krankheit sein.

Optional kann das Verfahren das Analysieren eines Ziels und – auf Basis eines oder mehreres des Folgenden – das Abgeben einer Prognose umfassen: Nachweisen einer Zielentität; Identifizieren einer Zielentität; Nachweisen einer Erhöhung einer Zielentität; Nachweisen einer Verringerung einer Zielentität.

Unter „Fortschreiten“ oder „Progression“ und Ableitungen dieser Ausdrücke versteht sich, dass sich die Krankheit verschlimmert, d. h. sich der Schweregrad erhöht. Beispielsweise bei Krebs kann dies bedeuten, dass der Krebs bösartig oder bösartiger wird.

Die Prognose kann sich auf das Gesamtüberleben beziehen. Unter „Gesamtüberleben“ (OS) versteht sich die Zeitdauer, für die ein Subjekt mit der Krankheit lebt, bevor der Tod eintritt. Das Gesamtüberleben kann z. B. als Zeit seit der Diagnose der Krankheit; Zeit seit Behandlungsbeginn; oder Zeit seit Behandlungsende bis zum Tod definiert sein. Das Gesamtüberleben wird für gewöhnlich als „Gesamtüberlebensrate“ ausgedrückt, die der Prozentsatz von Personen in einer Studie oder Behandlungsgruppe ist, die für einen gewissen Zeitraum nach Diagnosestellung oder Beginn einer Behandlung oder Ende der Behandlung einer Krankheit immer noch am Leben sind. Die Gesamtüberlebensrate kann z. B. als 5-Jahres-Überlebensrate ausgedrückt werden, die der Prozentsatz von Personen in einer Studie oder Behandlungsgruppe ist, die fünf Jahre nach Diagnosestellung oder Beginn oder Ende der Behandlung am Leben sind.

Statistische Informationen zum durchschnittlichen (z. B. medianen, mittleren oder modalen) OS oder PFS von Subjekten mit einem bestimmten Krankheitstyp stehen dem Fachmann zur Verfügung. Daher kann eine Ermittlung durchgeführt werden, ob ein Subjekt ein gegenüber einem solchen Durchschnittswert erhöhtes OS oder PFS aufweist oder dieses wahrscheinlich aufweist.

Ein Ansprechen auf eine Behandlung kann z. B. eine Verringerung der Zellwachstumsrate, ein eingestelltes Wachstum und/oder Zelltod sein. Alternativ oder zusätzlich kann ein Ansprechen auf eine Behandlung das Auftreten oder Verschwinden eines oder mehrerer Biomarker und/oder eine Erhöhung oder Verringerung der Expression eines oder mehrerer Biomarker sein.

Der Ausdruck „Behandlung“ oder „Behandeln“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Aktionsverlauf, der darauf abzielt, einen medizinischen Nutzen für ein Subjekt zu bewirken. Die Behandlung kann prophylaktisch oder therapeutisch sein.

Optional kann das Verfahren das Analysieren eines Ziels und – auf Basis eines oder mehrerer des Folgenden – das Ermitteln, dass ein Subjekt eine bestimmte Behandlung erhalten oder nicht erhalten sollte, umfassen: Nachweisen einer Zielentität; Identifizieren einer Zielidentität; Nachweisen einer Erhöhung einer Zielentität; Nachweisen einer Verringerung einer Zielentität.

Optional kann das Verfahren das Analysieren eines Ziels und – auf Basis eines oder mehrerer des Folgenden – das Ermitteln, dass ein Subjekt auf eine bestimmte Behandlung anspricht oder nicht anspricht oder wahrscheinlich anspricht oder wahrscheinlich nicht anspricht, umfassen: Nachweisen einer Zielentität; Identifizieren einer Zielidentität; Nachweisen einer Erhöhung einer Zielentität; Nachweisen einer Verringerung einer Zielentität.

Optional kann das Verfahren das Analysieren eines Ziels und – auf Basis eines oder mehrerer des Folgenden – das Verabreichen einer bestimmten Behandlung an ein Subjekt umfassen: Nachweisen einer Zielentität; Identifizieren einer Zielidentität; Nachweisen einer Erhöhung einer Zielentität; Nachweisen einer Verringerung einer Zielentität.

Organoide

Wie oben erwähnt, kann die Zellpopulation optional ein Organoid sein.

Säugetiergewebe, insbesondere Organe, sind schwer zu studieren, da sie für gewöhnlich nur schlecht für experimentelle Manipulation und/oder Analyse zugänglich sind. Säugetiergewebe kann jedoch durch dreidimensionale (3D-)Kulturtechniken ex vivo oder in vitro erzeugt werden. Dies ermöglicht das Untersuchen solcher Gewebe in Echtzeit, optional einschließlich der unabhängigen Manipulation diverser Faktoren, z. B. genetischer und/oder Mikroumgebungsfaktoren.

Gewebe, das über eine 3D-Kulturtechnik ex vivo oder in vitro erzeugt wird, wird hierin als „organotypisches Gewebe“ oder „Organoid“ bezeichnet, wobei diese Ausdrücke hierin miteinander austauschbar verwendet werden. Somit werden diese Ausdrücke hierin verwendet, um Modelle von Organen und/oder Modelle von Tumoren zu umfassen.

Organotypisches Gewebe kann auch aus „Organexplantaten“ erzeugt werden, d. h. Zellen oder Gewebestücke die aus primären Säugetierorganen isoliert wurden, oder Tumorexplantaten, d. h. Zellen oder Gewebestücke, die aus einem Tumor isoliert wurden. Explantate können z. B. aus reseziertem Gewebe und/oder Biopsien erhalten werden. Organotypisches Gewebe kann alternativ durch Expandieren von ES-Zellen, iPS-Zellen oder primären Stammzellen, die aus Organen gereinigt wurden, erzeugt werden.

Ein organotypisches Gewebe ist ein Gewebe, das in vitro gebildet wird und eine Sammlung von Zellen umfasst, die dreidimensionale Strukturen bilden und ihren In-vivo-Gegenstücken gleichen. Im Gegensatz zu herkömmlichen zweidimensionalen Zellkulturen ermöglichen Organoidsysteme ein 3D-Zellwachstum, eine Zellbewegung, eine Zelldifferenzierung und mehr physiologisch repräsentative Zell-Zell-Interaktionen. Im Gegensatz zu herkömmlichen 2D-Zellkulturen haben Organoide ähnliche physische, molekulare und physiologische Eigenschaften mit dem In-vivo-Gewebe des gleichen Typs gemein. Organoide stellen daher effektive Modelle dar, um die Organentwicklung, die Gewebemorphogenese und/oder die genetische oder molekulare Basis von Krankheiten zu verstehen. Sie werden bei Arzneimittelscreening, Arzneimitteltests und/oder Gewebeersatztherapien verwendet.

Somit kann das Verfahren optional das Analysieren eines Organoids umfassen. Eine oder mehrere Regionen eines Organoids können analysiert werden. Somit kann das Ziel ein Organoid oder ein Teil davon sein. Falls nicht anderweitig angegeben, sollte jede Erwähnung des Analysierens eines Organoids hierin als optional das Analysieren eines Teils eines Organoids umfassend verstanden werden.

Wie hierin andernorts erwähnt, stellen die Verfahren der vorliegenden Erfindung spektrometrische Daten zu den Zelltypen bereit, aus denen die Aerosole erzeugt werden. Somit ermöglichen die vorliegenden Verfahren eine Biomarkeranalyse, z. B. lipidomisches Fingerprinting, von Zelltypen und/oder – im vorliegenden Kontext – Organoidtypen.

Der Durchschnittsfachmann weiß, wie ein Organoid für seinen bestimmten Zweck herzustellen ist. Verfahren zum Herstellen von Organoiden sind auf dem Gebiet hinlänglich bekannt. Optional kann das Verfahren einen Schritt des Herstellens eines Organoids umfassen.

Unter einem „Organoid“ versteht sich ein organisiertes Gewebe, das in vitro oder ex vivo gebildet wird, wobei das Gewebe eine zelluläre Organisation und Gesamtmorphologie ähnlich jener des gleichen Gewebetyps in vivo aufweist, zumindest was eine Teilmenge der Zellen des Gewebes betrifft. Eine solche zelluläre Organisation und Gesamtmorphologie wird hierin „in-vivo-ähnliche Gesamt- und zelluläre Morphologie“ genannt.

Ein „Organoid“, wie hierin verwendet, kann optional ein Gerüst umfassen, das ein vorgeformter fester Träger ist, der dem Gewebe eine kurzzeitige (Stunden bis zwei Wochen in Kultur) Struktur verleiht oder bereitstellt, oder der erforderlich ist, um das Gewebe zu bilden.

Unter „zumindest eine Teilmenge von Zellen“ verstehen sich zumindest zwei Zellen, z. B. zumindest 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % oder 50 % der Zellen des Gewebes. Optional haben im Wesentlichen alle der Zellen innerhalb des Organoids eine zelluläre Organisation und Gesamtmorphologie ähnlich jener des gleichen Gewebetyps in vivo. Unter „im Wesentlichen alle der Zellen“ verstehen sich zumindest 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 % der Zellen.

Unter „in-vivo-ähnlicher Gesamt- und zellulärer Morphologie“ versteht sich eine dreidimensionale Form und zelluläre Organisation, die jener des Gewebes in vivo im Wesentlichen ähnelt.

Unter „dreidimensional“ versteht sich ein organisiertes Gewebe mit x-, y- und z-Achsen, wobei x und y der Achsen zumindest 2 mm sind, wobei z zumindest 0,05 mm dick ist und wobei eine, zwei oder alle der Achsen bis 20 cm sind. Optional kann ein dreidimensionales Gewebe ein- oder mehrmals zwischen In-vivo- und In-vitro-Umgebungen übertragen werden, z. B. genau oder zumindest zwei-, drei-, vier-, fünf-, sechs-, sieben-, acht-, neun- oder zehnmal, ohne dass sich die Struktur und/oder Form wesentlich ändern.

Das Organoid kann ein beliebiger Typ von Organoid sein, z. B. ein Organoid eines beliebigen der Zell- und/oder Gewebetypen, die hierin andernorts erwähnt sind. Optional kann das Organoid aus z. B. cerebralen Organoiden, Schilddrüsenorganoiden, Darmorganoiden (z. B. Dünndarm-, Kolon-, Rektum-, Zwölffingerdarm- oder Ileumorganoiden), Hodenorganoiden, Leberorganoiden, Bauchspeicheldrüsenorganoiden, Magenorganoiden, Epithelorganoiden, Lungenorganoiden, Nierenorganoiden, Muskelorganoiden, Prostataorganoiden, Brustorganoiden, Blutgefäßorganoiden, Lymphgefäßorganoiden und/oder Netzhautorganoiden ausgewählt sein.

Optional kann das Organoid aus terminal differenzierten Zellen des gewünschten Organs hergestellt werden, z. B. kann ein „Darmorganoid“ von terminal differenzierten Darmzellen abgeleitet sein. Typischer können Organoide jedoch aus Stammzellen hergestellt werden. Optional kann das Organoid aus einem Explantat oder Zellen aus einem Patienten hergestellt werden.

Der Ausdruck „ähnlich jener des gleichen Gewebetyps in vivo“ bedeutet, dass das Organoid genetische und phänotypische Charakteristika aufweist, die ermöglichen, dass es vom Fachmann als von einem bestimmten Gewebetyp seiend (wie z. B. den oben aufgelisteten Geweben) oder damit assoziiert erkannt wird. Es bedeutet nicht, dass das Organoid notwendigerweise genetisch und phänotypisch mit dem entsprechenden In-vivo-Gewebetyp identisch sein muss.

Ein Organoid, das den In-vivo-Genotyp und -Phänotyp des Darms aufweist, ist für die Zwecke dieser Erfindung in der Definition eines „Darmorganoids“ umfasst. Das Gleiche gilt mutatis mutandis für die anderen oben aufgelisteten Organoidtypen.

Optional kann das Organoid ein Säugetierorganoid sein, d. h. es kann von Zellen oder einem Explantat abgeleitet sein, die bzw. das einem Säugetier entnommen wurde bzw. wurden. Das Säugetier kann ein beliebiges Säugetier von Interesse sein, z. B. aus den hierin andernorts aufgelisteten Säugetieren ausgewählt sein. Optional kann das Organoid ein nicht humanes Organoid ist. Optional kann das Organoid ein humanes Organoid ist.

Optional kann das Organoid erkrankt sein, z. B. kanzerös. Optional kann es aus einem erkrankten Explantat oder aus erkrankten Zellen erzeugt sein. Optional kann es aus einem gesunden Explantat oder aus gesunden Zellen erzeugt sein. Optional kann ein Krankheitszustand im Organoid induziert werden, z. B. über genetische Manipulation und/oder unter Verwendung eines krankheitshervorrufenden Mittels.

Optional können der Genotyp und/oder Phänotyp des Explantats und/oder der Zellen verändert werden, bevor ein Organoid erzeugt wird. Optional können der Genotyp und/oder der Phänotyp des Organoids während oder nach Erzeugung des Organoids verändert werden. Optional können der Genotyp und/oder Phänotyp eines reifen Organoids verändert werden.

Die Manipulation des Genotyps und/oder Phänotyp kann optional durch ein beliebiges der hierin andernorts erwähnten Verfahren zur Manipulation von Genotyp und/oder Phänotyp erzielt werden.

Der Ausdruck „reifes Organoid“, wie hierin verwendet, bedeutet ein Organoid, bei dem im Wesentlichen alle der Zellen innerhalb des Organoids differenziert sind, optional terminal differenziert. Unter „differenziert“ verstehen sich Zellen mit zahlreichen reif-ähnlichen Charakteristika, entweder chemisch oder physisch. Unter „terminal differenziert“ versteht sich die Unfähigkeit zu weiterer Proliferation oder Differenzierung in einen anderen Zell- oder Gewebetyp.

Ein Organoid kann einen einzelnen Zelltyp umfassen. Typischer kann ein Organoid eine Mischung von unterschiedlichen Zelltypen umfassen.

Organoide sind für gewöhnlich ausreichend klein, so dass sie ohne Blutversorgung gehalten werden können. Aus diesem Grund fehlt dem Organoid hierin optional eine Vaskulatur. Neueste Entwicklungen in der Organoidherstellungstechnologie haben dazu geführt, dass Organoide eine Vaskulatur umfassen. Somit umfasst das Organoid optional hierin eine Vaskulatur.

Das Organoid kann z. B. eine freischwimmende multizelluläre Kugel sein, optional in der stark polarisierte Zellen sich um ein zentrales Lumen anordnen.

Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein zu analysierendes Organoid in vitro oder ex vivo vorliegen oder es kann dahingehend in vivo vorliegen, dass es zuvor in ein Subjekt transplantiert worden sein kann. Optional kann das Verfahren einen Schritt des Transplantierens eines Organoids in ein Subjekt umfassen. Das Transplantat kann optional orthotopisch sein, d. h. in das Ursprungsorgan, z. B. ein Organoid, das aus einem erkrankten Explantat oder aus erkrankten Zellen erzeugt wurde, kann orthotopisch transplantiert und die Interaktion zwischen dem Organoid und dem Ursprungsorgan kann analysiert werden.

Das zu analysierende Organoid kann eine Prüfprobe eines Organoids sein, das zuvor in ein Subjekt transplantiert wurde, wobei die Prüfprobe danach aus dem Subjekt entfernt wurde. Das Subjekt kann ein beliebiges Subjekt von Interesse sein, z. B. aus beliebigen der hierin andernorts aufgelisteten Subjekte ausgewählt.

Das Bereitstellen von spektrometrischen Daten eines bestimmten Organoids (hierin ein „Zielorganoid“) kann an sich nützlich sein. Solche Daten können analysiert werden, z. B. unter Verwendung von spektrometrischen Referenzdaten, wie hierin andernorts erörtert. Alternativ oder zusätzlich können Informationen aus einem Vergleich von spektrometrischen Daten, die vom Zielorganoid erhalten werden, mit den spektrometrischen Daten, die von einem oder mehreren anderen Organoiden (hierin „Vergleichsorganoide“) erhalten werden, bezogen werden.

Der Fachmann kennt die Struktur eines Organoids eines bestimmten Organs hinlänglich und weiß, wie das Organoid herzustellen ist. Optional kann das Verfahren einen oder mehrere Schritte des Herstellens eines Organoids umfassen, die z. B. aus den folgenden Schritten ausgewählt sein können:

  • 1. Erhalten geeigneter Zellen, z. B. von einer Zellbank, aus einem Patienten oder Erzeugen de novo;
  • 2. Vorbereiten eines Kulturgeräts mit den erforderlichen Bedingungen;
  • 3. Impfen von Zellen in das Kulturgerät und Zulassen, dass diese wachsen;
  • 4. Überwachen von Kulturbedingungen und entsprechendes Anpassen; und
  • 5. Analysieren eines Organoids oder eines Teils davon.

Beliebige der Schritte können optional so oft wie erforderlich oder erwünscht durchgeführt werden, z. B. zumindest ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun oder zehn Mal. Schritte 3 können so oft wie erforderlich durchgeführt werden, wobei bei jeder Durchführung des Schritts die gleichen und/oder unterschiedliche Zelltypen zum Kulturgerät hinzugefügt werden können. Schritt 3 kann vor oder nach Schritt 4 oder gleichzeitig mit Schritt 4 durchgeführt werden. Wenn Schritt 3 mehrmals durchgeführt wird, kann jede Durchführung vor oder nach Schritt 4 getrennt oder gleichzeitig mit Schritt 4 erfolgen.

Schritt 5 kann wiederholt in geeigneten Intervallen durchgeführt werden, um das Organoid zu überwachen. Wenn die Analyse in Schritt 5 zeigt, dass es erforderlich ist, können Schritt 3 und/oder Schritt 4 optional ein- oder mehrmals wiederholt werden, wie oben beschrieben.

In Schritt 1 sind die Zellen optional Stammzellen, d. h. Zellen, die nicht terminal differenziert sind. Die Zellen können totipotente Stammzellen, pluripotente Stammzellen, multipotente Stammzellen oder oligopotente Stammzellen sein. Alternativ können sie unipotente Zellen sein. Der Ausdruck „Stammzelle“, wie hierin verwendet, umfasst totipotente, pluripotente, multipotente und oligopotente Stammzellen. Optional sind die Stammzellen embryonale Stammzellen, fötale Stammzelle, adulte Stammzelle, amniotische Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs).

Totipotente Stammzellen sind jene, die in embryonale und extraembryonale Zelltypen differenzieren können. Pluripotente Stammzellen wie z. B. embryonale Stammzellen und iPSCs sind jene, die in eine beliebige Zelle differenzieren können, die von einer beliebigen der drei Keimschichten abgeleitet ist. Eine multipotente Zelle ist eine Zelle, die das Potenzial hat, zu Zellen aus mehreren, aber begrenzten Anzahl von Zelllinien zu führen. Ein Beispiel für eine multipotente Zelle ist eine hämatopoetische Zelle, eine Blutstammzelle, die in mehrere Blutkörperchentypen differenzieren kann, sich jedoch nicht in Gehirnzellen oder andere Zelltypen entwickeln kann. Mesenchymale Stammzellen bzw. MSCs sind multipotente Stammzellen, die in eine Vielzahl von Zelltypen differenzieren könnten, darunter Osteoblasten (Knochenzellen), Chondrozyten (Knorpelzellen) und Adipozyten (Fettzellen). Oligopotente Stammzellen können in nur ein paar wenige Zelltypen differenzieren; Beispiele umfassen lymphoide und myeloische Stammzellen. Unipotente Zellen können nur einen Zelltyp herstellen, ihren eigenen, besitzen jedoch die Eigenschaft der Selbsterneuerung, was sie von anderen Nicht-Stammzellen wie z. B. ihren Vorläuferzellen unterscheidet. Eine induzierte pluripotente Stammzelle (als iPSC oder iPS-Zelle abgekürzt) ist ein Typ einer pluripotenten Stammzelle, die von einer nichtpluripotenten Zelle künstlich abgeleitet wurde, für gewöhnlich eine adulte somatische Zelle, indem eine „erzwungene“ Expression gewisser Gene induziert wurde.

Alternativ können die Zellen Nicht-Stammzellen sein, z. B. Vorläuferzellen oder terminal differenzierte Zellen ohne Differenzierungspotenzial.

Optional können Gewebe- oder Zellexplantate in Schritt 1 verwendet werden, die optional erkrankt, z. B. kanzerös, sein können.

Bei manchen Ausführungsformen sind die in Schritt 1 erhaltenen Zellen eine Population von Zellen mit unterschiedlichen Differenzierungspotenzialen.

Der Fachmann kennt den bestimmten Zelltyp, den es für dessen bestimmte gewünschte Zwecke zu erhalten gilt.

Diverse Verfahren und Geräte zum Kultivieren von Organoiden sind auf dem Gebiet bekannt (siehe z. B. Shamir und Ewald, Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 647–664 (2014))

Schritt 2 umfasst optional das Mischen von zerstreuten oder teilweise zerstreuten Zellen mit einer Lösung von Komponenten extrazellulärer Matrix, um eine Suspension herzustellen. Unter „Komponenten extrazellulärer Matrix“ verstehen sich Verbindungen, seien es natürliche oder synthetische Verbindungen, die als Substrate für die Zellanhaftung und das Zellwachstum agieren.

Die Zusammensetzung der Lösung von Komponenten extrazellulärer Matrix kann je nach herzustellendem Gewebe variieren. Repräsentative Komponenten extrazellulärer Matrix umfassen Kollagen, Laminin, Fibronektin, Vitronektin, Elastin, Glykosaminoglykane und/oder Proteoglykane und/oder Kombinationen mancher oder all dieser Komponenten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Eine optionale Lösung ist Matrigel, eine gelatineartige Proteinmischung, die von Engelbreth-Holm-Swarm-(EHS)-Maus-Sarkomzellen sekretiert wird, die von Corning Life Sciences hergestellt und vermarktet werden. Matrigel gleicht der komplexen extrazellulären Umgebung, die in vielen Geweben zu finden ist, und wird von Zellbiologen als Substrat zum Kultivieren von Zellen verwendet.

Das Kulturmedium kann undefiniert oder definiert sein und optional serumfrei sein. Geeignete Kulturbedingungen, Medien und Nährstoffe sind hierin andernorts erörtert.

Schritt 3 umfasst optional das Platzieren des Gewebeexplantats oder der Zellen, z. B. der oben erwähnten Suspension, in einem Gefäß mit einer dreidimensionalen Geometrie, die der In-vivo-Gesamtmorphologie des Gewebes nahekommt. Die Zellen und beliebige Komponenten extrazellulärer Matrix dürfen danach optional innerhalb des Gefäßes koaleszieren oder gelieren. Optional wird das Gefäß in einer Kulturkammer platziert und unter Bedingungen mit Medien umgeben, unter denen die Zellen ein organisiertes Gewebe bilden dürfen.

Das Gefäß kann optional Gewebeanhaftungsoberflächen umfassen. Unter „Gewebeanhaftungsoberflächen“ verstehen sich Oberflächen mit einer Textur, Ladung oder Beschichtung, an der Zellen in vitro anhaften können. Beispiele für Anbindungsoberflächen umfassen Edelstahldraht, Klettverschluss, Nähmaterial, native Sehne, Verschlauchung aus kovalent modifiziertem Kunststoff und Kautschukgummi mit einer texturierten Oberfläche.

Im Allgemeinen kann das Gefäß, das das Organoid enthält, in einer Standardkulturkammer (z. B. Wells, Schalen oder dergleichen) platziert werden und die Kammer kann danach mit Kulturmedium gefüllt werden, bis das Gefäß untergetaucht ist. Die genaue Zusammensetzung des Kulturmediums variiert jedoch je nach herzustellendem Gewebe, der Notwendigkeit, die Proliferation oder Differenzierung mancher oder aller der Zellen im Gewebe zu kontrollieren, der Länge des Kulturzeitraums und der Anforderung, dass bestimmte Bestandteile die Herstellung einer bestimmten bioaktiven Verbindung vermitteln. Das Kulturgefäß kann aus einer Vielzahl von Materialien in einer Vielzahl von Formen konstruiert werden, wie beschrieben.

Der obige Schritt 4 kann ein Nachfüllen, Hinzufügen oder Entfernen einer oder mehrerer Kulturmedienkomponenten umfassen.

Kulturmedien können eine beliebige Kombination von Komponenten umfassen, die das Halten des Organoidgewebes ermöglicht. Ein beispielhaftes Medium für die langfristige Lebensfähigkeit eines Organoids besteht aus DMEM mit hohem Glukosegehalt, 10 % Pferdeserum, 5 % fötalem Kälberserum und 100 Einheiten/ml Penicillin.

Optional gibt es in einer beliebigen Stufe des Organoidherstellungsprozesses einen Schritt des Einsetzens reifer Organoide in ein Wirtstier, das z. B. aus einem beliebigen der hierin andernorts erwähnten ausgewählt sein kann, um ihnen zu ermöglichen, sich weiterzuentwickeln.

Der obige Schritt 5 ist ein Schritt des Analysierens eines Organoids. Die Ergebnisse der Analyse können indizieren, dass Schritt 3 und/oder Schritt 4 ein- oder mehrmals wiederholt werden sollten, optional unter Modifikation.

Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können das Erhalten spektrometrischer Daten von einer oder mehreren Stellen eines Zielorganoids und das Analysieren der spektrometrischen Daten umfassen.

Wenn das Ziel ein Organoid ist, kann das Verfahren sodann optional verwendet werden, um eine oder mehrere Eigenschaften des Organoids zu ermitteln. Eine Analyse unter Verwendung des hierin bereitgestellten Verfahrens im obigen Schritt 5 bietet im Organoidherstellungsprozess bestimmte Vorteile; und zwar das schnelle Erhalten der Ergebnisse einer Analyse einer oder mehrerer der Eigenschaften der Organoide.

Optional ist die zu analysierende Eigenschaft des Organoids eine Eigenschaft des Organoids als Ganzes. Alternativ ist die zu analysierende Eigenschaft des Organoids eine Eigenschaft einer Region innerhalb des Organoids. Somit können die Verfahren der Erfindung an einer gewählten oder willkürlich ausgewählten Region eines Organoids durchgeführt werden.

Optional ist die analysierte Eigenschaft der Zelltyp, aus dem das Organoid oder die Region davon umfasst ist. Beim Herstellen von Organoiden ist es wichtig sicherzustellen, dass der eine oder die mehreren gewünschten Zelltypen sich innerhalb der gewünschten Regionen des Organoids befinden. Dies trifft insbesondere bei der Herstellung von Organoiden aus Stammzellen und der Herstellung von Organoiden, die mehrere Zelltypen umfassen, zu. Die Herstellung von Organoiden aus Stammzellen erfordert eine kontrollierte Differenzierung von Stammzellen in einen oder mehrere spezifische gewünschte Zelltypen, potenziell in nur gewissen Regionen des Organoids. Die Differenzierung von Stammzellen in einen Nicht-Ziel-Zelltyp würde zur Herstellung eines Organoids führen, das das entsprechende In-vivo-Organgewebe weniger genau darstellt. Unterschiedliche Zelltypen sind anhand charakteristischer spektrometrischer Daten unterscheidbar. Somit kann das Verfahren verwendet werden, um einen oder mehrere Zelltypen zu identifizieren, die in einem Organoid oder einer Region davon vorhanden sind; Details zur Zellidentifikation sind hier andernorts zu finden. Wenn die Analyse zeigt, dass ein ungewünschter Zelltyp vorhanden ist, kann der Herstellungsprozess sodann erneut gestartet werden oder die ungewünschten Zellen können aus dem Organoid entfernt oder mit einem oder mehreren Mitteln in Kontakt gebracht werden, um eine Apoptose zu induzieren.

Wie oben erwähnt, können Organoide optional aus Stammzellen hergestellt werden. Bei solchen Ausführungsformen ist optional das Differenzierungspotenzial der Zellen im Organoid oder einer Region davon die zu analysierende Eigenschaft. Das Differenzierungspotenzial von Zellen im Organoid sollte sich während des Organoidherstellungsprozesses über die Zeit hinweg verringern, somit sollte sich deren Differenzierungsstatus ändern. Aus diesem Grund ist der Zeitpunkt der Zelldifferenzierung für den Fachmann, der ein bestimmtes Organoid herstellt, von besonderem Interesse. Das Differenzierungspotenzial oder der Differenzierungsstatus ist eine phänotypische und/oder genotypische Eigenschaft einer Zelle, die mit dem hierein bereitgestellten Verfahren analysiert werden kann, wie hierin andernorts erörtert. Der Fachmann muss Faktoren, die eine Zelldifferenzierung zu spezifischen Zeitpunkten beeinflussen, ggf. zu den Kulturmedien hinzufügen oder aus diesen entfernen.

Dieser Aspekt des Organoidherstellungsprozesses kann unter Verwendung des hierin bereitgestellten Verfahrens analysiert werden. Zellen mit unterschiedlichen Differenzierungspotenzialen, z. B. pluripotente, multipotente, oligopotente, Vorläufer- und/oder vollständig differenzierte Zellen, sind anhand charakteristischer spektrometrischer Daten unterscheidbar. Wenn die Analyse zeigt, dass Zellen innerhalb des Organoids ein unerwünschtes Differenzierungspotenzial aufweisen, können Verbesserungsschritte durchgeführt werden. Solche Schritte sind optional das Entfernen der unerwünschten Zellen und/oder das Anwenden eines oder mehrerer Mittel zum Induzieren oder Abreichern eines Differenzierungspotenzials umfassen, je nach Bedarf.

Somit ermöglichen die Verfahren der vorliegenden Erfindung z. B. eine schnelle Analyse des wachsenden Gewebes während Organoidherstellungsprozessen, um zu gewährleisten, dass es die gewünschten Zelltypen umfasst, die ungewünschten Zelltypen nicht umfasst und/oder die gewünschten Zelltypen an den gewünschten Positionen innerhalb der Organoidstruktur umfasst. Das hierin bereitgestellte Analyseverfahren ermöglicht dem Fachmann, die Kulturbedingungen des Organoids während des Entwicklungsprozesses oder danach zu modifizieren, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass Organoide des gewünschten Typs hergestellt und/oder gehalten werden.

