Title:
Apparatus to measure viscoelasticity of cells
Kind Code:
A1


Abstract:
The apparatus to measure the elastic and viscous characteristics of materials has the shoe (2) of the magnet (1) in a shape so that the magnetic force directed at the probe (7) is identical with a plane of the sample and parallel to the plane. When using identical magnetic probes, in lines, they are equidistant from the pole shoe and have the same value, where the vector of the magnetic force can lie on a focal plane for observation of the probes through a microscope. The magnetic probes are spherical particles with a diameter of <= 5 mu m. The pole shoe is shaped to give a sharp edge. The deflection of the magnetic probes is determined and set with digital image processing. The force is calibrated, to act on the probes. The magnet and the sample holder allow examination by a light microscope, to detect the deflection of the magnetic probes of a unified diameter in a mono-dispersion. The gap between the magnetic pole shoe and the magnetic probes can be adjusted (3), to bring the pole shoe edge into the proximity of a magnetic probe to be measured. The cells are held on a substrate, for a shear force to be exerted by the magnetic field. The cells are held in place such as by micro-pipettes, so that the magnetic force can act in the required direction in relation to the cell, and the probes are positioned in relation to the cell. The apparatus is combined with fluorescent microscopic working. Nonmagnetic probes are used with the magnetic probes, which have a specific cell bonding action or are bonded to the cells by immunological methods. The pole shoe is cladded with a thin and flexible material to prevent soiling the samples. The shift in the magnetic particles is detected by induction currents. The sample holder (4) has a flexible or rigid material at the sides (5), so that the pole shoe can be brought into microscopic proximity at the probes without contact with the sample volume, so that the sample cannot be contaminated by the pole shoe. The sample holder, as used for cell culture, can be wholly sterilized. The magnetic probes are bonded to the plasma membrane by specific antibodies, by chemical or physisorption. The magnetic probes are inserted into the cytosome by phagocytosis, micro injection, electroporation, scrap loading, lipid fusion or specific coating of the balls such as by adenovirus cladding. The magnetic probes have either a specific or nonspecific bonding in the cytosome of the cells. The nonmagnetic particles are in mechanical contact with the cells, for their lateral deflection following the deflection of the magnetic probes to give the pathological condition of the cells, which can be visualized.



Inventors:
BAUSCH ANDREAS (DE)
SCHMIDT FRANK DIPL PHYS (DE)
SACKMANN ERICH PROF DR (DE)
ZIEMANN FLORIAN DIPL PHYS (DE)
Application Number:
DE19745807A
Publication Date:
05/06/1999
Filing Date:
10/16/1997
Assignee:
BAUSCH, ANDREAS, M. SC., 80637 MUENCHEN, DE
SCHMIDT, FRANK, DIPL.-PHYS., 81667 MUENCHEN, DE
SACKMANN, ERICH, PROF. DR., 81827 MUENCHEN, DE
ZIEMANN, FLORIAN, DIPL.-PHYS., 81927 MUENCHEN, DE



Foreign References:
5486457
Other References:
Eur. Biophys. J. ,1996, 24, S. 348-353
Rev. Sci. Instrum., 1996, 67, (3), S.818-827
Biophys. J. 1994, Vol.66, S. 2210-2216
Claims:
1. Eine Vorrichtung zur Messung elastischer und viskoser Eigenschaften von Stoffen unter Verwendung mikroskopischer magnetischer Sonden, die durch Anbinden oder Einbetten in direkten mechanischen Kontakt mit dem Stoff gebracht werden und die mit Hilfe des magnetischen Feldgradienten eines Magneten, dessen Polschuh in die mikroskopische Nähe der Sonden gebracht wird, lateral aus ihrer Ruhelage ausgelenkt werden, wobei über diese Auslenkung auf die elastischen und viskosen Eigenschaften des Stoffs geschlossen wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Polschuh des Magneten so geformt ist, daß die auf die magnetischen Sonden ausgeübte Magnetkraft an allen Orten innerhalb einer Ebene der Meßprobe die gleiche, zu dieser Ebene parallele Richtung besitzt und bei Verwendung gleichartiger magnetischer Sonden auf Linien gleichen Abstands zum Polschuh zusätzlich den gleichen Betrag besitzt, wobei der Vektor der Magnetkraft in einer Fokalebene eines zur Beobachtung der Sonden eingesetzten Mikroskops liegen kann.

2. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Stoff, dessen elastische und viskose Eigenschaften bestimmt werden, um lebende Zellen, d. h. biologische Systeme handelt.

3. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den verwendeten magnetischen Sonden um kugelförmige Partikel mit einem Durchmesser von unterhalb 5 µm handelt.

4. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Polschuh des Magneten so geformt ist, daß er eine scharfe Kante darstellt.

5. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Auslenkung der magnetischen Sonden mit Hilfe digitaler Bildverarbeitungstechniken verfolgt und bestimmt wird.

6. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kraft, die auf die magnetischen Sonden wirkt, kalibrierbar ist.

7. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Magnet und Probenhalterung so angeordnet werden, daß der zu untersuchende Stoff einer lichtmikroskopischen Betrachtung zugänglich ist.

8. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Auslenkung der magnetischen Sonden mit lichtmikroskopischen Mitteln detektiert wird.

9. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß magnetische Sonden mit einheitlichem, definiertem Durchmesser (sog. monodisperse Sonden) verwendet werden.

10. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen magnetischem Polschuh und magnetischer Sonde einstellbar ist, so daß die Kante des Polschuhs in die mikroskopische Nähe einer magnetischen Sonde, die zur Messung verwendet werden soll, gebracht werden kann.

11. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen auf einem Substrat aufgebracht sind, so daß durch das Magnetfeld eine Scherkraft ausgeübt wird.

12. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen durch eine mikromanipulatorische Methode, wie Mikropipetten, festgehalten werden und positioniert werden können, so daß die magnetische Kraft in eine beliebige Richtung in Bezug auf die Zelle wirken kann.

13. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß durch Verwendung einer mikromanipluatorischen Methode, wie Mikropipetten, magnetische Sonden gezielt auf bestimmte Stellen der Zelle aufgebracht werden.

14. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mit Fluoreszenzmikroskopie kombiniert werden kann.

15. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß innerhalb der Vorrichtung zusätzlich zu den magnetischen unmagnetische Sonden verwendet werden, die spezifisch an die Zelle binden oder durch sonstige immunologische Methoden an die Zelle angebunden werden.

16. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff vom Polschuh des Magneten entweder durch Aufbringen einer geeigneten Beschichtung auf den Polschuh oder durch Überziehen des Polschuhs mit einem dünnen, flexiblen Material, z. B. einer Latexschicht, getrennt wird, so daß die Probe nicht verun­reinigt wird.

17. Eine Vorrichtung nach Patentanspruch I und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verschiebung der magnetischen Partikel anhand von Induktionsströmen detektiert wird.

18. Ein Probenbehälter, dadurch gekennzeichnet, daß der Probenbehälter seitlich mit einem flexiblen oder festen Material versehen ist, so daß der magnetische Polschuh nach Patentanspruch 1 und 4 in die mikroskopische Nähe der Sonden gebracht werden kann, ohne dabei in direkten Kontakt mit dem Probenvolumen zu kommen, d. h. ohne daß eine Kontaminierung des Probenvolumens durch den Polschuh auftreten kann.

19. Ein Probenbehälter nach Patentanspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß er für Zellkultur verwendet werden kann und insgesamt sterilisierbar ist.

20. Ein Verfahren, bei dem über die laterale Auslenkung magnetischer Sonden, die in mechanischen Kontakt mit lebenden Zellen gebracht werden, elastische und viskose Eigenschaften von Zellen gemessen werden können, dadurch gekennzeichnet, daß über die elastischen und viskosen Eigenschaften auf den pathologischen Zustand der Zellen geschlossen werden kann.

21. Ein Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Sonden über spezifische Antikörper, chemisch oder durch Physisorption an die Plasmamembran gebunden werden.

22. Ein Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Sonden durch Phagozytose, Mikroinjektion, Elektroporation, Scrap loading, Lipidfusion oder spezifische Beschichtung der Kugeln wie z. B. Adenovirus­beschichtung, in das Zytosol gebracht werden.

23. Ein Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Sonden entweder spezifisch oder unspezifisch im Zytosol der Zelle binden.

24. Ein Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß durch das Verfahren auf Defekte der Zelle, die durch die Zellelastizität detektierbar sind, und deren Behebung infolge therapeutischer Maßnahmen geschlossen werden kann.

25. Ein Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Erfolg therapeutischer Maßnahmen gegen die Duchennesche Muskel-Dystrophie auf zellulärer Basis diagnostiziert wird.

26. Ein Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Erfolg therapeutischer Maßnahmen gegen Krebs diagnostiziert wird.

27. Ein Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Erfolg therapeutischer Maßnahmen gegen Krankheiten, die auf einen fehlerhaften Aufbau des extrazellulären Bindegewebes zurückzuführen sind, diagnostiziert wird.

28. Ein Verfahren nach Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zu den magnetischen Sonden unmagnetische Sonden in mechanischen Kontakt mit Zellen gebracht werden und daß über die laterale Auslenkung der unmagne­tischen Sonden infolge der Auslenkung magnetischer Sonden auf den pathologischen Zustand der Zelle geschlossen werden kann.

29. Ein Verfahren nach Patentanspruch 20 und 28, dadurch gekennzeichnet, daß das durch die Auslenkung magnetischer Sonden auf oder in der Zelle hervorgerufene Deformationsfeld anhand der nach Patentanspruch 28 angebrachten unmagnetischen Sonden visualisiert wird.

