Title:
Neue Dimere von Cytidin-Derivaten
Kind Code:
U1


Abstract:

Ein Cytidinderivat-Dimär mit der folgenden Allgemeinformel (I), embedded imagewobei:
R1 ein C1-C10-Alkyl, C1-C10 -substituiertes Alkyl, -(CH2)n-Ph oder substituiertes - (CH2)n-Ph ist; in -(CH2)n-Ph, n = 0, 1, 2, 3~10 und Ph Phenyl ist; eine Kohlenstoffkette des substituierten Alkyls ist unabhängig substituiert von einem, zwei oder drei von Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe; und in dem substituierten -(CH2)n-Ph, n = 0, 1, 2, 3~10, und eine Kohlenstoffkette oder ein Phenylring, die/der unabhängig von einem, zwei oder drei Halogen-, Cyanogruppen, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe substituiert ist;
R2 ein C1-C10-Alkyl, C1-C10-substituiertes Alkyl, -(CH2)n-Ph oder substituiertes - (CH2)n-Ph ist; in -(CH2)n-Ph, n = 0, 1, 2, 3~10 und Ph ist Phenyl ist; eine Kohlenstoffkette des substituierten Alkyls ist unabhängig substituiert mit einem, zwei oder drei von Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe; und in dem substituierten -(CH2)n-Ph, n = 0, 1, 2, 3~10, und eine Kohlenstoffkette oder ein Phenylring, die/der unabhängig von einem, zwei oder drei Halogen-, Cyanogruppen, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe substituiert ist;
R3 ein Wasserstoff, Alkoxycarbonyl oder substituiertes Alkoxycarbonyl ist, wobei ein Substituent des substituierten Alkoxycarbonyls Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe ist;
R4 ein Wasserstoff, Alkoxycarbonyl oder substituiertes Alkoxycarbonyl ist, wobei ein Substituent des substituierten Alkoxycarbonyls Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe ist; und
R5 ein -(CH2)n- ist, n 1 bis 15 oder substituiertes -(CH2)n- mit einem Substituenten an einer zugehörigen Kohlenstoffkette ist, der Substituent ist eine Phenylgruppe, eine substituierte Phenylgruppe, eine Cyanogruppe, eine Nitrogruppe, eine Aminogruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe oder -(CH2)n-X1-X2-; in -(CH2)n-X1-X2-, n = 0, 1, 2 oder 3 ist, X1 O oder S und X2 -(CH2)n-Ph ist, wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist oder X2 Pyrimidyl, Pyranyl, Imidazolyl, Pyrazinyl oder Pyridyl ist. embedded image




Application Number:
DE202015009594U
Publication Date:
06/25/2018
Filing Date:
06/10/2015
Assignee:
CHANGZHOU FANGYUAN PHARMACEUTICAL CO., LTD., Jiangsu (Changzhou, CN)
INNER MONGOLIA PUYIN PHARMACEUTICAL CO., LTD., Inner Mongolia (Chifeng, CN)
International Classes:



Attorney, Agent or Firm:
HUASUN Patent- und Rechtsanwälte, 80801, München, DE
Claims:
Ein Cytidinderivat-Dimär mit der folgenden Allgemeinformel (I), embedded imagewobei:
R1 ein C1-C10-Alkyl, C1-C10 -substituiertes Alkyl, -(CH2)n-Ph oder substituiertes - (CH2)n-Ph ist; in -(CH2)n-Ph, n = 0, 1, 2, 3~10 und Ph Phenyl ist; eine Kohlenstoffkette des substituierten Alkyls ist unabhängig substituiert von einem, zwei oder drei von Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe; und in dem substituierten -(CH2)n-Ph, n = 0, 1, 2, 3~10, und eine Kohlenstoffkette oder ein Phenylring, die/der unabhängig von einem, zwei oder drei Halogen-, Cyanogruppen, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe substituiert ist;
R2 ein C1-C10-Alkyl, C1-C10-substituiertes Alkyl, -(CH2)n-Ph oder substituiertes - (CH2)n-Ph ist; in -(CH2)n-Ph, n = 0, 1, 2, 3~10 und Ph ist Phenyl ist; eine Kohlenstoffkette des substituierten Alkyls ist unabhängig substituiert mit einem, zwei oder drei von Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe; und in dem substituierten -(CH2)n-Ph, n = 0, 1, 2, 3~10, und eine Kohlenstoffkette oder ein Phenylring, die/der unabhängig von einem, zwei oder drei Halogen-, Cyanogruppen, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe substituiert ist;
R3 ein Wasserstoff, Alkoxycarbonyl oder substituiertes Alkoxycarbonyl ist, wobei ein Substituent des substituierten Alkoxycarbonyls Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe ist;
R4 ein Wasserstoff, Alkoxycarbonyl oder substituiertes Alkoxycarbonyl ist, wobei ein Substituent des substituierten Alkoxycarbonyls Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe ist; und
R5 ein -(CH2)n- ist, n 1 bis 15 oder substituiertes -(CH2)n- mit einem Substituenten an einer zugehörigen Kohlenstoffkette ist, der Substituent ist eine Phenylgruppe, eine substituierte Phenylgruppe, eine Cyanogruppe, eine Nitrogruppe, eine Aminogruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe oder -(CH2)n-X1-X2-; in -(CH2)n-X1-X2-, n = 0, 1, 2 oder 3 ist, X1 O oder S und X2 -(CH2)n-Ph ist, wobei n 0, 1, 2 oder 3 ist oder X2 Pyrimidyl, Pyranyl, Imidazolyl, Pyrazinyl oder Pyridyl ist.

Cytidinderivat-Dimer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R3 Wasserstoff und R4 Wasserstoff ist.

Cytidinderivat-Dimer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass R1 und R2 gleich sind.

Anwendung des tumorinhibierenden Arzneimittels unter Verwendung des Cytidinderivat-Dimers nach Anspruch 1 oder einer Salzform davon.

Anwendung des tumorhemmenden Arzneimittels unter Verwendung des Cytidinderivat-Dimers oder der Salzform davon gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein Bluttumor oder ein maligner solider Tumor ist.

Pharmazeutische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch umfassend das Cytidinderivat-Dimer, wie durch die allgemeine Formel (I) gemäß Anspruch 1 gezeigt, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon als einen aktiven Bestandteil; und einer oder mehrere von medizinischen Trägern oder Hilfsstoffen.

Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass: eine Form der pharmazeutischen Zusammensetzung eine Injektionsform oder eine orale Verabreichungsform ist, wobei:
die orale Verabreichungsform Tabletten, Pulver, Granulat, Kapseln, Pelletformulierungen, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Sirups oder Elixiere umfasst; und
die Injektionsform eine Injektion vom Lösungstyp, eine Injektion vom Suspensionstyp, eine Emulsionsinjektion oder eine Injektion vom Typ eines sterilen Pulvers umfasst.

Description:
TECHNISCHER BEREICH

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Antitumorverbindung und insbesondere ein neues Cytidinderivat-Dimer.

HINTERGRUNDTECHNOLOGIEN

Krebs ist eine der häufigsten Krankheiten, die die menschliche Gesundheit bedrohen. Die Sterblichkeitsrate von Krebs zählt zu den höchsten unter anderen Krankheiten. Gegenwärtig stehen klinische Antitumor-Arzneimittel vor großen Toxizitätsproblemen bei der Chemotherapie. Heutzutage ist es ein wichtiges Forschungsthema bei Antitumormedikamenten, den therapeutischen Effekt zu verbessern und gleichzeitig die Toxizität der Arzneimittel zu reduzieren.

Vorhandene Cytidin-Verbindungen werden hauptsächlich zur Behandlung von Bluttumoren verwendet. Bestimmte Cytidin-Verbindungen werden auch für solide Tumore verwendet. Aufgrund der hohen Toxizität, des engen Anwendungsbereichs und der geringen therapeutischen Wirkung treten jedoch Probleme auf. Ferner neigt der menschliche Körper dazu, eine Arzneimittelresistenz gegenüber bestehenden Cytidin-Verbindungen zu erzeugen, was zu einem Versagen der Behandlung und zu einem Wiederauftreten des Tumors führt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Das technische Problem, das durch die vorliegende Erfindung gelöst werden soll, besteht darin, ein neues Cytidinderivat-Dimer davon mit hoher Wirksamkeit, hoher Antitumoraktivität und geringer Toxizität bereitzustellen.

