Title:
System zur Unterscheidung fluoreszierender Molekülgruppen durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung
Kind Code:
A1


Abstract:
A system and process are disclosed for distinguishing at least two types of molecule groups having a different degree of fluorescence and bound to an analyte molecule by time resolved fluorescence measurement. A light source (5) irradiates a first sample volume with light suitable for exciting the fluorescence of the at least two types of molecule groups. A detector (2) detects the fluorescent radiation emitted by a second sample volume which at least partially overlaps the first sample volume. A control unit is designed to activate the light source for a time interval T1 and to activate the detector for a time interval T3 after a time interval T2 has elapsed. The irradiation and detection of emitted fluorescent radiation are carried out at least 1000 times per millisecond. The detector signals recorded by a recording unit during the time intervals T3 are evaluated by an evaluation unit. The molecule groups contained in the overlapping sample volume are determined from the variation in time of the signals during the time interval T3.



Inventors:
MUELLER RALPH DIPL PHYS (DE)
SAUER MARKUS DIPL CHEM DR (DE)
ZANDER CHRISTOPH DR (DE)
Application Number:
DE19634873A
Publication Date:
03/12/1998
Filing Date:
08/29/1996
Assignee:
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, 68305 MANNHEIM, DE



Claims:
1. System zur Unterscheidung von mindestens zwei unterschiedlich fluoreszierenden Arten von Molekülgruppen, die an Analytmoleküle gebunden sind, durch zeitaufge­löste Fluoreszenzmessung mit

ä einer Lichtquelle, die ein erstes Probevolumen mit Licht bestrahlt, das geeignet ist, die mindestens zwei Arten von Molekülgruppen zur Fluoreszenz anzuregen,

ä einem Detektor zur Detektion von aus einem zweiten mit dem ersten Probe­volumen zumindest teilweise überlappenden Probevolumen emittierter Fluores­zenzstrahlung,

ä einer Steuereinheit, die dazu ausgelegt ist,

a) die Lichtquelle für ein Zeitintervall T£ zu aktivieren und

b) nach Verstreichen eines Zeitintervalles T¥ den Detektor für ein Zeitintervall T· zu aktivieren,

Description:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein System zur Unterscheidung von mindestens zwei unterschiedlich fluoreszierenden Arten von Molekülgruppen, die an Analytmoleküle gebun­den sind, durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung mit einer Lichtquelle, die ein erstes Probevolumen mit Licht bestrahlt, das geeignet ist, die mindestens zwei Arten von Mole­külgruppen zur Fluoreszenz anzuregen sowie mit einem Detektor zur Detektion von aus einem zweiten, mit dem ersten Probevolumen zumindest teilweise überlappenden Probe­volumen emittierter Fluoreszenzstrahlung und mit einer Steuereinheit, die dazu ausgelegt ist, die Lichtquelle für ein Zeitintervall T£ zu aktivieren und nach Verstreichen eines Zeit­intervalls T¥ den Detektor für ein Zeitintervall T· zu aktivieren, wobei die Bestrahlung und Detektion emittierter Fluoreszenzstrahlung mindestens 1000fach pro Millisekunde durchge­führt wird, die während der Zeitintervalle T· mit einer Aufnahmeeinheit aufgenommenen Detektorsignale durch eine Auswerteeinheit ausgewertet werden und aus den zeitlichen Signalverläufen im Zeitintervall T· ermittelt wird, welche der mindestens zwei Molekül­gruppen im überlappenden Probevolumen enthalten ist. Die vorliegende Erfindung fällt in das Gebiet der chemischen Analytik durch Detektion an­geregter Fluoreszenzstrahlung. Derartige analytische Verfahren haben sehr breite Anwen­dungsmöglichkeiten, wobei jedoch in letzter Zeit stärker das Anwendungsgebiet der Bio­chemie in den Vordergrund tritt. Insbesondere kann die Detektion von Fluoreszenzstrahlung herangezogen werden, eine Sequenzierung von Nukleinsäuren vorzunehmen, wie bei­spielsweise in EP-B-0 157 280 beschrieben. Bei diesem Verfahren zur Sequenzierung wer­den klonierte DNA-Stränge hergestellt, von denen Fragmente gebildet werden, deren Ende mit Basen A, G, C und T versehen sind, die fluoreszierend markiert sind. Weiterhin sind im Stand der Technik Apparaturen bekannt, wie beispielsweise in US-5,252,834 beschrieben, mit denen es über eine geeignete zeitliche Abstimmung des Anregungslichtes und des de­tektierten Fluoreszenzlichtes möglich ist, unerwünschte Hintergrundstrahlung auszu­schließen. Die in US-5,252,834 beschriebene Apparatur verwendet jedoch eine apparativ aufwendige spektrale Analyse der emittierten Fluoreszenzstrahlung, um Analytmoleküle zu identifizieren. In der EP-A-0 563 998 wird bereits ein Verfahren zur Detektion von Biomolekülen be­schrieben, das auf einer zeitaufgelösten Laserspektroskopie basiert. Das hier beschriebene Verfahren basiert darauf, daß die nachzuweisenden Moleküle durch verschiedene Fluores­zenzfarbstoffe