Title:
VERFAHREN ZUM RAFFINIEREN VON REINEM THIOFLAVIN T, VERFAHREN ZUM HERSTELLEN VON REINEM THIOFLAVIN T, ZUSAMMENSETZUNG, DIE THIOFLAVIN T ENTHÄLT, UND VERFAHREN ZUM NACHWEISEN VON AMYLOID
Kind Code:
T5


Abstract:

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Reinigen von reinem Thioflavin T, das einen Schritt des Herstellens einer Thioflavin T-Lösung, in welchem rohes Thioflavin T in einem polaren Lösungsmittel gelöst wird, und einen Schritt des Durchführens einer Flüssig-Flüssig-Extraktion der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren Lösungsmittel aufweist. embedded image




Inventors:
Satozono, Hiroshi (Shizuoka, Hamamatsu-shi, JP)
Application Number:
DE112016004434T
Publication Date:
06/28/2018
Filing Date:
09/27/2016
Assignee:
HAMAMATSU PHOTONICS K.K. (Shizuoka, Hamamatsu-shi, JP)
International Classes:



Attorney, Agent or Firm:
Grünecker Patent- und Rechtsanwälte PartG mbB, 80802, München, DE
Claims:
Verfahren zum Reinigen von reinem Thioflavin T, umfassend:
einen Schritt des Herstellens einer Thioflavin T-Lösung, in welchem rohes Thioflavin T in einem polaren Lösungsmittel gelöst wird; und
einen Schritt des Durchführens einer Flüssig-Flüssig-Extraktion der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren Lösungsmittel.

Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Flüssig-Flüssig-Extraktionsschritt in einem Zustand durchgeführt wird, in welchem Licht mit einer Wellenlänge von 475 nm oder niedriger blockiert ist.

Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, außerdem umfassend einen Schritt des Messens der Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz der Thioflavin T-Lösung, welche eine Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist, und des Bestimmens, ob die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht oder nicht, wobei, wenn in dem Bestimmungsschritt festgestellt wird, dass die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau nicht erreicht, weiterhin der Schritt der Flüssig-Flüssig-Extraktion für die Thioflavin T-Lösung durchgeführt wird.

Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das polare Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem wässrigen Lösungsmittel, Methanol, Ethanol, Acetonitril und Dimethylsulfoxid, und einem Lösungsmittelgemisch, in welchem zwei oder mehr Arten davon miteinander vermischt sind.

Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das unpolare Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hexan, Heptan, Octan, Cyclohexan, Toluol und Xylol, und einem Lösungsmittelgemisch, in welchem zwei oder mehr Arten davon miteinander vermischt sind.

Verfahren zum Herstellen von reinem Thioflavin T umfassend einen Reinigungsprozess zum Durchführen des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.

Zusammensetzung, die Thioflavin T enthält, in welcher die Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm auf dem Hintergrundniveau liegt.

Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, zur Verwendung zum Nachweisen von Amyloid.

Verfahren zum Nachweisen von Amyloid umfassend:
einen Schritt des Inkontaktbringens einer Untersuchungsprobe mit einem Fluoreszenzreagenz, das Thioflavin T enthält; und
einen Schritt des Nachweisens der Fluoreszenz des Thioflavin T,
wobei das Fluoreszenzreagenz die Zusammensetzung gemäß Anspruch 7 oder 8 ist.

Nachweisverfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Amyloid β-Amyloid ist.

Description:
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Reinigen von reinem Thioflavin T. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen von reinem Thioflavin T, eine Zusammensetzung, die Thioflavin T enthält, und ein Verfahren zum Nachweisen von Amyloid.

Stand der Technik

Thioflavin T (ThT) ist das berühmteste Material, das als ein fluoreszierendes Färbepigment für Amyloid, welches ein spezielles Proteinaggregat ist, bekannt ist, und es wird für verschiedene Untersuchungen verwendet.

Es ist bekannt, dass von einem im Handel erhältlichen ThT-Reagenz zwei Arten von Fluoreszenz beobachtet werden. Diese zwei Arten von Fluoreszenz sind eine Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm (die Anregungswellenlänge beträgt zum Beispiel 350 nm) und eine Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 480 nm (die Anregungswellenlänge beträgt zum Beispiel 430 nm). Es bleibt noch immer unklar, ob die Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen (Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm) von ThT oder von Verunreinigungen in einem ThT-Reagenz herrührt.

