Title:
Selective labelling of proteins containing cysteine or seleno-cysteine residues
Kind Code:
A1


Abstract:
Selective labelling of proteins (I) that contain selenocysteine (SeCys) and/or Cys residues, optionally in oxidised form, comprises; (i) at least one incubation of a (I)-containing sample with at least one modifying agent (II) specific for SeCys or Cys, and (ii) at least one incubation with at least one labelling reagent (III) with similar specificity, provided that before, during and/or after at least one incubation, a substance (IV), that interacts with (I), is added.



Inventors:
WILLEY KEVAN DR (DE)
OBERMANN-PLES HEIKE DR (DE)
HUNT NICHOLAS DR (DE)
HENCO KARSTEN DR (DE)
Application Number:
DE19747632A
Publication Date:
05/06/1999
Filing Date:
10/29/1997
Assignee:
IHF INSTITUT FUER HORMON- UND FORTPFLANZUNGSFORSCHUNG, 22529 HAMBURG, DE
EVOTEC BIOSYSTEMS AG, 22525 HAMBURG, DE



Claims:
1. Verfahren zur spezifischen Markierung eines Proteins mit folgenden Schritten:

ä mindestens einer Inkubation einer proteinhaltigen Probe mit mindestens einem Modifizierungsreagenz zum Beeinflussen von Selenocystein- und/oder Cysteingrup­pen in dem Protein, gefolgt von

ä mindestens einer weiteren Inkubation der proteinhal­tigen Probe mit mindestens einem Markierungsreagenz zum Markieren von Selenocystein- und/oder Cystein­gruppen in dem Protein,

ä wobei vor und/oder während und/oder nach mindestens einer der genannten Inkubationen die Zugabe minde­stens einer Substanz, die mit dem Protein in Wechsel­wirkung tritt, erfolgt.

Description:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifi­schen Markierung eines Proteins. Die Untersuchung von Rezeptoren, wie z. B. den G-Protein-ge­koppelten Rezeptoren, deren Polypeptidkette sich zu einer Struktur mit sieben membrandurchspannenden Helices faltet, ist sowohl wissenschaftlich als auch wirtschaftlich von großer Bedeutung. Es handelt sich bei diesen sogenannten 7-Transmem­branrezeptoren um eine große Gruppe von Rezeptoren, die phyloge­netisch sehr alt ist und deren Aminosäuresequenz charakteristi­sche Cysteine aufweist. Die Liganden gehören dabei den unter­schiedlichsten chemischen Stoffklassen und Molekülgrößen an, angefangen bei Lipiden, Metallionen und Monoaminen bis hin zu Peptiden und Proteinen. Über mögliche strukturelle Veränderungen derartiger Rezeptoren, welche das Bindeglied zwischen Liganden­bindung und Signaltransduktion darstellen, ist jedoch bislang nur wenig bekannt. Es wird vermutet, daß ligandeninduzierte Konformationsänderungen der 7-Transmembranrezeptoren am Initialschritt der Dissoziation des heterotrimeren G-Protein-Komplexes unter Austausch von GDP/GTP beteiligt sind. Schwartz und Rosenkilde (TiPS, Vol. 17, 1996) stellen ein Modell vor, welches als einzige Anforderung an einen neuen Agonisten die Fähigkeit zur Stabilisierung einer aktiven Rezeptorkonformation nennt, und gelangen zu dem Schluß, daß kein gemeinsames "Schloß" für alle "Schlüssel" in der Superfamilie der 7-Transmembranrezeptoren existiert. Allgemein werden bei der Untersuchung von Proteinen, aber auch insbesondere bei der Erforschung der Signalkaskade, Cystein-spezifische Reagenzien verwendet, um die funktionalen und strukturellen Eigenschaften der Cysteine näher zu beleuchten (Creighton, "Proteins", Freeman & Co., 1984). Korner et al. (The Journal of Biological Chemistry, Vol. 257, No. 7, pp. 3389ä3396, 1982) beschreiben ein Verfahren zur Unter­suchung des b2-adrenergen Rezeptors unter Verwendung von N-Ethylmaleimid (NEM). Um bereits exponierte Thiolgruppen vor dem eigentlichen Experiment zur Reaktion zu bringen, wurden die Membranproben in einem ersten Verfahrensschritt