markiert werden, die unterschiedliche Fluoreszenzlebensdauern besitzen. Die Fluoreszenzlebensdauern werden durch eine zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie voneinander unterschieden, wobei zur Unterdrückung von Hintergrundstrahlung die emittierte Fluoreszenz gegenüber dem Anregungslicht zeitlich verzögert detektiert wird. Die beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen des Standes der Technik basieren darauf, daß eine größere Zahl von Molekülen gleicher Fluoreszenzeigenschaften vorhanden sind, so daß ein Nachweis und eine Charakterisierung der fluoreszierenden Moleküle möglich ist. Um dies zu erreichen, müssen entweder ausreichend hohe Molekülkonzentrationen vor­handen sein oder es muß ein ausreichend großes Probevolumen bestrahlt werden. Beide Vorgehensweisen, die darauf abstellen, Fluoreszenzlicht von einer größeren Zahl von Molekülen zu empfangen, besitzen den Nachteil, daß das Molekülensemble nicht not­wendigerweise homogen sein muß, d. h. daß gegebenenfalls Moleküle unterschiedlicher Fluoreszenzeigenschaften detektiert werden. Wird eine Auswertung der Fluoreszenzstrah­lung gemäß der Fluoreszenzlebensdauer vorgenommen, so wird dem betrachteten Mole­külensemble eine gemeinsame und daher gemittelte Fluoreszenzlebensdauer zugeordnet. Dies kann zu einem Versagen der Zuordnung bzw. zu einer Fehlinterpretation führen. Weiterhin besitzen die Verfahren des Standes der Technik den Nachteil, daß bei Vor­handensein von nur sehr wenigen Molekülen einer Sorte aufgrund statistischer Signal­schwankungen sowie aufgrund geringer Signalintensitäten keine sichere Zuordnung zu einer Gruppe von Molekülen erfolgen kann. Die vorgenannten Nachteile des Standes der Technik werden durch ein System zur Unter­scheidung unterschiedlicher Arten fluoreszierender Molekülgruppen gemäß Anspruch 1 behoben. Insbesondere ist mit einem System der vorliegenden Erfindung eine sichere Unter­scheidung und Zuordnung der untersuchten Moleküle zu bestimmten Gruppen auch dann möglich, wenn nur wenige oder gar einzelne Moleküle im untersuchten Probevolumen vor­handen sind. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, daß es geeignet ist, sehr kleine Probevolumina zu untersuchen. Dies eröffnet die Möglichkeit, Detektionssysteme, wie sie beispielsweise bei der DNA-Sequenzierung eingesetzt werden, stark zu miniaturi­sieren. Im Bereich der chemischen Analytik haben sich Fluoreszenztechniken aufgrund ihrer Ein­fachheit und hohen Empfindlichkeit ein breites Anwendungsgebiet erschlossen. Insbe­sondere stehen bei der Fluoreszenzanalytik solche Verfahren im Vordergrund, bei denen nicht die Eigenfluoreszenz der Analytmoleküle ausgenutzt wird, sondern die Analytmo­leküle zunächst spezifisch an geeignet fluoreszierende Molekülgruppen gebunden werden. Daher sind Fluoreszenztechniken, besonders in Verbindung mit immunologischen Assays oder Nukleinsäurenachweisen, von großer Bedeutung, da hier spezifisch immunologische Affinitäten oder selektive Hybridisierungseigenschaften von Oligonukleotiden an Analyt-Nukleinsäuren ausgenutzt werden können. Die spezifisch an den Analyten bindefähigen Substanzen, wie z. B. Antikörper oder Detektionsoligonukleotide, werden im Folgenden als Detektionsmoleküle bezeichnet. Sie sind ihrerseits direkt oder indirekt an fluoreszierende Molekülgruppen gebunden. Die fluoreszierenden Molekülgruppen können weitestgehend unabhängig von dem im jeweiligen Fall nachzuweisenden Analytmolekül und der spezifisch bindefähigen Substanz ausgewählt werden. Bevorzugt werden solche Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, die günstige Eigenschaften, wie eine hohe Quantenausbeute, hohe Photostabilität und/oder einen geeigneten Absorptionsbereich aufweisen, ohne daß diese Auswahl wesent­lichen Einschränkungen durch das jeweils nachzuweisende Analytmolekül unterworfen ist. Fluoreszenztechniken sind in ihrer Empfindlichkeit hauptsächlich durch die Untergrund­fluoreszenz der Probe und gegebenenfalls des Probenträgers limitiert. Erfindungsgemäß wird die Detektion emittierten Fluoreszenzlichtes erst vorgenommen, wenn nach der Fluoreszenzanregung eine vorgegebene Zeit verstrichen ist. Durch das Setzen eines Zeit­fensters zwischen der Fluoreszenzanregung und der Detektion emittierter Fluoreszenz wird verhindert, daß die spontane Emission der Probe bzw. des Probengefäßes zum gemessenen Fluoreszenzsignal beiträgt. Das Zeitintervall T¥ zwischen Bestrahlung des Probevolumens und Aktivierung des Detektors liegt bevorzugt zwischen 0,1 und 10 ns. Eine weitere Maßnahme, die erfindungsgemäß zur Empfindlichkeitssteigerung vorge­nommen wird, besteht darin, daß lediglich ein kleines Probevolumen vorzugsweise zwischen 0,05 und 10 Femtoliter mit Licht bestrahlt wird, das geeignet ist, die fluoreszierenden Molekülgruppen anzuregen. Auf diese Weise kann verhindert werden, daß