Title:
Therapeutische anti-TIRC7 Antikörper für die Verwendung in Immun und anderen Krankheiten
Kind Code:
U1


Abstract:

Monoklonaler Antikörper oder antigenbindendes Molekül, welches in der Lage ist an ein Antigen zu binden umfassend oder bestehend aus der Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 9 bis 11.




Application Number:
DE202011103324U
Publication Date:
01/02/2012
Filing Date:
07/12/2011
Assignee:
Nekonal S.a.r.l. (Luxemburg, LU)
International Classes:



Foreign References:
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Attorney, Agent or Firm:
König Szynka Tilmann von Renesse, Patentanwälte, Partnerschaft, 40545, Düsseldorf, DE
Claims:
1. Monoklonaler Antikörper oder antigenbindendes Molekül, welches in der Lage ist an ein Antigen zu binden umfassend oder bestehend aus der Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 9 bis 11.

2. Antikörper oder antigenbindende Molekül nach Anspruch 1, umfassend in seiner variablen Region wenigstens eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR) der VH und/oder VL der variablen Region umfassend
(a) die Aminosäuresequenz gezeigt in 4 (VH) (SEQ ID NO: 2) und 5 (VL) (SEQ ID NO: 4); oder
(b) die Aminosäuresequenz gezeigt in 6 (VH) (SEQ ID NO: 6) und 7 (VL) (SEQ ID NO: 8).

3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein chimärer oder humanisierter Antikörper ist.

4. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassend die Aminosäuresequenz der VH und/oder VL Region wie in einer der 4 bis 7 gezeigt.

5. Antigen oder ein Epitop davon welches durch den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 erkannt wird.

6. Polynukleotid kodierend zumindest die variable Region einer Immunglobulinkette eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

7. Vektor umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 6, optional in Kombination mit einem Polynukleotid nach Anspruch 6 welches die variable Region der anderen Immunglobulinkette des besagten Antikörpers kodiert.

8. Wirtszelle umfassend ein Polynukleotid nach Anspruch 6 oder einen Vektor nach Anspruch 7.

9. Antikörper, eine Immunglobulinkette davon oder ein antigenbindendes Fragment davon kodiert durch ein Polynukleotid nach Anspruch 6.

10. Zusammensetzung umfassend den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Antigen von Anspruch 5, das Polynukleotid von Anspruch 6, den Vektor nach Anspruch 7 oder die Zelle nach Anspruch 8.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10 welche eine pharmazeutische Zusammensetzung ist und zusätzlich einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 weiterhin umfassend einen immunsuppresiven Wirkstoff.

13. Diagnostische Zusammensetzung umfassend den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 9, das Antigen nach Anspruch 5, das Polynukleotid nach Anspruch 6, den Vektor nach Anspruch 7 oder die Zelle nach Anspruch 8; und optional geeignete Reagenzien die herkömmlicher Weise in Immun- oder Nukleinsäure-basierten diagnostischen Methoden genutzt werden.

14. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 9, oder des Antigens nach Anspruch 5 für die Darstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Inhibition einer Immunantwort.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutischen Zusammensetzung intravenös, intramuskulär, subkutan, intraperitoneal oder als Aerosol verabreicht wird.

16. Verwendung eines ligandenbindenden Moleküls umfassend wenigstens eine CDR eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 9 für die Diagnose und/oder die Behandlung einer Krankheit mit Bezug auf die anormale Expression oder Fehlfunktion der T-Zell Immunantwort cDNA 7 (TIRC7).

17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte ligandenbindende Molekül ein Antikörper nach einem der Anspüche 1 bis 4 oder eine Immunglobulinkette davon ist.

18. Oligonukleotid im Wesentlichen bestehend aus der Nukleotidsequenz einer der SEQ ID NOs: 12 bis 40.

19. Verwendung eines Oligonukleotids umfassend eine Nukleotidsequenz einer der SEQ ID NOs: 12 bis 40 für die Klonierung eines anti-TIRC7 Antikörpers oder eines TIRC7 bindenden Moleküls.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft anti-T-Zell Immunantwort cDNA 7 (TIRC7) Antikörper und deren Verwendung. Im Besonderen sind die erfindungsgemäßen anti-TIRC7 Antikörper im Stande die Proliferation von aktivierten Zellen des Immunsystems zu unterdrücken. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die die vorgenannten Antikörper umfassen und Verfahren um die Immunzellenproliferation zu modulieren und Krankheiten der Immunantwort zu behandeln.

Mehrere Dokumente sind innerhalb des Textes dieser Beschreibung zitiert. Jedes dieser hier zitierten Dokumente (inklusive von Herstellerangaben, Anleitungen, etc.) werden hiermit durch Bezugnahme hierin aufgenommen; jedoch stellt dies kein Eingeständnis dar, dass jedes dieser zitierten Dokumente tatsächlich Stand der Technik für diese Erfindung ist.

T-Zell Aktivierung ist ein serieller Prozess, der mehrere Signalkaskadenwege, sequentielle Änderungen in der Genexpression umfasst die eine Differenzierung der T-Zellen in verschiedene Subpopulationen zu Folge hat, zum Beispiel Th1 und Th2, die sich durch ihr Muster der Zytokinproduktion unterscheiden lassen und die Art und Weise der Immunantwort charakterisieren. Die T-Zellantwort wird durch die die Interaktion des antigenspezifischen T-Zellrezeptors (T-cell receptor, TCR) mit Peptiden initiiert, die durch die Haupthistokompatibilitätskomplex(major histocompatibility complex, MHC)-Moleküle auf der Oberfläche von antigen-präsentierenden Zellen (antigen-presenting cells, APCs) präsentiert werden. Zusätzliche Signale werden durch ein Netzwerk von Rezeptor-Liganden Interaktionen abgegeben vermittelt durch eine Anzahl an Membranproteinen, wie z. B. CD28/CTLA4 und B7, CD40/CD40L, LFA-1 und ICAM-1 (Lenschow, Science 257 (1992), 789–792; Linsley, Annu. Rev. Immunol. 11 (1993), 191–212; Xu Immunity 1 (1994), 423–431; Bachmann, Immunity 7 (1997), 549–557; Schwartz, Cell 71 (1992), 1065–1068), die zusammenfassend als ko-stimulatorische Signale bezeichnet werden. Diese Membranproteine können die T-Zellaktivierung auf bestimmte Art und Weise verändern (Bachmann, Immunity 7 (1997), 549–557) und regulieren die Immunantwort durch die Integration von positiven und negativen Signalen, die durch diese Moleküle abgegeben werden. Viele der Mittel, die wirksam sind, die zelluläre Immunantwort zu modulieren interferieren entweder mit dem T-Zellrezeptor (Cosimi, Transplantation 32 (1981), 535–539), blockieren die ko-stimulatorischen Signalwege (Larsen, Nature 381 (1996), 434–438; Blazar J. Immuno. 157 (1996), 3250–3259; Kirck, Proc. Natl. Acad. Sc,. USA (1997), 8789–8794; Linsley, Science 257 (1992), 792–95; Turka, Proc. Natl. Acad., Sci. USA 89 (1992), 11102–11105) oder inhibieren intrazelluläre, den primären Zellmembran-Auslösern nachgeordnete Aktivierungssignale (Schreiber und Crabtree, Immunology Today 13 (1992), 136–42). Therapeutische Unterdrückung der T-Zellaktivierung bei Organtransplantationen und Autoimmunkrankheiten stützen sich auf pan-immunsupressive Medikamente, die mit nachgeschalteten, intrazellulären Ereignissen interferieren. Eine spezifische Modulation der Immunantwort bleibt als ein seit langer Zeit bestehendes Ziel in der immunologischen Forschung.

Angesichts des Bedarfs eines therapeutischen Mittels für die Behandlung von Krankheiten der Immunantworten des menschlichen Körpers, stellt das technische Problem der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Mitteln und Methoden für die Modulation von Immunantworten in einer Person dar. Die Lösung für das genannte technische Problem wird durch die Bereitstellung der Ausführungsbeispiele, wie sie in den Ansprüchen und nachfolgend beschrieben werden erzielt.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung im allgemeinen monoklonale Antikörper oder Antigen-bindende Moleküle, die in der Lage sind an ein Antigen zu binden umfassend oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NO. 9 bis 11. Diese Antikörper sind vorzugsweise fähig die Proliferation von peripheren mononukleären Blutzellen (peripheral blond mononuclear cells, PBMCs) zu inhibieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des genannten Antikörpers umfasst dieser in seiner variablen Region zumindest eine Komplementarität bestimmende Region (complementarity determing region, CDR) der VH und/oder VL der variablen Region umfassend

  • (a) the Aminosäuresequenz dargestellt in 4 (VH) (SEQ ID NO: 2) und 5 (VL) (SEQ ID NO: 4); oder
  • (b) die Aminosäuresequenz dargestellt in 6 (VH) (SEQ ID NO: 6) und 7 (VL) (SEQ ID NO: 8).

Der Fachmann weiß, dass jede variable Domäne (die schwere Kette VH und die leichte Kette VL) eines Antikörpers drei hypervariable Regionen umfasst, die manchmal auch als Komplementarität bestimmende Region (complementarity determing region) oder „CDRs” bezeichnet werden, die von vier relativ konservierten Framework-Regionen flankiert werden. Die CDRs der variablen Region des erfindungsgemäßen Antikörpers kann zum Beispiel nach Kabat, „Sequences of Proteins of Immunological Interest” (US Department of Health and Human Services, third edition 193, fourth edition 1987, fifth edition 1990) bestimmt werden. Der Fachmann wird leicht erkennen, dass die variable Domäne des Antikörpers mit der zuvor beschriebenen variablen Domäne für die Konstruktion anderer Polypeptide oder Antikörper mit der gewünschten Spezifität und biologischen Funktion genutzt werden kann. Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch Polypeptide und Antikörper umfassend zumindest eine CDR der zuvor genannten variablen Domäne und welche vorteilhafterweise im Wesentlichen die gleichen oder ähnliche Bindungseigenschaften wie der in den beigefügten Beispielen beschriebene Antikörper hat. Der Fachmann wird sogleich erkennen, dass durch die Verwendung der herin beschriebenen variablen Domänen oder CDRs Antikörper nach im Stand der Technik bekannten Methoden, wie zum Beispiel in EP-A1 0 451 216 und EP-A1 0 549 581 beschrieben, konstruiert werden können. Weiterhin weiß der Fachmann, dass die Bindungsaffinität durch Aminosäuresubstitutionen innerhalb der CDRs oder der hypervariablen Schleifen erhöht werden kann (Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901–917), welche teilweise mit den von Kabat definierten CDRs überlappen. Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf Antikörper, wobei eine oder mehrere der erwähnten CDRs eine oder mehrere, vorzugsweise nicht mehr als zwei Aminosäuresubstitutionen umfassen. Vorzugsweise umfasst der erfindungsgemäße Antikörper eine oder beide seiner Immunglobulinketten zwei oder alle drei CDRs der vorgenannten variablen Regionen wie jeweils in 45 und 67.