mit NEM in Gegenwart des Antagonisten Propranolol vorbehandelt. In einem weiteren Verfahrensschritt erfolgte eine Inkubation mit ¢3H!Iso­proterenol unter Zusatz von NEM. Die Autoren kommen insbesondere zu dem Schluß, daß NEM nicht mit dem Rezeptor selbst, sondern mit einer assoziierten Komponente, dem G-Protein, interagiert. Nach Korner et al. werden spezifische Thiolgruppen des G-Pro­teins exponiert, wenn das G-Protein mit dem hormonaktivierten Rezeptor interagiert. Demnach ist das Verfahren von Korner et al. nicht geeignet, den eigentlichen Rezeptor zu markieren. André et al. (Biochemical Pharmacology, Vol. 31, No. 22, 3657ä3662, 1982) beschreiben den Effekt von NEM auf agonisten-in­duzierte Konformationsänderungen des b-adrenergen Rezeptors. Das an Membranpräparationen durchgeführte Verfahren ist durch drei Inkubationsschritte gekennzeichnet: Inkubation mit NEM, gefolgt von einer Inkubation von NEM in Gegenwart des Agonisten (ä)-Iso-proterenol und anschließender Inkubation mit dem mar­kierten Antagonisten (ä)-¢3H!DHA. André et al. beobachteten, daß in ihren Experimenten die durch NEM hervorgerufenen Effekte auch durch GTP induziert werden können, so daß hier offenbar G-Proteine entscheidend beteiligt sind. Lipson et al. (Biochemistry 1986, 25, 5678ä5685) beschreiben ein Verfahren zur Untersuchung des Glucagon-Rezeptor-N-Protein-Komplexes unter Verwendung von N-Ethylmaleimid und anderer, Thiole alkylierender Reagenzien. Es konnte hier z. B. gezeigt werden, daß die Anwesenheit von NEM vor, während oder nach der Assoziationsreaktion von 125I-Glucagon und partiell gereinigten, proteinhaltigen Lebermembranen die Freisetzung von gebundenem Hormon, während einer anschließenden Dissäziationsreaktion, begünstigt. In einem Übersichtsartikel, in dem die Verwendung des alkylie­renden Reagenzes N-Ethylmaleimid (NEM) bei der Erforschung G-Protein gekoppelter Rezeptoren erwähnt wurde (Lefkowitz et al., Ann. Rev. Biochem. 52, 159ä86, 1983), merken die Autoren an, daß Unsicherheit darüber besteht, ob die kritischen Sulfhydryl­gruppen auf dem Rezeptor, G-Protein oder gar auf beiden Kom­ponenten lokalisiert sind. Heutzutage ist die besondere Bedeutung der Cysteine im abq-Hetero­trimer des G-Proteins allgemein bekannt. Entsprechende Untersuchungen wurden z. B. von Garcia-Higuera (J. Biol. Chem., Vol. 257, No. 1, 528ä535, 1996) unter Verwendung von vernetzenden Reagenzien sowie mittels SDM (Site-directed mutagenesis) durch­geführt. Li et al. (The Journal of Biological Chemistry, Vol. 267, No. 11, 7570ä7575, 1992) untersuchten die Bedeutung von Thiolgruppen für die Bindung des Neuropeptides Y an den Y2 Rezeptor. Untersuchungen hinsichtlich der Bedeutung von Disulfidbrücken und Thiolgruppen für die Bindung des Thyrotropin-Releasing Hormons (TRH) an den TRH-Rezeptor wurden von Cook et al. (Endo­crinology, Vol. 137, No. 7, 2851ä2858, 1996) durchgeführt. Dithiothreitol (DTT), ein Disulfidbrücken-reduzierendes Reagenz, und p-CMB, eine Thiolgruppen-blockierende Substanz, reduzieren in dosisabhängiger Weise die spezifische TRH-Bindung. Ansätze zur Untersuchung von Konformationsänderungen von G-Pro­tein-gekoppelten Rezeptoren sind oftmals indirekter Natur, d. h. es wird z. B. der Effekt der Rezeptorkonformation auf die GTPase-Aktivität des G-Proteins oder die Aktivität von Effektorenzymen untersucht. Gether et al. (The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No. 47, Issue of November 24, pp. 28268ä28275, 1995) beschreiben jedoch ein Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung des gereinigten b2-adrenergen Rezeptors mit dem Ziel, ligandeninduzierte Kon­formationsänderungen dieses G-Protein-gekoppelten