Title:
Immobilised organic material with defined release of active agent
Kind Code:
A1


Abstract:
An immobilised organic material, or material from an organ, is claimed, with defined release of active agent, for implantation into a living human.



Inventors:
WAGNER KARL-HEINZ DR MED (DE)
NAARMANN HERBERT DR RER NAT (DE)
Application Number:
DE19623440A
Publication Date:
12/18/1997
Filing Date:
06/12/1996
Assignee:
WAGNER, KARL-HEINZ, DR.MED., 35440 LINDEN, DE
NAARMANN, HERBERT, DR.RER.NAT., 67227 FRANKENTHAL, DE



Claims:
1. Immobilisiertes organisches Material mit definiertem Wirkstoff-Release, dadurch gekennzeichnet, daß das erfindungsgemäße Material in den lebenden Organismus eines Menschen implantiert wird.

2. Patentanspruch entspr. 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Implantation in eine Leitungsbahn des Empfängerorganismus ein- und/oder angebracht wird.

3. Patentanspruch entspr. 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches immobilisiertes Material Insulin, Proinsulin, Präproinsulin und/oder Organzellen (Langerhans'sche Inseln, APVD-Amine Precursor Uptake Decarboxylating) Systeme xenogener, autogener Herkunft verwendet werden.

4. Patentanspruch entspr. 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobili­sierung des organischen Materials mit Hilfe von synthetischen und/oder nativen hochmolekularen Verbindungen erfolgt.

5. Patentanspruch entspr. 1, 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Immo­bilisierungssystem definierte polare Gruppen enthält, die durch Anlegen einer elektrischen Spannung, die definierte Abgabe des Wirkstoffes erlauben.

6. Patentanspruch entspr. 1, 2, 3, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Immobilisierungssystem Komponenten enthält, die eine Agglomeration des Blutes unterdrücken bzw. verhindern.

7. Patentanspruch entspr. 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Agglomerationsauto­gonisten, Heparin, Hirudin, Marcumar® bzw. deren Derivate und/oder Modifika­tionen verwendet werden.

8. Patentanspruch entspr. 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Immobilisierungssystem aus porösem bzw. hohlförmig ausgebildetem Material besteht.

9. Patentanspruch entspr. 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Immobilisierungs-System aus polymerem Material mit großer innerer bzw. äußerer Oberfläche besteht.

10. Patentanspruch entspr. 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Immobilisierungs-System Hohlkörper, wie Schläuche, Röhren, Kohlefasern oder Mikrokapseln sowie Schwämme und offenporige Schäume und/oder Folien, Gewebe und/oder Vliese mit Mikroporen bzw. großen Oberflächen eingesetzt werden.

11. Patentanspruch entspr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Freisetzung des Wirkstoffes bedarfs- und/oder zeitge­recht erfolgt.

12. Patentanspruch entspr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß für das offenporige immunseparierende erfindungsgemäße Immunisierungssystem eine dauerhafte Antagonisierung membranadhärenter Blut­bestandteile sowie der wechselseitige Stoffaustausch (O¥-Aufnahme, Wirkstoffab­gabe) zwischen Spendergewebe und Empfängerorganismus gewährleistet ist.