Wie in den Beispielen beschrieben, erkennt der erfindungsgemäße Antikörper ein Fragment der Aminosäuresequenz des T-Zellimmunantwort cDNA 7 (TIRC7) Proteins. Der Ausdruck „TIRC7” wie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung benutzt, bezeichnet ein Protein, welches ursprünglich beschrieben worden ist an der Signalübertragung der T-Zell Aktivierung und Proliferation beteiligt zu sein und welches, vorzugsweise in löslicher Form fähig ist, die T-Zell Proliferation als Antwort auf Alloaktivierung in einer gemischen Lymphozytenkultur oder als Antwort auf Mitogene, wenn diese exogen zur Kultur hinzugegeben werden, zu inhibieren oder zu unterdrücken. Für in vitro translatiertes TIRC7 Protein wurde gezeigt, das es in einer dosisabhängigen Weise imstande ist, die T-Zell Proliferation als Antwort auf Alloaktivierung in einer gemischten Lymphoyzytenkultur oder als Antwort auf Mitogene zu unterdrücken. TIRC7 ist dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt und beschrieben, inter alia, in WO 99/11782, Utku, Immunity 9 (1998), 509–518 und Heinemann, Genomics 57 (1999), 398–406, welcher auch die Amino- und Nukleinsäuresequenz von TIRC7 offenbart.

Wie von Utku et al. gezeigt wurde (Immunity, 1998), unterdrückten polyklonale Antikörper gegen TIRC7 die Proliferation von aktivierten T-Zellen in MLR in einer dosisabhängigen Art und Weise. Während diese vielversprechenden Versuche die therapeutische Verwendung solcher Antikörper nahelegen, bestand der Bedarf an Antikörpern mit einer hohen Bindungsspezifität und Affinität und die beispielsweise effizient die T-Zell Proliferation unterdrücken und somit die Verwendung solcher Antikörper bei niedrigen Dosen erlauben, um so eine mögliche HAMA Antwort in einer Person zu umgehen. Weiterhin können solche Antikörper unterschiedliche oder unterschiedlich stark ausgeprägte Effekte auf, z. B. Zytokinproduktion haben, was wichtig in der Behandlung von bestimmten Krankheiten der Immunantwort sein kann, zum Beispiel Transplantatabstoßung.

Um Antikörper zu finden, welche den oben genannten Anforderungen genügen, wurden Mäuse mit Peptiden von mehreren Domänen von TIRC7 immunisiert, von denen angenommen wurde, dass sie möglicher Weise geeignete Antigene repräsentieren; siehe der WO 99/11782. Während die meisten dieser Peptide sich als gute Antigene für die Herstellung polyklonaler Antikörper erwiesen, scheiterten mehrere Versuche stabile Hybridoma herzustellen, die Antikörper mit der gewünschten Bindungsaffinität und/oder der biologischen Aktivität sekretierten. Jedoch hatten die Erfinder schlussendlich mit drei (siehe Tabelle 1 und SEQ ID NOs: 9 bis 11, infra) von sechs Peptiden abgeleitet von hypothetischen extrazellulären Domänen von TIRC7 Erfolg stabile Hybridoma zu generieren, die die gewünschten monoklonalen Antikörper produzierten. Auf diese Weise wurden 192 stabile antikörper-produzierende Hybridoma erhalten und 42 Antikörper wurden getestet; siehe 1. Von diesen Antikörpern wurden 15 Antikörper ausgewählt, die sowohl die Zellproliferation (2, Proliferations-Assay), als auch die Sekretion von IFNγ und IL-2 (2) von PHA-stimulierten humanen PBMC von gesunden Spendern unter 30% berechnet in Bezug auf die Positivkontrolle (100%) inhibierten. Schließlich wurden drei Antikörper ausgewählt, #9 und #17, welche beide von Fusionen mit Milzzellen von Mäusen abstammten, die mit Peptiden immunisiert worden waren, die von der größten extrazellulären Domäne von TIRC7 abgeleitet waren, und #18, in diesem Fall war das Peptid, welches zur Immunisierung verwendet wurde, von der größten extrazellulären Schleife von TIRC7, dem C-Terminus von TIRC7, abgeleitet war (3); siehe auch Tabelle 1. Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung konnte dann überraschender Weise gezeigt werden, dass chimäre rekombinante Antikörper in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, welche die Variablen VH- und VL-Regionen von mausmonoklonalen Antikörpern und entweder die humane Gamma- oder Kappa-konstante Region aufweisen, im Wesentlichen die gleiche Spezifität, Bindungsaffinität und biologische Aktivität wie die Mausspenderantikörper hatten.

Dementsprechend kann von den Antikörpern der vorliegenden Erfindung erwartet werden, dass sie nützlich in der Modulation der Immunantwort sind. Die Modulation der Immunantwort liegt z. B. durch die Aktivierung oder Inhibierung der Proliferation und/oder Differenzierung von T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, LAK-Zellen, dendritischen Zellen, Monozyten, Magrophagen oder anderen Immunsystemzellen und kann nützlich in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, allergischen Krankheiten, und in Transplantationstherapien sein, bei denen Transplantat-gegen-Wirt- oder Wirt-gegen-Transplantat-Effekte unerwünscht sein können. Die Antikörper können ebenso Immunstimulanzien bei Gegebenheiten, wie z. B. Krebs, Infektionskrankheiten, Sepsis, Wundheilung oder Immunisierung sein. Alternativ könnten sie Immunsuppressiva sein. Sie könnten ebenfalls dazu genutzt werden, Entzündungen zu detektieren und vorzugsweise Entzündung durch Aktivierung oder Inhibition, der Aktivierung von Immun- oder inklamatorischen Zellen zu modulieren. Eine bevorzugte Methode beinhaltet die Detektion (und vorzugsweise Modulation) von Entzündungen in Geweben, wie beispielsweise entzündeter Vaskulatur oder Leukozyten. Weiterhin können die Antikörper der vorliegenden Erfindung genutzt werden, um Empfindlichkeit zu induzieren oder aufrechtzuerhalten.

Der Ausdruck „Immununempfindlichkeit” umfasst nicht Unempfindlichkeit von einem Teil der Immunzellen, wie T-Zellen oder B-Zellen, NK-Zellen, Monozyten und/oder Magrophagen. Die Bezeichnungen „Behandlung”, „behandeln” und dergleichen bezeichnen hierin im Allgemeinen einen gewünschten pharmakologischen und/oder physiologischen Effekt zu erzielen. Der Effekt kann prophylaktisch in Bezug auf eine komplette oder teilweise Vorbeugung einer Krankheit oder dessen Symptom und/oder kann therapeutisch in Bezug auf die teilweise oder komplette Heilung einer Krankheit und/oder nachteiligen Effekten, die dieser Krankheit zugeschrieben sind. Der Ausdruck „Behandlung”, wie vorliegend benutzt, deckt jegliche Behandlung einer Krankheit in einem Säuger, insbesondere eines Menschen ab, und beinhaltet: a) Vorbeugung des Auftretens der Krankheit in einer Person, die für die Krankheit prädispositioniert sein kann, aber bisher noch nicht mit der Krankheit diagnostiziert wurde; b) Inhibition der Krankheit, nämlich Stoppen der Entwicklung; oder c) Lindern der Krankheit, nämlich durch Hervorrufung der Regression der Krankheit. Weiterhin bezieht sich der Ausdruck „Subjekt”, wie hierin verwendet, auf Tiere, die der Besserung, Behandlung und/oder Vorbeugung von immunologischen Krankheiten, wie hierin offenbart, bedürfen. Am meisten bevorzugt ist das besagte Subjekt ein Mensch.

Daher können die hier beschriebenen Antikörper für jede Anwendung verwendet werden, welche für die Anti-TIRC7-Antikörper zuvor beschrieben wurde. Insbesondere, wenn therapeutische oder in vivo-diagnostische Verwendungen geplant sind; siehe z. B. WO 99/11782 und die ebenfalls anhängige PCT-Anmeldung Nr. PCT/EP 02/13384, deren Offenbarungsgehalt hiermit durch Verweis einbezogen wird.

Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die beschriebenen Anti-TIRC7-Antikörper in der Lage sind, die Funktion von TIRC7 zu modulieren (z. B. die Signalkaskaden oder adhäsive Aktivitäten), von Familienmitgliedern und/oder deren Liganden, z. B. durch Eingreifen in die Interaktion von TIRC7 mit seinem Liganden. Jedoch ungeachtet der Theorie hinter den molekularen Wirkmechanismen kann der erfindungsgemäße Antikörper durch (1.) Eine Bindungsaffinität zu TIRC7 in der Größenordnung von wenigstens 10–7 M, vorzugsweise von wenigstens 10–8 M, am meisten bevorzugt von wenigstens 0,5 × 10–8 M und noch mehr bevorzugt von wenigstens 10–8 M und am meisten bevorzug von wenigstens 10–9 M oder 10–10 M und (2.) durch die Fähigkeit, die Proliferation durch mitogen-stimulierte PBMCs in einem Test, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu inhibieren. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Antikörper und jedes davon abgeleitete bindende Fragment in der Lage, sowohl die Proliferation als auch die Sekretion von IFNg und IL-2 von PHA-stimulierten humanen PBMC von gesunden Spendern unter 30%, berechnet im Verhältnis zur Positivkontrolle (100%), zu inhibieren. Am meisten bevorzugt ist der Antikörper oder das Bindefragment fähig, die Proliferation von PHA-stimulierten humanen PBMC von gesunden Spendern unter 25% oder sogar unter 20% oder mehr, berechnet in Bezug auf die Positivkontrolle (100%), zu inhibieren.

Somit sind die vorliegenden Antikörper vorzugsweise fähig, die Proliferation von peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) zu modulieren, vorzugsweise zu inhibieren. Vorzugsweise modulieren die Antikörper der vorliegenden Erfindung zumindest eine der nachfolgenden Funktionen (welche Funktionen von TIRC7-Proteinen und/oder Liganden davon sind): Aktivierung von Neutrophilen; Aktivierung oder Inhibition von T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, LAK-Zellen, dendritischen Zellen oder anderen Immunsystemzellen; die Proliferation und/oder Differenzierung von T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, LAK-Zellen, dendritischen Zellen oder anderen Immunsystemzellen; die Proliferation und/oder Differenzierung von Epithelialzellen, wie z. B. Brust- oder Darm-/Dickdarm-Epithelzellen, oder Keratinozyten. Zusätzlich sind diese Antikörper vorzugsweise fähig, die homotypische und/oder heterotypische Adhäsion zwischen TIRC7-Proteinen (z. B. TIRC7-Familienmitgliedern) zu verändern oder die Adhäsion von TIRC7-Proteinen zu anderen TIRC7-Liganden. Der erfindungsgemäße Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper, ein single chain-Antikörper, chimärer Antikörper, humanisierter Antikörper, xenogenetischer Antikörper oder ein Fragment und/oder ein chemisch modifiziertes Derivat hiervon sein, das spezifisch das TIRC7-Antigen bindet, einschließlich bi-spezifischer Antikörper, synthetischer Antikörper, Antikörperfragmente, wie z. B. Fab-, Fv- oder scFv-Fragemente etc., oder ein chemisch modifiziertes Derivat hiervon. Antikörper oder Fragmente davon können durch Methoden erhalten werden, die z. B. in Harlow und Lane „Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988, beschrieben sind. Wenn Derivate der genannten Antikörper durch die Phage-Display-Technik erhalten werden, kann die Oberflächenplasmonresonanz, wie in dem BIAcore-System, verwendet werden, um die Effizienz der Phagenantikörper zu erhöhen, die an das gleiche Epitop binden, wie einer der hier beschriebenen Antikörper (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97–105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7–13). Die Produktion von chimären Antikörpern ist z. B. in WO 89/09622 beschrieben. Methoden für die Produktion von humanisierten Antikörpern sind z. B. in EP-A1 0 239 400 und WO 90/07861 beschrieben. Eine weitere Quelle für Antikörper, die im Einklang mit der vorliegenden Erfindung genutzt werden können, sind sogenannte xenogenetische Antikörper. Das allgemeine Prinzip für die Produktion von xenogenetischen Antikörpern, wie z. B. von humanen Antikörpern in Mäusen, ist in z. B. WO 910741, WO 94/02602, WO 96/34096 und WO 96/33735 beschrieben. Wie zuvor diskutiert, kann der erfindungsgemäße Antikörper in einer Vielzahl von Formen neben den von kompletten Antikörpern existieren; inklusive, z. B., Fν, Fab und F(ab)2 sowie als Einzelkette; siehe z. B. WO 88/09344. Im Falle von bi-spezifischen Antikörpern, bei denen nur eine Spezifität auf TIRC7 gerichtet ist und die andere vorzugsweise auf ein T-Zellen-Antigen sowie z. B. CD3, ist es vorteilhaft, wenn die Bindestelle, die TIRC7 erkennt, eine hohe Affinität hat, um die Antigen-Zielzelle einzufangen. Auf der anderen Seite sollte die Bindungsaffinität der Bindestelle, die z. B. ein stimulatorisches T-Zellen-Molekül erkennt, in der Größenordnung von solchen von natürlichen T-Zell-Rezeptor-/Liganden-Interaktionen sein oder in einer solchen, die gewöhnlicherweise bei der Interaktion von T-Zellkostimulatorischen Molekülen mit ihrem Rezeptor gefunden werden.