Zum Beispiel wurde gemäß frühen Untersuchungen in Nicht-Patentliteratur 1 berichtet, dass die Verunreinigungen in einem ThT-Reagenz eine Absorption für eine Wellenlänge von 350 nm aufweisen und sie in Hexan oder Cyclohexan gelöst werden. Da die Fluoreszenz mit der Wellenlänge 445 nm selbst nach einer Wiederholung der ThT-Reinigung (Umkristallisation) erhalten bleibt, wird mittlerweile gemäß Nicht-Patentliteratur 2 der Schluss gezogen, dass es eine Fluoreszenz ist, die von ThT herrührt, und als Fluoreszenz kategorisiert, welche von einem Teil einer funktionellen Gruppe, die ThT bildet, emittiert wird (lokale Fluoreszenz). Diese lokale Fluoreszenz-Hypothese wird von Nicht-Patentliteratur 3 gestützt und der physikalische und chemische Ursprung der Hypothese wird in dem gleichen Dokument erörtert. Mittlerweile wird in Nicht-Patentliteratur 4 berichtet, dass ThT eine Photoreaktion bei Belichtung mit Licht verursacht und, indem es eine Absorptionsbande in der Nähe einer Wellenlänge von 350 nm aufweist, ein Photoreaktionsprodukt erzeugt, welches eine Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 450 nm emittiert, und es wird beschrieben, dass die Verunreinigungen in einem ThT-Reagenz von einem Photoreaktionsprodukt von ThT herrühren.

Liste der zitierten LiteraturPatentliteratur

  • Nicht-Patentliteratur 1: J. Appl. Spectrosc., 2003, Bd. 70, Nr. 6, S. 868-874.
  • Nicht-Patentliteratur 2: J. Chem. Biol., 2010, Bd. 3, S. 1-18
  • Nicht-Patentliteratur 3: Dyes Pigments, 2014, Bd. 110, S. 97-105
  • Nicht-Patentliteratur 4: J. Phys. Chem. B, 2013, Bd. 117, S. 3459-3468

Zusammenfassung der ErfindungProbleme, die durch die Erfindung gelöst werden sollen

Der Grund dafür, dass es noch immer unklar bleibt, ob die Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen (Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm) von ThT oder Verunreinigungen in einem ThT-Reagenz herrührt, ist der, dass gemäß einer Methode des Standes der Technik ein ThT-Reagenz, das keine Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen aufweist, (reines ThT) nicht erhalten werden kann.

In Anbetracht des technischen Hintergrundes, welcher vorstehend beschrieben ist, ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Erhalten eines ThT-Reagenzes, das keine Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen aufweist, das heißt ein Verfahren zum Erhalten von reinem ThT bereitzustellen.

Mittel zum Lösen der Probleme

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Reinigen von reinem Thioflavin T bereit, das einen Schritt des Herstellens einer Thioflavin T-Lösung, in welchem rohes Thioflavin T in einem polaren Lösungsmittel gelöst wird, und einen Schritt des Durchführens einer Flüssig-Flüssig-Extraktion der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren Lösungsmittel einschließt.

Da das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit einem unpolaren Lösungsmittel nach dem Herstellen von Thioflavin T in einer Lösung mit einem polaren Lösungsmittel aufweisen soll, kann ein ThT-Reagenz, das keine Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen aufweist, (reines ThT) erhalten werden. Dies bedeutet auch, dass die Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen nicht die Fluoreszenz ist, die von ThT herrührt, sondern die Fluoreszenz, die von fluoreszierenden Verunreinigungen herrührt. Außerdem wird es gemäß den Untersuchungen, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, auch offensichtlich, dass die fluoreszierenden Verunreinigungen erneut erzeugt werden, wenn ThT, das keine Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen aufweist, Licht ausgesetzt ist (insbesondere Licht mit einer Wellenlänge von 475 nm oder niedriger). Es wird nämlich angenommen, dass die fluoreszierenden Verunreinigungen ein Photoreaktionsprodukt von ThT sind.

In der vorliegenden Beschreibung bedeutet das „rohe Thioflavin T (rohe ThT)“ eine Mischung aus den vorstehend erwähnten fluoreszierenden Verunreinigungen und ThT. Die herkömmlicherweise als „ThT“ bezeichneten Substanzen entsprechen rohem ThT der vorliegenden Beschreibung, da sie alle die fluoreszierenden Verunreinigungen enthalten, die vorstehend beschrieben sind.