Description:
Von den 4 Millionen Diabetikern sind nach neueren Schätzungen etwa 160.000 Diabetiker vom Typ 1. Sie sind schon im jugendlichen Alter auf multiple tägliche Insulininjektionen angewiesen. Auch die primär nicht auf Insulin angewiesenen Typ 2-Diabetiker benötigen mit zunehmender Erkrankungsdauer Insulin. Selbst wenn man nur den manifesten Diabetes als singulären Risikofaktor zugrunde legt, bedeutet dies bei einem zehn Jahre alten Typ 1-Diabetiker eine Verkürzung der Lebenserwartung um circa 21 Jahre, da daß diabetische Spätsyndrom zu multiplen Organschäden führt. Die periphere und autonome Neuropathie. Retinopathie, Mikro- und Makroangiopathien von eingeschränkter Leistungsbreite bis hin zur Dialysepflichtigkeit dokumentieren die sozialpolitische und volkswirtschaftliche Relevanz. Das Auftreten oder die Progredienz des "Diabetischen Spätsyndroms" kann nur durch eine normale oder nahe-normale Blutzuckereinstellung verhindert werden, wie dies von der amerikanischen DCCT-Studie nochmals belegt wird. Die nahe-normale Blutzuckereinstellung läßt sich nur mit einer intensivierten Insulintherapie erzielen, allerdings mit dem Kalkül dreifach erhöhter hypoglykämischer Stoffwechselreaktionen. Das eigentliche Ziel muß daher nach wie vor sein:zeit- und bedarfsgerechte Insulinfreisetzung zu erzielen. Künstlich endokrines Pancreas (KEP) Eine rein technische Alternative hierzu ist das künstlich endokrine Pancreas (KEP), wobei der Glucosesensor auf der Basis der GOD-Methode mit einer Insulinpumpe gekoppelt ist. Die Grenzen des gesamten Systems sind durch die interstitielle Messung des "Gewebezuckers" und die Applikation des Insulins in das s.c. Gewebe vorgegeben. Nach maximal 25 Minuten tritt erst die effektive Insulinwirkung auf, so daß eine echte Rückkopplung (closed loop system) nicht möglich sein wird. Da mit der Effektivität des sogenannten closed loop-Systems der physiologischen Regulation die organischen Spätschäden entsprechend verzögert werden können, ist auch mit der rein technischen Lösung noch kein Durchbruch erzielt worden. Eine Normoglykämie mit dem Ziel einer bedarfs- und zeitgerechten Release von Insulin läßt sich nur durch biologischen Ersatz des zerstörten insulinproduzierenden Inselzellapparates durch Pancreas- oder Inselzelltransplantation erzielen. Freie allogene Transplantate bedürfen einer intensiven Immunsuppression. Daher könnte die erfolgreiche Entwicklung eines "Bioartefiziellen Pancreas" mittels biologischen Organersatzes, d. h. durch die Verwendung von isolierten Inselzellen des Schweines ein größerer Patientenkreis erschlossen werden. Darüber hinaus kann durch die Verwendung immunseparierender Membranen auf die oben erwähnte Immunsuppression verzichtet werden.ZielsetzungBioartefizielles Pancreas Insulinproduzierende Zellen die auf einen Glucosereiz mit einer zeit- und bedarfsgerechten Freisetzung von Insulin reagieren, werden in einen diabetischen Organismus eingepflanzt. Die freien Inselzellen allogener oder xenogener Herkunft werden durch künstliche Membranen vor einer Zerstörung durch das Immunsystem des Empfängers geschützt. Zur Zeit werden zwei unterschiedliche auf diffusem Stofftransport beruhende Membranformen diskutiert:1. Makroverkapselung in Kapillarmembranen (Abb. 1:) Hierbei werden Inseln in eine 0.5ä4 mm im Durchmesser und 2ä3 cm lange Kapillarmembran verkapselt und in die freie Bauchhöhle implantiert. Diese Methode, die bislang lediglich tierexperimentell realisiert wurde, hat den Vorteil der exakten Reproduzierbarkeit sowie Charakterisierbarkeit auch im "in vitro Modell". Limitierend ist die niedrige Packungsdichte von Inseln in der Kapillarmembran, was in einem relativ großen zu implantierenden Volumen resultiert. Das Dilemma besteht vor allem darin, daß das in Bezug auf Volumen geeignete Kompartiment, nämlich das Peritoneum wegen der Gefahr einer Peritonitis nicht in Frage kommt. Eine andere Form der Makroverkapselung ist der Anschluß eines "Bioartefiziellen Pancreas" über Gefäßprothesen an den Blutkreislauf, wobei das Blut die Kapillarmembranen durchströmt und die Inseln in einem künstlich geschaffenen Raum um die Kapillarmembranen herum liegen über diese Methode wurden partielle Erfolge berichtet (Abb. 2). Mikroverkapselung: Bei der Mikroverkapselung werden einzelne Inseln in kleinste Kapseln aus Polylysin-komplexiertem Alginat eingeschlossen und transplantiert. Die Mikrokapseln haben einen Durchmesser von 0.5 mm. Diese Technik ist weit vebreitet, da tierexperimentell eine deutliche Verlängerung der Transplantat-Überlebenszeit gegenüber nicht verkapselten Inseln in den Kontrollversuchen festzustellen war. Die Ergebnisse sind allerdings nicht einheitlich reproduzierbar, da die Verkapselungstechnologie