Die Antikörper der vorliegenden Erfindung oder ihre entsprechenden Immunglobulinketten können weiterhin durch konventionelle Techniken modifiziert werden, die im Stand der Technik bekannt sind, z. B. durch die Verwendung von Aminosäuredeletionen, Insersionen, Substitutionen, Additionen und/oder Rekombinationen und/oder durch irgendeine Modifikation, die im Stand der Technik bekannt ist, entweder alleine oder in Kombination modifiziert werden. Methodiken für das Einführen solcher Modifikationen in der Aminosäuresequenz einer Immunglobulinkette sind dem Fachmann wohl bekannt; siehe z. B. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. Modifikationen des erfindungsgemäßen Antikörpers beinhaltet chemische und/oder enzymatische Derivatisierung an einer oder mehreren bestehenden Aminosäuren, einschließlich Seitenkettenmodifikationen, Grundgerüstmodifikationen und N- und C-terminalen Modifikationen inklusive Acetylierung, Hydroxilierung, Methylierung, Amidierung und dem Anhängen von Kohlenhydrat- oder Fettresten, Kofaktoren und dergleichen. Gleichfalls umfasst die vorliegende Erfindung chimäre Proteine, welche die beschriebenen Anti-TIRC7-Antikörper oder ein Fragment davon, welches am Aminoterminus an ein heterologes Molekül fusioniert ist, wie z. B. ein immunstimulatorischer Ligand am C-Terminus; siehe z. B. WO 00/30680 für korrespondierende technische Details.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung jedweden Antikörper und ähnliche Bindemoleküle, die das gleiche Epitop erkennen, mit im Wesentlichen der gleichen Affinität oder zumindest 1/10 der Affinität wie die hier beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörper. Solche Antikörper und Bindemoleküle können auf ihre Bindungsspezifität und Affinität durch z. B. die Verwendung von Peptid 6 und/oder kompetitiven Tests mit dem in den Beispielen beschriebenen Antikörper getestet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Antikörper ein chimärer oder humanisierter Antikörper. Chimäre Antikörper sind Antikörper, deren leichte und schwere Kettengene konstruiert wurden, typischerweise durch Genmanipulation von Immunglobulin-Gensegmenten, die zu verschiedenen Spezies gehören. Z. B. können die variablen Segmente (V) von Genen von dem Maus-TIRC7-monoklonalen Antikörper mit menschlichen konstanten Segmenten (C) zusammengeführt werden, wie z. B. γ1 und γ3. Ein typischer therapeutischer chimärer Antikörper ist daher ein Hybridprotein, bestehend aus der V- oder Antigen-bindenden Domäne von einem Mausantikörper und der C- oder Effektordomäne von einem menschlichen Antikörper. Jedoch können auch andere Säugerspezies ebenfalls genutzt werden, wenn z. B. eine veterinärmedizinische Verwendung vorgesehen ist. Humane DNA-Sequenzen der konstanten Region können im Einklang mit wohlbekannten Verfahren isoliert werden von einer Vielzahl von menschlichen Zellen, aber vorzugsweise immortalisierten B-Zellen (siehe Kabat op. cit. und WO 87/02671). Zum Beispiel die humane konstante Kappa-Immunglobulin- und J-Region-Gene und die Sequenzen sind in Heiter, Cell 22 (1980), 197–207 beschrieben und die Nukleotidsequenz des humanen Immunglobulin C-Genes ist beschrieben in Ellison, Nucl. Acids Res. 10 (1982), 4071, welche beide hiermit durch Bezugnahme einbezogen sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Antikörper die Aminosäuresequenz von der VH- und/oder VL-Region, wie jeweils in 4 und 5 und 6 und 7 dargestellt.

In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Antigen oder ein Epitop davon, welches durch den erfindungsgemäßen Antikörper erkannt wird. Das genannte Antigen oder Epitop kann glykosiliert, unglykosiliert oder partiell deglykosiliert sein. Wie hier diskutiert und in Beispielen erklärt, zeigt die vorliegende Erfindung Antigene, die besonders geeignet sind, eine Immunantwort hervorzurufen. Für die Identifizierung und Isolierung von erfindungsgemäßen Antigenen und Epitopen kann konventionelle Epitopenkartierung genutzt werden; siehe z. B. Harlow und Lane, supra. Zudem können z. B. cDNA-Bibliotheken durch Injektion von verschiedenen cDNAs in Oozyten gescreent werden unter Gewährung von ausreichend Zeit, so dass die Expression des cDNA-Genproduktes stattfinden kann, und die Anwesenheit des gewünschten cDNA-Expressionsproduktes getestet werden kann, z. B. durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers. Alternativ kann eine cDNA-Expressionsbibliothek in E. coli nach Peptiden gescreent werden, die zumindest ein erfindungsgemäßes Epitop aufweisen unter Verwendung von erfindungsgemäßen Antikörpern (Chang und Gottlieb, J. Neurosci., 8: 2123, 1988). Nachdem die Struktur eines solchen Antigens aufgedeckt wurde, ist das rationelle Design von Bindepartnern und/oder Domänen möglich. Zum Beispiel können Faltungssimulationen und Computer-Redesign von strukturellen Motiven unter Verwendung von geeigneten Computerprogrammen durchgeführt werden (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286–299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675–679). Weiterhin können Computer dafür verwendet werden, konformations- und energetische Analysen von detaillierten Proteinmodellen durchzuführen (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995–1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37–45).

Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Antigen nicht mehr als 50, vorzugsweise nicht mehr als 40 und über dies bevorzugt nicht mehr als 30 aufeinanderfolgende Aminosäuren des TIRC7-Proteins. Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Antigene ungefähr 12 bis 30 von TIRC7 abgeleitete Aminosäuren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst oder besteht das besagte Antigen aus der Aminosäuresequenz von Peptid 6 (DLPDASVNGWSSDE, SEQ ID NO: 9), Peptid 7c (DLPDASVNGWSSDEEKAGGLDDEE, SEQ ID NO: 10) und/oder Peptid 4 (VEFQNKFYSGTGYKLSPFDFAATD, SEQ ID NO: 11). Dies schließt Peptide ein, die modifiziert oder derivatisiert wurden, wie z. B. durch Glykosylierung, Acetylierung, Phosporylierung und dergleichen.

In einem anderen Ausführungsbeispiel bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Polynukleotid, welches zumindest die variable Region einer Immunglobulinkette irgendeines der zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Antikörper kodiert. Eine Form des Immunglobulins stellt die grundlegende strukturelle Einheit eines Antikörpers dar. Diese Form ist ein Tetramer und besteht aus zwei identischen Paaren von Immunglobulinketten, von denen jedes Paar eine leichte und eine schwere Kette aufweist. In jedem Paar sind die variable Region oder Domäne der leichten und schweren Kette zusammen für die Bindung an das Antigen verantwortlich und die Konstantenregionen sind für die Antikörpereffektorfunktionen verantwortlich. Zusätzlich zu Antikörpern können Immunglobuline in einer Vielzahl von Formen existieren (einschließlich weniger als Volllänge, die die gewünschten Aktivitäten beibehalten), inklusive z. B. Fν, Fab und F(ab')2 sowie Einzelketten-Antikörper (Huston, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5879–5883 und Bird, Science 242 (1988), 423–426), siehe ebenfalls supra. Die variable Domäne einer Immunglobulin leichten oder schweren Kette besteht aus einer „framework”-Region, die durch drei hypervariable Regionen, welche auch CDRs genannt werden; siehe supra. Die erfindungsgemäßen Antikörper können durch die Expression von entweder einzeln oder in Kombination mit rekombinanten DNA-Segmenten, die die schwere oder leichte Immunglobulinkette der Antikörpererfindung kodieren, hergestellt werden.

Das erfindungsgemäße Polynukleotid, welches für den zuvor beschriebenen Antikörper kodiert, kann z. B. DNA, cDNA, RNA oder synthetisch produzierte DNA oder RNA oder ein rekombinant hergestelltes chimäres Nukleinsäuremolekül sein, umfassend eines der Polynukleotide, entweder alleine oder in Kombination. Vorzugsweise ist das genannte Polynukleotid ein Teil eines Vektors. Solche Vektoren können weitere Gene umfassen, wie z. B. Markergene, welche eine Selektion des genannten Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen erlauben. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polynukleotid operativ mit Expressionskontrollsequenzen verbunden, die eine Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen erlauben. Die Expression des genannten Polynukleotids umfasst Transkription des Polynukleotids in eine translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente, die eine Expression in eukaryontischen Zellen sicherstellen, vorzugsweise in Säugerzellen, sind dem Fachmann wohl bekannt. Diese umfassen gewöhnlicherweise regulatorische Sequenzen, die die Initiierung der Transkription sicherstellen und optional Poly-A-Signale, die die Termination der Transkription sicherstellen und eine Stabilisierung des Transkriptes sicherstellen. Zusätzliche regulatorische Elemente können transkriptionelle als auch translationale Enhancer und/oder natürlicherweise hiermit verbundene heterologe Promotoren einschließen. In dieser Hinsicht wird der Fachmann ohne Weiteres anerkennen, dass die vorliegende Nukleotide, die zumindest die variable Domäne der leichten und/oder schweren Kette kodieren, die variablen Domänen von beiden Immunglobulinketten oder nur eine kodieren kann. Gleichermaßen können die genannten Polynukleotide unter der Kontrolle des gleichen Promotors sein oder ihre Expression kann unabhängig voneinander kontrolliert werden. Mögliche regulatorische Elemente, die die Expression in prokaryontischen Wirtszellen erlauben, umfassen z. B. die PL, lac-, trp- oder tac-Promotor in E. coli, und Beispiele für regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Wirtszellen erlauben, sind die AOX1- oder GAL1-Promotoren in Hefe oder der CMV-, SV40-, RSV-Promotor (Rous Sarcoma Virus), CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säuger- oder anderen tierischen Zellen. Neben den Elementen, die für die Initiierung der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente ebenfalls transkriptionelle Terminationssignale, wie z. B. die SV40-Poly-A-Stelle oder die TK-Poly-A-Stelle, dem Polynukleotid nachgeschaltet umfassen. Weiterhin können in Abhängigkeit vom verwendeten Expressionssystem Leadersequenzen, welche in der Lage sind, das Polypeptid in ein zelluläres Compartement zu dirigieren oder es ins Medium zu sekretieren, können der erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenz hinzugefügt werden und sind im Stand der Technik wohl bekannt. Die Leadersequenz oder -sequenzen sind in geeigneter Phase mit Translationsinitiierungs- und Terminationssequenzen assembliert und vorzugsweise einer Leadersequenz, welche fähig ist, die Sekretion des translatierten Proteins oder eines Teiles davon in den periplasmischen Raum oder extrazelluläre Medium zu dirigieren. Optional können die heterologen Sequenzen ein Fusionsprotein kodieren, welches ein C- oder N-terminales Identifikationspeptid enthält, welches die gewünschten Charakteristika verleiht, z. B. Stabilisierung oder vereinfachte Aufreinigung des exprimierten, rekombinanten Produktes. In diesem Zusammenhang sind geeignete Expressionsvektoren im Stand der Technik bekannt, wie z. B. Okayama-Berg cDNA Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) oder pSPORT1 (GIBCO BRL). Vorzugsweise werden die Expressionskontrollsequenzen eukaryontische Promotorsysteme in Vektoren sein, geeignet für die Transformation oder Transfektion von eukaryontischen Wirtszellen, jedoch können auch Kontrollsequenzen für prokaryontische Wirtszellen genutzt werden. Sobald der Vektor in den geeigneten Wirt eingebracht wurde, wird der Wirt unter Bedingungen gehalten, der für einen hohen Grad der Expression der Nukleotidsequenzen geeignet sind und nachfolgend kann, wie gewünscht, die Sammlung und Aufreinigung der Immunglobulin leichten Ketten, schweren Ketten, leichten/schweren Kettendimere oder intakten Antikörpern, Bindefragmenten oder anderen Immunglobulinformen erfolgen; siehe Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N. Y., (1979); see zum Beispiel ebenso die angefügten Beispiele.

