Title:
Mischung aus einem Aktivator und einem Additiv zur Herstellung von phosphitylierten Verbindungen
Kind Code:
U1


Abstract:

Eine Mischung aus einem Aktivator mit der Formel I worin
R = Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroalkyl, Heteroaryl
R1, R2 = entweder Wasserstoff oder bilden zusammen einen 5- oder 6-gliedrigen Ring
X1, X2 = unabhängig entweder N oder CH
Y = H oder Si(R4)3, mit R4 = Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroalkyl, Heteroaryl
B = deprotonierte Säure
und mit einem Additiv mit der Formel VIII in der R1, R2, X1, X2 wie für Formel I definiert sind oder Pyridin
in einem molaren Verhältnis von 1:1 zu 1:10 (mol:mol).




Application Number:
DE202005021488
Publication Date:
05/08/2008
Filing Date:
12/15/2005
Assignee:
Girindus AG (Bergisch Gladbach, 51427, DE)



Attorney, Agent or Firm:
Hinkelmann & Huebner (München, 80803)
Claims:
1. Eine Mischung aus einem Aktivator mit der Formel I worin
R = Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroalkyl, Heteroaryl
R1, R2 = entweder Wasserstoff oder bilden zusammen einen 5- oder 6-gliedrigen Ring
X1, X2 = unabhängig entweder N oder CH
Y = H oder Si(R4)3, mit R4 = Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroalkyl, Heteroaryl
B = deprotonierte Säure
und mit einem Additiv mit der Formel VIII in der R1, R2, X1, X2 wie für Formel I definiert sind oder Pyridin
in einem molaren Verhältnis von 1:1 zu 1:10 (mol:mol).

2. Mischung nach Anspruch 1, worin der Aktivator eine Formel hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus worin
Y wie in Anspruch 1 definiert ist
R Methyl, Phenyl oder Benzyl ist.

3. Mischung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein phosphitylierendes Mittel enthält.

4. Mischung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das phosphitylierende Mittel ein Phosphoramidit mit der folgenden Struktur ist: in der Z eine Abgangsgruppe bedeutet, R3 ein C1-C6-Alkyl oder ein Heterocycloalkyl- oder Heterocycloalkenyl-Ring ist, der von 4 bis 7 Atome und bis zu 3 aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff ausgewählte Heteroatome enthält, und „Verbindung" der Rest einer Hydroxy enthaltenden Verbindung ist.

5. Mischung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung zusätzlich ein Keton der Formel Rx-C(=O)-Ry ist, worin Rx und Ry unabhängig C1-C6-Alkyl sind oder miteinander ein Cycloalkyl bilden, enthält.

6. Mischung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Keton Aceton ist.

Description:
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Mischung aus einem Aktivator und einem Additiv zur Herstellung von phosphitylierten Verbindungen unter Verwendung von spezifischen Aktivatoren, insbesondere zur Synthese von Phosphoramiditen.

Hintergrund der Erfindung

Oligonukleotide sind Schlüsselverbindungen in der Biowissenschaft, die auf verschiedenen Gebieten wichtige Rollen haben. Sie werden z.B. als Sonden auf dem Gebiet der Genexpressions-Analyse, als Primer in der PCR oder für die DNA-Sequenzierung verwendet.

Darüberhinaus gibt es auch eine Vielzahl von potentiellen therapeutischen Anwendungen einschließlich z. B. Antisense-Oligonukleotiden.

Eine Vielzahl von chemischen Modifikationen wurde in Oligonukleotiden eingeführt, um deren Nützlichkeit für die Diagnose, als Forschungsagenzien und als therapeutische Mittel zu erhöhen, beispielsweise zur Stabilisierung gegen Nukleasen.

Die Synthese von Oligonukleotiden kann erzielt werden unter Verwendung von sowohl Lösungsphasen- als auch Festphasen-Methoden. Die gegenwärtig bevorzugte Methode ist die Festphasen-Synthese, bei der ein Oligonukleotid auf einem festen Träger hergestellt wird und das Oligonukleotid durch die sequentielle Addition von Nukleotiden wächst.

Die wachsende Anzahl von Anwendungen erfordert größere Mengen an Oligonukleotiden; daher gibt es ein anhaltendes Bedürfnis für die Entwicklung von verbesserten synthetischen Methoden.

Für eine allgemeine Übersicht siehe z.B. „Antisense – From Technology to Therapy" Blackwell Science (Oxford, 1997).

Ein prominenter Typ von Bildungsblöcken bei der Synthese von Oligonukleotiden sind Phosphoramidite; vgl. z.B. S.L. Beaucage, M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 1859 (1981) 22. Diese Phosphoramidite von Nukleosiden, Desoxyribonukleosiden und Derivaten von beiden sind kommerziell erhältlich. Bei der normalen Festphasen-Synthese werden 3'-O-phosphoramidites verwendet, aber bei anderen synthetischen Prozeduren werden auch 5'-O- und 2'-O-Phosphoramidite verwendet. Ein Schritt bei der Herstellung von diesen Nukleosid-Phosphoramiditen ist das Phosphitylieren der (geschützten) Nukleoside. Es ist meistens üblich, die im Nukleosid anwesende Hydroxylgruppe und Aminogruppen und andere funktionelle Gruppen vor dem Phosphitylieren der verbleibenden 3'-, 5'- oder 2'-O-Hydroxylgruppen zu schützen. Mehrere Routen sind für die Herstellung der monomeren (Nukleoside) und polymeren (Nukleotide oder Oligonukleotide) Phosphoramidite bekannt. Die bekannten Methoden resultieren sehr häufig in Problemen der Chemie oder Sicherheit. Für die Verwendung dieser Chemie für größere „Eintopf" („batch")-Synthesen (100 kg-1000 kg) muss die Kosteneffizienz erhöht werden.

