Title:
Neues Reagenz
Kind Code:
U1


Abstract:

Ninhydrin-Reagenz zur Verwendung in einem Verfahren zur Analyse stickstoffhaltiger Verbindungen, wobei das Ninhydrin-Reagenz umfasst:
Ninhydrin;
einen wässrigen Puffer; und
ein temperaturabhängiges Reduktionsmittel, wobei das Mittel inaktiv bei der Reduktion von Ninhydrin bei einer ersten Temperatur ist und aktiv bei der Reduktion von Ninhydrin bei einer zweiten Temperatur ist, wobei die zweite Temperatur höher als die erste Temperatur ist.




Application Number:
DE202013010433U
Publication Date:
02/13/2014
Filing Date:
11/20/2013
Assignee:
JPP Chromatography Limited (Devon, Plymouth, GB)
International Classes:



Foreign References:
36324961972-01-04
43593231982-11-16
37782301973-12-11
42748331981-06-23
Other References:
Spackmann, D. H., Stein, W. H. und Moore, S. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. Anal. Chem., 1958, 30: 1190-1206
Attorney, Agent or Firm:
Graf von Stosch Patentanwaltsgesellschaft mbH, 80538, München, DE
Claims:
1. Ninhydrin-Reagenz zur Verwendung in einem Verfahren zur Analyse stickstoffhaltiger Verbindungen, wobei das Ninhydrin-Reagenz umfasst:
Ninhydrin;
einen wässrigen Puffer; und
ein temperaturabhängiges Reduktionsmittel, wobei das Mittel inaktiv bei der Reduktion von Ninhydrin bei einer ersten Temperatur ist und aktiv bei der Reduktion von Ninhydrin bei einer zweiten Temperatur ist, wobei die zweite Temperatur höher als die erste Temperatur ist.

2. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 1, wobei das Reagenz im Wesentlichen frei von Hydrindantin ist.

3. Ninhydrin-Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die zweite Temperatur wenigstens 100°C beträgt.

4. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel eine Verbindung ist, welche die Standards der Reduktionsaktivität bei der zweiten Temperatur des Protokolls 1 von Beispiel 1 erfüllt.

5. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 4, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel eine Verbindung ist, welche die Standards der Reduktionsaktivität bei der zweiten Temperatur gemäß Protokoll 1 erfüllt, mit dem eine minimale Absorbanz von 0,4 beobachtet wird.

6. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die erste Temperatur 0°C bis 30°C beträgt.

7. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 6, wobei die erste Temperatur 5°C bis 25°C beträgt.

8. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 7, wobei die erste Temperatur 10°C bis 20°C beträgt.

9. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel eine Verbindung ist, welche die Standards der Reduktionsaktivität bei der ersten Temperatur gemäß Protokoll 2 von Beispiel 2 erfüllt.

10. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 9, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel eine Verbindung ist, die nach drei Monaten eine Aktivität von mindestens 50% ihrer anfänglichen Aktivität aufweist.

11. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 10, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel eine Verbindung ist, die nach sechs Monaten eine Aktivität von mindestens 50% ihrer anfänglichen Aktivität aufweist.

12. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 11, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel eine Verbindung ist, die nach zwölf Monaten eine Aktivität von mindestens 50% ihrer anfänglichen Aktivität aufweist.

13. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 12, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel eine Verbindung ist, die nach 24 Monaten eine Aktivität von mindestens 50% ihrer anfänglichen Aktivität aufweist.

14. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein oder mehrere Saccharide umfasst.

15. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 14, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein oder mehrere Monosaccharide umfasst.

16. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 15, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel Glukose, Fruktose, Glyceraldehyd, Galaktose, Ribose, Xylose, Erythrose, Threose, Lyxose, Arabinose, Allose, Altrose, Mannose, Gulose, Idose, Talose und L-Glycero-D-mannoheptose, Dihydroxyaceton, Erythrulose, Ribulose, Xylulose, Psicose, Sorbose, Tagatose, Sedoheptalose oder eine Mischung davon umfasst.

17. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein oder mehrere Disaccharide umfasst.

18. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 17, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel Laktose, Maltose, Trihalose, Cellobiose, Kojibiose, Nigerose, Isomaltose, Sophorose, Laminaribiose, Gentiobiose, Turanose, Maltulose, Palatinose, Gentiobiulose, Mannobiose, Melibiose, Melibiulose, Rutinose, Xylobiose oder eine Mischung davon umfasst.

19. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein oder mehrere längerkettige Polysaccharide umfasst.

20. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 19, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel Stachyose, Dextrin, Maltodextrin oder eine Mischung davon umfasst.

21. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein oder mehrere Carbonsäuren und/oder ein Salz davon umfasst.

22. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 21, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein Gruppe-I- oder Gruppe-II-Metallsalz einer Carbonsäure umfasst.

23. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein oder mehrere monofunktionale Carbonsäuren oder ein Salz davon umfasst.

24. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 23, wobei die Carbonsäure Ameisensäure oder ein Salz davon ist.

25. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 21 bis 24, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein oder mehrere Carbonsäuren, welche wenigstens eine weitere reduzierende Gruppe enthalten, umfasst.

26. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein oder mehrere Verbindungen umfasst, welche ein oder mehrere Aldehyd- und/oder Ketongruppen aufweisen.

27. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 26, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel Aceton umfasst.

28. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein oder mehrere anorganische Verbindungen umfasst.

29. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 28, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel eine anorganische Schwefelverbindung in einer niedrigen Oxidationsstufe oder eine Phosphoroxosäure in einer niedrigen Oxidationsstufe umfasst.

30. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 29, wobei das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein Sulfit, Thiosulfat, ein Phosphit und/oder ein Hypophosphit umfasst.

31. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die Konzentration des temperaturabhängigen Reduktionsmittels 0,01% bis 75% w/v oder v/v beträgt.

32. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 31, wobei die Konzentration des temperaturabhängigen Reduktionsmittels 0,01% bis 20% w/v oder v/v beträgt.

33. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 32, wobei die Konzentration von Ninhydrin in dem Ninhydrin-Reagenz 0,5 bis 3% w/v oder v/v beträgt.

34. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 33, wobei die Konzentration von Ninhydrin in dem Ninhydrin-Reagenz 1 bis 2,5% w/v oder v/v beträgt.

35. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 34, wobei die Konzentration von Ninhydrin in dem Ninhydrin-Reagenz etwa 2% w/v oder v/v beträgt.

36. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei der Puffer ein wässriger Puffer ist.

37. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 36, wobei der Puffer eine schwache Säure und eine(s) ihrer konjugierten Basen/Salze umfasst.

38. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 37, wobei der Puffer eine organische Säure umfasst.

39. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 38, wobei der Puffer Essigsäure, Ethansäure oder Propansäure umfasst.

40. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei der Puffer den pH-Wert bei einem Wert zwischen 3 bis 7 hält.

41. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 40, wobei der Puffer den pH-Wert bei einem Wert zwischen 4 bis 6 hält.

42. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 41, wobei der Puffer den pH-Wert bei einem Wert zwischen 4,5 bis 5,5 hält.

43. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 42, wobei der Puffer den pH-Wert bei einem Wert von ungefähr 5,2 hält.

44. Ninhydrin-Reagenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, welches außerdem ein oder mehrere organische Lösungsmittel umfasst.

45. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 44, wobei das organische Lösungsmittel aus Dimethylsulfoxid, Ethylenglykol, Propylenglykol, Sulfolan, Carbitol, Propylenglykolmonomethylether, Methylcellosolve und Methanol ausgewählt ist.

46. Ninhydrin-Reagenz gemäß einem der Ansprüche 44 oder 45, wobei die Konzentration des organischen Lösungsmittels 10% bis 75% v/v beträgt.

47. Ninhydrin-Reagenz gemäß Anspruch 46, wobei die Konzentration des organischen Lösungsmittels 25% bis 65% v/v beträgt.

48. The Ninhydrin Reagenz gemäß Anspruch 47, wobei die Konzentration des organischen Lösungsmittels 35% bis 55% v/v beträgt.

49. Ninhydrin-Reagenz, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Reagenz zur Analyse stickstoffhaltiger Verbindungen, beispielsweise Aminosäuren und Ähnlichem, und ein Verfahren, in dem dieses verwendet wird.

Aminosäuren stellen die Komponenten dar, aus denen Proteine gebildet werden, welche wiederum eine Schlüsselrolle in vielen biologischen Abläufen spielen. In einigen Fällen kann die Anwesenheit oder Abwesenheit einer bestimmten Aminosäure in einem Individuum ernsthaft dessen Gesundheit beeinträchtigen. Beispielsweise kann ein Individuum, welches an der genetischen metabolischen Störung Phenylketonurie leidet, kein Phenylalanin metabolisieren, wobei dessen Akkumulation ernsthaft die Gehirnentwicklung beeinträchtigt. Entsprechend sind Verfahren zum Nachweis freier Aminosäuren oder zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung von Proteinen lebenswichtig für die genaue Diagnose und das Management von Krankheiten. Gleichermaßen sind derartige Verfahren wichtig für die Analyse kommerzieller Arzneimittel und Nahrungsmittel sowie für die Protein- und Enzymforschung und -entwicklung. Allgemeiner findet der Nachweis und die Identifizierung stickstoffhaltiger Verbindungen Anwendung in einem großen Bereich von Disziplinen, einschließlich landwirtschaftlicher, biochemischer, klinischer, Umwelt-, Nahrungsmittel-, forensischer, histochemischer, mikrobiologischer, medizinischer, Ernährungs-, Pflanzen- und Protein-Wissenschaften.

Derzeit werden freie oder hydrolytisch freigesetzte Aminosäuren typischerweise unter Verwendung automatischer Aminosäureanalysevorrichtungen nachgewiesen. In den 1950ern wurde das erste automatische Aminosäureanalyseverfahren von Moore, Stein und Spackmann entwickelt (Spackmann, D. H., Stein, W. H. und Moore, S. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. Anal. Chem., 1958, 30: 1190–1206). Dieses mehrstufige Verfahren beinhaltet die Trennung von Aminosäuren durch Ionenaustauscherflüssigchromatographie. Ein Ninhydrin-Reagenz wird aus einem Reagenzreservoir gepumpt, mit dem Eluent aus der Ionenaustauschersäule gemischt und durch eine Stahl- oder Kunststoff-Reaktionsspirale geleitet, welche auf die Temperatur erhitzt wird, die für die Reaktion notwendig ist. Ninhydrin reagiert mit allen Aminosäuren und verwandten Aminosäureverbindungen unter Bildung stark gefärbter Reaktionsprodukte. Ruhemanns Purpur wird durch primäre Amine und primäre Aminosäuren gebildet und kann durch die Absorbanz von Licht bei einer Wellenlänge von 570 nm gemessen werden. Andere farbige Reaktionsprodukte, insbesondere gelbe Reaktionsprodukte, werden durch sekundäre Amine und verschiedene sekundäre Aminosäuren gebildet. Diese Reaktionsprodukte können durch ihre Absorbanz von Licht bei einer Wellenlänge von 440 nm gemessen werden. Die farbigen Reaktionsprodukte variieren in ihrer Intensität entsprechend der Konzentration der Aminosäure.

Die Aminosäurereaktionsprodukte werden durch ein Photometer geleitet, wo das durch die Farbstoffkomplexe absorbierte Licht bei geeigneten Wellenlängen, insbesondere 570 nm und 440 nm, detektiert wird. Die Anwesenheit verschiedener Aminosäuren kann durch Chromatographie bestimmt werden. Die Identität jeder Aminosäure wird auf Grundlage ihrer Wanderungseigenschaften, und somit ihrer Position auf dem Chromatogramm, festgestellt. Die Konzentration der Aminosäure wird durch die Intensität des farbigen Produkts, welches in dem Photometer mittels Absorbanz bei einer bestimmten Wellenlänge detektiert wird, bestimmt. Entsprechend kann dieses Verfahren qualitativ und quantitativ eingesetzt werden, um zu bestimmen, welche Aminosäuren in einer Testprobe vorliegen und welche relativen Konzentrationen sie jeweils aufweisen.