Description:
Die Erfindung beschreibt ein Magnetkugel-Mikrorheometer, das die Bestimmung viskoelastischer Parameter von Stoffen auf mikroskopischer Skala ermöglicht. Zusätzlich wird ein Verfahren beschrieben, mit dem Veränderungen des Zell-Zytoskeletts festgestellt werden können. Als beschreibende Meßgröße wird dabei das viskoelastische Verhalten des Zytoskeletts verwendet. Zur Verfügung stehende Apparaturen zur Messung viskoelastischer Parameter bedienen sich i. d. R. des folgenden Prinzips: Ein gewisses Volumen des zu untersuchenden Stoffs wird zwischen zwei Flächen (die unterschiedlich geformt sein können) gebracht und durch Bewegung einer dieser Flächen einer Scherspannung ausgesetzt (z. B. R18 Cone and Plate Weissenberg Rheogoniometer, Fa. Sangamo Controls, England). Hierbei gibt es im wesentlichen zwei Betriebsarten, die sich im zeitlichen Verlauf der Scherspannung unterscheiden: Im einfachsten Fall wird der Stoff einer konstanten Scherspannung ausgesetzt. Bei solchen sog. Kriechmessungen kann die Kriechkomplianz J des Stoffs gemessen werden. In einem anderen Modus wirkt eine oszillierende, d. h. sinusförmige Scherspannung auf den Stoff. Dies ermöglicht die frequenzabhängige Messung der viskoelastischen Moduln G' (Speiehermodul) und G'' (Verlustmodul). Auch wenn den gängigen rheologischen Verfahren unterschiedliche Prinzipien zugrundelie­gen können, so sind doch alle diese Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß stets gemittelte viskoelastische Parameter eines makroskopischen Probenvolumens bestimmt werden. Eine Untersuchung von mikroskopischen Probenvolumina, die etwa denen einer einzelnen lebenden Zelle entsprechen, ist nur möglich, wenn man zur Ermittlung der viskoelastischen Eigenschaften des Volumens Sonden einsetzt, die ebenfalls mikroskopische Abmessungen besitzen. In letzter Zeit werden dazu beispielsweise kugelförmige paramagnetische Partikel mit einem Durchmesser im Mikrometerbereich verwendet. Diese Partikel werden in mechanischen Kontakt mit dem zu untersuchenden Stoff gebracht. Bei Anlegen eines externen Magnetfelds (mit geeignetem zeitlichem Verlauf) übertragen die Sonden die auf sie ausgeübte magnetische Kraft auf den Stoff; aus der resultierenden Bewegung der magnetischen Sondenpartikel kann dann auf die viskoelastischen Eigenschaften des Stoffes geschlossen werden (Ziemann et al., 1994; Amblard et al., 1996). Im Falle von Kriech­messungen kann der Zeitverlauf der Kriechkomplianz J mit der Beziehungaus dem gemessenen zeitlichen Verlauf der Partikelposition x (bei konstanter Magnetkraft F0) bestimmt werden, wobei der Faktor g von der experimentellen Geometrie abhängt und sich z. B. für vollständig in den untersuchten Stoff eingebettete sphärische Partikel mit dem Radius R zug = 6fRergibt. Bei frequenzabhängigen Messungen (d. h. oszillierender Kraft F(t) = F0-sinlt mit l: Kreisfrequenz der Schwingung) wird aus dem zeitlichen Verlauf der Partikelposition die frequenzabhängige Schwingungsamplitude der Antwortbewegung des Partikels, x0(l), ermittelt. Zusätzlich wird die Phasenverschiebung zwischen Partikelbewegung und anregender Kraft, dl), gemessen. Aus diesen Meßgrößen können die viskoelastischen Moduln G' und G'' mit den Beziehungenberechnet werden, wobei wiederum der oben genannte Geometriefaktor g Verwendung findet (Ziemann et al., 1994). Mit den bereits existierenden Apparaturen dieser Art können jedoch auf die magnetischen Sondenpartikel lediglich Kräfte ausgeübt werden, die nicht ausreichen, um Auslenkungen der Partikel in oder an lebenden Zellen zu erzielen, was eine Verwendung der beschriebenen Apparaturen für die Bestimmung viskoelastischer Eigenschaften von Zellen unmöglich macht: erreichbare Kräfte auf typische magnetische Sondenpartikel (Dynabeads® der Firma Dynal mit Durchmessern von 2.8 µm und 4.5 µm) liegen im Subnanonewton-Bereich. Gerade die letztgenannte Anwendung ist jedoch aus folgendem Grund von Interesse: Verän­derungen des Zell-Zytoskeletts, die u. a. krankheitsbedingt aufgrund von Veränderungen im genetischen Material auftreten können, können zum einen das mechanische, d. h. das elastische bzw. viskose Verhalten der Zelle so beeinflussen, daß die Zelle Kräften, die von außen auf sie einwirken, nicht mehr in ausreichender Weise