bisher wenig standardisiert ist (siehe Abb. 1). Gründe hierfür sind:1. Die Alginate sind keine standardisierten Extrakte aus Braunalgen mit polyvalenten Kationen, analog deren Affinität mehr oder weniger reversibel komplexierbar. Die Alginate können durch mitogene Faktoren nach Implantationen Fremdkörperreaktionen auslösen.2. Die immunseparierende Membran wird in Anwesenheit des zu verkapselnden Gewebes durchgeführt. Die Membranumbildungsprozesse laufen unter physiologischen Bedingungen ab und sind daher unzureichend kontrollierbar, ebenso wie der Komplexierungsprozeß.3. Die meisten der Mikrokapseln von einem halben Millimeter Durchmesser haben ein vielfaches des Volumens der eingeschlossenen 50ä300 mµ großen Langerhannschen Inseln. Je enger die Membran einer Insel anliegt, oder je kleiner eine Mikrokapsel ist, desto besser werden die für die Ernährung und Insulinfreisetzung zu fordernden Diffusionsbedingungen. Das bedeutet auch, daß dünne und eng anliegende Membranen in andere Kompartimente mit besserer Oxygenierung implantiert werden können. Vor einer Anwendung eines bioartefiziellen Pancreas oder anderen endokrinen Organes als therapeutisches Prinzip nicht nur bei Insulin-Mangel-Diabetes sondern auch bei anderen endokrinen Defizit-Syndromen sind grundlegende Untersuchungen durchzuführen.1. Definition und Kontrolle des Verkapselungsprozesses und Materialien2. Untersuchung zur Optimierung der Mikrokapsel-Membranen unter dem Gesichtspunkt der Biokompatibilität und Immunologie bzw. Immunseparation.3. Untersuchung am Großtiera) exakte Beschreibung des Glucosestoffwechsels nach Transplantationb) Nachweis eines Ausbleibens des "Diabetischen Spätsyndroms"c) Nachweis und Funktion des "Bioartefiziellen Pancreas".Diskussion Der Grund für die eingeschränkte klinische Verwendbarkeit aller bisheriger. Untersuchungsmodelle sind als Membranbildungsprozesse bis hin zu Verklebungen, die dann über zunehmend eingeschränkte Oxygenierung bzw. nutritive Versorgung die Effektivität der Transplantation in Frage stellen. Die bislang bevorzugten Kompartimente, wie z. B. das Peritoneum, eignet sich zwar zum Studium patho-morphogenetischer Prinzipien, sind aber wegen der Gefahr der Peritonitis grundsätzlich beim Menschen nicht geeignet. Nierenkapsel bzw. mesenteriales Fettgewebe limitieren ebenfalls den Erfolg wegen der genannten Grundprobleme. Ausgehend vom Vascularisierungsmodell mit Anschluß an den Blutkreislauf wird den haemodynamischen Parametern die Bedeutung beigemessen, daß membranadhärente Plasmafaktoren durch entsprechende Strömungsverhältnisse ihre funktionsbehindernde Wirkungen nicht mehr entfalten können. Anders ausgedrückt: Verklebungen können nur verhindert werden, wenn in dem Kompartiment eine ausreichende Strömung vorherrscht bzw. die haemodynamischen Parameter eine ausreichende Oxygenisierung und nutritive Versorgung gewährleisten, ohne daß das Kompartiment selbst einer Beeinträchtigung unterzogen wird. Aus diesen Grundüberlegungen folgt, daß der rechte Herzinnenraum als geeignetes Kompartiment in Frage kommt. Analog dem transvenösen Zugang eines endocardial fixierten Katheters handelt es sich um ein leicht zugängiges Kompartiment. Ein problemloser Austausch ist ebenfalls gewährleistet, wenn man eine flexible katheterförmige Verkapselungsstruktur mit proximalen und distalen Pexiemöglichkeiten zugrunde legt. Ein Schwerpunkt dieser Erfindung liegt darin, den wirkungshemmenden Einfluß der Blutbestandteile auf die Membranoberfläche zu antagonisieren. Hier liegen interessante Vorteile für extravasculäre Systeme, die darin bestehen, mit nur geringem operativem Aufwand Device-Konstruktionen zu plazieren. Der Einfluß elektrisch leitfähiger Polymere auf Interaktionen zwischen Blut und Blutbestandteilen sowie künstlichen Oberflächen entspr. Patentanspruch 5. Bisher bekannte Einflüsse des Blutes auf künstliche Oberflächen1. Proteinadsorption2. Plättchenreaktion3. Erythrozyten4. Leukozyten5. Komplementaktivierung6. Fibrinolytische Aktivität7. Zielsetzungen und Variationen der Versuchsparameter. Im folgenden Abschnitt werden die Membranbildungsprozesse zwischen Blut und künstlichen Oberflächen im einzelnen beschrieben, um dann anschließend die Möglichkeit zu erörtern, welche Veränderungen im Sub-Mikrometerbereich notwendig und möglich sind, um plasmatische Systeme und Moleküle im Hinblick auf ihre Membran-adhäsive Wirkung zu beeinflussen. Am Ende wird ein vorläufiger Katalog mit wissenschaftlichen Fragestellungen zur Polymercharakterisierung, Funktionsuntersuchungen sowie Biokompatibilitätsprüfungen stichwortartig skizziert. Es ist unerläßlich, sämtliche Möglichkeiten der Interaktion zwischen Blutplasma und künstlichen Oberflächen zu kennen, um gezielte Änderungen