In der vorliegenden Beschreibung bedeutet das „reine Thioflavin T (reine ThT)“ ein ThT-Reagenz, das keine Fluoreszenz auf der Seite der kurzen Wellenlängen aufweist, und das „ThT-Reagenz“ hat die gleiche Bedeutung wie eine molekulare Anordnung, die ThT enthält (Zusammensetzung). Somit kann das „reine ThT“ auch als eine molekulare Anordnung von ThT, welche im Wesentlichen keine fluoreszierenden Verunreinigungen enthält, oder eine molekulare Anordnung, welche im Wesentlichen aus ThT besteht, erkannt werden. Es ist bevorzugt, dass das „reine ThT“ eine molekulare Anordnung von ThT, welche keine fluoreszierenden Verunreinigungen enthält, oder eine molekulare Anordnung, welche aus ThT besteht, ist.

Was das vorstehend beschriebene Verfahren anbelangt, ist es bevorzugt, dass der Schritt der Flüssig-Flüssig-Trennung in einem Zustand durchgeführt wird, in dem Licht mit einer Wellenlänge von 475 nm oder niedriger blockiert ist. Entsprechend kann die Produktion eines neuen Photoreaktionsproduktes (fluoreszierende Verunreinigungen) stärker unterdrückt werden und somit kann reines ThT mit noch höherer Effizienz gereinigt werden.

Es ist auch möglich, dass das Verfahren außerdem einen Schritt des Messens der Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz einer Thioflavin T-Lösung, welche eine Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist, und des Bestimmens, ob die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht oder nicht, einschließt, wobei, wenn in dem Bestimmungsschritt festgestellt wird, dass die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau nicht erreicht, weiterhin ein Schritt der Flüssig-Flüssig-Extraktion der Thioflavin T-Lösung durchgeführt wird. Entsprechend ist es möglich, einen Fortgang der Reinigung zu haben, während die von den fluoreszierenden Verunreinigungen herrührende Fluoreszenz überwacht wird.

Das polare Lösungsmittel kann ein Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem wässrigen Lösungsmittel, Methanol, Ethanol, Acetonitril und Dimethylsulfoxid, und ein Lösungsmittelgemisch, in welchem zwei oder mehr Arten davon miteinander vermischt sind, sein. Außerdem ist es auch möglich, dass das unpolare Lösungsmittel aus der Gruppe bestehend aus Hexan, Heptan, Octan, Cyclohexan, Toluol und Xylol, und einem Lösungsmittelgemisch, in welchem zwei oder mehr Arten davon miteinander vermischt sind, ausgewählt ist.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Herstellen von reinem Thioflavin T bereit, welches einen Reinigungsprozess zum Durchführen des vorstehenden Verfahrens zum Reinigen von reinem Thioflavin T einschließt.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit, die Thioflavin T enthält, in welcher die Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm auf dem Hintergrundniveau liegt.

Da die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung eine ThT-haltige Zusammensetzung ist, in welcher fluoreszierende Verunreinigungen nicht eingeschlossen sind, kann, wenn sie zum Beispiel für die Fluoreszenzfärbung von Amyloid verwendet wird, der Einfluss der fluoreszierenden Verunreinigungen ausgeschlossen werden, so dass die Testergebnisse und Diagnoseergebnisse mit höherer Genauigkeit erhalten werden können. Als solche ist die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Verwendung zum Nachweisen von Amyloid geeignet. Die vorliegende Erfindung kann nämlich auch als eine Verwendung oder eine Anwendung einer Zusammensetzung, die Thioflavin T enthält, in welcher die Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm auf dem Hintergrundniveau liegt, zum Nachweisen von Amyloid erkannt werden. Außerdem wird die vorliegende Erfindung auch als eine Zusammensetzung, die Thioflavin T enthält, zur Verwendung zum Nachweisen von Amyloid erkannt, in welcher die Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm auf dem Hintergrundniveau liegt.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweisen von Amyloid bereit, welches einen Schritt des Inkontaktbringens einer Untersuchungsprobe mit einem fluoreszierenden Reagenz, das Thioflavin T enthält, und einen Schritt des Nachweisens der Fluoreszenz des Thioflavin T einschließt, in welchem das fluoreszierende Reagenz die vorstehend beschriebene Zusammensetzung ist.

Gemäß dem Verfahren zum Nachweisen von Amyloid der vorliegenden Erfindung kann Amyloid mit höherer Genauigkeit nachgewiesen werden unter dem Gesichtspunkt, dass das Verfahren eine ThT-haltige Zusammensetzung verwendet, in welcher fluoreszierende Verunreinigungen nicht enthalten sind.