standhalten kann (z. B. bei der Duchenneschen Muskel-Dystrophie). Andererseits ist ein intaktes Zytoskelett auch Voraus­setzung für den korrekten Ablauf von Signaltransduktionsvorgängen über die Zellmembran ä die Signalübertragung kann durch Deformationen des Zytoskeletts stattfinden (z. B. bei mechanosensitiven Ionenkanälen in der Membran). Weiterhin werden Defekte im Zytoskelett für die Metastisierung von Tumoren verantwortlich gemacht. Es gibt bereits seit einiger Zeit Versuche zur Durchführung viskoelastischer Messungen an Zellen unter Zuhilfenahme magnetischer Partikel, die in eine Zelle eingebracht werden und durch Ausüben einer magnetischen Kraft lateral ausgelenkt werden; die Messung der Stärke der Auslenkung bei bekannter Kraft auf die Partikel ermöglicht eine Bestimmung elastischer Eigenschaften (Hiramoto, 1969 I&H; Sato et al., 1984). Ein Hauptproblem ist dabei die Erzeugung von Kräften, die zur Auslenkung der Partikel in der Zelle ausreichen. Bei sämtlichen bekannten Ansätzen wurden deshalb unphysiologisch große Partikel (mit Durchmessern von 5 bis 100 µm) verwendet. Ein weiteres Problem liegt in der genauen Bestimmung der Kraft, die auf die Partikel ausgeübt wird. Sie konnte bisher gar nicht oder nur einzeln, d. h. für genau das im jeweiligen Experiment betrachtete Partikel, unter beträchtlichem Aufwand bestimmt werden. Neben Verfahren, bei denen magnetische Partikel lateral ausgelenkt werden, gibt es eine Methode, die auf der Verdrehung ferromagnetischer Partikel basiert (Wang et al., 1993, US Patent-Nr.: 5,486,457). Das dabei verwendete Prinzip beruht auf der Messung der Verände­rung des Gesamt-Magnetfelds, das durch eine große Anzahl magnetisierbarer Partikel erzeugt wird, die infolge eines kurzen Magnetisierungspulses gleichsinnig magnetisiert wurden. Mit dieser Methode wurden viskoelastische Messungen sowohl an Plasma­membranen als auch im Inneren der Zelle (Zytosol) durchgeführt. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zu schaffen, die es ermöglicht, über die laterale Auslenkung magnetischer Partikel viskoelastische Eigenschaften von Stoffen zu messen, wobei die Vorrichtung insbesondere der Anforderung genügen muß, daß mit ihr auf magnetische Partikel mit sehr kleinem Durchmesser (& 5 µm) Kräfte ausgeübt werden können, die ausreichen, Zellen detektierbar zu verformen. Desweiteren muß ein Verfahren gefunden werden, daß es ermöglicht, unter Einsatz dieser Vorrichtung Verän­derungen der Viskoelastizität von Zellen festzustellen. Diese der Erfindung zugrundeliegenden Aufgaben werden durch die Merkmale der Patentansprüche 1 und 20 gelöst. Mit der Erfindung werden dabei verschiedene Vorteile erzielt. Die Erfindung ermöglicht die Ausübung vergleichsweise sehr großer und exakt definierter Kräfte auf mikroskopische magnetische Sondenpartikel, die in mechanischen Kontakt mit der Meßprobe gebracht werden, d. h. beispielsweise an die Plasmamembran von Zellen angekoppelt oder aber in das Zytosol von Zellen eingebettet werden. Die Antwortbewegung der Sondenpartikel auf die externen magnetischen Kräfte erlaubt Rückschlüsse auf das viskoelastische Verhalten der untersuchten Zellen. Dies ermöglicht einen Einsatz sowohl bei der Erforschung von Zytoskelettdefekten und deren Behebung als auch bei der Erforschung von Signalketten. Eine Besonderheit und Neuheit der in Patentanspruch 1 beschriebenen Apparatur ist dabei, daß die magnetischen Sondenpartikel innerhalb der Fokalebene eines zur Beobachtung der Auslenkung der Sondenpartikel eingesetzten Mikroskops verschoben werden (d. h. keine oder nur vernachlässigbare Verschiebungskomponente senkrecht zu dieser Ebene) und daß zusätzlich alle Partikel in dieser Ebene parallel zueinander ausgelenkt werden. Diese Apparatur hat außerdem den Vorteil, daß der die Kraft erzeugende magnetische Feldgradient auf Linien gleichen Abstandes zum Polschuh denselben Wert besitzt. Bei Verwendung von gleichartigen Sondenpartikeln erfahren infolgedessen auf diesen Linien alle Partikel dieselbe Kraft. Möglichkeiten einer für verschiedene Zwecke angepaßten Ausgestaltung der Apparatur sind in den Patentansprüchen 2 bis 17 angegeben. Die Vorrichtung kann insbesondere zur Messung viskoelastischer Parameter von Zellen oder anderen biologischen