Fluoreszenz von außerhalb des untersuchten Bereiches zum Signal beiträgt. Herkömmliche Verfahren zur Fluoreszenzanalyse gehen davon aus, daß die emittierte Fluoreszenz von einem Molekül­ensemble ausgeht, das mehrere tausend oder mehrere hunderttausend Moleküle umfaßt. Hierdurch ist einerseits gewährleistet, daß die Signalintensität ausreichend hoch ist und weiterhin eine statistische Verteilung von Fluoreszenzlebensdauern sowie Fluoreszenz­frequenzen gegeben ist. Bei den erfindungsgemäß untersuchten sehr kleinen Probenvolu­mina liegen im bestrahlten Probenvolumen jedoch nur wenige Moleküle vor. Erfindungs­gemäß wurde gefunden, daß eine statistische Auswertung der Fluoreszenzlebensdauer der bestrahlten Moleküle trotz der geringen Zahl von Molekülen möglich ist, indem das gleiche Probevolumen mindestens 1000fach innerhalb einer Millisekunde bestrahlt und nach den Be­strahlungen die emittierte Fluoreszenzstrahlung ausgewertet wird. Diese Erkenntnis steht im Widerspruch zu den in der einschlägigen Literatur vorherrschenden Ansichten. In dem Artikel "Single Molecule Detection in Capillary Electrophoresis: Molecular shot noise as a fundamental limit to chemical analysis" in Analytical Chemistry, Band 68, Seiten 690ä696 (1996) von D. Chen und N.J. Dovichi, wird beschrieben, daß für eine Fluoreszenzanalyse mindestens ein Ensemble von 104 Analytmolekülen vorhanden sein muß, um die durch statistische Schwankungen verursachte Impräzision auf unter 1% zu senken. Mit dem Ver­fahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedoch auch noch mit einem Ensemble be­stehend aus weniger als 104 Molekülen eine verläßliche Unterscheidung der fluoreszieren­den Molekülgruppen vorgenommen werden. Vorzugsweise besteht das Molekülensemble bei der vorliegenden Erfindung sogar aus einem oder wenigen Molekülen gleicher Sorte. Die vorliegende Erfindung kann vorteilhaft im Bereich der klinischen Analytik, insbesondere im Bereich der Immunologie oder Nukleinsäureanalytik, angewandt werden. Analyt­moleküle können demgemäß Antigene, Antikörper, Nukleinsäuren oder Fragmente davon sein. Allgemein kommen als Analytmoleküle jegliche Substanzen in Betracht, an die spezi­fisch Detektionsmoleküle gebunden werden können. Andererseits können auch die Analyt­moleküle selbst erfindungsgemäß nachweisbare fluoreszierende Molekülgruppen enthalten oder an diese gebunden sein. Letzterer Fall tritt insbesondere bei einer Sequenzanalyse von Nukleinsäuren auf beispielsweise ist in diesem Zusammenhang die nach Sanger benannte Methode der Sequenzanalyse zu nennen. Bei dieser Methode wird durch enzymatische Synthese der Gegenstrang zu einer zu sequenzierenden Nukleinsäure aufgebaut. Hierzu wird an eine einzelsträngige Nukleinsäure ein Primer hybridisiert, der unter Einbau von Mononukleotiden elongiert wird. Bei der Sequenzanalyse nach Sanger werden neben den gewöhnlichen Mononukleosid-Triphosphaten auch Mononukleotid-Analoga eingesetzt, die einen Kettenabbruch bewirken, d. h. daß nach ihrem Einbau eine weitere Elongation des Stranges unterbunden wird. Im Rahmen der Sequenzanalyse unter Zuhilfenahme der Fluoreszenzanalytik werden für den Kettenabbruch Mononukleotid-Analoga eingesetzt, die ein Fluoreszenzlabel enthalten. Dabei werden zur Unterscheidung der vier möglichen Mononukleotide unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe verwendet. Im Rahmen der Erfin­dung werden diese Fluoreszenzfarbstoffe durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung unter­schieden und somit festgestellt, durch welche Base der jeweilige Nukleinsäurestrang terminiert ist. Weiterhin kann die vorliegende Erfindung zur Durchführung von Nukleinsäurehybridisie­rungs-Assays eingesetzt werden. Bei einem bevorzugten Testformat wird zunächst eine unmarkierte Fangsonde, in der Regel ein Oligonukleotid, auf einer Oberfläche immobilisiert. Durch Inkubation mit einer Probeflüssigkeit findet eine Hybridisierung zwischen Fangsonde und Analyt (beispielsweise ein PCR-Produkt) statt. Im Falle eines fluoreszenzmarkierten Analyten kann dieser direkt nachgewiesen werden oder der Analyt wird seinerseits wieder­um mit einer fluoreszenzmarkierten Nachweissonde detektiert. Die vorliegende Erfindung kann weiterhin sehr vorteilhaft zum Nachweis und zur Unter­scheidung fluoreszierender Moleküle in Kapillaren eingesetzt werden. Beispielsweise können Mikrokapillaren mit einem Innendurchmesser von 1 bis 2 µm eingesetzt werden, durch die die zu untersuchende Flüssigkeit strömt. Zur Untersuchung wird eine Optik ein­gesetzt, die in einem Bereich der Mikrokapillare deren gesamten Querschnitt oder zu­mindest einen großen Teil davon erfaßt, so daß das Hindurchtreten eines fluoreszierenden Moleküls durch die Kapillare sicher erkannt wird. Mit einer derartigen Anordnung ist es beispielsweise möglich, einzelne Nukleinsäurestränge zu sequenzieren, indem Basen