Das Amyloid kann β-Amyloid sein. Es ist bekannt, dass sich β-Amyloid im Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit ansammelt (senile Plaques). Der Nachweis von β-Amyloid mit hoher Genauigkeit kann sehr zu der Aufklärung von Symptomen beitragen, die mit der Alzheimer-Krankheit oder dergleichen verbunden sind.

Auswirkungen der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, reines ThT zu erhalten, welches nicht durch eine Methode des Standes der Technik erhalten werden kann.

ThT ist ein fluoreszierendes Färbereagenz, welches die erste Wahl für die Amyloidfärbung ist, und es wird nicht nur für eine Untersuchung von Amyloid verwendet, sondern auch für eine pathologische Diagnose einer Erkrankung, die mit Amyloid zusammenhängt. Durch die Verwendung von reinem ThT für die Amyloidfärbung kann der Einfluss von fluoreszierenden Verunreinigungen auf Messergebnisse ausgeschlossen werden und somit können Testergebnisse und Diagnoseergebnisse mit höherer Genauigkeit erhalten werden.

Figurenliste

  • 1 ist ein Fließdiagramm, welches das Reinigungsverfahren gemäß einer Ausführungsform veranschaulicht.
  • 2 ist eine Zeichnung, welche die Beziehung zwischen der Anzahl der Flüssig-Flüssig-Extraktionen und der Fluoreszenzintensität zeigt.
  • 3 ist eine Zeichnung, in welcher Fluoreszenzspektren einer ThT-Lösung vor und nach der Reinigung miteinander verglichen werden.

Ausführungsformen zum Durchführen der Erfindung

Nachstehend werden Ausführungsformen zum Durchführen der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Ausführungsformen beschränkt, die nachstehend angegeben sind.

[Thioflavin T]

Thioflavin T (ThT) ist durch die folgende chemische Formel wiedergegeben und es ist eine bekannte chemische Verbindung, die auch als 4-(3,6-Dimethyl-1,3-benzothiazol-3-ium-2-yl)-N,N-dimethylanilin-chlorid bezeichnet wird. embedded image

ThT weist eine Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 480 nm auf (die Anregungswellenlänge ist zum Beispiel 430 nm). Mittlerweile erzeugt ThT bei Belichtung mit Licht ein Photoreaktionsprodukt (fluoreszierende Verunreinigungen), welches eine Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist (die Anregungswellenlänge ist zum Beispiel 350 nm). Bis jetzt bleibt es unmöglich, ThT von einer Mischung (rohem ThT) aus den fluoreszierenden Verunreinigungen und ThT abzutrennen.

Das Verfahren zum Erhalten von rohem ThT unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Es ist zum Beispiel möglich, es durch Kaufen eines im Handel erhältlichen ThT-Reagenzes oder durch Synthetisieren desselben gemäß einem bekannten Verfahren zu erhalten.

[Verfahren zum Reinigen von Thioflavin T]

Das Verfahren zum Reinigen von Thioflavin T gemäß dieser Ausführungsform schließt einen Schritt des Herstellens einer Thioflavin T-Lösung, in welchem rohes Thioflavin T in einem polaren Lösungsmittel gelöst wird, und einen Schritt des Durchführens einer Flüssig-Flüssig-Extraktion der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren Lösungsmittel ein. Außerdem ist es auch möglich, ferner einen Schritt des Messens der Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz einer Thioflavin T-Lösung, welche eine Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist, und des Bestimmens, ob die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht oder nicht, einzuschließen. Gemäß dem Reinigungsverfahren dieser Ausführungsform kann reines ThT erhalten werden.

1 ist ein Fließdiagramm, welches das Reinigungsverfahren gemäß einer Ausführungsform veranschaulicht. Nachstehend wird ein Beispiel für das Reinigungsverfahren auf der Grundlage von 1 beschrieben.

Der erste Schritt ist ein Schritt des Herstellens einer Thioflavin T-Lösung, in welchem rohes Thioflavin T in einem polaren Lösungsmittel gelöst wird. Die ThT-Lösung kann zum Beispiel durch Auflösen von rohem ThT in einem polaren Lösungsmittel hergestellt werden. Außerdem kann, wenn ThT als eine Lösung hergestellt wird, wobei es in einem polaren Lösungsmittel gelöst wird, während es synthetisiert wird oder dergleichen, die Lösung als eine ThT-Lösung genommen werden.