Die Farbreaktion zwischen Ninhydrin und der Aminosäure oder dem Amin läuft bei Raumtemperatur sehr langsam ab. Bei erhöhten Temperaturen geht sie wesentlich schneller vonstatten, nimmt aber sogar bei einer Temperatur von 130°C und darüber noch viele Minuten in Anspruch. Um ein gutes chromatografisches Ergebnis aufrecht zu erhalten, ist es notwendig, dass die Farbreaktion in einem Zeitraum von etwa einer Minute oder weniger stattfindet. Bei Anstrengungen, dies zu erreichen, stellte sich heraus, dass Hydrindantin, die reduzierte Form von Ninhydrin, für die Wirksamkeit des Ninhydrin-Reagenz und für den Erhalt einer akzeptablen Reaktionsgeschwindigkeit notwendig ist. Es wurden eine Reihe von Gründen oder Mechanismen vorgeschlagen, um die Fähigkeit von Hydrindantin, die Bildung der farbigen Produkte bei erhöhten Temperaturen zu beschleunigen, zu erklären. Ein Vorschlag ist, dass Hydrindantin als Stabilisator für eines der Reaktionszwischenprodukte dient. Als solcher wird es als Beschleuniger und nicht als Katalysator betrachtet.

Der Ausdruck „Ninhydrin-Reagenz” bezieht sich auf eine Lösung oder Lösungen, welche sämtliche Bestandteile enthält/enthalten, die für die Verwendung in Aminosäureanalysevorrichtungen erforderlich sind. Entsprechend enthält ein Ninhydrin-Reagenz Hydrindantin, Ninhydrin und die notwendigen Puffer und Lösungsmittel. Das Ninhydrin-Reagenz kann durch Zugabe einer separaten Lösung von Hydrindantin zu der Ninhydrin-Lösung gebildet werden. Obwohl es vorteilhaft wäre, eine Lösung, welche sämtliche für die Aminosäureanalyse notwendigen Bestandteile enthält, bereitzustellen, würde dies zu einer inakzeptablen geringen Haltbarkeit des Ninhydrin-Reagenz führen. Alternativ kann Hydrindantin in situ durch Zugabe eines Reduktionsmittels zu der Ninhydrin-Lösung, wodurch ein Teil des Ninhydrins zu Hydrindantin reduziert wird, hergestellt werden. Die Bildung von Hydrindantin in situ geschieht mehr oder weniger unverzüglich in Gegenwart eines starken Reduktionsmittels. Jedoch ist bei beiden Methoden die Mischung einer separaten Ninhydrin-Lösung mit einer separaten Hydrindantin-Lösung oder einem geeigneten Reduktionsmittel durch den Anwender notwendig, bevor das Ninhydrin-Reagenz in der Aminosäureanalyse verwendet werden kann.

In der Vergangenheit wurde es zur bevorzugten Praxis bei den Herstellern, zwei Flaschen, von denen die eine eine Lösung von Hydrindantin in einem organischen Lösungsmittel und die andere eine Lösung von Ninhydrin, einen wässrigen Puffer und ein weiteres organisches Lösungsmittel enthält, bereitzustellen, wobei beide Flaschen unter einer inerten Gasatmosphäre fest verschlossen werden. Die Inhalte beider Flaschen werden dann kurz vor oder unmittelbar vor der Verwendung in einer Aminosäureanalysevorrichtung gemischt, um das Ninhydrin-Reagenz zu bilden.

Unglücklicherweise ist Hydrindantin ein Reagenz, welches schwierig zu handhaben ist. Es ist insbesondere instabil in Gegenwart von Luft, wobei der Sauerstoff das Hydrindantin schnell zurück zu Ninhydrin oxidiert. Es sind nur relativ kleine Mengen an Luft notwendig, um das Hydrindantin gravierend abzubauen und somit die Sensitivität der Farbreaktion wesentlich zu reduzieren. Wenn Luft nicht strikt von dem Reagenz ferngehalten wird, fällt die Hydrindantin-Konzentration langsam ab, bis keine Farbreaktion mehr im Zeitrahmen der chromatographischen Analyse stattfindet.

Die Exposition eines Hydrindantin enthaltenden Ninhydrin-Reagenz an der Umgebungsluft muss daher bei einem absoluten Minimum gehalten werden, da sogar winzige Spuren an Sauerstoffexposition einen stetigen Verlust der Hydrindantin-Aktivität verursachen. Es kann eine inerte Atmosphäre, üblicherweise Stickstoff, sowohl bei der Herstellung als auch bei der Verwendung des Ninhydrin-Reagenz eingesetzt werden. Dies Erfordernis führt natürlich dazu, dass eine komplexe Ausstattung und Vorgehensweisen notwendig sind, um zu gewährleisten, dass sich die Hydrindantin-Aktivität vor und/oder während seiner Verwendung nicht in einem inakzeptablen Maß verschlechtert. Ungeachtet der Anwendung dieser Vorsichtsmaßnahmen besitzt ein Hydrindantin enthaltendes Ninhydrin-Reagenz typischerweise eine Haltbarkeit von nicht mehr als einem Monat.

Zudem ist Hydrindantin in vollständig wässrigem Medium unlöslich. Jedoch ist Hydrindantin in einer Reihe organischer Lösungsmittel löslich. Entsprechend werden im Allgemeinen organische Lösungsmittel in relativ hohen Anteilen zu dem Reagenz gegeben, um die Möglichkeit des Ausfällens von Hydrindantin während der Lagerung und Verwendung zu reduzieren. Tatsächlich werden üblicherweise hohe Gehalte an organischem Lösungsmittel von bis zu 75 Volumen-% eingesetzt. Das Lösungsmittel kann auch eine Kombination aus zwei oder mehr unterschiedlichen Lösungsmittel-Typen umfassen, um eine angemessene Auflösung des Hydrindantin zu gewährleisten. Zu organischen Lösungsmitteln, die zu diesem Zweck eingesetzt werden, zählen typischerweise Dimethylsulfoxid (DMSO), Methylcellosolve, Ethylenglykol und Sulfolan. Dennoch kann, wenn eine ungenügende Menge an organischem Lösungsmittel eingesetzt wird oder die Hydrindantin-Konzentration zu hoch ist, Ausfällung beim Stehen auftreten oder sich in der Chromatographievorrichtung anreichern, wodurch die Leitungen blockiert werden.

In Anbetracht der oben erwähnten Schwierigkeiten in Verbindung mit der Verwendung von Hydrindantin wurden alternative Techniken und Vorrichtungen für die Aminosäureanalyse, bei der typische Ninhydrin-Reagenzien eingesetzt werden, vorgeschlagen. Beispielsweise offenbart US 3,632,496 einen Reagenz-Generator, der von einem verlängerten Gehäuse gebildet wird, durch das ein Kanal verläuft, welcher an einem Ende einen Einlass zur Aufnahme eines Reagenz und am anderen Ende einen Auslass zum Ablassen des aktivierten Reagenz umfasst. Der Kanal wird definiert durch Oberflächen aus metallischem Material, welches bei der Reduktion von Ninhydrin katalytisch aktiv ist, wodurch das aktivierte Reagenz gebildet wird. Auf diese Weise kann Ninhydrin in seinem stabilen Zustand in einem Vesikel gelagert und aktiviert werden.

US 4,359,323 betrifft ein Flüssigchromatographieanalysesystem für Amine. Das System besteht aus einer Chromatographiesäule, einer Reaktionssäule und einer Spirale zum Recyceln der mobilen Phase zur Wiederverwendung. Das primäre und signifikanteste Merkmal dieses Systems ist, dass die flüssige mobile Phase eine Kombination aus einem Elutionsmittel und einer Substanz, welche mit Aminen reagiert, um eine Verbindung zu erzeugen, die photometrisch nachgewiesen werden kann, umfasst. Entsprechend erfordert dieses Verfahren nur eine einzige Pumpe für die gesamte Verfahrensführung. Trotz der verminderten Komplexität des Pumpensystems führt die Anwesenheit von Hydrindantin in der Mischung immer noch zu den gleichen Problemen der Instabilität und Luftempfindlichkeit wie mit gegenwärtig verfügbaren kommerziellen Reagenzien.

Neben den obigen Maßnahmen wurden eine Reihe von Reduktionsmitteln auf ihre Eignung hin zur Verwendung in Reagenzien, die für Aminosäureanalyse notwendig sind, bewertet. Reduktionsmittel für Ninhydrin sind bevorzugt in der Reagenzlösung hoch löslich, weisen ausgezeichnete Reduktionseigenschaft bezüglich Ninhydrin auf, bilden keine farbigen Nebenprodukte, verhalten sich inert in Bezug auf die Vorrichtung und sind stabil und leicht zu handhaben. Jedoch weisen, wie später detaillierter diskutiert wird, existierende Reduktionsmittel nicht sämtliche dieser Eigenschaften auf und beeinträchtigen daher in signifikantem Ausmaß die Sensitivität und Genauigkeit der Aminosäureanalyse auf die eine oder andere Weise.

Im Laufe der fortschreitenden Entwicklung des Ninhydrin-Reagenz wurde starkes Augenmerk auf die Verwendung starker Reduktionsmittel zur Herstellung von Hydrindantin in situ gerichtet. Das Originalverfahren von Moore, Stein und Spackmann verwendete Zinnchlorid als Reduktionsmittel. Jedoch verursachte die Menge an Zinnchlorid, die zur Erzeugung von ausreichend Hydrindantin für eine annehmbar schnelle Reaktion erforderlich war, am Ende die Ausfällung von Zinnhydroxid-Verbindungen, welche wiederum die Durchflussleitungen verschmutzten und blockierten. Die Verwendung von Zinnchlorid wurde daher bald wieder eingestellt, und es wurden andere Reduktionsmittel, wie beispielsweise Cyanid, Titansalze, Borhydrid und Ascorbinsäure, untersucht. Cyanid konnte nicht kommerziell verwendet werden, da es Toxizitätsprobleme verursachte und nicht die notwendige Stabilität aufwies. Ernsthaftere Studien wurden an Natriumborhydrid und Ascorbinsäure als Reduktionsmittel durchgeführt.

Zum Beispiel offenbart US 3,778,230 eine Farbentwicklungslösung zur Verwendung in der automatischen Aminosäureanalyse durch Flüssigchromatographie, worin Ascorbinsäure als Reduktionsmittel eingesetzt wird. In dem beschriebenen Verfahren wird Ascorbinsäure mit Ninhydrin in Gegenwart von Methylcellosolve umgesetzt, um Hydrindantin zu bilden. Es stellte sich heraus, dass Ascorbinsäure mehrere Vorteile, wie beispielsweise erhöhte Löslichkeit, potentes Reduktionsvermögen und Sensitivität der Färbung, aufweist. Außerdem wird Ascorbinsäure im Vergleich zu konventionellen Reduktionsmitteln, wie beispielsweise Zinnchlorid, leicht regeneriert.

Trotz dieser Vorteile ist das in US 3,778,230 offenbarte Ninhydrin-Reagenz, welches Ascorbinsäure als Reduktionsmittel umfasst, anfällig für Oxidation. Das Ninhydrin-Reagenz muss zunächst hergestellt werden, was typischerweise in einem inerten Behälter bei Umgebungstemperatur geschieht. Als Konsequenz sind aufwändige und zeitraubende Verfahren notwendig, um das Risiko der Oxidation von Hydrindantin zu minimieren. Außerdem vergeht eine sehr lange Zeit in dem Verfahren, während getrennte Aminosäuren in das Ninhydrin-Reagenz eingeführt werden, bevor sie die erwärmte Reaktionsspirale erreichen, wodurch die in dem Chromatogramm aufgezeichneten Ergebnisse verfälscht werden. Zudem kann während dieser Zeit das Ninhydrin-Reagenz Sauerstoff ausgesetzt werden, der in die Analysevorrichtung diffundiert ist. Tatsächlich wird in US 3,778,230 zugegeben, dass die Verfallseigenschaften des Ascorbinsäure enthaltenden Ninhydrin-Reagenz lediglich äquivalent zu denen des Reagenz von Moore, Stein und Spackmann, welches Zinnchlorid enthält, waren (d. h., 15 Tage). Die Wiedererlangung der Färbungsfähigkeit nach Verfall aufgrund von Luftoxidation erfordert die erneute Zugabe von Ascorbinsäure. Ein analoger Ansatz unter Anwendung des konventionellen Verfahrens von Moore, Stein und Spackmann wäre aufgrund der geringen Löslichkeit von Zinnchlorid nicht möglich.