Traditionell wird die Phosphitylierung von Nukleosiden durchgeführt durch Behandlung der geschützten Nukleoside mit einem phosphitylierenden Reagenz wie z.B. Chlor-(2-cyanoethoxy)-N,N-diisopropylaminophosphin, das sehr reaktiv ist und keinen Aktivator benötigt, oder 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (Bis-phos- oder Bis-amidit-Reagenz), das einen Aktivator benötigt.

Der herkömmlich am häufigsten bei der Phosphitylierungsreaktion verwendete Aktivator ist 1H-Tetrazol.

Es gibt inhärente Probleme bei der Verwendung von 1H-Tetrazol, insbesondere wenn eine Synthese in größerem Maßstab durchgeführt wird. Beispielsweise ist bekannt, dass 1H-Tetrazol explosiv und toxisch ist. Entsprechend dem Materialsicherheitsdatenblatt („material safety data sheet", MSDS) kann 1H-Tetrazol (1-H-Tetrazol, 98%) bei Einatmung, Einnahme oder Absorption durch die Haut hindurch gesundheitsschädlich sein.

Außerdem ist 1H-Tetrazol teuer. Selbst bei einer Synthese in großem Maßstab hat es eine beträchtliche Einwirkung auf die Herstellungskosten der Oligonukleotide.

Das MSDS stellt auch fest, dass 1H-Tetrazol explodieren kann, wenn es über seinen Schmelzpunkt von 155°C hinaus erhitzt wird und kann sehr empfindliche explosive metallische Verbindungen bilden. Im Falle der Synthese in großem Maßstab in einem Kessel würde 1H-Tetrazol eine wesentliche Gefahr für den Menschen und seine Umgebung darstellen.

Zusätzlich ist bekannt, dass 1H-Tetrazol während seiner Lagerung, Verwendung und Beseitigung eine besondere Handhabung erfordert.

1-H-Tetrazol und die verwandten Derivate, z.B. 5-Ethylthio-1H-tetrazol, 5-Benzylthio-1H-tetrazol haben auch das Potential für eine Zersetzung des Zielmoleküls. Daher wurde in verschiedenen Publikationen über die Spaltung der säureempfindlichen Schutzgruppe berichtet (Krotz et al, Tetrahedron Letters, 1997, 38, 3875).

Unabsichtliche Deprotektionen [Entschützungen] der säureempfindlichen Schutzgruppe sind auch bei der Verwendung von Chlor-(2-Cyanoethoxy)-N,N-diisopropylaminophosphin bekannt. Neben der Tendenz zur Spaltung der verwendeten Schutzgruppen wird dieses Phosphitylierungsreagenz in größeren Mengen des 3'-3'-Isomeren resultieren. Die resultierenden Amidite müssen durch einen zeit- und kostenaufwendigen Chromatographie-Schritt gereinigt werden.

Insbesondere bei der Verwendung für die Phosphitylierung von oligomeren Phosphoramiditen resultierten die bekannten Methoden zumeist in Zersetzung oder komplexen Mischungen des Zielmoleküls und von Nebenprodukten.

Die Verwendung von bis-Phos mit bestimmten Aktivatoren ist im Allgemeinen für monomere Nukleosidamidite bekannt, aber im Falle von Oligonukleotiden machte die geringe Reaktivität diese Näherung sehr kompliziert.

Die niedrige Reaktivität resultierte auch in einer langen Reaktionsdauer (2-6 Stunden). Die Vermeidung der langen Reaktionszeit wird die Verwendung eines großen Überschusses an Phosphitylierungsmittel und Aktivator erfordern. Am Ende wird diese Art der Reaktionsführung auch zusätzliche Reinigungsschritte erfordern.

EP 0 906 917 A2 und Hayakawa et al., J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 12395-12401 offenbaren die Verwendung von Imidazoliumtriflat zur Synthese von Phosphoramiditen. Ausbeute und Reinheit der beschriebenen Synthese konnten nicht wiederholt werden.

Außerdem wird die Anwendung des Verfahrens von Hayakawa mit der Verwendung eines Aktivators einhergehen, der getrennt hergestellt, isoliert und gereinigt wurde. Nach der Reinigung des wasserempfindlichen Aktivators ist es notwendig, diesen Aktivator unter vollständig trockenen Bedingungen aufzubewahren.

Die Empfindlichkeit und die niedrige Reaktivität dieses Aktivators werden in einer komplizierten Handhabung resultieren, welche für die Synthese von Amiditen in großem Maßstab schwierig ist.

In allen Experimenten mit diesem Aktivator von Hayakawa müssen die resultierenden Amidite in einem kostenintensiven Chromatographie-Schritt gereinigt werden.

Jedoch war in allen Fällen das Ergebnis der Phosphitylierungsreaktion unvollständig und ineffizient, und daher ist ein Reinigungsschritt immer ein wesentliches Erfordernis.

Die Phosphitylierung von empfindlichen Oligonukleotiden endete zumeist in einer Zersetzung.

Die Ausbeuten und Reinheit der beschriebenen Synthese konnten nicht wiederholt werden, weil die verwendeten Imidazoliumtriflate einen hohen nukleophilen Charakter und eine hohe hygroskopische Tendenz haben. Diese Eigenschaften werden im Endergebnis zu wesentlichen Mengen an Zersetzung und Hydrolyse führen. Die beschriebenen Aktivatoren wurden in ihrer reinen Form isoliert und verwendet.

Diese Methode für die Synthese von Amiditen erfordert eine Flash-Chromatographie zur Reinigung der Zielverbindung.

Zusätzlich verwendete Hayakawa die Verbindung zur Bildung der Internukleotid-Bindung (Kondensation des Amidits mit einem Nukleosid).

Hayakawa et al., J. Org. Chem. 61 (1996) 7996-7997 offenbaren die Verwendung von Benzimidazoliumtriflat zur Kondensation eines Phosphoramidits mit einem Nukleosid.