Als das polare Lösungsmittel kann ein Lösungsmittel, in welchem ThT gelöst werden kann, ohne irgendeine besondere Beschränkung verwendet werden. Als das polare Lösungsmittel kann zum Beispiel ein Lösungsmittel mit einer relativen Permittivität von 10 oder mehr verwendet werden. Spezifische Beispiele für das polare Lösungsmittel schließen ein wässriges Lösungsmittel, Methanol, Ethanol, Acetonitril, Dimethylsulfoxid und ein Lösungsmittelgemisch, in welchem zwei oder mehr Arten davon miteinander vermischt sind, ein. Beispiele für das wässrige Lösungsmittel schließen Wasser (welches gereinigtes Wasser, das für pharmazeutische Produkte verwendet wird, Ionenaustauschwasser, das durch Ionenaustausch, Ultrafiltration oder dergleichen hergestellt wird, und ultrareines Wasser einschließt), eine Pufferlösung wie phosphatgepufferte physiologische Salzlösung (PBS) und Trisgepufferte physiologische Salzlösung (TBS), und physiologische Salzlösung ein. Das polare Lösungsmittel, das verwendet werden soll, wird in Abhängigkeit von der Verwendung von ThT nach der Reinigung in geeigneter Weise ausgewählt. Zum Beispiel ist ein wässriges Lösungsmittel als ein polares Lösungsmittel bevorzugt, wenn ThT nach der Reinigung für den Nachweis von Amyloid verwendet wird.

Die ThT-Konzentration in der ThT-Lösung unterliegt keiner besonderen Beschränkung. Sie liegt jedoch im Allgemeinen in einem Bereich von 0,001 bis 10 mmol/l. Unter dem Gesichtspunkt der weiteren Unterdrückung einer neuen Erzeugung eines Photoreaktionsproduktes (fluoreszierende Verunreinigungen) während des Reinigungsprozesses ist es bevorzugt, eine niedrige ThT-Konzentration zu haben. Die ThT-Konzentration liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,05 bis 5 mmol/l. Sie liegt mehr bevorzugt in einem Bereich von 0,025 bis 2,5 mmol/l und noch mehr bevorzugt in einem Bereich von 0,1 bis 1 mmol/l. Außerdem kann die ThT-Konzentration in der ThT-Lösung in Abhängigkeit von der Verwendung des ThT nach der Reinigung so eingestellt werden, dass es nicht notwendig ist, erneut eine Verdünnung oder Konzentration durchzuführen.

Der zweite Schritt ist ein Schritt des Durchführens einer Flüssig-Flüssig-Extraktion der Thioflavin T-Lösung mit einem unpolaren Lösungsmittel. Gemäß diesem Schritt wandern fluoreszierende Verunreinigungen aus der ThT-Lösung in ein unpolares Lösungsmittel, während ThT in der ThT-Lösung bleibt, so dass die ThT-Lösung gewaschen wird. Die Flüssig-Flüssig-Extraktion (Flüssigkeitstrennung) kann auf der Grundlage eines bekannten Verfahrens durchgeführt werden. Speziell kann die Flüssig-Flüssig-Extraktion beispielsweise unter Verwendung eines Scheidetrichters oder einer Flüssigkeitsextraktionsvorrichtung durchgeführt werden.

Als das unpolare Lösungsmittel kann ein Lösungsmittel, welches ThT nicht löst und eine Schichtentrennung von einer ThT-Lösung aufweist, ohne irgendeine besondere Beschränkung verwendet werden. Als das unpolare Lösungsmittel kann zum Beispiel ein organisches Lösungsmittel mit einer relativen Permittivität von weniger als 10 verwendet werden. Zu spezifischen Beispielen für das unpolare Lösungsmittel gehören aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Octan oder Cyclohexan, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Toluol oder Xylol und ein Lösungsmittelgemisch, in welchem zwei oder mehr Arten davon miteinander vermischt sind.

Der zweite Schritt kann auch ein Schritt sein, in welchem, wenn ein Vorgang, bei dem durch Zugeben eines nicht-extrahierten unpolaren Lösungsmittels zu einer ThT-Lösung, gefolgt von ausreichendem Mischen und Erhalten einer Schichtentrennung der ThT-Lösung (polaren Lösungsmittelschicht) von der unpolaren Lösungsmittelschicht eine Verteilung eines gelösten Stoffs erhalten wird, als ein Extraktionsvorgang angesehen wird, ein solcher Extraktionsvorgang zum Beispiel zwei- oder mehrmals wiederholt wird. Wenn der Extraktionsvorgang zwei- oder mehrmals wiederholt wird, ist es günstig, dass die ThT-Lösung nach der Schichtentrennung zurückgewonnen wird, ein nicht-extrahiertes unpolares Lösungsmittel zu der rückgewonnenen ThT-Lösung zugegeben wird und der vorstehend erwähnte Vorgang wiederholt wird.