an der polymeren Oberfläche vorzunehmen. Sprachlich ist es sehr bequem, Blutgerinnung in festen schematischen Begriffen darzustellen, wenn man nur die systematischen Anteile charakterisiert wie: Plättchenaktivierung, intrinsic-extrinsic system, gemeinsame Gerinnungsstrecke und die Kontrollsysteme, die an der Thrombushemmung und der Fibrinolyse partizipieren (Abb. 3). Die genannten Vorgänge kann man sich auch zu eigen machen, um die Interaktionen zu beschreiben, die nach Blutkontakt mit einer künstlichen Oberfläche auftreten, wenn man dabei zwei grundlegende Unterschiede berücksichtigt:1. Eine künstliche Membranoberfläche ist ohne Modifikation nicht in der Lage, die Aktivierung der lokalen Gerinnung, so wie das endotheliale Strukturen können, zu verhindern. Ebensowenig sind künstliche Oberflächen in der Lage, jene adhäsive Wirkung zu entfalten wie Endothelien dazu in der Lage sind.2. Während Endothel unter physiologischen Bedingungen nicht in der Lage ist, Proteine zu adsorbieren, ist die Proteinadsorption ein wesentlicher Vorgang der Blut-Polymerinteraktion. Die obligatorische Antwort des Blutes auf eine künstliche Oberfläche kann als Adsorption von Proteinen angesehen werden. Ebenfalls zum Teil fakultativ assoziiert ist die Plättchenadhäsion einschließlich Faktorenfreisetzung und Aggregation, Aktivierung des intrinsic pathway, Mitwirkung der Fibrinolyse des Komplement- und des Kallikrein-Kinin-Systems sowie zellulärer Elemente. Dies alles führt unausweichlich zur Thrombusentstehung, so daß bei klinischer Anwendung eine Pharmakotherapie mit Antikoagulantien, Plättchenaggregationshemmern und Plasminogenaktivatoren als simultane Begleitbehandlung notwendig ist.1. Proteinadsorption an künstlichen Oberflächen Die Proteinadsorption auf künstlichen Oberflächen ist ein spontanes Ereignis im Rahmen der Blut-Oberflächen-Interaktion. Diese Adhärenz ist von erheblicher Bedeutung, da er auf alle nachfolgenden Erscheinungen Einfluß hat. Die wichtige Rolle der adsorbierten Proteine wird im Sinne des Terminus konditionierender Belag wissenschaftlich reflektiert. Dieser Belag verhält sich allerdings nicht passiv. Es besteht die Möglichkeit temporärer Adhärenz. Denaturierungen, Konformitätsänderungen des Moleküls, sowie fortlaufende Änderung der Art des Proteinbelages inclusive physikalischer und biologischer Eigenschaften. Das Verhalten der Proteine sich spontan an künstliche Membranen zu heften, hat mit dem amphipathischen Charakter (zwitterionisch) der Proteine zu tun, nämlich im sauren bzw. basischen Milieu polare Gruppen zu bilden und im Bereich des isoelektrischen Punktes (Dielektrizitätskonstante) ladungsneutral zu sein. (Elektrophoretische Mobilität 0 bei isoelektrischem Punkt) Anmerkung: (Isoionisch sind Moleküle, die in salzfreier Lösung keine Ladung aufweisen). Dieser zwitterionische Charakter der Proteine bildet die treibende Kraft für die Konzentrationsansammlung in den polymeren Spalt räumen. Die geringe Löslichkeit der Proteine liegt an dem hohen Molekulargewicht der Makroglobuline. Eine Abnahme der freien Energie des Systems, kann aus der Enthalpieabnahme resultieren, wenn die Reaktion exergonisch verläuft. Die andere Möglichkeit ist die Entropiezunahme verursacht durch Hydrolyse in Proteinnähe oder der künstlichen Oberfläche. Die Natur der künstlichen Oberfläche bestimmen Art und Umfang der Proteinbindung (protein attachement). An Glasoberflächen ist die Adsorption elektrostatischer Natur. Auf Polymer-Oberflächen wird die Adhäsion und Bindung durch hydrophobe Oberflächen ausgelöst, wobei die Interaktion zwischen non-polaren Proteingruppen und non-polaren künstlichen Oberflächen erst durch das polare wäßrige Medium zustande kommt. Im allgemeinen ist die Bindung auf hydrophoben Oberflächen stärker als auf hydrophilen Oberflächen. Hydrophobe Eigenschaften der Polymere beeinflussen auch die sterische Konformation in adsorbierten Proteinen. Die Adsorption auf hydrophilen Oberflächen ist stärker und schneller reversibel als auf hydrophoben Oberflächen. Die Reversibilität beschreibt das Bindungsgleichgewicht. Bei Blutkontakt an einer künstlichen Oberfläche lagert sich das Protein selektiv in Form eines Mono-Layers mit einer Schichtdicke von circa 100 nm an, der ebenfalls in dieser Form eine Kontrollfunktion auf sämtliche nachfolgenden Interaktionen aus. Unter dem Aspekt des Einflusses auf Blutplättchen sind folgende Proteine am meisten untersucht worden: 1. Albumin, 2. Fibrinogen, 3. gamma-Globulin (IgG). Eine Erkenntnis daraus ist, daß nach vorheriger Adsorption von Albumin die nachfolgende Plättchenadhäsion nicht stattfindet, aber umgekehrt bei primärer Adsorption von Fibrinogen oder gamma-Globulin (IgG) die Plättchenadhäsion gefördert wird. Über