Die technische Lösung, um das Ziel der vorliegenden Erfindung zu erreichen, umfasst ein neues Cytidinderivat-Dimer mit der folgenden Formel (I): embedded imagewobei R1 ein C1-C10-Alkyl, C1-C10-substituiertes Alkyl, - (CH2)n-Ph oder substituiertes -(CH2)n-Ph ist. In dem -(CH2)n-Ph ist n = 0, 1, 2, 3 ~ 10 und Ph ist Phenyl. Eine Kohlenstoffkette des substituierten Alkyls ist unabhängig substituiert mit einem, zwei oder drei von Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe. In dem substituierten -(CH2)n-Ph, worin n = 0, 1, 2, 3~10, und eine Kohlenstoffkette oder ein Phenylring, die/der unabhängig mit einem, zwei oder drei von Halogen-, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe substituiert ist. R1 ist vorzugsweise ein C1-C10-Alkyl oder -(CH2)n-Ph, wobei n = 0, 1, 2, 3~10; besonders bevorzugt ist ein C1-C4-Alkyl oder -(CH2)n-Ph, wobei n = 0, 1, 2, 3 ist; und weiterhin vorzugsweise n-Butyl oder Benzyl.

R2 ist ein C1-C10-Alkyl, C1-C10-substituiertes Alkyl, -(CH2)n-Ph oder substituiertes - (CH2)n-Ph. In der -(CH2)n-Ph, n = 0, 1, 2, 3~10. Eine Kohlenstoffkette des substituierten Alkyls ist unabhängig substituiert mit einem, zwei oder drei von Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe. In dem substituierten -(CH2)n-Ph, worin n = 0, 1, 2, 3~10, und eine Kohlenstoffkette oder ein Phenylring, die/der unabhängig mit einem, zwei oder drei der Halogen-, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe substituiert ist. R2 ist vorzugsweise ein C1-C10 Alkyl oder -(CH2)n-Ph, wobei n = 0, 1, 2, 3~10; besonders bevorzugt ist ein C1-C4-Alkyl oder -(CH2)n-Ph, wobei n = 0, 1, 2, 3; und weiterhin vorzugsweise n-Butyl oder Benzyl.

In einer besonders bevorzugten Auswahl sind R1 und R2 gleich.

R3 ist Wasserstoff, Alkoxycarbonyl oder substituiertes Alkoxycarbonyl, wobei ein Substituent des substituierten Alkoxycarbonyls Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe ist. R3 ist vorzugsweise H oder Alkoxycarbonyl; und bevorzugter H oder n-Butoxycarbonyl.

R4 ist Wasserstoff, Alkoxycarbonyl oder substituiertes Alkoxycarbonyl, wobei ein Substituent des substituierten Alkoxycarbonyls Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe ist. R4 ist vorzugsweise H oder Alkoxycarbonyl; und bevorzugter H oder n-Butoxycarbonyl.

In einer bevorzugteren Auswahl sind R3 und R4 beide Wasserstoff.

R5 ist -(CH2)n-, wobei n 1 bis 15 ist; oder substituierte -(CH2)n- mit einem Substituenten an einer Kohlenstoffkette davon, wobei der Substituent eine Phenylgruppe, substituierte Phenylgruppe, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe oder -(CH2)n-X1-X2-. In -(CH2)n-X1-X2-, n = 0, 1, 2 oder 3, X1 O oder S und X2 -(CH2)n-Ph ist, wobei n = 0, 1, 2, oder 3, oder X2 Pyrimidyl, Pyranyl, Imidazolyl, Pyrazinyl oder Pyridyl ist. R5 ist vorzugsweise -(CH2)n-, wobei n von 1 bis 15 oder -(CH2)n-X1-X2- ist, wobei n = 0, 1, 2 oder 3, X1 O oder S und X2 Ph ist; bevorzugter -(CH2)n-, wobei n 1 bis 5 oder -(CH2)-O-Ph- ist; und weiterhin bevorzugt -(CH2)2 - oder -(CH2)3-.

Vorstehend genannten neuen Cytidinderivat-Dimers oder einer seiner Salzformen bei der Herstellung von Arzneimitteln zur Inhibierung von Tumoren.

Der Tumor ist ein Bluttumor oder ein bösartiger solider Tumor.

Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst: ein Cytidinderivat-Dimer, wie durch die Formel (I) gezeigt, oder eins seiner pharmazeutisch verträglichen Salze als einen aktiven Bestandteil; und einer oder mehrere von medizinischen Trägern oder Hilfsstoffen.

Die Form der Zusammensetzung ist eine Injektionsform oder eine orale Dosierungsform. Die orale Dosierungsform umfasst: Tablette, Pulver, Granulat, Kapsel, Pelletformulierung, Lösung, Suspension, Emulsion, Sirupe oder Elixiere; und die Injektionsform umfasst Injektion vom Lösungs-Typ, eine Injektion vom Suspensionstyp, eine Injektion vom Emulsionstyp oder ein injizierbares steriles Pulver ein.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Behandlung von Krebs. Insbesondere zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, ein an einem Tumor leidendes Subjekt, einschließlich eines Säugers, insbesondere eines Menschen, zu behandeln. Die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis der neuen Verbindung (I) an das Individuum über einen Zeitraum hinweg erzeugt eine Antitumorwirkung.

In seiner breitesten Definition bezieht sich Krebs allgemein auf bösartiges Neoplasma, das ein abnormales Gewebe ist, das mit einer Geschwindigkeit wächst, die sich von normalem Gewebe unterscheidet und weiterhin auf die gleiche Weise wuchert, nachdem die Induktion des Stimulus aufhört. Außerdem hat dieses abnormale Gewebe keinen Zweck, absorbiert Nährstoffe vom Wirt und ist nahezu autonom. Krebs kann sich auch auf bösartigen Tumor beziehen. Eine weitere Diskussion von Neoplasmen findet sich in Kapitel 8 des Buches Robbins Pathologic Basis of Disease, sechste Ausgabe, von RS Cotran, V. Kumar und T. Collins RS Cotran (veröffentlicht von WB Saunders Company). Die Informationen in Kapitel 8 dieses Buches sind hierin durch Bezugnahme aufgenommen. Beispiele für Krebsarten, die durch Verabreichung der offenbarten Verbindung behandelt werden können, wie z. B. ein bösartiger Tumor oder Neoplasma.

Die offenbarten neuen Verbindungen sind wirksam bei der Behandlung von Neoplasmen, einschließlich Leukämie und soliden Tumoren. Zu den soliden Tumoren gehören Tumoren im Dickdarm, Rektum, Eierstock, Brust, Prostata, Lunge, Niere und Melanom. Der Bereich der Arzneimitteldosierung hängt vom Verabreichungsweg und Alter, Körpergewicht und Zustand des Patienten ab. Der Verabreichungsweg für die Verbindung kann ein parenteraler Weg sein, einschließlich intramuskulärer Injektion, intravenöser Injektion oder venöser Injektion.

Wie hierin verwendet, ist ein Patient oder ein Subjekt ein Wirbeltier mit einem Krebs oder einer anderen Krankheit. Vorzugsweise ist das Subjekt ein warmblütiges Tier, insbesondere ein Säugetier, einschließlich sowohl menschliche als auch nichtmenschliche Säugetiere. Beispiele für nichtmenschliche Säugetiere umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Nutztiere wie Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen, Pferde und Lamas und Haustiere wie Hunde und Katzen. Bevorzugter ist das Subjekt ein Mensch. Die vorliegende Erfindung erreicht eine Antitumorwirkung durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis der Verbindung an ein Subjekt über einen Zeitraum.

Für Säugetiere, einschließlich Menschen, kann eine wirksame Dosis basierend auf der Körperoberfläche bestimmt werden. In Krebs Chemother. Rep., 50 (4): 219 (1966), E.J. Freireich et al. veranschaulichen Zusammenhänge, dass die Dosis je nach Größe und Art der Tiere und Menschen variiert (auf der Basis der Körperoberfläche mg/m2). Die Körperoberfläche kann ungefähr entsprechend der Höhe und dem Gewicht des Individuums bestimmt werden (siehe z. B. Scientific Tables, Geigy harmaceuticals, Ardsley, N. Y., Seiten 537-538 (1970)). Ein geeigneter Dosierungsbereich kann von 1 bis 1000 mg der offenbarten Verbindung pro Quadratmeter Körperoberfläche sein. Das heißt, die Dosis beträgt 50-500 mg/m2.

