Title:
Antikörper, Verwendungen und Verfahren
Kind Code:
T5
Abstract:

Die vorliegende Erfinidung betrifft Anti-Human-OX40L-Antikörper, neue medizinische Verwendungen und Verfahren.



Inventors:
Campbell, Jamie (Cambridge, GB)
Kirby, Ian (Cambridge, GB)
Kosmac, Miha (Cambridge, GB)
Holmes, Steve (Cambridge, GB)
Application Number:
DE112015001085T
Publication Date:
12/08/2016
Filing Date:
03/03/2015
Assignee:
(Kymab Limited, Cambridge, GB)
International Classes:
Attorney, Agent or Firm:
df-mp Dörries Frank-Molnia & Pohlman Patentanwälte Rechtsanwälte PartG mbB, 80333, München, DE
Claims:
1. Antikörper oder Fragment davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet und um eine Bindung an das genannte hOX40L mit dem Antikörper 02D10 konkurriert, wobei der Antikörper oder das Fragment eine VH-Domäne beinhaltet, die eine HCDR3 beinhaltet, die das Motiv VRGXYYY beinhaltet, wobei X eine Aminosäure ist.

2. Antikörper oder Fragment nach Anspruch 1, wobei X eine neutrale Aminosäure ist, optional P oder G.

3. Antikörper oder Fragment davon, optional nach Anspruch 1 oder 2, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet und um eine Bindung an den genannten hOX40L mit dem Antikörper 02D10 konkurriert, wobei der Antikörper oder das Fragment eine VH-Domäne beinhaltet, die die HCDR3-Sequenz von SEQ ID NR. 40 oder 46 oder die HCDR3-Sequenz von SEQ ID NR. 40 oder 46 beinhaltet, die weniger als 5 Aminosäuresubstitutionen beinhalten.

4. Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die VH-Domäne eine VH-Domäne beinhaltet, die eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet, und abgeleitet von der Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments, wobei die humane JH-Gensegment IGHJ6 (z.B. IGHJ6*02) ist.

5. Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die VH-Domäne die HCDR1-Sequenz von SEQ ID NR. 36 oder 42 oder die HCDR1-Sequenz von SEQ ID NR. 36 oder 42 beinhaltet, die weniger als 4 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

6. Antikörper oder Fragment nach einem vorherigen Anspruch, wobei die VH-Domäne die HCDR2-Sequenz von SEQ ID NR. 38 oder 44 oder die HCDR2-Sequenz von SEQ ID NR. 38 oder 44 beinhaltet, die weniger als 5 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

7. Antikörper oder Fragment nach einem vorherigen Anspruch, wobei die VH-Domäne eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 34 oder eine Schwerketten-variable Domäne-Aminosäuresequenz beinhaltet, die wenigstens 80 % (z.B. wenigstens 85 %) identisch mit SEQ ID NR. 34 ist.

8. Antikörper oder Fragment nach einem vorherigen Anspruch, der/das eine erste und eine zweite Kopie der genannten VH-Domäne beinhaltet.

9. Antikörper oder Fragment nach einem vorherigen Anspruch, der/das eine VL-Domäne beinhaltet, die die LCDR1-Sequenz von SEQ ID NR. 54 oder 60 oder die LCRD3-Sequenz von SEQ ID NR. 54 oder 60 beinhaltet, die weniger als 5 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

10. Antikörper oder Fragment nach einem vorherigen Anspruch, der/das eine VL-Domäne beinhaltet, die die LCDR2-Sequenz von SEQ ID NR. 52 oder 58 oder die LCRD2-Sequenz von SEQ ID NR. 52 oder 58 beinhaltet, die weniger als 2 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

11. Antikörper oder Fragment nach einem vorherigen Anspruch, der/das eine oder die genannte VL-Domäne beinhaltet, wobei die VL-Domäne die LCDR1-Sequenz von SEQ ID NR. 54 oder 60 oder die LCRD1-Sequenz von SEQ ID NR. 54 oder 60 beinhaltet, die weniger als 4 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

12. Antikörper oder Fragment nach einem vorherigen Anspruch, der/das eine oder die genannte VL-Domäne beinhaltet, wobei die VL-Domäne eine Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 48 oder eine Leichtketten-variable Domäne-Aminosäuresequenz beinhaltet, die wenigstens 80 % (z.B. wenigstens 85 %) identisch mit SEQ ID NR. 48 ist.

13. Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 9 bis 12, der/das eine erste und eine zweite Kopie der genannten VL-Domäne beinhaltet.

14. Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei der Antikörper oder das Fragment eine Kappa-Leichtkette beinhaltet.

15. Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 3 bis 14, wobei die Aminosäuresubstitutionen konservative Aminosäuresubstitutionen sind, wobei die konservativen Substitutionen optional von einer von sechs Gruppen stammen (wobei jede Gruppe Aminosäuren enthält, die konservative Substitutionen für eine andere sind), ausgewählt aus:
1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).

16. Antikörper oder Fragment nach einem vorherigen Anspruch, wobei der Antikörper oder das Fragment eine konstante Region beinhaltet, z.B. eine konstante IgG4-Region, wobei die konstante Region optional IgG4-PE (Seq ID Nr. 128) ist.

17. Antikörper nach einem vorherigen Anspruch, wobei der Antikörper eine Schwerkette und eine Leichtkette beinhaltet, wobei die Schwerketten-Aminosäuresequenz aus der Sequenz von SEQ ID Nr. 62 besteht und die Leichtketten-Aminosäuresequenz aus der Sequenz von SEQ ID Nr. 64 besteht.

18. Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 17, 26, 27, 29 oder 30 zur Verwendung bei der Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, rheumatoide Arthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose und Atherosklerose, insbesondere GvHD.

19. Verwendung eines Antikörpers oder Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 17, 26, 27, 29 oder 30 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an einen Menschen zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei einem Menschen, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD.

20. Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD, bei einem Menschen, das das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers oder Fragments wie in einem der Ansprüche 1 bis 17, 26, 27, 29 oder 30 definiert an den genannten Menschen beinhaltet, wobei die/der hOX40L-vermittelte Krankheit oder Zustand damit behandelt oder verhütet wird.

21. Antikörper oder Fragment nach Anspruch 18, Verwendung nach Anspruch 19 oder Verfahren nach Anspruch 20, wobei die/der hOX40L-vermittelte Krankheit oder Zustand GvHD ist.

22. Antikörper oder Fragment, Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei der Antikörper prophylaktisch verabreicht wird.

23. Humaner Antikörper oder Fragment davon, der/das eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet und von der Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments abgeleitet ist, wobei das humane JH-Gensegment IGHJ6 (z.B. IGHJ6*02) ist, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD (wobei der Antikörper z.B. zur Verhütung von GvHD vorgesehen ist).

24. Verwendung eines humanen Antikörpers oder Fragments davon, der/das eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet und von der Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments abgeleitet ist, wobei das humane JH-Gensegment IGHJ6 (z.B. IGHJ6*02) ist, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an einen Menschen zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei dem Menschen, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD.

25. Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD, bei einem Menschen, das das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines humanen Antikörpers oder Fragments davon an den genannten Menschen beinhaltet, der/das eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet und von der Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments abgeleitet ist, wobei das humane JH-Gensegment IGHJ6 (z.B. IGHJ6*02) ist, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, wobei die/der hOX40L-vermittelte Krankheit oder Zustand dadurch behandelt oder verhütet wird.

26. Antikörper oder Fragment nach Anspruch 14 oder Antikörper oder Fragment nach Anspruch 23, Verwendung nach Anspruch 24 oder Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Antikörper oder das Fragment eine Kappa-Leichtkette beinhaltet, z.B. wobei die VL-Domäne der Leichtkette von der Rekombination eines humanen VL-Gensegments und eines humanen JL-Gensegments abgeleitet ist, wobei das humane VL-Gensegment IGKV1D-39 (z.B. IGKV1D-39*01) ist und das humane JL-Gensegment IGKJ1 (z.B. IGKJ1*01) oder IGKJ3 (z.B. IGKJ3*01) ist.

27. Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 17, 26, 29 oder 30 oder Antikörper oder Fragment, Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 26, wobei der Antikörper oder das Fragment mehr als 80 % Stammzellenspender-Chimärismus bis zu Tag 12 in einem Rhesus macaque-Modell einer haploidentsichen hämatopoetischen Stammzellentransplantation ermöglicht, wobei der Antikörper optional zur Verhütung von GvHD vorgesehen ist.

28. Antikörper oder Fragment, Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei der Antikörper wie in einem der Ansprüche 1 bis 17, 26, 27, 29 oder 30 definiert ist.

29. Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 17, 26, 27 oder 30 oder Antikörper oder Fragment, Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 28, wobei der Antikörper oder das Fragment einen stabil transfizierten Pool in Lonza GS-XceedTM auf einem Niveau von mehr als 1,5 g/l in einer Fed-Batch-Überwuchungskultur mit dem Lonza-Zulaufsystem Version 8 mit einem Überwucherungszeitraum von 14 Tagen exprimiert.

30. Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 17, 26, 27 oder 29 oder Antikörper oder Fragment, Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 29, wobei der Antikörper oder das Fragment eine naive Population von CD4+ T-Zellen von > 20 % der gesamten CD4+ T-Zellpopulation am Tag 12 in einem Rhesus macaque-Modell einer haploidentischen hämatopoetischen Stammzellentransplantation beibehält.

31. Antikörper oder Fragment, Verwendung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 30, das ferner das Verabreichen eines weiteren Therapeutikums an den Menschen beinhaltet, wobei das weitere Therapeutikum optional unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat-Mofetil, Anti-CD28-Antikörpern, Anti-IL12/IL-23-Antikörpern (z.B. Ustekinumab), Anti-CD20-Antikörpern (z.B. Rituximab), Anti-CD30-Antikörpern (z.B. Brentuximab), CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), CCR5-Rezeptor-Antagonisten (z.B. Maraviroc), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-VLA4-Antikörpern (z.B. Natalizumab), Anti-LFA1-Antikörpern, Fludarabin, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Anti-CD45-Antikörpern, Cyclophosphamid, Anti-Thymozyten-Globulinen, Anti-Komplement-C5-Antikörpern (z.B. Eculizumab), Anti-a4b7-Integrin-Antikörpern (z.B. Vedolizumab), Anti-IL6-Antiköpern (z.B. Tocilizumab), Anti-IL2R-Antikörpern (z.B. Basilixumab), Anti-CD25-Antikörpern (z.B. Daclizumab), Anti-TNFa / TNFa-Fc-Molekülen (z.B. Etanercept, Adalimumab, Infliximab, Golimumab oder Certolizumab Pegol) und Vorinostat, insbesondere Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat Mofetil und Anti-CD28-Antikörpern, CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-LFA1-Antikörpern, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Cyclophosphamid und Anti-Thymozyten-Globulinen.

32. Antikörper oder Fragment, Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 31, wobei das weitere Therapeutikum der Reihe nach oder gleichzeitig mit dem Anti-hOX40L-Antikörper oder Fragment verabreicht wird.

33. Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Antikörper oder ein Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 17, 26, 27, 29 oder 30 und ein(en) pharmazeutisch akzeptablen/s Exzipienten, Verdünnungsmittel oder Träger beinhaltet und optional ferner ein weiteres Therapeutikum beinhaltet, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat Mofetil, Anti-CD28-Antikörpern, Anti-IL12/IL-23-Antikörpern (z.B. Ustekinumab), Anti-CD20-Antikörpern (z.B. Rituximab) und Anti-CD30-Antikörpern (z.B. Brentuximab), CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), CCR5-Rezeptor-Antagonisten (z.B. Maraviroc), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-VLA4-Antikörpern (z.B. Natalizumab), Anti-LFA1-Antikörpern, Fludarabin, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Anti-CD45-Antikörpern, Cyclophosphamid, Anti-Thymozyten-Globulinen, Anti-Komplement-C5-Antikörpern (z.B. Eculizumab), Anti-a4b7-Integrin-Antikörpern (z.B. Vedolizumab), Anti-IL6-Antikörpern (z.B. Tocilizumab), Anti-IL2R-Antikörpern (z.B. Basilixumab), Anti-CD25-Antikörpern (z.B. Daclizumab), Anti-TNFa / TNFa-Fc-Molekülen (z.B. Etanercept, Adalimumab, Infliximab, Golimumab oder Certolizumab Pegol) und Vorinostat, insbesondere Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat Mofetil, Anti-CD28-Antikörpern, CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-LFA1-Antikörpern, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Cyclophosphamid und Anti-Thymozyten-Globulinen.

34. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 33 oder Kit, der eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 33 beinhaltet, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Verhütung eines/einer hOX40L-vermittelten Zustands oder Krankheit vorgesehen ist, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose und Atherosklerose, insbesondere GvHD.

35. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 33 oder Anspruch 34 in Kombination mit, oder Kit nach Anspruch 34, der ein(em) Etikett oder Anweisungen für den Gebrauch, zur Behandlung und/oder Verhütung der/des genannten Krankheit oder Zustands bei einem Menschen, beinhaltet; wobei das Etikett oder die Anweisungen optional eine Arzneimittelzulassungsnummer beinhalten (z.B. eine FDA oder EMA-Zulassungsnummer); wobei der Kit optional eine IV- oder Injektionsvorrichtung enthält, die den Antikörper oder das Fragment beinhaltet.

36. Nucleinsäure, die die HCDR3 eines Antikörpers oder Fragments nach einem der Ansprüche 1 to 17, 26, 27, 29 or 30 kodiert.

37. Nucleinsäure, die eine VH-Domäne und/oder eine VL-Domäne eines Antikörpers oder Fragments nach einem der Ansprüche 1 to 17, 26, 27, 29 oder 30 beinhaltet.

38. Nucleinsäure nach Anspruch 37, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die wenigstens 80 % identisch mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 33 und/oder SEQ ID Nr. 47 ist.

39. Nucleinsäure, die eine Schwerkette oder eine Leichtkette eines Antikörpers kodiert, der in einem der Ansprüche 1 bis 17, 26, 27, 29 oder 30 aufgeführt ist.

40. Vektor, der die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 36 bis 39 beinhaltet; wobie der Vektor optional ein CHO- oder HEK293-Vektor ist.

41. Wirt, der die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 36 bis 39 oder den Vektor nach Anspruch 40 beinhaltet.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft Anti-Human-OX40L-Antikörper, neue medizinische Verwendungen und Verfahren

HINTERGRUND

OX40-Ligand (OX40L) ist ein Mitglied der TNF-Familie; ein 34 kDa Transmembranprotein vom Typ II. Der kristallisierte Komplex von humanem OX40 und OX40L ist eine trimere Konfiguration von einem OX40L (Trimer) und drei OX40-Monomeren. Die humane extrazelluläre Domäne ist 42 % homolog zu Maus-OX40L.

OX40L wird nicht konstitutiv exprimiert, sondern kann auf professionellen APCs wie B-Zellen, dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen induziert werden. Andere Zelltypen wie Langerhans-Zellen, Endothelzellen, Glattmuskelzellen, Mastzellen und natürliche Killer-(NK)-Zellen können veranlasst werden, OX40L zu exprimieren. T-Zellen können auch OX40L exprimieren. Der OX40L-Rezeptor, OX40, wird auf aktivierten T-Zellen (CD4 und CD8 T-Zellen, Th2, Th1 und Th17 Zellen) und CD4+ Foxp3+ Zellen selbst ohne Aktivierung exprimiert.

Die Interaktion zwischen OX40 und OX40L findet während der T-Zell-DC-Interaktion 2 oder 3 Tage nach der Antigenerkennung statt. Nach dem Verlassen von DCs kann die OX40 exprimierende T-Zelle mit einer anderen OX40L exprimierenden Zelle als einer DC interagieren und ein OX40-Signal von dieser Zelle empfangen, das wesentliche Signale für die Erzeugung von Gedächtnis-T-Zellen, die Verbesserung der Th2-Reaktion und die Verlängerung der inflammatorischen Reaktionen bereitstellen kann. OX40-Signale an Responder-T-Zellen machen sie gegen eine Treg-vermittelte Unterdrückung resistent.

Die Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD) ist eine bedeutende Mortalitätsursache nach einer allogenen Knochenmarkbehandlung. In der akuten Version der Krankheit erkennen die reifen T-Zellen im Knochenmarktransplantat das Spendergewebe in einer Umgebung von geschädigtem Gewebe als fremd an und bewirken über Wirts-APCs die Aktivierung und Proliferation der Spender-T-Zellen, mit einer nachfolgenden T-Zellmigration in Leber, Milz, Darm, Haut und Lunge, was einen Gewebeschaden durch die CTL-Effektorreaktion und Freisetzung von inflammatorischem Zytokin/Chemokin verursacht. Gewöhnlich setzt die akute Krankheit innerhalb der ersten 100 Tage nach der Transplantation ein (Hill-Ferrara, Blood, 1. Mai 2000, Bd. 95, Nr. 9 2754–275, Reddy- Ferrara Blood, Band 17, Ausgabe 4, Dezember 2003).

Eine chronische GvHD tritt gewöhnlich 100 Tage nach der Transplantation auf, wobei man davon ausgeht, dass mehrere Faktoren involviert sind, inkl. eines Thymusschadens, der durch eine vorherige akute GvHD verursacht wird und in einer verringerten Beseitigung pathogener T-Zellen resultiert (Zhang et al, 1. September 2007, Bd. 179, Nr. 5 3305–3314), einer Hochregulation von TGF-β, wodurch Fibrose verursacht wird (McCormick et al J Immuno, 15. November 1999, Bd. 163, Nr. 10 5693–5699), und einer B-Zellkomponente, angetrieben durch erhöhten B-Zell-aktivierenden Faktor (BAFF) (Sarantopoulos et al, Clin Cancer Res, 15. Oktober 2007, 13; 6107) sowie Autoantikörper gegen von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor (Svegliati et al, Blood, 1. Juli 2007, Bd. 110, Nr. 1 237–241).

Klinische Studien haben gezeigt, dass OX40 sowohl bei akuter (Morante et al, Clinical and Experimental Immunology, 145: 36–43) als auch chronischer (Kotani et al, Blood, 15. November 2001, Bd. 98, Nr. 10 3162–3164) GvHD hochreguliert wird. Die Verabreichung eines antagonistischen Anti-OX40L verbesserte das Überleben in einem letalen akuten Mausmodell von GvHD, mit einem Überleben von 70 % in der behandelten Gruppe im Vergleich zur unbehandelten Gruppe, in der bis Tag 43 alle gestorben waren (Tsukada et al, Blood, 1. April 2000, Bd. 95, Nummer 7), wohingegen die Behandlung mit einem agonistischen Anti-OX40-Ab Krankheit und Mortalität beschleunigte (Blazar et al Blood, 1. Mai 2003, Bd. 101, Nr. 9 3741–3748). Es hat sich gezeigt, dass eine Blockade der OX40-OX40L-Interaktion bei mehreren anderen Entzündungskrankheiten wirksam ist, wobei anti-OX40L-Ab zur Behandlung eines Mausmodells von Kolitis verwendet wird (Totsuka et al., AJP – GI, 1. April 2003, Bd. 284, Nr. 4 G595–G603), und dass ein Anti-OX40L-Ab die Entstehung von Diabetes bei NOD-Mäusen blockieren konnte (Pakala et al European Journal of Immunology, Band 34, Ausgabe 11, Seiten 3039–3046, November 2004).

Quellenangaben

  • Lamb, L. S., Abhyankar, S. A., Hazlett, L., O'Neal, W., Folk, R. S., Vogt, S., Parrish, R. S., Bridges, K., Henslee-Downey, P. J. und Gee, A. P. (1999), Expression of CD134 (0X-40) on T-cells during the first 100 days following allogeneic bone marrow transplantation as a marker for lymphocyte activation and therapy-resistant graft-versus-host disease. Cytometry, 38: 238–243.
  • Xupeng Ge, Julia Brown, Megan Sykes, Vassiliki A. Boussiotis, CD134-Allodepletion Allows Selective Elimination of Alloreactive Human T-cells without Loss of Virus-Specific and Leukemia-Specific Effectors, Biology of Blood and Marrow Transplantation, Band 14, Ausgabe 5, Mai 2008, Seiten 518–530.
  • Naoto Ishii, Takeshi Takahashi, Pejman Soroosh, Kazuo Sugamura, Kapitel 3 – OX40–OX40 Ligand Interaction in T-Cell-Mediated Immunity and Immunopathology, In: Frederick W. Alt, Editor(s), Advances in Immunology, Academic Press, 2010, Band 105, Seiten 63-98.
  • Croft, M., So, T., Duan, W. und Soroosh, P. (2009), The significance of OX40 and OX40L to T-cell biology and immune disease. Immunological Reviews, 229: 173–191.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt Anti-Human-OX40L-(hOX40L)-Antikörper und Fragmente und neuartige medizinische Anwendungen zur Behandlung oder Verhütung von hOX40L-vermittelten Krankheiten oder Zuständen bei Menschen bereit. Zu diesem Zweck stellt die Erfindung Folgendes bereit:-

In einer ersten Konfiguration

Einen Antikörper oder ein Fragment davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, um eine(n) hOX40L-vermittelte(n) Krankheit oder Zustand bei einem Menschen in einem Verfahren zu behandeln oder zu verhüten, wobei der Antikörper oder das Fragment dem genannten Menschen verabreicht wird, wobei der Antikörper oder das Fragment dafür vorgesehen ist, die/den genannte(n) hOX40L-vermittelte(n) Krankheit oder Zustand zu behandeln oder zu verhüten, indem eines, mehrere oder alle der Folgenden verringert wird/werden:

  • a. Sekretion eines Zytokins, ausgewählt aus TNF-alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES und Interferon-gamma bei dem Menschen;
  • b. Proliferation von Leukozyten des Menschen; und
  • c. Bindung des hOX40-Rezeptors, der durch humane T-Zellen exprimiert wird, mit Endothelzellen-exprimiertem hOX40L.