bevorzugte Adsorption von Fibrinogen gegenüber Albumin und gamma-Globulin wurde berichtet. Diese Präferenz gegenüber Fibrinogen hat man ebenfalls bei Lipoproteinen und anderen Gerinnungsfaktoren beobachtet. Fibrinogen übt auf Plättchen eine starke Anziehungskraft aus und die Plättchenreaktivität korreliert mit dem Grad der bevorzugten Fibrinogen-Adsorption, obwohl der Einfluß des Proteins sich nach rascher Konformitätsänderung verringert. Die enge physiologische Beziehung zwischen Fibrin und Plättchen ist vor allem durch die Tatsache belegt, daß defibriniertes oder afibrinogenämisches Plasma die Plättchenakkumulation nicht mehr unterstützt, bis zu dem Zeitpunkt, wo Fibrinogen dem Plasma wieder zugefügt wird. Die Anwesenheit von Fibrinogen ist nötig, um die ADP-induzierte Plättchenaggregation in Gang zu setzen (zwei Klassen von ADP-stimulierenden Plättchenrezeptoren). Dadurch ist es möglich, daß die Adsorption von Fibrinogen auf künstlichen Oberflächen nicht unabhängig von Plättchenablagerungen ist, die mit spezifischen Rezeptoren der adhärenten Plättchen reagiert. Die vorübergehende Aufrechterhaltung der Fibrinogenadsorption wird als "Vromann-Effekt" bezeichnet. Von teilweisem Interesse ist der Austausch von adsorbiertem Fibrinogen durch hochmolekulares Kininogen, ein Protein welches in der Kontaktaktivierung der intrinsic coagulation eine entscheidende Rolle spielt. Zum Beispiel bedeutet ein niedriger "Vromann-Effekt", wenn aufgrund der Fibrinretention die intrinsic coagulation weniger aktiviert wird, während ein hoher "Vromann-Effekt" mit Fibrinogenaustausch einhergeht und damit geringeren Einfluß auf die Plättchenreaktion entfaltet. Dies hat eine wichtige klinische Bedeutung bei der Thromboseentstehung auf künstlichen Oberflächen, die ebenfalls im Zusammenhang der Interaktionen zwischen Fibrinogen und Leukozyten zu sehen ist. Die Adååƒ18207DEA119623440 DE971124 sorption von gamma-Globulinen auf künstlichen Oberflächen fördert die Plättchenadhäsion und stimuliert die Plättchenfreisetzungsreaktion. Der gamma-Globulinadsorption folgt die Leukozytenadhäsion. Albumin wird rasch an künstliche Oberflächen adsorbiert, obwohl es nicht die Hauptproteinkomponente ist, welche in die Interaktion miteinbezogen ist. Adsorbiertes Albumin besitzt die Fähigkeit Plättchen- und Leukozytenadhärenz abzuschwächen und damit die Thrombusbildung insgesamt zu hemmen. Die Herstellung derartiger Oberflächen weisen eine erhöhte Blutkompatibilität auf. Auch andere Proteinarten als die bisher genannten können in Spuren an der Interaktion eine physiologische Rolle spielen. Adsorbierte Proteine die identifiziert wurden: Fibronectin (möglicher Einfluß auf die Leukozytenadhärenz), Lipoproteine, IgA, IgM, IgD, von Willebrand Faktor XIII Multi-Proteinkomplex. Letzterer ist ein mögliches Bindeglied bei verstärkter Plättchenadhäsion, sowie Plasminogen mit einem möglichen Effekt auf Oberflächen-assoziierte fibrinolytische Aktivität. Nach Exposition mit Blut leiten proteinbeladene Oberflächen die intrinsische Koagulation durch die Kontaktaktivierungsphase unter Einbeziehung des Kontaktproteins Faktor XII (Hagemann-Faktor), Faktor XI, high molecular weight kininogen (HMWK) und Präkallikrein. Eine Kaskade enzymatischer Reaktionen resultiert aus der Adsorption von HMWK und Faktor XII. Komplexierter HMWK bildet mit Präkallikrein einen Komplex. Dieser Komplex spaltet Faktor XII in Faktor XIIa, der wiederum die Konversion von Präkallikrein in Kallikrein, der wiederum im HMWK-Komplex partizipiert. Der Reaktionszyklus in dem Kallikrein Faktor XII aktiviert, sichert seine schnelle Verfügbarkeit nahe der künstlichen Oberfläche. HMWK ist auch in der Lage einen Komplex mit Faktor XI zu bilden, um auf diese Weise den Faktor XI für den Faktor XII zu erhalten, damit die Gerinnungskaskade ihren Verlauf nehmen kann.2. Plättchenreaktionen an künstlichen Oberflächen Im Rahmen der Blut-Biomaterial-Interaktionen führt der Blutkontakt unausweichlich zur Adhäsion und Plättchenaggregation. Wie ausgedehnt diese stattfindet ist stark abhängig von der Natur des adsorbierten Proteinbelages. Unter Beachtung der Kollagen-induzierten Plättchenreaktion ist es bekannt, daß die Plättchen-Interaktion mit adsorbiertem Fibrinogen oder gamma-Globulin zur Bildung eines Komplexes beitragen kann, der sich biochemisch zwischen Glycosyl-Transferasen der Plättchenmembran und inkompletten Heterosacchariden des Fibrinogens oder des gamma-Globulins abspielt. Aus diesem Grund scheint die Hemmung der Plättchenadhäsion durch adsorbiertes Albumin in Abwesenheit von Saccharid-Brücken in analoger Weise zu funktionieren. Die Adhärenz zirkulierender Plättchen an Protein­ummantelten Oberflächen führt zu einer Änderung der Plättchenform