Einer der schwerwiegendsten Nachteile der Verwendung von Ascorbinsäure als Reduktionsmittel ist vermutlich der, dass sie bekanntermaßen braun gefärbte Abbausubstanzen bereits bei Erwärmung allein bildet. US 3,778,230 legt nahe, dass die Reduktionsprodukte der Reaktion von Ascorbinsäure mit Ninhydrin nicht braun gefärbt sind. Es besteht jedoch ein hohes Risiko, dass die Verwendung von Ascorbinsäure als Reduktionsmittel zur Bildung von farbigen Nebenprodukten als Ergebnis der thermischen Zersetzung der Ascorbinsäure führt, wodurch die Genauigkeit der durch das Chromatogramm aufgezeichneten Ergebnisse nachteilig beeinflusst wird.

In einem weiteren Beispiel offenbart US 4,274,833 ein Ninhydrin-Reagenz, welches ein Reduktionsmittel (Natriumborhydrid oder Zinnchlorid) oder Hydrindantin selbst sowie ein mit Wasser mischbares organisches Sulfolan-Lösungsmittel umfasst. Es wird davon ausgegangen, dass die Verwendung von Sulfolan als Solubilisierungsmittel viele Vorteile hat. Insbesondere solubilisiert Sulfolan sehr gut Hydrindantin und Ninhydrin und reagiert nicht mit irgendwelchen Lösungskomponenten. Entsprechend ist das Reagenz über lange Zeiträume stabil ohne auszufallen, was bekanntermaßen zur Verstopfung von Fließleitungen führt. Es wird behauptet, dass die Lebensdauer von dem Ninhydrin-Reagenz, welches Hydrindantin umfasst, wenigstens drei Monate beträgt. Jedoch muss das Ninhydrin-Reagenz, wie in dem Fall der US 3,778,230, zunächst – typischerweise in einem inerten Behälter bei Umgebungstemperatur – hergestellt werden. Wie oben diskutiert, erfordert dies aufwändige und zeitraubende Verfahren, um das Risiko der Oxidation von Hydrindantin zu minimieren.

Es änderte sich wenig in den vergangenen 60 Jahren seit der Entdeckung von auf Ninhydrin basierender, Hydrindantin erfordernder Analyse durch Moore, Stein und Spackmann. Vielmehr stellt dieses Verfahren immer noch die gebräuchlichste derzeit angewendete Technik dar. Obwohl dieses Verfahren durch Verwendung verschiedener Reduktionsmittel und/oder Lösungsmittel modifiziert wurde, stellen Anfälligkeit für Oxidation und geringe Löslichkeit in wässrigen Lösungen, wie oben aufgezeigt, immer noch Nachteile dar.

Trotz umfangreicher Forschung, die im Hinblick auf das Auffinden alternativer Reduktionsmittel durchgeführt wurde, sind die Hersteller allgemein zu der Bereitstellung separater Lösungen von Hydrindantin und Ninhydrin zurückgekehrt. Typischerweise stellen die Hersteller zwei Flaschen bereit, von denen die erste eine Lösung von Hydrindantin in einem organischen Lösungsmittel enthält, und die zweite eine Lösung von Ninhydrin, einen wässrigen Puffer und ein weiteres organisches Lösungsmittel enthält, wobei beide Flaschen unter einer inerten Gasatmosphäre fest verschlossen werden. Die Flaschen werden dann vor der Verwendung in einer Aminosäureanalysevorrichtung gemischt, um das Ninhydrin-Reagenz zu bilden.

Die meisten Hersteller geben eine maximale Haltbarkeit von etwa 12 Monaten vor dem Mischen und von 2 bis 3 Monaten nach dem Mischen an. Jedoch ist die Lebensdauer des gemischten Reagenz sogar noch geringer, wenn es erst einmal mit dem Analysegerät verbunden ist, und kann deutlich unter einem Monat betragen.

Hitachi scheint der einzige Haupthersteller zu sein, der ein Reduktionsmittel zur Herstellung von Hydrindantin, insbesondere Natriumborhydrid, bereitstellt. Natriumborhydrid ist weder einfach zu handhaben, noch handelt es sich um ein besonders stabiles Reduktionsmittel. Annehmbare Stabilität wird nur erreicht, wenn es in nicht-wässrigen Lösungsmitteln aufbewahrt wird. Der Hauptvorteil der Verwendung von Natriumborhydrid als Reduktionsmittel besteht darin, dass keine unerwünschten farbigen Produkte oder Ausfällungen erzeugt werden. Es sind jedoch immer noch zwei Flaschen während der Herstellung erforderlich, wobei sich die Zusammensetzung und der Mischvorgang ziemlich von den oben beschriebenen Verfahren unterscheiden. Eine Flasche enthält Natriumborhydrid, Ninhydrin und ein nicht-wässriges Lösungsmittel. Die andere Flasche enthält einen wässrigen Puffer und ein weiteres nicht-wässriges Lösungsmittel. Es kann davon ausgegangen werden, dass das Borhydrid nicht mit dem Ninhydrin reagiert, bis es mit dem wässrigen Reagenz gemischt wird.

Im Gegensatz zu dem Verfahren von Moore, Stein und Spackmann werden Natriumborhydrid und Ninhydrin in der Leitung („in-line”) vor der erwärmten Reaktionskammer der Analysevorrichtung miteinander gemischt. Entsprechend wurde versichert, dass das Hitachi-Reagenz für bis zu maximal 12 Monate von der Öffnung eines verschlossenen Reagenz-Behälters an, anstatt des üblichen einen Monats, verwendet werden kann. Nichtsdestotrotz ist Borhydrid immer noch nicht vollständig stabil, und die Anwesenheit von Spuren von Metallen wird bekanntermaßen seinen Verfall beschleunigen. Im Ergebnis wird eine signifikante Menge des Borhydrids in der Regel vor Ablauf eines Jahres verloren gehen. Obwohl bei der Anwendung Hydrindantin in der Leitung („in-line”) erzeugt wird, ist ein zusätzliches Pumpensystem oder eine zusätzliche Leitung notwendig, um Natriumborhydrid in die Analysevorrichtung einzuführen. Dies erhöht die Komplexität und die Kosten des Systems, und das Hitachi-Reagenz könnte nicht für alle Vorrichtungen geeignet sein, wenn diese nicht mit einem derartigen zusätzlichen Pumpensystem und Zuführleitungen ausgestattet sind. Des Weiteren wird bei der Verwendung Hydrindantin aus Ninhydrin gebildet, bevor es mit den eluierten Aminosäuren in der erwärmten Reaktionskammer in Kontakt kommt.

Es wird deutlich, dass immer noch ein Bedarf an einem verbesserten Ninhydrin-Reagenz besteht, welches weniger anfällig für Oxidation ist und somit vor und während der Verwendung leichter zu handhaben ist und eine längere Haltbarkeit bereitstellt.

Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Ninhydrin-Reagenz zur Verwendung in einem Verfahren zur Visualisierung stickstoffhaltiger Verbindungen zur Verfügung, wobei das Ninhydrin-Reagenz (i) Ninhydrin, (ii) einen wässrigen Puffer und (iii) ein temperaturabhängiges Reduktionsmittel umfasst, wobei das Mittel inaktiv bei der Reduktion von Ninhydrin bei einer ersten Temperatur und aktiv bei der Reduktion von Ninhydrin zu Hydrindantin bei einer zweiten Temperatur ist, wobei die zweite Temperatur höher als die erste Temperatur ist.

Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ein Ninhydrin-Reagenz zur Visualisierung stickstoffhaltiger Verbindungen, welche Aminosäuren einschließen aber nicht auf diese beschränkt sind, zur Verfügung. Das Ninhydrin-Reagenz umfasst ein temperaturabhängiges Reduktionsmittel, welches eine Reihe von spezifischen Eigenschaften aufweist, die detaillierter weiter unten ausgeführt werden. Im Ergebnis müssen – im Gegensatz zu bekannten und/oder kommerziell erhältlichen Ninhydrin-Reagenzien – die Komponenten des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung nicht separat aufbewahrt und unmittelbar vor der Verwendung vorgemischt werden und können somit in einer Flasche gelagert und dem Nutzer bereitgestellt werden. In Anbetracht dessen ist die Verwendung des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung weniger aufwendig und weniger kostspielig als die derzeit kommerziell erhältlicher Ninhydrin-Reagenzien.

Das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung muss kein Hydrindantin enthalten und ist bevorzugt im Wesentlichen frei von Hydrindantin. Dies stellt einen vorteilhaften Aspekt des Reagenz der vorliegenden Erfindung dar.

Die Komponenten des Reagenz sind stabil bei der ersten, niedrigeren Temperatur, bei der sie transportiert und gelagert werden können. Hydrindantin wird gebildet, wenn die Komponenten des Ninhydrin-Reagenz auf die zweite Temperatur erhitzt werden;
bei dieser Temperatur ist das Reduktionsmittel für die Reduktion von Ninhydrin zu Hydrindantin aktiv. Entsprechend ist das Ninhydrin-Reagenz sowohl vor als auch während der Verwendung in der Aminosäureanalysevorrichtung leicht zu handhaben und zu beherrschen. Tatsächlich kann das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung in Gegenwart von Luft für einen beachtlichen Zeitraum sehr einfach und effizient gelagert und verwendet werden. Es stellte sich heraus, dass das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung eine Haltbarkeit von deutlich über zwei Jahren aufweisen kann.

In Anbetracht des oben Ausgeführten kann das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung bei anderen Anwendungen eingesetzt werden als bei der Aminosäureanalyse unter Verwendung einer Aminosäureanalysevorrichtung. Aufgrund seiner erhöhten Stabilität kann das Ninhydrin-Reagenz als Visualisierungsmittel allgemein eingesetzt werden, vorausgesetzt, dass die Testprobe ein oder mehrere organische stickstoffhaltige Verbindungen enthält. Obwohl kommerziell erhältliche Ninhydrin-Reagenzien für andere Zwecke als den Nachweis von Aminosäuren in Aminosäureanalysevorrichtungen, welche Ionenaustausch-Trennverfahren verwenden, eingesetzt werden können, kann ein verbessertes Ninhydrin-Reagenz mit den oben erwähnten Eigenschaften leichter in einem weiten Bereich anderer analytischer Verfahren zum Nachweis stickstoffhaltiger organischer Verbindungen Anwendung finden.

Die Verwendung des Reagenz der vorliegenden Erfindung basiert auf der bestens etablierten Aminosäure-Ninhydrin-Reaktion. Entsprechend können die farbigen Reaktionsprodukte in bekannter Weise Photometrie unterzogen werden. Insbesondere gleichen die Empfindlichkeiten der relativen Absorbanz, die bei Anwendung der vorliegenden Erfindung bei den beiden gängigsten Wellenlängen von 570 nm und 440 nm erhalten werden, denen, die derzeit in Aminosäureanalysevorrichtungen, welche kommerziell erhältliche Reagenzien verwenden, erreicht werden. Für viele Anwendungen kann lediglich eine Überwachungswellenlänge erforderlich sein, um primäre und sekundäre Aminosäuren zu bestimmen.