Die vorliegende Erfindung hat mehrere vorteilhafte Wirkungen: (1) Durch molekulares Optimierungsdesign von Cytidin-basierten Verbindungen zeigen die hergestellten neuen Cytidinderivat-Dimere der vorliegenden Erfindung signifikante inhibierende Wirkungen auf menschliche Dickdarmkrebszellen HCT-116 und zeigen starke wachstumshemmende Wirkungen auf menschliche HCT-116 Dickdarmkrebs-Heterotransplantaten, die in Nacktmäusen gezüchtet wurden; Die offenbarten neuen Cytidinderivat-Dimere bieten eine hohe Antitumoraktivität mit geringer Toxizität.

Figurenliste

  • 1 veranschaulicht einen Syntheseweg eines Cytidinderivat-Dimers in Beispiel 1, in der Figur ist TBSCI tert-Butyldimethylsilylchlorid, pyr ist Pyridin, DCM ist Dichlormethan, rt ist Raumtemperatur, Butylcarbonochloridat ist Butylchlorformiat, HF.Et3N ist Triethylamintrihydrofluorid, über Nacht ist über Nacht, DCC ist N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und DMAP ist 4-Dimethylaminopyridin;
  • 2 veranschaulicht einen Syntheseweg eines Cytidinderivat-Dimers in Beispiel 2, in der Figur ist HMDS Hexamethyldisilazan, Rückfluss ist Rückfluss, Chloridat ist Chloridat, TEA ist Triethylamin, (Boc)2O ist Di-tert-butyldicarbonat, Dioxan ist 1,4 - Dioxan, Bernsteinsäureanhydrid ist Bernsteinsäureanhydrid, pyr ist Pyridin, DCC ist N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid, DMAP ist 4-Dimethylaminopyridin, TFA ist Trifluoressigsäure und DCM ist Dichlormethan;
  • 3 veranschaulicht einen Syntheseweg eines Cytidinderivat-Dimers in Beispiel 3, in der Figur ist HMDS Hexamethyldisilazan, Rückfluss ist Rückfluss, Chloridat ist Chloridat, TEA ist Triethylamin, (Boc)2O ist Di-tert-butyldicarbonat, Dioxan ist 1,4 - Dioxan, Glutarsäureanhydrid ist Glutarsäureanhydrid, pyr ist Pyridin, DCC ist N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid, DMAP ist 4-Dimethylaminopyridin, TFA ist Trifluoressigsäure und DCM ist Dichlormethan;
  • 4 veranschaulicht einen Syntheseweg eines Cytidinderivat-Dimers in Beispiel 4, in der Figur ist DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, DMAP ist 4-Dimethylaminopyridin, TFA ist Trifluoressigsäure und DCM ist Dichlormethan;
  • 5 ist ein Balkendiagramm, das die Inhibierungsraten von Klonbildung von menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebszellen, die mit vier Verbindungen in Konzentrationen von 50 nM, 150 nM und 450 nM in Anwendungsbeispiel 1 behandelt wurden, veranschaulicht; und
  • 6 ist ein Kurvendiagramm, das eine Dosis-Antwort-Beziehung zwischen Konzentrationen von Verbindungen und Inhibierungssraten bei menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebszellen zeigt, die mit den vier Verbindungen in Anwendungsbeispiel 1 behandelt wurden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung offenbart ein Cytidinderivat-Dimer mit einer Strukturformel wie Formel (I): embedded imagewobei R1 ein C1-C10-Alkyl, C1-C10-substituiertes Alkyl, -(CH2)n-Ph, wobei n = 0, 1, 2, 3 ~ 10 oder substituiertes -(CH2)n-Ph ist, wobei n = 0, 1, 2, 3~10 ist, und Ph Phenyl ist. Eine Kohlenstoffkette des substituierten Alkyls ist unabhängig substituiert mit einem, zwei oder drei von Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe. Eine Kohlenstoffkette oder ein Phenylring des substituierten -(CH2)n-Ph ist unabhängig substituiert mit einem, zwei oder drei von Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe.

R2 ist C1-C10-Alkyl, C1-C10-substituiertes Alkyl, -(CH2)n-Ph, wobei n = 0, 1, 2,3 ~10 oder substituiertes -(CH2)n-Ph, wobei n = 0, 1, 2, 3~10 ist, und Ph Phenyl ist. Eine Kohlenstoffkette des substituierten Alkyls ist unabhängig substituiert mit einem, zwei oder drei von Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe. Eine Kohlenstoffkette oder ein Phenylring des substituierten - (CH2)n-Ph ist unabhängig substituiert mit einem, zwei oder drei von Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe.

R3 ist Wasserstoff, Alkoxycarbonyl oder substituiertes Alkoxycarbonyl. Ein Substituent des substituierten Alkoxycarbonyls ist Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe.

R4 ist Wasserstoff, Alkoxycarbonyl oder substituiertes Alkoxycarbonyl. Ein Substituent des substituierten Alkoxycarbonyls ist Halogen, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe.

R5 ist -(CH2)n-, wobei n von 1 bis 15 ist. Oder R5 ist substituierte -(CH2)n-, wobei der Substituent eine Phenylgruppe, Cyanogruppe, Nitrogruppe, Aminogruppe, Hydroxylgruppe oder Carboxylgruppe ist. Alternativ ist R5 -(CH2)n-X1-X2-, wobei n = 0, 1, 2 oder 3, X1 O oder S und X2 -(CH2)n-Ph ist, wobei n = 0, 1, 2 oder 3, oder X2 Pyrimidyl, Pyranyl oder Pyridyl ist.

In Bezug auf Cytidinderivat-Dimere der vorliegenden Erfindung listet Tabelle 1 die folgenden Verbindungen auf. Die Cytidinderivat-Dimere der vorliegenden Erfindung sind jedoch nicht auf diese Verbindungen beschränkt. Tabelle 1. Verbindungen von beispielhaften Cytidinderivat-Dimeren.

Verbindung Nr.Substituentengruppe(n)101R1 und R2 sind n-Butyl, R3 und R4 sind n-Butoxycarbonyl, R5 ist - (CH2)3-102R1 und R2 sind n-Butyl, R3 und R4 sind n-Butoxycarbonyl, R5 ist - CH2-103R1 und R2 sind n-Butyl, R3 und R4 sind n-Butoxycarbonyl, R5 ist - (CH2)2-104R1 und R2 sind n-Butyl, R3 und R4 sind n-Butoxycarbonyl, R5 ist - (CH2)4-105R1 und R2 sind n-Butyl, R3 und R4 sind n-Butoxycarbonyl, R5 ist - (CH2)5-106R1 und R2 sind tert-Butyl, R3 und R4 sind n-Butoxycarbonyl, R5 ist -(CH2)3-107R1 und R2 sind n-Butyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -(CH2)3-108R1 und R2 sind n-Butyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -(CH2)2-109R1 und R2 sind n-Butyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -(CH2)2-O-Ph-110R1 und R2 sind n-Butyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -(CH2)-O-Ph-111R1 und R2 sind tert-Butyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -(CH2)2-O-Ph-112R1 und R2 sind Benzyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -(CH2)3-113R1 und R2 sind Benzyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -CHBr(CH2)2-114R1 und R2 sind Benzyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -CHPh(CH2)2-115R1 und R2 sind Benzyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -CHCNCH2-116R1 und R2 sind Benzyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -CHBrCH2-117R1 ist Benzyl, R2 ist n-Butyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -(CH2)2-118R1 ist Benzyl, R2 ist n-Butyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -(CH2)3-119R1 ist Benzyl, R2 ist n-Butyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -(CH2)2-O-Ph-120R1 ist Benzyl, R2 ist n-Butyl, R3 und R4 sind H, R5 ist -(CH2)2-O-Ph-, die para-Position des Phenylrings ist durch Nitro substituiert

Bei der Herstellung der Verbindungen in der obigen Tabelle werden die in dem Syntheseverfahren verwendeten festen Reagenzien direkt ohne weitere Behandlung verwendet, die flüssigen Reagenzien werden nach erneutem Destillieren und Trocknen verwendet.