und zwar von kernlosen Scheiben zu kernlosen Sphärozyten mit langen filiformen Pseudopodien (visköse Metamorphose). Mit zunehmender Plättchenadhäsion an den unregelmäßigen Belägen der künstlichen Oberfläche findet eine zunehmende Vernetzung von Leukozytenwällen mit Erythrozyten mit Fibrin statt. Nach der Plättchenadhäsion kann man erwarten, daß die Plättchenfreisetzungsreaktion in den adhärenten Plättchen stattfindet mit nachfolgender Aggregation an der Oberfläche. Folgende Plättchenbestandteile stellen daher im Hinblick auf ihre Freisetzung unter dem Einfluß der Membranoberfläche. Die Freisetzung von Serotonin (5-OH-Tryptamin) ist weniger abhängig von der eigentlichen Plättchenadhärenz als von hydrophilen Oberflächeneigenschaften der Biomembran. Beta-Thromboglobulin (beta-T-G) wird in vitro freigesetzt durch Oberflächeneigenschaften und man fand erhöhte Spiegel von beta-T-G und Plättchenfaktor 4 (PF4) nach Implantation von Herzklappen und während Haemodialyse. Über Freisetzung von Thromboxanen (TXB2) während intra-aortaler Ballondilatation wurde berichtet. Erhöhte TXB2-Spiegel während aorto-pulmonalem Bypass wurden beobachtet. Der Verlauf der Blutgerinnung an einer künstlichen Oberfläche bedeutet, daß die Interaktion zwischen Plättchen und intrinsischem Verlauf der Gerinnung wahrscheinlich ist. Die intrinsische Koagulation mag induziert worden sein durch Thromboplastine, die aus Plättchen freigesetzt wurden oder durch Faktor XII-Aktivierung verursacht durch aus Plättchen freigesetztem ADP. Thrombinbildung, die aus intrinsischer Aktivierung resultiert, führt zu einer raschen Produktion von Fibrin-Monolayern an der künstlichen Oberfläche und zur Begünstigung von Plättchenadhäsion und -aggregation. Thrombinerzeugung mag ebenfalls die Plättchenfreisetzungsreaktion einschließlich der Sekretion von PF4, TXB2 und Thrombospondin aktivieren. Es ist möglich, daß Thrombospondin eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Plättchenaggregation auf einer künstlichen Oberfläche spielt. Die Plättchenantwort im Rahmen der Blut-Biomaterial-Interaktion wird beeinflußt durch Diffusion und Scherkräfte.3. Erythrozyten Durch Blutkontakt mit einer künstlichen Oberfläche lagern sich auch Erythrozyten an adsorbierten Protein-Layern an, wobei unter bestimmten Bedingungen eine Haemolyse im Zusammenhang mit der Plättchenfreisetzungsreaktion durch freigesetztes ADP und Erythrozytenfragmenten stattfindet. Durch Zugabe von Erythrozyten in Proteinlösungen konnte eine Herabsetzung der adsorbierten Proteinmenge festgestellt werden. Dieser "red cell effect" wird dem Erythrozytenoberflächenkontakt zugeschrieben resultierend in Ablagerung von Membranbestandteilen und einer neuen, weniger adsorptiven Oberfläche. Seitdem ähnliche Reduktionen in der Adsorption erzielt werden konnten z. B. mit Zellfragmenten primär Membran- oder Partikel-bezogen, obwohl ein möglicher Effekt durch kompetetive Adsorption von freigesetztem Haemoglobin herrührt. Bei hoher Oberflächenaktivität von Haemoglobin ist seine Adsorption wahrscheinlich. Der klinische Gebrauch von Membran Oxygenatoren und beim künstlichen Herzen wird die Thrombusbildung auf den künstlichen Oberflächen durch die Haemodynamik roter Zellen gefördert durch Reduktion der Adsorption von protektiven Faktoren oder Anlagerungen einer adhäsiven Substanz durch Haemolyse wird durch Scherkräfte gefördert mit Einleitung der Koagulation unter geringen Scherkräften, so daß Erythrozyten und Fibrin zusammen den roten Thrombus bilden.4. Leukozyten Die Adhäsion von Leukozyten an einer künstlichen Oberfläche wurde vor einer beachtlichen Zeit schon erkannt. Die adhäsive Potenz der PMN-Leukozyten war im Vergleich zu der der Lymphozyten stärker (Leukophereseuntersuchungen). Die Leukozytenadhäsion wird ebenfalls beeinflußt durch adsorbierte Proteinbeläge (Mono-Layer) Oberflächen, die mit IgG, Thrombin und Prothrombin ummantelt waren, zeigten eine verstärkte leukozytäre Adhärenz. Mit Vorbehalt auf die Empfindlichkeit der Leukozyten bei mechanischer Alteration zeigt die Leukozytenansammlung an den künstlichen Oberflächen ein ähnliches Verhalten wie die Blutplättchen. Scherkräfte beeinflussen die Leukozytenaggregation und die Inkorporation von Leukozyten in die micro-aggregierten Plättchen. Die Thrombinbildung auf künstlichen Oberflächen kontrastiert zu dem vergleichsweise passiven Verhalten der Erythrozyten gegenüber den Leukozytenaktionen. Leukozyten werden vom Thrombus angezogen und in den Thrombosierungsprozeß miteinbezogen. Leukozyten beeinflussen die Plättchenrekrutierung durch lysosomale Enzyme um dann anschließend in der Fibrinolyse zu partizipieren. Die direkte Rolle der Leukozyten bei der Thrombusbildung auf künstlichen Oberflächen resultiert