Materialien (z. B. Biopolymernetzwerken) eingesetzt werden, da einerseits die mikroskopischen Abmessungen der Sondenpartikel eine lokale Messung viskoelastischer Parameter auf mikroskopischer Skala ermöglichen, und andererseits der für die Untersuchung biologischer Proben erforderliche Kraftbereich von dieser Methode abgedeckt wird. Aufgrund der Eigenschaften der Vorrichtung nach Patentanspruch 1 können mehrere Zellen innerhalb einer Probe untersucht werden, ohne daß für jede Zelle eine gesonderte Kalibration durchgeführt werden muß. Die typischen Lateralabmessungen von einzelnen Zellen (beispielsweise von menschlichen Fibroblasten oder Muskelzellen) liegen im Bereich von einigen zehn Mikrometern, was den Einsatz von Sondenpartikeln mit deutlich kleineren Abmessungen erforderlich macht. Die Erfindung ermöglicht erstmals die Verwendung von kugelförmigen Sondenpartikeln mit Durchmessern von unterhalb fünf Mikrometern für Messungen an Zellen, zu deren Deformation Kräfte im Nanonewton-Bereich nötig sind. Der magnetische Polschuh der Vorrichtung kann die Form einer unter spitzem Winkel zulaufenden geraden Kante besitzen, was den Vorteil besitzt, daß die auf gleichartige Sondenpartikel ausgeübte Kraft nur von ihrem Abstand zu dieser Kante abhängt (d. h. in der Beobachtungsebene keine Abhängigkeit senkrecht zur Kraftrichtung). Dadurch wird die Kraftkalibrierung der Methode, die die Grundlage für die quantitative Ermittlung von viskoelastischen Parametern bildet, erheblich vereinfacht, da insbesondere bei Verwendung magnetischer Sonden mit einheitlichem, definiertem Durchmesser (sog. monodisperser Sonden) nur eine Abhängigkeit vom Polschuhabstand zu berücksichtigen ist. Die typischen Auslenkungen der Sondenpartikel als Antwort auf die magnetischen Kräfte liegen im Mikrometerbereich und darunter. Zur Beobachtung dieser Antwortbewegungen ist deshalb ein handelsübliches Mikroskop besonders geeignet. Die Apparatur kann so ausgeführt werden, daß sie mit geringem Aufwand auf einem derartigen Mikroskop montiert werden kann, so daß dadurch die Methode allen gängigen lichtmikroskopischen Unter­suchungsmethoden (z. B. Durchlicht-, Phasenkontrast- oder Fluoreszenzmikroskopie) zugänglich gemacht werden kann. Bei Einsatz derartiger mikroskopischer Beobachtungstechniken kann die Antwortbewegung der Sondenpartikel mit Hilfe von Bildverarbeitungstechniken quantifiziert werden. Die Verschiebung der Partikel in videomikroskopischen Bildsequenzen kann hierbei automatisch mit einer Partikelverfolgungs-Software bestimmt werden, wobei die Genauigkeit der relativen Positionsbestimmung im Bereich weniger Nanometer liegen kann. Zur Messung viskoelastischer Parameter an bestimmten Orten innerhalb des Proben­volumens (also beispielsweise an einer bestimmten {¯15544DEA119745807 DE990421 Zelle) kann der magnetische Polschuh mittels einer Mikrometerschraube auf einen bestimmten Abstand zum untersuchten Partikel justiert werden. Dadurch kann der Polschuh einerseits so nahe an das Partikel herangebracht werden, daß ausreichend hohe Kräfte erzeugt werden können, und andererseits kann ein Abstand eingestellt werden, für den eine Kalibrierung bereits erfolgt ist. Die Messung dieses Abstands kann hierbei mit bildverarbeitungstechnischen Methoden erfolgen, da Sonden­partikel und Polschuh gleichzeitig im Mikroskopbild sichtbar sein können. Die Apparatur kann mit einer mikromanipulatorischen Methode (beispielsweise der sog. Mikropipetten-Technik) kombiniert werden, wodurch man über die bei auf einem Substrat adhärierten Zellen möglichen Scherdeformationen hinaus nahezu beliebige Kraftrichtungen in bezug auf die Zelle erzeugen kann, da eine mit Hilfe dieser Technik festgehaltene Zelle bezüglich der Kraftrichtung nahezu beliebig orientiert werden kann. Solche mikromani­pulatorischen Verfahren können überdies dazu verwendet werden, die Sondenpartikel gezielt auf bestimmten Stellen der Zelloberfläche zu plazieren. Eine Erweiterung der Methode kann durch den zusätzlichen Einsatz unmagnetischer Sondenpartikel erreicht werden. Befinden sich auf einer Zelle ein magnetisches und weitere unmagnetische Partikel, so kann aus der Verschiebung der unmagnetischen Partikel bei Ausübung einer Kraft auf das magnetische Partikel der Effekt der punktuellen