Optional ist die analysierte Eigenschaft der phänotypische und/oder genotypische Zustand der Zellen des Organoids oder der Zellen einer Region des Organoids. Optional versteht sich unter phänotypischem und/oder genotypischem Zustand die Lebensfähigkeit der Zellen darin, der Krankheitsstatus der Zellen darin und/oder die Höhe des oxidativen Schadens/Stress innerhalb der Zellen darin, insbesondere die Höhe der Lipidoxidation. Zellen mit unterschiedlichen phänotypischen und/oder genotypischen Zuständen sind anhand charakteristischer spektrometrischer Daten unterscheidbar. Somit können der Phänotyp und/oder Genotyp des Organoids mit dem hierein bereitgestellten Verfahren analysiert werden, wie hierin andernorts erörtert.

Optional kann das Verfahren die Analyse der Wirkung von Umgebungsbedingungen auf ein Organoid umfassen, wobei diesbezügliche Details hierin andernorts erörtert sind. Nach der Analyse einer beliebigen Eigenschaft eines Zielorganoids, wie hierin beschrieben, können eine oder mehrere dieser Bedingungen optional entsprechend modifiziert werden. Eine solche Modifikation liegt im Wissen des Durchschnittsfachmanns.

Optional können, wenn ein unerwünschter Krankheitsstatus nachgewiesen wird, z. B. eine Infektion der Zellen des Organoids durch einen Infektionserreger, Schritte durchgeführt werden, um die Infektion durch Behandlung mit geeigneten Mitteln und/oder durch Entfernen der infizierten Zellen zu eliminieren.

Nach Herstellung können Organoide in Kultur gehalten werden. Unterschiedliche Organoidtypen bauen sich jedoch ab, d. h. sie verlieren über die Zeit hinweg an Funktionalität und/oder ihren optimalen Zustand. Dies ist insbesondere bei gewissen Organoidtypen problematisch, z. B. nehmen Neuronen in zerebralen Organoiden ab und werden bis 15 Monate nach Herstellung durch Gliazellen ersetzt.

Die vorliegenden Verfahren ermöglichen eine Analyse von Organoiden, wie oben beschrieben, nicht nur während des Organoidherstellungsprozesses, sondern auch nachdem das Organoid hergestellt wurde. Anders ausgedrückt ermöglichen die Verfahren die Analyse eines reifen Organoids oder einer Region davon. Der Zelltyp, die Migration, das Differenzierungspotenzial und/oder der Zustand von Zellen eines reifen Organoids oder einer Region davon können ebenfalls analysiert werden. Spektrometrische Daten, die vom Zielorganoid oder einer Region davon erhalten wurden, können mit spektrometrischen Daten vom gleichen Organoid oder der gleichen Region davon zu einem früheren Zeitpunkt verglichen werden, um Änderungen von Eigenschaften des Organoids über die Zeit hinweg zu ermitteln. Somit kann das Verfahren optional verwendet werden, um Änderungen der Eigenschaften eines Organoids zu überwachen.

Unter gewissen Umständen kann es wünschenswert sein, ein Organoid herzustellen, das ein Modell einer bestimmten Krankheit ist. Organoide, die krankheitsspezifische Phänotypen aufweisen, können hergestellt werden. Solche Organoide sind beim Studium von Krankheiten und Studium potenzieller Therapien äußerst nützlich, darunter ihre Verwendung in Verfahren zum Screenen von Mitteln auf ihre therapeutische Wirksamkeit, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Die Herstellung von Organoiden mit krankheitsspezifischen Phänotypen liegt im Fachwissen eines Durchschnittsfachmanns. Optional wird der Krankheitsstatus durch genetische Modifikation der Zellen, aus denen das Organoid hergestellt wird, oder durch Anwendung eines oder mehrerer krankheitsinduzierender Mittel auf das Organoid induziert. Optional ist der Krankheitsstatus Krebs, eine Infektion und/oder eine Krankheit, die aus beliebigen der hierin andernorts erörterten Krankheiten ausgewählt ist.

Das Verfahren kann optional den Schritt des Analysierens des Krankheitsstatus des Organoids oder einer Region davon umfassen. Das Analysieren des Krankheitsstatus kann das Analysieren der Inzidenz, des Schweregrads oder des Fortschreitens eines Krankheitsstatus umfassen. Zellen unterschiedlicher Krankheitsstatus führen zu charakteristischen spektrometrischen Daten.

Optional kann die Analyse des Krankheitsstatus ein- oder mehrmals während der Herstellung eines Organoids mit einem Krankheitsstatusphänotyp erfolgen. Auf diese Weise kann das Erzeugen des Krankheitsstatusphänotyps überwacht und nach Wunsch gefördert oder diesem entgegengewirkt werden. Optional wird die Analyse des Krankheitsstatus an reifen Organoid durchgeführt.

Optional können die Verfahren das Analysieren der Krankheitsstatus von Organoiden mit unterschiedlichen Genotypen und/oder Phänotypen umfassen, um die Rolle spezifischer Genotypen und/oder Phänotypen bei der Inzidenz, dem Schweregrad und/oder dem Fortschreiten von Krankheiten aufzuzeigen.

Das Verfahren kann optional das Analysieren des Krankheitsstatus eines hergestellten Organoids nach Verabreichung einer Kandidatenverbindung umfassen, wobei die Kandidatenverbindung den jeweiligen Krankheitsstatus verhindert, behandelt, induziert und/oder verstärkt. Auf diese Weise ermöglichen die Verfahren der Erfindung die Verwendung von Organoiden in Verbindungsscreenings.

Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verbindungsscreeningverfahren bereit, das die Schritte umfasst:

  • i) Inkontaktbringen eines Organoids mit einer Kandidatenverbindung;
  • ii) Erhalten von spektrometrischen Daten vom Organoid oder einer Region davon, wie hierin andernorts beschrieben; und
  • iii) Analysieren der Daten, um eine oder mehrere Eigenschaften der Kandidatenverbindung zu ermitteln.

Das Organoid kann ein Organoid wie hierin andernorts beschrieben sein. Optional zeigt das Organoid oder eine Region davon einen Krankheitsstatusgenotyp und/oder -phänotyp. Für gewöhnlich ist die zu analysierende Eigenschaft die Wirkung der Verbindung auf den Krankheitsstatus des Organoids.

Kandidatenverbindungen, die gescreent werden können, umfassen optional Toxine, Zytokine, Neurotransmitter, Wachstumsfaktoren, Morphogene, Hemmer, Stimulatoren, Bakterien, Viren, DNA, Antisense-Nukleinsäuren, Arzneimittel, Peptide, natürliche Verbindungen und/oder beliebige der hierin andernorts aufgelisteten Verbindungen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Optional umfassen die Verfahren das Analysieren der Krankheitsstatus des Organoids nach dessen genetischer Modifikation, z. B. über Genombearbeitungstechniken.

Optional ist das Organoid in einem Kit vorhanden, der eine Mehrzahl (d. h. zumindest 6, optional 24, 48, 96 und sogar bis zu mehreren Tausend) von organisierten Geweben, die einzeln in einem Behälter enthalten sind.

Die Erzeugung und/oder Analyse von Organoiden wird nun unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen beschrieben, es sei jedoch verstanden, dass die nachstehend beschriebenen Grundsätze mutatis mutandis auf die Erzeugung und/oder Analyse eines beliebigen Typs oder von Organoiden gelten.

Optional kann das Organoid sektioniert und/oder sequentiell disassoziiert werden, z. B. mechanisch und/oder enzymatisch, z. B. mit Trypsin, um unterschiedliche Schichten eines Organoids zu erhalten und/oder Zellen von unterschiedlichen Schichten eines Organoids abzuleiten. Unterschiedliche Schichten oder Zellen, die von unterschiedlichen Schichten abgeleitet sind, des Organoids können sodann analysiert werden. Während des Wachstums und/oder Haltens des Organoids werden unterschiedliche Schichten eines Organoids ggf. unterschiedlichen Umgebungsbedingungen und/oder unterschiedlichen Konzentrationen einer Substanz ausgesetzt, da Substanzen nicht jede Schicht im gleichen Ausmaß durchdringen können. Somit kann das Verfahren optional verwendet werden, um eine oder mehrere unterschiedliche Schichten eines Organoids oder von davon abgeleiteten Zellen zu analysieren.

Humane Kolonkarzinomorganoide

Humane Kolonkarzinom-LIM1863-Zellen können als freischwimmende multizelluläre Kugeln (Organoide) gezüchtet werden, in der stark polarisierte Zellen sich um ein zentrales Lumen anordnen. Diese Organoide gleichen Kolonkrypten dahingehend, dass sie morphologisch differenzierte hochprismatische und Becherzellen enthalten. LIM1863-Zellen können in RPMI-1640-Medium, enthaltend 5 % FCS, α-Thioglycerol (10 µm), Insulin (25 Einheiten/l) und Hydrocortison (1 mg/l), mit 10 % CO2 bei 37 °C kultiviert werden.

Die LIM1863-Zellen (6 × 108 Zellen) können viermal mit 30 ml RPMI-1640-Medium gewaschen und für 24 h in 150 ml serumfreiem RPMI-Medium, supplementiert mit 0,6 % Insulin-Transferrin-Selen-Lösung, kultiviert werden.

Kulturmedium (CM) kann gesammelt und bei 4 °C (480 × g für 5 min, gefolgt von 2,000 × g für 10 min) zentrifugiert werden, um intakte Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Das CM kann bei 10,000 × g für 30 min zentrifugiert werden, um sMVs zu isolieren.

Gemäß einer Ausführungsform kann das CM unter Verwendung einer VacuCap® 60 Filtereinheit, ausgestattet mit einer 0,1-µm-Supor®Membran, filtriert werden und danach unter Verwendung einer Amicon® Ultra-15 Ultracel-Zentrifugalfiltervorrichtung mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze von 5000 auf 500 µl konzentriert werden.

Bauchspeicheldrüsenkrebsorganoide

Bauchspeicheldrüsenkrebs ist eine der tödlichsten Malignitäten, da er spät diagnostiziert wird und das Ansprechen auf eine Behandlung begrenzt ist. Lenkbare Verfahren zum Identifizieren und Untersuchen von Pathways, die an der Tumorgenese der Bauchspeicheldrüse umfasst sind, sind erwünscht. Bauchspeicheldrüsenorganoide können aus resezierten Tumoren und Biopsien schnell erzeugt werden, überleben eine Kryokonservierung und zeigen duktale und krankheitsstadienspezifische Charakteristika. Orthotopisch transplantiert neoplastische Organoide durchlaufen das vollständige Spektrum der Tumorentwicklung, indem sie Frühstadiumneoplasmen bilden, die zu lokal invasiven und metastatischen Karzinomen fortschreiten. Da sie genetisch manipuliert werden können, sind Organoide eine Plattform zum Untersuchen der genetischen Zusammenwirkung. Umfassende Transkriptions- und Proteomanalysen von murinen Bauchspeicheldrüsenorganoiden haben Gene und Pathways aufgezeigt, die während des Fortschreitens der Krankheit verändert werden. Die Bestätigung vieler dieser Proteinveränderungen in humanen Geweben zeigt, dass Organoide ein nützliches Modellsystem zum Entdecken wichtiger Charakteristika von Bauchspeicheldrüsenkrebs sind.

Humane Brustexplantatkultur

Das Brustexplantatkultursystem und das Brustepithelzellkultursystem stellen nützliche In-vitro-Modelle dar, um das Ansprechverhalten von nichtkanzerösem Brustgewebe auf Mittel, die die Zellproliferation, Zytodifferenzierung und neoplastische Transformation beeinflussen, auf molekularer, biochemischer und zellulärer Ebene zu untersuchen. Die Gewebekulturtechnologie und Biomarkerassays, die für die murinen Modelle entwickelt wurden, wurden in Bezug auf humanes Brustgewebe optimiert.

Explantatkulturen können aus der humanen terminalen duktulo-lobulären Einheit (TDLU) der Brust hergestellt werden, die aus chirurgischen Proben erhalten wird. Die TDLU sind die auf Endokrin ansprechenden und proliferativ aktiven intakten Organoide, die Zielgewebe für eine Karzinogenese darstellen.

Gemäß einer Ausführungsform können diese Organoide in einem chemisch definierten, serumfreien Waymouth-MB-752/1-Medium, supplementiert mit 5 pg/ml Insulin, 1 ng/ml E2, 2 mM L-Glutamin und Antibiotika, gehalten werden.

Das Medium kann routinemäßig alle 48 h gewechselt werden und die Kulturen können in einer befeuchteten Atmosphäre von 95 % Luft: 5 % CO2 bei 37 °C gehalten werden.

Gemäß einer Ausführungsform kann die humane 184-B5-Epithelzelllinie der Brust in chemisch definiertem, serumfreiem KBM-MEM-Medium, supplementiert mit 10 pg/ml Insulin, 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor, 10 pg/ml Transferrin, 0,5 pg/ml Hydrocortison und 5 pg/ml Gentamycin, gehalten werden (24, 25).

Das Medium kann routinemäßig alle 48 h gewechselt werden und die Zellen können durch eine 1:4-Teilung bei einer Konfluenz von ungefähr 70 % subkultiviert werden.

Xenotransplantate

Zellen und/oder Gewebe können optional für einen geeigneten Zeitraum in einen Wirtsorganismus xenotransplantiert werden, z. B. zumindest 1, 2 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 2, 23 oder 24 h und/oder 1, 2 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 2, 23 oder 24 Tage.. Beispielsweise können Zellen oder kann Gewebe, wie aus einem humanen Tumor erhalten, in ein Wirtstier xenotransplantiert werden. Optional kann das Verfahren das Herstellen eines Xenotransplantats und/oder Entfernen eines Xenotransplantats oder einer Probe davon aus einem Wirtsorganismus umfassen. Optional kann das Verfahren an einem bereitgestellten Xenotransplantat durchgeführt werden.

Optional kann das Xenotransplantat Tumorzellen umfassen oder aus diesen bestehen. Optional können Zellen aus einem Xenotransplantat erhalten werden, um eine xenotransplantatabgeleitete Zellpopulation zu bilden. Eine xenotransplantatabgeleitete Zellpopulation kann optional analysiert werden, z. B. um den Einfluss der Wirtsumgebung auf die Zellpopulation zu analysieren. Optional kann eine Zellpopulation vor und nach einer Xenotransplantation analysiert werden und/oder eine xenotransplantatabgeleitete Population kann mit einer nicht xenotransplantatabgeleiteten Zellpopulation verglichen werden.

Bildgebung

Gemäß den diversen Ausführungsformen hierin kann eine Ionenbildgebung verwendet werden, um ein Bild oder eine Karte einer oder mehrerer Eigenschaften des Ziels zu erzeugen, z. B. wenn das Ziel ein Organoid ist. Dies kann unter Verwendung der ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Aerosol, Rauch oder Dampf aus mehreren unterschiedlichen Regionen des Ziels; Ionisieren von Analyten im Rauch, Aerosol oder Dampf, aus den unterschiedlichen Regionen stammend, um Analytionen (oder davon abgeleitete Ionen, z. B. Fragmentionen) herzustellen; und danach Analysieren der Analytionen (oder davon abgeleiteten Ionen), um spektrometrische Daten für jede der Regionen des Ziels zu erhalten, erreicht werden. Die spektrometrischen Daten werden mit der Region des Ziels, auf die sie sich beziehen (d. h. aus der der Rauch, das Aerosol oder der Dampf stammen, der bzw. das die spektrometrischen Daten generiert hat), korreliert, um Bild- oder Kartendaten zu generieren. Ein Bild oder eine Karte des Ziels kann danach auf Basis der Bild- oder Kartendaten erzeugt werden. Beispielsweise können eine oder mehrere Eigenschaften jeder Region des Ziels anhand der spektrometrischen Daten ermittelt werden und diese können in die Bild- oder Kartendaten integriert und somit als Funktion von Position innerhalb des Ziels kartiert werden. Die Bild- oder Kartendaten können danach einem Benutzer angezeigt werden.

Die erste Vorrichtung kann zwischen mehreren beabstandeten Regionen des Ziels gestuft werden, um das Aerosol, den Rauch oder den Dampf aus einzelnen Regionen des Ziels zu erzeugen. Alternativ kann eine Mehrzahl von Vorrichtungen verwendet werden, um das Aerosol, den Rauch oder den Dampf aus einzelnen Regionen des Ziels zu erzeugen, optional gleichzeitig. Diese Mehrzahl von Vorrichtungen bewegt sich ggf. nicht über das Ziel, auch wenn sie sich in Kontakt mit dem Ziel bewegen und aus diesem lösen kann. Alternativ kann die erste Vorrichtung kontinuierlich über und durch das Ziel bewegt werden, um Aerosol, Rauch oder Dampf aus den unterschiedlichen Regionen des Ziels zu erzeugen. Beliebige Bewegungen der ersten Vorrichtung oder der Mehrzahl von Vorrichtungen können automatisiert und von einer Maschine gesteuert werden.

Die spektrometrischen Daten für jede Region können analysiert und in Daten umgewandelt werden, die für den Typ, die Bedingung oder den einen oder die mehreren Bestandteile des Materials in dieser Region im Ziel repräsentativ sind. Die repräsentativen Daten können danach als Bild oder Karte angezeigt werden, die den Typ, die Bedingung oder die Bestandteile des Materials als Funktion der Position im Ziel zeigen.

Beispielsweise können die repräsentativen Daten den Typ, die Höhe, das Vorhandensein und/oder Nichtvorhandensein von: erkranktem; kanzerösem; und/oder nekrotischem Material in jeder der Regionen im Ziel indizieren. Beispielsweise können die spektrometrischen Daten verwendet werden, um die Positionen von Rändern von erkranktem, kanzerösem und/oder nekrotischem Gewebe im Ziel zu identifizieren und/oder anzuzeigen. Diese Gewebetypen wie z. B. Tumorgewebe können normalem Gewebe stark gleichen und können undeutliche Grenzen aufweisen, wodurch es schwierig ist, zu ermitteln, wo der Tumor endet und das normale Gewebe beginnt. Das hierin bereitgestellte Verfahren ermöglicht das Identifizieren der Positionen solcher Geweberänder.

Zusätzlich oder alternativ können die spektrometrischen Daten verwendet werden, um die Position und/oder Ränder einer oder mehrerer Zell- oder Gewebetypen von Interesse zu identifizieren und/oder anzuzeigen. Beispielsweise kann der Zell- oder Gewebetyp von Interesse erkrankte/s und/oder kanzeröse/s und/oder nekrotische/s Gewebe oder Zellen im Ziel umfassen; und/oder kann der Zell- oder Gewebetyp von Interesse gesundes Gewebe oder gesunde Zellen umfassen.

Die repräsentativen Daten können den unterschiedlichen Typ von Zellen oder Bestandteilen im Ziel indizieren.

Zusätzlich oder alternativ können die repräsentativen Daten das Vorhandensein und/oder die Verteilung eines oder mehrerer Typen von Mikroben innerhalb des Ziels indizieren.

Zusätzlich oder alternativ können die repräsentativen Daten das Vorhandensein und/oder die Verteilung eines oder mehrerer Typen von Verbindungen innerhalb des Ziels indizieren.

Zusätzlich oder alternativ können die repräsentativen Daten den Typ oder Spiegel von Biomarker im Ziel indizieren und die Verteilung des Typs oder Spiegels von Biomarkern innerhalb eines Ziels kann identifiziert und/oder angezeigt werden.

Die Ionenbildgebungs- und Kartendaten können in Echtzeit generiert und/oder angezeigt werden.

Eine Ionenbildgebungs-Massenspektrometrietechnologie wie z. B. DESI-MS- und/oder REIMS-Technologie kann optional verwendet werden, um die spektrometrischen Daten für unterschiedliche Regionen des Ziels zu erhalten. Eine REIMS-Technologie-Vorrichtung kann optional im Schneide- und/oder Zeigermodus verwendet werden.

Gewisse Ionenbildgebungs-Massenspektrometrie-Technologien wie z. B. DESI-MS zerstören die Gesamtheit eines Organoids nicht, somit kann eine solche Technologie optional verwendet werden, um ein Organoid zu analysieren, wobei zumindest manche Zellen des Organoids das Analyseverfahren überleben.

Diese Ionenbildgebungsanalyse kann optional mit einer weiteren Analyse der Prüfprobe kombiniert werden. Details zu weiteren Analyseverfahren und -werkzeugen sind hierin andernorts zu finden. Optional können die Ergebnisse einer Massenspektrometriebildgebung mit den Ergebnissen einer weiteren Analyse korreliert werden.

Mehr Detail darüber, wie eine Ionenbildgebung durchzuführen ist, werden nachstehend unter Bezugnahme auf ein bestimmtes Beispiel der DESI-Bildgebung erörtert. Es wird verstanden, dass die spezifischen erörterten Parameter jene waren, die in einem Assay vom Erfinder verwendet wurden, und dass beliebige dieser Parameter variiert werden können.

Prüfproben wie z. B. infizierte Gewebeteilbereiche oder Zellkulturen, die auf eine Oberfläche eines standardmäßigen Glasmikroskopobjektträgers geschmiert sind, wurden einer DESI-MS-Bildgebungsanalyse unter Verwendung eines Exactive-Massenspektrometers (Thermo Fisher Scientific Inc., Bremen, Deutschland) unterzogen. Exactive-Instrumentparameter sind nachstehend Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden. aufgelistet. Thermo Exactive-Instrumentparameter, die bei einer DESI-MS-Bildgebung verwendet wurden.

Parameter EinstellungPolarität negativAuflösung 100.000Massenbereich 200–1050Sprühspannung –4,5kV Kapillarentemperatur 250 °C Kapillarenspannung –50 V Tubuslinsenspannung –150 V Abschöpferspannung –24 V Max. Injektionszeit 1000 ms Mikroabtastungen 1 AGC-Ziel 5e6

Methanol/Wasser (95:5 v/v) wurde als Elektrospraylösungsmittel bei einer Durchflussrate von 1,5 µl/min verwendet. Stickstoff N4.8 wurde als Zerstäubungsgas bei einem Druck von 7 bar verwendet. Alle Lösungsmittel hatten LC-MS-Klasse (Chromasolv, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA). Der Höhenunterschied zwischen der DESI-Sprüheinheit und der Probenoberfläche wurde auf 2 mm eingestellt, wobei der Abstand zwischen der Sprüheinheit und einem Schnüffler auf 14 mm eingestellt wurde. Der Abstand zwischen der Probenoberfläche und der Einlasskapillare des Massenspektrometers war << 1 mm. Der Winkel zwischen Sprüheinheitenspitze und der Probenoberfläche wurde auf 80° eingestellt. Der Sam melwinkel zwischen der Einlasskapillare und der Probe wurde auf 10° eingestellt.

Das allgemeine Prinzip, das Bildgebungsprozessen unter Verwendung von DESI-MS zugrunde liegt, ist, dass anstatt einer Punkt-für-Punkt-Abtastung horizontale Linienscans über die Prüfprobenoberfläche durchgeführt werden, indem die automatisierte Abtastungsplattform bei einer Geschwindigkeit bewegt wird, die den als Pixel bestimmten Bereich (räumliche Auflösung) in der Zeit abdeckt, die das Massenspektrometer benötigt, um einen vollständigen Scan durchzuführen (ein Massenspektrum zu erfassen). Dies führt zu einer Datei pro Zeile des entstehenden Bilds (Anzahl von Zeilen durch Teilen der Probenhöhe durch die räumliche Auflösung ermittelt).

Für eine Bildanalyse wurden einzelne horizontale Linienscans unter Verwendung des imzML Converter Version 1.1.4.5 (www.maldi-msi.org) in .imzML-Dateien umgewandelt. Einzelne Ionenbilder und RGB-Bilder wurden unter Verwendung von MSiReader Version 0.05(146) mit linearer Interpolation (Ordnung 1) und einer Bin-Größe von 0,005 Da erzeugt.

Biomarker

Das Verfahren kann optional das Analysieren eines oder mehrerer Biomarker umfassen. Ein Biomarker kann ein objektives, quantifizierbares Charakteristikum z. B. eines Zelltyps, eines Krankheitsstatus, einer Mikrobe, einer Verbindung und/oder eines biologischen Prozesses sein.

Der Ausdruck „Biomarker“ wird hierin manchmal explizit verwendet, es sei jedoch verstanden, dass beliebige der hierin erwähnten Analysen optional die Analyse eines Biomarkers sein können. Somit sollte z. B. jedwede Erwähnung eines Analysierens eines „Zelltyps“ optional als „Analysieren eines Biomarkers für einen Zelltyp“ verstanden werden; eine beliebige Erwähnung eines Analysierens eines „Phänotyps und/oder Genotyps“ sollte optional als „Analysieren eines Phänotyp- und/oder Genotypbiomarkers“ verstanden werden, usw.

Der Biomarker kann optional ein spektrometrischer Biomarker sein. Der Ausdruck „spektrometrischer Biomarker“ wird hierin verwendet, um sich auf spektrometrische Daten zu beziehen, die für einen Zelltyp, einen Krankheitsstatus, eine Mikrobe, eine Verbindung und/oder einen biologischen Prozess charakteristisch sind, der Einfachheit wegen kann jedoch ein spektrometrischer Biomarker einfach als „Biomarker“ bezeichnet werden.

Unter „für einen Zelltyp charakteristisch“ versteht sich, dass der Biomarker optional verwendet werden kann, um den Zelltyp zu analysieren, z. B. nachzuweisen, zu identifizieren und/oder zu charakterisieren. Optional kann der Biomarker verwendet werden, um zwischen Zellen, die aus unterschiedlichen Geweben stammen; zwischen genotypisch und/oder phänotypisch unterschiedlichen Zelltypen; zwischen einer tierischen Zelle und einer mikrobiellen Zelle; zwischen einer normalen und einer anomalen Zelle; zwischen einer Wildtyp- und einer mutierten Zelle; und/oder zwischen einer erkrankten und/oder gesunden Zelle zu unterscheiden.

Unter „für einen Krankheitsstatus charakteristisch“ versteht sich, dass der Biomarker optional verwendet werden kann, um den Krankheitsstatus eines Ziels zu analysieren. Optional kann der Biomarker verwendet werden, um zwischen gesunden und erkrankten Zellen zu unterscheiden; und/oder den Schweregrad, den Grad und/oder das Stadium einer Krankheit zu analysieren.

Unter „für eine Mikrobe charakteristisch“ versteht sich, dass der Biomarker optional verwendet werden kann, um die Mikrobe zu analysieren, z. B. nachzuweisen, zu identifizieren und/oder zu charakterisieren. Wie hierin andernorts erörtert, kann die Identifikation auf einer beliebigen Ebene erfolgen, z. B. auf taxonomischer Ebene. Ein Biomarker, der eine Identifikation einer Mikrobe als zu einer bestimmten taxonomischen Ebene gehörend ermöglicht, kann als „taxonomischer Marker“ oder „taxonomischer Biomarker“ bezeichnet werden. Somit kann ein taxonomischer Marker für ein Reich, ein Phylum, eine Klasse, eine Ordnung, eine Familie, eine Gattung, eine Spezies und/oder einen Stamm spezifisch sein.

Unter „für eine Verbindung charakteristisch“ versteht sich, dass der Biomarker optional verwendet werden kann, um die Verbindung zu analysieren, z. B. nachzuweisen, zu identifizieren und/oder zu charakterisieren.

Unter „für einen biologischen Prozess charakteristisch“ versteht sich, dass der Biomarker optional verwendet werden kann, um einen biologischen Prozess zu analysieren. Optional kann der Biomarker verwendet werden, um den Beginn, das Fortschreiten, die Geschwindigkeit, die Effizienz, die Spezifität und/oder das Ende eines biologischen Prozesses zu analysieren.

Unterschiedliche Zelltypen, Krankheitsstatus, Verbindungen, Mikroben, biologisches Fortschreiten und dergleichen können anhand des Vorhandenseins oder Nichtvorhandensein und/oder der relativen Abundanz einer oder mehrerer Verbindungen, die als Biomarker dienen können, charakterisiert werden. Jedwede Erwähnung eines Biomarkers hierin, der eine bestimmte Verbindung oder Klasse von Verbindungen ist, sollte als optional die spektrometrischen Daten dieser Verbindung oder Klasse von Verbindungen seiend verstanden werden.

Beispielsweise sollte eine Erwähnung eines „C24:1-Sulfatid-(C48H91NO11S)”-Biomarkers als Erwähnung der spektrometrischen Daten, die dem C24:1-Sulfatid (C48H91NO11S) entsprechen, verstanden werden, die z. B. ein Signal sein können, das m/z von ungefähr 888,6 entspricht; eine Erwähnung eines Biomarkers von „glykosyliertem Ceramid“ sollte hingegen als Erwähnung der spektrometrischen Daten, die dem glykosylierten Ceramid entsprechen, verstanden werden, die z. B. ein Signal sein können, das m/z von 842, 844 oder 846 entspricht.

Wie oben erläutert, kann ein Biomarker für einen Zelltyp, einen Krankheitsstatus, eine Mikrobe, eine Verbindung und/oder einen biologischen Prozess indikativ sein. Ein Biomarker, der für Krebs indikativ ist, kann daher als „Krebsbiomarker“ bezeichnet werden, ein Biomarker, der für Pseudomonas aeruginosa indikativ ist, kann als „Biomarker von Pseudomonas aeruginosa“ bezeichnet werden usw.

Optional kann ein spektrometrischer Biomarker als die spektrometrischen Daten einer bestimmten Verbindung oder Klasse von Verbindungen seiend identifiziert werden. Somit kann ein Signal, das einer bestimmten Masse, einem bestimmten m/z, einem bestimmten Ladungsstatus und/oder einer bestimmten Ionenmobilität entspricht (z. B. aufgrund der Querschnittsform oder -fläche), optional als für das Vorhandensein einer bestimmten Verbindung oder Klasse von Verbindungen indikativ seiend identifiziert werden.