Hayakawa et al., J. Am. Chem. Soc. 123 (2001) 8165-8176 offenbaren die Verwendung von Säure/Azol-Komplexen zur Kondensation eines Phosphoramidits mit einem Nukleosid.

Arnold et al., Collect. Czech. Chem. Commun. 54 (1989) 523-532 offenbaren eine automatisierte Chloridit- und Amidit-Synthese von Oligodesoxyribonukleotiden und unter anderem die Verwendung von 1-Methylimidazol bei der Kondensation eines Phosphoramidits mit einem Nukleosid.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Mischung aus einem Aktivator und einem Additiv zur Herstellung von phosphitylierten Verbindungen bereitzustellen, die zumindest einige der Nachteile des Standes der Technik überwindet.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, einen Aktivator bereitzustellen, der im Vergleich zu Aktivatoren aus dem Stand der Technik verbesserte Eigenschaften aufweist.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Aktivator/Additiv-Mischung bereitzustellen, die im Vergleich zu Aktivatoren aus dem Stand der Technik verbesserte Eigenschaften aufweist. In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Methode zur Herstellung einer phosphitylierten Verbindung zur Verfügung, welche den Schritt beinhaltet:

  • – Umsetzen einer Hydroxyl enthaltenden Verbindung mit einem phosphitylierenden Mittel in der Gegenwart eines Aktivators mit der Formel I worin
    R = Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroalkyl, Heteroaryl
    R1, R2 = entweder Wasserstoff oder bilden zusammen einen 5- oder 6-gliedrigen Ring
    X1, X2 = unabhängig entweder N oder CH
    Y = H oder Si(R4)3, mit R4 = Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroalkyl, Heteroaryl
    B = deprotonierte Säure.

Der Aktivator kann in stöchiometrischer oder katalytischer Menge (3 bis 50 Mol%, vorzugsweise 10 bis 30 Mol%) oder im Überschuss (bis zu 300 Mol%) verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Aktivator eine Formel, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus worin
Y wie oben definiert ist
R Methyl, Phenyl oder Benzyl ist.

Die Herstellung dieser Aktivatoren ist beispielsweise in Hayakawa et al, J. Am. Chem. Soc. 123 (2001) 8165-8176 beschrieben.

In einer Ausführungsform wird der Aktivator in Kombination mit einem Additiv verwendet. Additive können unter der deprotonierten Form der Verbindungen mit der Formel I und anderen heterocyclischen Basen wie z.B. Pyridin ausgewählt werden. Geeignete Verhältnisse zwischen dem Aktivator und dem Additiv sind 1:1 bis 1:10.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Aktivator gemäß eines „in situ"-Verfahrens hergestellt werden. In diesem Fall wird der Aktivator nicht isoliert, was zu verbesserten Ergebnissen der Reaktion führte. Die Hydrolyse oder Zersetzung des Zielmoleküls wird unterdrückt.

Für eine hohe Ausbeute bei der Phosphitylierung in 3'- und/oder 5'-Position von Oligonukleotiden (Di-, Tri-, Tetra-, Penta-, Hexa-, Hepta- und Oktamere) ist die „in situ"-Herstellung des Aktivators und die Kombination mit einem Additiv bevorzugt.

Wie oben beschrieben, ist die Phosphitylierung besonders nützlich für die Synthese von Oligonukleotiden und die Baustein-Phosphoramidite. Daher umfasst die Hydroxyl enthaltende Verbindung in einer bevorzugten Ausführungsform einen Zuckerteil, z.B. ein Nukleosid oder ein daraus abgeleitetes Oligomer. Derartige Nukleoside sind z.B. Adenosin, Cytosin, Guanosin und Uracil, Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin, Desoxycytosin und Derivate hiervon, die optional Schutzgruppen umfassen.

Die Methode der vorliegenden Erfindung ist besonders nützlich für die Phosphitylierung von Oligonukleotiden (Di-, Tri-, Tetra-, Penta-, Hexa-, Hepta- und Oktamere). Derartige phosphitylierte Oligonukleotide werden z.B. für die Synthese von großen Oligonukleotiden durch ein Fragment-Kondensations-Konzept verwendet.

Normalerweise werden sie an deren heterocyclischer Funktionalität und an ihren Hydroxyl enthaltenden Gruppen geschützt, außer an derjenigen, die phosphityliert werden soll. Typischerweise werden als Schutzgruppen für die 5'-OH-Gruppe Dimethoxytrityl, Monomethoxytrityl oder Silyl enthaltende Schutzgruppen (z.B. TBDMS) verwendet, wodurch die Phosphitylierung der 3'-OH-Gruppe ermöglicht wird.

Die 3'-OH-Gruppe kann ebenfalls mit einer Schutzgruppe (LEV, TBDMS usw.) geschützt werden und das entschützte 5'-OH wird die 5'-O-Phosphitylierung von Nukleosiden oder Nukleotiden ermöglichen.

Die Methoden der Phosphitylierung können mit identischen Ergebnissen für die Synthese von 3'- oder 5'-Phosphoramiditen verwendet werden.

Das resultierende Zielmolekül der Phosphitylierungsreaktion ist in einer Ausführungsform ein Phosphoramidit und hat die Struktur: Z stellt eine Abgangsgruppe z.B. CH3, C2H5, CH2C6H5, -CH2CH2CN, -CH2CH=CHCH2CN, para-CH2C6H4CH2CN, -(CH2)2-5N(H)COCF3, -CH2CH2Si(C6H5)2CH3 oder -CH2CH2N(CH3)COCF3 dar und worin R3 Alkyl mit 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen ist; oder R3 ist ein Heterocycloalkyl oder Heterocycloalkenyl-Ring, der von 4 bis 7 Atome enthält, und bis zu 3 Heteroatome hat, die unter Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff ausgewählt sind, und „Verbindung" ist der Rest der Hydroxy enthaltenden Verbindung, d.h. ein Nukleosid, Nukleotid oder ein Oligonukleotid.