Deformation auf die gesamte Zelle, d. h. also das Deformationsfeld, untersucht werden. Außerdem kann aus der Verschiebung der unmagnetischen Partikel auf viskoelastische Parameter an den Positionen dieser Partikel geschlossen werden. Damit ist die Erfassung derartiger Parameter an unterschiedlichen Orten der Zelle gleichzeitig möglich; dies kann nicht durch mehrere magnetische Partikel geschehen, da die durch sie erzeugten lokalen Magnetfelder und Deformationen sich gegenseitig beeinflussen können. Eine Verunreinigung des untersuchten Stoffs durch das Material des Polschuhs (beispiels­weise eine Kontamination der Zellen durch für sie toxisches Eisen) kann auf einfache Weise dadurch verhindert werden, daß der Polschuh entweder in geeigneter Weise beschichtet wird (z. B. durch Aufbringen eines nichttoxischen Zweikomponentenlacks) oder mit einem geeigneten Material überzogen wird (z. B. einer Latexschicht). Alternativ zur Detektion der Antwortbewegung mittels digitaler Bildverarbeitungsmethoden kann die Verschiebung der magnetischen Sondenpartikel über die Messung eines in einer Meßspule induzierten elektrischen Stroms detektiert werden. In diesem Fall kann auf eine Beobachtung mit mikroskopischen Techniken verzichtet werden. Patentanspruch 18 beschreibt einen Probenbehälter, der mit der Apparatur nach Patent­anspruch 1 verwendet werden kann. Seine Verwendung verhindert Verunreinigungen des untersuchten Stoffes durch den Polschuh des Magneten, da Polschuh und Stoff durch eine flexible oder feste Behälterwand getrennt sind und der Polschuh dadurch nicht in direkten Kontakt mit dem Stoff kommt. Patentanspruch 19 ist eine Ausgestaltung dieses Behälters. Seine Verwendung ist vorteilhaft bei Untersuchungen an Zellen, die in diesem Behälter vor der Messung kultiviert werden können (sog. Zellkulturbehälter). Der Behälter kann wie andere handelsübliche Zellkultur­behälter mit gängigen Verfahren sterilisiert werden (z. B. durch Autoklavieren). Zur Messung können die Zellen im Behälter belassen werden und eine Kontamination der Zellen durch den Polschuh des Magneten wird verhindert. Patentanspruch 20 beschreibt ein Verfahren, daß über die Bestimmung viskoelastischer Parameter unter Einsatz der in Patentanspruch 1 beschriebenen Apparatur einen Rückschluß auf den pathologischen Zustand einzelner Zellen zuläßt. Dies unterscheidet das Verfahren von gängigen Methoden, die lediglich die Bestimmung von Mittelwerten (d. h. aus der Bewegung mehrerer magnetischer Sondenpartikel resultierenden Werten) der viskoelasti­schen Parameter erlauben. Eine Ausgestaltung dieses Verfahrens und mögliche Einsatzbereiche beschreiben die Patentansprüche 21 bis 29. Entsprechend der in Patentanspruch 1 beschriebenen Apparatur werden die magnetischen Sondenpartikel in mechanischen Kontakt mit den zu untersuchenden Zellen gebracht. Dies kann beispielsweise über spezifische Antikörperbindung, chemische Wechselwirkung oder Physisorption geschehen. Alternativ können die magnetischen Sondenpartikel durch Phagozytose (d. h. selbsttätige Aufnahme durch die Zelle), Mikroinjektion (Injektion der Partikel in das Innere der Zellen mit Hilfe von Mikrokanülen, die die Zellmembran penetrieren), Elektroporation (spontane Bildung von Öffnungen in der Zellmembran durch Anlegen elektrischer Felder), Scrap loading (Porenbildung durch Ausübung starker Scherkräfte auf die Zellmembran), Lipidfusion (Verschmelzen von Lipidvesikeln, die die Sondenpartikel enthalten, mit der Zellmembran) oder spezifische Beschichtung (z. B. Adenovirusbeschichtung) in das Zytosol gebracht werden. Die derart in die Zelle eingebrachten Sondenpartikel können dann entweder spezifisch oder unspezifisch an bestimmte Bereiche innerhalb der Zelle angebunden werden. Mit Hilfe dieses Verfahrens können krankhafte Veränderungen von Zellen, die Auswir­kungen auf die viskoelastischen Eigenschaften der Zelle haben, diagnostiziert werden. Darüberhinaus kann der Erfolg therapeutischer Maßnahmen zur Behebung solcher Veränderungen überprüft werden. Zu Krankheiten, die derartige Veränderungen hervorrufen können, gehören beispielsweise die Duchennesche Muskel-Dystrophie und verschiedene Formen krebsartiger Erkrankungen. Darüberhinaus können mit diesem Verfahren auch krankhafte