von einem Ende des Nukleinsäurestranges nacheinander abgespalten und unter Beibehaltung der Reihenfolge durch die Kapillare transportiert werden. Eine Verwendung des erfindungsge­mäßen Systems ist weiterhin auch in Verbindung mit konventiellen Techniken, wie HPLC oder CGE, möglich. Weiterhin unterscheiden sich die Farbstoffe, die voneinander unterschieden werden sollen, in ihrer Fluoreszenzlebensdauer. Als Fluoreszenzlebensdauer wird, wie allgemein üblich, die durchschnittliche Zeit bezeichnet, mit der sich ein angeregter Fluoreszenzfarbstoff im ange­regten Zustand befindet. Der Übergang von diesem angeregten Zustand in einen energetisch tiefer liegenden Zustand erfolgt spontan und liegt in der Regel im Bereich von Nanosekun­den. Da es sich bei dem energetischen Übergang des Moleküls um einen quantenmecha­nischen Prozeß handelt, ist die Fluoreszenzlebensdauer eines einzelnen +€+19992DEA119634873 DE980217 Moleküls unbe­stimmt und der Bereich experimentell auftretender Fluoreszenzlebensdauern ist durch die Heisenbergsche Unschärferelation gegeben. Zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer einer Molekülsorte wird im Stand der Technik so verfahren, daß ein ausreichend großes Molekülensemble mit Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt und eine große Anzahl von Molekülen in den angeregten Zustand gebracht wird. Der Übergang der Moleküle in den Grundzustand verläuft im Regelfall nach einer Kinetik erster Ordnung, so daß ein expo­nentielles Zerfallsgesetz vorliegt. Durch Integration der zugrunde liegenden Differential­gleichung erhält man die Signalintensität in Abhängigkeit von der Zeit. Durch Auswertung des gemessenen Signal-Zeitverlaufes kann auf die Fluoreszenzlebensdauer zurückge­schlossen werden. Diese ist, sofern eine Kinetik erster Ordnung vorliegt, die Zeit, nach der die Fluoreszenzintensität auf 1/e abgefallen ist. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß eine Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauer auch für einzelne Moleküle möglich ist, wenn die Vorgehensweise geeignet gewählt wird. Eine Bestimmung der mittleren Fluoreszenz­lebensdauer erfolgt, indem ein und dasselbe Probenvolumen mindestens 1000fach innerhalb einer Millisekunde mit Licht bestrahlt wird, das geeignet ist, die fluoreszierende Molekül­gruppe(n) anzuregen. Bei einer Auswertung der emittierten Fluoreszenzsignale wird davon ausgegangen, daß sich in dem bestrahlten Probevolumen während jeder der Messungen Moleküle der gleichen Sorte befinden. Dies wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß ein kleines Probevolumen vorzugsweise zwischen 0,05 und 10 Femtoliter untersucht wird und durch eine geeignete Verfahrensführung sichergestellt wird, daß sich im bestrahlten Probevolumen im wesentlichen nur Moleküle gleicher Fluoreszenzlebensdauer befinden. Erfindungsgemäß ist es weiterhin wichtig, daß die Messungen an dem Probevolumen inner­halb einer kurzen Zeitspanne, vorzugsweise innerhalb weniger als 50 Millisekunden, statt­finden, damit sich Diffusionsprozesse nicht störend auswirken. Fluoreszenzfarbstoffe, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, besitzen weiterhin eine ausreichend hohe Photostabilität, d. h. die Farbstoffe überstehen eine hohe Zahl von Anregungs- und Zerfallszyklen, ohne sich zu zersetzen. Als besonders geeignet haben sich die in der EP-A-0 563 998 genannten Farbstoffe erwiesen. Vorteilhaft werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 2 Arten von fluoreszierenden Molekülen eingesetzt, deren Fluoreszenzlebensdauer verschieden ist. Im Regelfall bedeutet dies, daß die fluoreszierenden Molekülgruppen als solche unterschiedlich sind. Es sind erfindungsge­mäß jedoch auch Unterscheidungen möglich, bei denen die fluoreszierenden Molekül­gruppen identisch sind, jedoch durch die Wechselwirkung von fluoreszierender Molekül­gruppe und dem Molekül, an das sie gebunden ist, eine detektierbare Veränderung der Fluoreszenzlebensdauer erfolgt. Ein System zur Unterscheidung von Fluoreszenzfarbstoffen durch zeitaufgelöste Fluores­zenzmessung besitzt eine Lichtquelle, mit der ein erstes Probevolumen bestrahlt wird. Ge­eignete Lichtquellen sind insbesondere Laser, vorzugsweise Diodenlaser und auch Blitz­lampen. Die Lichtquellen müssen ausreichend leistungsstark und mit hoher Frequenz repe­tierbar sein. Letztere Eigenschaft ist dann gegeben, wenn die Lichtquelle sowohl kurzzeitig aktiviert als auch gelöscht werden kann. Vorzugsweise liegt die Repetitionsfrequenz der verwendeten Lichtquellen oberhalb 10 MHz und besitzt Pulshalbwertszeiten von weniger als 1 Nanosekunde. Der Emissionsbereich verwendeter Lichtquellen wird so gewählt, daß im Absorptionsbereich der Fluoreszenzfarbstoffe eine ausreichende Lichtleistung, vorzugsweise oberhalb 100 mW, vorhanden ist. Andererseits können auch bei Vorhandensein einer geeigneten