aus der Adhäsion der Leukozyten und dessen Effekt auf die Plättchenaggregation, wobei sich dieser Prozeß aus der Bindung endogener pro-koagulatorischer und pro­aggregatorischer Aktivitäten in den Leukozyten entfaltet. Die Interaktionen zwischen Leukozyten und künstlicher Oberfläche führen zu einer Schwächung der Immun-Phagozytose mit verminderter Infektabwehr. Die Leukozytenadhäsion führt zu einer gesteigerten Proteinbildung im Rahmen spezifischer Zellfunktionen. Dies führt zur Freisetzung von Superoxidradikalen, Leukotrienen, Interleukine, Tumor-Nekrose-Faktor, Plasminogenaktivator, Prostaglandine, Histamine und Plättchenaktivierungsfaktor. Ein Teil der Interaktionen bezieht sich auf die Komplementaktivierung, die im nächsten Punkt erörtert wird.5. Komplementaktivierung Der Einfluß künstlicher Oberflächen auf die Komplementaktivierung kann bei Haemodialyse mit regenerierten Zellulosemembranen beobachtet werden. Bemerkenswert ist die Spaltung des C3-Moleküls, wobei der klassische Reaktionsablauf dann über C1-C2-C4 abläuft. Der alternative pathway zeigt, daß C3 die vorherigen Komplement-Komponenten nicht involviert. Die Tatsache, daß Polysaccharide Aktivatoren des alternative pathway sind, zeigt sich im Einklang mit der Beobachtung, daß Zellulosemembranen diesen Weg (alternative pathway) aktivieren können (cardio-pulmonale Bypass-Operation). Im Gegensatz dazu zeigen Leukopheresestudien, daß künstliche Oberflächen den common pathway aktivieren. Folgende Komplement-Komponenten sind von Interesse: Anaphylatoxin Molekül C3a, C4a, C5a. Diese fungieren als Entzündungsmediatoren. Die klinische Bedeutung der Komplementaktivierung liegt in der Vermittlung der Leukozyten- und Plättchenadhäsion auf polymeren Oberflächen.6. Fibrinolytische Aktivität (vgl. Abb. 3)7. Zielsetzungen und Variationen der Versuchsparameter Das Ziel dieser Erfindung besteht in der Modifizierung der Implantat-Oberfläche um die Blutkompatibilität so zu verbessern, daß die Diffusionsbedingungen für verkapselte Inselzellen (siehe Einleitung) optimal sind. Die Verbesserung der Kompatibilität erfolgt durch:1. Änderung der physikalischen Oberflächeneigenschaften (Texturverbesserung von rauhen Oberflächen).2. Verstärkung der hydrophilen Eigenschaften. Hydrophile Oberflächen vermindern sowohl die Protein- als auch die zelluläre Adsorption. Die meisten hydrophilen Oberflächen sind als polymere Hydrogele darstellbar mit leider nur geringer mechanischer Konsistenz (Aufquallung in wäßriger Lösung). Hier können Verbesserungen erzielt werden mit coating oder Co-Polymerisation. Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) wurde durch Polyäthylenoxyd (PEO) ersetzt weil es gegenüber HEMA eine reduzierte Komplementaktivierung aufweist. Eine Modifikation an polymeren Oberflächen ist das Konzept der partiellen Ladungsübertragung durch Komplexierung (Dotierung) auf konjugierte Polymere. (Lit. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry Vol A 21, 429ä445 (1992) Verlag Chemie, Weinheim.Prinzip Der Zusatz von Elektronen-Donatoren oder Akzeptoren bewirkt unter Reduktion bzw. Oxidation des polymeren Grundgerüstes den Umschlag von Isolatoreigenschaften in metallische Leitfähigkeit. Durch diese Redoxreaktion wird eine deutliche Erhöhung der Elektronenbeweglichkeit und hohe elektrische Leitfähigkeit erreicht. Voraussetzung für das Zustandekommen der elektrischen Leitfähigkeit ist neben dem hohen Ordnungsgrad der Charge-Transfer Partner vor allem der partielle Ladungsübergang vom Donor zum Akzeptor. Ziel ist es, mit der Modifizierung und Einführung von interessanten Seitengruppen nach Bedarf hydrophil/hydrophobes Verhalten autoregulatorisch zu gestalten. Dies würde bedeuten, daß die entscheidenden Interaktionen wie Proteinadhärenz in Mono-Layer Form mit den konsekutiv involvierten Thrombogenitätsmechanismen wie Plättchenaktivierung und -adhärenz, intrinsische Aktivierung der Gerinnung, Leukozytenadhärenz etc. durch die dotierte artifizielle Oberfläche antagonisiert werden kann.Variationen der Versuchsparameter1. Permeabilität Polymerfolien verschiedene Typen:ä Polyamide <ä Polyester <ä Polyolefine <ä Polysilikone <ä Polystyrol <ä Copolymerisation <ä Polyflour <(f) Dicke; Gasdruck; O¥/N¥/CO¥ Feuchtigkeit, H¥O, isotone Flüssigkeiten , Blut u. a.2. O¥-Anteil im Blut über ESR, NMR Radikale im Blut(f) arteriell, venös3. Ergänzungen zur Permeabilität z. B. von elektrisch leitfähigen Materialien (f) gefüllte Polymere z. B. Ruß oder andere leitfähige Partner, intrinsisch leitfähige Polymere z. B. PPY.4. Oberflächenverhalten O¥a) reversibel: z. B. abpumpenb) fixiertc) chemisch reagiert: Peroxid, Hydroxid, COOH, CHO, OH, z. B. mit ESCA, IR o. ä.