In einer zweiten Konfiguration

Einen Antikörper oder ein Fragment davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet und um eine Bindung an das genannte hOX40L mit einem Antikörper konkurriert, der aus der Gruppe bestehend aus 02D10, 10A07, 09H04 und 19H01 ausgewählt ist.

In einer dritten Konfiguration

Verwendung eines Antikörpers oder eines Fragments davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an einen Menschen, um eine(n) hOX40L-vermittelte(n) Krankheit oder Zustand bei dem Menschen zu behandeln oder zu verhüten, indem eines, mehrere oder alle der Folgenden verringert wird/werden:

  • a. Sekretion eines Zytokins, ausgewählt aus TNF-alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES und Interferon-gamma bei dem Menschen;
  • b. Proliferation von Leukozyten des Menschen; und
  • c. Bindung des hOX40-Rezeptors, der durch humane T-Zellen exprimiert wird, mit Endothelzellen-exprimiertem hOX40L.

In einer vierten Konfiguration

Ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei einem Menschen, indem eines, mehrere oder alle der Folgenden verringert wird/werden:

  • a. Sekretion eines Zytokins, ausgewählt aus TNF-alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES und Interferon-gamma bei dem Menschen;
  • b. Proliferation von Leukozyten des Menschen; und
  • c. Bindung des hOX40-Rezeptors, der durch humane T-Zellen exprimiert wird, mit Endothelzellen-exprimiertem hOX40L;
wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers oder Fragments, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, an den genannten Menschen beinhaltet.

In einer fünften Konfiguration

Einen Antikörper oder ein Fragment davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet und um eine Bindung an das genannte hOX40L mit dem Antikörper 02D10 konkurriert, wobei der Antikörper oder das Fragment eine VH-Domäne beinhaltet, die eine HCDR3 beinhaltet, die das Motiv VRGXYYY beinhaltet, wobei X eine beliebige Aminosäure ist.

In einer sechsten Konfiguration

Einen Antikörper oder ein Fragment davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet und um eine Bindung an das genannte hOX40L mit dem Antikörper 02D10 konkurriert, wobei der Antikörper oder das Fragment eine VH-Domäne beinhaltet, die die HCDR3-Sequenz von SEQ ID Nr. 40 oder 46 oder die HCDR3-Sequenz von SEQ ID Nr. 40 oder 46 beinhaltet, die weniger als 5 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

In einer siebten Konfiguration

Einen humanen Antikörper oder ein Fragment davon, der/das eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet und durch eine Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments gewonnen wurde, wobei das humane JH-Gensegment IGHJ6 ist, das sich spezifisch an hOX40L bindet, um eine Autoimmunkrankheit zu behandeln oder zu verhüten, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung.

In einer achten Konfiguration

Verwendung eines humanen Antikörpers oder Fragments davon, der/das eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet und durch eine Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments gewonnen wurde, wobei das humane JH-Gensegment IGHJ6 ist, das sich spezifisch an hOX40L bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an einen Menschen, um eine(n) hOX40L-vermittelte(n) Krankheit oder -zustand bei einem Menschen zu behandeln oder zu verhüten, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung.

In einer neunten Konfiguration

Ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder -zustands, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung, das Folgendes beinhaltet: Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines humanen Antikörpers oder Fragments davon, der/das eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet und durch eine Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments gewonnen wurde, wobei das humane JH-Gensegment IGHJ6 ist, das sich spezifisch an hOX40L bindet, wobei die/der hOX40L-vermittelte Krankheit oder -Zustand somit behandelt oder verhütet wird.

Die Erfindung stellt außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen, Kits, Nucleinsäuren, Vektoren und Wirte bereit.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

1: Profilieren von völlig humanen rekombinanten Anti-OX40L-Antikörpern im HTRF Ligand/Rezeptor-Neutralisationsassay. Die gezeigten Daten repräsentieren drei Wiederholungsexperimente.

2: Bestimmen der Wirkung von Anti-OX40L-Antikörpern in einer allogenen PBMC/T Mischlymphozytenreaktion. Die gezeigten Daten stammen von drei unabhängigen Spender-Paarungen, wobei davon ausgegangen wird, dass jeder Spender ein anderes Individuum ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt die folgenden Aspekte 1 bis 113 bereit.

Die Erfindung ist z.B. zur Behandlung oder Verhütung einer Transplantatabstoßung, z.B. Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD) oder allogene Transplantatabstoßung, von Nutzen. Die Erfindung ist außerdem z.B. zur Behandlung oder Verhütung einer entzündlichen Darmkrankheit, z.B. UC oder CD, oder zur Behandlung oder Verhütung einer/eines entzündlichen Atemwegserkrankung oder -zustands von Nutzen. In einem Beispiel ist dieser Aspekt zur Behandlung oder Verhütung von Asthma von Nutzen. Die Erfindung ist auch z.B. zur Behandlung oder Verhütung von Fibrose von Nutzen. Die Erfindung ist auch z.B. zur Behandlung oder Verhütung von Diabetes von Nutzen. Die Erfindung ist auch z.B. zur Behandlung oder Verhütung von Uveitis von Nutzen. Die Erfindung ist auch z.B. zur Behandlung oder Verhütung von Pyoderma gangrenosum von Nutzen. Die Erfindung ist auch z.B. zur Behandlung oder Verhütung von Riesenzellarteriitis von Nutzen. Die Erfindung ist auch z.B. zur Behandlung oder Verhütung des Schnitzler-Syndroms von Nutzen. Die Erfindung ist auch z.B. zur Behandlung oder Verhütung von nicht infektiöser Skleritis von Nutzen.

  • 1. Ein Antikörper oder ein Fragment davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei einem Menschen in einem Verfahren, bei dem der Antikörper oder das Fragment dem genannten Menschen verabreicht wird, wobei der Antikörper oder das Fragment zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands vorgesehen ist, indem eines, mehrere oder alle der Folgenden verringert wird/werden:
    a. Sekretion eines Zytokins, ausgewählt aus TNF-alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES und Interferon-gamma bei dem Menschen;
    b. Proliferation von Leukozyten des Menschen; und
    c. Bindung des hOX40-Rezeptors, der durch humane T-Zellen exprimiert wird, mit Endothelzellen-exprimiertem hOX40L.

Die Erfinder identifizierten somit zum ersten Mal Verringerungen von (a), (b) und (c) als Möglichkeiten zur Behandlung und/oder Verhütung einer/eines OX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei Menschen und stellen Antikörper und Antikörperfragmente für diesen Zweck bereit.

In einem Beispiel ist die Sekretion Leukozytensekretion. In einem Beispiel ist (a) durch ein signifikant erhöhtes Niveau des/der Zytokins/e im menschlichen Blut, Plasma oder Serum gekennzeichnet.

In einem Beispiel ist das Zytokin ausgewählt aus (i) TNF-alpha, (ii) IL-2 und (iii) Interferon-gamma. In einem Beispiel ist das Zytokin TNF-alpha. In einem Beispiel ist das Zytokin IL-2. In einem Beispiel ist das Zytokin Interferon-gamma. In einem Beispiel sind die Zytokine (i) und (ii); oder (i) und (iii); oder (ii) und (iii); oder (i)-(iii).

In einem Beispiel ist die Verringerung von (a), (b) oder (c) oder eine beliebige andere hierin offenbarte Verringerung eine Verringerung von wenigstens 10 oder 20 % im Vergleich zum Niveau bei einem Menschen, der für die/den hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustand gefährdet ist oder daran leidet. In einem Beispiel ist Letzterer der in Aspekt 1 angegebene Mensch vor der Verabreichung des Antikörpers oder Fragments; in einem anderen Beispiel ist der letztgenannte Mensch ein anderer Mensch. In einem Beispiel beträgt die genannte Verringerung wenigstens 10, 20, 30, 40, 50 oder 60 %.

  • (i) In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, eine Verringerung der Sekretion des relevanten Zytokins aus Leukozyten (z.B. humane T-Zellen) in einem In-vitro-Assay (wie weiter unten erläutert) zu bewirken, so dass die Verabreichung eines solchen Antikörpers oder Fragments an den Menschen zu einer Verringerung von (a) führt.
  • (ii) In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, eine Verringerung der Proliferation von Leukozyten (z.B. humane PBMCs und/oder humane T-Zellen) in einem In-vitro-Assay (wie weiter unten erläutert) zu bewirken, so dass die Verabreichung eines solchen Antikörpers oder Fragments an den Menschen zu einer Verringerung von (b) führt.
  • (iii) In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, eine Verringerung der Bindung des hOX40-Rezeptors, der durch humane T-Zellen exprimiert wird, mit Endothelzellen-exprimiertem hOX40L in einem In-vitro-Assay (wie weiter unten erläutert) zu bewirken, so dass die Verabreichung eines solchen Antikörpers oder Fragments an den Menschen zu einer Verringerung von (c) führt.

In einem Beispiel treffen (i) und (ii); oder (i) und (iii); oder (ii) und (iii); oder (i)–(iii) zu.

Zusätzlich oder alternativ kann eine Beurteilung der genannten Verringerungen unter Verwendung von Proben von dem behandelten Menschen durchgeführt werden. Es wird z.B. verwiesen auf J. Clin. Immunol., 2004 Jan, 24(1): 74–85; “Increased expression of CCL20 in human inflammatory bowel disease”; Kaser A et al. Diese Veröffentlichung liefert ein Beispiel für eine allgemein anwendbare Methode zur Verwendung von Gewebebiopsien und Ablesung verringerter Zytokinniveaus, die auf eine verringerte Zytokinsekretion nach der Behandlung mit einem Antikörper in vivo hindeuten. Ähnliche Verfahren können zum Bestimmen der Verringerung der Sekretion von einem oder mehreren Zytokinen in einem Menschen angewendet werden, der einen erfindungsgemäßen Antikörper erhalten hat. Die Fachperson wird mit den Methoden zur Beurteilung der Zytokinniveaus in Patienten und Patientenproben vertraut sein, z.B. durch Gewebebiopsie, Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, Gewebefärbung, Zytokin-mRNA-Quantifizierung (z.B. mit PCR wie TaqmanTM PCR) Zytokinproteindetektion und/oder -quantifizierung (z.B. mit zytokinspezifischem/r Hilfs-Antikörper und -Quantifizierung wie ELISA oder eine andere standardmäßige Proteinquantifizierungsmethode). Wenn die Krankheit oder der Zustand z.B. den Magen-Darm-Trakt betrifft (z.B. CED), kann eine Biopsie des relevanten Darmgewebes eines Patienten durchgeführt werden, der einen erfindungsgemäßen Antikörper erhalten hat, gefolgt von einer Quantifizierung von Zytokin-mRNA und/oder Zytokinprotein (z.B. mit quantitativer PCR). Das Ergebnis kann mit einer Zytokinquantifizierung in biopsiertem relevantem Gewebe vom selben Patienten vor der Antikörperverabreichung verglichen werden oder kann mit einem anderen menschlichen Patienten verglichen werden, der an derselben Krankheit oder demselben Zustand leidet, aber keine Anti-OX40L-Behandlung oder keine Behandlung für die/den Krankheit oder Zustand erhält. Auf diese Weise kann die Fachperson bestimmen, dass der erfindungsgemäße Antikörper die Sekretion des Zytokins in dem menschlichen Empfänger verringert. Anstatt Darmgewebeniveaus zu beurteilen, kann ein(e) andere(s) Gewebe oder Probe von dem menschlichen Patienten je nach Art und Ort der Krankheit oder des Zustands verwendet werden. Wenn die Krankheit oder der Zustand z.B. die Atemwege (z.B. Lunge) betrifft, dann ist es möglich, eine Lungen- oder andere Atemweggewebeprobe für die Zytokinbeurteilung zu nehmen. Alternativ kann eine bronchoalveoläre Lavage(BAL)-Probe verwendet werden, wie der Fachperson einleuchten wird. In einem anderen Beispiel kann für einige Krankheiten oder Zustände die Verringerung von Zytokin in einer Blut-, Serum- oder Plasmaprobe von einem Menschen beurteilt werden, der einen erfindungsgemäßen Antikörper erhalten hat, und dann mit dem Niveau vor dem Erhalt des Antikörpers verglichen werden oder mit dem Niveau in einem nicht behandelten Menschen verglichen werden, wie oben erörtert.

Wie in der Technik bekannt ist, schließt der Begriff “Leukozyten” z.B. Lymphozyten, polymorphonukleäre Leukozyten und/oder Monozyten ein. Wie der Fachperson auch durchaus bekannt sein wird, schließt der Begriff “Monozyten” z.B. mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) oder von Monozyten abgeleitete Zellen, z.B. dendritische Zellen (DCs) ein (siehe z.B. Immunobiology, 2013 Nov, 218(11): 1392–401. doi: 10.1016/j.imbio.2013.07.005. Epub 2013 Jul 25; “Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes”, Pfeiffer IA et al).

Die Proliferation von Leukozyten, z.B. Lamina-propria-Lymphozyten (LPLs), kann anhand einer Gewebebiopsie, Färbung und Histologie beurteilt werden, wie der Fachperson einleuchten wird. Eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E-Färbung oder HE-Färbung) wird beispielsweise häufig in der Histologie angewendet, um nach infiltrierenden Lymphozyten eine ganze Reihe von menschlichem Gewebe zu suchen, und ist eines der wichtigsten Färbeverfahren in der Histologie. Es ist das in der medizinischen Diagnostik am häufigsten angewendete Färbeverfahren und ist oft der Goldstandard, so dass es zum Beurteilen der Proliferation von Leukozyten gemäß der Erfindung angewendet werden kann. Gewebe des Magen-Darm-Traktes (z.B. Darmgewebe) von einem Menschen, der an einer/einem hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustand leidet oder dafür gefährdet ist, kann beispielsweise erhalten, gefärbt und im Hinblick auf das Infiltrationsausmaß von LPLs beurteilt werden. Ein Vergleich kann zwischen Gewebe von einem Menschen, der einen erfindungsgemäßen Antikörper erhalten hat, und dem Infiltrationsausmaß in Gewebe gezogen werden, das von demselben Menschen vor der Verabreichung des Antikörpers oder von einem anderen Menschen erhalten wurde, der keine Behandlung erhalten hat und für die/den Krankheit oder Zustand gefährdet ist oder daran leidet. Der Vergleich erfolgt zum Beispiel zwischen menschlichem Darmgewebe von demselben (oder anderen) Menschen, der/die an CED leidet/leiden.

Mit der Fachperson bekannten standardmäßigen Bindungsassays, z.B. ELISA oder SPR, kann z.B. bestimmt werden, ob der Antikörper oder das Fragment in der Lage ist, eine Bindung des hOX40-Rezeptors, der durch humane T-Zellen exprimiert wird, mit Endothelzellen-exprimiertem hOX40L zu verringern.

Die chronisch-entzündliche Darmerkrankung (CED) ist eine chronische Entzündungsstörung, die den Magen-Darm-Trakt betrifft und mit einer offenbar ständig zunehmenden Auftretenshäufigkeit und Tendenz für schwerwiegendere klinische Phänotypen einhergeht. Die Krankheit ist durch eine übertriebene Immunreaktion auf die luminale Flora gekennzeichnet, die eventuelle Unzulänglichkeiten in der Barrierefunktion der Darmflora nahelegt, und diese Gedanken werden durch Studien gestützt (Cucchiara et al., 2012; Jostins et al., 2012; Manichanh et al., 2012; Salzman et al., 2007, alle aufgeführt in Deuring et al., “The cell biology of the intestinal epithelium and its relation to inflammatory bowel disease”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 45 (2013) 798–806). CED beinhaltet zwei Hauptgruppen: die Crohn-Krankheit (CD) und Colitis ulcerosa (UC). CD-Patienten können in ihrem gesamten Magen-Darm-Trakt entzündliche Läsionen haben, wohingegen die Entzündung bei UC-Patienten auf den Dickdarm beschränkt ist. Es wird auch auf Hisamatsu et al. (“Immune aspects of the pathogenesis of inflammatory bowel disease”, Pharmacology & Therapeutics 137 (2013) 283–297) und die darin aufgeführten Dokumente verwiesen.

Granulombildung ist eines der wichtigsten pathologischen Charakteristiken der Crohn-Krankheit beim Menschen. Mizoguchi et al zeigten, dass F4/80-positive unreife CD11c+ dendritische Zellen (DCs) IL-23 produzieren und zu Granulombildung in einem Kolitis-Mausmodell beitragen (Mizoguchi et al., 2007). Eine Th1-Immunreaktion ist bei der Crohn-Krankheit vorherrschend. In der Tat exprimierten CD4+ T-Zellen in der LP der Crohn-Krankheit T-bet und produzierten große Mengen an Interferon(IFN)-γ (Matsuoka et al., 2004). Sakuraba et al zeigte, dass DCs in den mesenterischen Lymphknoten von Patienten mit der Crohn-Krankheit nachdrücklich eine Th1- und Th17-Immunreaktion förderten (Sakuraba et al., 2009). DCs in mesenterischen Lymphknoten tragen zur CED-Pathogenese, insbesondere der der Crohn-Krankheit, bei.

Die Rolle von Zytokinen bei Krankheiten und Zuständen

Es wird auf Muzes et al, World J Gastroenterol 7. November 2012; 18(41): 5848–5861 ISSN 1007-9327 (Druckschrift) ISSN 2219-2840 (online), “Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel Diseases” verwiesen.

Zytokine sind unverzichtbare Signale des schleimhautassoziierten Immunsystems zur Beibehaltung einer normalen Darm-Homöostase. Ein Ungleichgewicht ihres Profils zugunsten eines Entzündungsbeginns kann zu Krankheitszuständen wie den bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED), z.B. die Crohn-Krankheit (CD) und Colitis ulcerosa (UC), beobachteten führen. Die Rolle von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-1α, IL-1β, IL-2, -6, -8, -12, -17, -23, IFN-gamma oder TNF-alpha bei CED steht mit dem Beginn und dem Fortschritt von UC und CD in Zusammenhang. CD wird oft als Prototyp von T-Helfer (Th) 1-vermittelten Krankheiten beschrieben, da die primären Entzündungsmediatoren die Th1-Zytokine wie Interleukin (IL)-12, Interferon(IFN)-γ und Tumornekrosefaktor(TNF)-α sind.

Die Bindung von TNF-artigen Liganden an ihre Rezeptoren löst intrazelluläre Pfade aus, die direkt in Zellproliferation, -differenzierung und -überleben involviert sind. Die meisten Mitglieder der TNF/TNF-Rezeptorproteinüberfamilien werden auf Immunzellen exprimiert und spielen bei mehreren Komponenten der Immunreaktion eine entscheidende Rolle. TNF-α ist ein Haupt-Zytokin in der Pathogenese von CED. Es übt seine pleiotropen Wirkungen über die Expression von Adhäsionsmolekülen, Fibroblastenproliferation, Prokoagulationsfaktoren sowie die Initiierung von zytotoxischen, apoptotischen und Akut-Phase-Reaktionen aus. Die Quelle von TNF-α bei CED sind zum Teil die angeborenen Immunzellen wie Makrophagen oder Monozyten sowie differenzierte Th1-Zellen. Die Serumniveaus von TNF-α korrelieren mit der klinischen Aktivität von UC und CD [31]. Es spielt eine instrumentierende Rolle bei der Darmentzündung bei CED. Die Rolle von TNF-α bei CD wurde weitgehend untersucht. Die Bindung von TNF-α an serumlöslichen TNF-Rezeptor 1 und 2 (sTNFR1 und 2) löst proinflammatorische Signale aus. Die Niveaus von sTNFR1 und 2 sind bei CD erhöht.

Der Tumornekrosefaktor-artige Faktor (TL1A), ein anderes Mitglied der TNF-Familie, stimuliert die IFN-γ-Sekretion durch eine Bindung an den Todesrezeptor 3 (DR3). DR3 wird durch einen hohen Prozentanteil an Zellen von Schleimhautbiopsien von UC und CD exprimiert, und eine Erhöhung des IFN-γ-Niveaus wurde mit einer Krankheitsaktivität bei CED-Patienten beobachtet. Das TL1A/DR3-System ist an der Pathogenese von CD beteiligt. Die Makrophagen der Lamina propria sind ein Hauptproduzent von TL1A, dessen Expression bei CD deutlich erhöht ist. Es wurde gefunden, dass TL1A und IL-23 die Produktion von IFN-γ durch Schleimhaut-T-Zellen synergistisch unterstützen. FN-Y: wird von TH1 T-Zellen produziert. Nach Entzündungsbeginn wird IFN-γ produziert und wirkt anschließend durch verschiedene Moleküle und Pfade des Immunsystems, um den Entzündungsprozess zu intensivieren. Es gibt einen überwältigenden Literaturbestand, der die proinflammatorische Natur von IFN-γ umfangreich dokumentiert, was zu der etablierten Ansicht geführt hat, dass IFN-γ ein wichtiges proinflammatorisches Zytokin bei Entzündungs- und Autoimmunkrankheiten ist. Interferon-gamma ist in der experimentellen entzündlichen Darmerkrankung bei Mäusen kausal involviert (Ito et al, Clinical and Experimental Immunology (2006), 146: 330–338). Die Studie demonstrierte eindeutig, dass IFN-γ-/- Mäuse nach einer Stimulation mit DSS bezüglich des Grads an Körpergewichtsverlust, DAI, histologischem Score und MPO-Aktivität eine abgeschwächte Kolitis aufwiesen. IFN-γ wurde vermehrt im Dickdarm von DSS-behandelten WT-Mäusen produziert, die starke CED-artige Symptome aufwiesen.

Interleukin-2 (IL-2) wird von T-Zellen produziert und ist größtenteils für T-Zellen zum Differenzieren in Effektor-T-Zellen wichtig. IL-2 ist auch für die T-Zell-Proliferation wichtig. Dies ist für CED wichtig, da man davon ausgeht, dass Effektor-T-Zellen ein Hauptzelltyp für die Schadensverursachung bei CED sind.