Lichtquelle die Fluoreszenzfarbstoffe so ausgewählt werden, daß ihr Absorp­tionsbereich geeignet ist. Aufgrund der hauptsächlichen Verwendung des erfindungsgemäßen Systems für wäßrige Lösungen sind Lichtquellen mit Emissionswellenlängen oberhalb 600 nm bevorzugt. Insbe­sondere hat sich eine Anwendung der vorliegenden Erfindung im Infrarotgebiet als vorteil­haft erwiesen, da hier einerseits geringe Fluoreszenzhintergrundstrahlungen durch die Probe auftreten als auch geeignete Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauern vor­handen sind. In dem besonders bevorzugten Wellenlängenbereich von 630 bis 670 nm gibt es nur sehr wenige Moleküle, die zur Fluoreszenz angeregt werden können, daher ist in diesem Bereich die natürliche Untergrundfluoreszenz besonders gering. Die Bestrahlung des ersten Probevolumens mit der Lichtquelle kann direkt, d. h. ohne eine zwischengeschaltete Optik, erfolgen, wenn der von der Lichtquelle ausgesandte Lichtstrahl bereits ausreichend stark fokussiert ist, um das erfindungsgemäß verwendete, sehr kleine Probevolumen zu gewährleisten. Vorzugsweise wird jedoch der Anregungslichtstrahl durch eine mikroskopische Optik auf einen Probenbereich fokussiert. Es ist vorteilhaft, von der Probe emittierte Fluoreszenzstrahlung durch dieselbe Mikroskopoptik aufzufangen und auf einen Detektor zu leiten. Durch die Verwendung der selben Optik für die Einkoppelung des Anregungslichtes und Auskoppelung der Fluoreszenzstrahlung kann gewährleistet werden, daß die detektierten Signale aus einem eng begrenzten Raumbereich stammen. Bei Verwendung einer mikroskopischen Optik ist der Raumbereich in Richtung des Strahles durch die abnehmende Schärfe mit räumlicher Entfernung von der Fokalebene durch eine Blende begrenzt. In der Ebene senkrecht zum Lichtstrahl ist das Probevolumen durch die Güte der Fokussierung und der Blende begrenzt. Bestrahlung der Probe und Detektion von Fluoreszenzstrahlung wird erfindungsgemäß so vorgenommen, daß ein erstes Probevolumen bestrahlt wird und Fluoreszenzstrahlung aus einem zweiten Probevolumen detektiert wird, das zumindest teilweise mit dem ersten Probevolumen überlappt. Eine besonders gute Überlappung von bestrahltem und ausge­wertetem Probenbereich kann erzielt werden, wenn sowohl Einkoppelung des Anregungs­lichtes als auch Auskoppelung der Fluoreszenzstrahlung durch die gleiche Optik erfolgt. Alternativ zu der vorstehend genannten Ausführungsform kann die Bestrahlung der Probe in einer ersten Richtung mit der Lichtquelle erfolgen und emittierte Fluoreszenzstrahlung davon unabhängig aus einer zweiten Richtung mit einer Mikroskopoptik aufgefangen wer­den. Vorzugsweise wird hierbei in einer sogenannten 90°-Anordnung gearbeitet, d. h. An­regungs- und Detektionsstrahl bilden einen rechten Winkel zueinander. Von der Probe ausgehende Fluoreszenzstrahlung wird durch ein optisches System, vor­zugsweise eine Mikroskopoptik, auf den Detektor geleitet. Im Detektionsstrahlengang können gegebenenfalls optische Filter eingebracht werden, die Hintergrundstrahlung her­ausfiltern. Es ist jedoch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß auf optische Filter ver­zichtet werden kann. Bei Verwendung einer Mikroskopoptik zur Aufnahme emittierter Fluoreszenz wird das von der Mikroskopoptik ausgehende Strahlenbündel durch ein weite­res optisches System auf den Detektor fokussiert. Bei dieser sogenannten konfokalen An­ordnung ist es möglich, Detektoren mit kleiner aktiver Fläche einzusetzen. Der Querschnitt der Detektorfläche liegt dabei vorzugsweise unterhalb 500 µm. Geeignete Detektoren verfügen ferner über eine hohe Photonenachweisempfindlichkeit, um mit den bei der gewählten Anordnung auftretenden geringen Intensitäten eine Auswertung zu ermöglichen. Geeignet sind besonders Halbleiter Silizium-Detektoren aufgrund ihrer hohen Quanten­effizienz von bis zu 80% im NIR-Bereich. Werden hingegen Photomultiplier eingesetzt, die eine verhältnismäßig große aktive Detektorfläche aufweisen, so wird die Flächenbegrenzung durch einen Raumfilter (Pinhole) im Strahlengang vorgenommen. Der Detektor wird aktiviert, nachdem die Lichtquelle aktiviert war und eine Karenzzeit T¥ verstrichen ist. Die Aktivierungszeit des Detektors liegt im Bereich von 1 ns während die Zeitauflösung der detektierten Signale bei etwa 300 ps liegt. Die Deaktivierung des Detek­tors kann längere Zeit in Anspruch nehmen, sollte jedoch 10 ns nicht überschreiten. Die Signale des Detektors werden durch eine Aufnahmeeinheit aufgenommen. Eine Auf­nahmeeinheit besitzt einen sehr schnellen Konverter zur Umwandlung analoger Detektor­signale in digitale Werte, die gespeichert werden. Eine Auswertung der digitalen Werte kann vorzugsweise im Zeitintervall T· vorgenommen werden, jedoch auch zeitlich verzögert erfolgen. Zur Auswertung der digitalen Werte kann ein gewöhnlicher Mikroprozessor