Wie oben erwähnt, umfasst das Reagenz der vorliegenden Erfindung ein temperaturabhängiges Reduktionsmittel. Es stellte sich heraus, dass eine Reihe von temperaturabhängigen Reduktionsmitteln, die bei der Reduktion von Ninhydrin bei einer ersten Temperatur inaktiv sind, bei einer zweiten Temperatur, welche höher als die erste Temperatur ist, Ninhydrin zur Bildung von Hydrindantin reduzieren können.

Im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Ninhydrin-Reagenzien sind deshalb die temperaturabhängigen Reduktionsmittel der vorliegenden Erfindung in Gegenwart von Sauerstoff bei der ersten Temperatur hoch stabil. Entsprechend sind keine aufwändigen und zeitraubenden Verfahren vonnöten, um den Abbau der Reagenzien vor ihrer Verwendung zu umgehen. Des Weiteren kann die Bildung und die Bildungsrate von Hydrindantin aus Ninhydrin durch Variieren der Temperatur gesteuert werden. Auf diese Weise wird Hydrindantin nur erzeugt, wenn es erforderlich ist, wodurch die Lebensdauer des Ninhydrin-Reagenz während der Verwendung erhöht wird und die Kosten reduziert werden.

Eine Verbindung ist unter der Bedingung geeignet zur Verwendung als temperaturabhängiges Reduktionsmittel des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung, dass es inaktiv bei der Reduktion von Ninhydrin bei der ersten Temperatur und aktiv bei der Reduktion von Ninhydrin zu Hydrindantin bei der zweiten Temperatur ist, wobei die zweite Temperatur höher als die erste Temperatur ist. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck „inaktiv”, wenn er in Bezug auf die Reduktion von Ninhydrin bei der ersten Temperatur verwendet wird, auf die Verbindung, welche eine Aktivität bei oder unterhalb einer maximalen Aktivität aufweist. Entsprechend bezieht sich der Ausdruck „aktiv”, wenn er in Bezug auf die Reduktion von Ninhydrin bei der zweiten Temperatur verwendet wird, auf die Verbindung, welche eine minimale Aktivität aufweist oder übersteigt, wie weiter unten detaillierter diskutiert wird.

Verbindungen, die bei der Bildung des temperaturabhängigen Reduktionsmittels des Ninhydrin-Reagenz verwendet werden, können eine Reduktionswirkung aufweisen, so dass Ninhydrin hierdurch mit einer Rate reduziert werden kann, die mit der bekannter Reduktionsmittel vergleichbar ist. Jedoch ist es bevorzugt, dass das temperaturabhängige Reduktionsmittel des Ninhydrin-Reagenz weniger aktiv ist und Ninhydrin mit einer geringeren Rate reduziert als die kommerziell verwendeten Reduktionsmittel. Dies hat den Vorteil, dass die Reduktionsreaktion leichter kontrolliert werden kann.

Um festzustellen, ob eine bestimmte Verbindung eine ausreichende Aktivität bei der Reduktion von Ninhydrin bei der zweiten Temperatur aufweist, wurde ein erstes Protokoll erstellt, dessen Einzelheiten Beispiel 1 zu entnehmen sind. Verbindungen, die die Anforderungen des Protokolls 1 erfüllen, besitzen wenigstens eine minimale Aktivität bei der Reduktion von Ninhydrin zu Hydrindantin bei einer erhöhten oder zweiten Temperatur.

Gemäß dem Verfahren von Protokoll 1 wird eine Verbindung als ausreichend aktiv bei der Reduktion von Ninhydrin angesehen, wenn sie bei einer Schwellentemperatur, d. h., der zweiten Temperatur, einen minimalen Aktivitätsgrad aufweist, d. h., in der Lage ist, eine bestimmte Menge an Ninhydrin in einem bestimmten Zeitraum zu reduzieren. In diesem Protokoll beträgt die Schwellentemperatur 100°C.

Gemäß dem Testprotokoll werden Ninhydrin und die Aminosäurelösung mit einer Lösung der ausgewählten Verbindung bei einer Schwellentemperatur von 100°C gemischt. Nach 20 Minuten wird die Intensität des gegebenenfalls erzeugten Ruhemanns Purpur durch Messen der Absorption der Lösung unter Verwendung eines Standard-Spektrometers bei einer bestimmten Wellenlänge von 570 nm berechnet. Eine starke Intensität der Färbung weist darauf hin, dass die ausgewählte Verbindung einen hohen Aktivitätsgrad bei der Schwellentemperatur aufweist. Bevorzugter ist zum Zwecke der Beurteilung, ob die ausgewählte Verbindung den minimalen Grad an Aktivität aufweist, der erforderlich ist, um einen Bestandteil des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung zu bilden, eine minimale Absorbanz von 0,3 erforderlich. Die minimale Aktivität der Verbindung bei der Reduktion von Ninhydrin bei der zweiten Temperatur ist eine Aktivität, die eine Absorbanz von wenigstens 0,3 in dem zuvor erwähnten Test liefert. Eine Absorbanz unterhalb von etwa 0,3 weist darauf hin, dass die Verbindung nicht ausreichend aktiv bei erhöhten Temperaturen bei der Reduktion von Ninhydrin ist, um in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden. Noch bevorzugter beträgt die minimale Absorbanz, die von der Kandidatenverbindung erreicht werden müsste, wenigstens 0,4.

Zusätzlich zu dem oben Ausgeführten müssen Verbindungen zur Verwendung bei der Bildung des temperaturabhängigen Reduktionsmittels in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung inaktiv bei der Reduktion von Ninhydrin bei einer ersten Temperatur sein.

Die erste Temperatur, bei der die Verbindungen inaktiv sein müssen, ist niedriger als die zweite Temperatur. Typischerweise ist die erste Temperatur eine Temperatur oder ein Temperaturbereich, bei der/dem das Reagenz üblicherweise gelagert und/oder transportiert wird, bevor es in einer Aminosäureanalysevorrichtung oder allgemein zum Zwecke der Visualisierung stickstoffhaltiger Verbindungen verwendet wird. Existierende Ninhydrin-Reagenzien werden üblicherweise bei Raumtemperatur oder darunter gelagert. Entsprechend ist die erste Temperatur bevorzugt Raumtemperatur. Da die Raumtemperatur typischerweise aufgrund äußerer Faktoren variiert, beträgt die erste Temperatur bevorzugt bis zu 30°C, noch bevorzugter bis zu 25°C, noch bevorzugter 20°C oder darunter. Die erste Temperatur ist bevorzugt höher als 0°C, noch bevorzugter höher als 5°C, noch bevorzugter höher als 10°C. In einer Ausführungsform beträgt die erste Temperatur 5°C bis 25°C. Noch bevorzugter beträgt die erste Temperatur 10°C bis 20°C.

Zu Verbindungen, bei denen festgestellt wurde, dass sie bei der ersten Temperatur inaktiv sind, zählen Verbindungen, von denen normalerweise nicht angenommen wird, dass sie irgendeine signifikante Reduktionswirkung bei der ersten Temperatur aufweisen, welche aber zu ausreichend starken Reduktionsmitteln bei der zweiten Temperatur werden und mit Ninhydrin unter Bildung von Hydrindantin reagieren. Außerdem zählen zu den temperaturabhängigen Reduktionsmitteln, von denen gezeigt wurde, dass sie bei der ersten Temperatur inaktiv sind, Verbindungen, die bekanntermaßen nur eine schwache Reduktionsaktivität bei der ersten Temperatur aufweisen (die unterhalb der oben definierten maximalen Aktivität liegt), die jedoch zu ausreichend starken Reduktionsmitteln bei der zweiten Temperatur werden und mit Ninhydrin unter Bildung von Hydrindantin reagieren.

Um zu bestimmen, ob eine Verbindung ausreichend inaktiv bei der ersten Temperatur ist, wurde ein zweites Protokoll erstellt, welches detailliert in Beispiel 2 beschrieben ist. Protokoll 2 kann vor oder nach Protokoll 1 durchgeführt werden, welches in Beispiel 1 beschrieben ist. Bevorzugter wird Protokoll 2 durchgeführt, nachdem Protokoll 1 verwendet wurde, um festzustellen, dass die ausgewählte Verbindung den minimalen Aktivitätsgrad aufweist, der bei der Schwellentemperatur oder zweiten Temperatur für die Reduktion von Ninhydrin notwendig ist.

Gemäß dem Verfahren von Protokoll 2 wird ein Ninhydrin-Reagenz, welches die ausgewählte Verbindung umfasst, bei der ersten Temperatur in Gegenwart von Luft hergestellt und gelagert. In bestimmten Zeitabständen wird eine Probe von dem Ninhydrin-Reagenz genommen, mit einer Aminosäurelösung gemischt und auf die zweite Temperatur erhitzt. Zum Zwecke der Kontinuität in Bezug auf das in Beispiel 1 beschriebene Protokoll 1 beträgt die zweite Temperatur 100°C, wie oben ausgeführt. Die Intensität des gegebenenfalls erzeugten Ruhemanns Purpur wird durch Messen der Absorptionsspektren der Lösung unter Verwendung eines Standardphotometers berechnet. Das Messen der Intensität bei aufeinander folgenden Proben, insbesondere die Bestimmung der Rate irgendeiner Abnahme der Intensität der Färbung, ist ein Hinweis darauf, ob die Langzeitstabilität der ausgewählten Verbindung derart ist, dass die Verbindung geeignet ist, um in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden.

Gemäß Protokoll 2 wird eine ausgewählte Verbindung als nicht ausreichend stabil bei der ersten Temperatur und somit als nicht geeignet zur Verwendung in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung angesehen, wenn die korrigierte Absorbanz nach einem Monat auf weniger als 50% abfällt. Das bedeutet, dass Verbindungen, die zur Verwendung bei der Bildung des temperaturabhängigen Reduktionsmittels in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung geeignet sind, nach einem Monat eine Aktivität von wenigstens 50% ihrer ursprünglichen Aktivität aufweisen. Bevorzugter wird die ausgewählte Verbindung als geeignet zur Verwendung in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung angesehen, wenn die korrigierte Absorbanz nicht weniger als 50% nach drei Monaten beträgt, noch bevorzugter, wenn die korrigierte Absorbanz nicht weniger als 50% nach sechs Monaten beträgt. Besonders bevorzugte Verbindungen sind solche, bei denen die korrigierte Absorbanz in Protokoll 2 wenigstens 50% nach 12 Monaten beträgt, noch bevorzugter, bei denen die korrigierte Absorbanz wenigstens 50% der ursprünglichen Absorbanz nach 24 Monaten beträgt.

Es stellte sich heraus, dass Verbindungen, welche die oben ausgeführten Eigenschaften aufweisen und die Anforderungen von Protokoll 1 von Beispiel 1 erfüllen können und die Anforderungen von Protokoll 2 von Beispiel 2 erfüllen oder übertreffen, am vorteilhaftesten für die Verwendung in einem Ninhydrin-Reagenz sind. Wie oben erwähnt, wurden unter Anwendung der in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Methoden eine Reihe von Verbindungen identifiziert, die ausreichend stabil bei der ersten Temperatur sind und ebenso den minimalen Aktivitätsgrad bei der zweiten Temperatur aufweisen, der für die Verwendung in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung erforderlich ist. Obwohl diese Verbindungen in ihrem Aktivitätsgrad bei der zweiten Temperatur variieren können, besitzen sie alle den minimalen Aktivitätsgrad, der für die Verwendung in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung erforderlich ist.

Wie angegeben, wurden Protokoll 1 von Beispiel 1 und Protokoll 2 von Beispiel 2 verwendet, um eine Reihe von Verbindungen auf ihre Eignung hin, als temperaturabhängiges Reduktionsmittel des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden, zu screenen. Das Ninhydrin-Reagenz kann ein einziges temperaturabhängiges Reduktionsmittel umfassen. Alternativ kann das Reagenz eine Kombination von zwei oder mehr temperaturabhängigen Reduktionsmitteln umfassen.

Geeignete Verbindungen zur Verwendung als das temperaturabhängige Reduktionsmittel des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung sind im Stand der Technik bekannt und kommerziell erhältlich.