Wie zuvor beschrieben, kann die erfindungsgemäße Polynukleotidsequenz alleine oder als Teil eines Vektors genutzt werden, um das erfindungsgemäße (Poly)peptid in Zellen zu exprimieren. Für z. B. Gentherapie oder Diagnostik von Krankheiten, die Bezug zu Immunkrankheiten haben. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide oder Vektoren werden in die Zellen eingeführt, welche wiederum den Antikörper produzieren. Gentherapie, die darauf basiert, dass therapeutische Gene in Zellen durch ex-vivo- oder in-vivo-Techniken eingeführt werden, ist eine der wichtigsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren und Methoden für in-vitro- oder in-vivo-Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt; siehe z. B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534–539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911–919; Anderson, Science 256 (1992), 808–813; Isner, Lancet 348 (1996), 714–716; WO 94/29469; WO 97/00957 oder Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635–640, und die darin zitierten Referenzen. Die erfindungsgemäßen Polynukleotide und Vektoren können für eine direkte Einbringung in die Zelle oder für Einbringung via Liposomen oder virale Vektoren (z. B. adenovirale, retrovirale) entworfen werden. Vorzugsweise ist die genannte Zelle eine Keimbahnzelle, embryonische Zelle oder eine Eizelle oder davon abgeleitet, jedoch am meisten bevorzugt ist besagte Zelle eine Stammzelle.

Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Vektoren, besonders Plasmide, Cosmide, Viren und Bakteriophagen, die gewöhnlicherweise in der Gentechnik verwendet werden, die ein Polynukleotid umfassen, welches die variable Domäne einer Immunglobulinkette eines erfindungsgemäßen Antikörpers kodiert; optional in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid, welches die variable Domäne einer anderen Immunglobulinkette eines erfindungsgemäßen Antikörpers kodiert. Vorzugsweise ist der genannte Vektor ein Expressionsvektor und/oder ein Gentransfer- oder Targetingvektor. Expressionsvektoren, die von Viren abgeleitet sind, wie z. B. Retroviren, Vacciniavirus, Adeno-assoziierten Virus, Herpesvirus oder Bovine-Papilloma-Virus können für die Zufuhr des erfindungsgemäßen Polynukleotides oder Vektors in die vorgesehene Zellpopulation genutzt werden. Methoden, die dem Fachmann wohlbekannt sind, können für die Konstruktion der rekombinanten viralen Vektoren genutzt werden; siehe z. B. die Techniken beschrieben in Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y. (1994). Alternativ können die erfindungsgemäßen Polynukleotide und Vektoren in Liposomen für die Zufuhr zu den Zielzellen rekonstituiert werden. Die Vektoren, welche die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten (z. B. die schwere und/oder leichte variable Domäne/Domänen der Immunglobulinketten, welche Sequenzen und Expressionskontrollsequenzen kodieren) können in die Wirtszelle durch wohlbekannte Methoden transferiert werden, welche in Abhängigkeit vom Typ des zellulären Wirts variieren. Zum Beipiel wird Calciumchloridtransfektion allgemein für prokaryontische Zellen benutzt, wohingegen Calciumphosphatbehandlung oder Elektroporation für andere zelluläre Wirte genutzt werden kann; siehe Sambrook, supra.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid oder Vektor transformiert wurden. Die genannte Wirtszelle kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein. Das erfindungsgemäße Polynukleotid oder Vektor, welcher in der Wirtszelle vorhanden ist, kann entweder in das Genom der Wirtszelle integriert sein oder kann extrachromosomal erhalten werden. Die Wirtszelle kann jedwede prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein, wie z. B. bakterielle, Insekten, Pilz, Pflanzen, Tier oder humane Zelle. Bevorzugte Pilzzellen sind z. B. solche des Genus Saccharomyces, im Besonderen solche von der Spezies S. cerevisiae. Der Ausdruck „prokaryontisch” soll alle Bakterien beinhalten, welche mit einem DNA- oder RNA-Molekül für die Expression eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder korrespondierenden Immunglobulinketten transformiert oder transfiziert werden können. Prokaryontische Wirte können Gram negative als auch Gram positive Bakterien, wie z. B. E. coli, S. thyphimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis sein. Der Ausdruck „eukaryontisch” soll Hefe, höhere Pflanzen, Insekten und vorzugsweise Säugerzellen, meist bevorzugt NSO- und CHO-Zellen beinhalten. In Abhängigkeit vom Wirt, der in einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendet wird, können die Antikörper oder Immunglobulinketten, die durch das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kodiert werden, glykosyliert oder unglykosyliert sein. Erfindungsgemäße Antikörper oder die korrespondieren Immunglobulinketten können ebenfalls einen initialen Methioninsäurerest beinhalten. Das erfindungsgemäße Polynukleotid kann dazu genutzt werden, den Wirt zu transformieren oder transfizieren unter Verwendung jedweder Technik, die dem Fachmann allgemein bekannt ist. Weiterhin sind die Methoden zur Bereitstellung von fusionierten, funktionell verbundenen Genen und deren Expression in z. B. Säugerzellen und Bakterien im Stand der Technik wohl bekannt Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Die genetischen Konstrukte und Methoden, die darin beschrieben sind, können für die Expression des erfindungsgemäßen Antikörpers oder korrespondierender Immunglobulinketten in eukaryontischen oder prokaryontischen Wirten genutzt werden. Im Allgemeinen werden Expressionsvektoren genutzt, die Promotorsequenzen enthalten, die in Verbindung mit dem Wirt die effiziente Transkription des inserierten Polynukleotids erleichtern. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, einen Promotor und einen Terminator sowie spezifische Gene, die eine phenotypische Selektion der transformierten Zellen ermöglichen. Geeignete Ursprungszellen für die DNA-Sequenzen und Wirtszellen für die Immunoglobulinexpression und Sekretion können von einer Reihe von Quellen bezogen werden, wie z. B. American Type Culture Collection (”Catalogue of Cell Lines and Hybridomas,” Fifth edition (1985) Rockville, Maryland, U.S.A.), welche hiermit durch Bezugnahme einbezogen ist. Weiterhin können transgene Tiere, vorzugsweise Säuger, die erfindungsgemäße Zellen umfassen, für die Produktion des erfindungsgemäßen Antikörpers in großem Maßstab genutzt werden.

Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung in einem weiteren Ausführungsbeispiel auf eine Methode für die Produktion eines Antikörpers, der fähig ist, die Proliferation von peripheren mononuklearen Zellen des Blutes (PBMCs) zu inhibieren oder ein funktionales Fragment oder Immunglobulinketten davon, umfassend

  • (a) Kultivierung der erfindungsgemäßen Zelle; und
  • (b) Isolierung des genannten Antikörpers oder funktionalen Fragments oder Immunglobulinketten hiervon aus der Kultur.

Die transformierten Wirte können in Fermentern gezogen werden und entsprechend deren Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, kultiviert werden, um optimales Zellwachstum zu erzielen. Einmal exprimiert, können ganze Antikörper ihre dimere, individuelle leichte und schwere Ketten, oder andere immunglobuline Formen der vorliegenden Erfindung nach Standardprozeduren des Standes der Technik aufgereinigt werden, inklusive Ammoniumsulfatprecipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen; siehe Scopes, „Protein Purification”, Springer-Verlag, N. Y. (1982). Der erfindungsgemäße Antikörper oder die entsprechenden Immunoglobulinketten können dann vom Wachstumsmedium, Zelllysaten oder zellulären Membranfraktionen isoliert werden. Die Isolierung und Aufreinigung von z. B. mikrobiell exprimierten erfindungsgemäßen Antikörpern oder Immunoglobulinketten kann durch jedes konventionelle Mittel erfolgen, wie z. B. präparative chromatographische Auftrennung und immonologische Auftrennung, wie solche, die die Verwendung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern einschließen, die z. B. gegen die konstante Region des erfindungsgemäßen Antikörpers gerichtet sind. Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, dass die erfindungsgemäßen Antikörper an andere funktionelle Gruppen gekoppelt werden können für z. B. gezielte Medikamentenplatzierung und bildgebende Verfahren. Solche Kopplungen können chemisch nach der Expression des Antikörpers oder des Antigens chemisch am Ort der Anbringung durchgeführt werden oder das Kupplungsprodukt kann in den erfindungsgemäßen Antikörper oder Antigen auf DNA-Ebene eingebaut werden. Die DNAs werden dann in einem geeigneten Wirtssystem exprimiert und die exprimierten Proteine werden gesammelt und renaturiert, falls notwendig. Im Wesentlichen reine Immunoglobuline von mindestens 90 bis 95% Homogenität sind bevorzugt und eine Homogenität von 98 bis 99% oder mehr ist am meisten für pharmakologische Verwendungen bevorzugt. Einmal aufgereinigt, partiell oder bis zur gewünschten Homogenität, können die Antikörper dann therapeutisch verwendet werden (einschließlich extrakorporal) oder in der Entwicklung und Durchführung von Testprozeduren genutzt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine Methode für die Produktion von Zellen, die in der Lage sind, den erfindungsgemäßen Antikörper oder die entsprechenden Immunoglobulinketten zu exprimieren, umfassend genetisch veränderte Zellen mit dem erfindungsgemäßen Polynukleotid oder Vektor. Die Zellen, die durch die erfindungsgemäße Methode erhalten werden können, können z. B. verwendet werden, die Interaktion des erfindungsgemäßen Antikörpers mit seinem Antigen zu testen.