(Beispiel 1)

Das Cytidinderivat-Dimer dieses Beispiels ist 1,5-Di- [4-N- (n-butyloxycarbonyl) -3'-O-(n-butoxycarbonyl) -2'-desoxy-2 ', 2'-difluor-cytidin]Glutarat (Codename D1, Nr. 101 in Tabelle 1) mit der folgenden Strukturformel: embedded image

Ein Syntheseweg von D1 ist in 1 gezeigt,
1H-NMR(MeOD-d4,400MHz) δ: 7.97(d, 2H, J=7.68Hz, H6-1, H6-2), 7.40(d, 2H, J=7.68Hz, H5-1, H5-2), 6.35(t, 2H, J=7.24Hz, H1'-1, H1'-2), 4.47(m, 6H, H5a'-1, H5a'-2, H5b'-1, H5b'-2, H4'-1, H4'-2), 4.21(m, 8H, O-CH2×4), 2.53(t, 4H, J=7.16Hz, CH2-CH2-CH2), 1.97(m, 2H, CH2-CH2-CH2), 1.64(m, 8H, O-CH2-CH2×4), 1.42(m, 8H, O-CH2-CH2-CH2x4), 0.98(m, 12H, CH2-CH3×4).

13C NMR(MeOD-d4,100MHz) δ: 172.83, 164.51, 153.87, 144.53, 96.26, 77.52, 69.13, 65.89, 61.94, 32.42, 30.66, 30.47, 18.83, 18.67, 12.79, 12.74, 8.48.

(Beispiel 2)

Das Cytidinderivat-Dimer dieses Beispiels ist 1,5-Di-[4-N-(n-butoxycarbonyl)-2'-desoxy-2',2'-difluorcytidin]glutarat (Codename D2, Nr. 107 in Tabelle 1) mit folgender Strukturformel: embedded image

Zuerst wurde eine Zwischenverbindung 8 hergestellt, das Reaktionsverfahren ist in 2 gezeigt.

1H-NMR(MeOD-d4,400MHz) δ 7.85(d, 2H, J=7.68Hz, H6-1, H6-2), 7.37(d, 2H, J=7.68Hz, H5-1, H5-2), 6.26(t, 2H, J=7.24Hz, H1'-1, H1'-2), 4.53(m, 2H, H5a'-1, H5a'-2), 4.40(m, 4H, H5b'-1, H5b'-2, H4'-1, H4'-2), 4.20(m, 2H, H3-1, H3-2), 2.73(m, 4H, - CH2-CH2-), 1.64(m, 4H, O-CH2-CH2), 1.37(m, 4H, O-CH2-CH2-CH2), 0.93(m, 6H, CH2-CH3).

13C-NMR(MeOD-d4,100MHz) δ 172.41, 164.01, 155.95, 153.52, 144.36, 96.56, 70.53, 66.29, 62.49, 30.74, 28.76, 19.01, 13.49.

ESIMS: errechnet für C32H40F4N6O14 m/z 809.25 (M+H)+, gemessen 809.34.

(Beispiel 3)

Das Cytidinderivat-Dimer dieses Beispiels ist 1,5-Di-[4-N-(benzyloxycarbonyl)-2'-desoxy-2',2'-difluorcytidin]glutarat (Codename D3). embedded image

Ein Syntheseweg von D3 ist in 3 gezeigt.

1H-NMR (MeOD-d4, 400MHz) δ: 8.31(d, 1H, J=7.64Hz, H6), 7.39(m, 5H, J=7.68Hz, Ph), 6.27(t, 2H, J=7.8Hz, H1'-1, H1'-2), 5.17(s, 4H, CH2-Ph×2), 4.46(m, 4H, H5a'-1, H5a'-2, H5b'-1, H5b'-2), 4.21(m, 2H, H4'-1, H4'-2), 4.10(m, 2H, H3'-1, H3'-2), ,2.53(t, 4H, J=7.16Hz, -CH2-CH2-CH2-), 1.99(q, 2H, J=7.2Hz, -CH2-CH2-CH2-).

13C NMR(MeOD-d4,100MHz) δ 172.90, 164.21, 155.90, 153.31, 144.25, 141.03, 135.86, 128.41, 128.28, 128.10, 124.85, 123.25, 122.26, 96.14, 79.17, 74.97, 67.59, 62.06, 33.19, 32.51, 19.96.

ESIMS: errechnet für C39H38F4N6O14 m/z 891.24 (M+H)+, gemessen 891.31.

(Beispiel 4)

Das Cytidinderivat-Dimer dieses Beispiels ist 1-O-(4-N-(Benzyloxycarbonyl)-gemcitabin)-4-O-(4-N-(n-Butoxycarbonyl)-Gemcitabin)-succinat (Codename D4) mit der folgenden Strukturformel: embedded image

Ein Syntheseweg von D4 ist in 4 gezeigt.

1H-NMR(MeOD-d4,400MHz) δ 7.98(m, 2H, H6-1, H6-2), 7.40(d, 2H, J=7.68Hz, H5-1, H5-2), 7.38(m, 6H, Ph), 6.26(t, 2H, J=8Hz, H1'-1, H1'-2), 5.21(s, 2H, CH2-Ph), 4.43(m, 2H, H5a'-1, H5a'-2), 4.29(m, 2H, H5b'-1, H5b'-2), 4.21 (m, 6H, H4'-1, H4'-2 H3'-1, H3'-2), 2.74(m, 4H, -CH2-CH2-), 1.43(m, 2H, O-CH2-CH2-), 1.28(m, 2H, O-CH2-CH2-CH2-), 0.97(t, 3H, J=7.4Hz, -CH2-CH3).

13C NMR(MeOD-d4,100MHz) δ 172.56, 164.19, 155.89, 153.52, 144.61, 135.86, 128.09, 122.22, 96.21, 79.38, 78.91, 70.83, 67.60, 65.92, 62.11, 56.72, 30.64, 28.66, 28.51, 25.93, 18.82, 14.26, 12.77.

ESIMS: errechnet für C35H38F4N6O14 m/z 843.24 (M+H)+, gemessen 843.33.

(Beispiel 5: Hydrochlorid des Cytidinderivat-Dimers)

Dieses Beispiel umfasst Hydrochlorid des Cytidinderivat-Dimers aus Beispiel 1.

Zusätzlich zu dem zuvor erwähnten Hydrochloridsalz können andere Salze von Cytidinderivat-Dimer hergestellt werden, einschließlich Phosphaten, Sulfaten, Carbonaten, Nitraten, Citraten, Tartraten, Maleaten, Succinaten, Sulfonaten, p-Toluolsulfonaten, Methansulfonaten, Benzoaten oder Fumaraten.

(Beispiel 6: Lyophilisiertes Pulver von Cytidinderivat-Dimer zur Injektion)

Dieses Beispiel umfasst die Herstellung von injizierbarem lyophilisiertem Pulver der Verbindung D3 aus Beispiel 3.

Zusätzlich zu den lyophilisierten Pulverinjektionen (d.h., steriles Pulver zur Injektion) können die Cytidinderivat-Dimer(e) der vorliegenden Erfindung in anderen geeigneten Formen für die Injektion gemacht werden, wie beispielsweise Injektionen vom Lösungstyp, Injektionen vom Suspensionstyp, Injektionen vom Emulsionstyp.

(Beispiel 7: Pharmazeutische Zusammensetzung von Cytidinderivat-Dimer)

Eine pharmazeutische Zusammensetzung des Cytidinderivat-Dimers dieses Beispiels umfasst einen pharmazeutisch aktiven Bestandteil und ein Hilfsstoff. Der pharmazeutisch aktive Bestandteil kann das Cytidinderivat-Dimer oder ein entsprechendes Salz davon sein, das in den vorhergehenden Beispielen hergestellt wurde. Der Gewichtsprozentanteil des pharmazeutisch aktiven Bestandteils in der Zusammensetzung kann 1% bis 95% (30% in diesem Beispiel) betragen. Die Hilfsstoffe können Wasser, Lactose, Maisstärke, Hydroxypropylmethylcellulose und Magnesiumstearat umfassen. Die Form der pharmazeutischen Zusammensetzung in diesem Beispiel ist eine Tablette.