IL-8 (Interleukin-8; alias CXCL8) vermittelt hauptsächlich die Aktivierung und Migration von Neutrophilen in Gewebe aus peripherem Blut und zu Entzündungsstellen. Man hat gefunden, dass das Niveau von IL-8 in Gewebe bei aktiver UC im Vergleich zu normalem Darmgewebe höher ist, und seine Serumkonzentration wurde mit endoskopischem und histologischem Schweregrad von UC in Zusammenhang gebracht. IL-8 ist für Entzündungsumgebungen und Krebs von Bedeutung (siehe z.B. “The Chemokine CXCL8 in Carcinogenesis and Drug Response”, ISRN Oncol. 9. Okt 2013; 2013: 859154; Gales D et al., und Future Oncol., 2010 Jan; 6(1): 111–6. doi: 10.2217/fon.09.128; “CXCL8 and its cognate receptors in melanoma progression and metastasis”, Singh S et al.). Man geht davon aus, dass IL-8 vor allem bei Krebs auch durch eine Unterstützung der Angiogenese beiträgt.

In jeder/jedem beliebigen Konfiguration, Aspekt oder Beispiel hierin wirkt der Antikörper oder das Fragment einer Bindung von hOX40L an einen OX40-Rezeptor entgegen.

In jeder/jedem beliebigen Konfiguration, Aspekt oder Beispiel hierin wirkt der Antikörper oder das Fragment einer Bindung von hOX40L an OX40 entgegen.

In jeder/jedem beliebigen Konfiguration, Aspekt oder Beispiel hierin kann der OX40L-Rezeptor humanes OX40 sein.

In jeder/jedem beliebigen Konfiguration, Aspekt oder Beispiel hierin leidet der Mensch an Asthma oder ist dafür gefährdet, und der Antikörper oder das Fragment verringert IgE in einem Menschen.

In jeder/jedem beliebigen Konfiguration, Aspekt oder Beispiel hierin leidet der Mensch an Asthma oder ist dafür gefährdet, und der Antikörper oder das Fragment ist zum Verringern von IgE in einem Menschen vorgesehen.

  • 2. Der Antikörper oder das Fragment von Aspekt 1, wobei der Antikörper oder das Fragment die Bindung des hOX40-Rezeptors, der durch humane T-Zellen exprimiert wird, mit Endothelzellen-exprimiertem hOX40L verringert und die Proliferation von humanen T-Zellen verringert; wobei der Antikörper oder das Fragment zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands vorgesehen ist, indem die Sekretion eines Zytokins verringert wird, das aus TNF-alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES und Interferon-gamma ausgewählt ist.

In einem Beispiel ist das Zytokin aus (i) TNF-alpha, (ii) IL-2 und (iii) Interferon-gamma ausgewählt. In einem Beispiel ist das Zytokin TNF-alpha. In einem Beispiel ist das Zytokin IL-2. In einem Beispiel ist das Zytokin Interferon-gamma. In einem Beispiel sind die Zytokine (i) und (ii); oder (i) und (iii); oder (ii) und (iii); oder (i)–(iii).

  • 3. Der Antikörper oder das Fragment von Aspekt 1, wobei die Leukozyten ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus polymorphonukleären Leukozyten, Monozyten, mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMCs), Lymphozyten, T-Zellen, antigenpräsentierende Zellen (APCs), dendritischen Zellen (DC-Zellen) und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen).

In einer Ausgestaltung sind die Leukozyten mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMCs) und T-Zellen (z.B. PBMCs).

  • 4. Der Antikörper oder das Fragment von Aspekt 3, wobei die Leukozyten Lamina-propria-Lymphozyten (LPLs) beinhalten und die Krankheit oder der Zustand eine Krankheit oder ein Zustand des Magen-Darm-Traktes (GI-Trakt) ist.
  • 5. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorliegenden Aspekt, wobei die Epithelzellen Zellen beinhalten, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Magen-Darm-Zellen, Kolonzellen, Darmzellen und Atemwegsepithelzellen (z.B. Lunge).

In einer anderen Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Magen-Darm-Zellen, Kolonzellen, Darmzellen, Augenzellen und Atemwegsepithelzellen (z.B. Lunge). In einer anderen Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Magen-Darm-Zellen, Kolonzellen, Darmzellen und Augenzellen. In einer weiteren Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Augenzellen.

  • 6. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei dem genannten Menschen durch Verringern der Proliferation von T-Zellen in dem genannten Menschen.

In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, eine Verringerung der Proliferation von T-Zellen in einem In-vitro-Assay (z.B. in einem humanen DC-Zell/T-Zell-In-vitro-Assay, wie z.B. weiter unten erläutert) zu bewirken, so dass die Verabreichung eines solchen Antikörpers oder Fragments an den Menschen zu einer Verringerung der Proliferation von T-Zellen in dem genannten Menschen führt.

  • 7. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei dem genannten Menschen durch Entgegenwirken der Interaktion zwischen hOX40L und Leukozyten des Menschen, wobei die Proliferation von Leukozyten verringert wird.

In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, eine Verringerung der Proliferation von Leukozyten (z.B. mononukleäre Zellen) in einem In-vitro-Assay (z.B. in einem MLR In-vitro-Assay, wie z.B. weiter unten erläutert) zu bewirken, so dass die Verabreichung eines solchen Antikörpers oder Fragments an den Menschen zu einer Verringerung der Proliferation von Leukozyten in dem genannten Menschen führt.

  • 8. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei dem genannten Menschen durch Verringern der Proliferation von Leukozyten des Menschen durch Entgegenwirken der durch T-Zellen in dem genannten Menschen vermittelten OX40L/OX40L-Rezeptor-Interaktion.

In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, eine Verringerung der Proliferation von Leukozyten (z.B. mononukläre Zellen) in einem In-vitro-Assay zu bewirken, wobei der Antikörper oder das Fragment der durch T-Zellen vermittelten OX40L/OX40L-Rezeptor-Interaktion in dem genannten Assay entgegenwirkt, so dass die Verabreichung eines solchen Antikörpers oder Fragments an den Menschen zu einer Verringerung der Proliferation von Leukozyten in dem genannten Menschen führt.

  • 9. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei dem genannten Menschen durch Verringern der Sekretion eines Zytokins, das aus TNF-alpha, IL-2 und Interferon-gamma ausgewählt ist, in dem Menschen.

In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit, Zustands oder Epithelzellschadens bei dem genannten Menschen vorgesehen, indem die Sekretion von (i) IL-2 und Interferon-gamma, (ii) IL-2 und TNF-alpha oder (iii) Interferon-gamma und TNF-alpha in dem Menschen verringert wird.

In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, eine Verringerung der Sekretion eines Zytokins, das aus IL-2, TNF-alpha und Interferon-gamma ausgewählt ist, in einem In-vitro-Assay (z.B. in einem MLR In-vitro-Assay z.B. wie weiter unten erläutert) zu bewirken, so dass eine Verabreichung eines solchen Antikörpers oder Fragments an den Menschen zu einer Verringerung des/der ausgewählten Zytokins/Zytokine in dem genannten Menschen führt.

In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, eine Verringerung der Sekretion von IL-8 in einem In-vitro-Assay (z.B. in einem MLR In-vitro-Assay z.B. wie weiter unten erläutert) zu bewirken, so dass die Verabreichung eines solchen Antikörpers oder Fragments an den Menschen zu einer Verringerung der Sekretion von IL_8 in dem genannten Menschen führt.

  • 10. Der Antikörper oder das Fragment von Aspekt 9 zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten Krankheit oder Zustands durch Verringern der durch die Interaktion dendritischer Zellen (DC-Zellen) mit T-Zellen vermittelten Sekretion des genannten Zytokins in dem Menschen.

In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, eine Verringerung der Sekretion des/der genannten Zytokins/Zytokine in einem DC-Zell-/T-Zell-In-vitro-Assay (z.B. wie weiter unten erläutert) zu bewirken, so dass die Verabreichung eines solchen Antikörpers oder Fragments an den Menschen zu einer Verringerung der Sekretion des/der genannten Zytokins/Zytokine in dem genannten Menschen führt.

  • 11. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei ein Magen-Darm-Zell-, Kolonzell-, Darmzell- oder Atemwegs-(z.B. Lunge)Zellschaden ein Symptom oder eine Ursache der/des genannten Krankheit oder Zustands bei Menschen ist.

In einer anderen Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Magen-Darm-Zellen, Kolonzellen, Darmzellen, Augenzellen und Atemwegs-(z.B. Lunge)Epithelzellen. In einer anderen Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Magen-Darm-Zellen, Kolonzellen, Darmzellen und Augenzellen. In einer weiteren Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Augenzellen.

  • 12. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Mensch an einer entzündlichen Darmkrankheit (CED), allogenen Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Diabetes oder Atemwegsentzündung leidet oder dafür gefährdet ist und das genannte Verfahren CED, allogene Transplantatabstoßung, GvHD, Diabetes oder eine Atemwegsentzündung bei dem Menschen behandelt oder verhütet.
  • 12a. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Mensch an einer entzündlichen Darmkrankheit (CED), allogenen Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Uveitis, Pyoderma gangrenosum, Riesenzellarteriitis, Schnitzler-Syndrom, nicht infektiöse Skleritis, Diabetes oder Atemwegsentzündung leidet oder dafür gefährdet ist und das genannte Verfahren CED, allogene Transplantatabstoßung, GvHD, Uveitis, Pyoderma gangrenosum, Riesenzellarteriitis, Schnitzler-Syndrom, nicht infektiöse Skleritis, Diabetes oder Atemswegsentzündung beim Menschen behandelt oder verhütet.

In einem Beispiel von einem vorherigen Aspekt leidet der Mensch an einer/einem Entzündungs- oder Autoimmunkrankheit oder -zustand oder ist dafür gefährdet oder wurde damit diagnostiziert.

In einem Beispiel ist die/der Autoimmunkrankheit oder -zustand ausgewählt aus:-
Akute disseminierte Enzephalomyelitis (ADEM)
Addison-Krankheit
Allergische Granulomatose und Angiitis oder Churg-Strauss-Syndrom (CSS)
Alopezie oder Alopecia areata (AA)
Spondylitis ankylosans
Autoimmune chronisch-aktive Hepatitis (CAH)
Autoimmune hämolytische Anämie
Autoimmune Pankreatitis (AIP)
Autoimmune Retinopathie (AR), siehe Retinopathie
Autoimmune thrombozytopenische Purpura
Autoimmune Neutropenie
Autoimmunerkrankung des Innenohres (AIED)
Antiphospholipid-Syndrom (APS)
Autoimmunes lymphoproliferatives Syndrom (ALPS)

Behçet-Syndrom
Bullöses Pemphigoid

Zöliakie
Churg-Strauss-Syndrom (CSS) oder allergische granulomatöse Angiitis
Chronische bullöse Krankheit im Kindesalter
Chronische inflammatorische demyelinisierende Polyradikuloneuropathie (CIDP)
Vernarbendes Pemphigoid (CP)
Vaskulitis des Zentralnervensystems
Crohn-Krankheit
Kryoglobulinämie

Dermatitis herpetiformis (DH)
Diskoider Lupus erythematodes (DLE)

Enzephalomyelitis
Epidermolysis bullosa acquisita (EBA)

Riesenzellarteriitis, siehe temporale Arteriitis
Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit
Basedow-Krankheit
Guillain-Barré-Syndrom

Hanot-Syndrom, siehe primär biliäre Zirrhose
Hashimoto-Thyreoiditis, auch autoimmune Thyreoiditis und chronische lymphozytische Thyreoiditis genannt
Hypersensiblitätsvaskulitis (HV) oder Kleingefäßvaskulitis

Immunvermittelte Unfruchtbarkeit
Entzündliche Darmkrankheit
Insulinabhängiger Diabetes mellitus
Isolierte Vaskulitis des Zentralnervensystem oder CNS-Vaskulitis
Isaac-Syndrom: Neuromyotonie

Kawasaki-Krankheit (KD)

Lambert-Eaton-Myasthenie-Syndrom (LEMS)
Lineare IgA-Krankheit
Lupus – siehe systemischer Lupus erythematodes

Ménière-Krankheit
Mikroskopische Polyangiitis (MPA)
Gemischte Bindegewebserkrankung oder MCTD
Monoklonale Gammopathie
Myasthenia gravis
Multiple Sklerose
Multifokale motorische Neuropathie

Neuromyotonie oder Isaac-Syndrom
Neutropenie, siehe autoimmune Neutropenie

Oophoritis
Opsoclonus-Myoclonus-Syndrom
Orchitis

Paraneoplastische neurologische Störungen
Pemphigus vulgaris
Pemphigus follaceus (PF)
Pemphigoid gestationis (PG)
Perniziöse Anämie
Paraneoplastischer Pemphigus (PNP)
Polyangiitis – siehe mikroskopische Polyangiitis
Polyarteritis nodosa (PAN)
Polymyositis/Dermatomyositis
Polymyalgia rheumatica
Primär biliäre Zirrhose (PBC), auch Hanot-Syndrom genannt
Primäre sklerosierende Cholangitis (PSC)

Raynaud-Phänomen
Recoverin-assoziierte Retinopathie (RAR), siehe Retinopathie
Reaktive Arthritis, ehemals bekannt als Reiter-Syndrom,
Retinopathie
Rheumatoide Arthritis (RA)

Sarkoidose
Sklerosierende Cholangitis, siehe primäre sklerosierende Cholangitis
Sjögren-Syndrom
Systemische nekrotisierende Vaskulitis
Stiff-Man-Syndrom oder Moersch-Woltman-Syndrom
Systemischer Lupus erythematodes
Systemische Sklerose (Sklerodermie)

Temporale Arteriitis oder Riesenzellarteriitis (GCV)
Takayasu-Arteriitis
Thromboangiitis obliterans oder Buerger-Krankheit
Thyreoiditis mit Schilddrüsenunterfunktion
Thyreoiditis mit Schilddrüsenüberfunktion
Autoimmunes polyglanduläres Syndrom Typ I (PAS)
Autoimmunes polyglanduläres Syndrom Typ II

Vaskulitis

Wegener-Granulomatose

In einem Beispiel von einem Aspekt, einer Konfiguration oder Ausgestaltung leidet der Mensch an Uveitis. Die Uveitis ist z.B. von der Art her nicht infektiös und/oder autoimmun, d.h. es ist eine nicht infektiöse Uveitis oder eine autoimmune Uveitis. Beispielsweise wird die nicht infektiöse/autoimmune Uveitis verursacht durch und/oder ist assoziiert mit: Behçet-Krankheit, Fuchs heterochrome Iridozyklitis, Granulomatose mit Polyangiitis, HLA-B27-verwandter Uveitis, juveniler idiopathischer Arthritis, Sarkoidose, Spondyloarthritis, sympathische Ophthalmie, tubulointerstitielle Nephritis oder Uveitis-Syndrom. In einem Beispiel ist die Uveitis von Natur aus systemisch, d.h. es handelt sich um systemische Uveitis. Beispielsweise wird die systemische Uveitis verursacht durch und/oder ist assoziiert mit: Spondylitis ankylosans, Behçet-Krankheit, chronische Granulomatose, Enthesitis, entzündliche Darmkrankheit, juvenile rheumatoide Arthritis, Kawasaki-Krankheit, multiple Sklerose, Polyarteriitis nodosa, psoriatische Arthritis, reaktive Arthritis, Sarkoidose, systemischer Lupus erythematodes, Vogt-Koyanagi-Harada-Syndrom oder Whipple-Krankheit.

In einem Beispiel von einem Aspekt, einer Konfiguration oder Ausgestaltung leidet der Mensach an Pyoderma gangrenosum, Riesenzellarteriitis, Schnitzler-Syndrom oder nicht infektiöser Skleritis. In einem Beispiel leidet der Mensch an Pyoderma gangrenosum. In einem Beispiel leidet der Mensch an Riesenzellarteriitis. In einem Beispiel leidet der Mensch am Schnitzler-Syndrom. In einem Beispiel leidet der Mensch an nicht infektiöser Skleritis.

In einem Beispiel von einem Aspekt, einer Konfiguration oder Ausgestaltung leidet der Mensch an einer/einem hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustand, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, rheumatoide Arthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose und Atherosklerose, insbesondere GvHD. In einer anderen Ausgestaltung leidet der Mensch an einer multiviszeralen Organtransplantatabstoßung.

  • 13. Ein Antikörper oder ein Fragment davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet und mit einem Antikörper, der aus der Gruppe bestehend aus 02D10, 10A07, 09H04 und 19H01 ausgewählt ist, um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert.

In einem Beispiel von einem Aspekt, einer Konfiguration oder Ausgestaltung wird Konkurrenz durch Oberflächen-Plasmon-Resonan (SPR) bestimmt, wobei der Fachperson solche Methoden durchaus bekannt sind. SPR kann mit BiacoreTM, ProteonTM oder einer anderen standardmäßigen SPR-Methode durchgeführt werden. Eine solche Konkurrenz kann beispielsweise darin begründet sein, dass sich Antikörper/Fragmente an identische oder überlappende Epitope von hOX40L binden. In einem Beispiel von einem Aspekt, einer Konfiguration oder Ausgestaltung wird Konkurrenz durch ELISA ermittelt, wobei solche Methoden der Fachperson durchaus bekannt sind. In einem Beispiel von einem Aspekt, einer Konfiguration oder Ausgestaltung wird Konkurrenz durch homogene zeitaufgelöste Fluoresenzen (HTRF) ermittelt, wobei solche Methoden der Fachperson durchaus bekannt sind. In einem Beispiel von einem Aspekt, einer Konfiguration oder Ausgestaltung wird Konkurrenz durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ermittelt, wobei solche Methoden der Fachperson durchaus bekannt sind. In einem Aspekt werden die HTRF, ELISA und/oder FACS-Verfahren wie in den folgenden Beispielen beschrieben durchgeführt.

  • 14. Der Antikörper oder das Fragment von Aspekt 13, wobei der Antikörper oder das Fragment einem beliebigen der Aspekte 1 bis 12 entspricht.
  • 15. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das variable Domänen der Lambda-Leichtkette beinhaltet (die optional human sind).

In einem Beispiel von einem Aspekt, einer Konfiguration oder Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind die variablen Domänen des Antikörpers oder Fragments human oder humanisiert. Außerdem beinhaltet der Antikörper oder das Fragment ferner optional humane oder humanisierte konstante Regionen (z.B. humanes Fc und/oder humanes CL). In einem Beispiel von einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die variablen Domänen des Antikörpers oder Fragments durch ein transgenes Tier (z.B. ein Nagetier, eine Maus, Ratte, ein Kaninchen, Huhn, Schaf, einen Schwielensohler oder Hai) produziert. In einem Beispiel von einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die variablen Domänen des Antikörpers oder Fragments durch Phagen-Display, Ribosomen-Display oder Hefe-Display produziert.

In einem Beispiel von einem Aspekt, einer Konfiguration oder Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird der Antikörper oder das Fragment durch eine rekombinante Säugetier-, Bakterien-, Insekten-, Pflanzen- oder Hefezelle produziert.

In einem Beispiel ist die Säugetierzelle eine CHO- oder HEK293-Zelle und der Antikörper oder das Fragment beinhaltet CHO- oder HEK293-Zellglykosylierung.

In einem Beispiel von einem Aspekt, einer Konfiguration oder Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper oder das Fragment isoliert.

  • 16. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das eine VH-Domäne beinhaltet, die eine HCDR1-Sequenz beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der HCDR1 von:
    a. 02D10, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    b. 10A07, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 10A07 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    c. 09H04, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 09H04 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert; und
    d. 19H01, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 19H01 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert.
  • 17. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das eine VH-Domäne beinhaltet, die eine HCDR2-Sequenz beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der HCDR2 von:
    a. 02D10, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    b. 10A07, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 10A07 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    c. 09H04, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 09H04 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert; und
    d. 19H01, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 19H01 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert.
  • 18. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das eine VH-Domäne beinhaltet, die eine HCDR3-Sequenz beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der HCDR3 von:
    a. 02D10, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    b. 10A07, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 10A07 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    c. 09H04, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 09H04 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert; und
    d. 19H01, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 19H01 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert.
  • 19. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das eine VH-Domäne beinhaltet, die (i) die CDR1 und 2, (ii) CDR1 und 3, (iii) CDR2 und 3 oder (iv) CDR1, 2 und 3 Sequenzen beinhaltet, die:
    a. in (a) der Aspekte 16–18 aufgeführt sind, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    b. in (b) der Aspekte 16–18 aufgeführt sind, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 10A07 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    c. in (c) der Aspekte 16–18 aufgeführt sind, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 09H04 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert; oder
    d. in (d) der Aspekte 16–18 aufgeführt sind, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 19H01 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert.
  • 20. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das eine VH-Domäne beinhaltet, die eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den VH-Aminosäuresequenzen in der Sequenzauflistung.

In einem Aspekt stellt die Erfindung ein(en) Anti-hOX40L-Antikörper oder Fragment (optional nach einem anderen hierin aufgeführten Aspekt) bereit, der/das eine VH-Domäne beinhaltet, die eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die aus der Gruppe bestehend aus den VH-Aminosäuresequenzen in der Sequenzauflistung ausgewählt ist. In einem Aspekt beinhaltet die VH-Domäne eine Aminosäuresequenz, die aus Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 34, Seq ID Nr. 66, Seq ID Nr. 94, Seq ID Nr. 122, Seq ID Nr. 124, Seq ID Nr. 126, Seq ID Nr. 128, Seq ID Nr. 132 oder Seq ID Nr. 134 ausgewählt ist.