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf einen Antikörper, eine Immunoglobulinkette davon und einem Bindefragment davon, kodiert durch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid oder erhältlich durch die oben beschriebenen Methoden oder von Zellen produziert mach der oben beschriebene Methode. Die erfindungsgemäßen Antikörper werden typischerweise Anwendung bei der Behandlung vom im Wesentlichen jeder Krankheit finden, die empfänglich für monoklonale antikörperbasierte Therapie ist. Im Besonderen können die Immunoglobuline als immunsuppressive Mittel verwendet werden. Für einen erfindungsgemäßen Antikörper schließen typische Krankheitszustände, die für die Behandlung geeignet sind, entzündliche Symptome ein. Die Antikörper können therapeutisch z. B. in Patienten genutzt werden, die an Krankheiten in Bezug auf die Immunantwort leiden; siehe supra. Eine solche Therapie kann beispielsweise durch die Verabreichung von erfindungsgemäßen Antikörpern, Antigenen oder Epitopen durchgeführt werden. Solch eine Verabreichung kann unmarkierte als auch markierte Antikörper oder Antigene verwenden. Solche Markierungsmittel können entweder direkt oder indirekt an die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antigene gekoppelt werden. Ein Beispiel für eine indirekte Kupplung ist die Verwendung eines Abstandsrestes (spacer). Weiterhin können die Antikörper der vorliegenden Erfindung eine weitere Domäne umfassen, wobei diese Domäne durch kovalente oder nicht kovalente Bindungen verknüpft sein kann. Die Verknüpfung kann auf genetischer Fusion entsprechend den Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, basieren oder kann durch z. B. chemisches cross-linking, wie z. B. in WO 94/04686 beschrieben, durchgeführt werden. Die zusätzlich vorhandene Domäne in dem Fusionsprotein, umfassend den erfindungsgemäßen Antikörper, kann vorzugsweise durch einen flexiblen Linker verknüpft sein, vorteilhafterweise durch einen Polypeptid-Linker, wobei der besagte Polypeptid-Linker eine Mehrzahl von hydrophilen durch Peptidbindung gebundene Aminosäuren von ausreichender Länge umfasst, die Distanz zwischen dem C-terminalen Ende der genannten weiteren Domäne und dem N-terminalen Ende des erfindungsgemäßen Antikörpers zu überbrücken oder umgekehrt. Das oben beschriebene Fusionsprotein kann weiterhin einen spaltbaren Linker oder Spaltstelle für Proteinnasen umfassen. Diese Abstandsreste wiederum können entweder unlöslich oder löslich sein (Diener et al., Science, 231: 148, 1986) und können gewählt werden, die Wirkstofffreisetzung vom Antigen an seiner Zielstelle zu ermöglichen. Beispiele für therapeutische Mittel, die an die erfindungsgemäßen Antikörper, Antigene und Epitope für die Immuntherapie gekoppelt werden können, sind Wirkstoffe, Radioisotope, Lektine und Toxins. Die Wirkstoffe, die an die erfindungsgemäßen Antikörper und Epitope konjugiert werden können, schließen Verbindungen, welche klassischerweise als Wirkstoffe, wie Mitomycin C, Daunorubicin und Vinblastine bezeichnet werden. Bei der Verwendung von radioisotop-markierten erfindungsgemäßen Antikörpern, Antigenen oder Epitopen für z. B. Immuntherapie können bestimmte Isotope Anderen vorzuziehen sein in Abhängigkeit von Faktoren wie Leukozytenverteilung als auch Stabilität und Emission. In Abhängigkeit der Autoimmunantwort können manche Strahler anderen vorzuziehen sein. Generell sind α- und β-Partikel emittierende Radioisotope in der Immuntherapie bevorzugt. Bevorzugt sind α-Strahler mit kurzer Reichweite und hoher Energie sowie 212Bi. Beispiele für Radioisotope, die an die erfindungsgemäßen Antikörper, Antigene oder Epitope für therapeutische Zwecke gebunden werden können, sind 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 212Bi, 212At, 211Pb, 47Sc, 109Pd und 188Re. Andere therapeutische Mittel, die an die erfindungsgemäßen Antikörper, Antigens oder Epitope gekoppelt werden können, sowohl als ex-vivo und in-vivo therapeutische Protokolle, sind bekannt oder sind leicht durch den Fachmann ermittelbar. Wo immer angebracht, kann der Fachmann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, welches eines der oben beschriebenen Antikörper, Antigene oder entsprechenden Vektoren anstelle des proteinhaltigen Materials selbst verwenden. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die die zuvor genannten erfindungsgemäßen Antikörper, Antigene oder Epitope oder chemische Derivate davon oder ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, Vektor oder Zelle umfassen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann weiterhin einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Der Ausdruck „chemisches Derivat” beschreibt ein Molekül, das weitere chemische Reste beinhaltet, die normalerweise nicht Teil des Ausgangsmoleküls sind. Solche Reste können die Löslichkeit, die Halbwertzeit, Absorption, etc. des Ausgangsmoleküls verbessern. Alternativ können die Reste unerwünschte Nebeneffekte des Ausgangsmoleküls abschwächen oder die Toxizität des Ausgangsmoleküls herabsetzen. Beispiele für solche Reste sind in einer Vielzahl von Texten beschrieben, so wie Remington's Pharmaceutical Sciences. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind im Stand der Technik wohl bekannt und beinhalten phosphatgepufferte Salzlösungen, Wasser, Emulsionen, so wie Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Typen von Benetzungsmitteln, sterile Lösungen etc. Zusammensetzungen, die solche Träger umfassen, können durch wohlbekannte konventionelle Methoden formuliert werden. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können einem Subjekt in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung der geeigneten Zusammensetzungen kann auf verschiedenen Wegen bewirkt werden, z. B. durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung. Aerosolformulierungen, wie Nasensprayformulierungen beinhalten aufgereinigte wässrige oder andere Lösungen des aktiven Wirkstoffs mit einem Konservierungsmittel und isotonischen Mitteln. Solche Formulierungen sind vorzugsweise auf einem pH- und isotonischen Status eingestellt, der mit den Nasenschleimhäuten kompatibel ist. Formulierungen für rektale oder vaginale Verabreichungen können als Zäpfchen mit einem geeigneten Träger präsentiert werden.

Das Dosisregime wird durch den behandelnden Arzt und klinische Faktoren bestimmt. Wie in der Medizin wohlbekannt ist, hängen die Dosen für einen beliebigen Patienten von vielen Faktoren ab inklusive der Größe des Patienten, Körperoberfläche, Alter, Art der bestimmten Verbindung, die verabreicht werden soll, Geschlecht, Zeit und Weg der Verabreichung, Gesamtgesundheit und anderen Wirkstoffen, die gleichzeitig verabreicht werden. Eine typische Dosis kann z. B. im Bereich von 0,001 bis 1000 μg betragen (oder von Nuleinsäuren für die Expression oder für die Inhibition von der Expression in diesem Bereich); jedoch sind Dosen unterhalb oder überhalb dieses exemplarischen Bereiches vorgesehen, besonders unter Berücksichtigung der zuvor erwähnten Faktoren. Generell sollte das Regime als reguläre Einnahme der pharmazeutischen Zusammensetzung in einem Bereich von 1 μg bis 10 mg Einheiten pro Tag sein. Wenn das Regime eine kontinuierliche Infusion ist, so sollte es jedenfalls im Bereich von 1 μg bis 10 mg Einheiten pro kg Körpergewicht pro Minute sein. Fortschritt kann durch periodische Beurteilung überwacht werden. Dosierungen werden variieren, aber eine bevorzugte Dosierung für die intravenöse Verabreichung von DNA liegt bei ungefähr 106 bis 1012 Kopien des DNA-Moleküls. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können lokal oder systemisch verabreicht werden. Die Verabreichung wird generell parenteral sein, z. B. intravenös; DNA kann direkt an der Zielstelle verabreicht werden, z. B. durch biolistische Zulieferung an eine interne oder externe Zielstelle oder durch einen Katheder zu einer Stelle in einer Arterie. Präparate für parenterale Verabreichung beinhalten sterile wässrige und nicht wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht wässrige Lösemittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliche Öle sowie Olivenöl, und injizierbare organische Ester sowie Ethyloleat. Wässrige Träger schließen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen inklusive Salzlösung und gepufferten Medien ein. Parenterale Vehikel schließen Natriumchloridlösung, Ringerdextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringerlaktat oder nicht flüchtige Öle ein. Intravenöse Vehikel schließen flüssige und Nahrungsergänzungsmittel, Elektrolytergänzungen (so wie solche, die auf Ringerdextrose basieren) und dergleichen ein. Konservierungsmittel und andere Additive können ebenfalls vorhanden sein, antimikrobielle Mittel, Antioxidanzien, gelatierende Mittel und inerte Gase und dergleichen. Weiterhin kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung weiterer Mittel, wie Interleukine oder Interferone umfassen, in Abhängigkeit von der beabsichtigten Benutzung der pharmazeutischen Zusammensetzung.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zumindest einen zweiten Wirkstoff, vorzugsweise einen Wirkstoff, der die T-Zell-Stimulation inhibiert, in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung. Solche Wirkstoffe beinhalten z. B. Moleküle, die fähig sind, Rezeptor/Liganden-Interaktion zu blockieren oder dergleichen, welches zur T-Zell-Suppression führt. Derartige Wirkstoffe umfassen solche, die die Aktivität von z. B. costimulatorischen Molekülen, wie anti-TIRC7-Antikörpern, anti-TNF-α-Antikörpern, Integrinen, Ig-Superfamilienmoleküle, Selektinen blockieren als auch Medikamente, die die Interaktion von chemokinen und ihren jeweiligen Rezeptor blockieren, Medikamente, die die Interaktion von IL2/IL2-Rezeptor blockieren und andere herkömmliche immunsuppressive Medikamente sowie IL/2R mAK, IL-Toxine und IL-Muteine. Beispiele für kostimulatorische Moleküle und ihre Liganden sind im Stand der Technik beschrieben, z. B. in Schwartz, Cell 71 (1992), 1065–1068. Eine Unterbrechung der Rezeptor/Ligandeninteraktionen durch die Verwendung von mAK oder löslichen CTLA4Ig der Interaktion zwischen CD28 zu B7-2 und CTLA4 zu B7-1 und B7-2 sind in Blazar, J. Immunol. 157 (1996), 3250–3259; Bluestone, Immunity 2 (1995), 555–559; Linsley, Science 257 (1992), 792–95 aufgeführt. Beispiele für die Blockierung von Rezeptor/Ligandeninteraktionen durch die Verwendung von mAK gegen CD40 oder CD40L werden von Burden, Nature 381 (1996), 434–435; Kirk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 8794 berichtet. CD2-Antigen und dessen Ligand LFA-3 wurden in Bagogui Li et al., Übersichtsartikel in Adhesion Melocules, Fusion Proteins, Novel Peptides and Monoclonal Antibodies, Recent Developments in Transplantation Medicine, Vol. II, 1995, Physicians & Scientists Publishing Co., Inc. beschrieben und die Blockierung ihrer Interaktion durch die Verwendung von mAK (anti-Leu-5b, OKT11, T11) ist durch Bromberg, Transplantation 51 (1991) 219–225 oder berichtet worden oder des CD2.IgG1 Fusionsproteins. Die Verwendung von monoklonalen AK gegen CD4-Moleküle ist in Cosimi, Surgery 108 (1990), 406–414 beschrieben. CD47-Blockade durch mAK ist durch Rheinhold beschrieben, wie J. Exp. Med. 185 (1997), 1–11. Integrine und Ig-Superfamilienmoleküle schließen LFA-1 mit seinem Liganden ICAM-1, -2, -3, Mac-1 mit seinem Liganden ICAM-1, -3 ein; ICAM-1 mit seinem Liganden LFA-1, Mac-1, CD43; ICAM-2 mit seinem Liganden LFA-1; ICAM-3 mit seinem Liganden LFA-1, Mac-1; VLA4 und VCAM-1, siehe z. B. David, Adams, Übersichtsartikel in Adhesion Molecules, Fuson Proteins, Novel Peptides, and Monoclonal Antibodies, Recent Developments in Transplantation Medicine, Vol. II, 1995, Physicians & Scientists Publishing Co., Inc.; Isobe, Science, 255 (1992), 1125–1127; Cosimi, J. Immunology 144 (1990), 4604–4612; Hynes, Cell 69 (1992, 11–25.