Rezeptors direkt erkennbar zu machen. Hierzu wurde der in SF-9 Insekten­zellen exprimierte Rezeptor zunächst einer Reinigung unterzogen, bevor er mit dem Cystein-spezifischen Fluoreszenzmarker N,N'-dimethyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)eth­ylendiamin (IANBD) markiert wurde. Die Fluoreszenz von IANBD ist stark von der Polarität der Farbstoffumgebung abhängig und kann daher als Indikator für Konformationsänderungen des Rezeptors herangezogen werden. So konnte durch Eindung des Agonisten Isoproterenol an den b2-adrenergen Rezeptor eine geringe Abnahme der Fluoreszenzemission beobachtet werden. Nachteilig an dem von Gether et al. beschriebenen Verfahren ist insbesondere die äußerst arbeits- und zeitintensive mehrstufige Reinigung des Rezeptors. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur spezifischen Markierung und/oder zum Nachweis der Aktivierung und/oder Deaktivierung und/oder zur Bestimmung von Konforma­tionsänderungen von proteinhaltigen Proben wie Rezeptoren, insbesondere 7-Transmembranrezeptoren, bereit zu stellen. Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch die folgenden Ver­fahrensschritte gekennzeichnet:ä mindestens einer Inkubation einer proteinhaltigen Probe mit mindestens einem Modifizierungsreagenz zum Beeinflussen von Selenocystein- und/oder Cysteingruppen in dem Protein, gefolgt vonä mindestens einer weiteren Inkubation der proteinhaltigen Probe mit mindestens einem Markierungsreagenz zum Markieren von Selenocystein- und/oder Cysteingruppen in dem Protein,ä wobei vor und/oder während und/oder nach mindestens einer der genannten Inkubationen die Zugabe mindestens einer Sub­stanz, die mit dem Protein in Wechselwirkung tritt, er­folgt. Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt dabei aus, daß durch eine mittels Zugabe einer Substanz induzierte Aktivierung bzw. Konformationsänderung des Proteins, anscheinend unzugängliche Seleno-Cysteine und/oder Cysteine des Proteins im Rahmen einer Inkubation mit einem Seleno-Cystein- und/oder Cystein-spezifi­schen Markierungsreagenz markiert werden können bzw. sich der Markierungsgrad des Proteins und/oder Eigenschaften des Markie­rungsreagenz ändern. Zum Nachweis einer derartig induzierten Aktivierung bzw. Kon­formationsänderung ist es wünschenswert, insbesondere bereits vor der Zugabe der mit dem Protein in Wechselwirkung tretenden Substanz zugängliche Selenocysteine und/oder Cysteine zu modifi­zieren, um den Hintergrund zu reduzieren bzw. die Detektions­effizienz zu erhöhen. Dies erfolgt durch den erfindungsgemäßen ein- oder mehrmaligen Zusatz eines selenocystein- und/oder cystein-spezifischen Modifizierungsreagenzes. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit 7-Transmembranrezeptoren können so in vorteilhafter Weise negative allosterische Effekte des G-Proteins auf den Rezeptor, welche die Agonistendissoziation beschleunigen, unterdrückt oder störende Cystein-Proteasen, welche einen Abbau des Agonisten-Rezeptor-Komplexes hervorrufen können, inaktiviert werden. Die selenocystein- und/oder cystein­spezifischen Modifizierungs- und Markierungsreagenzien können stöchiometrisch oder gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfüh­rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens im Überschuß zu­gesetzt werden. In vorteilhafter Weise kann überschüssiges Modifizierungsreagenz vor der Inkubation der proteinhaltigen Probe mit einem Markierungsreagenz insbesondere durch Zentrifu­gation oder durch Waschschritte entfernt bzw. durch Zusatz von Cystein, Selenocystein oder SH-Gruppen enthaltenden Chemikalien inaktiviert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich in vorteilhafter Weise im Vergleich zum Stand der Technik dadurch aus, daß es durch den Einsatz eines einzelnen Markierungsreagenzes für die Anwendung im Bereich des Hochdurchsatz-Screenings besonders geeignet ist und die Detektion neuer Liganden zu insbesondere bekannten proteinhaltigen Proben oder umgekehrt ermöglicht. Eine beschleunigte funktionale Validierung von 7-Transmembran-Orphan-Rezep­toren als Target/Lead-Systeme und bereits bekannter Rezep­toren im Pharma-Screening auf neue Agonisten oder Antagonisten durch ein allgemeines Testverfahren ist von größter wirtschaft­licher Bedeutung. So können beispielsweise mittels des erfin­dungsgemäßen Verfahrens Agonisten für einen Orphan-Rezeptor mit unbekannter Funktion aus einer Liganden-Library identifiziert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Unterschei­dung von Agonisten und Antagonisten. So kann eine Detektion von Antagonisten aufgrund der Inhibierung der agonisten-induzierten Markierung bzw. eine Detektion einer Substrat/Inhibitorwechsel­wirkung erfolgen. Es kann wünschenswert sein, die Inkubationszeiten an die Art der selenocystein- und/oder cysteinspezifischen Modifizierungs- bzw. Markierungsreagenzien anzupassen. Ferner ist es möglich, nach Inkubation der proteinhaltigen Probe mit den selenocystein- und/oder cysteinspezifischen Modifizierungsreagenzien diese zu­nächst nur mit der Substanz im Sinne einer Prääquilibrierung zu versetzen und erst zu einem späteren Zeitpunkt das selenocy­stein- und/oder cysteinspezifische Markierungsreagenz zuzuset­zen. Der Zusatz des Markierungsreagenzes kann ein- oder mehr­malig erfolgen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden insbesondere Transmembran-Rezeptoren, wie z. B. G-Protein gekoppelte 7-Transmembran-Rezeptoren, spezifisch mar­kiert bzw. wird eine ligandeninduzierte Aktivierung und/oder Deaktivierung und/oder Konformationsänderung dieser Rezeptoren nachgewiesen. Cystein-reaktive Reagenzien sind aus der Literatur (Creighton, "Proteins", Freeman & Co., 1984) bekannt und können entsprechend im erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden. Hierzu wurden Experimente mit verschiedenen seleno-cystein- bzw. cystein­reaktiven Reagenzien (u. a. Iodacetat, Iodacetamid, Diamid, monovalente und bivalente Maleimide wie NEM, verschiedene Metallverbindungen, DTT, NaBH4, Pyridoxalphosphat) durchgeführt. In bevorzugter Weise können alkylierende Reagenzien wie N-Ethylmaleimid (NEM) im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Es kann weiterhin bevorzugt sein, eine Inkubation der proteinhaltigen Probe mit einem reduzierenden Reagenz wie b-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol durchzuführen, um somit Cysteine, welche durch Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind, zu beeinflussen. Durch Kombination von alkylierenden und reduzierenden Cystein-reaktiven Reagenzien ist es möglich, die Reaktionsbedingungen weiter zu optimieren. Reagenzien unter­schiedlicher Hydrophobizität und Größe weisen eine unterschied­liche Membranpermeabilität auf, welche im erfindungsgemäßen Ver­fahren berücksichtigt werden kann. Die Substitution von Cysteinen durch Selenocysteine in Protei­nen ist in der jüngeren Literatur beschrieben (Müller et al., Biochemistry, 33, 3404ä3412, 1994; Ursini et al., Methods in Enzymology, Vol. 252, 38ä53, Academic Press, 1995; Björnstedt et al., Methods in Enzymology, Vol. 252, 209ä219, Academic Press, 1995). Unter einem selenocystein- bzw. cysteinspezifischen Markierungs­reagenz werden im Sinne der Erfindung jegliche selenocystein- bzw. cysteinspezifischen Reagenzien verstanden, welche einen detektierbaren Anteil enthalten. Der detektierbare