In einem anderen Beispiel der Erfindung beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine VH-Domänen-Aminosäuresequenz, die in der folgenden Sequenzauflistung aufgeführt ist. Zusätzlich oder alternativ beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine HCDR1-Domänen-Aminosäuresequenz, die in der folgenden Sequenzauflistung dargelegt ist (d.h. Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 36, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 68, Seq ID Nr. 74, Seq ID Nr. 96 oder Seq ID Nr. 102, insbesondere Seq ID Nr. 36 oder Seq ID Nr. 42). Zusätzlich oder alternativ beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine HCDR2-Domänen-Aminosäuresequenz, die in der folgenden Sequenzauflistung dargelegt ist (d.h. Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 38, Seq ID Nr. 44, Seq ID Nr. 70, Seq ID Nr. 76, Seq ID Nr. 98 oder Seq ID Nr. 104, insbesondere Seq ID Nr. 38 oder Seq ID Nr. 44). Zusätzlich oder alternativ beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine HCDR3-Domänen-Aminosäuresequenz, die in der folgenden Sequenz dargelegt ist (d.h. Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 40, Seq ID Nr. 46, Seq ID Nr. 72, Seq ID Nr. 78, Seq ID Nr. 100 oder Seq ID Nr. 106, insbesondere Seq ID Nr. 40 oder Seq ID Nr. 46).

In einem Beispiel der Erfindung beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine VL-Domänen-Aminosäuresequenz, die in der folgenden Sequenzauflistung dargelegt ist. Zusätzlich oder alternativ beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine LCDR1-Domänen-Aminosäuresequenz, die in der folgenden Sequenzauflistung dargelegt ist (d.h. Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 50, Seq ID Nr. 56, Seq ID Nr. 82, Seq ID Nr. 88, Seq ID Nr. 110 oder Seq ID Nr. 116, insbesondere Seq ID Nr. 50 oder Seq ID Nr. 56). Zusätzlich oder alternativ beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine LCDR2-Domänen-Aminosäuresequenz, die in der folgenden Sequenzauflistung dargelegt ist (d.h. Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 26, Seq ID Nr. 52, Seq ID Nr. 58, Seq ID Nr. 84, Seq ID Nr. 90, Seq ID Nr. 112 oder Seq ID Nr. 118, insbesondere Seq ID Nr. 52 oder Seq ID Nr. 58). Zusätzlich oder alternativ beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine LCDR3-Domänen-Aminosäuresequenz, die in der folgenden Sequenzauflistung dargelegt ist (d.h. Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 28, Seq ID Nr. 54, Seq ID Nr. 60, Seq ID Nr. 86, Seq ID Nr. 92, Seq ID Nr. 114 oder Seq ID Nr. 120, insbesondere Seq ID Nr. 54 oder Seq ID Nr. 60).

In einem Beispiel von einem Aspekt hierin beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine Schwerkette, die eine konstante Region beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der konstanten Region der Schwerkette der SEQ ID Nrn. in der Sequenzauflistung (d.h. beliebige der Seq ID Nr: 126, 128, 132 oder 134, insbesondere die konstante Region von Seq ID Nr. 128); und optional eine VH-Domäne wie in Aspekt 19 oder 20 aufgeführt. In einem Beispiel beinhaltet der Antikörper oder das Fragment zwei Kopien einer solchen Schwerkette. In einem anderen Beispiel beinhaltet die Schwerkette eine konstante Region eines Nagetiers, einer Maus, eines Menschen, eines Kaninchens, eines Huhns, eines Schwielensohlers, eines Schafs, eines Rinds, eines nicht menschlichen Primaten oder eines Hais (z.B. Fc), insbesondere eine konstante Region einer Maus.

In einem Beispiel von einem Aspekt hierin beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine Schwerkette, die eine konstante Gamma- (z.B. humane Gamma)-Region, z.B. eine konstante humane Gamma-1-Region beinhaltet. In einem anderen Beispiel von einem Aspekt hierin beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine konstante humane Gamma-4-Region. In einer anderen Ausgestaltung bindet die konstante Schwerkettenregion Fc-γ-Rezeptoren nicht und beinhaltet z.B. eine Leu235Glu-Mutation (d.h. wobei der Wildtyp-Leucin-Rest zu einem Glutaminsäurerest mutiert ist). In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet die konstante Schwerkettenregion eine Ser228Pro-Mutation zum Erhöhen der Stabilität. In einer anderen Ausgestaltung ist die konstante Schwerkettenregion IgG4, die sowohl die Leu235Glu-Mutation als auch die Ser228Pro-Mutation beinhaltet. Diese konstante Schwerkettenregion wird hierin “IgG4-PE” genannt.

In einem Beispiel von einem Aspekt hierin ist der Antikörper oder das Fragment chimär und beinhaltet z.B. humane variable Domänen und nicht humane (z.B. Nagetier, Maus oder Ratte, wie z.B. Maus) konstante Regionen.

  • 21. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 16 bis 20, der/das erste und zweite Kopien der genannten VH-Domäne beinhaltet.
  • 22. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das eine VL-Domäne beinhaltet, die eine LCDR1-Sequenz beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der LCDR1 von:
    a. 02D10, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    b. 10A07, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 10A07 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    c. 09H04, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 09H04 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert; und
    d. 19H01, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 19H01 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert.
  • 23. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das eine VL-Domäne beinhaltet, die eine LCDR2-Sequenz beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der LCDR2 von:
    a. 02D10, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    b. 10A07, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 10A07 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    c. 09H04, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 09H04 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert; und
    d. 19H01, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 19H01 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert.
  • 24. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das eine VL-Domäne beinhaltet, die eine LCDR3-Sequenz beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der LCDR3 von:
    a. 02D10, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    b. 10A07, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 10A07 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    c. 09H04, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 09H04 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert; und
    d. 19H01, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 19H01 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert.
  • 25. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das eine VL-Domäne beinhaltet, die (i) die CDR1 und 2, (ii) CDR1 und 3, (iii) CDR2 und 3 oder (iv) CDR1, 2 und 3 Sequenzen beinhaltet, die:
    a. in (a) der Aspekte 22–24 aufgeführt sind, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    b. in (b) der Aspekte 22–24 aufgeführt sind, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 10A07 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert;
    c. in (c) der Aspekte 22–24 aufgeführt sind, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 09H04 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert; oder
    d. in (d) der Aspekte 22–24 aufgeführt sind, und wobei der Antikörper oder das Fragment mit 19H01 um eine Bindung an das genannte hOX40L konkurriert.
  • 26. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, der/das eine VL-Domäne beinhaltet, die eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den VL-Aminosäuresequenzen in der Sequenzauflistung.

In einem Aspekt der Erfindung wird ein Anti-hOX40L-Antikörper oder -Fragment (optional gemäß einem anderen Aspekt hierin) bereitgestellt, der/das eine VL-Domäne beinhaltet, die eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den VL-Aminosäuresequenzen in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 16, Seq ID Nr. 48, Seq ID Nr. 80 oder Seq ID Nr. 108, insbesondere Seq ID Nr. 48).

In einem Beispiel eines Aspekts hierin beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine Leichtkette (z.B. eine Lambda-Leichtkette), die eine konstante Region beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen der konstanten Region der Leichtkette in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 136, Seq ID Nr. 138, Seq ID Nr. 140, Seq ID Nr. 142, Seq ID Nr. 144, Seq ID Nr. 146, Seq ID Nr. 148, Seq ID Nr. 152, Seq ID Nr. 154, Seq ID Nr. 156, Seq ID Nr. 158, Seq ID Nr. 160, Seq ID Nr. 162, Seq ID Nr. 164 oder Seq ID Nr. 166); und optional eine VL-Domäne (z.B. Lambda VL) wie in Aspekt 25 oder 26 aufgeführt. In einem Beispiel beinhaltet der Antikörper oder das Fragment zwei Kopien einer solchen Leichtkette (optional auch zwei Kopien der oben beschriebenen Schwerkette). In einem anderen Beispiel beinhaltet die Leichtkette eine konstante Region eines Nagetiers, einer Ratte, einer Maus, eines Menschen, eines Kaninchens, eines Huhns, eines Schwielensohlers, eines Schafs, eines Rinds, eines nicht menschlichen Primaten oder eines Hais.

In einem Beispiel eines Aspekts hierin beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine Leichtkette (z.B. Kappa-Leichtkette), die eine konstante Region beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen der konstanten Region der Leichtkette in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 136, Seq ID Nr. 138, Seq ID Nr. 140, Seq ID Nr. 142, Seq ID Nr. 144, Seq ID Nr. 146, Seq ID Nr. 148, Seq ID Nr. 152, Seq ID Nr. 154, Seq ID Nr. 156, Seq ID Nr. 158, Seq ID Nr. 160, Seq ID Nr. 162, Seq ID Nr. 164 oder Seq ID Nr. 166); und optional eine VL-Domäne (z.B. Kappa VL) wie in Aspekt 25 oder 26 aufgeführt. In einem Beispiel beinhaltet der Antikörper oder das Fragment zwei Kopien einer solchen Leichtkette (optional auch zwei Kopien der oben beschriebenen Schwerkette). In einem anderen Beispiel beinhaltet die Leichtkette eine konstante Region eines Nagetiers, einer Ratte, einer Maus, eines Menschen, eines Kaninchens, eines Huhns, eines Schwielensohlers, eines Schafs, eines Rinds, eines nicht menschlichen Primaten oder eines Hais.

In einem Beispiel beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine Lambda-Leichtkette, die eine konstante Region beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen der konstanten Region der Leichtkette in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 146, Seq ID Nr. 148, Seq ID Nr. 152, Seq ID Nr. 154, Seq ID Nr. 156, Seq ID Nr. 158, Seq ID Nr. 160, Seq ID Nr. 162, Seq ID Nr. 164 oder Seq ID Nr. 166); und optional eine Lambda-VL-Domäne.

In einem Beispiel beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine Kappa-Leichtkette, die eine konstante Region beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen der konstanten Region der Leichtkette in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 136, Seq ID Nr. 138, Seq ID Nr. 140, Seq ID Nr. 142 oder Seq ID Nr. 144); und optional eine Kappa-VL-Domäne.

In einem Beispiel sind die VL-Domänen des Antikörpers oder Fragments variable Domänen der Lambda-Leichtkette. In einem Beispiel sind die VL-Domänen des Antikörpers oder Fragments variable Domänen der Kappa-Leichtkette.

  • 27. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 22 bis 26, der/das erste und zweite Kopien der genannten VL-Domäne beinhaltet.
  • 28. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei das hOX40L auf einer humanen Zelloberfläche exprimiertes hOX40L ist, z.B. auf Endothelzellen (z.B. eine Atemwegs- oder GI-Trakt-Endothelzelle).

In einer anderen Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Magen-Darm-Zellen, Kolonzellen, Darmzellen, Augenzellen und Atemwegs-(z.B. Lunge)Epithelzellen. In einer anderen Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Magen-Darm-Zellen, Kolonzellen, Darmzellen und Augenzellen. In einer weiteren Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Augenzellen.

  • 29. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die Proliferation humaner PBMCs oder T-Zellen in Anwesenheit von hOX40L in einem In-vitro-Mischlymphozytenreaktions-(MLR)-Assay um wenigstens 20, 30, 40, 50 oder 60 % im Vergleich zur Proliferation humaner PBMCs oder T-Zellen in Anwesenheit von hOX40L in einem In-vitro-Kontroll-MLR-Assay in Abwesenheit eines für hOX40L spezifischen Antikörpers verringert. In den folgenden Beispielen wird ein geeigneter Assay veranschaulicht.
  • 30. Der Antikörper oder das Fragment von Aspekt 29, wobei das hOX40L in dem Assay auf humanen dendritischen Zellen (DC-Zellen) oberflächenexprimiert wird. In den folgenden Beispielen wird ein geeigneter Assay veranschaulicht.
  • 31. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die NF-κB-Aktivität in humanen HT-1080-Zellen, die den hOX40-Rezeptor exprimieren, in vitro in Anwesenheit von hOX40L verringert.

In einem Beispiel der Antikörper oder das Fragment die Verringerung der NF-κB-Aktivität wird dadurch ermittelt, dass eine Verringerung der IL-8-Sekretion durch HT-1080-Zellen (ATCC® CCL-121) (optional transfiziert mit dem hOX40-Rezeptor, in Anwesenheit von hOX40) in vitro detektiert wird.

  • 32. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die IL-8-Sekretion aus humanen HT-1080-Zellen, die den hOX40-Rezeptor exprimieren, in vitro in Anwesenheit von hOX40L verringert.
  • 33. Der Antikörper oder das Fragment von Aspekt 32, wobei der Antikörper oder das Fragment die IL-8-Sekretion um wenigstens 20, 30, 40, 50 oder 60 % im Vergleich zur IL-8-Produktion durch HT-1080-Zellen verringert, die den hOX40-Rezeptor in vitro in Anwesenheit von hOX40L in Abwesenheit eines für hOX40L spezifischen Antikörpers exprimieren.
  • 34. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die hOX40L-stimulierte humane T-Zellproliferation in vitro verringert.
  • 35. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die hOX40L-stimulierte IL-2-Sekretion von humanen T-Zellen in vitro verringert.
  • 36. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die durch die Interaktion humaner dendritischer Zellen (DC-Zellen) mit humanen T-Zellen vermittelte Zytokinsekretion verringert, wobei das Zytokin ausgewählt ist aus einem, zwei, mehreren oder allen der Folgenden: TNF-alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES und Interferon-gamma.

Dies kann z.B. mit einem MLR-In-vitro-Assay (z.B. ein DC/T-Zell-MLR-In-vitro-Assay) beurteilt werden. In den folgenden Beispielen wird ein geeigneter Assay veranschaulicht. In einem Beispiel werden die DC-Zellen mit den T-Zellen fehlgepaart (Mismatch), z.B. MHC-Fehlpaarung, was z.B. möglich ist, wenn die DC-Zellen von einem Menschen stammen, der sich von der humanen T-Zell-Quelle unterscheidet. In einem Beispiel werden die DC-Zellen durch In-vitro-Induktion humaner Monozyten mit GMCSF und IL-4 produziert.

  • 37. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die Interferon-gamma-Sekretion um wenigstens 20, 30, 40, 50 oder 60 % im Vergleich zur Produktion von Interferon-gamma verringert, die durch die Interaktion humaner dendritischer Zellen (DC-Zellen) mit humanen T-Zellen in Abwesenheit eines Antikörpers, für hOX40L spezifisch ist, vermittelt wird.
  • 38. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die TNF-alpha-Sekretion um wenigstens 20, 30, 40, 50 oder 60 % im Vergleich zur Produktion von TNF-alpha verringert, die durch die Interaktion humaner dendritischer Zellen (DC-Zellen) mit humanen T-Zellen in Abwesenheit eines für hOX40L spezifischen Antikörpers vermittelt wird.
  • 39. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die IL-2-Sekretion um wenigstens 10, 20, 30, 40, 50 oder 60 % im Vergleich zur Produktion von IL-2 verringert, die durch die Interaktion humaner dendritischer Zellen (DC-Zellen) mit humanen T-Zellen in Abwesenheit eines für hOX40L spezifischen Antikörpers vermittelt wird.
  • 40. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die Zytokinsekretion (z.B. Leukozyten-Zytokinssekretion) in einem humanen PBMC-(mononukleäre Zelle des peripheren Bluts)-Mischlymphozyten-(MLR)-Assay verringert, wobei das Zytokin ausgewählt ist aus einem, zwei, mehreren oder allen aus TNF-alpha, IL-2, IL-4, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, RANTES und Interferon-gamma.
  • 41. Das Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die Interferon-gamma-Sekretion um wenigstens 20, 30, 40, 50 oder 60 % im Vergleich zur Produktion von Interferon-gamma in einem humanen PBMC-MLR-Assay in Abwesenheit eines für hOX40L spezifischen Antikörpers verringert.

In einer Ausgestaltung bezieht sich der Vergleich auf die Produktion von Interferon-gamma in einem humanen PBMC- MLR-Assay in Abwesenheit eines Antikörpers.

  • 42. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die TNF-alpha-Sekretion um wenigstens 20, 30, 40, 50 oder 60 % im Vergleich zur Produktion von TNF-alpha in einem humanen PBMC-MLR-Assay in Abwesenheit eines für hOX40L spezifischen Antikörpers verringert.
  • 43. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Anspruch, wobei der Antikörper oder das Fragment die IL-2-Sekretion um wenigstens 10, 20, 30, 40, 50 oder 60 % im Vergleich zur Produktion von IL-2 in einem humanen PBMC-MLR-Assay in Abwesenheit eines für hOX40L spezifischen Antikörpers verringert.
  • 44. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 36 bis 43, wobei die Zellen Primärzellen sind.

Eine "Primärzelle" bezieht sich auf eine Zelle in einem Menschen oder eine Zelle, die von dem Patienten für eine Bindung an den Antikörper oder das Fragment der Erfindung in vitro (was z.B. in einem Verfahren zur Diagnose des OX40L-Status oder Krankheits-/Zustands-Status in dem Menschen nützlich sein kann) genommen wurde. Hierin verwendete Primärzellen sind keine Zellen humaner Zelllinien, die typischerweise viele In-vitro-Kulturen durchlaufen haben. Die Fähigkeit des Antikörpers oder Fragments der Erfindung, die hOX40L-Bindung am Rezeptor in dieser Ausgestaltung spezifisch zu inhibieren, ist von Vorteil, da sie einen direkten Hinweis auf die Nützlichkeit zum Adressieren von Zellen in menschlichen Patienten liefert, die an einer/einem hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustand leiden oder dafür gefährdet sind.

  • 45. Der Antikörper oder das Fragment nach einem vorherigen Aspekt, wobei der Antikörper oder das Fragment die Bindung von hOX40L an einen hOX40L-Rezeptor (z.B. hOX40) mit einem IC50 von 1 × 10–8 oder weniger in einem HTRF-(homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz)-Assay inhibiert.

In einem Beispiel liegt der IC50 im Bereich von 1 × 10–8 bis 1 × 10–11 oder im Bereich von 1 × 10–9 bis 1 × 10–10.

  • 46. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Verhütung eines/einer OX40L-vermittelten Zustands oder Krankheit, wobei die Zusammensetzung einen Antikörper oder ein Fragment nach einem vorherigen Aspekt und ein Verdünnungsmittel, einen Exzipienten oder Träger enthält; und optional ferner ein entzündungshemmendes Arzneimittel enthält.

In einem Beispiel ist das entzündungshemmende Arzneimittel unabhängig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Anti-IL12/IL-23-Antikörpern (z.B. Ustekinumab), Anti-VLA4-Antikörpern (z.B. Natalizumab), Anti-LFA1-Antikörpern, Anti-Komplement-C5-Antikörpern (z.B. Eculizumab), Anti-a4b7-Integrin-Antikörpern (z.B. Vedolizumab), Anti-IL6-Antikörpern (z.B. Tocilizumab), Anti-IL2R-Antikörpern (z.B. Basilixumab) oder Anti-TNFa-Antikörpern/TNFa-Fc-Molekülen (z.B. Etanercept, Adalimumab, Infliximab, Golimumab, Certolizumab Pegol). In einem Beispiel ist das entzündungshemmende Arzneimittel unabhängig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon) und Anti-LFA1-Antikörpern.

  • 47. Eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Kit zur Behandlung und/oder Verhütung eines/einer OX40L-vermittelten Zustands oder Krankheit, wobei die Zusammensetzung oder der Kit einen Antikörper oder ein Fragment der Erfindung (und optional ein entzündungshemmendes Arzneimittel), optional in Kombination mit einem Etikett oder mit Anweisungen für den Gebrauch, zur Behandlung und/oder Verhütung der/des genannten Krankheit oder Zustands bei einem Menschen, beinhaltet; wobei das Etikett oder die Anweisungen optional eine Arzneimittelzulassungsnummer beinhaltet/n (z.B. eine FDA oder EMA-Zulassungsnummer); wobei der Kit optional eine IV- oder Injektionsvorrichtung enthält, die den Antikörper oder das Fragment beinhaltet.
  • 48. Eine Nucleinsäure, die die HCDR3 eines in einem der Aspekte 1 bis 45 aufgeführten Antikörpers kodiert.

In einer Ausgestaltung entsprechen die HCDRs hierin Kabat-Nomenklatur. In einer anderen Ausgestaltung entsprechen die HCDRs hierin IMGT-Nomenklatur.

  • 49. Die Nucleinsäure nach Aspekt 48, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die wenigstens 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99 % identisch oder 100 % identisch mit einer HCDR32-Sequenz in der Sequenzauflistung ist.

In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Nucleinsäure bereit, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die eine VH-Domäne eines Anti-hOX40L-Antikörpers kodiert, wobei die Nucleotidsequenz eine HCDR3-Sequenz beinhaltet, die wenigstens 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99 % identisch oder 100 % identisch mit einer HCDR3-Sequenz in der Sequenzauflistung ist. Optional entspricht der Antikörper einem anderen Aspekt hierin.

In einer anderen Ausgestaltung wird eine Nucleinsäure von Aspekt 48 bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die 100 % identisch mit einer HCDR3-Sequenz in der Sequenzauflistung ist, mit Ausnahme von 1, 2 oder 3 Nucleotidsubstitutionen, wobei die jeweiligen Substitutionen keine Aminosäureänderung hervorrufen oder eine konservative Aminosäureänderung (d.h. die Nucleotidsubstitution ist eine synonyme Substitution) in der entsprechenden Proteinsequenz hervorrufen. Die Fachperson wird mit konservativen Aminosäureänderungen vertraut sein.

Aminosäuresubstitutionen schließen Veränderungen ein, bei denen eine Aminosäure durch einen anderen natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt wird. Solche Substitutionen können als "konservativ" eingestuft werden, und in diesem Fall wird ein in einem Polypeptid enthaltener Aminosäurerest durch eine andere natürlich vorkommende Aminosäure ähnlichen Charakters mit Bezug auf Polarität, Seitenkettenfunktionalität oder Größe ersetzt wird. Solche konservativen Substitutionen sind in der Technik gut bekannt. Von der vorliegenden Erfindung eingeschlossene Substitutionen können auch "nicht konservativ" sein, wobei ein Aminosäurerest, der in einem Peptid vorliegt, durch eine Aminosäure mit anderen Eigenschaften substituiert ist, wie eine natürlich vorkommende Aminosäure von einer anderen Gruppe (die z.B. eine geladene oder hydrophobe Aminosäure durch Alanin substituiert), oder alternativ, wobei eine natürliche vorkommende Aminosäure durch eine nicht konventionelle Aminosäure substituiert ist.