Optional kann ein spektrometrisches Signal sogar dann als Biomarker dienen, wenn nicht ermittelt wurde, welche bestimmte Verbindung oder Klasse von Verbindungen zu diesem Signal geführt hat. Optional kann ein Muster von spektrometrischen Signalen sogar dann als Biomarker dienen, wenn nicht ermittelt wurde, welche bestimmten Verbindungen oder Klasse von Verbindungen zu einem oder mehreren Signalen in diesem Muster oder beliebigen der Signale in einem Muster geführt hat.

Die hierin offenbarte Arbeit hat zur Identifikation eines Bereichs von Biomarkern geführt sowie die Identifikation weiterer Biomarker ermöglicht. Optional kann der Biomarker aus beliebigen der hierin offenbarten Biomarker ausgewählt sein, darunter beliebige aus den Beispielen und/oder Tabellen. Optional kann der Biomarker ein Biomarker der substituierten oder unsubstituierten Form beliebiger der hierin erwähnten Biomarker sein; und/oder einer Ether-, Ester-, phosphorylierten und/oder glykosylierten Form oder eines anderen Derivats beliebiger der hierin erwähnten Biomarker sein.

Optional kann der Biomarker ein Biomarker eines Lipids; eines Proteins; eines Kohlenhydrats; eines DNA-Moleküls; eines RNA-Moleküls; eines Polypeptids wie z. B. eines ribosomalen Peptids oder eines nichtribosomalen Peptids; eines Oligopeptids; eines Lipoproteins; eines Lipopeptids; einer Aminosäure; und/oder einer chemischen Verbindung, optional eines organischen chemischen Moleküls oder eines anorganischen chemischen Moleküls, sein.

Ein Biomarker kann optional das deutliche Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer bestimmten Verbindung sein, was sich optional selbst als Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines spektrometrischen Signals manifestieren kann, das einer spezifischen Masse, einem spezifischen Ladungsstatus, einem spezifischen m/z und/oder einer spezifischen Ionenmobilität entspricht.

Ein Biomarker kann optional die relative Abundanz eines bestimmten Biomoleküls oder einer bestimmten Verbindung sein, was sich optional selbst als relative Intensität eines spektrometrischen Signals manifestieren kann, das einer spezifischen Masse, einem spezifischen Ladungsstatus, einem spezifischen m/z und/oder einer spezifischen Ionenmobilität entspricht.

Ein Biomarker kann optional die relative Abundanz einer oder mehrerer Verbindungen sein, was sich optional selbst als relative Intensität von zwei oder mehr spektrometrischen Signalen manifestieren kann, die zwei oder mehr Massen, Ladungsstatus, m/z und/oder Ionenmobilität entsprechen.

Somit kann ein Biomarker optional ein erhöhter oder verringerter Spiegel einer oder mehrerer Verbindungen, z. B. eines Metaboliten, eines Lipopeptids und/oder einer Lipidspezies, sein, was sich optional selbst als Erhöhung und/oder Verringerung der Intensität von zwei oder mehr spektrometrischen Signalen manifestieren kann, die zwei oder mehr Massen, Ladungsstatus m/z und/oder Ionenmobilität entsprechen.

Das Vorhandensein, das Nichtvorhandensein und die relative Abundanz einer Vielzahl von Verbindungen kann als molekularer „Fingerabdruck“ oder molekulares „Profil“ bezeichnet werden. Die Gesamtheit der Lipide einer Zelle kann als lipidomischer Fingerabdruck/lipidomisches Profil bezeichnet werden, die Gesamtheit von Metaboliten, die von einer Zelle hergestellt werden, kann hingegen als metabolomischer Fingerabdruck/metabolomisches Profil bezeichnet werden.

Somit kann der Biomarker ein molekularer Fingerabdruck sein, z. B. ein Lipidfingerabdruck und/oder ein metabolomischer Fingerabdruck, insbesondere z. B. (i) ein lipidomisches Profil; (ii) ein Fettsäureprofil; (iii) ein Phospholipidprofil; (iv) ein Phosphatidsäure-(PA)-Profil; (v) ein Phosphatidylethanolamin-(PE)-Profil; (vi) ein Phosphatidylglycerol-(PG)-Profil; (vii) ein Phosphatidylserin-(PS)-Profil; oder (viii) ein Phosphatidylinositol-(PI)-Profil.

Beispielsweise ist Phosphatidylglycerol bei beinahe allen Bakterientypen zu finden, es kann jedoch in unterschiedlichen Bakterien in unterschiedlichen relativen Mengen vorhanden sein. Phosphatidylglycerol ist in den meisten tierischen Geweben ggf. in einer Höhe von nur 1–2 % vorhanden. Es kann daher ein Biomarker für Bakterien in einer tierischen Prüfprobe und/oder ein Biomarker für spezifische Bakterientypen sein.

Der Biomarker kann optional ein direkter Biomarker oder ein indirekter Biomarker sein. Unter „direkter“ Biomarker versteht sich, dass die spektrometrischen Daten direkt aus dem Biomarker generiert werden. Beispielsweise wenn eine bestimmte Verbindung ein spezifisches spektrometrisches Signal oder Signalmuster aufweist, liefert das Erhalten dieses Signals oder Signalmusters aus einer Probe eine direkte Information zum Vorhandensein dieser Verbindung. Dies kann z. B. bei einem Metaboliten der Fall sein, der von einer Zelle oder Mikrobe in signifikanten Mengen hergestellt wird. Optional können die spektrometrischen Daten aus der Verbindung bei einem solchen Beispiel alternativ oder zusätzlich als indirekter Biomarker für die Zelle oder Mikrobe dienen, die diese Verbindung herstellt.

Unter „indirekter“ Biomarker versteht sich, dass die spektrometrischen Daten aus einem oder mehreren Biomarkern generiert werden, die für eine bestimmte Verbindung, einen bestimmten biologischen Prozess und/oder einen bestimmten Typ von Mikrobe oder Zelle indikativ sind. Somit ist ein indirekter Biomarker spektrometrische Daten, die aus einem oder mehreren Molekülen generiert werden, die Informationen zu einem unterschiedlichen Molekül bereitstellen. Beispielsweise kann ein molekularer Fingerabdruck wie z. B. ein Lipidfingerabdruck für die Expression eines bestimmten Proteins, z. B. eines Rezeptors; oder eines bestimmten Zelltyps oder Mikrobentyps indikativ sein.

Ein Lipidbiomarker kann optional aus z. B. Fettsäuren, Glycerolipiden, Sterollipiden, Sphingolipiden, Prenollipiden, Saccharolipiden und/oder Phospholipiden ausgewählt sein. Ein kurzer Überblick über diverse Lipide ist nachstehend gegeben, es sei jedoch verstanden, dass ein beliebiges bestimmtes Lipid in mehr als eine der hierin erwähnten Gruppen fallen kann.

Eine Fettsäure ist eine aliphatische Monocarbonsäure. Die Fettsäure kann optional eine Kohlenstoffkette aufweisen, die genau oder zumindest 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36, 38 oder 40 Kohlenstoffe umfasst. Sie kann optional einfach ungesättigt, mehrfach ungesättigt oder gesättigt sein. Sie kann optional ein Eicosanoid sein. Sie kann z. B. Ölsäure, Palmitinsäure, Arachidonsäure, ein Prostaglandin, eine Prostacyclin, ein Thromboxan, ein Leukotrien oder eine Epoxyeicosatriensäure sein.

Das Glycerolipid kann optional aus z. B. Monoacylglycerol, Diacylglycerol und/oder Triacylglycerol ausgewählt sein.

Das Sterol kann optional aus freien Sterolen, acylierten Sterolen (Sterolestern), alkylierten Sterolen (Sterylalkylethern), sulfatierten Sterolen (Sterolsulfat), Sterolen, die mit einer Glykosideinheit verknüpft sind (Sterylglykoside), und/oder acylierte Sterole, die mit einer Glycosideinheit verknüpft sind (acylierte Sterolglykoside), ausgewählt sein.

Das Sterol kann optional eine aliphatische Seitenkette von genau oder zumindest 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 10, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 20, 35 oder 40 Kohlenstoffatomen aufweisen. Die Anzahl von Kohlenstoffatomen in der aliphatischen Seitenkette kann als Buchstabe C, auf den die Zahl folgt, z. B. C27 für Cholesterin, ausgedrückt werden. Es kann z. B. aus Cholesterin, Cholesterinsulfat, Ergosterol, Lanosterol, Dinosterol-(4a,23,24-trimethyl-5a-cholest-22E-en-3b-ol), Oxysterol und/oder einem Derivat eines beliebigen davon ausgewählt sein.

Ein Phosphoplipid kann zwei Fettsäuren, eine Glyceroleinheit, eine Phosphatgruppe und ein polares Molekül umfassen. Das Phospholipid kann optional einen Ester, einen Ether und/oder ein anderes O-Derivat von Glycerol umfassen. Das Phospholipid kann optional aus z. B. Phosphatidylglycerol, Diphosphatidylglycerol (Cardiolipin), Acylphosphatidylglycerol (1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phospho-(3'-acyl)-1'-sn-glycerol) und/oder Plasmalogen ausgewählt sein.

Das Phosphatidylglycerollipid kann optional aus Phosphatidsäuren (PAs), Phosphatidylethanolaminen (PEs), Phosphatidylglycerolen (PGs), Phosphatidylcholinen (PCs), Phosphatidylinositolen (PIs) und/oder Phosphatidylserinen (PSs) ausgewählt sein.

Ein Sphingolipid ist ein Lipid, das ein Sphingoid enthält. Es kann optional aus z. B. einem Ceramid, d. h. einem N-acylierten Sphingoid; Sphingomyelin, d. h. einem Ceramid-1-phosphocholin; Phosphoethanolamindihydroceramid und/oder einem Glykosphingolipid, d. h. einem Lipid, das ein Sphingoid und einen oder mehrere Zucker enthält, ausgewählt sein. Beispielsweise kann es optional ein glykosyliertes Ceramid sein.

Der Biomarker kann optional ein Metabolit wie z. B. ein primärer oder ein sekundärer Metabolit; ein Antibiotikum; ein Quorum-Sensing-Molekül; ein Fettsäuresynthaseprodukt; ein Pheromon; und/oder ein Biopolymer sein.

Eine Biomarkerverbindung kann optional durch eine oder mehrere der folgenden funktionellen Gruppen gekennzeichnet sein: Alkohol, Ester, Alkan, Alken, Alkyn, Ether, Keton, Aldehyd, Anhydrid, Amin, Amid, Nitril, aromatisch, Carbonsäure, Alkylhalid und/oder Carbonyl. Optional kann sie zusätzlich als primär, sekundär oder tertiär identifiziert werden, z. B. als primärer Alkohol, sekundäres Amin oder dergleichen.

Beispielsweise kann sie optional ein Terpen; Prenylchinon; Sterol; Terpenoid; Alkaloid; Glykosid; Surfactin; Lichenysin, 2-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon oder 2-Heptyl-3,4-dihydroxychinolin (PQS- oder Pseudomonas-Chuinolon-Signal); 4-Hydroxy-2-heptylchinolin (HHQ); Phenol wie z. B. ein natürliches Phenol; Phenazin; Biphenyl; Dibenzofurane; Betalactam; Polyketid; Rhamnolipid; Mykolsäuren; und/oder Polyhydroxyalkanoate; sein.

Der Biomarker kann optional aus z. B. Glycerophosphocholinen, Sphingomyelinen, Glycerophospholipiden, Galaktoceramiden, Glycerophosphoinositolen, Glycerophosphoserinen, Glycerophosphoglycerolen, Cholesterinsulfat, Sulfatiden, Seminolipiden, Zitronensäure, Glycerophosphoethanolaminen, Glycerophosphoethanolaminen, 2-Hydroxygluterat, Glutamin, Glutamat, Succinat, Fumarat, Palmitoylglycin, Ubiquinonen, Gadoteridol und/oder beliebigen der anderen Biomarker, die hierin erwähnt sind, einschließlich beliebiger aus den Tabellen, ausgewählt sein.

Die Erfinder haben unter anderem die folgenden Biomarker identifiziert:
Mykolsäuren für Bakterien der Unterordnung Corynebacterineae wie z. B. Mycobacterium spp., Corynebacterium spp. und Rhodococcus spp. Insbesondere wurden die folgenden Mykolsäuren aus den entsprechenden Gattungen nachgewiesen:
Mycobacterium spp.: C77-C81 (mit gerader und ungerader Zahl, 0–2 Unsättigungen);
Corynebacterium spp.: C28-C36 (mit gerader Zahl, 0–2 Unsättigungen);
Nocardia spp.: C48-C56 (mit gerader Zahl, 0–3 Unsättigungen);
Rhodococcus spp.: C28-C38 (mit gerader und ungerader Zahl, 0–4 Unsättigungen).

Eine Vielzahl von Sphingolipidspezies wurde als für Mitglieder des Phylum Bacteriodetes spezifisch befunden. Diese Sphingolipide umfassen oxidierte Ceramidspezies, Phosphoethanolamindihydroceramide und C15:0-substituierte Phosphoglyceroldihydroceramide und Dihydroceramid. Unter diesen Sphingolipidspezies wurde eine Reihe von galaktosylierten Sphingolipiden als für Bacteroides fragilis (Bacteroides-fragilis-alpha-Galaktosylceramides) spezifisch befunden.

Unter den Bakterien sind Plasmalogene für anaerobe Bakterien wie z. B. Clostridium spp. und Fusobacterium spp. hochspezifisch. Dies ist darauf zurückzuführen, dass aerobe Bakterien den biochemischen Pathway verloren haben, der für eine Plasmalogensynthese erforderlich ist. Der Mensch ist in der Lage, Plasmalogene zu synthetisieren (auch wenn über einen anderen biochemischen Pathway als Anaeroben), obwohl diese im Allgemeinen als eine längere Kettenlänge als bakterielle Plasmalogene aufweisend befunden wurden.

Andere Biomarker, die für eine gewisse Gruppe von Bakterien indikativ sind, umfassen z. B. Lipopeptide, die von gewissen Bacillus-Gattungen spezifisch hergestellt werden, wie z. B. Surfaction für B. subtilis und Lichenysin für B. licheniformis. Die Herstellung dieser zwei Moleküle ermöglicht auch eine direkte Differenzierung dieser ansonsten sehr eng verwandten Bakterien. Ein weiteres Beispiel umfasst PQS-abgeleitete Quorum-Sensing-Moleküle und Mono- und Di-rhamnolipid-Spezies, die für Pseudomonas aeruginosa festgestellt wurden.

Quorum-Sensing ist eine Form einer Zell-zu-Zell-Kommunikation, die auf dem Grundsatz basiert, dass, wenn eine einzelne Mikrobe Quorum-Sensing-Moleküle in die Umgebung freisetzt, die Konzentration dieser Moleküle zu gering ist, um nachgewiesen zu werden. Wenn jedoch ausreichend Bakterien vorhanden sind, erreichen Konzentrationen von Quorum-Sensing-Molekülen einen Schwellenwert, der den Mikroben das Erfassen einer kritischen Zellmasse und in Reaktion darauf das Aktivieren oder Unterdrücken bestimmter Gene ermöglicht. Quorum-Sensing-Moleküle können daher auch als Autoinduktoren bezeichnet werden. Pathogene können Quorum-Sensing-Moleküle als Virulenzfaktoren verwenden.

Ein paar Beispiele für Quorum-Sensing-Moleküle sind oben aufgelistet. Weitere Beispiele umfassen N-Acylhomoserinlactone (N-Acyl-HSLs) wie z. B. 3-Oxo-C8-HSL, 3-Oxo-C10-HSL oder 3-Oxo-C12-HSL; Diketopiperazin; 3-Hydroxypalmitinsäuremethylester; und peptidbasierte Quorum-Sensing-Moleküle wie z. B. jene von Staphylococcus aureus, wobei es sich um ein Oligopeptid handelt, das als das autoinduzierte Peptid (AIP) bezeichnet wurde, das vom Gen agrD codiert wird. Das aktive AIP hat 7–9 Aminosäuren und einen 5-gliedrigen Thiolactonring.

Beispielsweise können Sphingomyelinlipide optional ein Biomarker sein, z. B. für Krebs, kann Ergosterol optional ein Biomarker sein, z. B. für Pilze; kann Dinosterol optional ein Biomarker sein, z. B. für Dinoflagellaten; kann Cholesterinsulfat optional ein Biomarker sein, z. B. für Krebs; kann 2-Hydroxygluterat optional ein Biomarker sein, z. B. für Krebs; und/oder können ein oder mehrere Sulfatide optional ein Biomarker sein, z. B. für Krebs, z. B. Astrozytom. Optional kann das Sulfatid aus C48H91NO11S, C48H92NO12S und/oder C50H94NO11S ausgewählt sein.

Iso-C15:0-substituierte Phosphoglyceroldihydroceramide können für die Porphyromonadaceae-Familie spezifisch sein. m/z = 566,4790 kann ein Biomarker für Mitglieder der Klasse der Flavobakterien sein.

Krankheiten

Wie hierin andernorts erwähnt, kann die Zellpopulation erkrankt sein, z. B. kann sie aus erkranktem Gewebe stammen und/oder manipuliert worden sein, so dass sie erkrankt.

Die Analyse kann sich optional auf eine Krankheit oder ein Leiden beziehen, wie z. B. beliebige der in diesem Abschnitt und/oder hierin andernorts aufgelisteten Krankheiten oder Leiden. Die Ausdrücke „Krankheit“ und „Leiden“ werden hierin miteinander austauschbar verwendet.

Die Krankheit kann optional ein Hautleiden sein, das optional z. B. aus Akne, Alopezie, Furunkeln, Morbus Bowen, bullösem Pemphigoid (BP), Karbunkel, Cellulite, Frostbeulen, Zysten, Morbus Darier, Dermatits, Dermatomyositis, Ekzem, Erythem, Exanthem, Follikelentzündung, Kälteschaden, Herpes, Ichtyose, Eiterflechte, Hautwolf, Keratose, Lichen ruber planus, linearer IgA-Krankheit, Melanom, Leberflecken, Onychonmykose, Papillom, Petechien, Prurigo, Psoriasis, Rosazea, Krätze, Sklerodermie, Talgzysten, Gürtelrose/Windpocken, Teleangiektasie, Urtikaria (Nesselausschlag), Warzen und/oder Xerodermie ausgewählt sein kann.

Die Krankheit kann optional ein Leberleiden sein, das optional aus z. B. Hepatitis, Fettleberkrankheiten, alkoholbedingter Hepatitis, Lebersklerose und/oder Leberzirrhose ausgewählt sein kann.

Die Krankheit kann optional ein Lungenleiden sein, das optional aus z. B. Asthma, Atelektase, Bronchitis, chronisch-obstruktiver Lungenkrankheit (COPD), Emphysem, Lungenkrebs, Pneumonie, Lungenödem, Pneumothorax und/oder Lungenembolus ausgewählt sein kann.

Die Schilddrüse ist eine endokrine Drüse, die für gewöhnlich Thyroxin (T4) und Triiodthyronin (T3) herstellt. Die Krankheit kann optional ein Schilddrüsenleiden sein, das optional z. B. Schilddrüsenunterfunktion oder Schilddrüsenüberfunktion sein kann.

Die Krankheit kann optional ein Krebs oder Tumor sein, der optional aus z. B. Karzinomen, Sarkomen, Leukämien, Lymphomen und Gliomen ausgewählt sein kann.

Mehr im Detail kann sie optional aus z. B. akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), akuter myeloischer Leukämie (AML), adrenokortikalem Karzinom, Adenom, Analkrebs, Blinddarmkrebs, Astrozytomen, Basalzellkarzinom, Gallengangkrebs, Birch-Hirschfeld-Tumor, Blastom, Blasenkrebs, Knochenkrebs, Ewing-Sarkom, Osteosarkom, malignem fibrösem Histiozytom; Hirnstammgliom, Hirnkrebs, Glioblastoma multiforme (GBM), Astrozytomen, Rückenmarkskrebs, Kraniopharyngiom, Brustkrebs, Bronchientumor, Burkittlymphom, karzinoidem Tumor, Zervikalkrebs, Cholangiokarzinom, Chordom, chronischer lymphozytärer Leukämie (CLL), chronischer myeloischer Leukämie (CML), chronischen myeloproliferativen Neoplasmen, Kolonkrebs, Kolorektalkrebs, Kraniopharyngiom, Kindesalter, duktalem Karzinom in situ (DCIS), Endometriumkrebs, Ependymom, Speiseröhrenkrebs, Estesioneuroblastom, Fibroadenom, intraokularem Melanom, Retinoblastom, Eileiterkrebs, Gallenblasenkrebs, Magenkrebs, Germinom, Haarzellleukämie, Kopf-Hals-Krebs, Herzkrebs, Hepatokarzinom, Hodgkin-Lymphom, Hypopharynxkrebs, Kahler, Kaposi-Sarkom, Nierenkrebs, Kehlkopfkrebs, Leiomyom, Lippen- und Mundhöhlenkrebs, Leberkrebs, Lungenkrebs (wie z. B. nicht kleinzellig oder kleinzellig), Lymphom, Lymphoblastom, Brustkrebs des Mannes, malignem fibrösem Histiozytom des Knochens, Melanom, Melanomkarzinom, Medulloblastom, Merkel-Zell-Karzinom, Mesotheliom, Mundkrebs, Myelom, multiplem Myelom, Mycosis fungoides, myeloproliferativer Störung, Nasenhöhlen- und Nasennebenhöhlenkrebs, Nasenrachenkrebs, Neuroblastom, Nephroblastom, Non-Hodgkin-Lymphom, Mundkrebs, Mund- und Rachenraumkrebs, Osteosarkom, Eierstockkrebs, Nebenschilddrüsenkrebs, Peniskrebs, peritonealem Krebs, Rachenkrebs, Pheochromozytom, Pineoblastum, Hypophysentumor, Prostatakrebs, Rektalkrebs, Retinoblastom, Rhabdomyosarkom, Speicheldrüsenkrebs, Sézary-Syndrom, Hautkrebs, Seminom, Teraton, Hodenkrebs, Halskrebs, Schilddrüsenkrebs, thorakaler Krebs, Harnröhrenkrebs, Vaginalkrebs, Vulvakrebs, Waldenström-Makroglobulinämie und/oder Wilms-Tumor ausgewählt ist. In der obigen Liste sollte jede Erwähnung von „Krebs“ oder „Tumor“ als eine Erwähnung von „Krebs und/oder Tumor“ dieses Typs umfassend verstanden werden.

Optional kann ein Hirnkrebs ein Glioblastoma multiforme, Glioblastom, Riesenzellglioblastom, rezidivierendes Glioblastom, anaplastisches Astrozytom, Oligodendrogliom und/oder diffuses Astrozytom sein.

Wenn der Krebs Brustkrebs ist, kann er optional z. B. aus duktalem Karzinom in situ (DCIS), lobulärem Karzinom in situ (LCIS), invasivem Brustkrebs (NST), invasivem lobulärem Brustkrebs, entzündlichem Brustkrebs, Brustkrebs in Assoziation mit Morbus Paget und Angiosarkom der Brust ausgewählt sein.

Der Krebs kann optional durch eine Mutation oder andere genetische Variation verursacht, damit assoziiert und/oder dadurch gekennzeichnet sein, die optional zu der veränderten Expression eines Moleküls, z. B. eines Moleküls, das ein Lipid umfasst oder daraus besteht, wie z. B. ein Glykolipid oder Phospholipid; eines Kohlenhydrats; DNA; RNA; eines Proteins; eines Polypeptids wie z. B. eines ribosomalen Peptids oder eines nichtribosomalen Peptids; eines Oligopeptids; eines Lipoproteins; eines Lipopeptids; einer Aminosäure; und/oder einer chemischen Verbindung, optional einer organischen chemischen Verbindung, führt. Insbesondere kann eine Mutation optional zu der veränderten Expression eines Proteins und/oder Metaboliten führen.

Ein Krebs kann optional einen oder mehrere Metaboliten exprimieren, die als Biomarker für diesen Krebs dienen können. Beispielsweise kann sich optional ein Metabolit wie z. B. Succinat, Fumarat, 2-HG und/oder ein beliebiger der anderen hierin erwähnten Metaboliten bei einem Krebs ansammeln.

Krebssubtypen können optional identifiziert werden, z. B. auf Basis einer solchen geänderten Expression. Beispielsweise kann optional ein Krebs auf Basis der Expression oder fehlenden Expression eines Rezeptors als von einem bestimmten Subtyp seiend identifiziert werden, z. B. ausgewählt aus Östrogenrezeptoren (ER), Progesteronrezeptoren (PRs) und Rezeptor 2 des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (HER2). Ein Krebs kann daher z. B. als ER-negativ bezeichnet werden, wenn er einen Mangel an ER-Expression zeigt; oder kann als dreifach negativer Brustkrebs (TNBC) bezeichnet werden, wenn er ER-, PR- und Her2-negativ ist.

Die Mutation kann optional in einem Gen sein, das für Isocitratdehydrogenase 1 (IDH1) und/oder 2 (IDH2) codiert, wobei mutierte Enzyme erhalten werden, die in der Lage sind, Alphaketoglutarat zu 2-Hydroxyglutarat (2-HG) umzuwandeln. Eine solche Mutation kann optional z. B. bei einem Gliom, intrahepatischem Cholangiokarzinom, akuter myeloischer Leukämie (AML) und/oder Chondrosarkomen auftreten. 2-HG kann somit als Onkometabolit bezeichnet werden. 2-HG kann in normalen Geweben in sehr kleinen Mengen vorhanden sein, in mutierten Tumoren hingegen kann es in hohen Konzentrationen vorhanden sein, z. B. mehrere Mikromol pro Gramm Tumor.

Somit kann ein Krebsuntertyp einen spezifischen Biomarker aufweisen. Das hierin bereitgestellte Verfahren kann optional das Analysieren eines Krebsuntertyps umfassen.

Das Verfahren kann optional das Analysieren des Phänotyps und/oder Genotyps eines Krebses umfassen, was optional das Analysieren beliebiger der oben erörterten Mutationen umfassen kann.

Die Krankheit kann optional eine Nekrose sein, die optional durch z. B. Verletzung, Infektion, Krebs, Infarkt, Toxine, Entzündung, mangelnde angemessene Versorgung einer Wunde, Frostbeulen, Diabetes und/oder Arteriosklerose verursacht sein oder damit assoziiert sein kann. Optional kann die Nekrose eine Nekrose von kanzerösem oder nichtkanzerösem Gewebe sein. Die Nekrose kann optional z. B. koagulativ, verflüssigend, käsig, Fettnekrose, fibrinoide Nekrose und/oder gangränöse Nekrose sein.

Die Krankheit kann optional aus einer Autoimmunstörung, einer Entzündungskrankheit, tropischer Sprue, einer Lebensmittelintoleranz, einer Infektion, einem Krebs und/oder beliebiger der hier erwähnten Störungen ausgewählt sein.

Mehr im Detail kann die Krankheit optional aus z. B. Asthma, Zöliakie, Gastritis, peptidischer Duodenitis, glutenempfindlicher Enteropathie; Allergie und/oder Intoleranz in Bezug auf ein Allergen, z. B. Milch, Soja, eine oder mehrere Baumnüsse, Ei, Weizen, Fleisch, Fisch, Schalentiere, Erdnüsse, Samen wie z. B. Sesam, Sonnenblumen und/oder Mohnsamen, Knoblauch, Senf, Koriander und/oder Zwiebel; Hashimoto-Thyroiditis; Reizdarmsyndrom; Morbus Grave; reaktiver Arthritis; Psoriasis; multipler Sklerose; systemischem Lupus erythematodes (SLE oder Lupus); ankylosierender Spondylitis, progressiver systemischer Sklerose (PSS); Glomerulonephritis; autoimmuner Enteropathie; IgA-Mangel; allgemeine variable Immundefizienz; Morbus Crohn; Kolitis wie z. B. lymphozytärer Kolitis; kollagener Kolitis und/oder ulzerativer Kolitis; diffuser lymphozytärer Gastroenteritis; Ulzer; intestinalem T-Zelllymphom; Infektion, z. B. Pharyngitis; Bronchitis und/oder Infektion mit einer Mikrobe, z. B. ausgewählt aus Giardien, Kryptosporidium, Helicobacter und/oder beliebigen der anderen hierin erwähnten Mikroben, ausgewählt sein.

Das Verfahren kann optional das Analysieren von Stoffwechselunterschieden zwischen diversen Leiden ermöglichen.

Analyse und/oder Behandlung einer Krankheit

Das hierin bereitgestellte Verfahren kann optional verwendet werden, um eine Krankheit zu studieren. Beispielsweise kann die Zellpopulation als In-vitro- oder Ex-vivo-Modell einer Krankheit dienen. Optional kann die Zellpopulation von einem Subjekt abgeleitet sein und/oder von einem Xenotransplantat abgeleitet sein.

Somit kann optional eine Zellpopulation mit einer bestimmten Krankheit verwendet werden, um das Fortschreiten dieser Krankheit auf Zellebene zu überwachen. Optional kann die Zellpopulation manipuliert, mutiert und/oder einer Substanz und/oder Umgebungsbedingung ausgesetzt werden, wie hierin andernorts erörtert, und die Wirkung daraus kann analysiert werden, um die Wirkung einer solchen Manipulation, Mutation, Substanz und/oder Umgebungsbedingung auf eine Krankheit zu ermitteln.

Das Verfahren kann optional verwendet werden, um das Fortschreiten einer Krankheit zu überwachen. Das Verfahren kann optional verwendet werden, um die Wirksamkeit einer therapeutischen oder Testsubstanz zu bewerten.