Anteil ist je nach Detektionssystem zu wählen, z. B. Haptene im Rahmen einer immunologischen Detektion, multivalente, bevorzugt bivalente, funktionale Gruppen für eine Cross-Linking-Reaktion. Ferner können auch radioaktiv markierte Substanzen verwendet werden oder ein Nachweis mittels Biotin/Streptavidin bzw. Avidin erfolgen. Es kann bevorzugt sein, wie im Ausführungsbeispiel 1 Biotin zu verwenden, so daß die spezifische Markierung eines Rezeptors mittels Western-Blot unter Verwendung entsprechender Antikörper nachgewiesen werden kann. Das selenocystein- bzw. cysteinspezifische Markierungsreagenz kann in bevorzugter Weise lumineszent sein. Zur Detektion der erfolgten Markierung und/oder einer Aktivierung und/oder Deaktivierung und/oder Konforma­tionsänderung des Rezeptors können sodann die Methode der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (WO 94/16313) sowie andere konfokale Fluoreszenztechniken, wie in der Offenlegungsschrift WO 96/13744 beschrieben sowie der europäischen Patentanmeldung 96 116 373.0 vorgeschlagen, eingesetzt werden. Die letztgenannte Anmeldung schlägt eine Methode zur Analyse von Proben durch wiederholte Messung der Anzahl von Photonen pro definiertem Zeitintervall von Licht vor, welches von den Partikeln in der Probe emittiert, gestreut und/oder reflektiert wird, und Bestim­mung der Verteilung der Anzahl von Photonen in den jeweiligen Zeitintervallen, dadurch gekennzeichnet, daß die Verteilung der modularen Helligkeiten der Partikel aus der Verteilung der Anzahl von Photonen bestimmt wird. Die Bereitstellung der proteinhaltigen Probe kann insbesondere unter Verwendung von (rekombinanten) Zellen, Geweben, Vesikeln oder künstlichen Membranen erfolgen. In vorteilhafter Weise erfordert das erfindungsgemäße Verfahren nicht zwingenderweise die Reinigung der beteiligten Komponenten. Die Fig. 1 zeigt den Effekt von NEM auf die Interaktion von Thyreotropin (TSH) mi… …09528DEA119747632 DE990421 t dem TSH-Rezeptor. Die Fig. 2 zeigt den Effekt von DTT auf die Interaktion von Thyreotropin (TSH) mit dem TSH-Rezeptor. Die Fig. 3 zeigt TSH-Bindungskurven. Die Fig. 4 zeigt die Ergebnisse von Western-Blots hinsichtlich der Detektion des TSH-FLAG-Rezeptors sowie der Biotin-Bindung an den Rezeptor. Die Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Western-Blots nach unter­schiedlichen NEM- und TSH-Behandlungen des TSH-Rezeptors. Die Fig. 1 verdeutlicht den Effekt von NEM auf die Interaktion von TSH mit dem TSH-Rezeptor. 125I-markiertes Rinder-TSH (B) bzw. mit humanem TSH-Rezeptor transfizierte HeLa-Zellen (C) wurden mit 3 mM NEM für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ver­dünnung bzw. Waschschritten erfolgte der Zusatz von unbehandel­tem Rezeptor bzw. Radioligand. Der Assay wurde über Nacht bei 30°C inkubiert und die Rezeptorfraktion anschließend zur Bestim­mung des gebundenen 125I-TSH präzipitiert. (D) zeigt das Ergebnis eines in Gegenwart von 3 mM NEM durchgeführten Assays, wobei vorher weder Hormon noch Rezeptorfraktion mit NEM vorbehandelt worden sind. (A) zeigt die Kontrollinkubation ohne jegliche NEM-Inkubation. Die Fig. 2 verdeutlicht den Effekt von DTT auf die Interaktion von TSH mit dem TSH-Rezeptor. 