In diesem Fall ist das P(III)-Atom mit zwei Sauerstoffatomen (oder bildet zwei P-O-Bindungen) und einem Stickstoffatom, das zu einer Aminogruppe gehört, vorzugsweise Diisopropylamin, Diethylamin oder andere sekundäre Amine, verbunden.

Die Kondensationsreaktion des Phosphoramidits mit einer anderen Hydroxylgruppe eines anderen Moleküls (Verbindung A) wird in einem Phosphittriester mit der folgenden Struktur resultieren:

In diesem Fall hat das P(III)-Atom Bindungen zu drei Sauerstoffatomen (drei P-O-Bindungen bildend) und keine Bindung mit dem Stickstoff.

Im Allgemeinen kann das Phosphitylierungsmittel das gleiche sein wie bei den Phosphitylierungsreaktionen unter Verwendung von 1H-Tetrazol.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat es die Formel in der Z eine Abgangsgruppe wie z.B. CH3, C2H5, CH2C6H5, -CH2CH2CN, -CH2CH=CHCH2CN, para-CH2C6H4CH2CN, -(CH2)2-5N(H)COCF3, -CH2CH2Si(C6H5)2CH3 oder -CH2CH2N(CH3)COCF3 darstellt und R1 und R2 sind unabhängig sekundäre Aminogruppen N(R3)2, worin R3 ein Alkyl mit von 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen ist; oder R3 ist ein Heterocycloalkyl- oder Heterocycloalkenylring, der von 4 bis 7 Atome enthält, und bis zu 3 Heteroatome hat, die unter Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff ausgewählt sind.

Ein typisches phosphitylierendes Mittel ist 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphordiamidit.

Andere bevorzugte phosphitylierende Reagentien sind Oxazaphospholidin-Derivate wie sie beschrieben sind in N. Ok et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307 bis 8317, das hierin durch Bezugnahme enthalten ist. Dieses phosphitylierende Mittel ermöglicht die Synthese von Oligonukleotiden, worin die Internukleotid-Bindung auf eine stereoselektive Weise zu Phosphothioaten umgewandelt werden kann. Derartige diastereoselektiv hergestellte internukleoditische Phosphothioat-Verknüpfungen haben eine viel versprechende Auswirkung auf die Verwendung von Phosphothioaten als Antisense-Arzneimittel.

Geeignete Beispiele für deprotonierte Säuren B- sind Triflat, Trifluoracetat, Dichloracetat, Mesyl, Tosyl, o-Chlorphenolat. Säuren mit einem pKa unterhalb von 4,5 sind bevorzugt. Vorzugsweise haben sie eine geringe Nukleophilie.

In einer Ausführungsform wird die Reaktion in Gegenwart von Molekülsieben oder anderen Wasser bindenden Reagentien durchgeführt. Im Allgemeinen sollte Wasser während der Reaktion ausgeschlossen oder durch ein ausgewähltes Trockenmedium fixiert sein.

Es ist entweder möglich, den Aktivator der vorliegenden Erfindung mit dem phosphitylierenden Mittel zu kombinieren und die Hydroxyl-Komponente später hinzuzufügen. Es ist auch möglich, den Aktivator mit der Hydroxyl enthaltenden Verbindung zu kombinieren und das phosphitylierende Mittel anschließend hinzuzufügen.

Im Falle der Verwendung eines Additivs wird der Aktivator mit der Hydroxy-Komponente gemischt, bevor das phosphitylierende Mittel hinzu gegeben wird.

Für die „in situ"-Erzeugung des Aktivators wird die ausgewählte Säure vorzugsweise nach der Zugabe des Additivs bei einer kontrollierten Reaktionstemperatur hinzu gegeben.

Das phosphitylierende Mittel kann vor oder nach der Zugabe der ausgewählten Säure hinzugefügt werden.

In Bezug auf die Zugabe von Säure und phosphitylierendem Mittel kann die Nukleosid-Komponente am Ende oder zu Beginn zugefügt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die entsprechende Base des Aktivators, die Hydroxyl enthaltende Verbindung und das phosphitylierende Mittel vereinigt und die Säure wird hinzugefügt, um die Reaktion zu starten.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung eines Aktivators mit der Formel I worin
R = Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroalkyl, Heteroaryl
R1, R2 = entweder Wasserstoff oder bilden zusammen einen 5- oder 6-gliedrigen Ring
X1, X2 = unabhängig entweder N oder CH
Y = H oder Si(R4)3, mit R4 = Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroalkyl, Heteroaryl
B = deprotonierte Säure
als einem Aktivator zur Phosphitylierung von Hydroxyl enthaltenden Verbindungen mit einem phosphitylierenden Mittel.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Kombination des Aktivators und einer nicht protonierten Base (Additiv), welche ein Gleichgewicht zwischen beiden Spezies bilden wird. Das resultierende Gleichgewicht zeigt im Vergleich zu Aktivatoren aus dem Stand der Technik verbesserte Eigenschaften.

Insbesondere in Verbindung mit der Verwendung von Aceton wird der Aktivator/Katalysator nicht die bekannten Nebenreaktionen (Zersetzung oder Bildung des 3'-3'- oder 5'-5'-Homologen) zeigen. Aceton hat auch die Fähigkeit, Edukte und Reagentien aufzulösen.

Gemäß dem Stand der Technik führt im Falle von längeren Reaktionszeiten die Freisetzung von Diisopropylamin und die Gegenwart von aktiviertem Bis-Phos zu einer Zersetzung der Zielverbindung (Detritylierung, CE-Spaltung, Depurinisierung oder Spaltung von anderen Schutzgruppen). Die Gegenwart von Aceton und die spezifische Formulierung des Aktivators reduziert diese Tendenzen.