In einer Ausführungsform umfasst das temperaturabhängige Reduktionsmittel ein oder mehrere Saccharide. Die Saccharide können zweckdienlich in Monosaccharide, Disaccharide und Polysaccharide eingeteilt werden.

Viele Saccharide besitzen leichte reduzierende Eigenschaften und werden gelegentlich als reduzierende Zucker bezeichnet. Ein reduzierender Zucker kann als ein Zucker definiert werden, der eine Hemiacetal- oder Hemiketalgruppe in seiner zyklischen Form enthält, die eine Aldehyd- oder Ketongruppe in seiner offenen Ringform erzeugt. Alle Monosaccharide und viele Disaccharide stellen reduzierende Zucker dar.

Zu bevorzugten Monosacchariden zählen Glukose und Fruktose, welche in ihren zyklischen Formen eine Hemiacetal- bzw. eine Hemiketalgruppe aufweisen. Es stellte sich heraus, dass Glukose und Fruktose jeweils ausreichende reduzierende Wirkung bei der zweiten Temperatur (Schwellentemperatur) aufweisen, während sie bei der ersten Temperatur in Gegenwart von Luft stabil bleiben, wenn sie den zuvor erwähnten Protokollen 1 und 2 unterzogen wurden.

Es stellte sich heraus, dass Fruktose eine Haltbarkeit von etwa 3 Jahren bei Raumtemperatur aufweist. Obwohl es nicht so reaktiv bei der Reduktion von Ninhydrin bei der zweiten Temperatur ist, wurde gefunden, dass Glukose mit einer Haltbarkeit von mehr als 4 Jahren bei Raumtemperatur stabiler als Fruktose ist. Entsprechend umfasst, wenn eine längere Haltbarkeit erforderlich ist, das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung bevorzugt Glukose.

Andere Monosaccharide zur Verwendung als das temperaturabhängige Reduktionsmittel des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung umfassen Verbindungen wie Glyceraldehyd und Galaktose, bei denen es sich jeweils um Aldosen handelt. Eine nicht erschöpfende Liste von Monosacchariden, welche sich als geeignet für die Bildung des temperaturabhängigen Reduktionsmittels der vorliegenden Erfindung herausstellten, umfasst die Aldosen, Ribose, Xylose, Erythrose, Threose, Lyxose, Arabinose, Allose, Altrose, Mannose, Gulose, Idose, Talose und L-Glycero-D-mannoheptose und die Ketosen Dihydroxyaceton, Erythrulose, Ribulose, Xylulose, Psicose, Sorbose, Tagatose und Sedoheptalose. Eine Aldose ist ein Monosaccharid, welches eine Aldehydgruppe in seiner linearen Form aufweist, und eine Ketose ist ein Monosaccharid, welches eine Ketongruppe in seiner linearen Form aufweist.

Im Allgemeinen weisen einige Disaccharide und Polysaccharide nicht die Eigenschaften auf, die erforderlich sind, um geeignete temperaturabhängige Reduktionsmittel, wie durch das Testprotokoll und den Batch-Stabilitätstest definiert, zu bilden. Bei den Disacchariden kann es sich um reduzierende oder nicht-reduzierende Zucker handeln. Beispielsweise ist Saccharose (Sucrose) ein nicht-reduzierendes Disaccharid, und es stellte sich heraus, dass sie bei der Reduktion von Ninhydrin zu Hydrindantin nicht ausreichend aktiv ist, wenn sie gemäß Protokoll 1 und Protokoll 2 bewertet wird. Jedoch gibt es eine beträchtliche Anzahl an Disacchariden und Polysacchariden, die eine Hemiacetalgruppe oder eine Hemiketalgruppe in ihrer zyklischen Form aufweisen. Diese Saccharid-Typen können als temperaturabhängige Reduktionsmittel, wie gemäß Protokoll 1 und Protokoll 2 definiert, wirken. Die Disaccharide Laktose und Maltose sind zwei Beispiele dafür.

Eine nicht erschöpfende Liste von Disacchariden, bei denen gefunden wurde, dass sie das temperaturabhängige Reduktionsmittel der vorliegenden Erfindung bilden können, umfasst Trihalose, Cellobiose, Kojibiose, Nigerose, Isomaltose, Sophorose, Laminaribiose, Gentiobiose, Turanose, Maltulose, Palatinose, Gentiobiulose, Mannobiose, Melibiose, Melibiulose, Rutinose und Xylobiose.

Langkettige Polysaccharide können effektive temperaturabhängige Reduktionsmittel darstellen; die Tetrasaccharose Stachyose ist ein Beispiel dafür. Während weitaus längerkettige Polysaccharide, wie beispielsweise Stärke, nicht geeignet sind, können teilweise hydrolysierte Stärken, wie beispielsweise die Dextrine und Maltodextrine, wirksame temperaturabhängige Reduktionsmittel darstellen. Es kann davon ausgegangen werden, dass, obwohl langkettige Polysaccharide geeignete temperaturabhängige Reduktionsmittel darstellen können, sie dennoch nicht bevorzugt sind, da sie viskosere Lösungen ergeben können und die Möglichkeit des Ausfallens erhöhen.

Das temperaturabhängige Reduktionsmittel kann außerdem ein oder mehrere Carbonsäuren und/oder deren Salze umfassen. Es stellte sich heraus, dass im Allgemeinen einfache monofunktionale Carbonsäuren, welche nur eine einzige Carbonsäuregruppe und keine weitere funktionale Gruppe aufweisen, nicht als temperaturabhängige Reduktionsmittel gemäß Protokoll 1 und Protokoll 2 wirken können. Solche monofunktionalen Carbonsäuren umfassen Essigsäure, Propionsäure und Benzoesäure. Jedoch stellte sich heraus, dass Ameisensäure und deren Salze als temperaturabhängige Reduktionsmittel gemäß Protokoll 1 und Protokoll 2 wirken können.

Zu geeigneten Carbonsäuresalzen zur Verwendung in dem temperaturabhängigen Reduktionsmittel zählen Metallsalze, insbesondere Gruppe-I- und Gruppe-II-Metallsalze, zum Beispiel Kalium-, Natrium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Es stellte sich heraus, dass Natriumformiat, das Natriumsalz der Ameisensäure, gemäß Protokoll 1 bzw. Protokoll 2 ausreichend aktiv bei der Reduktion von Ninhydrin zu Hydrindantin bei einer zweiten Temperatur und ausreichend inaktiv bei der Reduktion von Ninhydrin bei einer ersten Temperatur ist. Insbesondere wurde gefunden, dass Natriumformiat eine Reduktionsaktivität zwischen der von Glukose und Fruktose aufweist. Außerdem war die Haltbarkeit ähnlich zu der von Glukose, welche eine Haltbarkeit von über 4 Jahren aufweist.

Andere Carbonsäuren und/oder deren Salze, die zur Verwendung als temperaturabhängige Reduktionsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind solche, welche zusätzlich wenigstens eine weitere reduzierende Gruppe, zum Beispiel mindestens eine Hydroxyketon- und/oder Aldehydgruppe, umfassen. Zu geeigneten Salzen der Carbonsäuren zählen Metallsalze, zum Beispiel Salze von Metallen in den Gruppen I oder II des Periodensystems. Zu Beispielen für geeignete Salze zählen Kalium-, Natrium-, Magnesium- und Calciumsalze.

Bevorzugte Carbonsäuren weisen 1 bis 24 Kohlenstoffatome, bevorzugter 1 bis 18 Kohlenstoffatome, noch bevorzugter 1 bis 12 Kohlenstoffatome, auf, wobei C1- bis C6-Aldehyde und -Ketone besonders bevorzugt sind. Die Verbindungen können geradkettig, verzweigt oder zyklisch sein.

Des Weiteren stellte sich heraus, dass Verbindungen, welche ein oder mehrere Aldehyd- und Ketongruppen, in Anwesenheit oder Abwesenheit von Hydroxylgruppen, umfassen (einschließlich der einfachen Aldehyde und Ketone selbst), die Erfordernisse der Protokolle 1 und 2 erfüllen. Bevorzugte Verbindungen dieses Typs weisen 1 bis 24 Kohlenstoffatome, bevorzugter 1 bis 18 Kohlenstoffatome, noch bevorzugter 1 bis 12 Kohlenstoffatome, auf, wobei C1- bis C6-Aldehyde und -Ketone besonders bevorzugt sind. Die Verbindungen können geradkettig, verzweigt oder zyklisch sein. Beispiele für geeignete Aldehyde und Ketone umfassen Aceton.

Das temperaturabhängige Reduktionsmittel kann außerdem ein oder mehrere anorganische Verbindungen umfassen, vorausgesetzt, dass diese ebenfalls die Voraussetzungen von Protokoll 1 und Protokoll 2 erfüllen. Insbesondere können anorganische Verbindungen, welche Schwefel in einer niedrigen Oxidationsstufe enthalten, wie beispielsweise Sulfit oder Thiosulfat, und/oder anorganische Verbindungen, welche Phosphoroxosäuren in niedrigen Oxidationsstufen enthalten, wie beispielsweise Phosphite und Hypophosphite, besonders geeignet sein. Zum Beispiel stellte sich heraus, dass phosphorige Säure, einschließlich ihrer Phosphitsalze, wie beispielsweise Lithium, Natrium und Kalium, sowohl Protokoll 1 als auch Protokoll 2 bestehen, wobei ihre Aktivität zwischen der von Fruktose und Natriumformiat liegt.

Die temperaturabhängigen Reduktionsmittel zur Verwendung in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung sind allgemein im Stand der Technik bekannt und entweder kommerziell erhältlich oder können in einer Weise analog zu bekannten Synthesewegen hergestellt werden.

Es ist zu erwarten, dass andere Verbindungen oder Klassen von Verbindungen, welche oben nicht angegeben sind, geeignete Komponenten zur Verwendung als temperaturabhängiges Reduktionsmittel des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung darstellen können, vorausgesetzt, dass sie die Erfordernisse von Protokoll 1 von Beispiel 1 sowie von Protokoll 2 von Beispiel 2 erfüllen. Allgemein sollte das temperaturabhängige Reduktionsmittel, außer dass es die Erfordernisse von Protokoll 1 und Protokoll 2 erfüllt, leicht in Wasser löslich oder mit Wasser mischbar sein und keine Ausfällung verursachen, wenn es mit anderen Komponenten des Reagenz und/oder den Komponenten, die in den Analyseverfahren verwendet oder erzeugt werden, zusammengebracht wird. Ebenso ist es vorteilhaft, wenn das temperaturabhängige Reduktionsmittel im Wesentlichen nicht toxisch ist.

In Anbetracht des oben Ausgeführten kann das Ninhydrin-Reagenz das temperaturabhängige Reduktionsmittel in irgendeiner geeigneten Konzentration umfassen. Diese variiert in Abhängigkeit von dem verwendeten temperaturabhängigen Reduktionsmittel, insbesondere von derartigen Faktoren wie dem Aktivitätsgrad bei der zweiten Temperatur. Die Konzentration der temperaturabhängigen Reduktionsmittel kann 0,01% bis 75% w/v oder v/v betragen. Bevorzugter beträgt die Konzentration der temperaturabhängigen Reduktionsmittel 0,01% bis 20% w/v oder v/v. Es stellte sich heraus, dass bei Konzentrationen von höher als 20% w/v oder v/v Komponenten des Reagenz eher dazu tendieren, aus der Lösung auszufallen oder das Ausfallen anderer Komponenten zu bewirken; entsprechend sind Konzentrationen unter 20% zu bevorzugen.