Weiterhin können mit VLA-4 mAK selektiv interferierende Mittel für die Alpha4-Integrinkette (CD49d) verwendet werden, Beta1-Integrinkette (CD29) oder ein aktivierungsinduziertes Neoepitop von VLA-4 als auch lösliche VLA-4-Liganden, wie lösliches Fibronektin oder dessen relevantes Peptid (GPEILDVPST), oder lösliche VCAM-1 oder dessen relevantes Peptid. Selektivere Blockierungsmittel sind Antisense, Oligonukleotide, welche entworfen wurden, selektiv mit der zytoplastmatischen alpha4, beta1, oder VCAM-1 mRNA zu hybridisieren; Fedoseyeva, J. Immunol. 57 (1994), 606–612. Ein weiteres Beispiel ist der Wirkstoff Pentoxifyllin (PTX), welcher in der Lage ist, die Expression von VCAM-1 zu blockieren; Besler, J. Leukoc. Biol. 40 (1986), 747–754. Weiterhin konnten VCAM-1 mAK, M/K-2, antimaus, z. B. das Allotransplantatüberleben verlängern, Orosz, Transplantation 56 (1993), 453–460. Die Blockierung von Integrin-Familienmitgliedern und ihrer Liganden durch die Verwendung von mAK is in Kupiec-Weglinski beschrieben, Übersichtsartikel in Adhesion Molecules, Fusion Proteins, Novel Peptides, and Monoclonal Antibodies, Recent Developments in Transplantation Medicine, Vol. II, 1995, Physicians & Scientists Publishing Co., Inc. Selectine, z. B. L-Selektin (CD62L), E-Selektin (CD62E), P-Selektin (CD62P) wurden in Forrest and Paulson, Selectin family of adhesion molecules beschrieben. In: Grauger and Schmid-Schonbein, eds. Physiology and Patholphysiology of leukocyte Adhesion. New York, Oxford Press, 1995, pp 68–146. Die Kombination von herkömmlichen immunsuppressiven Medikamenten, z. B. ATG, ALG, OKT3, Azathioprin, Mycophenylat, Mofetyl, Cyclosporin A, FK506, Sirolimus (Rapamun), Kortikosteroide wie in Cosimi beschrieben verwendet werden Transplantation 32 (1981, 535–539; Shield, Transplantation 38 (1984), 695–701, und Graft, Juni 2001, Vol 4 (4). Die Unterbrechung der Interaktion von Chemokinen mit ihrem jeweiligen Rezeptor durch die Verwendung von mAK ist in Luster, Chemokines-chemotactic cytokines that mediate inflammation, New Engl. J. Med. Feb. (1998), 436–445 besprochen. Somit kann jeder Wirkstoff, wie oben definiert und auf den beispielhaft verwiesen wurde, im Einklang mit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung oder den Methoden und Verwendungen, die hier beschrieben wurden, verwendet werden.

Weiterhin kann die pharmazeutische Zusammensetzung als Impfstoff formuliert sein, z. B., wenn die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ein wie oben beschriebenes Antigen umfasst, das in der Lage ist, eine effektive Immunantwort gegen TIRC7 hervorzurufen. Vorteilhafterweise ist die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung bei Organtransplantationen vorgesehen.

Erfindungsgemäße therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen werden einem Individuum in therapeutisch effektiven Mengen verabreicht, ausreichend, Krankheiten zu behandeln oder diagnostizieren, bei denen die Modulation von TIRC7 verbundener Aktivität indiziert ist. Die effektive Menge kann gemäß einer Vielfalt an Faktoren variieren, so wie der Zustand eines Individuums, Gewicht, Geschlecht und Alter. Andere Faktoren schließen die Art der Verabreichung ein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum in einer Reihe von verschiedenen Wegen zur Verfügung gestellt werden, wie z. B. durch intrakoronare, intraperitoneale, subkutane, intravenöse, transdermale, intrasynoviale, intramuskuläre oder orale Wege. Zusätzlich kann die Mitverabreichung oder sequentielle Verabreichung anderer Mittel wünschenswert sein.

Eine therapeutisch effektive Dosis bezieht sich auf die Menge an erfindungsgemäßen Antikörpern, Antigenen, Polynukleotiden und Vektoren, welcher die Symptome oder den Zustand verbessert. Therapeutische Wirksamkeit und Toxizität dieser Verbindungen kann durch standardpharmazeutische Verfahren in Zellkultur oder Versuchstieren bestimmt werden, z. B. ED50 (die Dosis, die in 50% der Population therapeutisch effektiv ist) und LD50 (die Dosis, die für 50% der Population letal ist). Das Dosisverhältnis zwischen therapeutischen und toxischen Effekten ist der therapeutische Index und dieser kann als das Verhältnis von LD50/ED50 ausgedrückt werden.

Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von erfindungsgemäßen Antikörpern und Antigenen für die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Inhibition einer Immunantwort, vorzugsweise für die Behandlung von Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit, Autoimmunkrankheit, allergische Krankheiten, Infektionskrankheiten, Sepsis, für die Behandlung von Tumoren, für die Verbesserung der Wundheilung oder für die Induktion oder Aufrechterhaltung der Immuntoleranz in einem Subjekt; siehe ebenfalls supra. Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf eine Methode zur Modulation der Immunantwort in einem Subjekt, die derer bedarf, umfassend die Verabreichung des erfindungsgemäßen Antikörpers oder Antigens. Zusammensetzungen, die den erfindungsgemäßen Antikörper oder Antigen umfassen, können zu Zellen in Kultur hinzugegeben werden (in vitro) oder zur Behandlung von Patienten verwendet werden, wie z. B. Säuger (in vivo). Wo der Antikörper oder das Antigen benutzt werden, um Patienten zu behandeln, wird das Polypeptid vorzugsweise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert, wie z. B. einem größeren Molekül, um die Polypeptidstabilität zu unterstützen oder ein pharmazeutisch annehmbarer Puffer, der als Träger für die Antikörper dient, welcher mehr als einen Antikörper zu einer einzigen Einheit gekoppelt aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren schließt die Verabreichung an einen Patienten, vorzugsweise einen Säuger und am meisten bevorzugt einen Menschen, die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einer Menge, die effektiv den gewünschten Effekt hervorruft, einschließt. Der Antikörper oder das Antigen können in einer einzelnen Dosis oder in multiplen Dosen verabreicht werden. Sinnvolle Dosen für die aktiven Wirkstoffe können durch Vergleich deren in vitro-Aktivität und der in vivo-Aktivität in einem Tiermodell bestimmt werden. Verfahren für die Extrapolation der Effektivdosen in Mäusen und anderen Tieren bis hin zum Menschen sind im Stand der Technik bekannt. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit für die Modulation (z. B. Aktivierung oder Inhibition) von Immunzellen (z. B. T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, LAK-Zellen oder dendritischen Zellen) Aktivierung, Proliferation und/oder Differenzierung, wie das Kontaktieren einer Immunzelle mit einem Antikörper oder dem Antigen, wie oben beschrieben, einschließt.

Von dem Vorgenannten ist ersichtlich, dass die gegenwärtige Erfindung jede Verwendung eines Liganden bindenden Moleküls, umfassend wenigstens eine CDR des oben beschriebenen Antikörpers, im Besonderen für die Diagnose und/oder Behandlung einer Krankheit mit Bezug auf aberrante Expression oder Fehlfunktion einer T-Zell-Immunantwort cDNA 7 einschließt. Vorzugsweise ist das Liganden-bindende Molekül ein erfindungsgemäßer Antikörper oder eine Immunoglobulinkette davon.

Die biologische Aktivität der hier identifizierten Antikörper legt nahe, dass diese ausreichende Affinität aufweisen, um sie zu potentiellen Kandidaten für die Wirkstofflokalisation auf Zellen zu machen, die die geeigneten Oberflächenstrukturen exprimieren. Dieses Abzielen und Binden an Zellen könnte hilfreich für die Zufuhr von therapeutisch aktiven Wirkstoffen (Abzielung von Wirkmedikamenten, DNA-Sequenzen, RNA-Sequenzen, Lipiden, Proteinen (z. B. humane Wachstumsfaktoren)) und Gentherapie/Genzulieferung sein. Am meisten bevorzugt ist der therapeutisch aktive Wirkstoff ein antiinflammatorischer Wirkstoff. Moleküle/Partikel mit einem Anti-TIRC7-Antikörper können spezifisch an Zellen/Gewebe binden, die TIRC7 exprimieren und können daher diagnostische oder therapeutische Verwendung haben. Folglich kann der erfindungsgemäße Antikörper oder das Antigen markiert werden (z. B. fluoreszent, radioaktiv, Enzym, magnetische Kernresonanz) und verwendet werden, spezifische Ziele in vivo oder in vito zu detektieren, einschließlich „Immunochemie”, wie in vitro Assays. In vivo könnten diese in einer ähnlichen Art zu bildgebenden Verfahren in der Nuklearmedizin verwendet werden, um Gewebe, Zellen oder anderes Material, welches TIRC7 exprimiert, zu detektieren. Ein weiteres Verfahren umfasst die Bereitstellung eines therapeutisch aktiven Wirkstoffes für einen Patienten. Das Verfahren schließt die Verabreichung von wenigstens einem Antikörper oder des Antigens und des therapeutisch aktiven Wirkstoffes an einen Patienten ein. Vorzugsweise wird der therapeutisch aktive Wirkstoff aus Medikamenten, DNA-Sequenzen, RNA-Sequenzen, Proteinen, Lipiden und Kombinationen davon ausgewählt. Mehr bevorzugt ist, dass der therapeutisch aktive Wirkstoff ein antibakterieller Wirkstoff, antiinflammatorischer Wirkstoff oder antineoplastischer Wirkstoff ist.

In einer anderen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine diagnostische Zusammensetzung, umfassend beliebige oben beschriebene erfindungsgemäße Antikörper, Antigene, Polynukleotide, Vektoren oder Zellen und optional geeignete Mittel für die Detektion. Die erfindungsgemäße Antigene und Antikörper sind z. B. für die Verwendung in Immunoassays, bei denen sie in der flüssigen Phase oder gebunden an einen Festphasenträger verwendet werden können, geeignet. Beispiele für Immunoassays, welche das erfindungsgemäße Antigen verwenden, sind kompetitive und nicht kompetitive Immunoassays in entweder einem direkten oder indirekten Format.