Optional kann eine serielle (periodische) Analyse eines Ziels einer Änderung verwendet werden, um zu bewerten, ob eine therapeutische oder Testsubstanz wirksam war; das Ausmaß zu bewerten, in dem eine therapeutische oder Testsubstanz wirksam war; zu bewerten, ob eine Krankheit rezidivierend oder in der Zellpopulation fortschreitend ist; und/oder den wahrscheinlichen klinischen Ausgang (Prognose) der Krankheit für ein Subjekt zu bewerten.

Jedwede Erwähnung eines „Subjekts“ soll in diesem Kontext ein Subjekt mit der Krankheit sein, für die die Zellpopulation als Modell dient.

Optional umfassen beliebige der hierin bereitgestellten Verfahren auch einen Schritt des Ermittelns, ob ein Subjekt eine Behandlung mit einer therapeutischen Substanz erhalten sollte, z. B. der an der Zellpopulation getesteten Substanz.

Geeignete Behandlungen oder Substanzen werden hierin andernorts erörtert. Insbesondere wenn das Verfahren ein Ermitteln, dass eine Krankheit wahrscheinlich auf eine Behandlung ansprechen wird, und/oder dass eine erkrankte Zellpopulation auf eine Behandlung angesprochen ist, umfasst, kann das Verfahren sodann einen Schritt des Ermittelns, dass ein Subjekt eine entsprechende Behandlung erhalten sollte, umfassen.

Optional können beliebige der hierin bereitgestellten Verfahren in Bezug auf ein Subjekt, das eine Behandlung erhält oder erhalten hat, auch einen Schritt des Ermittelns, ob die Behandlung verändert oder beendet werden sollte, auf Basis des Ansprechens auf die Behandlung, wie für die Modellzellpopulation ermittelt, umfassen. Beispielsweise kann das Verfahren optional einen Schritt des Ermittelns, dass die Behandlungsdosis und/oder -häufigkeit erhöht oder verringert werden sollte, umfassen. Insbesondere wenn das Verfahren ein Ermitteln, dass ein oder mehrere Biomarker für eine Krankheit in der Modellzellpopulation erhöht sind, sich über die Zeit hinweg erhöht haben oder sich in Reaktion auf eine Behandlung nicht verringert (oder nicht ausreichend verringert) haben, umfasst, kann das Verfahren sodann optional einen Schritt des Ermitteln, dass die Behandlungsdosis und/oder -häufigkeit erhöht werden sollte, umfassen; und wenn das Verfahren ein Ermitteln, dass ein oder mehrere Biomarker für eine Krankheit in der Modellzellpopulation nicht erhöht sind, sich über die Zeit hinweg verringert haben oder sich in Reaktion auf eine Behandlung verringert haben, umfasst, kann das Verfahren sodann optional einen Schritt des Ermittelns, dass die Behandlungsdosis und/oder -häufigkeit verringert werden sollte oder dass die Behandlung beendet werden sollte, umfassen; oder umgekehrt.

Das Verfahren kann einen Schritt des Ermittelns, dass eine bestimmte Behandlung durch eine andere Behandlung ersetzt werden sollte, umfassen, z. B. dass ein Arzneimittel durch ein anderes Arzneimittel ersetzt werden sollte. Insbesondere wenn das Verfahren ein Ermitteln, dass ein oder mehrere Biomarker für eine Krankheit in der Modellzellpopulation erhöht sind, sich über die Zeit hinweg erhöht haben oder sich in Reaktion auf eine Behandlung nicht verringert (oder nicht ausreichend verringert) haben, umfasst, kann das Verfahren sodann einen Schritt des Ermitteln, dass Behandlung durch eine andere Behandlung ersetzt werden sollte, umfassen; und wenn das Verfahren ein Ermitteln, dass ein oder mehrere Biomarker für eine Krankheit in der Modellzellpopulation nicht erhöht sind, sich über die Zeit hinweg verringert haben oder sich in Reaktion auf eine Behandlung verringert haben, umfasst, kann das Verfahren sodann einen Schritt des Ermittelns, dass die Behandlung nicht durch eine andere Behandlung ersetzt werden sollte, umfassen; oder umgekehrt.

Optional können beliebige der hierin bereitgestellten Verfahren auch einen Schritt des Verabreichens einer Behandlung an das Subjekt umfassen. Das Verfahren kann sodann z. B. als Verfahren zum Diagnostizieren und Behandeln; Überwachen und Behandeln; Prognostizieren und Behandeln; Vorhersagen und Behandeln; oder Stratifizieren und Behandeln bezeichnet werden.

Optional können beliebige der hierin bereitgestellten Verfahren in Verbindung mit beliebigen anderen bekannten Verfahren, insbesondere einem bekannten Verfahren zum Diagnostizieren, Prognostizieren, Vorhersagen und/oder Überwachen einer Krankheit, verwendet werden.

Zellpopulationsinfektion

Wie andernorts erwähnt, kann eine potenzielle Infektion einer Zellpopulation analysiert werden. Die Infektion kann z. B. durch einen anderen Zelltyp und/oder eine Mikrobe erfolgen.

Eine „Mikrobe“, auch als Mikroorganismus bekannt, ist ein Organismus, der zu klein ist, als dass er für das bloße Auge sichtbar ist, d. h. er ist mikroskopisch. Eine Mikrobe kann aus Bakterien, Pilzen, Archaeen, Algen, Protozoen und Viren ausgewählt sein. Auch wenn die Ausdrücke Bakterien, Pilze, Archaeen, Algen, Protozoen und Viren technisch gesehen den Plural ausweisen, ist es gängige Praxis, sie auch für den Singular zu verwenden. Folglich werden die Ausdrücke „Bakterien“ und „Bakterium“ hierin miteinander austauschbar verwendet; werden die Ausdrücke „Pilze“ und „Pilz“ hierin miteinander austauschbar verwendet; werden die Ausdrücke „Archaeen“ und „Archaeum“ hierin miteinander austauschbar verwendet; werden die Ausdrücke „Protozoen“ und „Protozoum“ hierin miteinander austauschbar verwendet; und werden die Ausdrücke „Viren“ und „Virus“ hierin miteinander austauschbar verwendet.

Im Fall einer Mikrobe kann eine Analyse optional auf einer beliebigen taxonomischen Ebene erfolgen, z. B. auf der Reich-, Phylum- oder Abteilungs-, Klassen-, Ordnungs-, Familien-, Gattung-, Spezies- und/oder Stammebene.

Die „Taxonomie“ ist die Klassifizierung von Organismen und jede Klassifizierungsebene kann als „Taxon“ (Plural: Taxa) bezeichnet werden. Organismen können in ansteigender Reihenfolge der Spezifität in die folgenden Taxa klassifiziert werden: Reich, Phylum oder Abteilung, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung, Spezies und Stamm. Weitere Unterteilungen jedes Taxons können vorhanden sein. Es sei verstanden, dass es in der enormen wissenschaftlichen Gemeinschaft gewisse Diskrepanzen bezüglich gewisser taxonomischer Klassifizierungen gibt. Es kann auch ein mangelnder Konsens bezüglich der Nomenklatur gewisser Mikroben vorliegen, was dazu führt, dass eine bestimmte Mikrobe mehr als einen Namen hat oder zwei unterschiedliche Mikroben den gleichen Namen haben.

Als Abkürzung wird der Ausdruck „Typ“ einer Mikrobe verwendet, um sich auf eine Mikrobe zu beziehen, die sich auf taxonomischer Ebene von einer anderen Mikrobe unterscheidet.

Bei manchen Ausführungsformen kann die Mikrobe aus Bakterien, Pilzen, Archaeen, Algen und Protozoen ausgewählt sein. Bei manchen Ausführungsformen kann sie aus Bakterien und Pilzen ausgewählt sein. Bei manchen Ausführungsformen kann sie aus Bakterien ausgewählt sein.

Die Mikrobe kann einzellig oder mehrzellig sein. Wenn die Mikrobe ein Pilz ist, kann sie optional filamentös oder einzellig sein, z. B. eine Hefe.

Ein Pilz kann optional eine Hefe sein. Sie kann optional aus der Gattung Aspergillus, Arthroascus, Brettanomyces Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Geotrichum, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Trichosporon und Zygotorulaspora ausgewählt sein.

Sie kann optional aus der Spezies Arthroascus schoenii, Brettanomyces bruxellensis, Candida albicans, C. ascalaphidarum, C. amphixiae, C. antarctica, C. argentea, C. atlantica, C. atmosphaerica, C. blattae, C. bromeliacearum, C. carpophila, C. carvajalis, C. cerambycidarum, C. chauliodes, C. corydali, C. dosseyi, C. dubliniensis, C. ergatensis, C. fructus, C. glabrata, C. fermentati, C. guilliermondii, C. haemulonii, C. insectamens, C. insectorum, C. intermedia, C. jeffresii, C. kefyr, C. keroseneae, C. krusei, C. lusitaniae, C. lyxosophila, C. maltosa, C. marina, C. membranifaciens, C. milleri, C. mogii, C. oleophila, C. oregonensis, C. parapsilosis, C. quercitrusa, C. rugosa, C. sake, C. shehatea, C. temnochilae, C. tenuis, C. theae, C. tolerans, C. tropicalis, C. tsuchiyae, C. sinolaborantium, C. sojae, C. subhashii, C. viswanathii, C. utilis, C. ubatubensis, C. zemplinina, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus uniguttulatus, Debaryomyces carsonii, Geotrichum capitatum, Trichosporon asahii, Trichosporon mucoides, Trichosporon inkin, Saccharomyces cerevisiae, Pichia acaciae, Pichia anomala, Pichia capsulata, Pichia farinosa, Pichia guilliermondii, Pichia spartinae, Pichia ohmeri, Rhodotorula glutinous, Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae und/oder Zygotorulaspora florentinus ausgewählt sein.

Die Bakterien können optional einer Gattung sein, ausgewählt aus z. B. Abiotrophia, Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Actinomadura, Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Anaerococcus, Anaplasma, Bacillus, Bacteroides, Bartonella, Bifidobacterium, Bordetella, Borrelia, Brevundimonas, Brucella, Burkholderia Campylobacter, Capnocytophaga, Chlamydia, Citrobacter, Chlamydophila, Chryseobacterium, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Coxiella, Cupriavidus, Delftia, Dermabacter, Ehrlichia, Eikenella, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Erysipelothrix, Facklamia, Finegoldia, Francisella, Fusobacterium, Gemella, Gordonia, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Legionella, Leptospira, Listeria, Micrococcus, Moraxella, Morganella, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Nocardia, Orientia, Pandoraea, Pasteurella, Peptoniphilus, Peptostreptococcus, Plesiomonas, Porphyromonas, Pseudomonas, Prevotella, Proteus, Propionibacterium, Rhodococcus, Ralstonia, Raoultella, Rickettsia, Rothia, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptococcus, Tannerella, Treponema, Ureaplasma, Vibrio oder Yersinia.

Das Virus kann optional ein DNA-Virus und RNA-Virus oder ein Retrovirus sein. Es kann optional ein einzelsträngiges (ss) oder ein doppelsträngiges (ds) Virus sein. Mehr im Detail kann es eine ssDNA-Virus, dsDNA-Virus, dsRNA-Virus, ssRNA-Virus (positiver Strang), ssRNA-Virus (negativer Strang), ssRNA-Virus (reverstranskribiert) oder dsDNA-Virus (reverstranskribiert) sein.

Es kann optional aus einem oder mehreren von Herpesviridae; Adenoviridae; Papillomaviridae; Polyomaviridae; Poxviridae; Anelloviridae; Mycodnaviridae; Parvoviridae; Reoviridae; Coronaviridae; Astroviridae; Caliciviridae; Flaviviridae; Picornaviridae; Togaviridae; Rhabdoviridae; Filoviridae; Paramyxoviridae; Arenaviridae; Bunyaviridae; Orthomyxoviridae; Retroviridae; Epadnaviridae; Hepevirus; und/oder Deltavirus ausgewählt sein.

Konfokale Mikroskopie

Das Prinzip der konfokalen Bildgebung zielt darauf ab, gewisse Beschränkungen in Zusammenhang mit herkömmlichen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopen aufzuheben. Bei einem herkömmlichen (d. h. Weitfeld-)Fluoreszenzmikroskop wird die gesamte Prüfprobe gleichmäßig mit Licht von einer Lichtquelle geflutet. Alle Teile der Prüfprobe im Strahlengang werden gleichzeitig angeregt und die entstehende Fluoreszenz wird durch den Photodetektor des Mikroskops oder eine Kamera detektiert, einschließlich eines großen nichtfokussierten Hintergrundteils.

Im Gegensatz dazu verwendet ein Konfokalmikroskop Punktbeleuchtung und eine Aperturblende in einer optischen Konjugatebene vor dem Detektor, um Signal außerhalb des Fokus zu eliminieren (der Name „konfokal“ rührt aus dieser Konfiguration). Da nur Licht, das durch Fluoreszenz sehr nahe der Brennebene detektiert werden kann, ist die optische Auflösung des Bilds, insbesondere in der Probentiefenrichtung, viel besser als bei Weitfeldmikroskopen. Da jedoch ein großer Teil des Lichts aus der Probenfluoreszenz an der Aperturblende blockiert wird, erfolgt diese erhöhte Auflösung auf Kosten einer verringerten Signalintensität. Folglich können relativ lange Belichtungszeiten erforderlich sein.

Da jeweils nur ein Punkt in der Probe beleuchtet wird, erfordert eine 2D- oder 3D-Bildgebung ein Abtasten über ein regelmäßiges Raster (d. h. ein rechteckiges Muster paralleler Abtastlinien) in der Prüfprobe. Die erzielbare Dicke der Brennebene wird größtenteils durch die Wellenlänge des verwendeten Lichts geteilt durch die numerische Apertur der Objektivlinse und auch durch die optischen Eigenschaften der Prüfprobe definiert. Durch den möglichen dünnen optischen Schnitt sind diese Typen von Mikroskopen bei der 3D-Bildgebung und der Oberflächenprofilerstellung von Proben besonders gut.

Optional kann eine Zellbildgebung unter Verwendung eines Konfokalmikroskops durchgeführt werden.

Durchflusszytometrie

Optional kann das Verfahren außerdem einen Schritt der Durchflusszytometrie umfassen, z. B. vor und/oder nach der Analyse mittels Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometrie. Beispielsweise kann das Verfahren optional an einer Zellpopulation durchgeführt werden, die zuvor mittels Durchflusszytometrie analysiert wurde, z. B. kann es optional an einer Subpopulation von Zellen durchgeführt werden, die mittels fluoreszenzgestützter Zellsortierung (FACS) sortiert wurden.

Optional kann das Verfahren das Trennen markierter Zellen von unmarkierten Zellen davor in eine erste und eine zweite Teilmenge, optional eine markierte und eine unmarkierte Teilmenge, umfassen. Die Trennung kann optional vor und/oder nach dem Generieren von spektrometrischen Daten erfolgen. Somit kann das Ziel optional eine Teilmenge einer Zellpopulation sein, wobei die Teilmenge unter Verwendung von Durchflusszytometrie, z. B. FACS, erzeugt wurde.

Optional können die Schritte des Trennens markierter Zellen von unmarkierten Zellen vor dem Durchführen des hierin bereitgestellten Verfahrens durchgeführt werden. Optional (i) kann zumindest eine der Teilmengen direkt mit dem Verfahren nach einem beliebigen vorstehenden Anspruch analysiert werden; (ii) kann zumindest eine Teilmenge direkt in ein Massenspektrometer und/oder Ionenmobilitätsspektrometer eingebracht werden; und/oder (iii) kann eine FACS-Vorrichtung mit einer Vorrichtung verbunden werden, optional direkt, optional wie hierin andernorts definiert, z. B. mit einem Massenspektrometer und/oder einem Ionenmobilitätsspektrometer.

In der Biotechnologie ist die Durchflusszytometrie eine lasergestützte biophysikalische Technologie, die z. B. bei der Zellzählung, der Zellsortierung, dem Biomarkernachweis und beim Protein-Engineering verwendet wird. Die Durchflusszytometrie kann optional verwendet werden, z. B. um die Expression einer Zelloberfläche und/oder intrazellulärer Moleküle zu analysieren, unterschiedliche Zelltypen in einer heterogenen Zellpopulation zu charakterisieren und/oder identifizieren, die Reinheit von isolierten Subpopulationen zu bewerten und/oder Zellgröße und -volumen zu analysieren. Sie ermöglicht die gleichzeitige Mehrparameteranalyse einzelner Zellen.

Sie kann insbesondere verwendet werden, um eine Fluoreszenzintensität zu messen, die von Liganden erzeugt wird, die an spezifische zellassoziierte Moleküle binden, z. B. (i) fluoreszierend markierte Antikörper, die Proteine nachweisen; oder (ii) Propidiumiodid, das an DNA bindet.

Die Färbeverfahrensweise kann das Herstellen einer Einzelzellsuspension aus Zellkultur oder Gewebeproben umfassen. Die Zellen können danach mit unmarkierten oder fluorchrommarkierten Antikörpern inkubiert werden, z. B. in Röhrchen und/oder auf Mikrotiterplatten. Zellen können in einem Fluidstrom suspendiert und durch ein elektronisches Nachweisgerät laufengelassen werden.

Durchflusszytometer sind in der Lage, mehrere Tausende oder Partikel pro Sekunde zu analysieren. Ein Durchflusszytometer umfasst eine Durchflusszelle, in der ein flüssiger Strom Zellen trägt und ausrichtet, so dass sie im Gänsemarsch durch einen Lichtstrahl zur Erfassung marschieren. Die Impedanz oder Leitfähigkeit der Zellen und die diversen optischen Eigenschaften der Zellen können gemessen werden.

Die Durchflusszytometrie wird bei der Diagnose von gesundheitlichen Störungen, insbesondere Blutkrebsen, routinemäßig verwendet, findet in der Grundlagenforschung, in der klinischen Praxis und in klinischen Studien jedoch viele andere Anwendungen. Eine übliche Variation liegt in der physikalischen Sortierung von Partikeln aufgrund deren Eigenschaften, um Populationen von Interesse zu reinigen, z. B. durch fluoreszenzgestützte Zellsortierung (FACS).

Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist ein Verfahren zum Sortieren einer heterogenen Mischung von biologischen Zellen in zwei oder mehr Behälter, jeweils eine Zelle, auf Basis der spezifischen Lichtstreuung und fluoreszierenden Charakteristika jeder Zelle. Somit ermöglicht die FACS die physikalische Sortierung einer heterogenen Mischung von Zellen in zwei oder mehr unterschiedliche Subpopulationen.

Wie oben erwähnt, können Zellen mit fluoreszierenden Markierungen markiert werden, die für einen bestimmten Zellmarker spezifisch sind. Wenn eine Zellpopulation in Bezug auf diesen Marker heterogen ist, wird nur die markerpositive Subpopulation der Zellen markiert.

Ein FACS-Gerät kann danach verwendet werden, um die Zellen zu sortieren. Die Zellsuspension ist in der Mitte eines schmalen, schnell fließenden Flüssigkeitsstroms mitgerissen. Der Strom ist so ausgelegt, dass es zwischen Zellen in Bezug auf deren Durchmesser zu einer großen Trennung kommt. Ein Vibrationsmechanismus bewirkt, dass der Zellstrom in einzelne Tropfen aufbricht. Das System wird so eingestellt, dass die Wahrscheinlichkeit von mehr als einer Zelle pro Tropfen gering ist. Kurz bevor der Strom in Tropfen aufbricht, passiert der Strom eine Fluoreszenzmessstation, in der die fluoreszierende Eigenschaft von Interesse jeder Zelle gemessen wird. Ein elektrischer Ladungsring wird knapp an dem Punkt, an dem der Strom in Tropfen aufbricht, platziert. Eine Ladung wird auf Basis der unmittelbar davor durchgeführten Fluoreszenzintensitätsmessung am Ring platziert und die entgegengesetzte Ladung wird auf dem Tropfen eingefangen, während er aus dem Strom bricht. Die geladenen Tropfen fallen sodann durch ein elektrostatisches Ablenksystem, das Tropfen auf Basis ihrer Ladung in Behälter umlenkt. Bei manchen Systemen wird die Ladung direkt an den Strom angelegt und der ausbrechende Tropfen behält die Ladung mit dem gleichen Vorzeichen wie der Strom bei. Der Strom wird sodann nach Ausbrechen des Tropfens wieder neutral gemacht.

Fluoreszierende Markierung

Optional kann ein Molekül auf einer oder mehreren der Zellen oder innerhalb dieser markiert werden. Die Markierung kann z. B. eine fluoreszierende Markierung sein.

In der folgenden Tabelle sind Fluorchrome für eine Immunfluoreszenzmikroskopie aufgelistet:

Fluorchrome Anregung (nm) Emission (nm) AMCA 347 445 Alexa Fluor 350 345 440 Alexa Fluor 488 488 520 Cy2 492 510 FITC 496 518 Bodipy-FL 503 511 TRITC 544 572 Cy3 550 570 LRSC 572 590 Rhodamine Red-X 570 590 Texas Red 596 620 Cy5 650 670 Alexa Fluor 647 650 668
wobei AMCA Aminomethylcumarinessigsäure ist, Cy2 Cyanin ist, FITC Fluoresceinisothiocyanat ist, TRITC Tetramethylrhodaminisothiocyanat ist, Cy3 Indocarbocyanin ist, LRSC Lissaminrhodaminsulfonylchlorid ist und Cy5 Indodicarbocyanin ist.

Grün fluoreszierendes Protein (GFP) ist ein Protein, das aus 238 Aminosäureresten (26,9 kDA) zusammengesetzt ist, das eine helle grüne Fluoreszenz zeigt, wenn es Licht im blauen bis ultravioletten Bereich ausgesetzt wird. Auch wenn viele andere Meeresorganismen ähnliche grün fluoreszierende Proteine aufweisen, bezieht sich GFP für gewöhnlich auf das Protein, das zuerst aus der Qualle Aequorea victoria isoliert wurde. Das GFP aus A. victoria hat einen primären Anregungspeak bei einer Wellenlänge von 395 nm und einen sekundären bei 475 nm. Sein Emissionspeak liegt bei 509 nm, was im unteren grünen Abschnitt des sichtbaren Spektrums ist. Die Fluoreszenzquantenausbeute (QY) von GFP ist 0,79. Das GFP aus dem Seestiefmütterchen (Renilla reniformis) hat einen einzelnen primären Anregungspeak bei 498 nm.

In der Zell- und Molekularbiologie wird das GFP-Gen häufig als Expressionsreporter verwendet. In modifizierten Formen wird es verwendet, um Biosensoren herzustellen, und viele Tiere, die GFP exprimieren, wurden als Proof-of-Concept geschaffen, dass ein Gen in einem bestimmten gesamten Organismus exprimiert werden kann. Das GFP-Gen kann in Organismen eingebracht und durch Züchten, Injektion mit einem Virusvektor oder Zelltransformation in deren Genom gehalten werden. Bis heute wird das GFP-Gen in viele Bakterien, Hefen und andere Pilze, Fische (wie z. B. Zebrafisch), Pflanzen, Fliegen und Säugetierzellen, einschließlich des Menschen, eingebracht und exprimiert.

Analyse spektrometrischer Daten

Beliebige der Verfahren können optional das Analysieren spektrometrischer Daten umfassen; insbesondere das Analysieren spektrometrischer Daten aus einem Ziel, z. B. einer ersten Zielstelle.

Die Analyse eines Ziels basiert ggf. lediglich auf der Analyse spektrometrischer Daten oder sie kann optional ein oder mehrere weitere Analysewerkzeuge umfassen, wobei diesbezügliche Details hierin andernorts erörtert sind.

Bei manchen Ausführungsformen können die spektrometrischen Daten optional direkte Informationen zum Ziel oder zur Zielentität bereitstellen.

Beispielsweise wenn ein bestimmter Zelltyp ein spezifisches spektrometrisches Signalmuster aufweist, liefert das Erhalten dieses Signalmusters aus einem Ziel eine direkte Information zum Vorhandensein, zur Identität und/oder zu Charakteristika dieses Zelltyps.

Beispielsweise wenn eine bestimmte Mikrobe ein spezifisches spektrometrisches Signalmuster aufweist, liefert das Erhalten dieses Signalmusters aus einem Ziel eine direkte Information zum Vorhandensein, zur Identität und/oder zu Charakteristika dieser Mikrobe.

Beispielsweise wenn eine bestimmte Verbindung ein spezifisches spektrometrisches Signalmuster aufweist, liefert das Erhalten dieses Signalmusters aus einem Ziel eine direkte Information zum Vorhandensein, zur Identität und/oder zu Charakteristika dieser Verbindung. Dies kann z. B. bei einer Verbindung der Fall sein, die von einer Zelle und/oder einer Mikrobe sekretiert wird, oder bei einem Mittel wie z. B. einem Arzneimittel oder einem Metaboliten davon.

Bei anderen Ausführungsformen jedoch können die spektrometrischen Daten optional indirekte Informationen zum Ziel oder zur Zielentität bereitstellen. Dies kann z. B. bei einer Verbindung der Fall sein, die von einer Zelle und/oder einer Mikrobe zwar hergestellt, aber nicht sekretiert wird. Das Vorhandensein dieser Verbindung kann optional indirekt durch Nachweisen eines spektrometrischen Signalmusters nachgewiesen werden, das für eine Zelle und/oder Mikrobe, die die Verbindung enthält, charakteristisch ist.

Spektrometrische Daten, die aus einem Ziel erhalten werden, z. B. einer ersten Zielstelle, können optional mit einem oder mehreren anderen spektrometrischen Daten verglichen werden, die hierin praktischerweise als spektrometrische „Referenz“-, „Kontroll“- oder „Vergleichs“-Daten bezeichnet werden.

Wie hierin andernorts erläutert, kann das Analysieren spektrometrischer Daten optional das Analysieren eines oder mehrerer Probenspektren umfassen, um eine Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe zu klassifizieren. Dies kann das Entwickeln eines Klassifizierungsmodells oder einer Klassifizierungsbibliothek unter Verwendung eines oder mehrerer Referenzprobenspektren umfassen oder kann das Verwenden einer bestehenden Bibliothek umfassen.

Optional kann eine Analyse durchgeführt werden, um zu ermitteln, ob spektrometrische Daten, die aus einem Ziel erhalten werden, mit den spektrometrischen „Referenz“-, „Kontroll“- oder „Vergleichs“-Daten ausreichend übereinstimmt oder diesen ausreichend entspricht, um eine positive Ermittlung zu tätigen.

Der Ausdruck spektrometrische „Referenzdaten“ wird hierin verwendet, um sich auf spektrometrische Daten aus einem bekannten Zelltyp, einer bekannten Mikrobe oder einer bekannten Verbindung zu beziehen. Spektrometrische Referenzdaten können optional öffentlich zugänglich sein oder der Fachmann kann eine Bibliothek von spektrometrischen Referenzdaten erzeugen. Das Verfahren kann optional das Vergleichen der spektrometrischen Daten mit einem oder mehreren spektrometrischen Referenzdaten umfassen. Wenn die spektrometrischen Daten, die aus einem Ziel erhalten werden, mit einem spektrometrischen Referenzdatum ausreichend übereinstimmen oder diesem ausreichend entsprechen, kann sodann optional eine positive Ermittlung durchgeführt werden. Optional kann eine positive Ermittlung durchgeführt werden, wenn die spektrometrischen Daten einem Bibliothekseintrag stärker als einem beliebigen anderen Bibliothekseintrag entsprechen. Wenn die spektrometrischen Daten, die aus einem Ziel erhalten werden, mit einem spektrometrischen Referenzdatum nicht ausreichend übereinstimmen oder diesem ausreichend entsprechen, kann sodann optional eine negative Ermittlung durchgeführt werden.

Der Ausdruck spektrometrische „Vergleichsdaten“ wird hierin verwendet, um sich auf spektrometrische Daten zu beziehen, die aus einem zweiten Ziel erhalten werden. Das erste und das zweite Ziel können unterschiedliche Zellpopulationen oder zwei getrennte Proben sein, die aus der gleichen Zellpopulation erhalten werden. Das Verfahren kann optional das Vergleichen der spektrometrischen Daten mit einem oder mehreren spektrometrischen Vergleichsdaten umfassen. Wenn die spektrometrischen Daten, die aus einem Ziel erhalten werden, mit einem spektrometrischen Vergleichsdatum ausreichend übereinstimmen oder diesem ausreichend entsprechen, kann sodann optional eine positive Ermittlung durchgeführt werden. Wenn die spektrometrischen Daten, die aus einem Ziel erhalten werden, mit einem spektrometrischen Vergleichsdatum nicht ausreichend übereinstimmen oder diesem ausreichend entsprechen, kann sodann optional eine negative Ermittlung durchgeführt werden.

Der Ausdruck spektrometrische „Kontrolldaten“ wird hierin verwendet, um sich auf spektrometrische Daten zu beziehen, die zu einem früheren Zeitpunkt aus dem ersten Ziel erhalten werden. Spektrometrische Kontrolldaten können z. B. verwendet werden, wenn z. B. das Wachstum und/oder die Substanzherstellung durch eine Zellkultur überwacht werden. Beliebige der Verfahren können optional das Vergleichen der spektrometrischen Daten mit einem oder mehreren spektrometrischen Kontrolldaten umfassen. Wenn die spektrometrischen Daten, die aus einem Ziel erhalten werden, mit einem spektrometrischen Kontrolldatum ausreichend übereinstimmen oder diesem ausreichend entsprechen, kann sodann optional eine positive Ermittlung durchgeführt werden. Wenn die spektrometrischen Daten, die aus einem Ziel erhalten werden, mit einem spektrometrischen Kontrolldatum nicht ausreichend übereinstimmen oder diesem ausreichend entsprechen, kann sodann optional eine negative Ermittlung durchgeführt werden.

Unter einer „positiven Ermittlung“ versteht sich, dass das Vorhandensein, die Identität und/oder die Charakteristika eines bestimmten Zelltyps, einer bestimmten Mikrobe und/oder einer bestimmten Verbindung ermittelt wird. Beispielsweise kann eine positive Ermittlung das Ermitteln, dass eine Zielentität einer bestimmten Klassifizierung vorhanden ist; dass eine Zielentität ein gewisses Charakteristikum aufweist; und/oder dass eine bestimmte Verbindung vorhanden ist, umfassen.