Die Zahl der Wiederholungen des Extraktionsvorgangs kann in geeigneter Weise als die Zahl festgelegt werden, die zum Erhalten von reinem ThT in Abhängigkeit von der Art des polaren Lösungsmittels und des unpolaren Lösungsmittels, die verwendet werden sollen, und der Konzentration des gelösten Stoffs erforderlich ist. Die zum Erhalten von reinem ThT erforderliche Zahl kann festgelegt werden durch Bestätigen, gemäß der Wiederholung des zweiten Schritts und dritten Schritts, die später beschrieben wird, dass die Fluoreszenzintensität zum Beispiel das Hintergrundniveau erreicht. Wenn zum Beispiel Wasser (reines Wasser) als ein polares Lösungsmittel verwendet wird und Hexan als ein unpolares Lösungsmittel verwendet wird, kann reines ThT durch wenigstens zehnmaliges Wiederholen des Extraktionsvorgangs erhalten werden.

Der dritte Schritt ist ein Schritt der Messung der Lichtemissionsintensität der Floreszenz (Fluoreszenzintensität) einer ThT-Lösung, welche eine Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist. Die Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm ist für die fluoreszierenden Verunreinigungen spezifisch.

In dem dritten Schritt wird zum Beispiel ein Teil der ThT-Lösung nach der Flüssig-Flüssig-Extraktion (polare Lösungsmittelschicht) gesammelt, um eine Messprobe zu erhalten, und die Fluoreszenzintensität wird gemessen. Für die Messung der Fluoreszenzintensität kann z. B. ein Fluoreszenzspektralphotometer, ein Fluoreszenzplattenlesegerät oder dergleichen verwendet werden. Genauer gesagt wird eine Messprobe mit Licht mit einer Wellenlänge von 300 bis 430 nm belichtet und die Lichtemission mit einer Wellenlänge von 440 bis 460 nm (Fluoreszenz) wird entsprechend gemessen. Die Wellenlänge des Lichts zur Belichtung kann innerhalb des vorstehend erwähnten Bereichs in geeigneter Weise festgelegt werden. Es ist jedoch vorzugsweise eine Wellenlänge von 350 nm. Die Wellenlänge der Fluoreszenz, die gemessen werden soll, kann innerhalb des vorstehend erwähnten Bereichs in geeigneter Weise festgelegt werden. Es ist jedoch vorzugsweise eine Wellenlänge von 440 nm.

In dem vierten Schritt erfolgt eine Bestimmung, um zu sehen, ob die in dem dritten Schritt gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht oder nicht. Wenn festgestellt wird, dass die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau nicht erreicht, werden der zweite Schritt (Schritt zur Flüssig-Flüssig-Extraktion) und der dritte Schritt (Schritt zur Messung der Lichtemissionsintensität) zusätzlich wiederholt. Wenn festgestellt wird, dass die gemessene Lichtemissionsintensität das Hintergrundniveau erreicht, ist die Reinigung beendet.

Wenn außerdem die Bedingungen für die Flüssig-Flüssig-Extraktion (wie etwa die Extraktionszahl, das Volumenverhältnis von polarem Lösungsmittel/unpolaren Lösungsmittel, oder dergleichen) vorher festgelegt werden, ist es nicht notwendig, den dritten Schritt und den vierten Schritt durchzuführen.

Das „Hintergrundniveau“ bedeutet, dass die Fluoreszenzintensität einer gereinigten ThT-Lösung nahezu die gleiche ist wie die Fluoreszenzintensität einer reinen ThT-Lösung. Die Bestimmung des „Hintergrundniveaus“ kann zum Beispiel so durchgeführt werden, wie es nachstehend beschrieben ist. Zusätzlich zu der Fluoreszenzintensität einer gereinigten ThT-Lösung bei einer Wellenlänge von 440 nm wird nämlich auch die Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge von 480 nm gemessen und das Fluoreszenzverhältnis, das durch Dividieren der Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge von 440 nm durch die Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge von 480 nm resultiert, wird erhalten. Wenn das Fluoreszenzverhältnis innerhalb eines Bereichs von 0,4 bis 1,0 liegt, kann es als „Hintergrundniveau“ festgesetzt werden. Hierin wird es vorzugsweise als „Hintergrundniveau“ festgesetzt, wenn das Fluoreszenzverhältnis innerhalb eines Bereichs von 0,5 bis 0,9 liegt, und es wird mehr bevorzugt als „Hintergrundniveau“ festgesetzt, wenn das Fluoreszenzverhältnis innerhalb eines Bereichs von 0,6 bis 0,8 liegt. Außerdem kann es, kürzer gefasst, als „Hintergrundniveau“ festgesetzt werden, wenn der Messwert der Fluoreszenzintensität, welche in dem dritten Schritt gemessen wird, nicht weiter abnimmt.