Zusätzlich oder alternativ wird die Nucleinsäure von Aspekt 49 bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die 100 % identisch mit einer HCDR3-Sequenz in der Sequenzauflistung ist, mit Ausnahme von 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 synonymen Nucleotidsubstitutionen und keiner, 1, 2 oder 3 Nucleotidsubstitutionen, die konservative Aminosäureänderungen in der entsprechenden Proteinsequenz hervorrufen.

  • 50. Eine Nucleinsäure, die die HCDR2 eines in einem der Aspekte 1 bis 45 aufgeführten Antikörpers kodiert; wobei die Nucleinsäure optional Aspekt 48 oder 49 entspricht.
  • 51. Die Nucleinsäure von Aspekt 50, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die wenigstens 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99 % identisch oder 100 % identisch mit einer HCDR2-Sequenz in der Sequenzauflistung ist.

In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Nucleinsäure bereit, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die eine VH-Domäne eines Anti-hOX40L-Antikörpers kodiert, wobei die Nucleotidsequenz eine HCDR2-Sequenz beinhaltet, die wenigstens 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99 % identisch oder 100 % identisch mit einer HCDR2-Sequenz in der Sequenzauflistung ist. Optional entspricht der Antikörper einem anderen Aspekt hierin.

In einer anderen Ausgestaltung wird die Nucleinsäure von Aspekt 51 bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die 100 % identisch mit einer HCDR2-Sequenz in der Sequenzauflistung ist, mit Ausnahme von 1, 2 oder 3 Nucleotidsubstitutionen, wobei die jeweiligen Substitutionen keine Aminosäureänderung hervorrufen oder eine konservative Aminosäureänderung (d.h. die Nucleotidsubstitution ist einen synonyme Substitution) in der entsprechenden Proteinsequenz hervorrufen. Die Fachperson wird mit konservativen Aminosäureänderungen vertraut sein.

Zusätzlich oder alternativ wird die Nucleinsäure von Aspekt 50 bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die 100 % identisch mit einer HCDR2-Sequenz in der Sequenzauflistung ist, mit Ausnahme von 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 synonymen Nucleotidsubstitutionen und keiner, 1, 2 oder 3 Nucleotidsubstitutionen, die konservative Aminosäureänderungen in der entsprechenden Proteinsequenz hervorrufen.

  • 52. Eine Nucleinsäure, die die HCDR1 eines in einem der Aspekte 1 bis 45 aufgeführten Antikörpers kodiert; wobei die Nucleinsäure optional einem der Aspekte 48 bis 51 entspricht.
  • 53. Die Nucleinsäure von Aspekt 52, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die wenigstens 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99 % identisch oder 100 % identisch mit einer HCDR1-Sequenz in der Sequenzauflistung ist.

In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Nucleinsäure bereit, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die eine VH-Domäne eines Anti-hOX40L-Antikörpers kodiert, wobei die Nucleotidsequenz eine HCDR1-Sequenz beinhaltet, die wenigstens 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99 % identisch oder 100 % identisch mit einer HCDR1-Sequenz in der Sequenzauflistung ist. Der Antikörper entspricht optional einem anderen Aspekt hierin.

In einer anderen Ausgestaltung wird die Nucleinsäure von Aspekt 52 bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die 100 % identisch mit einer HCDR1-Sequenz in der Sequenzauflistung ist, mit Ausnahme von 1, 2 oder 3 Nucleotidsubstitutionen, wobei die jeweiligen Substitutionen keine Aminosäureänderung hervorrufen oder eine konservative Aminosäureänderung (d.h. die Nucleotidsubstitution ist eine synonyme Substitution) in der entsprechenden Proteinsequenz hervorrufen. Die Fachperson wird mit konservativen Aminosäureänderungen vertraut sein.

Zusätzlich oder alternativ wird die Nucleinsäure von Aspekt 52 bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die 100 % identisch mit einer HCDR1-Sequenz in der Sequenzauflistung ist, mit Ausnahme von 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 synonymen Nucleotidsubstitutionen und keiner, 1, 2 oder 3 Nucleotidsubstitutionen, die konservative Aminosäureänderungen in der entsprechenden Proteinsequenz hervorrufen.

  • 54. Eine Nucleinsäure, die eine VH-Domäne und/oder eine VL-Domäne eines in einem der Aspekte 1 bis 45 aufgeführten Antikörpers kodiert.
  • 55. Die Nucleinsäure von Aspekt 54, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die wenigstens 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99 % identisch oder 100 % identisch mit einer VH-Domänen-Nucleotidsequenz in der Sequenzauflistung ist.

In einer anderen Ausgestaltung wird die Nucleinsäure von Aspekt 54 bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die 100 % identisch mit einer VH-Domänen-Nucleotidsequenz in der Sequenzauflistung ist, mit Ausnahme von 1, 2 oder 3 Nucleotidsubstitutionen, wobei die jeweiligen Substitutionen keine Aminosäureänderung hervorrufen oder eine konservative Aminosäureänderung (d.h. die Nucleotidsubstitution ist eine synonyme Substitution) in der entsprechenden Proteinsequenz hervorrufen. Die Fachperson wird mit konservativen Aminosäureänderungen vertraut sein.

Zusätzlich oder alternativ wird die Nucleinsäure von Aspekt 54 bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die 100 % identisch mit einer VH-Domänen-Nucleotidsequenz in der Sequenzauflistung ist, mit Ausnahme von 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 synonymen Nucleotidsubstitutionen und keiner, 1, 2 oder 3 Nucleotidsubstitutionen, die konservative Aminosäureänderungen in der entsprechenden Proteinsequenz hervorrufen.

  • 56. Die Nucleinsäure von Aspekt 54 oder 55, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die wenigstens 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99 % identisch oder 100 % identisch mit einer VL-Domänen-Nucleotidsequenz in der Sequenzauflistung ist.

In einer anderen Ausgestaltung wird die Nucleinsäure von Aspekt 54 oder 55 bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die 100 % identisch mit einer VL-Domänen-Nucleotidsequenz in der Sequenzauflistung ist, mit Ausnahme von 1, 2 oder 3 Nucleotidsubstitutionen, wobei die jeweiligen Substitutionen keine Aminosäureänderung hervorrufen oder eine konservative Aminosäureänderung (d.h. die Nucleotidsubstitution ist eine synonyme Substitution) in der entsprechenden Proteinsequenz hervorrufen. Die Fachperson wird mit konservativen Aminosäureänderungen vertraut sein.

usätzlich oder alternativ wird die Nucleinsäure von Aspekt 54 oder 55 bereitgestellt, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die 100 % identisch mit einer VL-Domänen-Nucleotidsequenz in der Sequenzauflistung ist, mit Ausnahme von 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 synonymen Nucleotidsubstitutionen und keiner, 1, 2 oder 3 Nucleotidsubstitution, die konservative Aminosäureänderungen in der entsprechenden Proteinsequenz hervorrufen.

  • 57. Eine Nucleinsäure, die eine Schwerkette oder eine Leichtkette eines in einem der Aspekte 1 bis 45 aufgeführten Antikörpers kodiert.
  • 58. Die Nucleinsäure von Aspekt 57, die eine Nucleotidsequenz wie in einem der Aspekte 48 bis 56 aufgeführt beinhaltet.
  • 59. Ein Vektor (z.B. ein Säugetier-Expressionsvektor), der die Nucleinsäure nach einem der Aspekte 48 bis 58 beinhaltet; wobei der Vektor optional ein CHO- oder HEK293-Vektor ist. In einem Beispiel ist der Vektor ein Hefevektor, z.B. ein Saccharomyces- oder Pichia-Vektor.
  • 60. Ein Wirt, der die Nucleinsäure nach einem der Aspekte 48 bis 58 oder den Vektor von Aspekt 59 beinhaltet. In einem Beispiel ist der Wirt eine Säugetier- (z.B. human, z.B. CHO oder HEK293) Zelllinie oder eine Hefe- oder Bakterienzelllinie.
  • 61. Verwendung eines Antikörpers oder Fragments davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an einen Menschen, zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei dem Menschen durch Verringern von einem, mehreren oder allen der Folgenden:
    a. Sekretion eines Zytokins, ausgewählt aus TNF-alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES und Interferon-gamma bei dem Menschen;
    b. Proliferation von Leukozyten des Menschen; und
    c. Bindung des hOX40-Rezeptors, der durch humane T-Zellen exprimiert wird, mit Endothelzellen-exprimiertem hOX40L.

Die Merkmale von beliebigen der vorherigen Aspekte, Konfiguration, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen optional mutatis mutandis auf diese Verwendung zu.

In einem Beispiel leidet der Mensch an Asthma oder ist dafür gefährdet und der Antikörper oder das Fragment ist zum Verringern von IgE in dem Menschen vorgesehen, so dass Asthma bei dem Menschen behandelt, verhütet oder reduziert wird.

  • 62. Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei einem Menschen durch Verringern von einem, mehreren oder allen der Folgenden:
    a. Sekretion eines Zytokins, ausgewählt aus TNF-alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES und Interferon-gamma bei dem Menschen;
    b. Proliferation von Leukozyten des Menschen; und
    c. Bindung des hOX40-Rezeptors, der durch humane T-Zellen exprimiert wird, mit Endothelzellen-exprimiertem hOX40L;
    wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers oder Fragments an den genannten Menschen beinhaltet, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet.

Die Merkmale von beliebigen der vorherigen Aspekte, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen optional mutatis mutandis auf dieses Verfahren zu.

Das erfindungsgemäße Verfahren behandelt oder verhütet die/den genannte(n) Krankheit oder Zustand bei dem Menschen. Eine “therapeutisch wirksame Menge” des Antikörpers oder Fragments ist die Menge (verabreicht in einer oder mehreren Dosen, die zeitlich voneinander beabstandet sein können, z.B. im Wesentlichen monatliche Verabreichung), die die Wirkung hat, die genannte Behandlung oder Verhütung herbeizuführen. Diese wird der Fachperson ohne weiteres bekannt sein und kann je nach dem/der jeweiligen behandelten menschlichen Patienten und Krankheit oder Zustand variieren.

In einem Beispiel leidet der Mensch an Asthma oder ist dafür gefährdet und der Antikörper oder das Fragment verringert IgE in dem Menschen, so dass Asthma bei dem Menschen behandelt, verhütet oder reduziert wird.

  • 63. Das Verfahren oder die Verwendung von Aspekt 61 oder 62 zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit, Zustands oder Epithelzellschadens bei dem genannten Menschen durch Verringern der Proliferation von T-Zellen bei dem genannten Menschen.
  • 64. Das Verfahren oder die Verwendung nach einem der Aspekte 61 bis 63 zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit, Zustands oder Epithelzellschadens bei dem genannten Menschen durch Entgegenwirken der Interaktion zwischen hOX40L und Leukozyten des Menschen, wobei die Proliferation von Leukozyten verringert wird.
  • 65. Das Verfahren oder die Verwendung nach einem der Aspekte 61 bis 64 zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit, Zustand oder Epithelzellschadens bei dem genannten Menschen durch Verringern der Proliferation von Leukozyten des Menschen durch Entgegenwirken der durch T-Zellen vermittelten OX40L/OX40L-Rezeptorinteraktion bei dem genannten Menschen.
  • 66. Das Verfahren oder die Verwendung nach einem der Aspekte 61 bis 65 zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten hOX40L-vermittelten Krankheit, Zustands oder Epithelzellschadens bei dem genannten Menschen durch Verringern der Sekretion von IL-8-Zytokin bei dem Menschen.
  • 67. Das Verfahren nach Aspekt 66 zur Behandlung oder Verhütung der/des genannten Krankheit, Zustands oder Epithelzellschadens durch Verringern der Sekretion des genannten IL-8, vermittelt durch die Interaktion dendritischer Zellen (DC-Zellen) mit T-Zellen bei dem Menschen.
  • 68. Das Verfahren oder die Verwendung nach einem der Aspekte 61 bis 67, wobei Magen-Darm-Zell-, Kolonzell-, Darmzell- oder Atemwegs- (z.B. Lunge) Zellschaden ein Symptom oder eine Ursache der/des genannten Krankheit oder Zustands bei Menschen ist.

In einer anderen Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Magen-Darm-Zellen, Kolonzellen, Darmzellen, Augenzellen und Atemwegs-(z.B. Lunge)Epithelzellen. In einer anderen Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Magen-Darm-Zellen, Kolonzellen, Darmzellen und Augenzellen. In einer weiteren Ausgestaltung beinhalten die Epithelzellen Augenzellen.

  • 69. Das Verfahren oder die Verwendung nach einem der Aspekte 61 bis 68, wobei der Mensch an einer entzündlichen Darmkrankheit (CED), allogenen Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Diabetes oder Atemwegsentzündung leidet oder dafür gefährdet ist und das genannte Verfahren CED, allogene Transplantatabstoßung, GvHD, Diabetes oder Atemwegsentzündung bei dem Menschen behandelt oder verhütet.
  • 69a. Das Verfahren oder die Verwendung nach einem der Aspekte 61 bis 68, wobei der Mensch an einer entzündlichen Darmkrankheit (CED), allogenen Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Uveitis, Pyoderma gangrenosum, Riesenzellarteriitis, Schnitzler-Syndrom, nicht infektiösen Skleritis, Diabetes oder Atemwegsentzündung leidet oder dafür gefährdet ist und das genannte Verfahren CED, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Uveitis, Pyoderma gangrenosum, Riesenzellarteriitis, Schnitzler-Syndrom, nicht infektiöse Skleritis, Diabetes oder Atemwegsentzündung beim Menschen behandelt oder verhütet.

In jedem/jeder Aspekt, Konfiguration oder Ausgestaltung leidet der Mensch an einer/einem hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustand oder ist dafür gefährdet, die/der ausgewählt ist aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungserkrankung oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose und Atherosklerose, insbesondere GvHD.

  • 70. Das Verfahren oder die Verwendung nach einem der Aspekte 61 bis 69a, wobei der Antikörper oder das Fragment einem der Aspekte 1 bis 45 oder einem/einer hierin beschriebenen Beispiel, Konfiguration, Aspekt oder Ausgestaltung entspricht.
  • 71. Der Antikörper, das Fragment, die Zusammensetzung, der Kit, das Verfahren oder die Verwendung nach einem vorherigen Aspekt zur Behandlung oder Verhütung einer/eines Entzündungs- oder Autoimmunkrankheit oder -zustands bei einem Menschen oder zur Reduzierung oder Verhütung von Angiogenese bei einem Menschen.
  • 72. Der Antikörper, das Fragment, die Zusammensetzung, der Kit, das Verfahren oder die Verwendung nach einem vorherigen Aspekt, wobei die Krankheit oder der Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus entzündlicher Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Psoriasis, Bronchiolitis, Gingivitis, Transplantatabstoßung, allogener Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Asthma, adultem respiratorischem Distresssyndrom (ARDS), septischem Schock, Colitis ulcerosa, Sjögren-Syndrom, Atemwegsentzündung, systemischem Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Kontakthypersensibilität, mulipler Sklerose und Atherosklerose.
  • 72a. Der Antikörper, das Fragment, die Zusammensetzung, der Kit, das Verfahren oder die Verwendung nach einem vorherigen Aspekt, wobei die Krankheit oder der Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus entzündlicher Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Psoriasis, Bronchiolitis, Gingivitis, Transplantatabstoßung, allogener Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Asthma, adultem respiratorischem Distresssyndrom (ARDS), septischem Schock, Colitis ulcerosa, Sjögren-Syndrom, Atemwegsentzündung, systemischem Lupus erythematodes (SLE), Uveitis, Pyoderma gangrenosum, Riesenzellarteriitis, Schnitzler-Syndrom, nicht infektiöser Skleritis, Diabetes, Kontakthypersensibilität, multipler Sklerose und Atherosklerose.

In jedem/jeder Aspekt, Konfiguration oder Ausgestaltung leidet der Mensch an einer/einem hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustand oder ist dafür gefährdet, die/der ausgewählt ist aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungserkrankung oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose und Atherosklerose, insbesondere GvHD.

In einem Beispiel ist die Krankheit oder der Zustand ein(e) OX40L-vermittelte(r) Krankheit oder Zustand, die/der in der US7812133 oder EP1791869 offenbart ist.

In einem Beispiel ist die Krankheit oder der Zustand ein(e) entzündliche(r) oder autoimmune(r) Krankheit oder Zustand. In einem Beispiel ist die Krankheit oder der Zustand eine Transplantatabstoßung.

Der hierin verwendete Begriff entzündliche(r) Krankheit oder Zustand bezieht sich auf pathologische Zustände, die sich aus einer Entzündung ergeben, z.B. infolge neutrophiler Chemotaxis. Zu Beispielen für solche Störungen gehören entzündliche Hautkrankheiten, inkl. Psoriasis; Reaktionen in Verbindung mit einer entzündlichen Darmkrankheit (wie Crohn-Krankheit und Colitis ulcerosa); ischämische Reperfusion; adultes respiratorisches Distresssyndrom; Dermatitis; Meningitis; Enzephalitis; Uveitis; Autoimmunkrankheiten wie Rheumatoidarthritis, Sjörgen-Syndrom, Vaskulitis; Krankheiten, die mit Leukozytendiapedese einhergehen; Entzündungsstörung des Zentralnervensystems (ZNS), Multiorganverletzungssyndrom sekundär zu Septikämie oder Trauma; alkoholische Hepatitis, bakterielle Pneumonie, Antigen-Antikörper-Komplex-vermittelte Krankheiten; Entzündungen der Lunge, inkl. Pleuritis, Alveolitis, Vaskulitis, Pneumonie, chronischer Bronchitis, Bronchiektase und zystischer Fibrose; usw. Die bevorzugten Indikationen sind bakterielle Pneumonie und entzündliche Darmkrankheit wie Colitis ulcerosa. Die Erfindung wird somit in einem Beispiel zur Behandlung oder Verhütung von einem oder mehreren dieser Zustände bereitgestellt.

In einem Beispiel ist die Krankheit oder der Zustand Krebs.

In einem Beispiel ist die Krankheit Uveitis wie systemische Uveitis oder autoimmune/nicht infektiöse Uveitis.

  • 73. Ein Antikörper oder ein Fragment davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet und um eine Bindung an das genannte hOX40L mit dem Antikörper 02D10 konkurriert, wobei der Antikörper oder das Fragment eine VH-Domäne beinhaltet, die eine HCDR3 beinhaltet, die das Motiv VRGXYYY beinhaltet, wobei X eine Aminosäure ist.

Die Merkmale der Antikörper nach einem/einer der hierin beschriebenen Aspekte, Konfigurationen, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen optional mutatis mutandis auf diese Antikörper zu, z.B. kann der Antikörper ein humaner Antikörper oder ein chimärer Antikörper mit den hierin beschriebenen funktionellen Merkmalen sein. Die Konkurrenz kann wie in einem/einer hierin beschriebenen Aspekt, Ausgestaltung, Beispiel oder Konfiguration ermittelt werden, z.B. wie durch SPR, ELISA, HTRF oder FACS ermittelt.

In einer Ausgestaltung konkurriert der Antikörper oder das Fragment mit den variablen Regionen von 02D10 (z.B. konkurriert mit einem Antikörper, der die variable Region der Schwerkette von SEQ ID Nr. 34 und die variable Region der Leichtkette von SEQ ID Nr. 48 beinhaltet). In einer anderen Ausgestaltung konkurriert der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 IgG4-PE mit einer Schwerketten-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 62 und einer Leichtketten-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 64. Somit kann die Fähigkeit eines Antikörpers oder Fragments, um eine Bindung an hOX40L mit dem Antikörper 02D10 zu konkurrieren, z.B. durch SPR (wie hierin beschrieben) unter Verwendung eines IgG4-PE-Antikörpers mit einer Schwerketten-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 62 und einer Leichtketten-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 64 als 02D10-Referenzantikörper bestimmt werden.

In einer anderen Ausgestaltung konkurriert der Antikörper oder das Fragment zusätzlich oder alternativ mit 10A7. In einer Ausgestaltung konkurriert der Antikörper oder das Fragment mit den variablen Regionen von 10A7 (z.B. konkurriert mit einem Antikörper, der die variable Region der Schwerkette von SEQ ID Nr. 2 und die variable Region der Leichtkette von SEQ ID Nr. 16 beinhaltet). In einer anderen Ausgestaltung konkurriert der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 IgG4-PE mit einer Schwerketten-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 30 und einer Leichtketten-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 32.

In einer Ausgestaltung ist die Aminosäure eine beliebige natürlich vorkommende Aminosäure.

  • 74. Der Antikörper oder das Fragment nach Aspekt 73, wobei X eine neutrale Aminosäure ist, optional P oder G.

In einer Ausgestaltung ist X P oder G. In einer Ausgestaltung ist X aus P, N, A oder G ausgewählt. In einer anderen Ausgestaltung ist X aus P, G oder N ausgewählt. In einer anderen Ausgestaltung ist X aus P, G oder A ausgewählt.