Beispielsweise im Fall einer mikrobiellen Zielentität kann eine positive Ermittlung z. B. das Ermitteln, dass eine Mikrobe eines bestimmten taxonomischen Rangs vorhanden ist; dass eine bestimmte Mikrobe ein bestimmtes Charakteristikum aufweist, wie z. B. Resistenz gegen ein bestimmtes Arzneimittel; und/oder dass eine bestimmte Verbindung von einer Mikrobe hergestellt wird, umfassen.

Beispielsweise im Fall einer Zellzielentität kann eine positive Ermittlung z. B. das Ermitteln, dass eine Zelle eine bestimmte Identität aufweist; und/oder dass eine Zelle ein bestimmtes Charakteristikum aufweist, wie z. B. dass sie einen bestimmten Biomarker exprimiert, umfassen.

Beispielsweise im Fall einer Verbindungszielentität kann eine positive Ermittlung z. B. das Ermitteln, dass ein bestimmter Verbindungstyp vorhanden ist; und/oder dass eine Verbindung ein gewisses Charakteristikum aufweist, wie z. B. ein bestimmtes Glykosylierungsmuster, umfassen.

Beispielsweise wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe ausreichend mit spektrometrischen Referenzdaten übereinstimmen oder diesen ausreichend entsprechen, dann kann das Vorhandensein einer Zielentität in der ersten Probe optional bestätigt werden, die der Entität entspricht, aus der die spektrometrischen Referenzdaten erhalten wurden. Wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe ausreichend mit spektrometrischen Referenzdaten übereinstimmen oder diesen ausreichend entsprechen, dann kann die in der ersten Probe vorhandene Zielentität optional als der Identität der Entität entsprechend identifiziert werden, aus der die spektrometrischen Referenzdaten erhalten wurden. Wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe ausreichend mit spektrometrischen Referenzdaten übereinstimmen oder diesen ausreichend entsprechen, dann kann die in der ersten Probe vorhandene Zielentität optional als ein Charakteristikum aufweisend charakterisiert werden, das dem Charakteristikum der Entität entspricht, aus der die spektrometrischen Referenzdaten erhalten wurden. Wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe ausreichend mit spektrometrischen Referenzdaten übereinstimmen oder diesen ausreichend entsprechen, dann kann eine Ermittlung optional durchgeführt werden, dass die in der ersten Probe vorhandene Zielentität die Verbindung herstellt, die von der Entität hergestellt wird, aus der die spektrometrischen Referenzdaten erhalten wurden.

Wie hierin andernorts erläutert, versteht sich unter dem Ermitteln oder Bestätigen der „Identität“ einer Mikrobe oder einer Zelle, dass zumindest eine gewisse Information zur Identität erhalten wird, die z. B. auf taxonomischer Ebene. Wenn somit beispielsweise die spektrometrischen Referenzdaten aus Mycoplasma stammen, kann sodann bei einer Ausführungsform eine Übereinstimmung oder eine ausreichende Entsprechung optional herangezogen werden, um die erste Mikrobe als zur Gattung Mycoplasma gehörend zu identifizieren, während bei einer anderen Ausführungsform eine Übereinstimmung oder eine ausreichende Entsprechung optional herangezogen werden kann, um die erste Mikrobe als zur Gattung Mycoplasma genitalium gehörend zu identifizieren.

Ebenfalls beispielsweise, wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe ausreichend mit spektrometrischen Vergleichsdaten übereinstimmen oder diesen ausreichend entsprechen, dann kann das Vorhandensein einer Zielentität in der ersten Probe optional bestätigt werden, die der Entität entspricht, aus der die spektrometrischen Vergleichsdaten erhalten wurden. Wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe ausreichend mit spektrometrischen Vergleichsdaten übereinstimmen oder diesen ausreichend entsprechen, dann kann die in der ersten Probe vorhandene Zielentität optional als der Identität der Entität entsprechend identifiziert werden, aus der die spektrometrischen Vergleichsdaten erhalten wurden. Wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe ausreichend mit spektrometrischen Vergleichsdaten übereinstimmen oder diesen ausreichend entsprechen, dann kann die in der ersten Probe vorhandene Zielentität optional als ein Charakteristikum aufweisend charakterisiert werden, das dem Charakteristikum der Entität entspricht, aus der die spektrometrischen Vergleichsdaten erhalten wurden. Wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe ausreichend mit spektrometrischen Vergleichsdaten übereinstimmen oder diesen ausreichend entsprechen, dann kann eine Ermittlung optional durchgeführt werden, dass die in der ersten Probe vorhandene Zielentität die Verbindung herstellt, die von der Entität hergestellt wird, aus der die spektrometrischen Vergleichsdaten erhalten wurden.

Anders ausgedrückt kann eine Übereinstimmung oder eine ausreichende Entsprechung mit bzw. zu spektrometrischen Referenz- bzw. Vergleichsdaten herangezogen werden, um zu bestätigen, dass die erste Zielentität und die Referenz- bzw. Vergleichsentität die gleiche Identität aufweisen, während eine fehlende Übereinstimmung oder ausreichende Entsprechung mit bzw. zu spektrometrischen Referenz- bzw. Vergleichsdaten herangezogen werden kann, um zu bestätigen, dass die erste Zielentität und die Referenz- bzw. Vergleichsentität nicht die gleiche Identität aufweisen.

Unter einer „negativen Ermittlung“ versteht sich, dass das Nichtvorhandensein einer bestimmten Zielentität ermittelt wird; und/oder dass ermittelt wird, dass eine Zielentität eine bestimmte Identität und/oder ein bestimmtes Charakteristikum nicht aufweist.

Beispielsweise kann eine negative Ermittlung das Ermitteln, dass eine bestimmte Zielentität nicht vorhanden ist; dass eine bestimmte Zielentität ein gewisses Charakteristikum nicht aufweist; und/oder dass eine bestimmte Verbindung nicht vorhanden ist, umfassen.

Beispielsweise im Fall einer mikrobiellen Zielentität kann eine negative Ermittlung z. B. das Ermitteln, dass eine Mikrobe eines bestimmten taxonomischen Rangs nicht vorhanden ist; dass eine bestimmte Mikrobe ein bestimmtes Charakteristikum nicht aufweist, wie z. B. Resistenz gegen ein bestimmtes Arzneimittel; und/oder dass eine bestimmte Verbindung nicht hergestellt wird, umfassen.

Beispielsweise im Fall einer Zellzielentität kann eine negative Ermittlung z. B. das Ermitteln, dass ein bestimmter Zelltyp, z. B. eine HeLa-Zelle, nicht vorhanden ist; und/oder das eine Zelle ein gewisses Charakteristikum nicht aufweist, wie z. B. dass sie einen bestimmten Krebsmarker nicht exprimiert, umfassen.

Beispielsweise im Fall einer Verbindungszielentität kann eine negative Ermittlung z. B. das Ermitteln, dass ein bestimmter Verbindungstyp nicht vorhanden ist; und/oder dass eine Verbindung ein gewisses Charakteristikum nicht aufweist, wie z. B. ein bestimmtes Glykosylierungsmuster, umfassen.

Beispielsweise wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe nicht ausreichend mit spektrometrischen Referenzdaten übereinstimmen oder diesen nicht ausreichend entsprechen, dann kann das Nichtvorhandensein oder unausreichende Vorhandensein einer Zielentität in der ersten Probe optional bestätigt werden, die der Entität entspricht, aus der die spektrometrischen Referenzdaten erhalten wurden. Wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe nicht ausreichend mit spektrometrischen Referenzdaten übereinstimmen oder diesen nicht ausreichend entsprechen, dann kann die in der ersten Probe vorhandene Zielentität optional als der Identität der Entität nicht entsprechend identifiziert werden, aus der die spektrometrischen Referenzdaten erhalten wurden. Wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe nicht ausreichend mit spektrometrischen Referenzdaten übereinstimmen oder diesen nicht ausreichend entsprechen, dann kann die in der ersten Probe vorhandene Zielentität optional als ein Charakteristikum nicht aufweisend charakterisiert werden, das dem Charakteristikum der Entität entspricht, aus der die spektrometrischen Referenzdaten erhalten wurden. Wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe nicht ausreichend mit spektrometrischen Referenzdaten übereinstimmen oder diesen nicht ausreichend entsprechen, dann kann eine Ermittlung optional durchgeführt werden, dass die in der ersten Probe vorhandene Zielentität die Verbindung nicht herstellt oder unausreichend herstellt, die von der Entität hergestellt wird, aus der die spektrometrischen Referenzdaten erhalten wurden.

Ebenfalls beispielsweise wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe ausreichend mit spektrometrischen Kontrolldaten übereinstimmen oder diesen ausreichend entsprechen, kann sodann eine Ermittlung durchgeführt werden, dass keine oder keine signifikante Änderung erfolgt ist, während wenn die spektrometrischen Daten einer ersten Probe nicht ausreichend mit spektrometrischen Kontrolldaten übereinstimmen oder diesen nicht ausreichend entsprechen, sodann eine Ermittlung durchgeführt werden, dass eine Änderung, optional eine signifikante Änderung, erfolgt ist. Beispiele für eine Änderung kann z. B. das Vorhandensein einer kontaminierenden oder infiltrierenden Zelle, Mikrobe und/oder Verbindung; oder eine Änderung des Verhaltens oder der Umgebung einer Zelle oder Mikrobe, wie z. B. eine Änderung der Wachstumsrate, der Respirationsrate; der Herstellungsrate einer Verbindung wie z. B. einer sekretierten Verbindung; einer Umgebungstemperatur, des pH-Werts, der Nährstoffverfügbarkeit usw., sein.

Wie hierin andernorts erwähnt, kann das Verfahren optional das Analysieren von Biomarkern umfassen.

Wenn ein Biomarker für eine Zielentität oder einen Zielkrankheitsstatus bekannt ist (z. B. aus dem Stand der Technik oder aus der hierin offenbarten Arbeit), kann das Verfahren sodann optional das Analysieren des Ziels auf das Vorhandensein des spektrometrischen Signals dieses Biomarkers umfassen. Das spektrometrische Signal eines beliebigen Biomarkers kann optional in der Literatur, einer Datenbank nachgeschlagen oder bei Bedarf experimentell auf einfache Weise ermittelt werden.

Wie hierin ermittelt, sind beispielsweise Phosphatidylethanolamine wie z. B. PE(38:3) ein Biomarker für die fads2-Genexpression, mit einem spektrometrischen Signal von m/z von ungefähr 768,5578. Wenn ein Zellpopulationsziel analysiert wird, um zwischen Zellen, die das fads2-Gen exprimieren, und Zellen, die dieses Gen nicht exprimieren, eine Unterscheidung anzustellen zu versuchen, kann das Verfahren optional das Analysieren des Ziels auf das Vorhandensein eines spektrometrischen Signals von m/z von ungefähr 768,5578 umfassen.

Wie hierin andernorts erwähnt, kann der Analyt, der zu einem bestimmten spektrometrischen Signal führt, z. B. einem bestimmten m/z, optional weiter charakterisiert werden, z. B. unter Verwendung von MS/MS. Somit kann die Ionenspezies in den Massenspektren optional auf Basis von genauen Massenmessungen identifiziert werden, z. B. mit einer Massenabweichung von < 3 ppm, und/oder von MS/MS-Fragmentierungsmustern. Isobare Lipide mit unterschiedlichen Kopfgruppen können optional durch Ionenmobilität differenziert werden.

Somit kann das Verfahren optional das Analysieren des Ziels auf das Vorhandensein eines spektrometrischen Signals eines oder mehrerer Biomarker umfassen, die optional aus beliebigen der hierin erwähnten Biomarker ausgewählt sind.

Ein Biomarker für erkrankte Zellen kann optional ermittelt werden, z. B. durch Subtrahieren der spektrometrischen Signale, die aus normalen Zellen erhalten werden, von den spektrometrischen Signalen, die aus erkrankten Zellen erhalten werden, um spektrometrische Signale zu erhalten, die für die erkrankten Zellen spezifisch sind.

Die spektrometrischen Daten können ein oder mehrere Probenspektren umfassen. Das Erhalten der spektrometrischen Daten kann das Erhalten des einen oder der mehreren Probenspektren umfassen. Das Analysieren der spektrometrischen Daten kann das Analysieren des einen oder der mehreren Spektren umfassen. Das Erhalten des einen oder der mehreren Probenspektren kann einen Binning-Prozess umfassen, um einen Satz von Zeit-Intensität-Paaren und/oder einen Satz von Probenintensitätswerten für das eine oder die mehreren Probenspektren abzuleiten. Der Binning-Prozess kann das Sammeln von Ionennachweisen und/oder Identitätswerten in einem Satz von mehreren Bins oder das Erstellen eines diesbezüglichen Histogramms umfassen. Jedes Bin im Binning-Prozess kann einem bestimmten Bereich von Zeiten oder zeitbasierten Werten wie z. B. Massen, Masse-zu-Ladung-Verhältnissen und/oder Ionenmobilitäten entsprechen. Die Bins im Binning-Prozess können jeweils eine Breite aufweisen, die zu einer Breite in Da oder Th (Da/e) in einem Bereich äquivalent ist, der aus einer Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (i) < oder > 0,01; (ii) 0,01–0,05; (iii) 0,05–0,25; (iv) 0,25–0,5; (v) 0,5–1,0; (vi) 1,0–2,5; (vii) 2,5–5,0; und (viii) < oder > 5,0. Es wurde identifiziert, dass Bins mit Breiten äquivalent zu Breiten im Bereich von 0,01–1 Da oder Th (Da/e) besonders nützliche Probenspektren zum Klassifizieren gewisser Aerosol-, Rauch- oder Dampfproben bereitstellen können, wie z. B. aus Geweben erhaltenen Proben. Die Bins können alle die gleiche Breite aufweisen. Die Breiten des Bins im Binning-Prozess können je nach einer Binbreitenfunktion variieren. Die Binbreitenfunktion kann mit einer Zeit oder einem zeitbasierten Wert wie z. B. Masse, Masse-zu-Ladung-Verhältnis und/oder Ionenmobilität variieren. Die Binbreitenfunktion kann nichtlinear sein (z. B. logarithmisch basiert oder potenzbasiert, wie z. B. quadrat- oder quadratwurzelbasiert). Die Binbreitenfunktion kann die Tatsache berücksichtigen, dass die Flugzeit eines Ions ggf. nicht direkt proportional zu dessen Masse, Masse-zu-Ladung-Verhältnis und/oder Ionenmobilität ist. Beispielsweise kann die Flugzeit eines Ions direkt proportional zur Quadratwurzel dessen Masse und/oder Masse-zu-Ladung-Verhältnis sein.

Spektrometrische Bibliothek

Die Ausdrücke „spektrometrische Bibliothek“ und „spektrometrische Datenbank“ werden hierin miteinander austauschbar verwendet.

Der Fachmann kann öffentlich zugängliche spektrometrische Daten als spektrometrische Referenzdaten verwenden. Beispiele für nützliche Datenbanken sind: LipidMaps, LipidBlast und LipidXplorer, wobei diesbezügliche Details in den nachstehenden Veröffentlichungen bereitgestellt sind: „LipidBlast – in-silico tandem mass spectrometry database for lipid identification” von Kind et al., Nat Methods. August 2013; 10(8): 755–758; „LipidXplorer: A Software for Consensual Cross-Platform Lipidomics” von Herzog et al. PLoS ONE 7(1): e29851; und „Lipid classification, structures and tools” von Fahy et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids, Band 1811, Ausgabe 11, November 2011, Seite 637–647, Lipidomics and Imaging Mass Spectrometry, siehe auch http://www.lipidmaps.org/.

Alternativ oder zusätzlich kann der Fachmann eine spektrometrische Bibliothek durch Erhalten von spektrometrischen Daten aus einer oder mehrerer Proben erstellen, die im Fall von Mikroben optional Typkulturstämme und/oder klinische und/oder umgebungsbezogene mikrobielle Isolate umfassen können; wobei die eine oder mehreren Proben im Fall von Geweben oder Zellen optional eine Zelllinie, eine Zellkultur, eine Zellprobe und dergleichen umfassen können; wobei die eine oder mehreren Proben im Fall einer Verbindung erworben oder synthetisiert werden können.

Typkulturstämme und Zelllinien können optional aus Kultursammlungen wie z. B. der American Type Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 USA) erhalten werden.

Die vorliegenden Erfinder haben eine spektrometrische Bibliothek unter Verwendung von mehr als 1500 Mikrobenstämmen, einschließlich klinischer Isolate und Typkulturstämme aus der ATCC, erzeugt, die ungefähr 95 Gattungen und ungefähr 260 Spezies von Bakterien und Pilzen umfasst. Um das Erzeugen der spektrometrischen Bibliothek zu beschleunigen, haben die Erfindung eine Hochdurchsatzkultivierung, eine automatisierte Koloniebildgebung, Endoskop Kolonie-Picking und eine REIMS-Analyse durchgeführt.

Die Erfinder haben außerdem spektrometrische Bibliotheken unter Verwendung von Geweben und/oder Zelllinien erzeugt, wobei diesbezügliche Details hierin andernorts, einschließlich der Beispiele, bereitgestellt sind.

Das Erzeugen einer spektrometrischen Bibliothek aus Mikroben, Zelllinien und/oder Geweben kann optional mit einer weiteren Analyse, z. B. taxonomischen Klassifizierung und/oder Histologie, z. B. auf Basis beliebiger der weiteren Analysewerkzeuge, die hierin andernorts erörtert sind, kombiniert werden. Beispielsweise kann das Werkzeug DNA-Analyse sein. Dies kann eine DNA-Sequenzierung umfassen, vor der optional eine DNA-Isolation und/oder -Amplifikation unter Verwendung von z. B. PCR durchgeführt wird. Bei Bakterien ist das Sequenzieren des gesamten 16S-rRNA-Gens oder eines Teils davon besonders geeignet, bei Pilzen hingegen ist das Sequenzieren der gesamten Regionen des internen transkribierten Spacers (ITS) oder eines Teils davon besonders geeignet.

Analysieren von Probenspektren

Der Schritt des Analysierens der spektrometrischen Daten kann das Analysieren eines oder mehrerer Probenspektren umfassen, um eine Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe zu klassifizieren.

Das Analysieren des einen oder der mehreren Probenspektren zum Klassifizieren der Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe kann eine unüberwachte Analyse des einen oder der mehreren Probenspektren (z. B. für eine Dimensionalitätsverringerung) und/oder eine überwachte Analyse des einen oder der mehreren Probenspektren (z. B. für eine Klassifizierung) umfassen.

Das Analysieren des einen oder der mehreren Probenspektren kann eine unüberwachte Analyse (z. B. für eine Dimensionalitätsverringerung), gefolgt von einer überwachten Analyse (z. B. für eine Klassifizierung), umfassen.

Das Analysieren der einen oder mehreren Probenspektren kann wie hierin andernorts erörtert durchgeführt werden.

Eine Liste von Analysetechniken, die in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen sollen, ist in der nachstehenden Tabelle zu finden:

Analysetechniken Univariate Analyse Multivariate Analyse Hauptkomponentenanalyse (PCA) Lineare Diskriminanzanalyse (LDA) Maximum Margin Criteria (MMC) Bibliotheksbasierte Analyse Weiche unabhängige Modellierung der Klassenanalogie (SIMCA) Faktorenanalyse (FA) Rekursive Partitionierung (Entscheidungsbäume) Random Forest Unabhängige Komponentenanalyse (ICA) Diskriminanzanalyse der partiellen kleinsten Quadrate (PLS-DA) Orthogonale (partielle kleinste Quadrate) Projektionen zu latenten Strukturen (OPLS) OPLS-Diskriminanzanalyse (OPLS-DA) Support Vector Machine (SVM) (Künstliche) Neuronale Netze Mehrschichtiges Perzeptron Radiale-Basisfunktion-(RBF)-Netze Bayes-Analyse Clusteranalyse Problemkernreduzierte (kernelized) Verfahren Teilraumdiskriminanzanalyse K-Nächste Nachbarn (KNN) Quadratische Diskriminanzanalyse (QDA) Probabilistische Hauptkomponentenanalyse (PPCA) Nicht-negative Matrixfaktorisierung K-Means-Faktorisierung Fuzzy-c-Means-Faktorisierung Diskriminanzanalyse (DA)

Es können auch Kombinationen der vorstehenden Analyseansätze verwendet werden, wie z. B. PCA-LDA, PCA-MMC, PLS-LDA usw.

Das Analysieren der Probenspektren kann eine unüberwachte Analyse für eine Dimensionalitätsverringerung, gefolgt von einer überwachten Analyse für eine Klassifizierung, umfassen.

Es wird nun eine Reihe unterschiedlicher Analysetechniken beispielhaft ausführlicher beschrieben.

Multivariate Analyse – Entwicklung eines Modells für eine Klassifizierung

Es wird nun ein Verfahren zum Erstellen eines Klassifizierungsmodells unter Verwendung einer multivariaten Analyse mehrerer Referenzprobenspektren beschrieben.

15 zeigt ein Verfahren 1500 zum Erstellen eines Klassifizierungsmodells unter Verwendung einer multivariaten Analyse. Bei diesem Beispiel umfasst das Verfahren einen Schritt 1502 des Erhaltens mehrerer Sätze von Intensitätswerten für Referenzprobenspektren. Das Verfahren umfasst sodann einen Schritt 1504 einer unüberwachten Hauptkomponentenanalyse (PCA), gefolgt von einem Schritt 1506 einer überwachten linearen Diskriminanzanalyse (LDA). Dieser Ansatz kann hierin als PCA-LDA bezeichnet werden. Andere Ansätze der multivariaten Analyse können verwendet werden, wie z. B. PCA-MMC. Das PCA-LDA-Modell wird danach in Schritt 1508 ausgegeben, z. B. an einen Speicher.

Die multivariate Analyse wie z. B. diese kann ein Klassifizierungsmodell bereitstellen, das das Klassifizieren einer Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe unter Verwendung eines oder mehrerer Probenspektren ermöglicht, die aus der Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe erhalten wurden. Es wird nun die multivariate Analyse anhand eines einfachen Beispiels ausführlicher beschrieben.

16 zeigt einen Satz von Referenzprobenspektren, wie anhand von zwei Klassen bekannter Referenzproben erhalten. Die Klassen können beliebige einer oder mehrerer der hierin beschriebenen Zielklassen sein. Der Einfachheit wegen werden die zwei Klassen bei diesem Beispiel jedoch als linksseitige Klasse und rechtsseitige Klasse bezeichnet.

Jedes der Referenzprobenspektren wurde vorbearbeitet, um einen Satz von drei Referenzpeakintensitätswerten für jeweilige Masse-zu-Ladung-Verhältnisse in diesem Referenzprobenspektrum abzuleiten. Auch wenn nur drei Referenzpeakintensitätswerte gezeigt sind, wird verstanden, dass viel mehr Referenzpeakintensitätswerte (z. B. ~ 100 Referenzpeakintensitätswerte) für eine entsprechende Anzahl von Masse-zu-Ladung-Verhältnissen in jedem der Referenzprobenspektren abgeleitet werden können. Bei anderen Ausführungsformen können die Referenzpeakintensitätswerte entsprechen: Massen; Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; Ionenmobilitäten (Driftzeiten); und/oder Betriebsparametern.

17 zeigt einen multivariaten Raum mit drei Dimensionen, die durch Intensitätsachsen definiert werden. Jede der Dimensionen oder Intensitätsachsen entspricht der Peakintensität bei einem bestimmten Masse-zu-Ladung-Verhältnis. Wiederum wird verstanden, dass es viel mehr Dimensionen oder Intensitätsachsen (z. B. ~ 100 Dimensionen oder Intensitätsachsen) im multivariaten Raum geben kann. Der multivariate Raum umfasst mehrere Referenzpunkte, wobei jeder Referenzpunkt einem Referenzprobenspektrum entspricht, d. h. die Peakintensitätswerte jedes Referenzprobenspektrum liefern die Koordinaten für die Referenzpunkte im multivariaten Raum.

Der Satz von Referenzprobenspektren kann durch eine Referenzmatrix D mit Zeilen, die mit jeweiligen Reihenprobenspektren assoziiert sind, Spalten, die mit jeweiligen Masse-zu-Ladung-Verhältnissen assoziiert sind, und den Elementen der Matrix, die die Peakintensitätswerte für die jeweiligen Masse-zu-Ladung-Verhältnisse der jeweiligen Referenzprobenspektren sind, dargestellt sein.

In vielen Fällen ist es durch die große Anzahl von Dimensionen im multivariaten Raum und Matrix D ggf. schwierig, die Referenzprobenspektren in Klassen zu gruppieren. Eine PCA kann demgemäß an der Matrix D durchgeführt werden, um ein PCA-Modell zu berechnen, das einen PCA-Raum mit einer verringerten Anzahl einer oder mehrerer Dimensionen aufweist, die durch Hauptkomponentenachsen definiert sind. Die Hauptkomponenten können so ausgewählt werden, dass sie jene sind, die die größte Varianz in der Matrix D umfassen oder „erläutern“, und die eine Schwellenwertmenge der Varianz in der Matrix D kumulativ erläutern.

18 zeigt, wie die kumulative Varianz sich als Funktion der Anzahl n von Hauptkomponenten im PCA-Modell erhöhen kann. Die Schwellenwertmenge der Varianz kann wie erwünscht ausgewählt werden.

Das PCA-Modell kann anhand der Matrix D unter Verwendung eines nichtlinearen iterativen Algorithmus der partiellen kleinsten Quadrate (NIPALS) oder einer Singulärwertzerlegung berechnet werden, wobei diesbezügliche Details dem Fachmann bekannt sind und hierin somit nicht ausführlich beschrieben werden. Andere Verfahren zum Berechnen des PCA-Modells können verwendet werden.

Das entstehende PCA-Modell kann durch eine PCA-Scores-Matrix S und eine PCA-Loadings-Matrix L definiert sein. Die PCA kann auch eine Fehlermatrix E erzeugen, die die Varianz enthält, die durch das PCA-Modell nicht erläutert wird. Die Beziehung zwischen D, S, L und E kann sein: D = SLT + E(1)

19 zeigt den entstehenden PCA-Raum für die Referenzprobenspektren der 16 und 17. In diesem Beispiel hat das PCA-Modell zwei Hauptkomponenten PC0 und PC1 und daher hat der PCA-Raum zwei Dimensionen, die durch zwei Hauptkomponentenachsen definiert werden. Eine kleinere oder größere Anzahl von Hauptkomponenten kann jedoch nach Wunsch im PCA-Modell umfasst sein. Es ist im Allgemeinen erwünscht, dass die Anzahl von Hauptkomponenten zumindest eins kleiner als die Anzahl von Dimensionen im multivariaten Raum ist.

Der PCA-Raum umfasst mehrere transformierte Referenzpunkte oder PCA-Scores, wobei jeder transformierte Referenzpunkt oder PCA-Score einem Referenzprobenspektrum von 16 entspricht und somit einem Referenzpunkt von 17.

Wie in 19 gezeigt, erleichtert die verringerte Dimensionalität des PCA-Raums das Gruppieren der Referenzprobenspektren in die zwei Klassen. Jedwede Ausreißer können ebenfalls identifiziert und in dieser Stufe aus dem Klassifizierungsmodell entfernt werden.

Eine weitere überwachte multivariate Analyse wie z. B. Mehrklassen-LDA oder Maximum Margin Criteria (MMC) im PCA-Raum kann danach durchgeführt werden, um Klassen zu definieren und optional die Dimensionalität weiter zu verringern.

Wie der Fachmann verstehen wird, versucht eine Mehrklassen-LDA das Verhältnis der Varianz zwischen Klassen zur Varianz innerhalb von Klassen zu maximieren (d. h. um die größtmögliche Distanz zwischen den größtmöglich kompakten Klassen zu erreichen). Die Details zur LDA sind dem Fachmann bekannt und werden daher hierin nicht ausführlich beschrieben.

Das entstehende PCA-LDA-Modell kann durch eine Transformationsmatrix U definiert sein, die von der PCA-Scores-Matrix S und Klassenzuordnungen für jedes der darin enthaltenen transformierten Spektren abgeleitet sein kann, indem ein generalisiertes Eigenwertproblem gelöst wird.

Die Transformation der Scores S aus dem ursprünglichen PCA-Raum in den neuen LDA-Raum kann sodann wie folgt ausgedrückt werden: Z = SU(2) wobei die Matrix Z die Scores enthält, die in den LDA-Raum transformiert wurden.

20 zeigt einen PCA-LDA-Raum mit einer einzelnen Dimension oder Achse, wobei die LDA im PCA-Raum von 19 durchgeführt wird. Wie in 20 gezeigt, umfasst der LDA-Raum mehrere weitertransformierte Referenzpunkte oder PCA-LDA-Scores, wobei jeder weitertransformierte Referenzpunkt einem transformierten Referenzpunkt oder PCA-Score von 19 entspricht.

Bei diesem Beispiel erleichtert die weiterverringerte Dimensionalität des PCA-LDA-Raums das Gruppieren der Referenzprobenspektren in die zwei Klassen sogar noch mehr. Jede Klasse im PCA-LDA-Modell kann durch ihren transformierten Klassendurchschnitt und ihre Kovarianzmatrix oder eine oder mehrere Hyperebenen (einschließlich Punkten, Linien, Ebenen oder Hyperebenen höherer Ordnung) oder Hyperflächen oder Voronoi-Zellen im PCA-LDA-Raum definiert werden.

Die PCA-Loadings-Matrix L, die LDA-Matrix U und transformierte Klassendurchschnitte und Kovarianzmatrizes oder Hyperebenen oder Hyperflächen oder Voronoi-Zellen können für eine spätere Verwendung beim Klassifizieren einer Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe an eine Datenbank ausgegeben werden.