Die Gegenwart von Aceton dämpft die Aktivität jeglicher Menge an Diisopropylamin (DIPA), das während der Phosphitylierungsreaktion freigesetzt wird. Dies kann mit ähnlichen Resultaten (keine Zersetzung) für die Phosphitylierung von kürzeren und längeren Oligonukleotiden herangezogen werden. Andere Ketonverbindungen mit der Formel Rx-C(=O)-Ry, worin Rx und Ry unabhängig C1-C6-Alkyl sind oder zusammen ein Cycloalkyl bilden, können ebenso benutzt werden, solange sie in der Lage sind, Enolate in der Gegenwart von z.B. Aminen bilden und eine CH2-Gruppe in der α-Stellung haben.

Zusätzlich erlaubt die Verwendung von Aceton eine längere Reaktionszeit, ohne das die 5'-O-Schutzgruppe gespalten wird. In beiden Fällen wird die Verwendung von Aceton die verschiedenen Schutzgruppen schützen und die bekannte Tendenz zur Depurinisierung vermeiden.

Aceton hat auch ein besseres Toxizitätsprofil und verbesserte Umwelteigenschaften verglichen mit z.B. Acetonitril und ist nicht teuer.

Eine weitere Aufgabe ist daher die Verwendung von Aceton als einem Reaktionsmedium oder Co-Lösungsmittel bei der Synthese von Phosphoramiditen.

Die Kombination des Aktivators mit einer bestimmten Menge an Additiven unterstützt eine höhere Effizienz des Phosphitylierungsverfahrens von längeren und empfindlichen Oligonukleotiden (3' oder 5' entschützt).

Typischerweise nimmt die Reaktivität des Reagenz zu, um die Synthese nach 2-5 Minuten zu beenden.

Indem die hierin beschriebenen Methoden verwendet werden, erübrigt sich ein weiterer Reinigungsschritt.

Die resultierenden Monomer- und Oligomeramidite können für die Synthese von Oligonukleotiden in Festphase und in Lösungsphase verwendet werden.

Der Aktivator oder die Aktivator/Additiv-Kombination ist besonders nützlich bei der Synthese von Adenosinphosphoramidit, Cytosinphosphoramidit, Guanosinphosphoramidit und Uracilphosphoramidit, Desoxyadenosinphosphoramidit, Desoxyguanosinphosphoramidit, Desoxythymidinphosphoramidit, Desoxycytosinphosphoramidit wie auch Oligonukleotidphosphoramiditen mit der Formel Xn, worin jedes X ausgewählt ist unter A, dA, C, dC, G, dG, U, dT und n = 2 bis 30, vorzugsweise 2 bis 12, mehr bevorzugt 2 bis 8 oder 2 bis 6 und Derivate hiervon, die Schutzgruppen umfassen.

Wie es hierin verwendet wird, umfassen Oligonukleotide auch Oligonukleoside, Oligonukleotidanaloga, modifizierte Oligonukleotide, Nukleotidmimetika („nucleotide mimetics") und ähnliche in der Form von RNA und DNA. Im Allgemeinen umfassen diese Verbindungen ein Rückgrat von verbundenen monomeren Untereinheiten, in denen jede verbundene monomere Untereinheit direkt oder indirekt mit einer heterocyclischen Baseneinheit verbunden ist. Die Verknüpfungen, welche die monomeren Untereinheiten, die monomeren Untereinheiten und die heterocyclischen Baseneinheiten verbinden, können von variabler Struktur sein, so dass es eine Vielzahl von Motiven für die resultierenden Verbindungen gibt.

Im Stand der Technik bekannte Modifizierungen sind die Modifizierung der heterocyclischen Basen, der Zucker oder der Verknüpfungen, welche die monomeren Untereinheiten verbinden. Variationen von Internukleotid-Verknüpfungen sind z.B. in der WO 2004/011474, beginnend auf Seite 11 unten, beschrieben, die hierin durch Inbezugnahme enthalten sein soll.

Typische Derivate sind Phosphorthioate, Phosphordithioate, Methyl- und Alkylphosphonate und Phosphonacetoderivate.

Weitere typische Modifikationen sind beim Zuckerteil. Entweder ist die Ribose durch einen unterschiedlichen Zucker ersetzt oder ein oder mehrere der Positionen sind mit anderen Gruppen wie z.B. F, O-alkyl, S-Alkyl, N-Alkyl substituiert. Bevorzugte Ausführungsformen sind 2'-Methyl und 2'-Methoxyethoxy. Alle diese Modifikationen sind im Stand der Technik bekannt.

In Hinblick auf den Teil der heterocyclischen Base gibt es eine Vielzahl von anderen synthetischen Basen, die im Stand der Technik benutzt werden, wie z.B. 5-Methylcytosin, 5-Hydroxymethylcytosin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6- oder 2-Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Thiouracyl. Solche Modifikationen sind auch in der WO 2004/011474, beginnend auf Seite 21, offenbart.

Wenn sie bei der Synthese verwendet werden, haben diese Basen normalerweise Schutzgruppen, z.B. N-6-Benzyladenin, N-4-Benzylcytosin oder N-2-Isobutyrylguanin. Im Allgemeinen müssen alle reaktiven Gruppen, die nicht in einer weiteren Reaktion reagieren sollen, geschützt werden, insbesondere die Hydroxylgruppen des Zuckers.

In Ausführungsformen bezogen auf die Synthese von Oligonukleotidphosphoramidit ist es nützlich, die Reaktion in der Gegenwart von Aceton oder anderen Ketonen durchzuführen, wie z.B. Aceton, Butanon, Pentanon, Hexanon, Cyclohexanon, die entweder als solche als Reaktionsmedium benutzt werden können oder als ein Co-Lösungsmittel für andere Lösungsmittel.