Bei der Herstellung des Ninhydrin-Reagenz zur Verwendung in einem analytischen Verfahren kommt die Ausgangskonzentration des temperaturabhängigen Reduktionsmittels bevorzugt der Konzentration nahe, von der in Protokoll 1 gemäß Beispiel 1 festgestellt wurde, dass sie eine tatsächliche Absorbanz von wenigstens 0,3, bevorzugter eine Absorbanz von 0,3 bis 0,7, liefert. Bevorzugter wird, als Ergebnis wiederholter Durchführung des Testprotokolls gemäß Beispiel 1, wobei jedes Mal die prozentuale Konzentration des temperaturabhängigen Reduktionsmittels erhöht wird, die Konzentration, welche die höchste Absorbanz zwischen 0,6 und 0,7 liefert, ohne aus der Lösung auszufallen oder die anderen Komponenten des Ninhydrin-Reagenz nachteilig zu beeinflussen, als Ausgangskonzentration verwendet.

Das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung umfasst des Weiteren Ninhydrin und einen wässrigen Puffer. Ninhydrin und geeignete wässrige Puffer sind jeweils kommerziell erhältlich und werden in existierenden Ninhydrin-Reagenzien eingesetzt.

Das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung kann Ninhydrin in jeder beliebigen geeigneten Menge enthalten. Bevorzugt beträgt die Konzentration von Ninhydrin in dem Reagenz 0,5 bis 3% w/v. Bevorzugter beträgt die Konzentration von Ninhydrin 1 bis 2,5% w/v. Noch bevorzugter und gemäß Protokoll 1 von Beispiel 1 beträgt die Konzentration von Ninhydrin in dem Reagenz etwa 2% w/v.

In dem Ninhydrin-Reagenz kann irgendein beliebiger geeigneter Puffer verwendet werden. Geeignete Puffer sind aus dem Stand der Technik bekannt. Ein acidischer Puffer ist bevorzugt. Noch bevorzugter ist ein schwach acidischer Puffer, der den pH-Wert bei einem Wert zwischen 3 und 7, bevorzugter 4 bis 6, noch bevorzugter 4,5 bis 5,5, hält. Ein besonders bevorzugter pH-Wert ist etwa 5,2.

Der Puffer kann aus irgendeiner schwachen Säure und einer ihrer konjugierten Basen/Salze hergestellt werden. Bei der Säure kann es sich um eine organische oder eine anorganische Säure handeln. Organische Säuren sind bevorzugt; zu Beispielen dafür zählen Essigsäure, Ethansäure und Propansäure. Eine bevorzugte Kombination besteht aus Essigsäure und einem ihrer Salze. Das Säuresalz kann irgendein geeignetes Salz sein. Das Salz kann von einem beliebigen Metallkation gebildet werden. Jedoch wird bevorzugt das Salz aus irgendeinem Alkalimetall, insbesondere Lithium, Natrium oder Kalium, gebildet.

Wie oben erwähnt, ist Hydrindantin in einem gänzlich wässrigen Medium unlöslich. In Anbetracht dessen können kommerziell erhältliche Ninhydrin-Reagenzien, welche Hydrindantin enthalten, nicht ohne die Gegenwart einer erheblichen Menge an organischem Lösungsmittel hergestellt oder verwendet werden. Es ist jedoch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass das Ninhydrin-Reagenz kein organisches Lösungsmittel oder keine Mischung organischer Lösungsmittel enthalten muss. Als Folge davon werden die Herstellungskosten reduziert, das Reagenz ist für die Umwelt weniger schädlich, und Abfallbeseitigungsverfahren werden vereinfacht.

Die Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels in dem Ninhydrin-Reagenz kann die Wirksamkeit des Reagenz beeinflussen. Es stellte sich heraus, dass die Empfindlichkeit des Reagenz in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, welche kein organisches Lösungsmittel enthalten, um etwa 30% geringer ist als die kommerziell erhältlicher Reagenzien, welche ein organisches Lösungsmittel oder eine Mischung organischer Lösungsmittel umfassen. Außerdem könnte in Abwesenheit organischer Lösungsmittel ein größeres Risiko des Ausfallens des entstandenen Hydrindantins bestehen.

Nichtsdestotrotz liefert das Reagenz der vorliegenden Erfindung, wenn es ohne ein organisches Lösungsmittel formuliert wird, zumindest akzeptable Ergebnisse, wenn es zur Aminosäureanalyse eingesetzt wird. Zudem wird die Optimierung der Konzentration des temperaturabhängigen Reduktionsmittels gemäß Protokoll 1 und Protokoll 2 das Risiko einer Ausfällung minimieren.

In einer alternativen und bevorzugten Ausführungsform umfasst das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung außerdem ein organisches Lösungsmittel oder eine Mischung organischer Lösungsmittel. Zu organischen Lösungsmitteln, die üblicherweise in kommerziell erhältlichen Reagenzien verwendet werden, zählen Dimethylsulfoxid, Ethylenglykol, Propylenglykol, Sulfolan, Hydroxyether, wie beispielsweise Carbitol, Propyleneglykolmonomethylether und Methylcellosolve, und einfache Alkohole, wie beispielsweise Methanol, entweder allein oder als Mischungen. Die Zugabe eines organischen Lösungsmittels erhöht die Sensitivität des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung. Dies sollte berücksichtigt werden, wenn das bevorzugte Ninhydrin-Reagenz in einem Chromatographie-System verwendet wird, wie weiter unten detaillierter diskutiert wird.

Die Gesamtkonzentration des verwendeten organischen Lösungsmittels variiert in Abhängigkeit von der Natur des organischen Lösungsmittels. Insbesondere beträgt die Gesamtkonzentration des verwendeten organischen Lösungsmittels 10% v/v bis 75% v/v. Bevorzugter beträgt die Gesamtkonzentration des verwendeten organischen Lösungsmittels 25% v/v bis 65% v/v. Noch bevorzugter beträgt die Gesamtkonzentration des verwendeten organischen Lösungsmittels 35% v/v bis 55% v/v. Obwohl irgendeines der obigen kommerziell erhältlichen organischen Lösungsmittel verwendet werden kann, wird in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, in Übereinstimmung mit den unten gezeigten Chromatographie-Beispielen, bevorzugt 40% v/v bis 55% v/v Ethylenglykol eingesetzt.

Das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung kann in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren und Standardverfahren und -methoden zum Nachweis stickstoffhaltiger Verbindungen verwendet werden. Bei dem in derartigen Methoden eingesetzten Ninhydrin-Reagenz handelt es sich um das oben in dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung definierte Ninhydrin-Reagenz. Demgemäß umfasst das Ninhydrin-Reagenz ein temperaturabhängiges Reduktionsmittel, welches gemäß Protokoll 1 und Protokoll 2 der Beispiele 1 bzw. 2 inaktiv bei einer ersten Temperatur und aktiv bei einer zweiten Schwellentemperatur ist, um Ninhydrin unter Bildung von Hydrindantin zu reduzieren.

Wie zuvor diskutiert, muss das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung inaktiv bei einer ersten Temperatur und aktiv bei einer zweiten Temperatur sein, um Ninhydrin unter Bildung von Hydrindantin zu reduzieren, wobei die zweite Temperatur höher als die erste ist. Aufgrund seiner erhöhten Stabilität kann das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung als Visualisierungsmittel zur Identifizierung und/oder Quantifizierung einer großen Bandbreite stickstoffhaltiger Verbindungen eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung jedoch zur Aminosäureanalyse, insbesondere unter Anwendung von bekannten und gebräuchlichen Aminosäureanalysevorrichtungen, eingesetzt.

Entsprechend stellt in einem zweiten Aspekt die vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Ninhydrin-Reagenz in einem Verfahren zur Analyse stickstoffhaltiger Verbindungen, insbesondere von Aminosäuren und Ähnlichem, zur Verfügung, wobei das Ninhydrin-Reagenz (i) Ninhydrin, (ii) einen wässrigen Puffer und (iii) ein temperaturabhängiges Reduktionsmittel umfasst, wobei das Mittel inaktiv bei der Reduktion von Ninhydrin bei einer ersten Temperatur und aktiv bei der Reduktion von Ninhydrin zu Hydrindantin bei einer zweiten Temperatur ist, wobei die zweite oder Schwellentemperatur höher als die erste Temperatur ist.

Das Ninhydrin-Reagenz kann in einem Verfahren zur Analyse, zum Beispiel zur Identifizierung und/oder Quantifizierung, einer oder mehrerer stickstoffhaltiger Verbindungen eingesetzt werden. Das Verfahren ist geeignet zur Analyse einer Reihe stickstoffhaltiger Verbindungen. Tatsächlich kann, wie oben erwähnt, das Verfahren zur Analyse sowohl organischer als auch anorganischer stickstoffhaltiger Verbindungen eingesetzt werden.

Das Ninhydrin-Reagenz kann in einem Verfahren zur Analyse, zum Beispiel zur Identifizierung und/oder Quantifizierung, einer oder mehrerer stickstoffhaltiger Verbindungen eingesetzt werden. Das Verfahren ist für die Analyse einer Reihe stickstoffhaltiger Verbindungen geeignet. Tatsächlich kann, wie oben erwähnt, das Verfahren zur Analyse sowohl organischer als auch anorganischer stickstoffhaltiger Verbindungen eingesetzt werden.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbesondere zur Analyse von Aminosäuren und von Verbindungen, welche aus Aminosäuren gebildet werden, wie beispielsweise Proteinen, Peptiden und Ähnlichem, geeignet. Die nachfolgende Beschreibung befasst sich mit der Analyse von Aminosäuren. Selbstverständlich können die anderen zuvor erwähnten stickstoffhaltigen Verbindungen auf analoge Weise bearbeitet werden.

Die stickstoffhaltigen Verbindungen können in einem beliebigen flüssigen Medium oder Strom vorliegen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbesondere zur Analyse eines Eluents aus dem Auslass einer Ionenaustauschersäule, welches eine oder mehrere Aminosäuren enthält, in einem Ionenaustauscher-Flüssigchromatographieverfahren geeignet.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung einer konventionellen automatischen Aminosäureanalysevorrichtung durchgeführt werden. Wie oben erwähnt, umfassen automatische Analysevorrichtungen üblicherweise Mittel zum Trennen von Aminosäuren in ihre jeweiligen Komponenten, ein Eingabesystem zum Einführen eines Ninhydrin-Reagenz in das System, wodurch es den getrennten Aminosäuren und dem Ninhydrin-Reagenz ermöglicht wird, bei erhöhten Temperaturen unter Bildung farbiger Substanzen zu reagieren, und Mittel zum Aufzeichnen der Absorbanz der farbigen Substanzen bei spezifischen Wellenlängen. Auf diese Weise können die in einer zu testenden Probe vorliegenden Aminosäuren und ihre jeweiligen Konzentrationen bestimmt werden.

Aminosäuren werden üblicherweise unter Anwendung von Techniken, welche auf Grundlage der Größe, Löslichkeit, Ladung und/oder Bindungsaffinität unterscheiden, getrennt. Derzeit unterscheidet die geläufigste Technik, die zur Trennung von Aminosäuren eingesetzt wird, auf Grundlage der Nettoladung und wird daher als Ionenaustauscherchromatographie bezeichnet. Die vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, welches effektiv in Verbindung mit Ionenaustauscherchromatographie sowie mit anderen Formen chromatographischer Trennungstechniken, Säulen- und Planartechniken, angewendet werden kann, welche Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie und Hoch- und Niedrigdruckflüssigchromatographie, welche Normalphasen-, Umkehrphasen- und Adsorptionstrennungsmechanismen einbeziehen, einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, welches in Verbindung mit nicht-chromatographischen Trennungstechniken, wie beispielsweise Säulenelektrophorese, angewendet werden kann. Zudem kann das Reagenz effektiv bei Techniken eingesetzt werden, die nicht notwendigerweise chromatographische Trennung beinhalten, wie beispielsweise Fingerabdruck-Visualisierung und Farbentwicklung in Röhren oder Behältern.

In einer Ausführungsform wird die vorliegenden Erfindung als Teil eines Ionenaustauscherchromatographieverfahrens ausgeführt, wobei eine Aminosäure enthaltende Lösung durch eine mit Harz gepackte Ionenaustauschersäule geleitet wird, um die Aminosäureprobe anhand ihrer unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten die Säule hinunter in die jeweiligen Aminosäurekomponenten zu trennen. Die eluierten Aminosäuren liegen dann frei vor und können mit einer Farbentwicklungslösung gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung reagieren.