Die transformierte Kovarianzmatrix im LDA-Raum V’g für Klasse g kann wie folgt ausgedrückt werden: V’g = UTVgU(3) wobei Vg die Klassenkovarianzmatrizes im PCA-Raum sind.

Die transformierte Klassendurchschnittsposition zg für Klasse g kann ausgedrückt werden durch: sgU = zg(4) wobei sg die Klassendurchschnittsposition im PCA-Raum ist.

Multivariate Analyse – Verwendung eines Modells für eine Klassifizierung

Es wird nun ein Verfahren zum Verwenden eines Klassifizierungsmodells zum Klassifizieren einer Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe beispielhaft beschrieben.

21 zeigt ein Verfahren 2100 zum Verwenden eines Klassifizierungsmodells. Bei diesem Beispiel umfasst das Verfahren einen Schritt 2102 des Erhaltens eines Satzes von Intensitätswerten für ein Probenspektrum. Das Verfahren umfasst sodann einen Schritt 2104 des Projizierens des Satzes von Intensitätswerten für das Probenspektrum in einen PCA-LDA-Modellraum. Andere Klassifizierungsmodellräume können verwendet werden, wie z. B. PCA-MMC. Das Probenspektrum wird danach in Schritt 2106 auf Basis der Projektionsposition klassifiziert und die Klassifizierung wird sodann in Schritt 2108 ausgegeben.

Die Klassifizierung einer Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe wird nun unter Bezugnahme auf das oben beschriebene einfache PCA-LDA-Modell ausführlicher beschrieben.

22 zeigt ein Probenspektrum, das anhand einer unbekannten Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe erhalten wurde. Das Probenspektrum wurde vorbearbeitet, um einen Satz von drei Probenpeakintensitätswerten für jeweilige Masse-zu-Ladung-Verhältnisse abzuleiten. Wie oben erwähnt, auch wenn nur drei Probenpeakintensitätswerte gezeigt sind, wird verstanden, dass viel mehr Probenpeakintensitätswerte (z. B. ~ 100 Probenpeakintensitätswerte) bei viel mehr entsprechenden Masse-zu-Ladung-Verhältnissen für das Probenspektrum abgeleitet werden können. Wie oben erwähnt, können die Probenpeakintensitätswerte außerdem bei anderen Ausführungsformen entsprechen: Massen; Masse-zu-Ladung-Verhältnissen; Ionenmobilitäten (Driftzeiten); und/oder Betriebsparametern.

Das Probenspektrum kann durch einen Probenvektor dx dargestellt sein, wobei die Elemente des Vektors die Peakintensitätswerte für die jeweiligen Masse-zu-Ladung-Verhältnisse sind. Ein transformierter PCA-Vektor sX für das Probenspektrum kann wie folgt erhalten werden: dxL = sx(5)

Ein transformierter PCA-LDA-Vektor zX für das Probenspektrum kann sodann wie folgt erhalten werden: sxU = zx(6)

23 zeigt wiederum den PCA-LDA-Raum von 20. Der PCA-LDA-Raum von 23 umfasst jedoch ferner den projizierten Probenpunkt, der dem transformierten PCA-LDA-Vektor zx entspricht, der von den Peakintensitätswerten des Probenspektrums von 22 abgeleitet wurde.

Bei diesem Beispiel liegt der projizierte Probenpunkt auf einer Seite einer Hyperebene zwischen den Klassen, die sich auf die rechtsseitige Klasse bezieht, und somit kann die Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe als zur rechtsseitigen Klasse gehörend klassifiziert werden.

Alternativ kann die Mahalanobis-Distanz von den Klassenmitten im LDA-Raum verwendet werden, wobei die Mahalanobis-Distanz des Punkts zx von der Mitte der Klasse g ausgedrückt werden kann durch die Quadratwurzel von: (zx – zg)T(V’g)–1(zx – zg)(8) und kann der Datenvektor dx der Klasse zugeordnet werden, bei der diese Distanz die kleinste ist.

Außerdem kann, wenn man jede Klasse als multivariate Gaußsche Verteilung behandelt, die Wahrscheinlichkeit, dass der Datenvektor zu jeder Klasse gehört, berechnet werden.

Bibliotheksbasierte Analyse – Entwickeln einer Bibliothek zur Klassifizierung

Es wird nun ein Verfahren zum Erstellen eines Klassifizierungsmodells unter Verwendung mehrerer eingegebener Referenzprobenspektren beschrieben.

24 zeigt ein Verfahren 2400 zum Erstellen einer Klassifizierungsbibliothek. Bei diesem Beispiel umfasst das Verfahren einen Schritt 2402 des Erhaltens mehrerer eingegebener Referenzprobenspektren und einen Schritt 2404 des Ableitens von Metadaten von den mehreren eingegebenen Referenzprobenspektren für jede Probenklasse. Das Verfahren umfasst sodann einen Schritt 2406 des Speicherns der Metadaten für jede Probenklasse als separaten Bibliothekseintrag. Die Klassifizierungsbibliothek wird sodann in Schritt 2408 ausgegeben, z. B. an einen elektronischen Speicher.

Eine Klassifizierungsbibliothek wie diese ermöglicht das Klassifizieren einer Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe unter Verwendung eines oder mehrerer Probenspektren, die aus der Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe erhalten wurden. Es wird nun die bibliotheksbasierte Analyse anhand eines Beispiels ausführlicher beschrieben.

Bei diesem Beispiel wird jeder Eintrag in der Klassifizierungsbibliothek anhand mehrerer vorbearbeiteter Referenzprobenspektren erstellt, die für eine Klasse repräsentativ sind. Bei diesem Beispiel werden die Referenzprobenspektren für eine Klasse gemäß der folgenden Verfahrensweise vorbearbeitet.

Zunächst wird ein Rebinning-Prozess durchgeführt. Bei dieser Ausführungsform werden die Daten auf ein logarithmisches Raster den Abszissenwerten: erneut gesampelt, wobei Nchan ein ausgewählter Wert ist und [x] die nächste ganze Zahl unter x bezeichnet. Bei einem Beispiel ist Nchan 212 oder 4096.

Danach wird ein Hintergrundsubtraktionsprozess durchgeführt. Bei dieser Ausführungsform wird sodann ein kubischer Spline mit k Knoten erzeugt, so dass p% der Daten zwischen jedem Knotenpaar unter der Kurve liegen. Diese Kurve wird sodann von den Daten subtrahiert. Bei einem Beispiel ist k 32. Bei einem Beispiel ist p 5. Ein konstanter Wert, der dem q%-Quantil der intensitätssubtrahierten Daten entspricht, wird sodann von jeder Intensität subtrahiert. Positive und negative Werte werden behalten. Bei einem Beispiel ist q 45.

Danach wird ein Normalisierungsprozess durchgeführt. Bei dieser Ausführungsform werden die Daten auf ein Mittel-ýi normalisiert. Bei einem Beispiel ist ýi 1.

Ein Eintrag in der Bibliothek besteht sodann aus Metadaten in Form eines medianen Spektrumwerts μi und eines Abweichungswerts Di für jeden der Nchan Punkte im Spektrum.

Die Wahrscheinlichkeit für den i-ten Kanal wird wie folgt ausgedrückt: wobei 1/2 ≤ C < ∞ und wobei Γ(C) die Gammafunktion ist.

Die obige Gleichung ist eine generalisierte Cauchy-Verteilung, die sich auf eine Standard-Cauchy-Verteilung für C = 1 verringert und zu einer (normalen) Gauß-Verteilung als C → ∞ wird. Der Parameter Di steuert die Breite der Verteilung (in der Gauß-Grenze ist Di = σi einfach die Standardabweichung), während der allgemeine Wert C die Größe der Enden steuert.

Bei einem Beispiel ist C 3/2, was zwischen Cauchy und Gauß liegt, so dass die Wahrscheinlichkeit wird:

Bei jedem Bibliothekseintrag werden die Parameter μi auf den Median der Liste von Werten im i-ten Kanal der eingegebenen Referenzprobenspektren eingestellt, während die Abweichung Di als Interquartilsbereich dieser Werte geteilt durch √2 herangezogen wird. Diese Wahl kann gewährleisten, dass die Wahrscheinlichkeit für den i-ten Kanal den gleichen Interquartilbereich wie die eingegebenen Daten hat, unter Verwendung von Quantilen, die den gleichen Schutz vor Ausreißerdaten bieten.

Bibliotheksbasierte Analyse – Verwenden einer Bibliothek zur Klassifizierung

Es wird nun ein Verfahren zum Verwenden einer Klassifizierungsbibliothek zum Klassifizieren einer Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe beispielhaft beschrieben.

25 zeigt ein Verfahren 2500 zum Verwenden einer Klassifizierungsbibliothek. Bei diesem Beispiel umfasst das Verfahren einen Schritt 2502 des Erhaltens eines Satzes von mehreren Probenspektren. Das Verfahren umfasst sodann einen Schritt 2504 des Berechnens eines Wahrscheinlichkeits- oder Klassifizierungs-Scores für den Satz von mehreren Probenspektren für jede Probenklasse unter Verwendung von Metadaten für den Klasseneintrag in der Klassifizierungsbibliothek. Die Probenspektren werden danach in Schritt 2506 klassifiziert und die Klassifizierung wird sodann in Schritt 2508 ausgegeben.

Die Klassifizierung einer Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe wird nun unter Bezugnahme auf die oben beschriebene Klassifizierungsbibliothek ausführlicher beschrieben.

Bei diesem Beispiel ist ein unbekanntes Probenspektrum y das mediane Spektrum eines Satzes von mehreren Probenspektren. Die Verwendung des medianen Spektrums y kann vor Ausreißerdaten Kanal für Kanal schützen.

Die Wahrscheinlichkeit Ls für die eingegebenen Daten unter Berücksichtigung des Bibliothekseintrags s wird sodann wie folgt ausgedrückt: wobei μi und Di jeweils die medianen Bibliothekswerte und Abweichungswerte für Kanal i sind. Die Wahrscheinlichkeiten Ls können als log-Wahrscheinlichkeiten für numerische Sicherheit berechnet werden.

Die Wahrscheinlichkeiten Ls werden sodann in Bezug auf alle Kandidatenklassen ′s′ normalisiert, um Wahrscheinlichkeit zu erhalten, wobei von einer gleichmäßigen bisherigen Wahrscheinlichkeit über die Klassen hinweg ausgegangen wird. Die entstehende Wahrscheinlichkeit für die Klasse wird wie folgt ausgedrückt:

Der Exponent (1⁄F) kann die Wahrscheinlichkeiten weicher machen, die ansonsten zu definitiv wären. Bei einem Beispiel ist F 100. Diese Wahrscheinlichkeiten können als Prozentsätze ausgedrückt werden, z. B. in einer Benutzeroberfläche.

Alternativ können RMS-Klassifizierungs-Scores Rs unter Verwendung der gleichen medianen Probenwerte und Abweichungswerte aus der Bibliothek berechnet werden:

Wiederum werden die Scores Rs in Bezug auf alle Kandidatenklassen ′s′ normalisiert.

Die Aerosol-, Rauch- oder Dampfprobe kann sodann als zur Klasse mit dem höchsten Wahrscheinlichkeits- und/oder höchsten RMS-Klassifizierungs-Score gehörend klassifiziert werden.

Weitere Analysewerkzeuge

Beliebige der Verfahren der Erfindung können optional einen Schritt des Verwendens eines oder mehrerer zusätzlicher Analysewerkzeuge umfassen. Ein solches Werkzeug kann z. B. aus mikroskopischer Untersuchung; Nukleinsäureanalyse, z. B. unter Verwendung von Restriktionsenzymen, Hybridisierung, Polymerasekettenreaktion (PCR), Amplifikation und/oder Sequenzierung; und/oder Tests auf Antigene ausgewählt sein. Solche Werkzeuge sind auf dem Gebiet hinlänglich bekannt, es wird nachgehend jedoch kurz auf sie eingegangen.

Die Prüfprobe kann visuell ohne jedwede zusätzliche Hilfsmittel wie z. B. ein Mikroskop untersucht werden.

Die mikroskopische Untersuchung kann z. B. optional Lichtmikroskopie und/oder Elektronenmikroskopie sein.

Eine Nukleinsäureanalyse kann optional das Isolieren und Reinigen von DNA und/oder RNA umfassen.

Eine Nukleinsäureanalyse über PCR-Amplifikation kann z. B. optional eine Amplifikation eines gesamten geeigneten Gens oder eines Teils davon umfassen. Beispielsweise im Fall einer Mikrobe kann das Gen das bakterielle 16S-rRNA-Gen sein und können universelle und/oder speziesspezifische Primer verwendet werden. Andere Beispiele für geeignete mikrobielle Gene, die optional alternativ oder zusätzlich analysiert werden können, umfassen z. B. mikrobielle speziesspezifische Gene oder Virulenzgene, z. B. Shiga-Toxin (stx), Intimin (eae), Flagellum-H-Antigen-Gene fliC-fliA, hsp65, rpoB und/oder recA. Bei Pilzen ist eine PCR-Amplifikation des gesamten internen transkribierten Spacers (ITS) oder eines Teils davon besonders geeignet. Beim Analysieren humaner oder tierischer Zellen kann die PCR z. B. verwendet werden, um ein krankheitsspezifisches und/oder ein gewebespezifisches Gen zu amplifizieren.

Optional kann die PCR eine Echtzeit-PCR oder eine quantitative PCR sein. Optional kann eine Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) verwendet werden, um eine RNA-Expression zu analysieren.

Eine Nukleinsäureanalyse mit Restriktionsenzymen kann z. B. optional eine Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-(RFLP)-Analyse umfassen. Der RFLP ist eine Technik, bei der Schwankungen der Länge von homologen DNA-Sequenzen genutzt werden. Die RFLP-Analyse kann einen Restriktionsverdau umfassen, d. h. das Inkubieren einer DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym wie z. B. BamHI, HindIII oder EcoRI. Jedes Restriktionsenzym kann eine spezifische kurze Nukleinsäuresequenz erkennen und schneiden. Die entstehenden DNA-Fragmente können sodann nach Länge getrennt werden, z. B. durch Agarosegelelektrophorese. Die DNA-Fragmente im Gel können optional gefärbt werden, z. B. mit Ethidiumbromid, und das Muster der Fragmente unterschiedlicher Länge kann ermittelt werden.

Optional kann das DNA-Fragment durch das Southern-Blot-Verfahren auf eine Membran übertragen werden. Die Membran kann sodann einer markierten DNA-Sonde ausgesetzt werden, um eine Hybridisierung zu ermöglichen. Die Markierung kann z. B. ein radioaktives Isotop oder Digoxigenin (DIG) sein oder umfassen. Eine beliebige nicht hybridisierte Sonde kann danach abgewaschen werden. Die Markierung kann sodann nachgewiesen werden und das Muster der Fragmente, die an die markierte Sonde hybridisiert haben, kann ermittelt werden.

Das Sequenzieren kann z. B. optional das Didesoxy- oder Kettenterminierungsverfahren umfassen. Bei diesem Verfahren kann die DNA als Template verwendet werden, um einen Satz von Fragmenten zu erzeugen, die sich in der Länge um eine einzelne Base voneinander unterscheiden. Die Fragmente können sodann nach Größe getrennt werden und die Basen am Ende können identifiziert werden, wodurch die ursprüngliche Sequenz der DNA wiederhergestellt wird.

Eine Hybridisierungsanalyse kann z. B. optional eine DNA-DNA-Hybridisierung eines oder mehrerer ausgewählter DNA-Fragmente, Gene oder ganzer genomischer DNA aus einer ersten Zelle oder Mikrobe an eine markierte DNA-Sonde umfassen, um die genetische Ähnlichkeit zwischen der ersten Zelle oder Mikrobe und der bekannten oder Vergleichszelle oder -mikrobe zu ermitteln. Eine Hybridisierungsanalyse kann z. B. das Übertragen der DNA durch das Southern-Blot-Verfahren auf die Membran, das Markieren und das Nachweisen, wie oben beschrieben, umfassen.

Eine Nukleinsäureanalyse kann optional z. B. eine denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) und/oder Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE) umfassen.

Eine Fettsäureprofilerstellung von Zellen und Mikroben kann z. B. optional unter Verwendung von Gaschromatographie, verbunden mit einem Flammenionisationsdetektor (GC-FID), oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) durchgeführt werden.

Was die Mikrobenkoloniemorphologie betrifft, so können eines oder mehrere des Folgenden z. B. optional untersucht werden: Größe; ganze Kolonieform, die z. B. kreisförmig, unregelmäßig oder rhizoid sein kann; Kolonierand, der z. B. glatt, filamentöse oder hüglig sein kann; Erhöhung, die z. B. flach, erhoben, konvex oder kraterförmig sein kann; Oberfläche, die z. B. faltig, rau, wachsig oder glänzend sein kann; Opazität, die z. B. transparent, transluzent oder opak sein kann; Pigmentierung; Farbe, die z. B. Rot, Gelb oder Weiß sein kann; und/oder Wasserlöslichkeit.

Was die Morphologie einzelner Mikroben betrifft, so kann diese optional z. B. als Kokkus (kugelförmig), Bacillus (stabförmig), spiralförmig (verdreht) oder pleomorph seiend ermittelt werden. Kokki können optional ein einzelner Kokkus, Diplokokken, Streptokokken, Tetraden, Sarcina oder Staphylokokken sein. Bacillen können optional ein einzelner Bacillus, Diplobacillen, Streptobacillen oder Kokkobacillen sein. Spiralförmige können optional Vibrionen, Spirillen oder Spirochäten sein.

Was die Morphologie von Säugetierzellen betrifft, so kann diese optional z. B. als fibroblastisch, epithelähnlich, lymphoblastenähnlich und/oder neuronal, mit oder ohne Axon, seiend ermittelt werden.

Ein kulturbasiertes Screening auf Nährstoffanforderungen kann optional das Inokulieren von Zellen oder Mikroben auf in ein oder mehrere unterschiedliche Wachstumsmedien wie z. B. unterschiedliche selektive Medien und das Überwachen in/auf welchen Medien Zell- oder mikrobielles Wachstum auftritt und in welchem Ausmaß sich das Wachstum zwischen unterschiedlichen Medien unterscheidet.

Kulturbasiertes Screening auf antimikrobielle Empfindlichkeit kann optional das Inokulieren von Mikroben auf ein oder mehrere unterschiedliche Wachstumsmedien umfassen, was z. B. durch Streichen oder Aussäen der Mikroben auf eine Petrischale, die ein geeigneten Nährstoffagar enthält, durchgeführt werden. Ein antimikrobielles Mittel kann sodann hinzugefügt werden, was z. B. durch Platzieren einer Filterpapierscheibe, die mit dem antimikrobiellen Mittel imprägniert ist, auf dem Wachstumsmedium durchgeführt werden. Mehrere Scheiben, die jeweils ein unterschiedliches antimikrobielles Mittel enthalten, können auf eine einzelne Petrischale hinzugefügt werden. Danach kann eine Ermittlung, ob eine Zone einer Wachstumshemmung um beliebige der einen oder mehreren Scheiben auftritt, durchgeführt werden, und ist dies der Fall, kann ermittelt werden, wie groß diese Zone ist.

Eine Immunhistochemische Analyse kann das Inkontaktbringen der Zellen mit einem oder mehreren markierten Mitteln wie z. B. Antikörpern umfassen. Somit kann auf das Vorhandensein spezifischer Antigene, insbesondere auf der Zelloberfläche einer Zelle oder Mikrobe, optional unter Verwendung spezifischer Antikörper getestet werden. Tests auf Antigene können auch als Serotypisierung bezeichnet werden. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Wenn die Antikörper für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, kann die Anzahl von Zellen dieses Typs sodann bewertet werden. Der Test kann optional das einfache Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von Agglutination, d. h. der Bildung von Komplexen von Zellen/Mikroben und Antikörpern, umfassen. Alternativ oder zusätzlich können die Antikörper markiert werden und kann der Assay z. B. einen Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und/oder eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) umfassen.

Der Antikörper kann optional aus z. B. einem CD3- oder CD8-Antikörper ausgewählt sein.

Eine Durchflusszytometrie kann optional verwendet werden, um die Eigenschaften von Zellen oder Mikroben in einer Probe oder Prüfprobe zu analysieren, z. B. die Anzahl von Zellen/Mikroben, den Prozentsatz lebendiger Zellen/Mikroben, Zell-/Mikrobengröße, Zell-/Mikrobenform und/oder Vorhandensein bestimmter Antigene auf der Zell-/Mikrobenoberfläche.

Eine Western-Blot-Hybridisierung kann optional verwendet werden, um Proteine und/oder Peptide zu analysieren.

Optional kann eine In-situ-Hybridisierung von markierten Sonden an Gewebe, Mikroben und/oder Zellen durchgeführt werden, optional unter Verwendung eines Arrayformats. Das Verfahren kann Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) sein, die z. B. verwendet werden kann, um chromosomale Anomalien zu analysieren und/oder Gene zu kartieren.

Analyse von Medium, das von einer Zellpopulation abgeleitet ist

Optional kann Medium, das von einer Zellpopulation abgeleitet ist, analysiert werden. Somit wird ein Analyseverfahren unter Verwendung von Massen- und/oder Ionenmobilitätsspektrometrie bereitgestellt, das umfasst:

  • (a) Verwenden einer ersten Vorrichtung zum Erzeugen von Rauch, Aerosol oder Dampf aus einem Zielkulturmedium, das von einer In-vitro- oder Ex-vivo-Zellpopulation abgeleitet ist;
  • (b) Massenanalyse und/oder Ionenmobilitätsanalyse des Rauchs, des Aerosols oder des Dampfs oder von davon abgeleiteten Ionen, um spektrometrische Daten zu erhalten; und
  • (c) Analysieren der spektrometrischen Daten, um eine oder mehrere Verbindungen, die im Zielkulturmedium vorhanden sind, zu identifizieren und/oder charakterisieren.

Ein solches Verfahren kann z. B. eine Information zu den im Kulturmedium vorhandenen Verbindungen bereitstellen, wodurch optional wieder eine Information zur Zellpopulation bereitgestellt werden kann, von der das Kulturmedium abgeleitet wurde. Beliebige der hierin in Bezug auf eine Zellpopulation und deren Analyse bereitgestellten Informationen gelten mutatis mutandis für das Verfahren zum Analysieren eines Kulturmediums, das von einer Zellpopulation abgeleitet wurde.

Shotgun-Lipidomics-Charakterisierung des NCI-60-Zelllinienfelds unter Verwendung von Schnelle-Verdunstungsionisation-Massenspektrometrie

Ein Methodikhintergrund wurde für Grundlagenstudien erstellt, die auf die Erforschung des molekularen Hintergrunds der REIMS-basierten Gewebeidentifikation abgezielt sind. Ferner wurden auch umfassende Shotgun-Lipidomics-Daten zur NCI-60-Zellliniensammlung erhalten.

Gemäß einer Ausführungsform kann die Schnelle-Verdunstungsionisation-Massenspektrometrie (REIMS) auf das Shotgun-Lipidomics-Fingerprinting von Krebszelllinien angewandt werden. Experimentelle Daten in Bezug auf diverse Ausführungsformen und Details zum experimentellen Schema sind nachstehend zu finden.

Gemäß einer Ausführungsform wurde die spektrale Reproduzierbarkeit für einen Satz von drei unterschiedlichen Zelllinien bewertet.

Das NCI-60-Zelllinienfeld wurde danach einer REIMS-Analyse unterzogen und der entstehende Datensatz wurde auf seine Unterscheidung unterschiedlicher Gewebeursprungstypen und die Korrelation mit öffentlich zugänglichen Gen- und Proteinexpressionsprofilen untersucht. Signifikante Korrelationen zwischen spektralen REIMS-Merkmalen und Genexpressionsprofilen wurden identifiziert und sind im Fall von fads2- und ugcg-Genen beispielhaft veranschaulicht.

REIMS ist ein attraktives Mittel zum Untersuchen von Zelllinien, da sie minimale Probenvorbereitungs- und Analysezeiten im Bereich von mehreren Sekunden umfasst. Kultivieren von Zelllinien.

Zellen wurden in RPMI-1640-Medium kultiviert, mit Ausnahme von HEK- und HeLa-Zellen in der Mycoplasmastudie, die in Gibco-DMEM-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kultiviert wurden. In sämtlichen Fällen wurden Medien mit 10 % (Vol./Vol.) fötalem Kälberserum und mit 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplementiert. Die Zellen wurden in 75-cm2-Gewebekulturkolben bei 37 °C unter Bedingungen einer befeuchteten Atmo sphäre von 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Zelllinien wurden unter Verwendung des MycoAlertTM Mycoplasma Detection Kit (Lonza Group Ltd, Basel, Schweiz) regelmäßig auf Mycoplasmakontamination gescreent. Bei einer Konfluenz von 80 %–90 % in 75-cm2-Gewebekulturkolben wurden Zellen mit einer Lösung phosphatgepufferter Saline (PBS, pH-Wert: 7,2) gespült und unter Verwendung von 0,1 % Trypsin/EDTA für 10 min losgelöst. Das Trypsin wurde danach mit überschüssigem Kulturmedium (RPMI) neutralisiert. Die Zellsuspension wurde bei 250 × g für 5 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen resuspendiert und zweimal in 10 ml PBS gewaschen. Eine dritte Waschung wurde in einem Eppendorf-Röhrchen mit nur 1 ml PBS durchgeführt. Die Zellpellets wurden gefroren und bei –80 °C bis zur weiteren Analyse gelagert.

Mycoplasmainfektion und -behandlung

Mycoplasmainfizierte HEK- und HeLa-Zelllinien wurden für 14 Tage mit 25 µg/ml Plasmocin™ Mycoplasma Elimination Reagent (InvivoGen, San Diego, CA, USA) behandelt.

REIMS-Analyse

Für eine REIMS-Analyse wurden zwei mobile Elektroden in Form einer Pinzette als Probennahmesonde (gespülte bipolare Pinzette, erhalten von Erbe Elektromedizin, Tübingen, Deutschland) verwendet. Eine Valleylab Force EZc leistungsgesteuerte elektrochirurgische Einheit (Covidien, Dublin, Irland) wurde mit einer Leistungseinstellung von 60 W im bipolaren Modus als Funkfrequenz-Wechselstrom-Leistungsversorgung (470 kHz, sinusförmig) verwendet. Eine PTFE-Verschlauchung mit einer Länge von 1,5 m, einem Außendurchmesser von 0,31 cm (1/8 Zoll) und einem Innendurchmesser von 0,15 cm (1/16 Zoll) (Fluidflon PTFE-Verschlauchung; LIQUID-scan GmbH Co. KG, Überlingen, Deutschland) wurde verwendet, um die eingebettete Fluidübertragungsleitung der biopolaren Pinzette mit der Einlasskapillare eines Massenspektrometers zu verbinden. Das inhärente Vakuumsystem des Massenspektrometers wurde für eine Aspiration des analythaltigen Aerosols verwendet, das während der Analyse erzeugt wurde. Dieser Aufbau ist in den 1A1C gezeigt.

Wie in den 1A1C gezeigt, kann eine Probe in Form eines Zellpellets 101 in einem Eppendorf-Röhrchen bereitgestellt werden. Eine Probennahmesonde 102 kann verwendet werden, um das Zellpellet 101 zu samplen. Die Probennahmesonde 102 kann durch eine HF-Leistungsversorgung 103 mit Energie bespeist werden. Das Anlegen einer HF-Spannung an die Probennahmesonde 102 führt zur Erzeugung eines Aerosols, das über die Übertragungsverschlauchung 104 zum Einlass 105 eines Massenspektrometers gesendet wird.

Die bestimmten Instrumenteinstellungen, die verwendet wurden, sind in der nachstehenden Tabelle angeführt:

Parameter EinstellungInjektionszeit 1000 ms Mikroabtastungen 1 Ionenmodus negativMassenbereich 150–2000Tubuslinsenspannung –160 V Kapillarenspannung –50 V Abschöpferspannung –24 V Kapillarentemperatur 250 °C Automatische Verstärkungsregelung Ein AGC-Ziel Hochdynamischer Bereich Auflösung 50.000 bei m/z 200.

Die massenspektrometrische Analyse der Zelllinienbiomasse wurde direkt an einem aufgetauten Zellpellet ohne weitere Probenvorbearbeitungsschritte durchgeführt. 0,1–1,5 mg Zellbiomasse wurden zwischen den Spitzen der Pinzette aufgenommen und die zwei Elektroden wurden danach eng aneinander gebracht (d. h. durch Zwicken der Biomasse zwischen den Spitzen der Pinzette). Die HF-Leistungsversorgung wurde unter Verwendung eines Fußschalters ausgelöst. Die Zelllinienbiomasse wurde aufgrund ihrer Nicht-Null-Impedanz schnell erhitzt und eine aerosolhaltige geladene molekulare Spezies der Analyten wird hergestellt und direkt in das Massenspektrometer übertragen. Mehrere technische Replikate wurden für jede Zelllinie aufgezeichnet.

Datenanalyse

Massenspektrometrische Rohdaten wurde unter Verwendung des MSConvert-Werkzeugs (Teil der ProteoWizard-3.0.4043-Suite) in das mzML-Format umgewandelt und danach als imzML-Format nach MATLAB (Mathworks, Natick, MA; http://www.mathworks.co.uk/) importiert, für eine Datenvorbearbeitung. Alle REIMS-Spektren wurden linear auf ein gemeinsames Samplingintervall von 0,01 Da interpoliert. Eine rekursive segmentweise Peakalignierung wurde danach verwendet, um kleine Massenverschiebungen in Peakpositionen über spektrale Profile hinweg zu eliminieren. Die alignierten Daten wurde einer Gesamtionenzählung-(TIC)-Datennormalisierung und log-basierten Transformation unterzogen. Eine Mustererkennungsanalyse und Visualisierung wurde in Matlab oder in RStudio (Boston, MA, USA, siehe auch www.r-project.com) durchgeführt. Der Massenbereich von m/z 150–1000 wurde für eine Datenanalyse verwendet. Für Eigenidentitätsexperimente wurde der Datensatz gefiltert, um einen verringerten Satz von m/z-Werten zu behalten: ein m/z-Wert wurde behalten, wenn der Unterschied zwischen den verfügbaren Proben bei einer Schwellenwerthöhe von alpha = 0,01 auf Basis des Kruskal-Wallis-Tests signifikant unterschiedlich war.