Zusätzlich zu der obigen Tablettenform kann die pharmazeutische Zusammensetzung andere geeignete Formen annehmen. Der pharmazeutisch aktive Bestandteil kann zur oralen Verabreichung hergestellt werden als Pulver, Granulate, Kapseln, Pelletformulierungen, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Sirups oder Elixiere oder Formulierungen mit langsamer kontrollierter Freisetzung und Formulierungen mit kontrollierter Freisetzung oder andere geeignete Formen zur oralen Verabreichung. Diese oral verabreichten Arten von pharmazeutischen Zusammensetzungen können gewöhnlich verwendete entsprechende Hilfsstoffe enthalten (in Abhängigkeit von ihren Funktionen als Additive, Adjuvanten usw. kategorisiert). Die Additive können Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Zucker, Salz, Cellulose, Magnesiumsulfat usw. in pharmazeutischen Qualitäten enthalten.

Bei der Herstellung der oben erwähnten oral verabreichten pharmazeutischen Zusammensetzung können Adjuvanten in der Pharmakologie als medizinische Träger zum Tragen der pharmazeutisch aktiven Bestandteile verwendet werden und schließen im Stand der Technik bekannte Materialien ein, wie inerte feste Verdünnungsmittel, wässrige Lösungsmittel, Liposome, Mikrosphären und / oder nichttoxische organische Lösungsmittel. Bevorzugte Adjuvanten umfassen: Benetzungsmittel, Emulgatoren, pH-Puffer, Humanserumalbumin, Antioxidantien, Konservierungsmittel, Bakteriostatika, Dextrose, Saccharose, Trehalose, Maltose, Lecithin, Glycin, Sorbinsäure, Propylenglycol, Polyethylen, Protamin, Borsäure, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Mineralöl, Pflanzenöl usw. Eine oder mehrere Arten können ausgewählt und als ein medizinischer Träger kombiniert werden.

Die Zieltumore der offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen Bluttumore oder maligne solide Tumore. Insbesondere umfassen Zieltumore Lungenkrebs, Prostatakrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, Magenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs, Speiseröhrenkrebs, Hirntumor, Eierstockkrebs, Gebärmutterkrebs, Nierenkrebs, Kopf- und Halskrebs, Hautkrebs, Blasenkrebs, Vulvakrebs, Hodentumor, Dickdarmkrebs, Chorionkarzinom, Keimzelltumoren, malignes Lymphom, Leukämie und multiples Myelom. Ferner kann ein bevorzugter Zieltumor Bauchspeicheldrüsenkrebs (in einer First-Line- oder Second-Line-Behandlung), nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, kleinzelligen Lungenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom und/oder Darmkrebs umfassen. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt.

(Anwendungsbeispiel 1: Inhibierungstest einer Reihe von Verbindungen auf Koloniebildung von HCT-116 menschlichen Dickdarmkrebszellen)

1. Ein Kolonienbildungsinhibierungstest wurde verwendet, um die Wirkung von vier Kandidatenverbindungen (D1, D2, D3 und D4) in Konzentrationen von 50 nM, 150 nM und 450 nM auf die Inhibierung der Zellproliferation der menschlichen Dickdarmkrebszelllinie HCT-116 zu bewerten.

2. Experimentelles Material: Zelllinien: menschliche Dickdarmkarzinomzelllinie HCT-116, erworben von der Shanghai Academy Cell Resource Center der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Cat # TCHu 99.

3. Vorbereitung der Reagenzien

HCT-116 menschliche Dickdarmkrebszellkulturmedium: DMEM + 10% FBS.

Herstellung der Verbindung: DMSO wurde verwendet, um die Verbindung zu verdünnen, bis eine Endkonzentration von 100 µM erreicht war.

Herstellung einer Zellfärbelösung: Eine 0.5%-ige Kristallviolettlösung wurde unter Verwendung von wasserfreiem Ethanol hergestellt und im Dunkeln gelagert. Vor dem Anfärben wurde die Lösung mit einer PBS-Pufferlösung im Volumenverhältnis von 1: 4 als Zellfärbelösung gemischt.

4. Zellkultur: Zellen wurden in der logarithmischen Wachstumsphase geerntet, gezählt und in Komplettkulturmedium resuspendiert. Die Zellkonzentration wurde auf eine geeignete Konzentration eingestellt, 6-Well-Kulturschalen wurden angeimpft, wobei jedes Well etwa 300 Zellen und 1.8 ml Kulturmedium enthielt. Die Zellen wurden 5 Stunden in einem Inkubator bei 37°C, 100% relativer Feuchtigkeit und 5% CO2 inkubiert.

5. Inhibierungstest der Zellklonbildung und Datenverarbeitung

  1. (1) Zellen wurden in der logarithmischen Wachstumsphase gesammelt und gezählt. Die Zellen wurden in Kulturmedium, das 5% FBS enthielt, resuspendiert und gezählt. 6-Well-Platten wurden mit einer Anzahl von 300 Zellen pro Well besät. Die Zellen wurden 5 Stunden in einem Inkubator bei 37°C, 100% relativer Feuchtigkeit und 5% CO2 inkubiert.
  2. (2) Die Verbindungen wurden mit Kulturmedium (enthaltend 5% FBS) auf Konzentrationen von 0.5 µM, 1.5 µM und 4.5 µM verdünnt und den Zellen zu 200 µl pro Well zugegeben, um Endkonzentrationen von 50 nM, 150 nM und 450 nM zu erreichen. Jeder Konzentrationswert wurde wiederholt dreimal getestet.
  3. (3) Die Zellen wurden 72 Stunden in einem Inkubator bei 37°C, 100% relativer Feuchtigkeit und 5% CO2 inkubiert.
  4. (4) Das Kulturmedium von den Platten (das die Verbindungen enthaltende Kulturmedium) wurde abgesaugt. Die Platten wurden zweimal mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) gespült und durch frisches Kulturmedium (DMEM-Medium mit 15% FBS) ersetzt.
  5. (5) Zellen wurden 7 bis 10 Tage in einem Inkubator bei 37°C, 100% relativer Feuchtigkeit und 5% CO2 inkubiert, bis sichtbare klonierte Plaques gebildet wurden.
  6. (6) Das Kulturmedium wurde von den Platten abgesaugt. Die Platten wurden zweimal mit PBS-Lösung gewaschen.
  7. (7) Das restliche PBS wurde absorbiert und entfernt und 1 ml Ethanol pro Platte wurde zugegeben, und 30 Minuten fixiert.
  8. (8) Ethanol wurde absorbiert und entfernt, und Zellfärbelösung wurde zugegeben und 3 Minuten gefärbt.
  9. (9) Die Färbelösung wurde abgesaugt. Nach dreimaligem Spülen mit PBS wurden die Zellen gezählt.

Datenverarbeitung:

Klonbildungseffizienz = [As/Ac] × 100 %; Klonbildungsinhibierungsrate = 1-Klonbildungseffizienz, wobei As die Anzahl an Zellkolonien in behandelten Proben (zu testende Zellen + Verbindungen) bezeichnet und Ac die Anzahl an Zellkolonien in negativer Kontrolle (ohne Behandlung mit Proben) bezeichnet (Zellen + 1% DMSO).

6. Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 2 listet die Anzahl der klonierten Zellen von menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebszellen auf, die mit den vier Verbindungen behandelt wurden. Tabelle 2

Anzahl der klonierten HCT-116-ZellenDG-1DG-2DG-3DG-4mittel% Inhibierungmittel% Inhibierungmittel% Inhibierungmittel%InhibierungKontrolle25125524125650nM2423.58%2434.70%2371.66%2358.20%150nM18825.10%19125.10%2091.70%7570.70%450nM5279.28%3685.88%498.34%1195.70%
% Inhibierung: Inhibitionsrate

5 veranschaulicht die Inhibierungsraten der Klonbildung von menschlichen Dickdarmkrebszellen HCT-116, die mit den vier Verbindungen bei Konzentrationen von 50 nM, 150 nM und 450 nM behandelt wurden.