ver­wendet werden. Die im Zeitintervall T· erhaltenen Detektorsignale werden, gegebenenfalls nach Digitalisie­rung und weiterer elektronischer Bearbeitung, in Speicherzellen abgelegt, die einzelnen Zeitintervallen zugeordnet sind. Ein derartiger Speicher besitzt beispielsweise 100 oder mehr Speicherzellen, die aufeinanderfolgenden Zeitintervallen zugeordnet sind. Ein solches Zeitintervall liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 1 Nanosekunden. Findet die Detek­tion eines Fluoreszenzsprozesses beispielsweise 5 Nanosekunden nach Bestrahlung statt, so wird in der Speicherzelle, die eine Zerfallszeit von 5 Nanosekunden mit umfaßt, ein Wert gespeichert. Der Wert kann zu der detektierten Signalhöhe proportional sein, vorzugsweise wird jedoch ein Einheitswert abgespeichert, der anzeigt, daß ein Fluoreszenzprozeß mit einer Lebensdauer in dem von der Speicherzelle abgebildeten Lebensdauerintervall aufge­treten ist. Besonders bevorzugt kann das vom Detektor erhaltene Signal auch bezüglich der Signalintensität analysiert und festgestellt werden, von wievielen Einzelmolekülen das Signal ausgegangen ist. In der Speicherzelle wird nunmehr das der Molekülzahl entsprechende Vielfache des Einheitswertes abgespeichert. Der vorangehend beschriebene Speicherprozeß erfolgt für jede der Einzelmessungen erneut, wobei eine Summation vorgenommen wird. Das heißt, der nach einer Messung in einer be­stimmten Speicherzelle abzuspeichernde Einheitswert, oder gegebenenfalls ein Vielfaches davon, wird dem in der Zelle bereits vorhandenen Wert zugeschlagen. Die Summenkurve, die auf diese Weise mit den Messungen für ein bestimmtes Probevolumen erhalten wird, kann ausgewertet werden, um zu ermitteln, welche fluoreszierende(n) Molekülgruppe(n) im Probevolumen enthalten sind. Auf die Summenkurve können prinzipiell solche Auswerteverfahren angewandt werden, wie sie auch für Signalkurven eingesetzt werden, die mit einem großen Molekülensemble erhalten wurden. Bevorzugte Auswerteverfahren für die mit erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Summenkurven werden im Folgenden beschrieben. Mit einem erfindungsgemäßen System kann eine Gesamt-Photonensammeleffizienz von 5 bis 10% bezogen auf die eingestrahlte Photenenzahl erreicht werden. Dies ergibt sich aus einer Absorptionseffizienz der Fluoreszenzfarbstoffe von etwa 80%, einer Emissionswahr­scheinlichkeit von etwa 90% und einer Detektorempfindlichkeit von bis zu 70%. Es wurde gefunden, daß etwa 200 detektierte Fluoreszenzereignisse ausreichen, um die Unsicherheit der Unterscheidung unterhalb 10ä4 zu drücken. Bei Konzentrationen von 10ä9 bis 10ä12 mol/l sind dafür 5.000, besser 10.000 Messungen am gleichen Probevolumen ausreichend. Daraus ergibt sich, daß ein Probevolumen mit Meßzyklen im MHz-Bereich erfindungsgemäß innerhalb weniger Millisekunden oder darunter untersucht werden kann. Ein System gemäß der Erfindung beinhaltet weiterhin eine Steuereinheit, die dazu ausgelegt ist, die Lichtquelle für ein Zeitintervall T£ zu aktivieren und nach Verstreichen eines Zeitintervalls T¥ den Detektor für ein Zeitintervall T· zu aktivieren. Eine derartige Steu­ereinheit ist geeignet, eine zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung zu ermöglichen. Das Zei­tintervall T£, zu dem die Lichtquelle aktiviert ist, dient dazu, Analytmoleküle in einen an­geregten Zustand zu überführen, aus dem sie unter Aussendung von Fluoreszenzlicht in einen energetisch tieferen Zustand übergehen. Die Zeit T£ liegt vorzugsweise im Bereich von 100 pSek. Die Karenzzeit T¥ dient dazu, spontane Fluoreszenz der Probe, die nicht von den zu detektierenden Molekülgruppen ausgeht, aus der Messung auszuschließen. Vor­zugsweise liegt die Zeit T¥ im Bereich zwischen 0,1 und 10 ns. Während des Zeitintervalles T· ist der Detektor aktiviert und empfangt von der Probe ausgehende Fluoreszenzstrahlung. Die Zeit T· wird vorzugsweise zwischen 20 und 100 ns gewählt. Während dieser Zeit T· werden die Detektorsignale bezüglich Signalhöhe und Zeitpunkt durch eine Aufnahme­einheit aufgenommen. Da die Messung an einzelnen oder zumindest sehr wenigen Mole­külen durchgeführt wird, erhält man im Zeitintervall T· keine klassische Abklingkurve der Fluoreszenz, sondern im Falle eines einzelnen Moleküls einen Signalpeak, der den Zeitpunkt bzw. das Zeitintervall, in dem das individuelle Molekül Strahlung aussendet, kennzeichnet. Dadurch, daß die Messung wiederholt durchgeführt wird, kann eine statistische Auswertung erfolgen, aus der die Fluoreszenzlebensdauer ermittelt werden kann. Die Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer an einem oder wenigen Molekülen ist zunächst problematisch, da viele Moleküle bei wiederholter Anregung zerfallen und daher nicht geeignet sind,. die notwendige Zahl von Meßzyklen zu überdauern, die notwendig sind, um eine Auswertung zu