Wie oben diskutiert, umfasst die Farbentwicklungslösung Ninhydrin ein temperaturabhängiges Reduktionsmittel, welches inaktiv bei einer ersten Temperatur und aktiv bei einer zweiten Schwellentemperatur ist, um Ninhydrin unter Bildung von Hydrindantin zu reduzieren, einen Acetatpuffer und bevorzugt ein organisches Lösungsmittel.

Das oben beschriebene Ninhydrin-Reagenz ist geeignet zur Verwendung in einer gebräuchlichen Aminosäureanalysevorrichtung. Wie oben diskutiert, umfassen vorhandene Aminosäureanalysevorrichtungen eine einzige erwärmte Reaktionskammer. Diese wird ebenso als Farbentwicklungskammer bezeichnet, da hier nach Mischung der aus der Trennsäule ausfließenden Lösung mit dem Ninhydrin-Reagenz das Ruhemanns Purpur erzeugt wird.

Die Temperaturen der Farbentwicklungskammer und/oder die Konzentration des temperaturabhängigen Reduktionsmittels werden bevorzugt derart ausgewählt, dass eine Ausfällung des entstehenden Hydrindantins vermieden wird. Die Temperatur innerhalb der Farbentwicklungskammer kann gemäß dem eingesetzten temperaturabhängigen Reduktionsmittel und dem Umfang, in dem es in der Lage ist, Ninhydrin bei höheren Temperaturen zu reduzieren, variiert werden. Im Allgemeinen liegt jedoch die Temperatur der Farbentwicklungskammer bevorzugt im Bereich von 50°C bis 150°C, bevorzugter von 80°C bis 150°C. Noch bevorzugter beträgt die Temperatur der Farbentwicklungskammer 120°C bis 140°C. Noch bevorzugter beträgt die Temperatur der Farbentwicklungskammer 125°C bis 135°C.

Das Ninhydrin-Reagenz und die eluierten Aminosäuren werden innerhalb der erwärmten Reaktionskammer erhitzt und für eine ausreichende Dauer, zum Beispiel 15 Sekunden bis 5 Minuten, umgesetzt. Bevorzugter werden das Ninhydrin-Reagenz und die eluierten Aminosäuren in der erwärmten Reaktionskammer für eine Dauer von 30 Sekunden bis 2 Minuten, bevorzugter etwa 1 Minute, umgesetzt. Es stellt einen Vorteil des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung dar, dass die Zeit, die zur Erzeugung der erforderlichen Färbung in der Reaktionskammer erforderlich ist, kurz ist.

Wie oben diskutiert, reagieren die Komponenten des Ninhydrin-Reagenz dieser Erfindung nur, wenn sie erwärmt werden, wodurch Hydrindantin erzeugt wird, welches mit den Aminosäuren in Kontakt gebracht werden kann, um das farbige Produkt für die photometrische Analyse zu erzeugen. In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Komponenten des Ninhydrin-Reagenz innerhalb der erwärmten Farbentwicklungsreaktionskammer, typischerweise einer Spirale, erhitzt. Hydrindantin wird in sehr geringen Konzentrationen gleich am Anfang der Farbentwicklungsreaktionsspirale gebildet, und die Hydrindantin-Konzentration steigt mit der Zeit an, wenn das Reagenz weiterhin der erhöhten Temperatur ausgesetzt wird. Auf diese Weise kann das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung bei kommerziell erhältlichen Analysevorrichtungen eingesetzt werden, ohne dass ihre Bauteile oder Betriebsweise modifiziert werden müssen.

Die Komponenten des Ninhydrin-Reagenz können in die Farbentwicklungsreaktionskammer auf verschiedene Weisen, wie im Folgenden beschrieben, eingeführt werden.

In einer ersten Ausführungsform werden Ninhydrin, ein temperaturabhängiges Reduktionsmittel, wie oben beschrieben, und der Puffer und optional ein oder mehrere organische Lösungsmittel vorgemischt, um eine homogene Lösung zu bilden. Diese homogene Lösung stellt das Ninhydrin-Reagenz gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Dies ist die bevorzugte Ausführungsform, da die Mischung deutlich vor ihrer Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann.

Bevorzugter wird die Mischung aus einem oder mehreren Behältern oder Reservoirs durch eine oder mehrere Pumpen abgezogen und an eine gemeinsame Zone an irgendeinem geeigneten Punkt während des Aminosäureanalyseverfahrens abgegeben. Die Zone befindet sich stromabwärts der Ionenaustauschersäule aber stromaufwärts der Farbentwicklungsreaktionskammer. Bei dieser Anordnung handelt es sich um eine bevorzugte Ausführungsform, da in kommerziell erhältlichen Analysevorrichtungen üblicherweise Hydrindantin enthaltende Ninhydrin-Reagenzien auf diese Weise abgegeben werden. Entsprechend kann das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung in gebräuchlichen Aminosäureanalysevorrichtungen eingesetzt werden, ohne dass deren Bauteile oder deren Betriebsweise modifiziert werden müssen.

Noch bevorzugter befindet sich die Zone innerhalb der Farbentwicklungsreaktionskammer. Auf diese Weise wird Hydrindantin unmittelbar nach dem Erwärmen innerhalb der Farbentwicklungsreaktionskammer gebildet.

In einer alternativen Ausführungsform werden die Komponenten des Ninhydrin-Reagenz bis kurz vor dem Erwärmen und dem In-Kontakt-Bringen mit den Aminosäuren separat gehalten. Beispielsweise können Ninhydrin und das temperaturabhängige Reduktionsmittel aus einem einzigen oder aus getrennten Behältern oder Reservoirs durch zwei oder mehrere Pumpen abgezogen und an eine gemeinsame Leitung oder Mischzone abgegeben werden, wo sie unter Bildung einer Mischung vereinigt werden. In dieser Ausführungsform können der Puffer und optional ein oder mehrere Lösungsmittel jeweils aus einem einzigen oder aus separaten Behältern oder Reservoirs gezogen werden, um mit der Mischung aus Ninhydrin und der bei Raumtemperatur inaktiven Verbindung vereinigt zu werden.

Gleichermaßen ist die gemeinsame Leitung oder Mischzone typischerweise stromabwärts der Ionenaustauschersäule aber stromaufwärts der Farbentwicklungsreaktionskammer angeordnet. Diese Anordnung ist bevorzugt, da kommerziell erhältliche Analysevorrichtungen üblicherweise Hydrindantin enthaltende Ninhydrin-Reagenzien auf diese Weise abgeben. Entsprechend kann das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung in gebräuchlichen Aminosäureanalysevorrichtungen eingesetzt werden, ohne dass deren Bauteile oder deren Betriebsweise modifiziert werden müssen.

Noch bevorzugter befindet sich die Zone innerhalb der Farbentwicklungsreaktionskammer. Auf diese Weise wird Hydrindantin unmittelbar nach der Erwärmung in der Farbentwicklungsreaktionskammer gebildet.

Der Aminosäurestrom kann mit den Komponenten oder der Mischung von Komponenten an jedem geeigneten Punkt in dem Verfahren in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel können die Aminosäuren mit dem Ninhydrin oder dem temperaturabhängigen Reduktionsmittel vor Bildung der Mischung und dem Erwärmen vereinigt werden. Alternativ können die Aminosäuren mit der Mischung aus Ninhydrin und dem temperaturabhängigen Reduktionsmittel vor dem Erwärmen vereinigt werden. Als weitere Alternative können die Aminosäuren mit den Komponenten des Reagenz vereinigt werden, nachdem Mischen und Erwärmen stattgefunden haben und das Hydrindantin gebildet wurde.

Wie oben erwähnt, wurden eine Reihe von temperaturabhängigen Reduktionsmitteln unter Anwendung von Protokoll 1 und Protokoll 2 als inaktiv bei einer ersten Temperatur und aktiv bei einer zweiten Schwellentemperatur bei der Reduktion von Ninhydrin zu Hydrindantin identifiziert. Protokoll 1, Protokoll 2 und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun in den folgenden Beispielen beschrieben.

BEISPIELEBeispiel 1: Protokoll 1

Protokoll 1 der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:

  • 1) Herstellung der folgenden Lösungen:
  • i) Wässriger 1 M Lithium-, Natrium- oder Kaliumacetat/Essigsäure-Puffer bei pH 5,2, enthaltend 2% Ninhydrin w/v und eine ausgewählte Ausgangskonzentration (w/v oder v/v) der Verbindung X. Bevorzugt wird mit 0,01% w/v oder v/v gestartet und die Konzentration stufenweise erhöht. Hohe Konzentrationen an wasserlöslichen Feststoffen oder Flüssigkeiten, insbesondere nahe 50% und darüber, können aufgrund von Löslichkeitsproblemen oder anderen nachteiligen Wirkungen nach der Herstellung oder bei Verwendung in einem Analysesystem schwierig zu bewerten sein.
  • ii) Standardlösung von Glycin mit einer Konzentration von 1,0 mM in reinem Wasser. Wie zuvor beschrieben, wird Glycin als Standard-Referenzaminosäure ausgewählt.
  • 2) Geben von 2,0 ml der obigen Lösung i), 0,20 ml der Standard-Glycinlösung ii) und 2,8 ml reinem Wasser in ein Glasreagenzglas von etwa 15 cm Länge und 1,5 cm äußerem Durchmesser.
  • 3) Platzieren des Reagenzglases in einem flüssigen Erwärmungsbad bei 100°C und ungestörtes Belassen darin für 20 Minuten. Herausnehmen des Reagenzglases und schnelles Abkühlen auf Raumtemperatur.
  • 4) Überführen der abgekühlten Lösung in eine 1-cm-Küvette und Messen der Absorbanz bei 570 nm gegen reines Wasser unter Verwendung eines Standard-Spektrophotometers oder -Farbmessgeräts.
  • 5) Wenn die Verbindung auf ihre Aktivität hin untersucht wird, sollte gleichzeitig eine Leerprobe durchgeführt werden, für den Fall, dass Aminosäure- oder Aminverunreinigungen in den Reagenzien vorliegen. Es wird wie in 2) verfahren mit dem Unterschied, dass der Glycinstandard weggelassen wird und die Menge an reinem Wasser auf 3,0 ml erhöht wird. Die Absorbanz wird dann bei 570 nm wie in 4) oben bestimmt.
  • 6) Die tatsächliche Absorbanz, welche von der Verbindung bei der Bewertung erzeugt wird, die im Folgenden als korrigierte Absorbanz bezeichnet wird, wird durch Subtrahieren der Absorbanz der Leerprobe von der Glycinstandard-Absorbanz erhalten.

Da der Aktivitätsgrad der Verbindung X unbekannt ist, wird das Verfahren des obigen Protokolls bevorzugt mehrere Male wiederholt, wobei jedes Mal die Konzentration der Verbindung X stufenweise erhöht wird. Die Konzentration der Verbindung X ist zu erhöhen, bis die korrigierte Absorbanz in den Bereich zwischen 0,6 und 0,7 fällt. Die maximal mögliche korrigierte Absorbanz bei Verwendung von Glycin als Kontrolle liegt zwischen 0,75 und 0,80, so dass nicht notwendigerweise ein Vorteil in dieser Protokollbewertung durch weiteres Erhöhen der Konzentration der Verbindung erzielt wird, wenn eine korrigierte Absorbanz von 0,6 bis 0,7 erreicht wurde.

Wenn die korrigierte Absorbanz niemals über 0,3 hinausgeht, ist dies ein Hinweis darauf, dass Verbindung X nicht den Aktivitätsgrad aufweist, der für die Verwendung in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung erforderlich ist.

Wenn die korrigierte Absorbanz unter 0,30 fällt, ein Erhöhen der Konzentration der Verbindung X jedoch deren Ausfallen aus der Lösung oder irgendeine andere nachteilige Wirkung mit sich bringt, weist dies darauf hin, dass Verbindung X nicht die Eigenschaften aufweist, die zur Verwendung in dem Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung erforderlich sind.