Tabelle 2 und 5 zeigen, dass die offenbarten Verbindungen signifikante Wirkungen bei der Inhibierung von Tumorzellen aufweisen.

6 veranschaulicht Dosis-Wirkungs-Beziehungskurven zwischen den Inhibierungsraten und den Verbindungskonzentrationen, wenn die menschlichen Dickdarmkrebszellen HCT-116 mit den vier Verbindungen behandelt werden. Wie in 6 gezeigt ist, betrug der IC50-Wert von D1 245.3 nM, der IC50-Wert von D2 betrug 226.6 nM, der IC50-Wert von D3 betrug 99.80 nM und der IC50-Wert von D4 betrug 111.7 nM.

(Anwendungsbeispiel 2: Wirkungen einer Reihe von Verbindungen auf die Tumorwachstumsinhibierung)

Durch Beobachtung der Tumorbildung und des Tumorwachstums an den Impfstellen und Veränderungen des Körpergewichts der Testtiere wurde in diesem Anwendungsbeispiel die Tumorwachstumsinhibierung von HCT-116-Dickdarmkrebs-Heterotransplantaten und die Toxizität einer einzelnen intraperitonealen Injektion der Verbindungen D1 bis D4 für HCT-116-dickdarmtumortragende Nacktmäuse bewertet.

1. Versuchsziele waren die Auswertung der Tumorwachstumsinhibierung von menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebs-Heterotransplantaten und die Toxizität einer einzelnen intraperitonealen Injektion der offenbarten Cytidinderivat-Dimerverbindungen an HCT-116-Dickdarmtumortragenden Nacktmäusen.

2. Vorbereitung der Testsubstanz

Quellen von Lösungsmitteln, die zum Auflösen der Testsubstanz verwendet werden, sind wie folgt:

LösungsmittelLot-NummerAnbieterReines Ethanol10009218Sinopharm Chemical Reagent Co., LtdCremophor EL27963Sigma0.9% Kochsalzlösung13083004HUAYU Pharmaceutical Co., Ltd

Die entsprechende Testsubstanz wurde gewogen und in ein 5-ml-Glasröhrchen gegeben und unter Rühren mit einem 5-mm-Magnetrührer in Ethanol gelöst. Nach einer vollständigen Auflösung wurde Cremophor EL unter kontinuierlichem Rühren zugegeben. Unmittelbar vor dem Gebrauch der Testsubstanz wurde die markierte Menge an physiologischer Kochsalzlösung zugegeben und gerührt. Das hergestellte Ethanol, Cremophor EL, physiologische Kochsalzlösung hatte ein Volumenverhältnis von 5:5:90.

3. Tiere für Experimente.

  • Arten und Stämme: Balb/c Nacktmäuse; Level: spezifisch pathogenfrei (SPF); Geschlecht: weiblich.
  • Anbieter: Shanghai Sippr/BK Lab Animal Ltd.
  • Anzahl der Tiere: 40 Tiere wurden bestellt und diejenigen mit der gewünschten Gesundheit wurden für die Experimente ausgewählt.
  • Zertifikat der Tierkonformitätsnummer: 0123627.
  • Tieralter zu Beginn der Experimente: 7 Wochen bis 9 Wochen.
  • Tiergewicht zu Beginn der Versuche: 18 Gramm bis 22 Gramm.
  • Akklimatisierungsdauer: 5 Tage bis 7 Tage.
  • Tiernummerierung: Schwanznummer.

Der Tierraum wurde bei 23 ± 2°C, 40% - 70% Feuchtigkeit, mit wechselndem Licht und Dunkelheit alle 12 Stunden gehalten.

Tierfutter (SLAC-M01) wurde von Beijing Ke Ao Xie Li Cooperation Limited erworben. Sterilisiertes Filtrationswasser wurde für die Versuchstiere verwendet. Während der Versuchszeit konnten die Tiere frei essen und trinken.

4. Experimentelle Methoden wurden bereitgestellt.

4.1 Tumorzellen: HCT-116-Dickdarmkrebszellen wurden vom Institut für Zellbiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften erworben. F-12-Medium (enthaltend 10% FBS) wurde verwendet, um Zellen bei 37°C mit gesättigter Feuchtigkeit in einem Kohlendioxid-Inkubator zu kultivieren, der einen Volumenanteil von 5% CO2 und 95% Luft enthielt. Vor dem Einimpfen wurden Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Nach dem Verdau mit 0.25% Trypsin wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden resuspendiert und gezählt. Serumfreies Medium wurde zur Zellresuspension verwendet und die Zellkonzentration wurde auf 3 × 107 Zellen/ml eingestellt.

4.2 Tierimpfung und -gruppierung: Unter aseptischen Bedingungen wurde jeder Nacktmaus 0.1 ml Zellsuspension subkutan in das rechte Hinterbein injiziert (3 × 106 Zellen/Maus). Als die Größe des Tumors auf ein Volumen von etwa 60-150 mm3 angewachsen war, wurden Nacktmäuse mit einer ähnlichen Tumorgröße und einer gewünschten Form (im Wesentlichen eine einzige Kugelform, ohne unregelmäßige Formen oder mehrere Gruppen von Tumoren) ausgewählt und gruppiert, dass jede Gruppe Mäuse enthält. Die Gruppensituation wurde wie folgt aufgelistet. Tabelle 3

Gruppe Nr.MedikationAnzahl der TiereDosierungVerabreichungswegInjektion1D16400IPQD×12D26400IPQD×13D36350IPQD×14D46300IPQD×113Kontrolle6-IPQD×1IP: intraperitoneale Injektion, QD × 1: eine Injektion.

Den Mäusen in der Kontrollgruppe wurde eine gemischte Lösung injiziert, die Ethanol, Cremophor EL und normale Kochsalzlösung in einem Verhältnis von 5:5:90 enthielt.

4.3 Arzneimittelverabreichung und Beobachtung von Tieren

Tumorbildung und Wachstum an Impfstellen in Nacktmäusen in jeder Gruppe wurden beobachtet. Die Durchmesser (D) der Tumorknötchen wurden dreimal pro Woche mit einem Kreisgrößenlineal gemessen. Zusätzlich wurde die folgende Formel angewendet, um das Volumen eines Tumorknotens (V) zu berechnen: V = 3/4π(D/2)3.

Bewertungsindizes der Antitumoraktivität waren die Tumorwachstumsinhibierungsrate TGI (%) und die relative Tumorproliferationsrate T/C (%).

Die Berechnungsformel von TGI war: TGI (%) = (Vcontrol - Vtreatment) / Vcontrol) × 100%. Das relative Tumorvolumen (RTV) wurde berechnet durch: RTV = Vt/V0, wobei V0 das Tumorvolumen zum Zeitpunkt der Gruppenverabreichung und Vt das Tumorvolumen zum Zeitpunkt der Messung ist.

Die Berechnungsformel der relativen Tumorproliferationsrate T/C (%) war: T/C (%) = TRTV/CRTV×100%. TRTV bedeutet Behandlungsgruppe RTV; und CRTV bezeichnet die negative Kontrollgruppe RTV. Die Mäuse wurden dreimal wöchentlich gewogen.

4.4 Klinische Symptome

Alle klinischen Symptome jedes Tieres wurden zu Beginn der Experimente und während der Experimente aufgezeichnet. Die Beobachtung wurde jeden Tag zur selben Zeit durchgeführt.

Nach Verabreichung der Testsubstanz, wenn die Gewichtsreduktion > 20% betrug, wenn das Tier starb, oder wenn das Tumorvolumen 2800 mm3 betrug, wurde das Tier durch Anwendung von CO2 getötet. Der Tumor wurde abgetrennt und gewogen, eine Autopsie und eine visuelle Untersuchung durchgeführt, um festzustellen, ob pathologische Veränderungen in den Organen vorlagen.

4.5 Daten und statistische Analyse

Sofern nicht anders angegeben, wurden die experimentellen Daten durch Mittelwert ± SEM dargestellt; der ungepaarte T-Test wurde zum Vergleich zwischen zwei Gruppen verwendet, das Ergebnis wurde als signifikant unterschiedlich angesehen, wenn P <0.05 war.