Ionenspezies in den Massenspektren wurden auf Basis von genauen Massenmessungen (Massenabweichung von < 3 ppm) und von MS/MS-Fragmentierungsmustern identifiziert.

Spektraler Inhalt

Spektraler Inhalt umfasst Fettsäuren und alle Glycerophospholipidspezies, die eine Ionisation im Negativ-Ionenmodus durchlaufen, darunter Phosphatidsäuren (PAs), Phosphatidylethanolamine (PEs), Phosphoditylglycerole (PGs), Phosphatidylserine (PSs), Phosphatidylinositole (PIs), gemäß früheren REIMS-Studien, die an Bulk-Gewebeproben durchgeführt wurden. Alle beobachteten Ionen zeigten eine einzelne negative Ladung, die große Mehrheit durch Bilden des quasimolekularen [M – H]-Ion. Außerdem wurde [M – NH3 – H] bei PEs beobachtet. Diverse Ceramid-, Glykosyliertes-Ceramid-, Diglycerid- und Triglyceridspezies wurden als [M + Cl]-Ionen nachgewiesen.

Reproduzierbarkeitsdatensatz

Für jeden Kreuzvalidierungsdurchgang wurde eine Hauptkomponentenanalyse-(PCA)-Transformation des Schulungsdatensatzes mit einer vordefinierten Anzahl von Hauptkomponenten (PCs) in R berechnet und ein Vorhersage-Score wurde für jede Testprobe unter Verwendung des Verfahrens der drei nächsten Nachbarn (3-NN) berechnet. Die Schulungsdaten im „Reproduzierbarkeitssatz“ wurden die folgt ausgewählt: für jeden Messtag wurde eine Zelllinie mit definierter Passage (p) und Kolbenzahl (A/B) als Teil der Schulungsdaten behalten (z. B. HeLa p4 A), wenn Proben aus zumindest zwei unterschiedlichen biologischen Replikaten (d. h. A1-3) verfügbar waren. Solche Sätze aus jeder der drei Zelllinien wurden willkürlich kombiniert, um ausgeglichene Schulungsdaten zu generieren, wobei jede Zelllinien durch eine ähnliche Anzahl von Proben dargestellt ist. Alle restlichen Proben bildeten den Testsatz.

2 zeigt das experimentelle Schema, das für die Bewertung der spektralen REIMS-Reproduzierbarkeit verwendet wurde. Insbesondere sind die Kolben A und B gezeigt.

Alle restlichen Proben bildeten den Testsatz. Die erhaltenen Kreuzvalidierungsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angeführt.

Die Tabelle zeigt Kreuzvalidierungsergebnisse für SNB-19-, HeLa- und MES-SA-Zelllinien auf Basis eines PCA-Modells, das die ersten vier Hauptkomponenten umfasst, und unter Verwendung von drei nächsten Nachbarn als Klassifikator:

Im Testsatz behalten vorhergesagtkorrektHeLaMES-SASNB-19HeLa p6 A Tag2 (9 Proben)
MES-SA p8 A Tag1 (9 Proben)
SNB-19 p4 A Tag1 (9 Proben)
63
2
-
-
57
-
-
-
54
100 %
97 %
100 %
HeLa p4 B Tag2 (9 Proben)
MES-SA p10 B Tag1 (9 Proben)
62
17
1
42
-
-
98 %
71 %
SNB-19 p4 B Tag2 (7 Proben) -- 56100 % HeLa p4 A Tag1 (9 Proben)
MES-SA p10 A Tag3 (12 Proben)
49
-
14
56
-
-
78 %
100 %
SNB-19 p6 A Tag2 (7 Proben) -15598 %

Kreuzvalidierungen wurden auf Basis eines PCA-Modells durchgeführt, das aus einem Schulungssatz erstellt wurde, wie hierin andernorts beschrieben. Gemäß dieser Verfahrensweise wurden drei unterschiedlichen Schulungssätze erstellt und einer PCA-Analyse unterzogen. Diese Schulungssätze umfassten zwischen 25 und 28 Sampling-Punkte, die < 15 % der gesamten Sampling-Punkte darstellen (n = 203). Die Zusammensetzung der Schulungssätze und entsprechenden Kreuzvalidierungsergebnisse sind in der obigen Tabelle gezeigt. Durchgängig zeigen die Kreuzvalidierungsergebnisse eine zu ≥ 98 % korrekte Klassifizierung für SNB-19-Proben, wobei nur eine einzelne Fehlklassifizierung beim dritten Schulungssatz beobachtet wurde, die vorläufig mit der ungleichen Probengröße für MES-SA (n = 12) und SNB-19 (n = 7) assoziiert war. Eine ungleiche Probengröße führt bekannterweise zu einer Verzerrung von PCA-Berechnungen in Richtung der größeren Probenteilmenge, was die Fehlklassifizierung von SNB-19-Zellen als MES-SA erklärt.

Spektrale Reproduzierbarkeit im NCI-60-Zelllinienfeld

Die nachstehende Tabelle zeigt die unterschiedlichen Zelllinien, die im NCI-60-Zelllinienfeld vorhanden sind, und die jeweilige Anzahl von Replikaten, die verwendet wurden.

UrsprungsgewebeZelllinieAnz. biologischer ReplikateAnz. technischer ReplikateBrust BT5491 4 HS-578-T1 6 MCF-71 12 MDA-MB-231 2 10 (6 + 4) MDA-MB-4681 TD-47-D1 11CNS SF2682 18 (8 + 10)SF2952 18 (8 + 10) SF5391 8 SNB-191 (3) 10 (10 + ? + ?) SNB-75nicht gemessen U2511 9 COLO-2051 10 KolonHCC29981 7 HCT-1517 HCT-1161 11HT-292 9 (5 + 4) KM-121 7 SW-6201 12Leukämie CCRF-CEM1 10HL-601 7 K5621 (2) 9 MOLT-41 6 RPMI-82261 5 SR18 Melanom LOX-IMVI1 9 M142 15 (7 + 8)Malme-3M 1 6 MDA-MB-4352 14 (4 + 10) SK-MEL-2 1 10SK-MEL-518SK-MEL-2819UACC6216UACC25719Nicht kleinzelliger Lungenkrebs A549110EKVX1 9 HOP-621 6 HOP-92113NCI-H23111NCI-H22619 NCI-H322M17 NCI-H46019 NCI-H52219 EierstockIGROV-128 (5 + 3) NCI-ADR-RES 19OVCAR-316OVCAR-417OVCAR-5110OVCAR-81 8 SK-OV-3 1 9 Prostata DU-14519PC-3111Niere 786-019A498111ACHN110CAKI-116RXF39316SN-12-C18TK-1019UO3117

Biologische Replikate wurden bei 6 der 58 Zelllinien analysiert, die in dieser Studie verwendet wurden. Um die Spezifität der spektralen REIMS-Daten in Bezug auf einzelne Zelllinien zu bewerten, wurden Kreuzvalidierungen durchgeführt, indem ein Replikat aus dem PCA-Modell-Erstellungsprozess weggelassen wurde und dieses danach in den entstehenden Datenraum projiziert und jeder Datenpunkt auf Basis seiner drei nächsten Nachbarn klassifiziert wurde.

3 zeigt eine PCA-Graphik des NCI-60-Zelllinienfelds, m/z 150–1000, wobei Replikate hervorgehoben sind.

Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse von Kreuzvalidierungsergebnissen des PCA-Modells, wie in 3 gezeigt. Kreuzvalidierungen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, wobei ein ganzes biologisches Replikat jeweils ausgelassen wurde. Gute Identifikationsergebnisse (100 %) wurden für Leukämie-K562-, Melanom-MDA-MB-231- und MDA-MB-435-Zelllinien erhalten. Ein Replikat von CNS-SF295 wurde korrekt klassifiziert. Ein zweites wird jedoch nur im Fall von 50 % der Datenpunkte korrekt zugeordnet. Die fehlklassifizierten Proben wurden allesamt falsch als SNB-19 klassifiziert, eine andere CNS-Zelllinie. Das Gleiche gilt für IGROV-1, wobei das fehlklassifizierte Replikat in OVCAR-8 fällt, eine andere Eierstockkrebszelllinie. Bei einer kleinen Probenzahl wird eine korrekte Klassifizierung schwieriger, die Zellidentität eines großen Teils von HT-29-Proben wurde dennoch korrekt vorhergesagt.

Insgesamt unterstützen die guten Vorhersageergebnisse ferner, dass spektrale REIMS-Profile verwendet werden können, um humane Zelllinienproben zu charakterisieren und klassifizieren.

Kreuzvalidierungsergebnisse für Replikate im NCI-60-Datensatz

Bei manchen Zelllinien wurden zwei biologische Replikate gemessen. Für diese beiden Zelllinien wurde das Replikat eines nach dem anderen behalten und mit Proben aus allen anderen Zelllinien als Schulungssatz supplementiert. Das andere biologische Replikat bildete den Testsatz.

Die Tabelle zeigt Kreuzvalidierungsergebnisse für replizierte NCI-60-Zelllinien auf Basis eines PCA-Modells des gesamten NCI-60-Datensatzes, der die ersten zehn Hauptkomponenten umfasst. Drei nächste Nachbarn als Klassifikator:

Im Testsatz behalten vorhergesagtkorrektK562 P5 (9 Proben) LE:K562 (9) 100 % K562 P11 (9 Proben) LE:K562 (9) 100 % MDA-MB-231 (6 Proben) BR:MDAMB231 (4)100 % MDA-MB-231 P10 (4 Proben) BR:MDAMB231 (6) 100 % SF295 1 (10 Proben) CNS:SF295 (4), CNS:SNB19 (4) 50 % SF295 2 (8 Proben) CNS:SF295 (10) 100 % M14 (7 Proben) ME:M14 (5), ME:MDAMB435 (1), ME:SKMEL28 (2) 63 % M14 (2) (8 Proben) ME:M14 (1), ME:MDAMB435 (6) 14 % MDA-MB-435 (10 Proben) ME:MDAMB435 (4) 100 % MDA-MB-435 P6 (4 Proben) ME:MDAMB435 (10) 100 % HT-29 (5 Proben) CO:HT29 (3), OV:OVCAR5 (1) 75 % HT-29 P3 (4 Proben) CO:HT29 (4) CO:COLO205 (1)80 % IGROV-1 (5 Proben) OV:IGROV1 (3) 100 %IGROV-1 P9 (3 Proben) OV:OVCAR8 (4) RE:UO31 (1) 0 %

Korrelation mit Genexpressionsdaten

Genexpression für das NCI-60-Zelllinienfeld wurde aus dem CellMiner-Online-Datenabfragewerkzeug erhalten. Für jedes verfügbare Gen und jeden gefilterten m/z-Wert wurden die Genexpression und die gebinnte Signalintensität über die Zelllinien hinweg unter Verwendung des Pearson-Korrelationskoeffizienten mit 1000 Iterationen korreliert. Der einem Bootstrapping unterzogene Korrelationswert wurde als das untere 95-%-Konfidenzintervallniveau der 1000 Iterationen definiert, wobei insgesamt 26.065 (Gene) x 17.878 (gefiltertes m/z) = 465.990.070 Werte erhalten wurden.

Bootstrapping unterzogene Korrelationsanalyse

Für jedes verfügbare Gen und jeden gebinnten m/z-Wert mit ausreichender Varianz wurde ein einem Bootstrapping unterzogener Korrelationskoeffizient berechnet, wobei insgesamt 26.065 × 5452 = 142.106.380 Korrelationswerte erhalten wurden. Bei jedem Gen-m/z-Wert-Paar wurden die Genexpression und die gebinnte Signalintensität über die 58 Zelllinien hinweg unter Verwendung des Pearson-Korrelationskoeffizienten mit 1000 Iterationen korreliert. Der einem Bootstrapping unterzogene Korrelationswert wurde als das untere 95-%-Konfidenzintervallniveau der 1000 Iterationen definiert.

Vergleich von Zelllinien- und Bulk-Krebsgewebespektren

4 zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs von Zelllinien- und Bulk-Krebsgewebespektren, die Masse-zu-Ladungs-Verhältnis-Werte indizieren, die als in kanzerösen Bulk-Gewebe oder Krebszelllinien signifikant erhöht waren.

Korrelation von spektralen REIMS-Daten mit Proteinexpressionsdaten

Proteinexpressionsdaten wurden aus der Online-Quelle der Technischen Universität München, Deutschland (Gholami et al., supra) erhalten. Das fads2-Gen codiert für das Fettsäuredesaturase-2-Protein. Für dieses Protein waren Daten jedoch nur für 29 Elemente des NCI-60-Zelllinienfelds verfügbar.

Um die Übereinstimmung von Daten in Bezug auf Gen- und Proteinexpression zu bewerten, wurden beide als Funktion von Phospholipidspezies PE(38:3) und des Verhältnisses von PE(38:3)/PE(38:2) aufgetragen.

5A zeigt ein Phospholipidspezies-PE(38:3)/PE(38:2)-Peakintensitätsverhältnis und 5B zeigt eine PE(38:3)-Peakintensität als Funktion der fads2-Proteinexpression.

Korrelation von glykosylierten Lipiden mit ugcg-Gen

Fragmentierungsspektren wurden für einen Peak bei m/z = 842–846, aufgezeichnet unter Verwendung eines Waters Xevo G2-XS Q-ToF®-Instruments mit einer Kollisionsenergie von 35 eV, aufgezeichnet. Die Fragmentierungsspektren zeigten ein ähnliches Verhalten und somit ein ähnliches strukturelles Rückgrat. Die beobachteten Hauptfragmente sind auf einen Verlust von HCl (∆m = 36 Da) und einen Verlust einer Hexoseeinheit-HCl (∆m = 198 Da) zurückzuführen. Der Verlust der Hexoseeinheit als primärer Fragmentierungspathway stimmt mit Spektren von Referenzstandards gut überein, wie sie bei Lipid Maps für das entsprechende [M – H]-Ion gefunden wurden. Es konnte zwischen glykosylierten und galaktosylierten Ceramiden nicht unterschieden werden.

Sicherheitsaspekte

Um jedweden negativen Einfluss auf die Gesundheit durch aerosolisierte Krebszellen zu vermeiden, wurde die Analysestelle in einem Handschuhkastenfach der Sicherheitsstufe Klasse II umschlossen, das mit einer UV-Lichtquelle und HEPA-Filtern ausgestattet war.

Robustheit von spektralen REIMS-Profilen

Um zu zeigen, dass spektrale REIMS-Muster reproduzierbar und ausreichend spezifisch sind, um zwischen humanen Krebszelllinien zu unterscheiden, wurden drei unterschiedliche Zelllinien (HeLa – zervikales Adenokarzinom, MES-SA – Uterussarkom und SNB-19 – Glioblastom) in einem Experiment analysiert, das auf das Testen der spektralen Reproduzierbarkeit ausgelegt war.

Das experimentelle Schema berücksichtigt die Varianz, die durch unterschiedliche Kulturchargen oder die Passage-Anzahl eingebracht wird, und die analytische Varianz, die durch die mehreren Messungen eingebracht wird. Es wird auf 2 Bezug genommen.

Replikate wurden willkürlich über die drei Analysetage hinweg analysiert, um die analytische Varianz und Robustheit eines REIMS-basierten Lipidprofilerstellungsverfahrens zu bewerten. Außerdem wurde der Einfluss von Gefrieren-Auftauen-Zyklen auf die spektrale Varianz untersucht und als insignifikant befunden.

Massenspektrometrische REIMS-Rohprofile der drei Zelllinien zeigen signifikante Ähnlichkeiten, wie aus 6A hervorgeht. Der spektrale Hauptinhalt umfasst vorwiegend Glycerophospholipidtyp-Membranlipidkomponenten wie z. B. Phosphatidylethanolamine (PEs), Phosphatidlinositole (PIs), Phosphatidylglycerole (PGs), Phosphatidsäuren (PAs) und Phosphatidylserine (PSs) sowie andere komplexe Lipide, darunter Ceramide und glykosylierte Ceramidspezies. Alle beobachteten Ionen zeigten eine einzelne negative Ladung, die große Mehrheit durch Bilden des quasimolekularen [M – H]-Ion. Außerdem wurde [M – NH3 – H] bei PEs beobachtet. Sphingolipidspezies wurden als [M + Cl]-Ionen nachgewiesen.

Für klinisch ausgerichtete Anwendungen wurden spektrale REIMS-Profile größtenteils unter Verwendung von überwachten multivariaten statistischen Analysen wie z. B. linearer Diskriminanzanalyse (LDA) analysiert, um die Differenzierung diverser Gewebetypen oder gesunder und kranker Gewebe zu erforschen.

In den nachstehend dargebotenen experimentellen Ergebnissen war die Analyse auf erforschende nichtüberwachte Analyseverfahren beschränkt, um zu bestätigen, dass REIMS-Profile sich reproduzierbar in unterschiedliche Gruppen gruppieren, die Zelllinienidentitäten entsprechen.

Eine PCA der REIMS-Profile definierte drei Gruppierungen, wie in 6B gezeigt, die den drei Zelllinien entsprechen. SNB-19-Zellen sind von HeLa- und MES-SA-Zellen entlang der ersten Hauptkomponente deutlich zu unterscheiden. Die zweite und die dritte Hauptkomponente ermöglichen eine vollständige Trennung von HeLa- und MES-SA-Zelllinien voneinander. Eine geringfügige Trennung entlang der zweiten Hauptkomponente durch Passage-Anzahlen wurde für HeLa und SNB-19 beobachtet, analytische und biologische Varianzen wurden jedoch als im Vergleich zu den inhärenten spektralen Unterschieden der Zelllinien klein befunden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass, auch wenn erwartungsgemäß eine biologische und analytische Varianz vorliegt, die aus den Zelllinienpellets erhaltenen spektralen REIMS-Profile eine ausreichende Reproduzierbarkeit und Spezifität zeigen, um humane Krebszelllinien zu charakterisieren und unterscheiden.

REIMS-Profil des NCI-60-Zelllinienfelds

Nachdem bestätigt wurde, dass spektrale REIMS-Muster in der Lage sind, zwischen drei Krebszelllinien zu unterscheiden, wurde ein Profil des gesamten NCI-60-Felds erstellt, das aus 60 unterschiedlichen humanen Krebszelllinien besteht. Auf Basis der Menge verfügbarer Biomasse nach Kultivierung wurden 4 bis 15 einzelne Messpunkte für jede Zelllinie erstellt. Mehrere biologische Replikate wurden ebenfalls aufgenommen (der ausführliche Probenaufbau ist in einer obigen Tabelle zu finden).

Eine hierarchische Gruppierungsanalyse, wie in 7 gezeigt, und Hauptkomponentenanalyse (wie in 3 gezeigt) der gefilterten Probendurchschnitte indizierten, dass die 60 Zellen durch einzigartige REIMS-Profile charakterisiert sind.

Biologische Replikate zeigten die erwartete Ähnlichkeitshöhe, wie durch die Gruppierungsanalyse (7) oder die Kreuzvalidierungsergebnisse in der obigen Tabelle indiziert.

Profilerstellungsstudien zeigten, dass die MDA-MB-435-Zellen Melamomzellenlinien stärker als den anderen Brustumorlinien gleichen (Ross, Nat Genet 2000).

In Einklang mit Genexpression, SNP- und Karyotypanalysen bestätigten die REIMS-Profile auch, dass MDA-MB-435 und M14 den gleichen Ursprung haben (7, Pfeile).

Durch die Karyotypisierung wurde ebenfalls festgestellt, dass NCI-ADR-RES tatsächlich ein arzneimittelresistentes Derivat von OVCAR-8 ist.

Wie in 7 gezeigt, zeigen diese Zelllinien (durch Pfeile indiziert) auch eine große Ähnlichkeit, was ihre REIMS-Profile betrifft. Insgesamt gesehen bestätigen diese Ergebnisse, dass REIMS-Profile stark mit der biologischen Identität von Krebszelllinien assoziiert sind.

Es wurde festgestellt, dass Gen- und Proteinexpressionsmuster des NCI-60-Felds mit Gewebetypen korrelieren, metabolomische Signaturen hingegen zwischen Gewebeursprüngen nicht unterscheiden.

Die Gruppierungsbildung der Zelllinien auf Basis deren REIMS-Lipidprofils zeigte eine umfassende Heterogenität innerhalb der meisten Gewebetypen, ausgenommen Melanomproben (7).

REIMS-Profile des NCI-60-Felds wurden danach mit Bulk-Krebsproben von Eierstock- und Kolonadenokarzinomen verglichen, die unter Verwendung des gleichen experimentellen Aufbaus analysiert wurden. Eine PCA-Graphik des erhaltenen Datensatzes ist in 8 gezeigt und zeigt deutliche Unterschiede zwischen Zelllinien und Bulk-Gewebeprüfproben entlang der ersten Hauptkomponente, was starke Unterschiede zwischen deren Membranlipidzusammensetzung nahelegt. Eine vorläufige Trennung nach Gewebeursprungstyp kann bei beiden Zelllinien und Gewebeprüfproben beobachtet werden, auch wenn diese beim Letzteren stärker ausgeprägt ist. Nur eine kleine Anzahl von Gewebeprüfproben (n = 4) war bei Eierstocktumoren verfügbar, auf Basis bisheriger Studien kann jedoch eine signifikante Erhöhung der Trennleistung für größere Probensätze erwartet werden. Nichtsdestotrotz ist die Trennrichtung in beiden Fällen ähnlich, was ähnliche lipidomische Unterschiede indiziert.

Repräsentative spektrale Profile sowohl für Eierstock- als auch Kolonkrebsgewebs- und -zelllinienproben sind in den 9A9D gezeigt.

9A zeigt das massenspektrale Profil für Bulk-Eierstockkrebsgewebe, 9B zeigt ein entsprechendes massenspektrales Profil für die Eierstockkrebszelllinie OVCAR-3, 9C zeigt ein massenspektrales Profil für Bulk-Kolorektalkrebsgewebe und 9D zeigt ein massenspektrales Profil für die Kolonkrebszelllinie HCT-15.

Bulk-Gewebeproben (vergleiche in vitro kultivierte Zelllinien) zeigen größere Mengen an langkettigen Phosphatidylinositolen wie z. B. PI(38:4) bei m/z 885,55. Ähnliche Trends wurden bei gewissen Phosphatidylethanolaminen beobachtet. Beispielsweise Peaks, die im Massenbereich von m/z 790–794 nachgewiesen wurden, die PE(40:6)-PE(40:4)-Spezies entsprechen, oder jene, die bei m/z 766,54 und 768,55 auftreten, die PE(38:4) bzw. PE(38:3) entsprechen. Hingegen wurde m/z 645,45, das PA(32:1) entspricht, in signifikant höheren Anteilen in Zelllinien gefunden.

Die charakteristischen Unterschiede in der Lipidzusammensetzung können auf den gleichmäßigen Lipidgehalt des Kultivierungsmediums zurückzuführen sein, was die komplexe Lipidquelle von realen Tumoren nicht wiederholt, die auf diätetischen und lebersynthetisierten Lipiden sowie De-novo-Lipidsynthese basieren (siehe 8 für eine statistische Analyse einzelner spektraler Merkmale, die mit Zelllinien und Bulk-Tumoren assoziiert sind).

Korrelation mit Genexpressionsdaten

Es wurde festgestellt, dass Zellen, die aus unterschiedlichen Geweben erhalten wurden, einander stärker ähneln als den entsprechenden klinischen Proben. Die Einschränkungen der Verwendung von Zelllinien als Ersatz für klinische Tumoren sind hinlänglich bekannt, ein Vorteil des NCI-60-Felds ist jedoch der Reichtum an pharmakologischen Daten, die auf dem Aussetzen der Zellen gegenüber großen Anzahl von Arzneimitteln und anderen chemischen Verbindungen basieren. NCI-60 wurde umfassender als jeder andere Zellliniensatz charakterisiert. Die Beziehung von globalen Mustern brachte einen wertvollen biologischen Einblick und zeigte das Ziel und den Wirkmechanismus von Antikrebsverbindungen auf.

Die Verfügbarkeit der REIMS- und Genexpressionsprofile ermöglicht das Identifizieren der Beziehung von Lipidom- und Transkriptommerkmalen in den NCI-60-Zelllinien.

Um Lipid-Gen-Assoziationen zu identifizieren, wurde der REIMS-Datensatz mit Genexpressionsdaten korreliert, die über das CellMiner-Online-Abfragewerkzeug erhalten wurden. Unter Verwendung einer umfassenden Strategie wurden die Muster jeder gebinnten m/z-Intensität mit dem Genprofil jedes Gens über die Zelllinie hinweg korreliert, wie oben beschrieben.

Eine starke positive Korrelation wurde zwischen den Expressionsintensitäten mehrerer Gene, die beim Lipidstoffwechsel eine wichtige Rolle spielen, und den Lipidprofilen der 60 Zellen beobachtet. Positiv assoziierte Lipid-Gen-Paare können eine kausal relevante Beziehung widerspiegeln, wenn das Genprodukt bei der Herstellung der bestimmten Lipidspezies ein Ratenbegrenzungsfaktor ist. Beispielsweise wurde festgestellt, dass das Expressionsmuster des fads2-Gens signifikant mit der Abundanz mehrerer Lipide korreliert, wie durch die Intensität von m/z-Peaks innerhalb des REIMS-Datensatzes widergespiegelt (10). Die Säugetier-∆6-Desaturase, die vom fads2-Gen codiert wird, katalysiert die Biosynthese von mehrfach ungesättigten Fettsäuren aus essentiellen Vorläuferfettsäuren wie z. B. Linolsäure C18:2n-6 und Linolensäure C18:3n-3. Andere berichtete Substrate umfassen C16:0, C20:2n-6, C20:3n-3, C24:4n-6 und C24:5n-3.

Peaks, die eine signifikante Korrelation mit der fads2-Genexpression zeigen, könnten putativ diversen ungesättigten Glycerophospholipiden zugeordnet werden. Einer der korrelierten gebinnten Peaks (entspricht m/z = 768,54) wurde einem Peak mit einer Mitte bei m/z = 768,5578 zugeschrieben, der wiederum PE(38:3) auf Basis genauer Massenmessungen und PE(18:0/20:3) auf Basis von MS/MS-Daten zugewiesen wurde.

Unter der Annahme, dass sowohl Enzymsubstrat als auch -produkt in die gleiche Phospholipidspezies integriert werden, kann das putative Substrat indirekt PE(38:2) bei m/z = 770,5733 zugeschrieben werden. Tatsächlich wurde festgestellt, dass die relative Abundanz von PE(38:2) und PE(38:3) eine signifikante Korrelation mit fads2-Genexpressionshöhen über die NCI-60-Zellen hinweg zeigt (11B).

Die Korrelation von PE(38:3)/PE(38:2)-Intensitätsverhältnis oder PE(38:3)-Abundanz wurde unter Verwendung von Proteinexpressionsdaten verifiziert, wie gezeigt und unter Bezugnahme auf 5 oben beschrieben. Somit wird in Einklang mit der enzymatischen Aktivität der Säugetier-∆6-Desaturase erwartet, dass Zellen, die höhere fads2-Mengen exprimieren, niedrigere PE(38:2)- und höhere PE(38:3)-Spiegel aufweisen. REIMS-Rohprofile von HL-60- und HT-29-Zellen (die hohe bzw. niedrige fads2-Expressionshöhen zeigen) verifizieren diese Hypothese: Bei HT-29-Zellen macht PE(38:3) ungefähr 15 % der relativen Abundanz im Vergleich zu PE(38:2) aus, bei HL-60 erhöht sich die relative Abundanz auf ungefähr 40 % von PE(38:2).

Starke Korrelationen wurden auch die ugcg-Genexpression betreffend festgestellt (12). Dieses Gen codiert für das UDP-Glukoseceramid-Glykosyltransferase-(UGCG)-Enzym, das den ersten Glykosylierungsschritt in der Glykosphingolipidbiosynthese katalysiert, wobei Ceramide und UDP-Glukose als Substrate dienen. Glykosylierte Lipide sind in Lipid-Rafts/Lipidmikrodomänen angereichert und spielen bei einer Vielzahl von Zellprozessen eine wesentliche Rolle. Positive Korrelationen wurden für mehrere Signale zwischen m/z = 700–900 und deren jeweiligen Isotopen beobachtet, wie in 12B und der nachstehenden Tabelle gezeigt.

Auf Basis genauer Massenmessungen und MS/MS-Experimenten wurden diese Spezies vorläufig als homologe monohexosylierte Ceramide in Form von [M + Cl] Ionen identifiziert. Isotopische Muster, die für diese Spezies aufgezeichnet wurden, und MS/MS-Daten unterstützen das Vorhandensein eines Chlorids im Adduktion. Alle Ionen zeigen ein analoges Fragmentierungsverhalten, wobei sie einen Verlust des Chloridions (∆m = 35 Da) und einen zusätzlichen Verlust der Hexoseeinheit (∆m = 198 Da, Verlust von HCl und C6H10O5) zeigen. Unter Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie allein ist es nicht möglich, zwischen glykosylierten und galaktosylierten Ceramidspezies zu unterscheiden, da sie identische Fragmentionen aufweisen. Beispielhafte Tandem-Massenspektren und Intensitäten massenspektrometrischer Signale als Funktion der Genexpressionszahl sind in 13 bzw. 14 zu finden. Es wurde in Bezug auf die ugcg-Expression keine Korrelation mit der Vorläuferceramidspezies noch dem Verhältnis von Glukosylceramiden zu Vorläuferceramiden beobachtet. Dies ist mit der Tatsache assoziiert, dass Ceramide ubiquitöse Vorläufer in der Sphingolipidbiosynthese sind und es zahlreiche biosynthetische Pathways gibt, bei denen Ceramide als Substrate, Zwischenstufen oder Produkte agieren.