  • 75. Ein Antikörper oder ein Fragment davon, optional nach Anspruch 1 oder 2, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet und um eine Bindung an das genannte hOX40L mit dem Antikörper 02D10 konkurriert, wobei der Antikörper oder das Fragment eine VH-Domäne beinhaltet, die die HCDR3-Sequenz von SEQ ID Nr. 40 oder 46 oder die HCDR3-Sequenz von SEQ ID Nr. 40 oder 46 beinhaltet, die weniger als 5 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

Die Merkmale der Antikörper nach einem/einer der hierin beschriebenen Aspekte, Konfigurationen, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen mutatis mutandis auf diese Antikörper zu, z.B. kann der Antikörper ein humaner Antikörper oder ein chimärer Antikörper mit hierin beschriebenen funktionellen Merkmalen sein. Konkurrenz kann wie in einem/einer hierin beschriebenen Aspekt, Ausgestaltung, Beispiel oder Konfiguration bestimmt werden, z.B. wie durch SPR, ELISA, HTRF oder FACS bestimmt.

In einer Ausgestaltung beinhaltet die HCDR3-Sequenz von SEQ ID Nr. 40 oder 46 weniger als 4 Aminosäuresubstitutionen (d.h. 3 oder weniger). In einer Ausgestaltung beinhaltet die HCDR3-Sequenz von SEQ ID Nr. 40 oder 46 weniger als 3 Aminosäuresubstitutionen (d.h. 2 oder 1 Substitution(en)). In einer Ausgestaltung beinhaltet die HCDR3-Sequenz von SEQ ID Nr. 40 oder 46 weniger als 2 Aminosäuresubstitutionen (d.h. eine Substitution).

In einer Ausgestaltung konkurriert der Antikörper oder das Fragment mit den variablen Regionen von 02D10 (z.B. konkurriert mit einem Antikörper, der die variable Region der Schwerkette von SEQ ID Nr. 34 und die variable Region der Leichtkette von SEQ ID Nr. 48 beinhaltet). In einer anderen Ausgestaltung konkurriert der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 IgG4-PE mit einer Schwerketten-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 62 und einer Leichtketten-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 64.

In einer anderen Ausgestaltung konkurriert der Antikörper oder das Fragment zusätzlich oder alternativ mit 10A7. In einer Ausgestaltung konkurriert der Antikörper oder das Fragment mit den variablen Regionen von 10A7 (z.B. konkurriert mit einem Antikörper, der die variable Region der Schwerkette von SEQ ID Nr. 2 und die variable Region der Leichtkette von SEQ ID Nr. 16 beinhaltet). In einer anderen Ausgestaltung konkurriert der Antikörper oder das Fragment mit 02D10 IgG4-PE mit einer Schwerketten-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 30 und einer Leichtketten-Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 32.

  • 76. Ein Antikörper oder ein Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 75, wobei die VH-Domäne eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet, die von der Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments abgeleitet ist, wobei das humane JH-Gensegment IGHJ6 (z.B. IGHJ6*02) ist.

In einer Ausgestaltung ist das humane JH-Gensegment ausgewählt aus IGHJ6*01, IGHJ6*02, IGHJ6*03 und IGHJ6*04. In einer anderen Ausgestaltung ist das humane JH- Gensegment ausgewählt aus IGHJ6*01, IGHJ6*02 und IGHJ6*04. In einer anderen Ausgestaltung ist das JH-Gensegment IGHJ6*02.

In einer weiteren Ausgestaltung ist das humane VH-Gensegment IGHV3-23, z.B. ausgewählt aus IGHV3-23*01, IGHV3-23*02, IGHV3-23*03, IGHV3-23*04 und IGHV3-23*05. In einer anderen Ausgestaltung ist das humane VH-Gensegment IGHV3-23*01 oder IGHV3-23*04, insbesondere IGHV3-23*04.

In einer weiteren Ausgestaltung ist das humane DH-Gensegment IGHD3-10, z.B. ausgewählt aus IGHD3-10*01 und IGHD3-10*02. In einer Ausgestaltung ist das humane DH-Gensegment IGHD3-10*01. In einer Ausgestaltung ist das humane DH-Gensegment IGHD3-10*02.

  • 77. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 76, wobei die VH-Domäne die HCDR1-Sequenz von SEQ ID Nr. 36 oder 42 oder die HCDR1-Sequenz von SEQ ID Nr. 36 oder 42 beinhaltet, die weniger als 4 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

In einer Ausgestaltung beinhaltet die HCDR1-Sequenz von SEQ ID Nr. 36 oder 42 weniger als 3 Aminosäuresubstitutionen (d.h. 2 oder 1 Substitutionen). In einer Ausgestaltung beinhaltet die HCDR1-Sequenz von SEQ ID Nr. 36 oder 42 weniger als 2 Aminosäuresubstitutionen (d.h. eine Substitution).

  • 78. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 77, wobei die VH-Domäne die HCDR2-Sequenz von SEQ ID Nr. 38 oder 44 oder die HCDR2-Sequenz von SEQ ID Nr. 38 oder 44 beinhaltet, die weniger als 5 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

In einer Ausgestaltung beinhaltet die HCDR2-Sequenz von SEQ ID Nr. 38 oder 44 weniger als 4 Aminosäuresubstitutionen (d.h. 3 oder weniger). In einer Ausgestaltung beinhaltet die HCDR2-Sequenz von SEQ ID Nr. 38 oder 44 weniger als 3 Aminosäuresubstitutionen (d.h. 2 oder 1 Substitution(en)). In einer Ausgestaltung beinhaltet die HCDR2-Sequenz von SEQ ID Nr. 38 oder 44 weniger als 2 Aminosäuresubstitutionen (d.h. eine Substitution).

  • 79. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 78, wobei die VH-Domäne eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 34 oder eine Schwerketten-variable Domäne-Aminosäuresequenz beinhaltet, die wenigstens 80 % (z.B. wenigstens 85 %) identisch mit SEQ ID Nr. 34 ist.

In einer Ausgestaltung ist die Schwerketten-variable Domäne-Aminosäuresequenz wenigstens 85 %, wenigstens 90 %, wenigstens 95 %, wenigstens 96 %, wenigstens 97 %, wenigstens 98 % oder wenigstens 99 % identisch mit SEQ ID Nr. 34.

  • 80. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 79, der/das erste und zweite Kopien der genannten VH-Domäne beinhaltet.
  • 81. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 80, der/das eine VL-Domäne beinhaltet, die die LCDR1-Sequenz von SEQ ID Nr. 54 oder 60 oder die LCRD3-Sequenz von SEQ ID Nr. 54 oder 60 beinhaltet, die weniger als 5 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

In einer Ausgestaltung beinhaltet die LCRD3-Sequenz von SEQ ID Nr. 54 oder 60 weniger als 4 Aminosäuresubstitutionen (d.h. 3 oder weniger). In einer Ausgestaltung beinhaltet die LCRD3-Sequenz von SEQ ID Nr. 54 oder 60 weniger als 3 Aminosäuresubstitutionen (d.h. 2 oder 1 Substitution(en)). In einer Ausgestaltung beinhaltet die LCRD3-Sequenz von SEQ ID Nr. 54 oder 60 weniger als 2 Aminosäuresubstitutionen (d.h. eine Substitution).

  • 82. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 81, der/das eine oder die genannte VL-Domäne beinhaltet, wobei die VL-Domäne die LCDR2-Sequenz von SEQ ID Nr. 52 oder 58 oder die LCRD2-Sequenz von SEQ ID Nr. 52 oder 58 mit weniger als 2 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.
  • 83. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 82, der/das eine oder die genannte VL-Domäne beinhaltet, wobei die VL-Domäne die LCDR1-Sequenz von SEQ ID Nr. 54 oder 60 oder die LCRD1-Sequenz von SEQ ID Nr. 54 oder 60 mit weniger als 4 Aminosäuresubstitutionen beinhaltet.

In einer Ausgestaltung beinhaltet die LCDR1-Sequenz von SEQ ID Nr. 54 oder 60 weniger als 3 Aminosäuresubstitutionen (d.h. 2 oder 1 Substitution(en)). In einer Ausgestaltung beinhaltet die LCDR1-Sequenz von SEQ ID Nr. 54 oder 60 weniger als 2 Aminosäuresubstitutionen (d.h. eine Substitution).

  • 84. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 83, der/das eine oder die genannte VL-Domäne beinhaltet, wobei die VL-Domäne eine Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 48 oder eine Leichtketten-variable Domäne-Aminosäuresequenz beinhaltet, die wenigstens 80 % (z.B. wenigstens 85 %) identisch mit SEQ ID Nr. 48 ist.

In einer Ausgestaltung ist die Leichtketten-variable Domäne-Aminosäuresequenz wenigstens 85 %, wenigstens 90 %, wenigstens 95 %, wenigstens 96 %, wenigstens 97 %, wenigstens 98 % oder wenigstens 99 % identisch mit SEQ ID Nr. 48.

  • 85. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 81 bis 84, der/das erste und zweite Kopien der genannten VL-Domäne beinhaltet.
  • 86. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 81 bis 85, wobei der Antikörper oder das Fragment eine Kappa-Leichtkette beinhaltet.

In einer anderen Ausgestaltung ist die VL-Domäne eine Kappa-VL-Domäne. In einer Ausgestaltung ist die Kappa-VL-Domäne von der Rekombination eines humanen VL-Genseqments und eines humanen JL-Gensegments abgeleitet, wobei das humane VL-Gensegment IGKV1D-39 ist. In einer anderen Ausgestaltung ist das VL-Gensegment IGKV1D-39*01.

In einer weiteren Ausgestaltung ist das humane JL-Gensegment IGKJ1 oder IGKJ3. In einer anderen Ausgestaltung ist das JL-Gensegment IGKJ1*01. In einer anderen Ausgestaltung ist das JL-Gensegment IGKJ3*01.

  • 87. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 75 bis 86, wobei die Aminosäuresubstitutionen konservative Aminosäuresubstitutionen sind, wobei die konservativen Substitutionen optional von einer von sechs Gruppen stammen (wobei jede Gruppe Aminosäuren enthält, die konservative Substitutionen für eine andere sind), ausgewählt aus:
    1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
    2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
    3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
    4) Arginin (R), Lysin (K);
    5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
    6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).

In einer Ausgestaltung sind die konservativen Aminosäuresubstitutionen wie hierin beschrieben. Die Substitution kann z.B. wie folgt sein: Y durch F, T durch S oder K, P durch A, E durch D oder Q, N durch D oder G, R durch K, G durch N oder A, T durch S oder K, D durch N oder E, I durch L oder V, F durch Y, S durch T oder A, R durch K, G durch N oder A, K durch R, A durch S, K oder P. In einer anderen Ausgestaltung können die konservativen Aminosäuresubstitutionen so sein, dass Y substituiert ist durch F, T durch A oder S, I durch L oder V, W durch Y, M durch L, N durch D, G durch A, T durch A oder S, D durch N, I durch L oder V, F durch Y oder L, S durch A oder T und A durch S, G, T oder V.

  • 88. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 87, wobei der Antikörper oder das Fragment eine konstante Region beinhaltet, z.B. eine konstante IgG4-Region, wobei die konstante Region optional IgG4-PE (Seq ID Nr. 128) ist.

In einem anderen Beispiel nach einem Aspekt hierin beinhaltet der Antikörper oder das Fragment eine humane konstante Gamma-4-Region. In einer anderen Ausgestaltung bindet die konstante Schwerkettenregion Fc-γ-Rezeptoren nicht und beinhaltet z.B. eine Leu235Glu-Mutation (d.h. wobei der Wildtyp-Leucinrest zu einem Glutaminsäurerest mutiert ist). In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet die konstante Schwerkettenregion eine Ser228Pro-Mutation zum Erhöhen der Stabilität.

  • 89. Der Antikörper nach einem der Aspekte 73 bis 88, wobei der Antikörper eine Schwerkette und eine Leichtkette beinhaltet, wobei die Schwerketten-Aminosäuresequenz aus der Sequenz von SEQ ID Nr. 62 besteht und die Leichtketten-Aminosäuresequenz aus der Sequenz von SEQ ID Nr. 64 besteht.
  • 90. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99, 101 oder 102 zur Verwendung bei der Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD.

Die Merkmale der Antikörper und die hOX40L-vermittelte Krankheit nach einem/einer der hierin beschriebenen Aspekte, Konfigurationen, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen optional mutatis mutandis auf diese Verwendung zu. Jede(r) der Zusammensetzungen, Dosierungspläne oder Verabreichungsweisen, die in den Aspekten, Konfigurationen, Beispielen oder Ausgestaltungen hierin beschrieben sind, treffen mutatis mutandis auf diese Verwendung zu.

  • 91. Verwendung eines Antikörpers oder Fragments nach einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99, 101 oder 102 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an einen Menschen zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei dem Menschen, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantat/Wirt-Abstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD.

Die Merkmale der Antikörper und die hOX40L-vermittelte Krankheit nach einem/einer der hierin beschriebenen Aspekte, Konfigurationen, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen optional mutatis mutandis auf diese Verwendung zu. Jede(r) der Zusammensetzungen, Dosierungspläne oder Verabreichungsweisen, die in den Aspekten, Konfigurationen, Beispielen oder Ausgestaltungen hierin beschrieben sind, treffen mutatis mutandis auf diese Verwendung zu.

  • 92. Ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder -zustands, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD, bei einem Menschen, das das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers oder Fragments nach einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99, 101 oder 102 an den genannten Menschen beinhaltet, wobei die/der hOX40L-vermittelte Krankheit oder -zustand damit behandelt oder verhütet wird.

Die Merkmale der Antikörper und die hOX40L-vermittelte Krankheit nach einem/einer der hierin beschriebenen Aspekte, Konfigurationen, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen optional mutatis mutandis auf dieses Verfahren zu. Jede(r) der Zusammensetzungen, Dosierungspläne oder Verabreichungsweisen, die in den Aspekten, Konfigurationen, Beispielen oder Ausgestaltungen hierin beschrieben sind, treffen mutatis mutandis auf dieses Verfahren zu.

  • 93. Der Antikörper oder das Fragment nach Aspekt 90, die Verwendung nach Aspekt 91 oder das Verfahren nach Anspruch 92, wobei die/der hOX40L-vermittelte Krankheit oder Zustand GvHD ist.

In einer anderen Ausgestaltung ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, GvHD zu behandeln oder zu verhüten.

  • 94. Der Antikörper oder das Fragment, die Verwendung oder das Verfahren nach einem der Aspekte 90 bis 93, wobei der Antikörper prophylaktisch verabreicht wird.

In einer Ausgestaltung verhütet die Prophylaxe den Ausbruch der Krankheit oder des Zustands oder der Symptome der Krankheit oder des Zustands. In einer Ausgestaltung verhütet die prophylaktische Behandlung die Verschlimmerung, oder den Ausbruch, der Krankheit oder des Zustands. In einer Ausgestaltung verhütet die prophylaktische Behandlung die Verschlimmerung der Krankheit oder des Zustands.

In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper intravenös verabreicht. In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper in einer Dosis von etwa 5–10 mg/kg (z.B. zu etwa 8 mg/kg) verabreicht. In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper in einer Dosis verabreicht, die ausgewählt ist aus etwa 0,1 mg/kg, etwa 0,5 mg/kg, etwa 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, etwa 10 mg/kg, etwa 15 mg/kg, etwa 20 mg/kg, etwa 25 mg/kg, etwa 30 mg/kg, etwa 40 mg/kg, etwa 50 mg/kg, etwa 60 mg/kg, etwa 70 mg/kg, etwa 80 mg/kg, etwa 90 mg/kg oder etwa 100 mg/kg, insbesondere etwa 1 mg/kg oder etwa 3 mg/kg.

In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper 1–4 Tage vor der Transplantation, z.B. 1-3 Tage vor der Transplantation oder 1–2 Tage vor der Transplantation verabreicht. In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper wöchentlich, zweiwöchentlich oder monatlich nach der Transplantation, z.B. zweiwöchentlich, verabreicht. In einer weiteren Ausgestaltung wird der genannte Antikörper intravenös prophylaktisch 1–3 Tage vor der Transplantation in einer Dosis von etwa 5–10 mg/kg (z.B. etwa 8 mg/kg) und dann intravenös zweiwöchentlich in einer Dosis von etwa 5–10 mg/kg (z.B. etwa 8 mg/kg) verabreicht.

In einer anderen Ausgestaltung wird der Patient nach der Transplantation regelmäßig auf Anwesenheit eines Biomarkers überwacht, der für eine Entstehung von GvHD (z.B. akutve GvHD) prädiktiv ist, und der Anti-OX40L-Antikörper der Erfindung wird verabreicht, sobald die Biomarker-Niveaus derart sind, dass für den Patienten die Gefahr für die Entstehung einer GvHD (z.B. akute GvHD) besteht. Diese Strategie würde eine unnötige Arzneimitteldosierung und eine unnötige Unterdrückung des Immunsystems verhindern. Beispiele für Biomarker, die als prädiktive Biomarker für akute GvHD von Nutzen sind, können die in Levine et al., “A prognostic score for acute graft-versus-host disease based on biomarkers: a multicentre study”, Lancet Haematol 2015; 2: e21–29, angegebenen sein. Zu diesen Biomarkern gehören z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, TNFR1, ST-2, Elafin und IL2Rα und Reg3α.

  • 95. Ein humaner Antikörper oder ein Fragment davon, der/das eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet und von der Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments abgeleitet ist, wobei das humane JH-Gensegment IGHJ6 (z.B. IGHJ6*02) ist, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD (z.B. wobei der Antikörper zur Verhütung von GvHD).

Die Merkmale der Antikörper und die hOX40L-vermittelte Krankheit nach einem/einer der Aspekte, Konfigurationen, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen optional mutatis mutandis auf diese Verwendung zu. Beliebige der Zusammensetzungen, Dosierungspläne oder Verabreichungsweisen, die in den Aspekten, Konfigurationen, Beispielen oder Ausgestaltungen hierin beschrieben sind, treffen mutatis mutandis auf diese Verwendung zu.

  • 96. Verwendung eines humanen Antikörpers oder Fragments davon, der/das eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet und von der Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments abgeleitet ist, wobei das humane JH-Gensegment IGHJ6 (z.B. IGHJ6*02) ist, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung an einen Menschen zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD.

Die Merkmale der Antikörper und die hOX40L-vermittelte Krankheit nach einem/einer der Aspekte, Konfigurationen, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen optional mutatis mutandis auf diese Verwendung zu. Beliebige der Zusammensetzungen, Dosierungspläne oder Verabreichungsweisen, die in den Aspekten, Konfigurationen, Beispielen oder Ausgestaltungen hierin beschrieben sind, treffen mutatis mutandis auf diese Verwendung zu.

  • 97. Ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose oder Atherosklerose, insbesondere GvHD bei einem Menschen, das das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines humanen Antikörpers oder Fragments davon, der/das eine HCDR3 mit 16 bis 27 Aminosäuren beinhaltet und von der Rekombination eines humanen VH-Gensegments, eines humanen D-Gensegments und eines humanen JH-Gensegments abgeleitet ist, wobei das humane JH-Gensegment IGHJ6 (z.B. IGHJ6*02) ist, und der/das sich spezifisch an hOX40L bindet, an einen Menschen beinhaltet, wobei die/der hOX40L-vermittelte Krankheit oder Zustand dadurch behandelt oder verhütet wird.

Die Merkmale der Antikörper und die hOX40L-vermittelte Krankheit nach einem/einer der Aspekte, Konfigurationen, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen optional mutatis mutandis auf dieses Verfahren zu. Die Zusammensetzungen, Dosierungspläne oder Verabreichungsweisen, die in den Aspekten, Konfigurationen, Beispielen oder Ausgestaltungen hierin beschrieben sind, treffen mutatis mutandis auf dieses Verfahren zu.

In einer Ausgestaltung nach einem der Aspekte 95 bis 97 ist das humane JH-Gensegment ausgewählt aus IGHJ6*01, IGHJ6*02, IGHJ6*03 und IGHJ6*04. In einer anderen Ausgestaltung nach einem der Aspekte 95 bis 97 ist das humane JH-Gensegment ausgewählt aus IGHJ6*01, IGHJ6*02 und IGHJ6*04. In einer anderen Ausgestaltung nach einem der Aspekte 95 bis 97 ist das JH-Gensegment IGHJ6*02.

In einer weiteren Ausgestaltung nach einem der Aspekte 95 bis 97 ist das humane VH-Gensegment IGHV3-23, z.B. ausgewählt aus IGHV3-23*01, IGHV3-23*02, IGHV3-23*03, IGHV3-23*04 oder IGHV3-23*05. In einer anderen Ausgestaltung nach einem der Aspekte 95 bis 97 ist das humane VH-Genseqment IGHV3-23*01 oder IGHV3-23*04, insbesondere IGHV3-23*04.

In einer weiteren Ausgestaltung nach einem der Aspekte 95 bis 97 ist das humane DH-Gensegment IGHD3-10, z.B. ausgewählt aus IGHD3-10*01 oder IGHD3-10*02. In einer Ausgestaltung nach einem der Aspekte 95 bis 97 ist das humane DH-Gensegment IGHD3-10*01. In einer Ausgestaltung nach einem der Aspekte 95 bis 97 ist das humane DH-Gensegment IGHD3-10*02.

In einer Ausgestaltung nach einem der Aspekte 90 bis 97 ist der Antikörper in der Lage, GvHD zu behandeln oder zu verhüten. In einer anderen Ausgestaltung nach einem der Aspekte 90 bis 97 wird der Antikörper oder das Fragment zur Behandlung oder Verhütung einer anderen Krankheit als GvD verwendet, allerdings ist der Antikörper oder das Fragment in der Lage, GvHD zu behandeln oder zu verhüten.

  • 98. Der Antikörper oder das Fragment nach Aspekt 86 oder der Antikörper oder das Fragment nach Aspekt 95, die Verwendung nach Aspekt 96 oder das Verfahren nach Aspekt 97, wobei der Antikörper oder das Fragment eine Kappa-Leichtkette beinhaltet, z.B. wobei die VL-Domäne der Leichtkette von der Rekombination eines humanen VL-Gensegments und eines humanen JL-Gensegments abgeleitet ist, wobei das humane VL-Gensegment IGKV1D-39 (z.B. IGKV1D-39*01) ist und das humane JL-Gensegment optional IGKJ1 (z.B. IGKJ1*01) oder IGKJ3 (z.B. IGKJ3*01) ist.