Die ThT-Lösung kann nach Beendigung der Reinigung direkt für die nächste Verwendung eingesetzt werden. Falls erforderlich, kann sie nach dem Entfernen des polaren Lösungsmittels als ThT-Pulver für die nächste Verwendung eingesetzt werden. Sie kann auch für die nächste Verwendung eingesetzt werden, nachdem ThT-Pulver erneut in einem beliebigen Lösungsmittel aufgelöst wurde.

Das vorstehend erwähnte Reinigungsverfahren wird vorzugsweise in einem Zustand durchgeführt, in welchem Licht mit einer Wellenlänge von 475 nm oder niedriger blockiert ist. Entsprechend wird die Erzeugung von neuen fluoreszierenden Verunreinigungen unterdrückt, so dass die Wirksamkeit des gesamten Reinigungsverfahrens noch gesteigert werden kann. Es ist möglich, dass der gesamte Prozess des Reinigungsverfahrens in einem Zustand durchgeführt wird, in dem das Licht blockiert ist. Es ist jedoch auch möglich, dass der Prozess nach dem zweiten Schritt in einem Zustand durchgeführt wird, in dem das Licht blockiert ist. Das Verfahren zum Blockieren von Licht mit einer Wellenlänge von 475 nm oder niedriger kann in geeigneter Weise ausgewählt werden. Speziell ist es möglich, den Reinigungsvorgang unter Rotlicht durchzuführen oder den Reinigungsvorgang in einem Zustand durchzuführen, in dem Licht (vollständig) blockiert ist.

[Verfahren zum Herstellen von Thioflavin T]

Das Verfahren zum Herstellen von Thioflavin T gemäß dieser Ausführungsform schließt einen Reinigungsprozess zum Durchführen des Verfahrens zum Reinigen von Thioflavin T ein, welcher vorstehend beschrieben worden ist. Gemäß dem Herstellungsverfahren dieser Ausführungsform kann reines ThT erhalten werden.

Das Herstellungsverfahren gemäß dieser Ausführungsform kann auch vor dem Reinigungsprozess einen Syntheseprozess zum Synthetisieren von ThT, einen Auflösungsprozess zum Auflösen von rohem ThT in einem polaren Lösungsmittel oder dergleichen einschließen. Es ist auch möglich, dass ein Verpackungsprozess zum Verpacken des erhaltenen reinen ThTs nach dem Reinigungsprozess eingeschlossen ist. Der Verpackungsprozess kann zum Beispiel ein Prozess sein, in welchem die ThT-Lösung in einen Behälter wie eine lichtundurchlässige Flasche (wie etwa eine braune Flasche) eingefüllt wird.

[Thioflavin T enthaltende Zusammensetzung]

Die Thioflavin T enthaltende Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform ist eine Zusammensetzung, in welcher die Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz mit einer Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm sich auf dem Hintergrundniveau befindet. Sie ist nämlich eine Zusammensetzung, welche im Wesentlichen keine fluoreszierenden Verunreinigungen einschließt, oder eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus ThT besteht (molekulare Anordnung). Die Zusammensetzung gemäß einer Ausführungsform ist eine Zusammensetzung, welche Thioflavin T enthält und, wenn sie mit Licht mit einer Wellenlänge von 350 nm belichtet wird, eine Lichtemissionsintensität der Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 440 nm auf dem Hintergrundniveau aufweist.

Die Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform kann eine beliebige von einer flüssigen Phase und einer festen Phase sein. Unter dem Gesichtspunkt der Unterdrückung der Erzeugung der fluoreszierenden Verunreinigungen wird die Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform vorzugsweise in einen Behälter wie eine lichtundurchlässige Flasche (wie etwa eine braune Flasche) gefüllt.

Die Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform kann durch das Reinigungsverfahren oder Herstellungsverfahren für ThT erhalten werden, welche vorstehend beschrieben sind.