Die folgende Tabelle zeigt spektrometrische Signale, die eine starke positive Korrelation mit der ugcg-Genexpression für den NCI-60-Datensatz zeigen:

Erw. Masse Genaue Masse∆ppmVorl. IDFormelAdduktKorrelationskoeffizient734,5355 734,53430,2GlyCer(d18:1/16:0) C40H77NO8[M + Cl]0,552818,6295 818,62820,2 GlyCer(d18:1/22:0)C46H89NO8[M + Cl]0,662842,6312 842,6332–0,2GlyCer(d18:1/24:2)C48H89NO8[M + Cl]0,602844,6451 844,64390,1 GlyCer(d18:1/24:1) C48H91NO8[M + Cl] 0,668 846,6627 846,6595 0,4GlyCer(d18:1/24:0) C48H93NO8[M + Cl]0,688 872,6733 872,6752–0,2GlyCer(d18:1/26:1) C50H95NO8[M + Cl]0,707

Andere Lipidspezies, die bei m/z = 860,6411, 862,6552 und 864,6775 nachgewiesen wurden, zeigten positive Korrelationen mit den Expressionsprofilen einer Anzahl von Genen, die für Proteine codieren, die an der Sphingolipidsynthese beteiligt sind, z. B. fa2h, ein Gen, das für ein Protein codiert, das die Synthese von 2-Hydroxysphingolipiden katalysiert. Weitere Gene umfassen das degs2-Gen, das für das Delta(4)-Desaturase-Spingolipid-2-Protein codiert, und das nr1h3-Gen, das für das Leber-X-Rezeptor-alpha-Protein codiert. Leber-X-Rezeptoren sind Teil des Kontrollsystems für Transkriptionsprogramme, die an der Lipidhomöostase und Entzündung beteiligt sind, und könnten somit die Erhöhung gewisser Sphingolipidspezies indirekt beeinflussen.

Analyse von mycoplasmainfizierten Zelllinien

Zellkulturen werden häufig durch Mycoplasma infiziert, eine Bakteriengattung, der es an einer Zellwand um ihre Zellmembran fehlt. Eine Mycoplasmainfektion kann viele physiologische Prozesse verändern und somit irreführende experimentelle Ergebnisse mit sich bringen, wenn eine Studie unter Verwendung infizierter Zellen durchgeführt wird. Plasmocin® (InvivoGen, San Diego, CA, USA) ist eine im Handel erhältliche Antibiotikabehandlung, die häufig verwendet wird, um eine Mycoplasmainfektion in Zellkulturen auszulöschen.

REIMS-Profile von mycoplasmafreien, mycoplasmainfizierten und mit Plasmocin® geheilten HeLa- und HEK-Zelllinien wurden aufgezeichnet.

Die Daten wurden wie in Bezug auf den NCI-60-Datensatz beschrieben vorbearbeitet. Bei jeder HeLa- und HEK-Zelllinie wurden ANOVA-Tests durchgeführt, um signifikante Unterschiede zwischen mycoplasmapositiven und -negativen Proben zu ermitteln.

Angepasste p-Werte wurden unter Verwendung des adaptiven Benjamini-Hochberg-(BH)-Verfahrens erhalten, um auf Mehrfachtests zu korrigieren.

26 zeigt die zeitabhängigen Rohintensitäten im Laufe einer Plasmocin®-Behandlung der Mycoplasmainfektion bei m/z = 747,5183.

Der Probennahmepunkt Nr. 1 entspricht Tag 1 und der ursprünglichen mycoplasmapositiven oder -negativen Probe und Probennahmepunkt Nr. 2 entspricht Tag 2 und der Zugabe des Plasmocin®-Antibiotikums. Probennahmepunkt Nr. 3 entspricht Tag 3. Probennahmepunkt Nr. 4 entspricht dem Entfernen des Plasmocin®-Antibiotikums. Probennahmepunkt Nr. 5 entspricht dem Zustand, dass alle Proben frei von Plasmocin®-Antibiotikum sind.

Wie in 27A gezeigt, waren 23 und 386 gebinnte m/z-Signale in mycoplasmainfizierten HEK- bzw. HeLa-Zellen signifikant höher. Die höhere Anzahl von signifikant erhöhten Peaks kann durch eine höhere Anzahl von Probennahmepunkten erklärt werden (was zu einer höheren Aussagekraft bei Signifikanztests beiträgt) oder kann die erhöhte Reaktivität von HeLa-Zellen in Bezug auf eine Mycoplasmainfektion widerspiegeln. Interessanterweise haben wir keine Signale festgestellt, die eine verringerte Intensität in mycoplasmainfizierten Zelllinien zeigen (p = 0,15). In Tabelle 15 ist die Annotation der 18 m/z-Signale aufgelistet, die als bei allen mycoplasmainfizierten Zellen signifikant erhöht befunden wurden (p = 1,37E-20). Beispielsweise sind Änderungen der Intensität von m/z 819,52 (auf Basis genauer Massenmessungen als PG(40:7) identifiziert) in mycoplasmafreien, mycoplasmainfizierten und mit PlasmocinTM behandelten HEK- und HeLa-Zellen gezeigt (28A und 28B). Es wurde festgestellt, dass dieser m/z-Wert gemeinsam mit dem Signal, das dessen Isotop entspricht, in mycoplasmainfizierten HeLa- und HEK-Zellen erhöht ist, die Intensität bei erfolgreicher Behandlung mit PlasmocinTM hingegen wieder auf Höhen vor der Infektion zurückkehrte. Ähnliche Ergebnisse wurden für die anderen m/z-Signale erhalten, die in Tabelle 15 gezeigt sind.

Im 18-dimensionalen Raum dieser m/z-Signale wurden mycoplasmainfizierte und mycoplasmafreie HEK- und HeLa-Proben mittels PCA analysiert (27B). Die erste Hauptkomponente (PC1) zeigt Unterschiede zwischen den zwei unterschiedlichen Zelllinien, während die zweite PC mycoplasmafreie und mycoplasmainfizierte Proben trennt.

Es wurde festgestellt, dass sich die Trends in den spektralen Intensitäten dieser Spezies bei gesunden und infizierten Zelllinien signifikant unterscheiden, was nahelegt, dass der Lipidstoffwechsel durch die Mycoplasmainfektion gestört wird. Der obige Ansatz demonstriert die Anwendbarkeit des REIMS-Verfahrens bei der Untersuchung von Änderungen während einer Mycoplasmainfektion und als mögliche Anwendung beim Mycoplasmascreening.

Schlussfolgerung

Die oben beschriebenen Experimente zeigen die Anwendbarkeit eines REIMS-basierten Shotgun-Lipidomics-Charakterisierungsansatz bei humanen kanzerösen Zelllinien. Es wurde festgestellt, dass einzelne Krebszelllinien reproduzierbare und zelllinienspezifische spektrale Profile aufweisen, wobei Spektren in weniger als fünf Sekunden erfasst werden konnten. Dies ermöglicht nicht nur eine schnelle Identifikation von Zelllinien auf Basis deren spektralen Fingerabdrucks, sondern auch eine ausführliche Charakterisierung der Membranlipidzusammensetzung, um die Änderungen der Zellmembranzusammensetzung bei unterschiedlichen Krebsphänotypen zu untersuchen.

Durch fortgeführte Analyse der Korrelation zwischen spektralen REIMS-Daten und Gen- und Proteinexpressionsdaten kann die Empfindlichkeit des spektralen REIMS-Verfahrens in Bezug auf die Tumorphänotypcharakterisierung ausführlich bewertet werden. Außerdem ermöglicht diese Technik, dass Untersuchungen von Gen-Knockout-Modellen bezüglich Änderungen des Lipidstoffwechsels oder der Wirkungen von Feeding-Experimenten mit mit stabilen Isotop markierten Nährstoffquellen durchgeführt werden.

Tabelle 1: Biomarkertabelle: Phospholipide und spektrometrische Signale davon

Identifizierte Phospholipide, die im Massenbereich m/z = 600–900 bei allen analysierten mikrobiellen Spezies nachgewiesen wurden. Nur Phospholipide mit relativen Abundanzen von > 5 % und nur die abundanteste Acylkettenkombination wurden berücksichtigt. Feste Wachstumsmedien, auf denen Bakterien gezüchtet wurden, sind in Klammer beigefügt. Die ID basiert lediglich auf der genauen Masse, wenn die Lipidzusammensetzung als Kohlenstoffsummenzahl anstatt einzelner Acylketten angegeben war. *Signalintensität nicht ausreichend, um bedeutsame MS/MS-Daten zu erhalten; Abkürzungen: PG = Phophatidylglycerol, PE = Phosphatidylethanolamin, CBA = Columbia-Blutagar, LB = lysogener Brüheagar, MCC = McConkey-Agar.

Tabelle 2 – Biomarkertabelle: Cardiolipine und spektrometrische Signale davon

Cardiolipinspezies, identifiziert für Staphylococcus epidermidis, ATCC 12228.

Verbindung Summenformel Genaue Masse [M – H]Erw. Masse Massenabweichung CL(62:0) C71H138O17P21323,9335 1323,9268 5,0 ppm CL(63:0) C72H140O17P21337,9492 1337,9426 4,9 ppm CL(64:0) C73H142O17P21351,9649 1351,9601 3,6 ppm CL(65:0) C74H144O17P21365,9806 1365,9758 3,5 ppm CL(66:0) C75H146O17P21379,9962 1379,9913 3,5 ppm CL(67:0) C76H148O17P21394,0119 1394,0070 3,5 ppm CL(68:0) C77H150O17P21408,0275 1408,0238 2,6 ppm CL(69:0) C78H152O17P2 1422,0432 1422,0400 2,3 ppm CL(70:0) C79H154O17P2 1436,0588 1436,0561 1,9 ppm CL(71:0) C80H156O17P2 1450,0745 1450,0748 0,2 ppm CL(72:0) C81H158O17P2 1464,0900 1464,0970 4,8 ppm

Tabelle 3 – Biomarkertabelle: Mykolsäuren und spektrometrische Signale davon

Identifizierte Mykolsäuren, wie in unterschiedliche Corynebacterium-Spezies nachgewiesen.

Verbindung Summenformel Genaue Masse [M – H]Erw. Masse Massenabweichung MS/MS-Fragmente alpha-Mykolsäure C28:0 C28H55O3439,415669 439,4159 0,5 ppm - alpha-Mykolsäure C30:0 C30H59O3467,446969 467,4473 0,7 ppm 227 (C14:0), 255 (C16:0) alpha-Mykolsäure C32:1 C32H61O3493,462619 493,4634 1,6 ppm - alpha-Mykolsäure C32:0 C32H63O3495,478269 495,4786 0,7 ppm 255 (C16:0) alpha-Mykolsäure C34:2 C34H63O3519,478269 519,4788 1,0 ppm - alpha-Mykolsäure C34:1 C34H65O3521,493919 521,4942 0,5 ppm 255 (C16:0), 281 (C18:1) alpha-Mykolsäure C36:2 C36H67O3547,509569 547,5102 1,2 ppm 281 (C18:1)

Tabelle 4 – Biomarkertabelle: Mykolsäuren und spektrometrische Signale davon

Identifizierte Mykolsäuren, wie in Rhodococcus-Spezies nachgewiesen.

Verbindung Summenformel Genaue Masse [M – H]Erw. Masse Massenabweichung alpha-Mykolsäure C28:0 C28H56O3439,4157 439,4159 0,5 ppm alpha-Mykolsäure C30:1 C30H58O3465,4313 465,4315 0,4 ppm alpha-Mykolsäure C30:0 C30H60O3467,4470 467,4472 0,4 ppm alpha-Mykolsäure C31:1 C31H60O3479,4470 479,4473 0,6 ppm alpha-Mykolsäure C31:0 C31H62O3481,4626 481,4630 0,8 ppm alpha-Mykolsäure C32:2 C32H60O3491,4470 491,4475 1,0 ppm alpha-Mykolsäure C32:1 C32H62O3493,4626 493,4634 1,6 ppm alpha-Mykolsäure C32:0 C32H64O3495,4783 495,4786 0,6 ppm alpha-Mykolsäure C33:2 C33H62O3505,4626 505,4630 0,8 ppm alpha-Mykolsäure C33:1 C33H64O3507,4783 507,4785 0,4 ppm alpha-Mykolsäure C33:0 C33H66O3509,4939 509,4943 0,8 ppm alpha-Mykolsäure C34:3 C34H62O3517,4626 517,4632 1,2 ppm alpha-Mykolsäure C34:2 C34H64O3519,4783 519,4788 1,0 ppm alpha-Mykolsäure C34:1 C34H66O3521,4939 521,4944 1,0 ppm alpha-Mykolsäure C34:0 C34H68O3523,5096 523,5100 0,8 ppm alpha-Mykolsäure C35:3 C35H64O3531,4783 531,4784 0,2 ppm alpha-Mykolsäure C35:2 C35H66O3533,4939 533,4946 1,3 ppm alpha-Mykolsäure C35:1 C35H68O3535,5096 535,5100 0,7 ppm alpha-Mykolsäure C35:0 C35H70O3537,5252 537,5259 1,3 ppm alpha-Mykolsäure C36:3 C36H66O3545,4939 545,4944 0,9 ppm alpha-Mykolsäure C36:2 C36H68O3547,5096 547,5102 1,1 ppm alpha-Mykolsäure C36:1 C36H70O3549,5252 549,5260 1,5 ppm alpha-Mykolsäure C36:0 C36H72O3551,5409 551,5424 2,7 ppm alpha-Mykolsäure C37:3 C37H68O3559,5096 559,5102 1,1 ppm alpha-Mykolsäure C37:2 C37H70O3561,5252 561,5257 0,9 ppm alpha-Mykolsäure C37:1 C37H72O3563,5409 563,5418 1,6 ppm alpha-Mykolsäure C37:0 C37H74O3565,5565 565,5573 1,4 ppm alpha-Mykolsäure C38:4 C38H74O3571,5096 571,5098 0,3 ppm alpha-Mykolsäure C38:3 C38H74O3573,5252 573,5261 1,6 ppm alpha-Mykolsäure C38:2 C38H74O3575,5409 575,5415 1,0 ppm alpha-Mykolsäure C38:1 C38H74O3577,5565 577,5579 2,4 ppm alpha-Mykolsäure C39:2 C38H76O3589,5565 589,5578 2,2 ppm

Tabelle 5 – Biomarkertabelle: Mykolsäuren und spektrometrische Signale davon

Identifizierte Mykolsäuren, wie in Nocardia-Spezies nachgewiesen.

Verbindung Summenformel Genaue Masse [M – H]Erw. Masse Massenabweichung alpha-Mykolsäure C48:3 C48H90O3713,6817 713,6797 2,8 ppm alpha-Mykolsäure C48:2 C48H92O3715,6974 715,6959 2,1 ppm alpha-Mykolsäure C50:3 C50H94O3741,7130 741,7114 2,2 ppm alpha-Mykolsäure C50:2 C50H96O3743,7287 743,7285 0,3 ppm alpha-Mykolsäure C52:3 C52H94O3769,7443 769,7430 1,7 ppm alpha-Mykolsäure C52:2 C52H96O3771,7600 771,7588 1,6 ppm alpha-Mykolsäure C53:3 C53H96O3783,7600 783,7596 0,5 ppm alpha-Mykolsäure C53:2 C53H94O3785,7756 785,7754 0,3 ppm alpha-Mykolsäure C54:4 C54H96O3795,7600 795,7594 0,8 ppm alpha-Mykolsäure C54:3 C54H98O3797,7756 797,7739 2,1 ppm alpha-Mykolsäure C54:2 C54H100O3799,7913 799,7902 1,4 ppm alpha-Mykolsäure C55:4 C54H102O3809,7756 809,7748 1,0 ppm alpha-Mykolsäure C55:3 C54H104O3811,7913 811,7907 0,7 ppm alpha-Mykolsäure C55:2 C54H106O3813,8069 813,8061 1,0 ppm alpha-Mykolsäure C56:5 C56H102O3821,7756 821,7748 1,0 ppm alpha-Mykolsäure C56:4 C56H104O3823,7913 823,7907 0,7 ppm alpha-Mykolsäure C56:3 C56H106O3825,8069 825,8053 1,9 ppm alpha-Mykolsäure C56:2 C56H108O3827,8226 827,8213 1,6 ppm alpha-Mykolsäure C57:4 C57H106O3837,8069 837,8050 2,3 ppm alpha-Mykolsäure C57:3 C57H108O3839,8226 839,8215 1,3 ppm alpha-Mykolsäure C58:5 C58H106O3849,8069 849,8068 0,1 ppm alpha-Mykolsäure C58:4 C58H108O3851,8226 851,8218 0,9 ppm alpha-Mykolsäure C58:3 C58H110O3853,8382 853,8375 0,8 ppm alpha-Mykolsäure C59:3 C59H112O3867,8539 867,8537 0,2 ppm alpha-Mykolsäure C60:4 C60H112O3879,8539 879,8537 0,2 ppm alpha-Mykolsäure C60:3 C60H114O3881,8695 881,8683 1,4 ppm

Tabelle 6 – Biomarkertabelle: Mykolsäuren und spektrometrische Signale davon

Identifizierte Mykolsäuren, wie in unterschiedliche Mycobacterium-Spezies nachgewiesen.

Verbindung Summen-formel Genaue Masse [M – H] Erw. Masse Massenabweichung alpha-Mykolsäure C77:2 C77H150O31122,1512 1122,1525 1,2 ppm alpha-Mykolsäure C78:2 C78H152O31136,1669 1136,1684 1,3 ppm alpha-Mykolsäure C79:2 C79H154O31150,1825 1150,1833 0,7 ppm Epoxid/Keto-Mykolsäure C79:1 oder Methoxy-Mykolsäure C79:2 C79H154O41166,1774 1166,1769 0,4 ppm Epoxid/Keto-Mykolsäure C80:1 oder Methoxy-Mykolsäure C80:2 C80H156O41180,1931 1180,1897 2,9 ppm Epoxid/Keto-Mykolsäure C81:1 oder Methoxy-Mykolsäure C81:2 C81H158O31194,2087 1194,2102 1,3 ppm

Tabelle 7 – Biomarkertabelle: Sphingolipide und spektrometrische Signale davon

Identifizierte Spingolipidspezies in Mitgliedern des Bacteroidetes-Phylums.

Formel Experimentelle Masse Genaue Masse Massenabweichung Beobachtet in Ceramid-Phosphorylethanolamin/Phosphoethanolamin-Dihydroceramiden (PE-DHC) C36H74N2O7P677,5253 677,5239 2,0 B. fragilis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis, B. vulgatus, P. bivia, P. distonasis C37H76N2O7P691,5411 691,5396 2,2 C38H78N2O7P705,5569 705,5552 2,4 Ceramiden C34H69NO4Cl 590,4934a590,4921 2,2 B. fragilis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis, B. vulgatus, P. bivia, P. distonasis C35H71NO4Cl604,5090 604,5077 2,1 C36H73NO4Cl618,5246 618,5234 1,9 Bacteroides-fragilis-α-Galaktosylceramiden C40H79NO9Cl752,5465 752,5449 2,1 B. fragilis C41H81NO9Cl766,5623 766,5605 2,3 C42H83NO9Cl780,5781 780,5762 2,4 C15:0-substituierten Phosphoglycerol-Dihydroceramiden (subPG-DHC) C50H100O10NP 904,7007 904,7028 2,3 B. fragilis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis, B. vulgatus, P. distonasis C51H102O10NP 918,7163 918,7185 2,4 C52H104O10NP 932,7324b932,7337 1,4 C53H106O10NP 946,7481b 946,7484 0,3 C54H108O10NP 960,7637b960,7624 1,3 Unsubstituierten Phosphoglycerol-Dihydroceramiden (unPG-DHC) C37H76O9NP 708,5184 708,5199 2,1 P. distonasis C39H80O9NP 736,5497 736,5484 1,8
Tabelle 8 – Biomarkertabelle: Quorum-Sensing-Moleküle und spektrometrische Signale davon Identifizierte Quorum-Sensing-Moleküle in Psuedomonas aeruginosa. Verbindung Summenformel Genaue Masse Erw. Masse Massenabweichung 2-Heptylchinolin-4(1H)-on C16H21NO [M – H] = 242,1550 242,1552 –0,8 ppm 2-Heptyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolon (PQS) C16H21NO2[M – H] = 258,1499 258,1502 –1,2 ppm Hydroxynonenylchinolin C18H23NO [M – H] = 268,1707 268,1711 –1,5 ppm Hydroxynonylchinolin C18H25NO [M – H] = 270,1863 270,1868 –1,9 ppm Hydroxyundecenylchinolin C20H26NO [M – H] = 296,2020 296,2023 –1,0 ppm

Tabelle 9 – Biomarkertabelle: Rhamnolipide und spektrometrische Signale davon.

Rhamnolipidspezies, die üblicherweise von P.-aeruginosa-Stämmen hergestellt werden.

Verbindung Summenformel Genaue Masse [M – H]Erw. Masse Massenabweichung Rha-C20C26H48O9503,3225 503,3224 0,2 ppm Rha-C22:1C28H50O9529,3382 529,3384 –0,4 ppm Rha-C22C28H52O9531,3539 531,3538 0,2 ppm Rha-Rha-C20C32H58O13649,3805 649,3804 0,2 ppm Rha-Rha-C22C34H62O13677,4118 677,4116 –0,3 ppm Rha-Rha-C22:1C34H60O13675,3961 675,3965 –0,6 ppm

Tabelle 10 – Biomarkertabelle: Surfactine und spektrometrische Signale davon.

Surfactinspezies, wie im Positiv- und Negativ-Ionenmodus für Bacillus subtilis nachgewiesen.

Negativ-Ionenmodus Positiv-Ionenmodus Verbindung Erw. Masse Genaue Masse [M – H]∆ppmErw. Masse Genaue Masse [M + Na]+∆ppm Surfactin(C13) 1006,6453 1006,64401,31030,6389 1030,64162,6Surfactin(C14) 1020,6604 1020,65970,71044,6545 1044,65732,7Surfactin(C15) 1034,6754 1034,67530,11058,6702 1058,67292,6

Tabelle 11 – Biomarkertabelle: Lichenysine und spektrometrische Signale davon.

Lichenysinverbindungen, wie in Bacillus licheniformis nachgewiesen.

Verbindung Erw. Masse Genaue Masse [M – H] ∆ppm Lichenysin (C13) 1005,6594 1005,6600 0,6 Lichenysin (C14) 1019,6748 1019,6756 0,8 Lichenysin (C15) 1033,6906 1033,6913 0,7 Lichenysin (C16) 1047,7055 1047,7070 1,4

Tabelle 12 – Biomarkertabelle:

Massenspektrometrische Signale, die eine starke positive Korrelation mit der ugcg-Genexpression für einen Zellliniendatensatz (NCI-60) zeigen.

Erw. Masse Genaue Masse ∆ppm Vorl. ID Formel Addukt Korrelationskoeffizient 734,5355 734,5343 0,2 GlyCer(d18:1/16:0) C40H77NO8[M + Cl]0,552 818,6295 818,6282 0,2 GlyCer(d18:1/22:0) C46H89NO8[M + Cl]0,662 842,6312 842,6332 –0,2 GlyCer(d18:1/24:2) C48H89NO8[M + Cl]0,602 844,6451 844,6439 0,1 GlyCer(d18:1/24:1) C48H91NO8[M + Cl]0,668 846,6627 846,6595 0,4 GlyCer(d18:1/24:0) C48H93NO8[M + Cl]0,688 872,6733 872,6752 –0,2 GlyCer(d18:1/26:1) C50H95NO8[M + Cl]0,707

Tabelle 13 – Biomarkertabelle für Mycoplasma:

Auflistung von m/z-Peaks, die bei mycoplasmainfizierten Proben signifikant höher als bei mycoplasmafreien Proben sind, sowohl in HEK- als auch HeLa-Zelllinien. Spalte 2 zeigt den entsprechenden gebinnten Peak, Spalte 2 hebt putative Isotoppeaks hervor, Spalte 4 hingegen zeigt die vorläufige Annotation des gebinnten Peaks. Phosphatidylglycerol- und Sphingomyelinspezies, die Mycoplasma-Hauptbestandteile sind, sind fett dargestellt.

signifikant unterschiedliches gebinntes m/z entsprechendes m/z-Signal Annotation 687,54 687,5468 722,51 722,5156 PE(P-36:4) 733,53 733,5231 PE(P-38:4) 747,52 747,5193 PG(34:1) 748,53 748,5243 Isotop von m/z = 747,52 753,51 753,5090 PG(P-36:4) 764,52 764,5264 PE(38:5) 764,53 764,5262 PE(38:5) 766,53 766,5412 PE(38:4) 773,54 773,5359 PG(36:2) 774,54 774,5391 PG(36:2), Isotop von m/z = 773,54 774,55 774,5391 PG(36:2), Isotop von m/z = 773,54 775,56 775,5520 PG(36:1) 776,56 776,5564 PG(36:1), Isotop von m/z = 775,56 776,57 776,5564 PG(36:1), Isotop von m/z = 775,56 819,52 819,5189 PG(40:7) 820,53 820,5268 PG(40:7), Isotop von m/z = 819,52 820,54 820,5268 PG(40:7), Isotop von m/z = 819,52
Tabelle 14: Biomarkertabelle: mikrobielle taxonspezifische Biomarker Taxonspezifische Marker, wie für diverse Mikroben erhalten. Es wurden keine Marker berechnet, wenn die Größe des Probensatzes unausreichend war. Tabelle 16. Taxonspezifische Marker, wie auf Phylumebene ermittelt. Phylogenetische Information Taxonomische Ebene m/z-Wert Verbindungs-ID Gramnegativ Bacteroidetes (Phylum) 381,2765653,5113Sphingolipid654,5143Isotop m/z = 653 623,5024640,4993639,4954393,2764616,4724CerP(d34:1)) 624,5054Isotop m/z = 623 637,5044Isotop m/z = 635592,4883Isotop m/z = 590 604,5083Cer(d18:0/h17:0) 605,5113Isotop m/z = 604 606,5033Isotop m/z = 604 590,4923Cer(d34:0(2OH)591,4963Isotop m/z = 590 705,5562PE-DHC691,5395PE-DHC677,5238PE-DHCFusobakterien (Phylum) 646,4833PE-Plasmalogen227,2015648,4832856,6782865,6632696,4953PE-Plasmalogen714,5492673,4443644,4652884,7083645,4633647,4812Kombinationsmarker
mit m/z = 227
Proteobakterien 768,5182782,5342783,5293Grampositiv Actinobakterien - Firmicutes -
Tabelle 17. Taxonspezifische Marker, wie auf Klassenebene ermittelt. Phylogenetische Information Ebene Taxonomischem/z-Wert Verbindungs-ID Gramnegativ └Bacteroidetes Bacteroidetes635,5004Sphingolipid616,5094Cer(d36:1(2OH))628,4913636,5044627,4883PE-Cer(33:1) 644,5033711,5902CerP(d36:1) 618,5233Cer(d36:0(2OH)) 712,5933619,5273Isotop 618 697,5743DG(42:5)620,5184698,5763648,5003637,5044617,5124Isotop m/z = 616 Flavobakterien 333,2084390,2324566,4794567,4834568,4864556,4034600,4664565,4654553,4674392,2484651,4953618,4773619,4813324,2545620,4883393,2504891,7411554,4714552,4643553,4674651,4953601,4723Gramnegativ └Fusobakterien Fusobakterien (Klasse) Gramnegativ └Proteobakterien Alpha-Proteobakterien Beta-Proteobakterien - Epsilon-Proteobakterien 993,8381867,6582731,5452730,5422Gamma-Proteobakterien - Grampositiv └Actinobakterien Actinobakterien (Klasse) - Grampositiv └Firmicutes Bacillen- Clostridien 731,5253PG Plasmalogen 732,5283Isotop m/z = 731 449,2685703,4923PG Plasmalogen 925,7262704,4953Isotop m/z = 703 Negativicutes560,4194426,3674Isotop m/z = 425 425,3644423,3505461,3394851,7352
Tabelle 18. Taxonspezifische Marker, wie auf Ordnungsebene ermittelt. Tabelle 19. Taxonspezifische Marker, wie auf Familienebene ermittelt.

Auch wenn die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, wird der Fachmann verstehen, dass diverse Änderungen an Form und Details vorgenommen werden können, ohne sich vom Umfang der Erfindung, wie er in den beiliegenden Ansprüchen definiert ist, zu entfernen.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

  • GB 1503876 [0001]
  • GB 1503864 [0001]
  • GB 1518369 [0001]
  • GB 1503877 [0001]
  • GB 1503867 [0001]
  • GB 1503863 [0001]
  • GB 1503878 [0001]
  • GB 1503879 [0001]
  • GB 1516003 [0001]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Strittmatter et al. Anal. Chem. 2014, 86, 6555–6562 [0004]
  • Robert H. Shoemaker „The NCI60 human tumour cell line anticancer drug screen”, Nature Reviews Cancer 6, 813–823, Oktober 2006 [0008]
  • Weinstein „Integromic analysis of the NCI-60 cancer cell lines”, Breast Dis. 2004; 19: 11–22 [0009]
  • Gholami, Amin M., et al., Global Proteome Analysis of the NCI-60 Cell Line Panel. Cell Reports, 2013. 4(3): S. 609–620 [0033]
  • Shamir und Ewald, Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 647–664 (2014) [0466]
  • „LipidBlast – in-silico tandem mass spectrometry database for lipid identification” von Kind et al., Nat Methods. August 2013; 10(8): 755–758; „LipidXplorer: A Software for Consensual Cross-Platform Lipidomics” von Herzog et al. PLoS ONE 7(1): e29851 [0675]
  • „Lipid classification, structures and tools” von Fahy et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids, Band 1811, Ausgabe 11, November 2011, Seite 637–647, Lipidomics and Imaging Mass Spectrometry [0675]
  • Gholami et al., supra [0797]