Beispiel 2: Protokoll 2

Unter der Voraussetzung, dass die Verbindung X bei erhöhten Temperaturen ausreichend aktiv ist, um die Anforderungen von Protokoll 1 gemäß dem obigen Beispiel 1 zu erfüllen, kann der folgende Test verwendet werden, um die Langzeitstabilität des Ninhydrin-Reagenz, welches die Verbindung X enthält, bei Raumtemperatur und in Gegenwart von Luft zu beurteilen.

Ein Ninhydrin-Reagenz wird auf ähnliche Weise wie in Protokoll 1 von Beispiel 1 hergestellt und in Gegenwart von Luft bei Raumtemperatur gelagert. In festgelegten Zeitabständen wird eine Probe von dem Ninhydrin-Reagenz genommen, mit einer Aminosäurelösung gemischt und für eine festgelegte Zeit auf 100°C erhitzt. Die vorliegende Menge an gegebenenfalls erzeugtem Ruhemanns Purpur wird mittels eines Absorbanzwerts gemessen. Die Abnahmerate der Farbintensität (Absorbanz) in den aufeinander folgenden Proben zeigt an, ob die Langzeitstabilität der Verbindung X geeignet ist, um Teil des Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung zu bilden.

Wie in Protokoll 1 wird Glycin als Aminosäurestandard verwendet, da die relativen Empfindlichkeiten anderer Aminosäuren und Aminverbindungen ähnlich sein werden, unabhängig davon, welches Reagenz verwendet wird.

Protokoll 2 der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte:

  • 1) An Tag 1, Herstellung der folgenden Lösungen:
  • i) 1,0 mM Glycinstandardlösung in Wasser.
  • ii) Ninhydrin-Reagenz, umfassend einen wässrigen 1 M Lithium-, Natrium- oder Kaliumacetat/Essigsäure-Puffer bei pH 5,2, enthaltend 2% Ninhydrin w/v und eine ausgewählte Konzentration (w/v oder v/v) der Verbindung X. Die Konzentration der Verbindung X ist bevorzugt ähnlich zu der Konzentration, bei der gemäß Protokoll 1 eine korrigierte Absorbanz zwischen 0,4 und 0,7 erreicht wird. 250 ml Reagenz sollten für die gesamte Dauer des Stabilitätsversuchs ausreichend sein.
  • 2) An Tag 1, aufeinander folgende Zugabe von 2,0 ml Ninhydrin-Reagenz (ii), 0,20 ml Glycinstandard (i) und 2,8 ml reinem Wasser in ein übliches Reagenzglas. Mischen und Platzieren des Reagenzglases in einem flüssigen Heizbad bei 100°C und ungestörtes Belassen darin für 35 Minuten. Herausnehmen des Reagenzglases und schnelles Abkühlen auf Raumtemperatur. Messen der Absorbanz der Reagenzglaslösung in einem Spektrophotometer bei 570 nm gegen reines Wasser unter Verwendung einer Durchflusszelle mit 1 cm Weglänge.
  • 3) An Tag 1, Herstellen einer Leerprobe, enthaltend 2,0 ml des Reagenz (ii) und 3,0 ml reines Wasser. Dadurch wird jedweden Aminosäure- oder Aminverunreinigungen, welche in den zur Herstellung des Reagenz verwendeten Komponenten vorliegen können, Rechnung getragen. Mischen und Platzieren des Leerproben-Reagenzglases in einem Heizbad bei 100°C und ungestörtes Belassen darin für 20 Minuten. Herausnehmen des Reagenzglases und schnelles Abkühlen auf Raumtemperatur. Messen der Absorbanz der Reagenzglaslösung in einem Spektrophotometer bei 570 nm gegen reines Wasser unter Verwendung einer Durchflusszelle mit 1 cm Weglänge.
  • 4) An Tag 1, Berechnen der korrigierten Absorbanz, die von der Verbindung X erzeugt wurde. Dies geschieht durch Subtrahieren der Absorbanz der Leerprobe von der Absorbanz der Glycinprobe, wie in Protokoll 1 von Beispiel 1 beschrieben ist.
  • 5) An Tag 1, nach Durchführung der Schritte 1 bis 4, Aufbewahren des Reagenz in einer zugestöpselten Flasche bei 20°C im Dunkeln und unter Luftaussetzung. Diese wird durch Belassen einer großen Luftlücke des ungefähr gleichen Volumens wie das Reagenzvolumen in der Flasche erreicht.
  • 6) Alle 2 bis 4 Wochen, Entnehmen einer Probe des Reagenz und Wiederholen der Schritte 2 und 3. Jedes Mal Berechnen der korrigierten Absorbanz bei 570 nm wie in Schritt 4 und Vergleichen mit der an Tag 1 erhaltenen Absorbanz.

Beispiel 3 – Chromatographie-Beispiele

Die relativen Empfindlichkeiten einer Reihe von Ninhydrin-Reagenzien, welche unterschiedliche temperaturabhängige Reduktionsmittel enthalten, wurden unter Verwendung einer gebräuchlichen Aminosäureanalysevorrichtung bewertet. Wie in dem Testprotokoll und dem Batch-Stabilitätstest wurde Glycin als Referenz-Aminosäure verwendet.

Wie oben diskutiert, kann das Ninhydrin-Reagenz der vorliegenden Erfindung optional ein organisches Lösungsmittel oder Mischungen organischer Lösungsmittel enthalten. Entsprechend wurden zu Vergleichszwecken die relativen Empfindlichkeiten dieser Ninhydrin-Reagenzien sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels untersucht. Wie oben erwähnt, variiert, wenn ein organisches Lösungsmittel eingesetzt wird, die Gesamtkonzentration bevorzugt von 35% bis 55% entsprechend der Natur des verwendeten organischen Lösungsmittels. In diesen Experimenten wurden die temperaturabhängigen Reduktionsmittel sämtlich in Gegenwart von 40% Ethylenglykol untersucht.

Es wurden Chromatographie-Experimente mehrere Male in Bezug auf jedes der temperaturabhängigen Reduktionsmittel durchgeführt, bis deren Empfindlichkeit optimiert war. Dies wurde durch Variieren der Konzentration der temperaturabhängigen Reduktionsmittel und/oder der Reaktionstemperatur erreicht.

Die Ausgangskonzentration war die, bei der sich herausgestellt hatte, dass sie die Bedingungen des oben beschriebenen Testprotokolls erfüllt. Wie oben erwähnt, kann die Ausgangstemperatur innerhalb der Farbentwicklungskammer gemäß dem eingesetzten temperaturabhängigen Reduktionsmittel variiert werden; sie liegt jedoch bevorzugt in dem Bereich von 125°C bis 135°C.

Für die hier gezeigten Chromatographie-Beispiele werden die relativen Empfindlichkeiten für die verschiedenen Reagenz-Zusammensetzungen mittels der Peakhöhen für Glycin in mAU-Einheiten verglichen. Auf diese Weise sind die chromatographischen Bedingungen der Retentionszeit und der Peak-Breiten (d. h., die Peak-Breite bei halber Höhe) für sämtliche Analysen konstant (siehe die folgenden chromatographischen Bedingungen).

Es wurden die folgenden Geräteinstellungen verwendet:
Chromatographie-Modus – Isokratisch
Fließgeschwindigkeit in der Säule – 0,45 ml/min
Fließgeschwindigkeit des Ninhydrin-Reagenz – 0,30 ml/min
Temperatur der erwärmten Reaktionskammer – Variabel zwischen 125 und 135°C
Reaktionszeit – 60 Sekunden
Injektionsvolumen – 20 μl
Menge des injizierten Glycins – 2 nmol
Retentionszeit – 5,0 Minuten
Peakbreite bei halber Höhe (Halbwertsbreite) – 0,26 Minuten
Empfindlichkeits-Maßstab – mAU (1 mAU ist äquivalent zu einer Absorbanz von 0,001)

Beispiel 3.1 – Fruktose

Die Empfindlichkeit eines Ninhydrin-Reagenz, welches 0,20% w/v Fruktose als temperaturabhängiges Reduktionsmittel umfasst, wurde unter Verwendung einer gebräuchlichen Aminosäureanalysevorrichtung unter den oben spezifizierten Bedingungen beurteilt.

In Gegenwart von 40% Ethylenglykol wurde die Peakhöhe mit 112 mAU bei einer Reaktionstemperatur von 131°C identifiziert.

In Abwesenheit von Ethylenglykol lieferte das Ninhydrin-Reagenz, welches 0,20% w/v Fruktose umfasst, eine Peakhöhe von 88 mAU bei einer Reaktionstemperatur von 132°C.

Beispiel 3.2 – Natriumformiat

Die Empfindlichkeit eines Ninhydrin-Reagenz, welches 1% Natriumformiat w/v als temperaturabhängiges Reduktionsmittel umfasst, wurde unter Verwendung einer gebräuchlichen Aminosäureanalysevorrichtung unter den oben spezifizierten Bedingungen beurteilt.

In Gegenwart von 40% Ethylenglykol lieferte das Ninhydrin-Reagenz, welches 1% Natriumformiat umfasst, eine Peakhöhe von 126 mAU bei einer Reaktionstemperatur von 133°C.

In Abwesenheit von Ethylenglykol lieferte das Ninhydrin-Reagenz, welches 1% Natriumformiat umfasst, eine Peakhöhe von 107 mAU bei einer Reaktionstemperatur von 133°C.

Beispiel 3.3 – Glukose

Die Empfindlichkeit eines Ninhydrin-Reagenz, welches 2% Glukose w/v als temperaturabhängiges Reduktionsmittel umfasst, wurde unter Verwendung einer gebräuchlichen Aminosäureanalysevorrichtung unter den oben spezifizierten Bedingungen beurteilt.

In Gegenwart von 40% Ethylenglykol lieferte das Ninhydrin-Reagenz, welches 2% Glukose w/v umfasst, eine Peakhöhe von 97 mAU bei einer Reaktionstemperatur von 131°C.

In Abwesenheit von Ethylenglykol lieferte das Ninhydrin-Reagenz, welches 2% Glukose w/v umfasst, eine Peakhöhe von 79 mAU bei einer Reaktionstemperatur von 133°C.

Die obigen Ergebnisse zeigen einen bedeutenden Anstieg der Aktivität von Glukose zu Natriumformiat zu Fruktose, wie durch die prozentuale Konzentration deutlich wird, die bei Glukose und Fruktose zum Erreichen ähnliche Empfindlichkeiten, welche jeweils von 2% bis 0,2% variieren, erforderlich ist. Es wird daher erwartet, dass die prozentuale Konzentration, die zum Erreichen der gewünschten Empfindlichkeit erforderlich ist, in Abhängigkeit von der/den Verbindung(en), die zur Bildung des temperaturabhängigen Reduktionsmittel eingesetzt wird/werden, variiert. Durch Optimieren von Faktoren, wie beispielsweise der prozentualen Konzentration des temperaturabhängigen Reduktionsmittels, der prozentuale Konzentration des gegebenenfalls vorliegenden organischen Lösungsmittels und der Temperatur der Reaktionskammer während der Verwendung in einer gebräuchlichen Aminosäureanalysevorrichtung, wird die optimale prozentuale Konzentration sämtlicher Verbindungen, welche Protokoll 1 und Protokoll 2 durchlaufen, festgestellt.

Des Weiteren zeigen die Ergebnisse, dass in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels die Empfindlichkeiten der temperaturabhängigen Reduktionsmittel abnehmen. Jedoch wird deutlich, dass diese Abnahme der Aktivität die Empfindlichkeit des Analyseverfahrens nicht wesentlich beeinflusst.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • US 3632496 [0011]
  • US 4359323 [0012]
  • US 3778230 [0015, 0016, 0017, 0018]
  • US 4274833 [0018]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Spackmann, D. H., Stein, W. H. und Moore, S. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. Anal. Chem., 1958, 30: 1190–1206 [0003]