In einer anderen Ausgestaltung ist die VL-Domäne eine Kappa-VL-Domäne. In einer Ausgestaltung ist die Kappa-VL-Domäne von der Rekombination eines humanen VL-Gensegments und eines humanen JL-Gensegments abgeleitet, wobei das humane VL-Gensegment IGKV1D-39 ist. In einer anderen Ausgestaltung ist das VL-Gensegment IGKV1D-39*0.

In einer weiteren Ausgestaltung ist das humane JL-Gensegment IGKJ1. In einer anderen Ausgestaltung ist das JL-Gensegment IGKJ1*01. In einer weiteren Ausgestaltung ist das humane JL-Gensegment IGKJ3. In einer anderen Ausgestaltung ist das JL-Gensegment IGKJ3*01.

  • 99. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 101 oder 102 oder die/das Antikörper- oder Fragmentverwendung oder -verfahren nach einem der Aspekte 90 bis 98, wobei der Antikörper oder das Fragment einen Stammzellenspender-Chimärismus von mehr als 80 % bis zum Tag 12 in einem Rhesusaffen-Modell einer haploidentischen hämatopoetischen Stammzellentransplantation ermöglicht, wobei der Antikörper optional zur Verhütung von GvHD vorgesehen ist.

In einem anderen Aspekt wird ein Antikörper oder Fragment, eine Verwendung oder ein Verfahren nach einem der Aspekte 95 bis 98 bereitgestellt, wobei der Antikörper oder das Fragment zur Behandlung oder Verhütung einer Transplantatabstoßung (z.B. GvHD) bei einem Menschen vorgesehen ist, indem ein Stammzellenspender-Chimärismus von mehr als 80 % bis zum Tag 12 bei dem genannten Menschen nach einer humanen hämatopoetischen Spenderstammzellentransplantation ermöglicht wird.

In einer anderen Ausgestaltung wird ein Antikörper oder Fragment nach einem der Aspekte 73 to 89, 98, 101 oder 102 bereitgestellt, wobei der Antikörper oder das Fragment einen Stammzellenspender-Chimärismus von mehr als 80 % bis zum Tag 12 in einem Rhesusaffen-Modell einer haploidentischen hämatopoetischen Stammzellentransplantation ermöglicht.

In einer Ausgestaltung ist der Chimärismus T-Zell-(CD3+/CD20)-Chimärismus. In einer anderen Ausgestaltung ist der Chimärismus periphärer Blut-Chimärismus. In einer anderen Ausgestaltung ist der Chimärismus peripherer Blut- oder T-Zell-(CD3+/CD20)-Chimärismus.

In einer Ausgestaltung wird der Stammzellenspender-Chimärismus (z.B. der periphere Blut- oder T-Zell-(CD3/CD20)-Chimärismus) mittels divergenter spender- und empfängerspezifischer MHC-verknüpfter Mikrosatelliten-Marker bestimmt, indem Peakhöhen der spender- und empfängerspezifischen Amplikons verglichen werden. In einer anderen Ausgestaltung wird Stammzellenspender-Chimärismus wie in Kean, LS, et al., “Induction of chimerism in rhesus macaques through stem cell transplant and costimulation blockade-based immunosuppression”, Am J Transplant. 2007 Feb; 7(2): 320–35, beschrieben bestimmt. In einer anderen Ausgestaltung wird Zellspender-Chimärismus wie in Beispiel 7 beschrieben bestimmt.

In einer Ausgestaltung werden im Rahmen des Rhesusaffen-Modells der haploidentischen hämatopoetischen Stammzelle die Transplantat-(HSCT)-Empfängertiere einem Konditionierungsverfahren zusammen mit einer Anti-OX40L-Antikörper-Verabreichung unterzogen, gefolgt von einer Infusion eines peripheren Blutprodukts, das von einem Halbgeschwister-Spendertier isoliert wird, woraufhin die Tiere weiterhin wöchentliche Dosen des Anti-OX40L-Antikörpers der Erfindung erhalten und Blutproben genommen und auf Chimärismus analysiert werden.

In einer anderen Ausgestaltung erhalten die Empfängertiere im HSCT-Modell eine Konditionierungsstrahlungsdosis von 1020 cGy in 4 Dosisfraktionen über 2 Tage (Versuchstage –2 und –1), um das hämatopoetische Wirtssystem zu abladieren, bevor eine intravenöse Verabreichung eines erfindungsgemäßen Anti-OX40L-Antikörpers (Tag –2, mit anschließenden intravenösen Dosen an den Tagen 5, 12, 19, 26, 33, 40, 47) und eine Transplantation von mit weißen Blutkörperchen und Stammzellen angereichertem peripherem Blut von einem MHC halbgepaarten (Halbgeschwister) Spendertier erfolgt, um das Immunsystem des Empfängers wiederherzustellen, in Verbindung mit einer fortgesetzten unterstützenden Pflege, Blutprobenentnahme und Überwachung auf GVHD-Anzeichen.

In einer Ausgestaltung ist der Antikörper oder das Fragment, die Verwendung oder das Verfahren zur Verhütung von GvHD vorgesehen.

In einer Ausgestaltung wird der Anti-hOX40L-Antikörper der Erfindung prophylaktisch verabreicht. In einer Ausgestaltung verhindert die prophylaktische Behandlung die Verschlimmerung oder den Ausbruch der Krankheit oder des Zustands.

In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper intravenös verabreicht. In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper in einer Dosis von etwa 5–10 mg/kg (z.B. zu etwa 8 mg/kg) verabreicht. In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper intravenös verabreicht. In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper in einer Dosis von etwa 5-10 mg/kg (z.B. zu etwa 8 mg/kg) verabreicht. In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper in einer Dosis verabreicht, die ausgewählt ist aus etwa 0,1 mg/kg, etwa 0,5 mg/kg, etwa 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, etwa 10 mg/kg, etwa 15 mg/kg, etwa 20 mg/kg, etwa 25 mg/kg, etwa 30 mg/kg, etwa 40 mg/kg, etwa 50 mg/kg, etwa 60 mg/kg, etwa 70 mg/kg, etwa 80 mg/kg, etwa 90 mg/kg und etwa 100 mg/kg, insbesondere etwa 1 mg/kg oder etwa 3 mg/kg.

In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper 1–4 Tage vor der Transplantation verabreicht, z.B. 1–3 Tage vor der Transplantation oder 1–2 Tage vor der Transplantation. In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper wöchentlich, zweiwöchentlich oder monatlich nach der Transplantation, z.B. zweiwöchentlich, verabreicht. In einer weiteren Ausgestaltung wird der genannte Antikörper intravenös prophylaktisch 1–3 Tage vor der Transplantation in einer Dosis von etwa 5–10 mg/kg (z.B. etwa 8 mg/kg) und dann intravenös zweiwöchentlich in einer Dosis von etwa 5–10 mg/kg (z.B. etwa 8 mg/kg) verabreicht.

In einer anderen Ausgestaltung wird der Patient nach der Transplantation regelmäßig auf Anwesenheit eines Biomarkers überwacht, der für eine Entstehung von GvHD (z.B. akutve GvHD) prädiktiv ist, und der Anti-OX40L-Antikörper der Erfindung wird verabreicht, sobald die Biomarker-Niveaus derart sind, dass für den Patienten die Gefahr für die Entstehung einer GvHD (z.B. akute GvHD) besteht. Diese Strategie würde eine unnötige Arzneimitteldosierung und eine unnötige Unterdrückung des Immunsystems verhindern. Beispiele für Biomarker, die als prädiktive Biomarker für akute GvHD von Nutzen sind, können die in Levine et al., “A prognostic score for acute graft-versus-host disease based on biomarkers: a multicentre study”, Lancet Haematol 2015; 2: e21–29, angegebenen sein. Zu diesen Biomarkern gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, TNFR1, ST-2, Elafin und IL2Rα und Reg3α.

In einer weiteren Ausgestaltung wird das HSCT-Modell wie in Miller, Weston P., et al. "GVHD after haploidentical transplantation: a novel, MHC-defined rhesus macaque model identifies CD28 CD8+ T cells as a reservoir of breakthrough T-cell proliferation during costimulation blockade and sirolimus-based immunosuppression." Blood, 116, 24(2010): 5403–5418, beschrieben ausgeführt. In einer weiteren Ausgestaltung wird das HSCT-Modell wie in Beispiel 7 beschrieben ausgeführt.

  • 100. Der Antikörper oder das Fragment, die Verwendung oder das Verfahren nach einem der Aspekte 95 bis 99, wobei der Antikörper wie in einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99, 101 oder 102 definiert ist.
  • 101. Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99 oder 102, oder der Antikörper oder das Fragment, die Verwendung oder das Verfahren nach einem der Aspekte 90 bis 100, wobei der Antikörper oder das Fragment einen stabil transfizierten Pool in Lonza GS-XceedTM auf einem Niveau von mehr als 1,5 g/l in einer Fed-Batch-Überwucherungskultur mit dem Lonza-Zulaufsystem Version 8 mit einem Überwucherungszeitraum von 14 Tagen exprimiert.

In einer Ausgestaltung ist das Expressionsniveau größer als 1,0 g/l, größer als 1,1 g/l, größer als 1,2 g/l, größer als 1,3 g/l oder größer als 1,4 g/l.

  • 102. Ein Antikörper oder Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99 oder 101, oder der Antikörper oder das Fragment, die Verwendung oder das Verfahren nach einem der Aspekte 90 bis 101, wobei der Antikörper oder das Fragment eine naive Population von CD4+ T-Zellen von > 20 % der gesamten CD4+ T-Zellpopulation an Tag 12 in einem Rhesusaffen-Modell einer haploidentischen hämatopoetischen Stammzellentransplantation beibehält.

In einem anderen Aspekt wird ein Antikörper oder Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99 oder 101 oder ein Antikörper oder Fragment, eine Verwendung oder ein Verfahren nach einem der Aspekte 90 bis 101 bereitgestellt, wobei der Antikörper oder das Fragment zur Behandlung oder Verhütung einer Transplantatabstoßung in einem Menschen vorgesehen ist, indem eine naive Population von CD4+ Spender-T-Zellen von > 20 % der gesamten CD4+ T-Zellpopulation an Tag 12 in dem genannten Menschen nach einer humanen hämatopoetischen Spender-Stammzelltransplantation beibehalten wird.

In einer Ausgestaltung ist das HSCT-Modell wie in einer der oben erwogenen Ausgestaltungen beschrieben, z.B. wie im Zusammenhang mit Aspekt 99 beschrieben.

In einer anderen Ausgestaltung wird die naive Population gemessen, indem der relative Anteil spezifischer T-Zell-Phänotypen mit Durchflusszytometrie beurteilt wird, wobei Zell-Subsets durch Markieren mit fluoreszierenden Antikörpersonden identifiziert werden und wobei naive CD4 oder CD8 T-Zellen mit CD4+/CD28+/CD95 bzw. CD8+/CD28+/CD95 markiert sind; zentrale CD4 oder CD8 Speicher-T-Zellen mit CD4+/CD28+/CD95+ bzw. CD8+/CD28+/CD95+ markiert sind und CD4 oder CD8 Effektor-Speicher-T-Zellen mit CD4+/CD28/CD95+ bzw. CD8+/CD28/CD95+ markiert sind.

  • 103. Der Antikörper oder das Fragment, die Verwendung oder das Verfahren nach einem der Aspekte 90 bis 102, das ferner das Verabreichen eines weiteren Therapeutikums an den Menschen beinhaltet, wobei das weitere Therapeutikum optional unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat-Mofetil, Anti-CD28-Antikörpern, Anti-IL12/IL-23-Antikörpern (z.B. Ustekinumab), Anti-CD20-Antikörpern (z.B. Rituximab), Anti-CD30-Antikörpern (z.B. Brentuximab), CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), CCR5-Rezeptor-Antagonisten (z.B. Maraviroc), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-VLA4-Antikörpern (z.B. Natalizumab), Anti-LFA1-Antikörpern, Fludarabin, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Anti-CD45-Antikörpern, Cyclophosphamid, Anti-Thymozyten-Globulinen, Anti-Komplement-C5-Antikörpern (z.B. Eculizumab), Anti-a4b7-Integrin-Antikörpern (z.B. Vedolizumab), Anti-IL6-Antiköpern (z.B. Tocilizumab), Anti-IL2R-Antikörpern (z.B. Basilixumab), Anti-CD25-Antikörpern (z.B. Daclizumab), Anti-TNFa / TNFa-Fc-Molekülen (z.B. Etanercept, Adalimumab, Infliximab, Golimumab oder Certolizumab Pegol) und Vorinostat, insbesondere Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat Mofetil und Anti-CD28-Antikörpern, CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-LFA1-Antikörpern, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Cyclophosphamid und Anti-Thymozyten-Globulinen.

In einer Ausgestaltung ist das weitere Therapeutikum ein entzündungshemmendes Arzneimittel. In einer anderen Ausgestaltung ist das entzündungshemmende Arzneimittel unabhängig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Anti-IL12/IL-23-Antikörpern (z.B. Ustekinumab), Anti-VLA4-Antikörpern (z.B. Natalizumab), Anti-LFA1-Antikörpern, Anti-Komplement-C5-Antikörpern (z.B. Eculizumab), Anti-a4b7-Integrin-Antikörpern (z.B. Vedolizumab), Anti-IL6-Antikörpern (z.B. Tocilizumab), Anti-IL2R-Antikörpern (z.B. Basilixumab) oder Anti-TNFa-Antikörpern/TNFa-Fc-Molekülen (z.B. Etanercept, Adalimumab, Infliximab, Golimumab, Certolizumab Pegol). In einem Beispiel ist das entzündungshemmende Arzneimittel unabhängig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon) und Anti-LFA1-Antikörpern.

  • 104. Der Antikörper oder das Fragment, die Verwendung oder das Verfahren nach Aspekt 103, wobei das weitere Therapeutikum aufeinanderfolgend oder gleichzeitig mit dem Anti-hOX40L-Antikörper oder Fragment verabreicht wird.
  • 105. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Antikörper oder ein Fragment nach einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99, 101 oder 102 und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten, Verdünnungsmittel oder Träger beinhaltet und optional ferner ein weiteres Therapeutikum beinhaltet, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat Mofetil, Anti-CD28-Antikörpern, Anti-IL12/IL-23-Antikörpern (z.B. Ustekinumab), Anti-CD20-Antikörpern (z.B. Rituximab) und Anti-CD30-Antikörpern (z.B. Brentuximab), CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), CCR5-Rezeptor-Antagonisten (z.B. Maraviroc), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-VLA4-Antikörpern (z.B. Natalizumab), Anti-LFA1-Antikörpern, Fludarabin, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Anti-CD45-Antikörpern, Cyclophosphamid, Anti-Thymozyten-Globulinen, Anti-Komplement-C5-Antikörpern (z.B. Eculizumab), Anti-a4b7-Integrin-Antikörpern (z.B. Vedolizumab), Anti-IL6-Antikörpern (z.B. Tocilizumab), Anti-IL2R-Antikörpern (z.B. Basilixumab), Anti-CD25-Antikörpern (z.B. Daclizumab), Anti-TNFa / TNFa-Fc-Molekülen (z.B. Etanercept, Adalimumab, Infliximab, Golimumab oder Certolizumab Pegol) und Vorinostat, insbesondere Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat Mofetil, Anti-CD28-Antikörpern, CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-LFA1-Antikörpern, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Cyclophosphamid und Anti-Thymozyten-Globulinen.

Die hierin beschriebenen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten, Verdünnungsmittel oder Träger treffen mutatis mutandis auf diese Zusammensetzungen zu.

In einer Ausgestaltung ist das weitere Therapeutikum ein entzündungshemmendes Arzneimittel. In einer anderen Ausgestaltung ist das entzündungshemmende Arzneimittel unabhängig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Anti-IL12/IL-23-Antikörpern (z.B. Ustekinumab), Anti-VLA4-Antikörpern (z.B. Natalizumab), Anti-LFA1-Antikörpern, Anti-Komplement-C5-Antikörpern (z.B. Eculizumab), Anti-a4b7-Integrin-Antikörpern (z.B. Vedolizumab), Anti-IL6-Antikörpern (z.B. Tocilizumab), Anti-IL2R-Antikörpern (z.B. Basilixumab) oder Anti-TNFa-Antikörpern/TNFa-Fc-Molekülen (z.B. Etanercept, Adalimumab, Infliximab, Golimumab, Certolizumab Pegol). In einem Beispiel ist das entzündungshemmende Arzneimittel unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon) und Anti-LFA1-Antikörpern ausgewählt.

  • 106. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Aspekt 105 oder ein Kit, der eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Aspekt 106 beinhaltet, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Verhütung eines/einer hOX40L-vermittelten Zustands oder Krankheit vorgesehen ist, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthypersensibilität, multiple Sklerose und Atherosklerose, insbesondere GvHD.

Die hOX40L-vermittelten Krankheiten nach einem der hierin beschriebenen Aspekte, Konfigurationen, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen mutatis mutandis auf diese Kombination zu.

  • 107. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Aspekt 105 oder Aspekt 106 in Kombination mit dem oder Kit nach Aspekt 106 mit einem Etikett oder Anweisungen für den Gebrauch, zur Behandlung und/oder Verhütung der/des genannten Krankheit oder Zustands bei einem Menschen; wobei das Etikett oder die Anweisungen eine Arzneimittelzulassungsnummer (z.B. eine FDA- oder EMA-Zulassungsnummer) beinhaltet/beinhalten; wobei der Kit optional eine IV- oder Injektionsvorrichtung enthält, die den Antikörper oder das Fragment enthält.

Die Etiketten, Anweisungen, hOX40L-vermittelten Krankheiten und Zustände nach einem/einer der hierin beschriebenen Aspekte, Konfigurationen, Beispiele oder Ausgestaltungen treffen optional mutatis mutandis auf diese Kombination zu.

  • 108. Eine Nucleinsäure, die die HCDR3 eines Antikörpers oder Fragments nach einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99, 101 oder 102 kodiert.
  • 109. Eine Nucleinsäure, die eine VH-Domäne und/oder eine VL-Domäne eines Antikörpers oder Fragments nach einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99, 101 oder 102 kodiert.
  • 110. Eine Nucleinsäure nach Aspekt 109, die eine Nucleotidsequenz beinhaltet, die wenigstens 80 % identisch mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 33 und/oder SEQ ID Nr. 47 ist.

In einem Beispiel ist die Nucleotidsequenz wenigstens 85 % identisch, wenigstens 90 % identisch, wenigstens 95 % identisch, wenigstens 96 % identisch, wenigstens 97 % identisch, wenigstens 98 % identisch oder wenigstens 99 % identisch mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 33 und/oder SEQ ID Nr. 47.

  • 111. Eine Nucleinsäure, die eine Schwerkette oder eine Leichtkette eines in einem der Aspekte 73 bis 89, 98, 99, 101 oder 102 aufgeführten Antikörpers kodiert.
  • 112. Ein Vektor, der die Nucleinsäure nach einem der Aspekte 108 bis 111 beinhaltet; wobei der Vektor optional ein CHO- oder HEK293-Vektor ist.
  • 113. Ein Wirt, der die Nucleinsäure nach einem der Aspekte 108 bis 111 oder den Vektor nach Anspruch 112 beinhaltet.

Wie in den Beispielen erläutert, entwickelten die Erfinder eine Reihe von Kriterien, die zum Identifizieren von erfindungsgemäßen Antikörpern und Fragmenten besonders nützlich sind, wobei diese Kriterien wie folgt sind:-

  • (a) die Fähigkeit des Antikörpers oder Fragments zur Bindung von Zelloberflächen-hOX40L auf CHO-S-Zellen (optional transfiziert mit humanem Volllängen-OX40L) und/oder zur Bindung von rekombinantem hOX40L in einem HTRF-Assay;
  • (b) die Fähigkeit des Antikörpers oder Fragments zur Neutralisation von humanem OX40 (z.B. Neutralisation der humanen OX40L-Bindung an humanen OX40-Rezeptor) in einem Rezeptor-Neutralisations-HTRF-Assay und/oder einem Durchflusszytometrie-Rezeptor-Neutralisationsassay; und
  • (c) die Fähigkeit des Antikörpers oder Fragments zu einer spezifischen Bindung von sowohl humanem als auch Rhesusaffen-OX40L (nützlich, damit PK, PD, Wirksamkeit und andere Parameter des Antikörpers oder Fragments in dem Rhesusmodell als Ersatz für Menschen beurteilt werden können).

Folglich erfüllt der Antikörper oder das Fragment in einem Beispiel der Erfindung die Kriterien (a), (b) und (c).

In einem Beispiel ist Kriterium (a) so festgelegt, dass der Antikörper oder das Fragment laut FACS eine Rezeptorbindung von < 70 % an durch CHO-S-Zellen exprimiertes hOX40L aufweist.

In einem Beispiel ist Kriterium (a) so festgelegt, das der Antikörper oder das Fragment im HTRF-Assay eine Rezeptorbindung von < 90 % an OX40L aufweist.

In einem Beispiel ist Kriterium (a) so festgelegt, dass der Antikörper oder das Fragment im HTRF-Assay einen Effekt von wenigstens 20 % aufweist.

In einem Beispiel wird in Kriterium (b) OX40 verwendet.

In einer Ausgestaltung erfolgt die Untersuchung oder das Testen eines Antikörpers oder Fragments der Erfindung bei oder im Wesentlichen bei pH 7 (z.B. für In-vitro-Tests und -Assays) und bei oder im Wesentlichen bei rt.