5. Ergebnisse der Experimente

(1) Wirkungen der Testverbindungen auf das Gewicht tumortragender Mäuse mit menschlichem Dickdarmkrebs HCT-116 Tabelle 4. Mäusegewicht an verschiedenen Tagen (g, Mittelwert ± SEM)

GruppenDosis (mg/kg)Tag 0 (g)Tag 1 (g)Tag 2 (g)Tag 4 (g)Tag 7 (g)D140019.98±0.4919.48±0.5817.45±0.81*16.15±1.0819.80±1.40D240019.87±0.2519.85±0.2818.17±0.3117.75±0.4418.48±0.40D335019.95±0.0919.23±0.3117.70±0.2618.24±0.58*19.51 ±0.48D430020.15±0.2919.90±0.1918.48±0.2**19.07±0.3619.85±0.38Kontrolle(NA)20.55±0.3720.43±0.4520.07±0.3820.02±0.2919.33±0.26GruppenDosis (mg/kg)Tag 9 (g)Tag 11 (g)Tag 14 (g)Tag 16 (g)Tag 18 (g)D140020.75±1.0521.25±1.5521.35±1.35*21.75±1.25*23.30±1.60D240019.92±0.4520.42±0.5320.85±0.60*21.13±0.5121.63±0.51D335020.74±0.3821.12±0.4121.26±0.2122.00±0.4022.58±0.38D430020.73±0.29*21.05±0.3120.90±0.3421.48±0.3421.95±0.27Kontrolle(NA)19.85±0.2320.23±0.2519.42±0.1919.62±0.2919.68±0.23GruppenDosis (mg/kg)Tag 21 (g)Tag 23 (g)Tag 25 (g)Tag 28 (g)Tag 30 (g)D140022.30±1.3022.60±1.50*23.20±1.7023.80±1.5023.60±1.20D240020.72±0.46*20.60±0.4020.88±0.4820.18±0.4420.33±0.55D335021.98±0.4122.44±0.4122.50±0.5322.12±0.48*22.90±0.60D430021.63±0.3022.03±0.4322.30±0.4921.88±0.5922.03±0.53Kontrolle(NA)19.30±0.2419.55±0.1820.08±0.3019.75±0.05N/A

In der Tabelle bedeutet Tag Tag; „*“ zeigt p <0.05 gegenüber der Kontrollgruppe; und „**“ zeigt p <0.01 gegenüber der Kontrollgruppe an. Tabelle 5. Gewichtsänderungsraten

GruppesDosis (mg/kg)Tag 0 (%)Tag 1 (%)Tag 2 (%)Tag 4 (%)Tag 7(%)D14000.00-2.55±0.77-12.18±2.63**-18.58±4.66**-4.23±3.77D24000.00-0.08±0.74-8.54±1.31**-10.63±2.13**-6.98±1.43D33500.00-3.59±0.66-11.25±0.96**-8.10±2.84-1.68±2.50D43000.00-1.17±1.27-8.18±1.56**-5.33±1.78-1.43±1.92Kontrolle(NA)0.00-0.60±0.59-2.35±0.75-2.55±0.82-5.85±1.13GruppenDosis (mg/kg)Tag 9 (%)Tag 11 (%)Tag 14 (%)Tag 16 (%)Tag 18 (%)D14000.42±1.922.77±4.273.29±3.295.24±2.7412.70±4.20* *D24000.21±1.422.72±1.854.87±2.08**6.32±1.65**8.83±1.43**D33504.50±1.93*6.38±1.68*7.12±1.19**10.78±0.88* *13.71 ±0.63* *D43002.91±0.55* *4.47±0.52*3.72±0.73**6.62±0.79**8.99±1.38**Kontrolle(NA)-3.30±1.54-1.39±2.07-5.39±1.69-4.38±2.27-4.05±2.20GruppenDosis(mg/kg)Tag 21(%)Tag 23(%)Tag 25(%)Tag 28(%)Tag 30(%)D14007.90±2.90*9.32±3.82*12.20±4.7015.14±3.6414.22±2.22D24004.22±1.23**3.66±1.05**5.07±1.441.57±1.502.28±1.75D335010.72±1.67**13.08±2.31**13.34±2.34**11.44±2.29*15.37±2.93D43007.41±1.37**9.37±1.82**10.69±2.14**8.62±2.689.36±2.21Kontrolle(NA)-5.94±2.02-3.59±1.66-0.97±2.53-2.68±5.27N/A

In der Tabelle bedeutet Tag Tag; „*“ zeigt p <0,05 gegenüber der Kontrollgruppe; und „**“ zeigt p <0,01 gegenüber der Kontrollgruppe an.

Wie durch die Daten in den obigen Tabellen gezeigt, wurde nach intraperitonealer Injektion jeder Verbindung in die HCT-116-Dickdarmkrebstumortragenden Nacktmäuse das Tiergewicht der D1-Gruppe mit einer Dosis von 400 mg/kg am Tag 4 der Arzneimittelverabreichung signifikant verringert durch stetiges Gewichtswachstum in späteren Tagen. Von Tag 14 bis Tag 30 war das Gewicht im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen anderen medikamentenbehandelten Gruppen und der Kontrollgruppe.

(2) Wirkungen der Testverbindungen auf das Tumorvolumen von menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebs-Heterotransplantaten in tumortragenden Mäusen Tabelle 6. Detaillierte Daten über Tumorvolumina jeder Gruppe (mm3, Mittelwert ± SEM)

GruppenDosis (mg/kg)Tag 0 (mm3)Tag 1 (mm3)Tag 2 (mm3)Tag 4 (mm3)D140039.36±6.16**58.20±17.45**58.20±17.45**37.24±9.27**D240053.09±9.33**50.78±14.16**55.89±18.82**45.96±20.25**D335038.77±4.33**36.40±3.98**36.40±3.98**23.00±3.08**D430044.09±5.99**52.03±12.91**52.03±12.91**37.37±10.46**Kontrolle(NA)109.55±8.60180.51±9.97221.87±11.44296.98±22.98GruppenDosis (mg/kg)Tag 7 (mm3)Tag 9 (mm3)Tag 11 (mm3)Tag 14 (mm3)D140036.82±28.63**50.63±36.49**101.02±78.57**285.66±237.94*D240035.87±21.79**30.75±16.74**57.29±33.0**116.87±66.85**D335012.62±3.10**12.62±3.10**14.28±3.69**36.98±4.82**D430025.46±8.17**22.50±5.31**26.19±5.79**70.28±18.37**Kontrolle(NA)432.47±39.48590.34±60.83976.15±83.071440.15±144.73GruppenDose (mg/kg)Tag 16 (mm3)Tag 18 (mm3)Tag 21(mm3)Tag 23(mm3)D1400495.95±408.8**647.07±503.281017.61±749.531017.61±749.53D2400169.73±88.15**262.10±111.14489.13±174.91501.98±170.25D335080.10±11.07**120.40±23.44**204.05±36.25229.06±36.15D4300142.77±49.34**228.58±76.92**375.06±86.27420.73±76.08Kontrolle(NA)1811.14±119.301998.33±136.402444.84±167.642361.69±146.79GruppenDosis (mg/kg)Tag 25(mm3)Tag 28(mm3)Tag 30(mm3)D14001044.35±722.801296.79±847.871589.29±983.15D2400569.05±189.18689.78±203.52900.52±250.44D3350266.11±39.63347.17±60.84479.01±75.54D4300491.29±83.78608.08±85.37781.78±105.33Kontrolle(NA)2582.36±155.952689.30±116.86N/A
„*“ zeigt p <0,05 gegenüber der Kontrollgruppe; und „**“ zeigt p <0,01 gegenüber der Kontrollgruppe an.

Wie durch die obigen Tumorvolumendaten für jede Gruppe gezeigt, inhibierten die offenbarten Cytidinderivat-Dimere das Tumorwachstum signifikant.

(3) Tumorwachstumsinhibierungsrate (TGI%) der Testverbindungen auf HCT-116 menschlichen Dickdarmkrebstumoren in tumortragenden Mäusen.