Veränderungen des extrazellulären Bindegewebes diagnostiziert werden. Wenn ein Zusammenhang zwischen dem pathologischen Zustand der Zelle und ihrem viskoelastischen Verhalten besteht, so können auch, wie bereits oben beschrieben, zusätzlich zu den magnetischen unmagnetische Partikel eingesetzt werden, aus deren Verhalten bei Auslenkung der magnetischen Partikel sich ebenfalls viskoelastische Parameter ableiten lassen. In diesem Fall muß nicht notwendig eine Berechnung viskoelastischer Parameter erfolgen, da auf eine Intaktheit der Zelle auch direkt aus der Stärke der Auslenkung nichtmagnetischer Partikel bei gegebener Auslenkung eines magnetischen Partikels geschlossen werden kann.LiteraturlisteAmblard, F., B. Yurke, A. Pargellis, and S. Leibler. 1996. A magnetic manipulator for studying local rheology and micromechanical properties of biological systems. Rev. Sci. Instrum. 67: 818ä827.Hiramoto, Y. 1969. Mechanical Properties of the Protoplasm of the Sea Urchin Egg. I. Unfertilized Egg. Exp. Cell Res. 56: 201ä208.Hiramoto, Y. 1969. Mechanical Properties of the Protoplasm of the Sea Urchin Egg. II. Fertilized Egg. Exp. Cell Res. 56: 209ä218.Sato, M., T. Z. Wong, D. T. Brown, and R. D. Allen. 1984. Rheological properties of living cytoplasm: A preliminary investigation of squid axoplasm (Loligo pealei). Cell Motil. 4: 7ä23.Wang, N., J. P. Butler, and D. E. Ingber. 1993. Mechanotransduction Across the Cell Surface and Through the Cytoskeleton. Science 260: 1124ä1127.Ziemann, F., J. Rädler, and E. Sackmann. 1994. Local Measurements of Viscoelastic Moduli of Entangled Actin Networks Using an Oscillating Magnetic Bead Micro-Rheometer. Biophys. J. 66: 2210ä2216. Beschreibung von Ausführungsbeispielen Magnetkugel-Mikrorheometer Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Abbildungen dargestellt und werden im folgenden näher beschrieben. Fig. 1 zeigt eine maßstäbliche schematische Übersicht über die Apparatur und eine Detailvergrößerung des Probenbehälters sowie des probenseitigen Polschuhendes. Fig. 2 zeigt typische Kalibrierungskurven (Abhängigkeit der auf die Sondenpartikel wirkenden Kraft vom Abstand zwischen Sondenpartikel und Polschuh) für monodisperse sphärische Magnetpartikel mit dem Durchmesser 4.5 µm und einem Eisengehalt von ca. 20% (Dynal Dynabeads® M-450) bei verschiedenen Spulenströmen im Bereich von 250 mA bis 2500 mA. Fig. 3 zeigt die schematische Darstellung einer Möglichkeit zur Kombination von Magnetkugel-Mikrorheometer und Mikropipetten-Technik. Fig. 4 zeigt eine Schemazeichnung eines Probenbehälters für die Zellkultur, der aufgrund der mit einer elastischen Latexschicht verschlossenen Öffnung in der Seitenwand zur Verwendung in Verbindung mit dem Magnetkugel-Mikrorheometer geeignet ist. Fig. 5 zeigt den typischen zeitlichen Verlauf der Partikelposition bei einer Kriechmessung an der Plasmamembran einer Fibroblastenzelle (obere Kurve). Der Zeitverlauf der auf das Partikel wirkenden Kraft ist in der unteren Kurve wiedergegeben. Fig. 6 zeigt den typischen zeitlichen Verlauf von Partikelposition (Symbol: ¿) und Kraft auf das Partikel (Symbol: +) bei einer oszillatorischen Messung in einem Biopolymernetzwerk. Wie in Fig. 1 gezeigt, wird ein Elektromagnet (1) mit Weicheisenkern (2), eine Mikrometer­schraube (3) zur Positionierung des Magneten und eine Probenkammer (4) auf dem verschiebbaren Objekttisch eines handelsüblichen invertierten Mikroskops montiert. Die Probenkammer (4) besitzt seitlich eine Öffnung, durch die das Ende des Eisenkerns (2) eingeführt werden kann. Der Weicheisenkern (2) ist an seinem probenseitigen Ende so geformt, daß er in einer geraden Kante unter spitzem Winkel (z. B. 60°) zuläuft. Die Unterseite des Kerns (2) ist eine ebene Fläche, die parallel zu der durch das Deckglas (5) definierten Ebene ist. Die Kernunterseite befindet sich so nahe wie möglich oberhalb dieses Deckglases (etwa 20 bis 50 µm). Die probenseitige Stirnseite des Eisenkerns (2) ist ebenfalls eine ebene Fläche (Stirnseite und Unterseite laufen unter einem spitzen Winkel in der Kante zusammen). Unterhalb der durch das Deckglas (5) abgeschlossenen Probenkammer befindet sich das Objektiv (6) eines invertierten Mikroskops. Mit Hilfe einer Mikrometerschraube (3) kann die Position des