(f) Zeit, Druck, Bedingungen auch physiologisch.5. Belegung von Polymeroberflächen mit Sauerstoff (oder ä. Luft N¥, CO¥, CO) Kontrolle per ELFOberfläche: trocken, feucht (d. h. spezielle Lösungsmittelsysteme).6. Wirkstoff-Freisetzunga) Korrelation: Trägermaterialelektr. leitfähige Polymereneutrale Materialien(indifferent)b) Wirkstofftyp (z. B. Insulin), verschiedene Typen der Präparation, Grad der Freisetzung7. Polymere Depotmaterialien: Typvariationen und Umhüllungen In VIVO und In VITRO Doppelexperiment über die Funktion von isolierten Langerhanns'schen Inselzellen in Silikonkathetern. Einführung: Aus strömungsphysikalischer Sicht beruht die rasch eintretende funktionelle Immobilisierung verkapselter Inselzellen im Vaskularisationsmodell mit Anschluß an den Blutkreislauf (offenporiger Kapillaren zirkulär im textilen Träger einer Gefäßendoprothese) auf einem laminaren Strömungsprofil, bei der die dynamische Viskosität die Adhärenz molekularer Strukturen begünstigt. Gegenüber dem Gefäßsystem des Kreislaufs haben wir im Herzen nicht mehr die Symmetrie eines laminaren Geschwindigkeitsprofils, so daß die Proteinadhärenz unterbleibt. Aus diesem Grund ist die re. Herzkammer sowohl vom einfachen peripheren Zugang als auch strömungs-physikalisch ein geeigneter Implanatationsort für verkapselte Gewebe. Material und Methode: Die immunologischen Aspekte der immunseparierenden Membranen blieben bei dieser Arbeit unberücksichtigt. Aus ethischer Verantwortlichkeit gegenüber Großtierversuchen haben wir ein Modell angewendet, wo eine in Vitro und eine in Vitro Aussage miteinander gekoppelt sind. Dadurch konnte eine experimentell bedingte irreversible Krankheitserzeugung vermieden werden ohne daß die Aussagekraft über den in Vitro Teil qualitativ beeinträchtigt wäre. Folgendes Vorgehen: Wir haben jeweils 3000 Inselzellen von Lewis Ratten in 2 mikro­porösen Silikonkatheter mit einem molekularen "cut-of" zw. 50ä140 Kilo-dalton und einem Kapillardurchmesser zw. 500ä600 µ implantiert. Isolation und Präparation: Die Inselzellen wurden bei Lewis Ratten durch duktale Erweiterung isoliert. (10 ml Krebs-Ringer Lösung und einer 2-Schrift Kollagenase Verdauung (1.2 und 0.7 mg/ml Sigma Typ XI St. Louis USA, n. van Suylichem et. al.). Der Reinheitsgrad wurde durch diskontinuierlichen Dextran-Gradienten erzielt. Vor der Transplantation wurden die Zellen über Nacht mit RPMI-1640 Medium und 10%iger fetalem Rinderserum inkubiert (Gibco, Karlsruhe). Dann wurden die Organzellen in das Kapillarmembransystem des Silikonkatheters eingefüllt. Anschließend erfolgte die Implantation des 1. Katheters via V.jugularis externa in das re. Kammersystem eines nicht diabetischen Schäferhundorganismus. Nach externer Fixierung verweilte der Katheter für ca. 4 Wochen im Organismus des Hundes. Der 2. Katheter wurde extravskulär unter die Bauchdecke plaziert. Zur Durchführung einer statischen Glukosebelastung haben wir die Katheter in jeweils 6 kleine Segmente zerteilt und in Petrischalen mit 50 mg % Glukose äquilibriert für die Dauer von 60 min. (in 5 ml Krebs-Ringer-buffer pH 7.41%ige RIA grade bovine albumin sigma Heidelberg). Nach einer Stunde wurden die Inselzellen mit 300 mg % Glucose für 2 Stunden stimuliert. Um die Fähigkeit der Insulinsekretion zur "down regulation" nach der Stimulation beurteilen zu können, wurden die Inselzellen am Ende wieder in 50%iges Glucosemedium umgefüllt. Das Medium wurde nach 30, 60, 180 und 210 min. gewechselt. Die Proben wurden nach 30, 60,180, 210 und 240 min. zur Insulinmessung entnommen. Die Insulinkonzentration wurde mit einem Radioimmunassay bestimmt. (RIA Gnost Behring Werke Marburg) Ratten Insulinstandard, Novo Koepenhavn). Jeder Wert repräsentiert 2 Werte. Ergebnisse: Bei 50%iger Glucosebelastung betrug der 30 min Wert der Insulinsekretion 250 in U/L. Aus dem extravaskulären Kontrollsegment (Katheter in Bauchdecke) konnte keine Insulinsekretion mehr nachgewiesen werden. Der 60 min Wert betrug ebenfalls 250 m U/L. Bei der 300 mg % Glucosebelastung zeigte sich ein 2 Stundenwert von 750 m U/L. (Kontrolle: keine Insulinfreisetzung). Der 180 min Wert zeigte mit 1600 m U/L den höchsten Wert. (Kontrolle neg.). Die Insulinsekretion des 4 Stundenwertes war auf 200 m U/L abgesunken (down regulation). Diskussion: Die nach einer statischen Glucosebelastung in vitro gemessenen Insulinwerte des in einem nicht diabetischen Hundeorganismus mit verkapselten Inselzellen implantierten Silikonkatheters sind nach 4-wöchiger Verweildauer ein Beweis für die ausreichende Nutrition bzw. Oxygenierung in einem venösen Kompartiment. Aus diesem Grund können wir die Strömung als einen wichtigen adhäsionsverhindernden Faktor ansehen. Der Funktionsausfall im extravaskulären Kontrollsystem ist ebenfalls ein hinreichender Gegenbeweis.