Beispiele für solche Immunoassays sind der Radioimmunoassay (RIA), der Sandwich (Immunometric Assay) und der Western-Blot-Assay. Die erfindungsgemäße Antigene und Antikörper können an viele verschiedene Träger gebunden werden und verwendet werden, Zellen zu isolieren, die spezifisch an die genannten Polypeptide gebunden sind. Beispiele für wohlbekannte Träger schließen Glas, Polystyren, Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Dextran, Nylon, Amylosen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetite ein. Die Art der Träger kann entweder löslich oder unlöslich für die erfindungsgemäßen Zwecke sein. Es gibt viele verschiedene Markierungen und Methoden der Markierung, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele für die Typen der Markierung, die in der vorliegenden Erfindung genutzt werden können, schließen Enzyme, Radioisotope, kolloidale Metalle, fluoreszente Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen und biolumineszente Verbindungen ein; siehe auch die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele. Durch eine weitere Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Antikörper ebenfalls in einem Diagnoseverfahren für TIRC7 bezogene Krankheiten in einem Individuum genutzt werden durch Erhalt einer Probe einer Körperflüssigkeit des zu testenden Individuums, welches eine Blutprobe, eine Lymphprobe oder irgendeine andere Körperflüssigkeitsprobe sein kann, und durch Zusammenbringung der Körperflüssigkeitsprobe mit dem erfindungsgemäße Antikörper unter Bedingungen, die eine Bildung von Antikörper-Antigen-Komplexen erlaubt. Der Grad solcher Komplexe wird dann mit Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt, ein Grad signifikant höher als der in einer Kontrollprobe gebildete zeigt die Krankheit in dem getesteten Individuum an. In der gleichen Art und Weise kann das spezifische Antigen, welches durch die erfindungsgemäßen Antikörper gebunden wurde, verwendet werden. Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen in vitro-Immunoassay, umfassend den erfindungsgemäßes Antikörper oder Antigen.

Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Oligonukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz einer beliebigen Sequenz von SEQ ID NOs: 12 bis 40 und ihre Verwendung für die Klonierung eines Anti-TIRC7-Antikörpers; siehe die angehängten Beispiele.

Diese und andere Ausführungsbeispiele sind offenbart und durch die Beschreibung und Beispiele der vorliegenden Erfindung umfasst. Weitere Literatur hinsichtlich eines der Antikörper, Verfahren, Verwendungen und Verbindungen, die im Einklang mit der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, können aus öffentlichen Bibliotheken und Datenbanken unter Verwendung von beispielsweise elektronischen Gerätschaften abgerufen werden.

Zum Beispiel kann die öffentliche Datenbank „Medline” verwendet werden, welche durch das National Center for Biotechnology Information unterhalten wird und/oder durch die National Library of Medicine bei den National Institutes of Health. Weitere Datenbanken und Webadressen, wie z. B. solche für das European Bioinformatics Institute (EBI), welches Teil des Europäischen Labors für Molekularbiologie (EMBL) ist, sind dem Fachmann bekannt und können ebenso unter Verwendung von Internetsuchmaschinen erhalten werden. Ein Überblick über Patentinformationen in der Biotechnologie und ein Überblick über relevante Quellen der Patentinformation, welche nützlich für die retrospektive Suche und für gegenwärtige Kenntnis davon sind, wird in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352–364 gegeben.

Die obige Offenbarung beschreibt im Allgemeinen die vorliegende Erfindung. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele, welche hierin nur für den Zweck der Darstellung gegeben werden, und nicht bestimmt sind, den Schutzbereich der Erfindung zu beschränken.

Die Figuren zeigen:

1: Funktionaler Test in der Gegenwart von TIRC7 Antikörpern; siehe Beispiel 1.

2: Funktionaler Test in der Gegenwart von 15 ausgewählten TIRC7 mAK; siehe Beispiel 1

3: Funktionaler Test in der Gegenwart von drei ausgewählten therapeutischen TIRC7 mAK; siehe Beipiel 1 und Tabelle 1.

4: VH Sequenz von Klon 9 (Metiliximab) (CDRs sind unterstrichen).

5: VL Sequenz von Klon 9 (Metiliximab) (CDRs sind unterstrichen).

6: VH Sequenz von Klon 17-1 (Neliximab) (CDRs sind unterstrichen).

7: VL Sequenzen von Klon 17-1 (Neliximab) (CDRs sind unterstrichen).

8: Affinitätsmessung von monoklonalen Antikörpern: 1. Affinitätsmessung von maus und chimären Antikörpern gegen Vol 6 wurde nach der Methode von Friquet et al 1985 durchgeführt. Hierbei wurde der Antikörper (in nM Konzentration) mit steigenden Konzentrationen an Vol 6 titriert bis ein Gleichgewicht erreicht wurde. Der Anteil an freiem Antikörper ist durch ELISA bestimmt worden. Symbole der Klotz-Blot Darstellung repräsentieren: a = Antigen Konzentration (Peptid 6) in nM, b = gebundener Antikörper. Bivalenz der Antikörper ist durch die Auftragung von B–1/2 gegen 1/a berücksichtigt worden.

9: Funktionaler Test in der Gegenwart von chimärisiertem (bezeichnet humanisiert in 9 wegen ihrer humanen konstanten Region, aber chimärisiert ist gemeint) therapeutischem TIRC7 mAK. Gezeigt ist die funktionale Kapazität der Inhibition des chimärisierten anti-TIRC7 mAK auf die T-Zell Proliferatino (Proliferations-Test) als auch IFN-gamma Zytokin Inhibition (Zytokin ELISA) nach 48 h Aktivierung menschlicher T-Zellen in der Gegenwart eines Mitogens in dosisabhängiger Weise.

Die Beispiele stellen die Erfindung dar.

Beispiel 1: Generierung und Selektion von monoklonalen gegen TIRC7 gerichteter Antikörper

Balb/c Mäuse wurden in Gegenwart von Freunds Adjuvanz mit einem von sechs Peptiden immunisiert, die von Sequenzen mehrerer hypothetischer extrazellulären Domänen von TIRC7 abgeleitet waren. Das „Priming” der Mäuse mit Antigen wurde von mehreren Auffrischgungsinjektionen („booster”) über einen Zeitraum von 3 Monaten gefolgt. Die Fusion von Milzzellen mit SP2/0-Ag14 Myelomzellen wurde nach der PEG-Fusionstechnik durchgeführt. Insgesamt wurden 15 Fusionen durchgeführt und erfolgreich verfolgt. Nach 3 Wochen der Selektion in HAT-Medium, wiederholter Teilung der Zellen dem Grenzwert-Verdünnungs Verfahren und Überprüfung der Überstände unter Verwendung von ELISA wurden 192 stabile antikörperproduzierende Hybridoma erhalten. Die Bestimmung des Antikörper Isotyps offenbarte, dass 140 von 192 monoklonalen Antikörpern IgM Antikörper waren wohingegen 52 IgG Antikörper waren. Alle 52 IgG produzierende Hybridoma wurden aufgetaut, ein weiteres Mal separiert und hinsichtlich ihrer IgG Produktion getestet. Hybridoma, die weniger als 5 μg IgG pro ml Überstand nach Zelltod produzierten, wurden ausgeschlossen.

42 Antikörper wurden in kleinen Volumen von 150–200 ml Überstand produziert und unter Verwendung von Protein A oder Protein G auf HPLC Affinitätschromatographiesäule aufgereinigt. Aufgereinigte Antikörper wurden hinsichtlich ihrer Leistung getestet die Immunantwort auf Mitogene zu inhibieren (1, Proliferations-Assay) als auch ihre Wirkung auf die Zytokinexpression in den Überständen von für 48 h aktivierten menschlichen Zellen (1, IFNγ und hIL2 ELISA).

Radjoaktiver Proliferationsassay – Einbau von 3H-Thymidin:

PBMC von gesunden Spendern wurden gemäß des Ficoll-Paque Dichtegradientenprotokolls isoliert. Proben von 50000 PBMCs/Loch wurden mit PHA (1 μg/ml) stimuliert und für 48 h bei 5% CO2, 37°C in Gegenwart von TIRC7 Antikörpern und IgG-Kontrollantikörpern in einem Gesamtvolumen von 100 μl/Loch inkubiert. Die Proben wurden in Triplikaten in einer 96-Loch Mikrotiterplatte (MTP) durchgeführt. Nach 48 h wurden 0,5 μCi 3H-Thymidin pro Loch hinzugegeben und die Zellen wurden erneut für zusätzliche 18 h inkubiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Zell-Ernters geerntet und lysiert und auf Nitrozellulose-Filter-MTP gesammelt. Die Platten wurden für 4 h bei Raumtemperatur getrocknet. Um das radioaktive Signal, das durch die Probe hervorgebracht wurde zu verstärken, wurde eine Szintillationsflüssigkeit zugegeben und die „counts per minute” (cpm) wurden mit einem Beta-Zähler gemessen.

Quantifizierung von sekretierten Zytokinen in PBMC-Überständen

PBMC von gesunden Spendern wurden gemäß des Ficoll-Paque Dichtegradientenprotokolls isoliert. Proben von 50000 PBMCs/Loch wurden mit PHA (1 μg/ml) stimuliert und für 48 h inkubiert bei 5% CO2, 37°C in Gegenwart von TIRC7 Antikörpern und IgG-Kontrollantikörpern in einem Gesamtvolumen von 100 μl/Loch. Die Proben wurden in Triplikaten in 96-Loch Mikrotiterplatten (MTP) durchgeführt. Nach 48 h wurden die MTP bei 300 × g für 10 min zentrifugiert und die Überstände aus den Löchern abgesammelt. Die Quantifizierung der Zytokine im Überstand wurde auf anti-Zytokin-Antikörper beschichteten Mikrotiterstreifen durchgeführt, die mit dem Cytoscreen® ELISA Kit, Bioscource bereitgestellt wurden. Die zuvor gesammelten Überstände und verdünnten Standards wurden in der Gegenwart von biotinylierten Sekundärantikörpern, die das spezifische Zytokin erkennen, für 1,5–3 h bei Raumtemperatur auf diesen Streifen inkubiert, in Abhängigkeit des bestimmten Zytokins. Nachfolgend wurde überschüssiger Sekundärantikörper durch 3-maliges Waschen mit Waschpuffer entfernt. Ein Streptavidin-Peroxidase Konjugat wurde zugegeben und für 45 min–1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssiges Konjugat wurde durch Waschen entfernt. TMB-Substrat-Lösung wurde zugegeben und die Streifen wurden für weitere 30 min im Dunklen inkubiert gefolgt von der Zugabe von Stop-Lösung. Die Farbentwicklung wurde bei 450 nm gemessen und die Zahlen wurden statistisch analysiert.

Der erste funktionalle Test führte zu 15 Antikörpern, die die Proliferation inhibierten (2, Proliferations-Assay) als auch die Sekretion des IFNγ und IL-2 (2) von PHA-stimulierten humanen PBMC von gesunden Spendern auf unter 30% berechnet in Relation zur Positivkontrolle (100%).