Da die Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform im Wesentlichen keine fluoreszierenden Verunreinigungen enthält, kann, wenn sie für die Färbung von Amyloid verwendet wird, der Einfluss der fluoreszierenden Verunreinigungen auf die Messergebnisse ausgeschlossen werden, so dass die Testergebnisse und Diagnoseergebnisse mit noch höherer Genauigkeit erhalten werden können. Somit kann die Zusammensetzung gemäß dieser Ausführungsform in geeigneter Weise als eine Zusammensetzung zur Verwendung zum Nachweisen von Amyloid (Fluoreszenzreagenz zum Nachweisen von Amyloid) verwendet werden.

[Verfahren zum Nachweisen von Amyloid]

Amyloid stellt einen speziellen Aggregationszustand eines Proteins dar, welches eine spezifische β-Faltblattstruktur aufweist. In Abhängigkeit von einem Unterschied hinsichtlich des Proteins als Ausgangsmaterial sind viele Arten von Amyloid vorhanden. Im Fall von Insulin wird es nämlich als Insulin-Amyloid bezeichnet. Im Fall von β2-Mikroglobulin wird es als β2-Mikroglobulin-Amyloid bezeichnet und im Fall von Amyloid-β-Protein wird es als β-Amyloid bezeichnet. Die Ansammlung von Amyloid in einem menschlichen Körper kann eine Krankheitsursache sein. Zum Beispiel hängt β2-Mikroglobulin mit Dialyse-Amyloidose zusammen und Amyloid-β hängt mit der Alzheimer-Krankheit zusammen.

Das Verfahren zum Nachweisen von Amyloid gemäß dieser Ausführungsform kann gemäß einem gewöhnlichen Verfahren durchgeführt werden, mit der Ausnahme, dass die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung als ein Fluoreszenzreagenz verwendet wird.

Beispiele

Nachstehend wird die vorliegende Erfindung auf der Grundlage von Beispielen genauer beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.

Durch Auflösen von 3,4 mg ThT (hergestellt von AAT Bioquest Inc., entspricht dem rohen ThT in der vorliegenden Beschreibung) in 20 ml reinem Wasser wurde eine ThT-Lösung hergestellt.

Anschließend wurde die ThT-Lösung in einen Scheidetrichter gegeben, mit 50 mL Hexan versetzt und gründlich vermischt, um einen Extraktionsvorgang durchzuführen. Danach wurde von einem Hahn an der unteren Seite des Scheidetrichters die ThT-Lösung extrahiert. Ein Teil der ThT-Lösung wurde in einer Küvette gesammelt und für die Messung der Fluoreszenzintensität mit einer Anregungswellenlänge von 350 nm und einer Beobachtungswellenlänge von 440 nm unter Verwendung des Fluoreszenzspektralphotometers RF-5000 (hergestellt von SHIMADZU CORPORATION) verwendet.

Die vorstehend erwähnte Extraktion wurde zehnmal wiederholt, bis die Fluoreszenzintensität das Hintergrundniveau erreicht (der Messwert der Fluoreszenzintensität nicht weiter abnimmt). Die Beziehung zwischen der Zahl der Flüssig-Flüssig-Extraktionen und der Fluoreszenzintensität ist in 2 gezeigt. Es wurde festgestellt, dass die Fluoreszenzintensität bei der zehnten Extraktion das Hintergrundniveau erreicht. Außerdem wurde festgestellt, dass das Fluoreszenzverhältnis zwischen der Fluoreszenzintensität bei einer Beobachtungswellenlänge von 440 nm und der Fluoreszenzintensität bei einer Wellenlänge von 480 nm, welche getrennt gemessen wurde, 0,667 betrug. Es kann auch aus diesem Fluoreszenzverhältnis als das Hintergrundniveau festgesetzt werden.

Das Fluoreszenzspektrum der ThT-Lösung nach der Reinigung ist in 3 gezeigt. Zum Vergleich ist auch das Fluoreszenzspektrum der ThT-Lösung vor der Reinigung gezeigt. Wie aus 3 hervorgeht, wies die ThT-Lösung nach der Reinigung ein vollständiges Verschwinden der Fluoreszenz, welche eine Peakwellenlänge in der Nähe von 440 nm aufweist, auf, so dass nur die Fluoreszenz, welche eine Peakwellenlänge in der Nähe von 480 nm aufweist, die von ThT herrührt, beobachtet wurde. Es kann nämlich daraus der Schluss gezogen werden, dass ThT erhalten wird, aus dem fluoreszierende Verunreinigungen vollständig entfernt sind.