Die Erfindung wird weiter anhand der folgenden nicht einschränkenden Beispiele erklärt.

Beispiel 1Synthese von 5'-O-DMTr-T-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung von Methylimidazoliumtrifluoracetat

5,0 g 5'-O-DMTr-T-3'-OH (9,2 mmol, 1,0 Äquivalente) und 2,34 g Methylimidazoliumtrifluoracetat (11,9 mmol, 1,3 Äquivalente) werden in 100 ml Dichlormethan aufgelöst und 3 g Molekularsieb 3Å werden hinzugefügt und die Mischung für 10 Minuten gerührt. 3,8 ml 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphordiamidit (11,9 mmol, 1,3 Äquivalente) werden hinzugefügt. Die Reaktion ist nach 2 Stunden vollständig. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 95%

Beispiel 2Synthese von 5'-O-DMTr-dGiBu-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung von Benzylimidazoliumtrifluoracetat

322 mg Methylimidazoliumtrifluoracetat (1,64 mmol, 1,05 Äquivalente) und 1,0 g 5'-O-DMTr-dGiBu-3'-OH (1,56 mmol, 1,0 Äquivalente) werden in 10 ml Dichlormethan aufgelöst und 500 mg Molekularsieb 3Å werden hinzugefügt. 30 Minuten später werden 0,52 ml 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphordiamidit (1,64 mmol, 1,05 Äquivalente) und 0,1 ml Aceton zu der gerührten Lösung hinzugefügt. Die Reaktion ist nach 30 Minuten vollständig. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 74%

Beispiel 3Synthese von 5'-O-DMTr-dCBz-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung von Methylimidazoliniumtrifluoracetat

9,51 g 5'-O-DMTr-dCBz-3'-OH (15 mmol, 1.0 Äquivalente) werden in 80 ml Aceton und 80 ml Acetonitril aufgelöst. 6,17 g Methylimidazoliumtrifluoracetat (32 mmol, 2,1 Äquivalente) und 9,64 g 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphordiamidit (32 mmol, 2,1 Äquivalente) werden zu der gerührten Lösung hinzugefügt. Die Reaktion ist nach 30 Minuten vollständig. 500 ml Ethylacetat werden hinzugefügt, die Lösung zweimalig mit 250 ml NaHCO3-Lösung und mit 250 ml Kochsalz-Lösung extrahiert. Die organische Schicht wird mit MgSO4 getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird in 40 ml Dichlormethan aufgelöst, 250 ml Pentan werden hinzu gegeben, Überstehendes wird abdekantiert und der Rückstand wird unter reduziertem Druck getrocknet, um einen farblosen Schaum zu bilden. Ausbeute (12,0 g, 14,4 mmol): 96%, Reinheit (bestimmt mittels HPLC): 93%.

Beispiel 4Synthese von 5'-O-DMTr-dABz-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung von Benzylimidazoliumtrifluoracetat

38 mg Benzylimidazoliumtrifluoracetat (0,14 mmol, 1,5 Äquivalente) werden in 5 ml Acetonitril aufgelöst und 300 mg Molekularsieb 3Å werden hinzugefügt. 145 μl 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphordiamidit (0,46 mmol, 5,0 Äquivalente) werden hinzugefügt. 30 Minuten später werden 61 mg 5'-O-DMTr-dABz-3'-OH (0,09 mmol, 1,0 Äquivalente) zugefügt und die Lösung über Nacht gerührt. Die Reaktion is nach 17 Stunden vollständig. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 91%.

Beispiel 5Synthese von 5'-O-DMTr-dCBz-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung einer katalytischen Menge von Methylimidazoliumtrifluoracetat

500 mg 5'-O-DMTr-dCBz-3'-OH (0,79 mmol, 1,0 Äquivalente) werden in 18 ml Dichlormethan und 1 ml DMF aufgelöst, 3 g Molekularsieb 3Å werden hinzugefügt. 50 mg Methylimidazoliumtrifluoracetat (0,17 mmol, 0,2 Äquivalente) und 276 μl 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (0,87 mmol, 1,1 Äquivalente) werden zu der gerührten Lösung hinzugefügt. Die Reaktion ist nach 24 Stunden vollständig. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 89%.

Beispiel 6Synthese von 5'-O-DMTr-dGiBu-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung einer katalytischen Menge von Benzylimidazoliumtrifluoracetat

5 mg Benzylimidazoliumtrifluoracetat (0,02 mmol, 0,2 Äquivalente) werden in 5 ml Acetonitril aufgelöst und 300 mg Molekularsieb 3Å werden hinzugefügt. 145 μl 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphordiamidit (0,46 mmol, 5,0 Äquivalente) werden zu der gerührten Lösung hinzugefügt. 1 Stunde später werden 60 mg 5'-O-DMTr-dGiBu-3'-OH (0,09 mmol, 1,0 Äquivalente) zugefügt und die Lösung über Nacht gerührt. Die Reaktion ist nach 48 Stunden vollständig. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 90%.

Beispiel 7Synthese von 5'-O-DMTr-T-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung einer katalytischen Menge von Benzylimidazoliumtrifluoracetat

50 mg Benzylimidazoliumtrifluoracetat (0,18 mmol, 0,18 Äquivalente) und 500 mg 5'-O-DMTr-T-3'-OH (0,92 mmol, 1,0 Äquivalente) werden in 28 ml Dichlormethan aufgelöst und 3 g Molekularsieb 3Å werden hinzugefügt. 350 μl 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphordiamidit (1,0 mmol, 1,1 Äquivalente) werden zu der gerührten Lösung hinzugefügt. Die Reaktion ist nach 25 Stunden vollständig. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 90%.