ermöglichen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden daher bevorzugt solche fluoreszierenden Molekülgruppen eingesetzt, die mindestens 1000 Fluoreszenzzyklen über­dauern. Aufgrund der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten kleinen Probenvolumina, vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 10 Femtoliter, muß dafür gesorgt werden, daß das untersuchte Molekül bzw. das Molekülensemble während der Meßdauer nicht durch Strömungs- oder Diffusionsprozesse aus dem untersuchten Probevolumen hinauswandert. Diesem Umstand wurde erfindungsgemäß damit Rechnung getragen, daß pro Millisekunde mindestens 1000 Meßzyklen durchgeführt werden. Weiterhin müssen zur Auswertung der Meßergebnisse geeignete statistische Verfahren herangezogen werden. Als zur statistischen Auswertung im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders ge­eignet haben sich die sogenannten Maximum-Likelihood-Methode sowie die Musterer­kennung erwiesen. Die während der Detektionszyklen T· erhaltenen Signale werden zur statistischen Auswertung zeitaufgelöst in Speichern aufsummiert. Das bedeutet, die in ver­schiedenen Meßzyklen gemessene Intensität zu einem bestimmten Zeitintervall innerhalb T· wird addiert. Dies erfolgt für eine ausreichend große Zahl unterschiedlicher Zeitintervalle (beispielsweise 1000). Die in den einzelnen Speicherzellen enthaltenen Intensitätssummen sind proportional zur Wahrscheinlichkeit, daß das untersuchte Molekülensemble innerhalb des jeweiligen Zeitintervalles Fluroszenzstrahlung aussendet. Bei der Maximun-Likelihood-Methode wird nunmehr eine Fluoreszenzlebensdauer ge­schätzt und die Wahrscheinlichkeit berechnet, mit der die experimentell gemessene Wahr­scheinlichkeitsverteilung mit dieser Fluoreszenzlebensdauer erhalten worden wäre. Die Fluoreszenzlebensdauer, die zu der höchsten Wahrscheinlichkeit führt, wird als Maximum-Likelihood-Schätzer bezeichnet und ist das Ergebnis der statistischen Auswertung. Der Maximum-Likelihood-Schätzer wird mit den Fluoreszenzlebensdauern der unterschiedlichen Arten fluoreszierender Molekülgruppen verglichen, die bei der Untersuchung eingesetzt wurden. Die Art fluoreszierender Molekülgruppe, die möglichst nahe an dem Maximum-Likelihodd-Schätzer liegt, war im untersuchten Probevolumen vorhanden. Bei der zweiten statistischen Methode, der Mustererkennung, werden wie bereits beschrie­ben die Intensitäten summiert, die in einem bestimmten Zeitintervall innerhalb T· erhalten werden. Die Mustererkennung erfolgt mit der folgenden mathematischen Formel: Hierbei ist N die Summe aller über den Zeitraum T· gezählten Photonen. Die in einem Zeit­intervall i gezählten Photonen werden mit ni bezeichnet. Die Größe pi(j) gibt die Wahr­scheinlichkeit dafür an, daß ein Fluoreszenzereignis in das Zeitintervall i fällt, wenn die ge­messene Substanz vom Typ j ist. Die Photonenzahlen ni stellen demnach den Signalverlauf der durchgeführten Messung dar, während die pi(j) das Muster des Signalverlaufes für eine bestimmte Substanz angeben. Mit obiger Formel wird das Molekül bzw. werden die Mole­küle im vermessenen Probevolumen der Art fluoreszierender Molekülgruppe zugeordnet, für die bei Zugrundelegung des zugehörigen pi(j) der Wert I* am kleinsten ist. Die vorliegende Erfindung wird anhand einiger Figuren näher erläutert: Fig. 1 Darstellung einer optischen Anordnung, Fig. 2 Der der Auswertung zugrundeliegende Volumenbereich, Fig. 3 Zeitlicher Verlauf des Meßverfahrens, Fig. 4 Meßergebnisse aus Einzelmessungen, Fig. 5 Summenkurve aus den Einzelmessungen, Fig. 6 Summenkurve aus einer Vielzahl von Einzelmessungen an einem einzelnen Molekül. Fig. 1 zeigt prinzipiell den optischen Aufbau eines Systems gemäß der vorliegenden Erfin­dung. Die Probenflüssigkeit befindet sich im dargestellten Beispiel in einer den Kapillare (10), von der ein Teil des Innenraumes über eine Mikroskopoptik (1) auf einen Detektor (2) abgebildet wird. Vor dem Detektor befindet sich eine Blende (3), um Hintergrundstrahlung auszuschließen. Zwischen Mikroskopoptik (1) und Detektor (2) befindet sich ein Strahl­teiler (4), über den Licht aus einer Anregungslichtquelle (5) in die Mikroskopoptik (1) ein­gekoppelt wird. Bei der Anregungslichtquelle handelt es sich im dargestellten Beispiel um einen Diodenlaser Typ PLP 01 von Hamamatsu. Mit diesem Diodenlaser können Repeti­tionsraten von 10 MHz bei Pulsbreiten von < 100 pSek. und Pulsspitzenleistungen von über 50 mWatt realisiert werden. Dadurch, daß die Anregungsstrahlung über die gleiche Optik eingekoppelt wird, mit der auch die Fluoreszenzstrahlung aufgefangen wird, kann erreicht werden, daß selektiv ein sehr kleiner Bereich des Probevolumens bestrahlt und von diesem Bereich ausgehende Fluores­zenzstrahlung ausgewertet wird. Durch diese Vorgehensweise ist das untersuchte Probe­volumen sehr genau räumlich definiert und eine