Der nächste Selektionsprozess wurde basierend auf der Produktionsstabilität der Hybridoma, Stabilität des Antikörpers, Immunpräzitpitationsqualitäten und Immunfluoreszenz Farbungen durchgeführt. Schließlich wurden drei Antikörper ausgewählt, #9 und #17, beide entstammten von Fusionen von Milzzellen von Mäusen, die mit dem Peptid immunisiert worden waren, das von der größten extrazellulären Schleife von TIRC7 abgeleitet war, und #18, in diesem Fall war das Peptid vom extrazellulären C-Terminus von TIRC7 abgeleitet (3). Die nachfolgenden Tabellen zeigen die IgG Isotypen und Peptide, die für die Immunisierung der 3 ausgewählten Antikörper genutzt wurden:

AntikörperIsotypPeptid#9IgG1, κPeptid 6#17IgG1, κPeptid 7c#18IgG2b, κPeptid 4
Tabelle 1: Isotypenbestimmung

Diese Antikörper wurden weiter untersucht. Zusätzlich wurde der Antikörper von Klon 9 als Metiliximab bezeichnet und der von Klon 17 als Neliximab.

Beispiel 2: Entwicklung eines chimären Antikörpers1. Identifizierung der VH und VL Regionen der Antikörper Metiliximab und Neliximab

  • 1.1 RNA Isolierung. Als eine RNA Quelle wurden Hybridomazellen verwendet, die die in Beispiel 1 beschriebenen Antikörper exprimieren, Beispiel 1, supra. Die Isolierung wurde mit RNA-Isolationssäulen von Qiagen (Mini) gemäß den Angaben des Herstellers durchegeführt.
  • 1.2 cDNA Synthese. Die cDNA Synthese wurde mit gesamt RNA durchgeführt: 3 μg Gesamt-RNA in einem 17 μl Volumen wurden mit 2 μl cDNA-Primer inkubiert, der in Tabelle 2 genannt ist und für 10 min bei 75°C inkubiert.

Tabelle 2: Primer Sequenzen für die cDNA-Synthese und Amplifikation der variablen Regionen VH und VL aus der Maus.A: Primer für die cDNA Synthese:

– der VH Regionen

– der VL Regionen

B: Primer für die Amplifikation der variablen Regionen aus der Maus– VH Kette:

Rückwärtsprimer:

Vorwärtsprimer:

Eine Mischung bestehnd aus 8 μl Erststrang-Puffer, 4 μl DTT, 4 μl dNTP, 0,5 μl RNAse-Inhibitor und 1 μl DNase wurde zugegeben und weiter für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Enzyme wurden durch Inkubation bei 75°C für 5 min inaktiviert. 1 μl reverse Transkriptase und 1 μl RNAse-Inhibitor wurde zugegeben und die cDNA wurde durch Inkubation bei 42°C für 45 Minuten synthetisiert. Die Hitzeinaktivierung geschah bei 94°C für 5 Minuten.

  • 1.3 PCR-Amplifikation der variablen Regionen. Die Amplifikation wurde mit den Komponenten der CLONTECH Advantage-high-fidelity Polymerase durchgeführt. Die Reaktion fand in einem 50 μl Volumen statt mit 1 μl der cDNA (200 pg), 5 μl Reaktionspuffer, 200 μM eines äquimolaren dNTP Gemisches und 25 pmol des Vorwärtsprimers und 25 pmol des Rückwärtsprimers, die in Tabelle 2 genannt sind. Die Amplifikation wurde mit 36 Zyklen durchgeführt, jeder mit Denaturierung bei 94^C für 15 Sekunden, Annealing bei 55°C bis 65°C für 30 Sekunden und Elongation für 30 Sekunden bei 72°C. Nach dem letzen Amplifikationszyklus wurde eine zusätzliche Elongation von 5 min hinzugefügt.
  • 1.4 Klonierung der PCR-amplifizierten V-Regionen in den prokaryotischen Expressionsvektor pOPE-101 (Genbank #Y14585). PCR Produkte, die mit verschiedenen Annealing-Temperaturen amplifiziert wurden, wurden vereint und die DNA wurde durch die Zugabe von Natriumazetat pH 5,2 (1/10 Volumen), Ethanol (2,5 Volumen) und 1 μl Glycogen (Roche) als Träger präzipitiert. Die DNA wurde auf einem 1% Agarosegel aufgereinigt, ausgeschnitten (Qiagen Gel Aufreinigungskit) und entweder für die VL Regionen NotI/MluI (New England Biolabs) oder NcoI/HindIII (New England Biolabs) für die VH Regionen verdaut. Der Verdau geschah in einem Reaktionsvolumen von 50 μl mit 45 μl aufgereinigter DNA (ungefär 2 μg), 5 μl empfohlenen Puffers und 5 Einheiten des Enzyms für 3 Stunden bei 37°C.
    Die verdaute DNA wurde durch einen Lauf in einem 1% Agarosegel aufgereinigt und aus dem Gel ausgeschnitten gemäß den Anweisungen des Herstellers (Qiagen Gel Aufreinigungskit). Ein 50 ng Teil der verdauten und Gel-aufgereinigten VL Region wurde mit 500 ng des entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Expressionsvektors pOPE101 in einem finalen Volumen von 40 μl mit 1 μl Ligase (Boehringer Mannheim) bei 16°C über Nacht ligiert. Die DNA wurde präzipitiert, in XL 1 blue (Epicurian coli; STRATAGENE) elektroporiert und die Bakterien wurden für eine 1 h in 1 ml SOC Medium gezogen um eine Erholung zu erlauben. Die Bakterien wurden auf SOBGAT Platten (0,1 M Glukose, 100 μg·ml–1 Ampicillin, 12,5 μg·ml–1 Tetrazyklin) plattiert und nach Inkubation über Nacht wurden die Klone abgekratzt und die DNA wurde mit DNA Aufreinigungssäulen aufgereinigt gemäß den Vorgaben des Herstellers (MACHEREY und NAGEL).
    Vektor DNA (enthaltend die VL Kette) wurde mit NcoI/NotI verdaut, aufgereinigt durch einen Lauf in einem 1% Agarosegel und aus dem Gel ausgeschnitten gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen Gelaufreinigungskit).
    Ligation dieser aufgereinigten und verdauten Vektor-DNA mit den oben genanten NcoI/HindIII verdauten VH-Regionen wurde wie beschrieben ausgeführt. Nach der Elektroporation in E. coli wurden unhabhägige Klone gepickt und nach der Expression von funktionellen scFν (single-chains) mit Spezifität gegen Peptid gescreent.
  • 1.5 Screening der transfizierten Bakterien nach positiv Bindenden. Bakterielle Expression wurde IPTG-induziert und lösliche scFν-myc Fusionsproteine wurden aus dem periplasmatischen Kompartiment durch osmotische Lyse der Bakterien gewonnen. Der die scFν-myc Fusionsproteine enthaltende Überstand wurde in 2% Milch PBS blockiert und für 3 h in den Löchern einer ELISA-Platte inkubiert, die zuvor mit 100 ng Peptid/Loch beschichtet wurde. Detektion von Peptid6-gebundenen scFν wurde durch inkubation mit anti-c-myc (Maus) und Meerrettich-Peroxidase konjugierten anti-Maus (Kaninchen). Vektor DNA der positiven Klone wurde zurückgewonnen und die Nukleotidsequenzen der VH und VL regionen wurde bestimmt. Sequenzen der VH und VL Regionen sind in 4 bis 7 abgebildet.

2. Konstruktion der chimären Antikörper

Für die Konstruktion der chimären rekombinanten Antikörper, wurden die VH und VL Regionen entweder in den pConGamma1f-Vektor (für die VH Regionen) oder in den pConKappa-Vektor (für die VL Region) erworben von LONZA Biologics, (Slough, UK) kloniert. Hierdurch wurde vor den variablen Regionen eine IgG-Leadersequenz und eine Kozak-Sequenz für Sekretion in das Medium eingeführt. Die beiden Vektoren (pConGamma1f-Vektor und pConKappa-Vektor) wurden fusioniert um die Transfektion zu erleichtern und um eine balancierte Produktion der leichten und schweren Kette zu erreichen.

  • 2.1 Einführung der eukaryontischen Leadersequenz durch PCR: Komponenten der CLONTECH Advantage-high-fidelity Polymerase sind verwendet worden. Die PCR-Reaktion geschah in einem 50 μl Volumen mit 1 μl (100 ng) des pOPE Vektor enthaltend wentweder die VH oder die VL Region als Template, 5 μl Reaktionspuffer, 200 μM eines äquimolaren Gemisches an dNTP und 25 pmol des Vorwärtsprimers und 25 pmol des Rückwärtsprimers, die in Tabelle 3 genannt sind.

Tabelle 3: Primer für die Einführung der Leadersequenz und Klonierung der V-Regionen:Klonierung der VH Kette in den pConGamma1f Vektor:

5'-Primer:

3'-Primer:

Klonierung der VH-Kette in den pConKappa Vektor:

5' Primer:

3'-Primer

Hilfsprimer für den 5' Primer:

Die Amplifikation wurde mit 36 Zyklen vorgenommen, jeder mit Denaturierung bei 94°C für 15 Sekunden, Annealing bei 65°C für 30 Sekunden und Elongation für 30 Sekunden bei 72°C. Nach dem 10. Zyklus wurden 25 pmol des Primers HindIII-Kozakbeg (siehe Tabelle 3) zur Reaktionsmischung hinzugegeben. Nach dem letzten Amplifikationszyklus wurde eine zusätzliche Elongationsperiode von 5 min hinzugefügt.

  • 2.2 Klonierung in Vektoren, die die IgG-konstante Region enthalten. Das PCR-Produkt wurde durch einen Lauf in einem 1% Agarosegel aufgereinigt, mit HindIII/ApaI verdaut (VH Kette) oder HindIII/BsiWI (VL Kette) und nochmals gelaufgereinigt. 50 ng der verdauten VH und VL Regionen wurden in 200 ng der jeweils entsprechend verdauten pConGamma1f und pConKappa Vektoren ligiert. Die VH Expressionskassette, enthaltend die Promoterregion und das Gen für die gesamte schwere Kette, wurde aus dem pConGamma1f-Vektor durch verdau mit NotI/SalI zurückgewonnen und in den entsprechend verdauten und aufgereinigten pConKappa Vektor ligiert. Der resultierende Doppelgen-Vektor wurde mit PvuI linearisiert, Phenol/Chloroform extrahiert und 1 μg wurde für die Transfektion von entweder 1 × 107 NSO oder CHO Zellen verwendet.

Antikörper wurde isoliert und auf Bindung und biologische Aktivität getestet. Die Bindungs- und funktionalen Charakteristiken der chimären Antikörper im Vergleich zu den Mausantikörpern sind in den 8 und 9 gezeigt und können wie folgt zusammengefasst werden:

ELISA:– Spezifität für das TIRC7 abgeleitete Peptid 6WesternBlot:– gleiches Bandenmuster wie der mAK der MausT-Zell Proliferations-Assay:– Inhibition der Mitogen-induzierten T-Zell ProliferationAffinitätsmessung:– Affinität des chimären Neliximab für Peptid 6: Kd = 1 nM– Affinität des Maus Neliximab für Peptid 6: Kd = 1 nM– Affinität des Maus Metiliximab für Peptid 6: Kd = 0,5 nM– Affinität des des chimären Neliximab für Peptid 6: Kd = 1 nM

Die vollständige Offenbarung aller Patente, Patentdokumente und Publikationen die hier zitiert wurden sind durch Bezugnahme einbezogen. Die vorangehende detaillierte Beschreibung und Beispiele sind nur für die Klarheit und das Verständnis angegeben worden. Es sind hierdurch keine unnötigen Begrenzungen dadurch zu verstehen. Die Erfindung ist nicht auf die exakten Details, welche gezeigt und beschrieben wurden, beschränkt, da für den Fachmann offensichtliche Variationen durch die Ansprüche mit in die Erfindung einbezogen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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