125I-markiertes Rinder-TSH (E) bzw. mit humanem TSH-Rezeptor transfizierte HeLa-Zellen (C) wurden mit 1 mM DTT für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Verdünnung bzw. Waschschritten erfolgte der Zusatz von unbehan­deltem Rezeptor bzw. Radioligand. Der Assay wurde über Nacht bei 30°C inkubiert und die Rezeptorfraktion anschließend zur Bestimmung des gebundenen 125I-TSH präzipitiert. (D) zeigt das Ergebnis eines in Gegenwart von 1 mM DTT durchgeführten Assays, wobei vorher weder Hormon noch Rezeptorfraktion mit DTT vor­behandelt worden sind. (B) zeigt die Kontrollinkubation ohne jegliche DTT- Inkubation. TSH-Bindungskurven mit unbehandeltem Rezeptor als Kontrolle (a), mit 3 mM NEM vorbehandeltem Rezeptor (b), lediglich im anschlie­ßenden Bindungsassay mit 3 mM NEM behandeltem Rezeptor (c) sowie Rezeptor, der sowohl mit 3 mM NEM vorbehandelt als auch im Assay mit 3 mM NEM behandelt (d) wurde, sind in. Fig. 3 dargestellt. Die Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der Western-Blots hinsichtlich der Detektion des TSH-FLAG-Rezeptors als Kontrolle (Anti-FLAG-blot) sowie der Detektion des an den TSH-Rezeptor gebundenen cysteinspezifischen Markierungsreagenzes NEM-Biotin. Mit dem TSH-FLAG-Rezeptor transfizierte HeLa-Zellen wurden mit unter­schiedlichen NEM-Konzentrationen jeweils einmalig für 30 Minuten inkubiert (Spalte 1: HeLa-Zellen ohne TSH-FLAG-Rezeptor, keine NEM-Vorbehandlung; Spalte 2: HeLa-Zellen mit TSH-FLAG-Rezeptor, keine NEM-Vorbehandlung; Spalte 3: HeLa-Zellen mit TSH-FLAG-Rezeptor, Vorbehandlung mit 100 µM NEM; Spalte 4: HeLa-Zellen mit TSH-FLAG-Rezeptor, Vorbehandlung mit 1 mM NEM, Spalte 5: HeLa-Zellen mit TSH-FLAG-Rezeptor, Vorbehandlung mit 10 mM NEM). Nach Entfernen der NEM-Lösungen sowie Waschen der Zellen wurden die Zellen mit 100 nM TSH und 1 mM NEM-Biotin eine Stunde lang inkubiert. Nach Behandlung mit Zell-Lyse-Puffer wurde der TSH-FLAG-Rezeptor mittels anti-FLAG-Antikörper immunopräzipitiert. Das Immunopräzipitat wurde in zwei Fraktionen aufgeteilt, welche beide mittels SDS-PAGE weiterbehandelt wurden. Die separierten Proteine wurden für die Western-Blots (anti-FLAG bzw. anti-Piotin) auf Nitrocellulose-Membranen transferiert. Die Detektion erfolgte unter Verwendung eines zweiten enzymgekoppelten Antikörpers (anti-Ig). Der TSH-FLAG-Rezeptor zeigt ein charak­teristisches Bandenmuster (anti-FLAG blot) bestehend aus einer Hauptbande und zwei Nebenbanden, welches durch die NEM-Behand­lung unbeeinflußt blieb. Die Markierung des TSH-Rezeptors mit Biotin steigt mit zunehmenden Konzentrationen an NEM in der Vorbehandlung (anti-Biotin blot). Höhere NEM-Konzentrationen können entsprechend mehr bereits vorhandene Cystein-SH-Gruppen beeinflussen, so daß weniger NEM-Biotin aufgrund unspezifischer Bindungsreaktionen an den Zellen verloren geht. Als Folge steht relativ mehr NEM-Biotin zur Markierung der durch ligandenindu­zierte Aktivierung und/oder Konformationsänderung des Rezeptors zugänglich gemachten SH-Gruppen zur Verfügung. Die Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Western-Blots nach unter­schiedlichen NEM- und TSH-Behandlungen des TSH-Rezeptors. Die Zellen wurden in drei Fraktionen aufgeteilt und vor der Inkuba­tion mit Puffer (Spalten 1ä3) bzw. mit 3 mM NEM (Spalten 4ä6: 20-minütige Inkubation; Spalten 7 bis 9: 20-stündige Inkubation) pelletiert. Jede Probe wurde sodann wie folgt weiterbehandelt: einstündige Inkubation mit Puffer (Spalten 1, 4 und 7), ein­stündige Inkubation mit 100 nM TSH (Spalten 2, 5 und 8) bzw. 22-stündige Inkubation mit 100 nM TSH (Spalten 3, 6 und 9). Es folgte jeweils eine einstündige Inkubation mit 1 mN NEM-Biotin. Die Proben wurden zentrifugiert, mehrmals gewaschen, lysiert und nach SDS-PAGE mittels Western-Blot untersucht. Der TSH-Rezeptor wurde mit anti-FLAG Antikörper immunopräzipitiert und im Blot auf Biotinbindung hin untersucht. Die Spalten 1 und 2 zeigen eine schwache NEM-Biotin-Markierung des Rezeptors, welche sich durch einstündige TSH-Inkubation erhöhen läßt (Spalte 2). Die Spalten 4 bis 6 zeigen zum einen die durch 20-minütige Inkubation mit NEM hervorgerufene erhöhte