Störung der Messung durch Fluoreszenz von außerhalb des untersuchten Bereiches kann verhindert werden. Bei dem in Fig. 1 dargestellten Detektor (2) handelt es sich um einen zeitkorrelierten Einzelphotonenzähler in Form einer Avalanche-Photodiode. Auf dem Gebiet der zeitauf­gelösten Fluoreszenzspektroskopie können Avalanche-Photodioden vorteilhaft eingesetzt werden, da sie im Vergleich zu Photomultipliern eine geringe Detektionsfläche aufweisen. Avalanche-Photodioden können daher insbesondere in einer konfokalen Optik eingesetzt werden, bei der sich der zuƪ04758DEA119634873 DE980217 untersuchende Raumbereich des Probevolumens im Brennpunkt eines ersten Linsensystems befindet, während sich die Detektionsfläche der Photodiode im Brennpunkt eines zweiten Linsensystems befindet. Bei dieser Anordnung gelangt nur Licht aus dem gewünschten Raumbereich auf die Photodiode, womit der Untergrundanteil der Messung stark reduziert werden kann. In der Fig. 1 ist weiterhin zu erkennen, daß die Enden der Kapillare (10) in Fluidkontakt mit zwei Reservoirs stehen, in denen sich Probeflüssigkeit befindet. Die Probeflüssigkeiten sind ihrerseits mit jeweils einem Pol einer Spannungsquelle (nicht dargestellt) verbunden, so daß Analytmoleküle elektrophoretisch durch die Kapillare transportiert werden können. Fig. 2 zeigt eine Darstellung des mit der Anregungslichtquelle bestrahlten Probevolumens (erstes Probevolumen) und des zugehörigen Probevolumens (zweites Probevolumen), aus dem die Detektion vorgenommen wird. Im Idealfall überlappen die dargestellten Bereiche vollständig. Im praktisch realisierbaren Fall sind die Bereiche jedoch etwas gegeneinander verschoben, so daß sich das überlappende Probevolumen, aus dem die Messung vorge­nommen wird, als Schnittmenge der beiden Volumina ergibt. Die dargestellten Verhältnisse treten dann auf, wenn sowohl ein fokussierter Anregungslichtstrahl verwendet als auch eine konfokale Detektion vorgenommen wird. Die Begrenzung der in Fig. 2 skizzierten Volumenbereiche erfolgt lateral durch den Aufbau der Abbildungsoptiken und Blenden bzw. die als Blende wirkende Diodenfläche. Transversal erfolgt die Begrenzung durch den Schärfebereich der Optik in Zusammenwirken mit einer Blende, die unscharfe Strahlen ausblendet. Fig. 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzintensität über die Zeit, wie er durch Erstellung einer Summenkurve aus vielen Einzelmessungen mit erfindungsgemäßen Ver­fahren erhalten werden kann. Im Zeitintervall T£ erfolgt ein Anregungslichtimpuls, der eine hohe Flankensteilheit besitzt. Beim erfindungsgemäßen System kommt es nicht nur darauf an, daß die Anstiegsflanke des Anregungspulses steil ist, sondern auch daß die Löschung der Lichtquelle mit sehr hoher Geschwindigkeit erfolgt. Insbesondere soll der Zeitraum T£ klein sein im Verhältnis zur Fluoreszenzlebensdauer. Auf den Anregungslichtpuls folgt die Zeit T¥, in der weder Lichtquelle noch Detektor aktiviert sind, um spontane Untergrund­fluoreszenz, die in diesen Zeitraum fällt, auszublenden. Die Summenkurve im Zeitintervall T· gibt statistisch das Abklingen der Fluoreszenzemission über die Zeit wieder. Aus der Summenkurve kann die Fluoreszenzlebensdauer der fluoreszierenden Molekülgruppen ermittelt werden. Fig. 4 zeigt Meßergebnisse, die an demselben Molekül gewonnen wurden. Auf der X-Achse der Einzelabbildungen ist die Zeit dargestellt, die nach Bestrahlung des Moleküls mit der Lichtquelle vergangen ist. Auf der Y-Achse wird ein Einheitswert für ein erhaltenes Detektionssignal abgetragen. Das in den Einzelabbildungen jeweils dargestellte grau unter­legte Kästchen gibt an, in welchem Zeitintervall nach Bestrahlung des Moleküls die von dem Molekül imitierte Fluoreszenzstrahlung gemessen wurde. Da es sich bei der Fluoreszenz­emission um einen statistischen Vorgang handelt, wird die Fluoreszenzemission bei den einzelnen Experimenten auch für dasselbe Molekül nach unterschiedlichen Zeiten detektiert. Fig. 5 zeigt eine Zusammensteilung der Einzelmessungen aus Fig. 4. Die bei den Einzel­messungen erhaltenen Einheitswerte werden für die einzelnen Zeiträume summiert, so daß sich ein Diagramm ergibt, das anzeigt, wie häufig ein bestimmter Bereich der Fluoreszenz­lebensdauer bei den Messungen erhalten wurde. Fig. 6 zeigt eine der Fig. 5 entsprechende Darstellung jedoch mit einer weiter höheren Zahl von Einzelmessungen. Die in der Figur dargestellten Punkte geben an, wie häufig ein bestimmtes Intervall der Fluoreszenzlebensdauer bei den Messungen erhalten wurde. Auf der X-Achse ist wiederum die Zeiten von Bestrahlung des Moleküls bis zur Aussendung der Fluoreszenzstrahlung aufgetragen. Die in der Figur dargestellte durchgezogene Linie stellt statistisch das Abklingen der Fluoreszenzintensität dar. Im konkreten Experiment ergibt sich die statistisch ermittelte Fluoreszenzlebensdauer zu 3,7 ns.