Beispiel 8Synthese von 5'-O-DMTr-T-P(S)-dCBz-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung von Methylimidazoliumtrifluoracetat

100 mg 5'-O-DMTr-T-P(S)-dCBz-3'-OH (0,10 mmol, 1,0 Äquivalente) und 24,4 mg Methylimidazoliumtrifluoracetat (0,11 mmol, 1,1 Äquivalente) werden in 10 ml Dichlormethan aufgelöst, 200 mg Molekularsieb 4Å werden hinzugefügt. 32 μl 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (0,10 mmol, 1,0 Äquivalente) werden zu der gerührten Lösung hinzugefügt. Die Reaktion ist nach 24 Stunden vollständig. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 60%.

Beispiel 9Synthese von 5'-O-DMTr-dCBz-P(S)-dGiBu-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung von Methylimidazoliumtrifluoracetat

100 mg 5'-O-DMTr-dCBz-P(S)-dGiBu-3'-OH (0,09 mmol, 1,0 Äquivalente) und 17,8 mg Methylimidazoliumtrifluoracetat (0,09 mmol, 1,0 Äquivalente) werden in 10 ml Dichlormethan aufgelöst, 200 mg Molekularsieb 4Å werden hinzugefügt. 28 μl 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (0,09 mmol, 1,0 Äquivalente) werden zu der gerührten Lösung hinzugefügt. Die Reaktion ist nach 3 Stunden beendet. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 56%.

Beispiel 10Synthese von 5'-O-DMTr-dGiBu-P(O)-dGiBu-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung von Methylimidazoliumtrifluoracetat

106 mg 5'-O-DMTr-dGiBu-P(O)-dGiBu-3'-OH (0,10 mmol, 1,0 Äquivalente) und 30 mg Methylimidazoliumtrifluoracetat (0,15 mmol, 1,5 Äquivalente) werden in 10 ml Aceton aufgelöst, 500 mg Molekularsieb 3Å werden hinzugefügt. Nach 30 Minuten werden 34 μl 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (0,11 mmol, 1,1 Äquivalente) zu der gerührten Lösung hinzugefügt. Die Reaktion ist vollständig nach 4 Stunden. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 55%.

Beispiel 11Synthese von 5'-O-DMTr-T-P(S)-dCBz-P(S)-T-P(S)-dCBz-P(S)-dCBz-P(S)-dCBz -3'-O-phosphoramidit unter Verwendung von Methylimidazoliumtrifluoracetat

10 mg 5'-O-DMTr-T-P(S)-dCBz-P(S)-T-P(S)-dCBz-P(S)-dCBz-P(S)-dCBz-3'-OH (3,6 μmol, 1,0 Äquivalente) und 1,4 mg Methylimidazoliumtrifluoracetat (7,2 μmol, 2,0 Äquivalente) werden in 0,5 ml Aceton und 0,5 ml Acetonitril aufgelöst, 50 mg Molekularsieb 3Å werden hinzugefügt. Nach 30 Minuten werden 5,8 μl 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (18,1 μmol, 5,0 Äquivalente) zu der gerührten Lösung hinzugefügt. Die Reaktion ist vollständig nach 5 Stunden. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 71%.

Beispiel 12Synthese von 5'-O-DMTr-dT-3'-O-phosphoramidit über die „in situ"-Erzeugung von N-Methylimidazoliumtrifluoracetat

1,00 g 5'-O-DMTr-dT-3'-OH (1,84 mmol, 1,0 Äquivalente) werden in 2 ml Dichlormethan und 2 ml Aceton aufgelöst. 300 mg N-Methylimidazol (3,68 mmol, 291 μl, 2,0 Äquivalente) und 665 mg 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-Tetraisopropylphosphordiamidit (2,21 mmol, 700 μl, 1,2 Äquivalente), gefolgt von 1,00 g Molekularsieb 3Å werden hinzugefügt. Zu dieser gerührten Suspension werden tropfenweise 230 mg Trifluoressigsäure (2,02 mmol, 159 μl, 1,1 Äquivalente) in 1 ml Dichlormethan gegeben. Die Reaktion ist nach 3 Stunden vollständig. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 99%

Beispiel 13Synthese von 5'-O-DMTr-dGiBu-3'-O-phosphoramidit über die „in situ"-Erzeugung von N-Methylimidazoliumtrifluoracetat

1,00 g 5'-O-DMTr-dGiBu-3'-OH (1,56 mmol, 1,0 Äquivalente) werden in 2 ml Dichlormethan und 2 ml Aceton aufgelöst. 255 mg N-Methylimidazol (3,11 mmol, 247 μl, 2,0 Äquivalente) und 563 mg 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (1,87 mmol, 593 μl, 1,2 Äquivalente), gefolgt von 1,00 g Molekularsieb 3Å, werden hinzugefügt. Zu dieser gerührten Lösung werden 195 mg Trifluoressigsäure (1,72 mmol, 135 μl, 1,1 Äquivalente) in 1 ml Dichlormethan tropfenweise hinzugefügt. Die Reaktion ist vollständig nach 5 Stunden. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 88%.

Beispiel 14Synthese von 5'-O-DMTr-dGiBu-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung einer N-Methylimidazoliumtrifluoracetat-N-Methylimidazol-Mischung

1,00 g 5'-O-DMTr-dGiBu-3'-OH (1,56 mmol, 1,0 Äquivalente) werden in 2 ml Dichlormethan und 2 ml Aceton aufgelöst. 2,00 g Molekularsieb 3Å, 367 mg N-Methylimidazoliumtrifluoracetat (1,87 mmol, 1,2 Äquivalente) und 383 mg N-Methylimidazol (4,68 mmol, 371 μl, 3,0 Äquivalente) werden hinzu gegeben, gefolgt von 563 mg 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (1,87 mmol, 593 μl, 1,2 Äquivalente). Die Reaktion ist vollständig nach 20 Minuten. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 90%.