Markierung des Rezep­tors und belegen zum anderen, die mittels TSH-Inkubation erziel­te höhere Markierungsrate des Rezeptors. Die Spezifität der TSH-induzierten Biotinmarkierung des Rezeptors geht offenbar durch lange NEM-Inkubationszeiten verloren (Spalten 7 bis 9).BeispielSpezifische Markierung und/oder Bestimmung von Konformations­änderungen eines Rezeptors, wie z. B. dem TSH-Rezeptor, durch Verwendung von biotinyliertem NEM als Cystein-reaktivem Markie­rungsreagenz Zellen, welche den mit einem FLAG-Epitop versehenen TSH-Rezeptor enthielten, in Assaypuffer (10 mM Kaliumphosphat mit 0.1 g/l BSA, 0.01 g/l Natriumazid und 0.01 g/l Phenolrot, pH 7.4) mit 3 mM NEM für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wurde der Überschuß an Reagenz durch Zentrifugation (1.000 g, 5 min) entfernt. Es folgte sodann eine Inkubation über Nacht mit 100 µM TSH in Gegenwart von 300 µM biotinyliertem NEM. Die Reaktionseffizienz von biotinyliertem NEM wurde zuvor in einem gesonderten Assay ermittelt und entsprach der von NEM. Sodann wurde die Rezeptorfraktion zweimal zentrifugiert (2ô10.000 g, 2 min), die Überstände wurden entfernt und die Zellen mit 1 ml kaltem Protein-Lyse-Puffer (25 mM TRIS-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1 g/l Nonident P-40 mit 1 Tab. Boehringer "Complete Protease Inhibitor Complex") bedeckt. Nach 20-minütiger Inkubation bei 4°C auf Eis wurden die Zellen abgeschabt und unerwünschte Bestandteile durch Zentrifugation (10.000 g, 2 min) pelletiert. 250 µl des Zell-Lysates wurden mit 5 µl des Anti-FLAG-Antikörpers versetzt und 60 min bei 4°C inkubiert. Nach Zentrifugation (10.000 g, 15 min, 4°C) und Abnehmen des Überstandes erfolgte die Zugabe von Protein A-Sepharose-Beads. Es schloß sich eine weitere 60-minütige Inkubation bei 4°C an. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation (6.000 g, 30 sec). Es folgten mehrere Waschschritte (20 mM TRIS-HCl, pH 8, 100 mM NaCl, 0.05 g/l Nonident P-40) mit wiederholten Zentrifugationen. Das Pellet wurde in 150 µl Waschpuffer wieder aufgenommen. 40 µl dieser Probe wurden sodann mit 8 µl Probenpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 12% Glycin, 2% b-Mercaptoethanol, 0.01% SERVA Blue G). Die Proben wurden sodann für 3 bis 5 min aufgekocht, kurz zentrifugiert und anschließend mittels diskontinuierlicher 10%iger SDS-PAGE getrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel entnommen, in Blotting-Puffer (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20% Methanol, 0.037% SDS) gewaschen und auf einer PVDF-Membran geblottet. Die Membran wurde über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet und sodann mit 20% Methanol versetzt. Zur Verminderung des Hintergrundes wurde die Membran für 1 Stunde geblockt (1% w/v Casein-Hydrolysat). Der Blockingpuffer wurde anschließend entfernt. Die Membran wurde mit 10 ml einer geeigneten Erst-Antikörper-Verdünnung (Anti-Biotin 1 : 500 und für die Kontrolle Anti-FLAG 1 : 1000, jeweils in 20 mM TRIS-HCl, pH 7.6, 137 mM NaCl, 0.05% TWEEN 20, 0.1% Casein-Hydrolysat) für 1 Stunde inkubiert, 3-malig für 10 min gewaschen (20 mM TRIS-HCl, pH 7.6, 137 mM NaCl, 0.05% TWEEN 20) und sodann mit dem jeweiligen zweiten Antikörper (1 : 4000 als Peroxidase-Konjugate, in 20 mM TRIS-HCl, pH 7.6, 137 mM NaCl, 0.05% TWEEN 20, 0.1% Casein-Hydrolysat) für 1 Stunde inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen (20 mM TRIS-HCl, pH 7.6, 137 mM NaCl, 0.05% TWEEN 20), zuletzt mit Wasser, wurden jeweils 5 ml ECL-Lösung 1 und 2 zugegeben und der Blot darin 60 Sekunden lang getränkt. Anschließend wurde ein Film aufgelegt. Die Expositionszeit richtete sich nach der Signalstärke.