Magneten (1) so verändert werden, daß im Gesichtsfeld des Mikro­skops das zu beobachtende Sondenpartikel (7) und die Kante des Eisenkerns (2) gleichzeitig sichtbar sind. Dies ermöglicht eine genaue Bestimmung des Abstands zwischen Sonden­partikel und Kante mit Bildverarbeitungstechniken. Dieser Abstand wird benötigt, um eine genaue Aussage über die auf das Sondenpartikel ausgeübte Kraft machen zu können. Eine Kalibrierung des Magnetkugel-Mikrorheometers, die erforderlich ist, um die auf die magnetischen Sondenpartikel ausgeübten Kräfte zu ermitteln, kann folgendermaßen durchgeführt werden: Die Sondenpartikel werden bei definierter Stromstärke I im Elektromagneten durch eine Newtonsche Flüssigkeit mit bekannter Viskosität h gezogen. Bestimmt man die Geschwindigkeit n der Sondenpartikel, so kann man bei bekanntem Radius R der Partikel die Kraft F auf die Partikel durch Zuhilfenahme des Stokesschen GesetzesF = 6fhRnberechnen. Das Ergebnis einer derartigen Kalibrierung einer Apparatur nach Fig. 1 zeigt Fig. 2. Aus Fig. 2 wird ersichtlich, daß die auf die Sondenpartikel ausgeübte Kraft einerseits stark vom Abstand zwischen Polschuhkante (2) und Sondenpartikel (7) und andererseits von der Stärke des den Elektromagneten (1) durchfließenden Stromes abhängt. Ferner zeigt Fig. 2, daß mit Hilfe der Apparatur nach Fig. 1 Kräfte von bis zu ca. 10 nN auf paramagnetische Sondenpartikel des Typs Dynabeads® M-450 (Durchmesser 4.5 µm) ausgeübt werden können. Ein Beispiel für die Kombination des Magnetkugel-Mikrorheometers mit einer mikromani­pulatorischen Technik, hier der Mikropipetten-Technik, zeigt Fig. 3. Eine mit einer Mikromanipulatoreinheit (8) verbundene Glas-Mikropipette (9) wird durch eine weitere, dem Magnetspulenkern (10) gegenüberliegende Öffnung in die Probenkammer (11) eingeführt. Die Mikropipette (9) kann z. B. dazu verwendet werden, Zellen durch Erzeugung eines Unterdruckes in der Pipette anzusaugen und mit einer beliebigen Orientierung bezüglich des Spulenkerns (10) festzuhalten. Eine Möglichkeit zur Ausgestaltung des zur Zellkultur geeigneten Probenbehälters nach Patentanspruch 18 und 19 zeigt Fig. 4. Die Wand des Probenbehälters (12) besitzt entweder an einer Stelle eine Öffnung (13), die mit einem flexiblen Material verschlossen ist, oder ist an einer Stelle so geformt, daß sie sich der Form des Weicheisenkerns (2) genau anpaßt. Eine Möglichkeit zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung der Kriechkomplianz J besteht darin, an den Elektromagneten, nachdem die Kante seines Weicheisenkerns wie oben beschrieben an die zu untersuchende Sondenkugel herangeführt wurde, eine konstante elektrische Spannung anzulegen. Damit wird eine konstante Kraft auf die Sondenkugel ausgeübt. J kann berechnet werden, wenn der Betrag der Kraft auf die Sondenkugel bekannt ist und die Auslenkung der Sondenkugel in Abhängigkeit von der Zeit bei Anlegen der Kraft gemessen wird. Fig. 4 zeigt eine typische Auslenkungs-Zeit-Kurve für eine derartige Messung (obere Kurve). Zur weiteren Verdeutlichung ist in der unteren Kurve der dazugehörige Zeitverlauf der Kraft wiedergegeben. Eine Möglichkeit zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung der viskoelastischen Moduln G' und G'' in Abhängigkeit von der Kreisfrequenz l besteht darin, an den Elektromagneten, nachdem die Kante seines Weicheisenkerns wie oben beschrieben an die zu untersuchende Sondenkugel herangeführt wurde, eine sinusförmige elektrische Spannung der Formanzulegen. Hierbei ist zu beachten, daß auf die Sondenpartikel nur anziehende Kräfte ausgeübt werden können. Daher ist es erforderlich, an den Elektromagneten eine zwischen Null und einem Maximalwert U0 oszillierende Spannung anzulegen. Dadurch oszilliert das Sondenpartikel nicht um seine entspannte Ruhelage, sondern um eine einer bestimmten konstanten Vorspannung entsprechenden Position. Fig. 6 zeigt den typischen zeitlichen Verlauf von Partikelposition (Symbol: ¿) und Kraft auf das Partikel (Symbol: +) bei einer solchen Messung. Aus derartigen Kurven können die zur Bestimmung der viskoelastischen Moduln erforderlichen Meßgrößen (Schwingungsamplitude des Sondenpartikels und Phasenverschiebung zwischen oszillierender Kraft und Antwortbewegung des Partikels) abgeleitet werden.