Die Tumorwachstumsinhibierungsrate (TGI%) der Testverbindungen auf HCT-116 menschlichen Dickdarmkrebstumoren in tumortragenden Mäusen ist in Tabelle 7 wie folgt gezeigt. Tabelle 7. Tumorwachstumsinhibierungsrate (TGI%) von D1-D4 an HCT-116 menschlichen Dickdarmkrebstumoren in tumortragenden Mäusen.

GruppeDosis (mg/kg)Tag 0 (TGI%)Tag 1 (TGI%)Tag 2 (TGI%)Tag 4 (TGI%)Tag 7 (TGI%)D14000.0067.7673.7787.4691.49D24000.0071.8774.8184.5391.71D33500.0079.8383.5992.2697.08D43000.0071.1776.5587.4294.11GruppeDosis (mg/kg)Tag 9 (TGI%)Tag 11 (TGI%)Tag 14 (TGI%)Tag 16 (TGI%)Tag 18 (TGI%)D140091.4289.6580.1672.6267.62D240094.7994.1391.8890.6386.88D335097.8698.5497.4395.5893.97D430096.1997.3295.1292.1288.56GruppeDosis (mg/kg)Tag 21 (TGI%)Tag 23 (TGI%)Tag 25 (TGI%)Tag 28 (TGI%)Tag 30 (TGI%)D140058.3856.9159.5651.7843.36D240079.9978.7477.9674.3567.91D335091.6590.3089.7087.0982.93D430084.6682.1980.9877.3972.14

Die Tumorinhibierungsrate der Verbindung D1-Gruppe mit 400 mg/kg-Dosis erreichte am Tag 7 einen maximalen Wert von 91.49%, am Tag 16 72.62% und am Tag 30 43.36%. Die Tumorinhibierungsrate der Verbindung D2-Gruppe mit 400 mg/kg-Dosis erreicht am Tag 9 einen maximalen Wert von 94.79%, am Tag 16 90.63% und am Tag 30 67.91%. Die Tumorinhibierungsrate der Verbindung D3-Gruppe mit 350 mg/kg Dosis erreichte einen maximalen Wert von 98.54% am Tag 11, 95.58% am Tag 16 und am Tag 30 82.93%. Die Tumorinhibierungsrate der Verbindung D4-Gruppe mit 300 mg/kg Dosis erreichte am Tag 11 einen maximalen Wert von 97.32%, 92.12%. am Tag 16 und 72.14% am Tag 30.

(4) Wirkungen der Testverbindungen auf das relative Tumorvolumen (RTV) von menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebstumoren in tumortragenden Mäusen

Tabelle 8 zeigt die signifikanten Wirkungen von D1-D4-Testverbindungen auf das relative Tumorvolumen (RTV) von menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebstumoren in tumortragenden Mäusen, wobei „*“ einen p-Wert <0,05 gegenüber der Kontrollgruppe und "* *"zeigt p-Wert <0,01 gegenüber der Kontrollgruppe anzeigen. Tabelle 8. Wirkungen von Testverbindungen auf RTV von HCT-116-menschlichen Dickdarmkrebstumoren in tumortragenden Mäusen. (Mittelwert ± SEM)

GruppenDosis (mg/kg)Tag 0 (RTV)Tag 1 (RTV)Tag 2 (RTV)Tag 4 (RTV)Tag 7 (RTV)D14001.001.35±0.24*1.35±0.24*0.89±0.12**1.16±0.79*D24001.000.89±0.10**0.95±0.15**0.73±0.19**0.52±0.23**D33501.000.98±0.12**0.98±0.12**0.65±0.10**0.34±0.06**D43001.001.12±0.121.12±0.120.79±0.11*0.55±0.10*Kontrolle(NA)1.001.68±0.132.07±0.162.76±0.244.09±0.53GruppenDosis (mg/kg)Tag 9 (RTV)Tag 11 (RTV)Tag 14 (RTV)Tag 16 (RTV)Tag 18 (RTV)D14001.61±0.983.18±2.18*8.88±6.7515.44±11.5620.37±13.96D24000.46±0.17**0.87±0.35**1.80±0.69**2.66±0.88**4.20±1.02**D33500.32±0.05**0.37±0.09**1.00±0.00**2.17±0.14**3.16±0.39**D43000.55±0.12*0.69±0.20*1.81±0.54*3.29±0.82*5.11±1.12*Kontrolle(NA)5.61±0.839.22±1.1613.84±2.2117.26±2.1819.09±2.45GruppenDosis (mg/kg)Tag 21 (RTV)Tag 23 (RTV)Tag 25 (RTV)Tag 28 (RTV)Tag 30 (RTV)D140032.34±20.4032.34±20.4033.53±19.2142±2251.88±24.88D24008.09±1.528.48±1.379.62±1.4812.03±1.5015.85±1.92D33505.55±0.666.21±0.617.22±0.539.28±0.7312.93±0.90D43008.73±1.399.89±1.3011.61±1.5114.73±2.1819.08±2.98Kontrolle(NA)23.41±3.1019.77±1.7321.62±1.8621.13±1.62N/A
„*“ zeigt p <0,05 gegenüber der Kontrollgruppe; und „**“ zeigt p <0,01 gegenüber der Kontrollgruppe an.

(5) Wirkungen von vier Testverbindungen auf die relative Tumorproliferationsrate (T/C%) von menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebstumoren in tumortragenden Mäusen

Tabelle 9 zeigt die Wirkungen der Testverbindungen auf die relative Tumorproliferationsrate von menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebstumoren in tumortragenden Mäusen. Tabelle 9. Wirkungen von Testverbindungen auf die relative Tumorproliferationsrate von menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebstumoren in tumortragenden Mäusen

GruppenDosis (mg/kg)Tag 0 (T/C %)Tag 1 (T/C %)Tag 2 (T/C %)Tag 4 (T/C %)Tag 7 (T/C %)D14000.0080.1365.1532.2028.36D24000.0050.1540.7825.1916.63D33500.0060.9849.5823.266.76D43000.0077.0766.4843.3131.86GruppenDosis (mg/kg)Tag 9 (T/C %)Tag 11 (T/C %)Tag 14 (T/C %)Tag 16 (T/C %)Tag 18 (T/C %)D140028.7734.4764.1589.47106.69D240014.4116.7718.3321.6421.99D33504.713.415.7810.4916.55D430030.5525.9432.8337.9626.76GruppenDosis (mg/kg)Tag 21 (T/C %)Tag 23 (T/C %)Tag 25 (T/C %)Tag 28 (T/C %)Tag 30 (T/C %)D1400138.14163.55155.09198.76209.10D240034.5742.8744.5156.9463.87D335023.7031.4133.4043.9352.09D430037.2850.0453.6869.7276.91

Die relative Tumorproliferationsrate der Verbindung D1-Gruppe mit 400 mg/kg Dosierung erreichte am Tag 7 einen Minimalwert von 28.36% und am Tag 16 89.47%. Die relative Tumorproliferationsrate der Verbindung D2-Gruppe mit 400 mg/kg Dosierung erreichte am Tag 9 einen Minimalwert von 14.41% und am Tag 16 21.64%.

Die relative Tumorproliferationsrate der Verbindung D3-Gruppe mit 350 mg/kg Dosierung erreichte am 11. Tag einen Minimalwert von 3.41% und betrug am Tag 16 10.49%. Die relative Tumorproliferationsrate der Verbindung D4-Gruppe mit einer Dosis von 300 mg/kg erreichte am Tag 11 einen Minimalwert von 25.94% und am Tag 16 37.96%.

In dem Tumorinhibierungsexperiment der Reihe von Verbindungen auf menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebs-Heterotransplantaten in tumortragenden Nacktmäusen zeigten die Verbindungen D2, D3, D4 höhere Tumorinhibierungsraten auf menschlichen HCT-116-Dickdarmkrebs-Heterotransplantaten in tumortragenden Nacktmäusen. Nach einer einmaligen intraperitonealen Arzneimittelverabreichung bis zum 16. Tag hatte sich eine signifikante tumorinhibierende Wirkung ohne offensichtlichen Einfluss auf das Körpergewicht der Tiere ergeben, was auf eine hohe Antitumoraktivität der offenbarten Cytidinderivat-Dimere mit sehr geringen toxischen Nebenwirkungen hinweist.