Beispiel 15Synthese von 5'-O-DMTr-dCBz-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung einer N-Methylimidazoliumtrifluoracetat-N-Methylimidazol-Mischung

1,00 g 5'-O-DMTr-dGiBu-3'-OH (1,56 mmol, 1,0 Äquivalente) werden in 2 ml Dichlormethan und 2 ml Aceton aufgelöst. 2,00 g Molekularsieb 3Å, 367 mg N-Methylimidazoliumtrifluoracetat (1,87 mmol, 1,2 Äquivalente) und 383 mg N-Methylimidazol (4,68 mmol, 371 μl, 3,0 Äquivalente) werden hinzugegeben, gefolgt von 563 mg 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (1,87 mmol, 593 μl, 1,2 Äquivalente). Die Reaktion ist vollständig nach 20 Minuten. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 90%.

Beispiel 16Synthese von 5'-O-DMTr-dCBz-P(O)-dABz-3'-O-phosphoramidit über die „in situ"-Erzeugung von Methylimidazoliumtrifluoracetat

100 mg 5'-O-DMTr-dCBz-P(O)-dABz-3'-OH (90,7 μmol, 1,0 Äquivalente) werden in 200 μl Dichlormethan und 200 μl Aceton aufgelöst. 15 mg N-Methylimidazol (180 μmol, 14 μl, 2,0 Äquivalente) und 54,6 mg 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (181 μmol, 57 μl, 2,0 Äquivalente), gefolgt von 100 mg Molekularsieb 3Å, werden hinzugefügt. Zu dieser gerührten Suspension werden tropfenweise 100 μl einer 1M-Lösung von Trifluoressigsäure in Dichlormethan hinzugefügt. Die Reaktion ist vollständig nach 30 Minuten. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 90%.

Beispiel 17Synthese von 5'-O-phosphoramidit-dT-P(O)-dGiBu-P(O)-dGiBu-3'-O-Lev unter Verwendung von N-Methylimidazoliumtrifluoracetat

2,0 g 5'-HO-dT-P(O)-dGiBu-P(O)-dGiBu-3'-O-Lev (1,6 mmol, 1,0 Äquivalente) wurden in 80 ml Aceton aufgelöst, 500 mg Methylimidazoliumtrifluoracetat (2,5 mmol, 1,56 Äquivalente) und 4,0 g Molekularsieb 3Å wurden hinzugefügt. 2,76 ml 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (2,62 g, 8,7 mmol, 5 Äquivalente) wurden hinzugefügt und nach 30 Minuten Rühren wurde das Phosphoramidit durch Hinzufügung von 300 ml n-Heptan ausgefällt. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 72%.

Beispiel 18Synthese von 5'-O-phosphoramidit-dCBz-P(O)-dABz-3'-O-Lev unter Verwendung von N-Methylimidazoliumtrifluoracetat

1,0 g 5'-HO-dCBz-P(O)-dABz-3'-O-Lev (1,1 mmol, 1,0 Äquivalente) und 326 mg Methylimidazoliumtrifluoracetat (1,66 mmol, 1,5 Äquivalente) wurden in 8 ml Aceton und 10 ml Dichlormethan aufgelöst und 2,0 g Molekularsieb 3Å wurden hinzugefügt. 700 μl 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (664 mg, 2,2 mmol, 2 Äquivalente) wurden hinzugefügt und nach 1 Stunde Rühren wurde das Phosphoramidit durch Zugabe von 50 ml n-Heptan ausgefällt. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 78%.

Beispiel 19Synthese von 5'-O-phosphoramidit-T-P(O)-dCBz-P(O)-dCBz-P(O)-dCBz-3'-O-Lev unter Verwendung von N-Methylimidazoliumtrifluoracetat

1,0 g 5'-HO-T-P(O)-dCBz-P(O)-dCBz-P(O)-dCBz-3'-O-Lev (11,6 μmol, 1,0 Äquivalente) und 4,3 mg N-Methylimidazoliumtrifluoracetat (22 μmol, 1,9 Äquivalente) wurden in 2 ml Aceton aufgelöst und 40 mg Molekularsieb 3Å wurden hinzugefügt. 15 μl 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (14 mg, 47 μmol, 4 Äquivalente) wurden hinzugefügt und nach 1 Stunde Rühren wurde das Phosphoramidit durch Zugabe von 3 ml n-Heptan ausgefällt. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 86%.

Beispiel 20Synthese von 5'-O-TBDPS-dT-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung von N-Methylimidazoliumtrifluoracetat

510 mg 5'-O-DMTr-dT-3'-OH (1,06 mmol, 1,0 Äquivalente) werden in 20 ml Aceton aufgelöst und 251 [mg] N-Methylimidazoliumtrifluoracetat (1,27 mmol, 1,2 Äquivalente), 1,0 g Molekularsieb 3Å und 383 mg 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (403 μl, 1,27 mmol, 1,2 Äquivalente) werden unter Rühren hinzugefügt. Die Reaktion ist nach 30 Minuten vollständig. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 88%.

Beispiel 21Synthese von 5'-O-TBDMS-dGiBu-3'-O-phosphoramidit unter Verwendung von N-Methylimidazoliumtrifluoracetat

1 mg 5'-O-TBDMS-dGiBu-3'-OH (2,21 mmol, 1,0 Äquivalente) werden in 20 ml Aceton aufgelöst und 875 [mg] N-Methylimidazoliumtrifluoracetat (4,42 mmol, 2 Äquivalente), 2,0 g Molekularsieb 3Å und 3,33 g 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (3,5 ml, 11 mmol, 5 Äquivalente) werden unter Rühren hinzugefügt. Die Reaktion ist nach 30 Minuten vollständig. Ausbeute (bestimmt mittels HPLC): 88%.