Optional bindet der Antikörper oder das Fragment spezifisch hOX40L mit einer Affinität (apparente Affinität, Kd) von weniger als 1 microM, 1000 nM bis 100 nM, 100 nM bis 10 nM, 10 nM bis 1 nM, 1000 pM bis 500 pM, 500 pM bis 200 pM, weniger als 200 pM, 200 pM bis 150 pM, 200 pM bis 100 pM, 100 pM bis 10 pM, 10 pM bis 1 pM, z.B. im Bereich von 1 mM bis 1 pM (z.B. 1 mM bis 100 pM; 10 nM bis 100 pM; 1nM bis 10 pM; oder 100 pM bis 1 pM) wie durch SPR bestimmt, z.B. unter den hierin offenbarten SPR-Bedingungen). Zusätzlich oder alternativ bindet der Antikörper oder das Fragment spezifisch Rhesusaffen-OX40L mit einer Affinität (apparente Affinität, Kd) von weniger als 1 microM, 1000 nM bis 100 nM, 100 nM bis 10 nM, 10 nM bis 1 nM, 1000 pM bis 500 pM, 500 pM bis 200 pM, weniger als 200 pM, 200 pM bis 150 pM, 200 pM bis 100 pM, 100 pM bis 10 pM, 10 pM bis 1 pM, z.B. im Bereich von 1 mM bis 1 pM (z.B. 1 mM bis 100 pM; 10 nM bis 100 pM; 1 nM bis 10 pM; oder 100 pM bis 1 pM) wie durch SPR bestimmt, z.B. unter den hierin offenbarten SPR-Bedingungen). Solche Bindungsmessungen können mit einer Reihe von in der Technik bekannten Bindungsassays erfolgen, z.B. mit Oberflächenplasmonresonanz (SPR), wie durch BiacoreTM oder mit ProteOn XPR36TM (Bio-Rad®), mit KinExA® (Sapidyne Instruments, Inc) oder mit ForteBio Octet (Pall ForteBio Corp.).

Die OX40L-Bindungsfähigkeit, -spezifität und -affinität (Kd, Koff und/oder Kon) können mit einem beliebigen in der Technik bekannten Routineverfahren bestimmt werden, z.B. durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR). Der hierin verwendete Begriff “Kd” soll sich auf die Gleichgewichtsdissoziationskonstante einer speziellen Antikörper-Antigen-Interaktion beziehen.

In einer Ausgestaltung findet die Oberflächenplasmonresonanz (SPR) bei 25°C statt. In einer anderen Ausgestaltung findet die SPR bei 37°C statt.

In einer Ausgestaltung findet die SPR bei einem physiologischen pH-Wert wie z.B. etwa pH 7 oder pH 7,6 statt (z.B. mit Hepes-gepufferter Salzlösung bei pH 7,6 (auch HBS-EP genannt)).

In einer Ausgestaltung findet die SPR auf einem physiologischen Salzniveau statt, z.B. 150 mM NaCl.

In einer Ausgestaltung findet die SPR auf einem Detergensniveau von nicht mehr als 0,05 Vol.-% statt, z.B. in Anwesenheit von P20 (Polysorbat 20; z.B. Tween-20TM) mit 0,05 % und EDTA mit 3 mM.

In einem Beispiel findet die SPR bei 25°C oder 37°C in einem Puffer bei pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,05 % Detergens (z.B. P20) und 3 mM EDTA statt. Der Puffer kann 10 mM Hepes enthalten. In einem Beispiel erfolgt die SPR bei 25°C oder 37°C in HBS-EP. HBS-EP ist von Teknova Inc (Kalifornien; Katalognummer H8022) erhältlich.

In einem Beispiel wird die Affinität des Antikörpers oder Fragments mit SPR bestimmt durch:

  • 1. Koppeln von Anti-Maus- (oder anderem relevantem humanem, Ratten- oder nicht humanem Wirbeltier-Antikörper-Konstantregion-Spezies-gepaartem) IgG (z.B. BiacoreTM BR-1008-38) an einem Biosensor-Chip (z.B. GLM-Chip), z.B. durch primäre Aminkopplung;
  • 2. Aussetzen des Anti-Maus-IgG (oder Antikörper einer anderen gepaarten Spezies) einem Test-IgG-Antikörper, um Testantikörper auf dem Chip einzufangen;
  • 3. Führen des Testantigens über die Fangoberfläche des Chips bei 1024 nM, 256 nM, 64 nM, 16 nM, 4 nM mit 0 nM (d.h. nur Puffer); und
  • 4. Bestimmen der Affinität der Bindung des Testantikörpers am Testantigen durch oOberflächenplasmonresonanz, z.B. unter einer oben erörterten SPR-Bedingung (z.B. bei 25 C in physiologischem Puffer). SPR kann mit einer standardmäßigen SPR-Apparatur, z.B. durch BiacoreTM oder mit ProteOn XPR36TM (Bio-Rad®), durchgeführt werden.

Eine Regeneration der Fangoberfläche kann mit 10 mM Glycin bei pH 1,7 erfolgen. Dadurch wird der eingefangene Antikörper entfernt und die Oberfläche kann für eine andere Interaktion verwendet werden. Die Bindungsdaten können an 1:1 modellimmanente Standardmethoden angepasst werden, z.B. mit einem Modell der ProteOn XPR36TM Analysesoftware.

In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment der Erfindung in einem medizinischen Behälter, z.B. Phiole, IV-Behälter oder Injektionsvorrichtung (z.B. eine intraokulare oder intravitreale Injektionsvorrichtung) enthalten. In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment in vitro, z.B. in einem sterilen Behälter. In einem Beispiel stellt die Erfindung einen Kit bereit, der den Antikörper oder das Fragment der Erfindung, Verpackungen und Anweisungen für den Gebrauch zur Behandlung oder Verhütung oder Diagnose einer/eines OX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei einem Menschen enthält. In einem Beispiel geben die Anweisungen an, dass der Mensch mit Bezug auf eine OX40L-Variantensequenz der Erfindung genotypisiert werden soll, bevor der Antikörper oder das Fragment dem Menschen verabreicht wird. In einem Beispiel geben die Anweisungen an, dass der Mensch mit Bezug auf eine OX40L-Variante der Erfindung phänotypisiert werden soll, bevor der Antikörper oder das Fragment dem Menschen verabreicht wird. In einem Beispiel ist der Mensch chinesischer (z.B. Han oder CHS) Ethnizität und die Anweisungen liegen auf Chinesisch (z.B. Mandarin) vor.

In einem Beispiel ist/sind die Bindungsstelle(n) des Antikörpers oder Fragments ausgewählt aus einer Mehrzahl (z.B. Bibliothek) von Bindungsstellen. Beispielsweise beinhaltet oder besteht die Mehrzahl von Bindungsstellen (aus) einer Mehrzahl von 4-kettigen Antikörpern oder Fragmenten davon, z.B. dAbs, Fabs oder scFvs. Geeignete Verfahren zur Herstellung einer Mehrzahl von Bindungsstellen zum Screenen beinhalten Phagen-Display (wobei eine Phagen-Display-Bibliothek von Antikörperbindungsstellen produziert wird), Ribosomen-Display (wobei eine Ribosomen-Display-Bibliothek von Antikörperbindungsstellen produziert wird), Hefe-Display (wobei eine Hefe-Display-Bibliothek von Antikörperbindungsstellen produziert wird) oder Immunisierung eines nicht menschlichen Wirbeltieres (z.B. ein Nagetier, z.B. eine Maus oder Ratte, z.B. VelocimouseTM, KymouseTM, XenomouseTM, Aliva MouseTM, HuMab MouseTM, OmnimouseTM, OmniratTM oder MeMo MouseTM) mit hOX40L oder einem hOX40L-Epitop und Isolation eines Repertoires von antikörperproduzierenden Zellen (z.B. ein B-Zell-, Plasmazell- oder Plasmablasten-Repertoire) und/oder eines Repertoires von isolierten Antikörpern, Fragmenten oder Bindungsstellen.

Der Begriff “Epitop” bezieht sich auf eine Region eines Antigens, das durch einen Antikörper oder ein Fragment gebunden ist. Epitope können als strukturell oder funktionell definiert sein. Funktionelle Epitope sind im Allgemeinen ein Subset der strukturellen Epitope und haben Reste, die direkt zur Affinität der Interaktion beitragen. Epitope können außerdem konformationell sein, d.h. sie sind aus nicht linearen Aminosäuren zusammengesetzt. In bestimmten Ausgestaltungen können Epitope Determinanten enthalten, die chemisch aktive Oberflächengruppierungen von Molekülen wie Aminosäuren, Zuckerseitenketten, Phosphorylgruppen oder Sulfonylgruppen sind, und in bestimmten Ausgestaltungen spezifische dreidimensionale strukturelle Charakteristiken und/oder spezifische Ladungscharakteristiken haben.

Der Begriff “isoliert” bedeutet mit Bezug auf einen Aspekt der Erfindung, z.B. einen Antikörper oder ein Fragment, dass ein gegenständlicher/s Antikörper oder Fragment usw. (1) frei von wenigstens einigen anderen Proteinen ist, mit denen er/es normalerweise zu finden ist, (2) im Wesentlichen frei von anderen Proteinen von derselben Quelle ist, z.B. von derselben Spezies, (3) durch eine Zelle von einer anderen Spezies exprimiert wird, (4) von wenigstens etwa 50 Prozent der Polynucleotide, Lipide, Kohlenhydrate oder anderen Materialien getrennt wurde, mit denen es von Natur aus assoziiert ist, (5) funktionsfähig (durch kovalente oder nicht kovalente Interaktion) mit einem Polypeptid assoziiert ist, mit dem es von Natur aus nicht assoziiert ist, oder (6) nicht von Natur aus vorkommt. Typischerweise stellt ein “isolierter/isoliertes” Antikörper, Fragment usw. wenigstens etwa 5 %, wenigstens etwa 10 %, wenigstens etwa 25 % oder wenigstens etwa 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % oder > 99 % einer bestimmten Probe dar. Genomische DNA, cDNA, mRNA oder andere RNA synthetischen Ursprungs oder eine beliebige Kombination davon kann einen solchen isolierten Antikörper, ein solches isoliertes Fragment usw. kodieren. Vorzugsweise ist der/das isolierte Antikörper, Fragment usw. im Wesentlichen frei von Proteinen oder Polypeptiden oder anderen Kontaminanten, die in seiner natürlichen Umgebung zu finden sind und die seine therapeutische, diagnostische, prophylaktische, forschungsbezogene oder andere Verwendung beeinträchtigen würden.

Zum Beispiel, ein “isolierter” Antikörper ist ein solcher, der von einer Komponente seiner Produktionsumgebung (z.B. natürlich oder rekombinant) identifiziert, getrennt und/oder gewonnen wurde. Vorzugsweise ist das isolierte Polypeptid frei von Assoziationen mit allen anderen Komponenten seiner Produktionsumgebung, so dass der Antikörper z.B. gemäß einem FDA-zugelassenen oder einem zugelassenen Standard isoliert wurde. Kontaminierte Komponenten seiner Produktionsumgebung, wie z.B. solche, die sich aus rekombinanten transfizierten Zellen ergeben, sind Materialien, die typischerweise forschungsbezogene, diagnostische oder therapeutische Verwendungen für den Antikörper stören würden, und sie können Enzyme, Hormone und andere proteinische oder nicht proteinische gelöste Substanzen einschließen. In bevorzugten Ausgestaltungen wird das Polypeptid gereinigt: (1) auf mehr als 95 Gew.-% bezogen auf den Antikörper, wie z.B. mit dem Lowry-Verfahren bestimmt, und in einigen Ausgestaltungen auf mehr als 99 Gew.-%; (2) in einem Maße, das ausreicht, um wenigstens 15 Reste einer N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz mit einem Drehbecher-Sequenzierer zu erhalten, oder (3) auf Homogenität durch SDS-PAGE unter nicht reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen mit Coomassie-Blau oder, vorzugsweise, Silberfärbung. Der isolierte Antikörper beinhaltet den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da wenigstens eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht anwesend ist. Gewöhnlich wird ein isoliertes Polypeptid oder ein isolierter Antikörper jedoch mit wenigstens einem Reinigungsschritt hergestellt.

Immunkonjugate

Die Erfindung schließt den Antikörper oder das Fragment, konjugiert mit einem therapeutischen Anteil (“Immunkonjugat”), wie ein Zytotoxin, ein Chemotherapeutikum, ein Immunosuppressivum oder ein Radioisotop, ein. Zytoxin-Agenzien schließen jedes Agens ein, das für Zellen schädlich ist. Beispiele für geeignete Zytotoxin-Agenzien und Chemotherapeutika zur Bildung von Immunkonjugaten sind in der Technik bekannt, siehe z.B. WO 05/103081, die hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

Bispezifika

Die erfindungsgemäßen Antikörper und Fragmente können monospezifisch, bispezifisch oder multispezifisch sein. Multispezifische mAbs können für verschiedene Epitope von einem Zielpolypeptid spezifisch sein oder können Antigenbindungsdomänen enthalten, die für mehr als ein Zielpolypeptid spezifisch sind (siehe z.B. Tutt et al., (1991) J. Immunol. 147: 60–69). Die humanen Anti-hOX40L-Antikörper oder Fragmente können mit einem anderen funktionellen Molekül, z.B. einem anderen Peptid oder Protein, verknüpft oder co-exprimiert sein. Ein Antikörper oder Fragment davon kann z.B. mit einem oder mehreren anderen molekularen Entitäten, z.B. einem anderen Antikörper oder Antikörperfragment, funktionell verknüpft sein (z.B. durch chemische Kopplung, genetische Fusion, nicht kovalente Assoziation oder anderweitig), um einen bispezifischen oder multispezifischen Antikörper mit einer zweiten Bindungsspezifität zu produzieren.

Ein exemplarisches bispezifisches Antikörperformat, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt die Verwendung einer ersten Immunoglobulin-(Ig)-CH3-Domäne und einer zweiten Ig-CH3-Domäne ein, wobei sich die erste und die zweite Ig-CH3-Domäne voneinander um wenigstens eine Aminosäure unterscheiden und wobei wenigstens eine Aminosäuredifferenz die Bindung des bispezifischen Antikörpers an Protein A im Vergleich zu einem bispezifischen Antikörper, dem die Aminosäuredifferenz fehlt, verringert. In einer Ausgestaltung bindet die erste Ig-CH3-Domäne Protein A und die zweite Ig-CH3-Domäne enthält eine Mutation, die die Protein-A-Bindung verringert oder beseitigt, wie z.B. eine H95R-Modifikation (nach IMGT-Exon-Nummerierung; H435R nach EU-Nummerierung). Die zweite CH3 kann ferner eine Y96F-Modifikation (nach IMGT; Y436F nach EU) enthalten. Weitere Modifikationen, die innerhalb der zweiten CH3 zu finden sind, schließen die folgenden ein: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M und V821 (nach IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M und V422I nach EU) im Falle von IgG1-Antikörpern; N44S, K52N und V82I (IMGT; N384S, K392N und V422I nach EU) im Falle von IgG2-Antikörpern; und Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q und V82I (nach IMGT; Q355R, N3845, K392N, V397M, R409K, E419Q und V422I nach EU) im Falle von IgG4-Antikörpern. Variationen bzgl. des oben beschriebenen bispezifischen Antikörperformats sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung denkbar.

In bestimmten Ausgestaltungen beinhaltet der Antikörper oder das OX40L bindende Fragment davon weniger als sechs CDRs. In einigen Ausgestaltungen beinhaltet oder besteht der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon (aus) eine(r), zwei, drei, vier oder fünf CDRs, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 und LCDR3. In spezifischen Ausgestaltungen beinhaltet oder besteht der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon (aus) eine(r), zwei, drei, vier oder fünf CDRs, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den HCDR1-, HCDR2-, HCDR3-, LCDR1-, LCDR2- und LCDR3-Sequenzen in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 36, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 68, Seq ID Nr. 74, Seq ID Nr. 96 oder Seq ID Nr. 102, insbesondere Seq ID Nr. 36 oder Seq ID Nr. 42 für HCDR1; Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 38, Seq ID Nr. 44, Seq ID Nr. 70, Seq ID Nr. 76, Seq ID Nr. 98 oder Seq ID Nr.104, insbesondere Seq ID Nr. 38 oder Seq ID Nr.44 für HCDR2; Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 40, Seq ID Nr. 46, Seq ID Nr. 72, Seq ID Nr. 78, Seq ID Nr. 100 oder Seq ID Nr. 106, insbesondere Seq ID Nr. 40 oder Seq ID Nr. 46 für HCDR3; Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 50, Seq ID Nr. 56, Seq ID Nr. 82, Seq ID Nr. 88, Seq ID Nr. 110 oder Seq ID Nr. 116, insbesondere Seq ID Nr. 50 oder Seq ID Nr. 56 für LCDR1; Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 26, Seq ID Nr. 52, Seq ID Nr. 58, Seq ID Nr. 84, Seq ID Nr. 90, Seq ID Nr. 112 oder Seq ID Nr. 118, insbesondere Seq ID Nr. 52 oder Seq ID Nr. 58 für LCDR2; und Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 28, Seq ID Nr. 54, Seq ID Nr. 60, Seq ID Nr. 86, Seq ID Nr. 92, Seq ID Nr. 114 oder Seq ID Nr. 120, insbesondere Seq ID Nr. 54 oder Seq ID Nr. 60 für LCDR3).

In spezifischen Ausgestaltungen ist ein erfindungsgemäßer Antikörper ein völlig humaner Antikörper, ein monoklonaler Antikörper, ein rekombinanter Antikörper, ein antagonistischer Antikörper, ein hOX40L neutralisierender Antikörper oder eine beliebige Kombination davon oder die Erfindung stellt ein hOX40L bindendes Fragment davon bereit. In einem Beispiel ist der Antikörper ein chimärer Antikörper, der humane variable Domänen und nicht humane (z.B. Maus oder Ratte oder Kaninchen) konstante Domänen beinhaltet. In besonderen Ausgestaltungen ist der Antikörper ein völlig humaner Antikörper, wie z.B. ein völlig humaner monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, der/das sich spezifisch an hOX40L bindet. In bevorzugten Ausgestaltungen ist der Antikörper ein antagonistischer Antikörper. In bevorzugten Ausgestaltungen ist der Antikörper ein neutralisierender Antikörper.

In einem Beispiel ist der Antikörper oder das Fragment ein Lambda-Antikörper oder -Fragment (d.h. dessen variable Domänen variable Lambda-Domänen sind). Optional beinhaltet der Antikörper oder das Fragment auch konstante Lambda-Domänen.

In bestimmten Ausgestaltungen konkurriert der Antikörper (z.B. in einer dosisabhängigen Weise) mit OX40 oder einem Fusionsprotein davon (z.B. Fc: OX40) für eine Bindung an hOX40L, z.B. ein Zelloberflächen-exprimiertes hOX40L oder lösliches hOX40L. Beispielhafte kompetitive Blockierungstests werden in den Beispielen hierin bereitgestellt.

In einem anderen Aspekt werden hierin isolierte Nucleinsäuren bereitgestellt, die Antikörper kodieren, die sich spezifisch an ein hOX40L-Polypeptid (z.B. ein Zelloberflächen-exprimiertes oder lösliches hOX40L), ein hOX40L-Polypeptidfragment oder ein hOX40L-Epitop binden. In bestimmten Ausgestaltungen kodiert die Nucleinsäure eine VH-Kette, VL-Kette, VH-Domäne, VL-Domäne, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 und LCDR3 wie in der Sequenzauflistung offenbart (d.h. Seq ID Nr. 30 oder Seq ID Nr.62 für VH-Ketten; Seq ID Nr. 32 oder Seq ID Nr. 64 für VL-Ketten; Seq ID Nr. Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 34, Seq ID Nr. 66 oder Seq ID Nr. 94, insbesondere Seq ID Nr. 34 für VH-Domänen; Seq ID Nr. 16, Seq ID Nr. 48, Seq ID Nr. 80 oder Seq ID Nr. 108, insbesondere Seq ID Nr. 48 für VL-Domänen; Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 36, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 68, Seq ID Nr. 74, Seq ID Nr. 96 oder Seq ID Nr. 102, insbesondere Seq ID Nr. 36 oder Seq ID Nr. 42 für HCDR1; Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 38, Seq ID Nr. 44, Seq ID Nr. 70, Seq ID Nr. 76, Seq ID Nr. 98 oder Seq ID Nr. 104, insbesondere Seq ID Nr. 38 oder Seq ID Nr.44 für HCDR2; Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 40, Seq ID Nr. 46, Seq ID Nr. 72, Seq ID Nr. 78, Seq ID Nr. 100 oder Seq ID Nr. 106, insbesondere Seq ID Nr. 40 oder Seq ID Nr. 46 für HCDR3; Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 50, Seq ID Nr. 56, Seq ID Nr. 82, Seq ID Nr. 88, Seq ID Nr. 110 oder Seq ID Nr. 116, insbesondere Seq ID Nr. 50 oder Seq ID Nr. 56 für LCDR1; Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 26, Seq ID Nr. 52, Seq ID Nr. 58, Seq ID Nr. 84, Seq ID Nr. 90, Seq ID Nr. 112 oder Seq ID Nr. 118, insbesondere Seq ID Nr. 52 oder Seq ID Nr.58 für LCDR2; and Seq ID Nr.22, Seq ID Nr. 28, Seq ID Nr. 54, Seq ID Nr. 60, Seq ID Nr. 86, Seq ID Nr. 92, Seq ID Nr. 114 oder Seq ID Nr. 120, insbesondere Seq ID Nr. 54 oder Seq ID Nr. 60 für LCDR3).

In einem anderen Aspekt werden hierin Vektoren und Wirtszellen bereitgestellt, die Nucleinsäuren beinhalten, die Antikörper oder Fragmente der Erfindung kodieren.

In bestimmten Ausgestaltungen bindet sich der Antikörper spezifisch an eine oder mehrere Einzelnucleotid-Polymorphismus-(SNP)-Varianten von hOX40L. In einer Ausgestaltung nach einem Aspekt der Erfindung ist der hOX40L ein Trimer von Monomeren.

In einem Aspekt wird hierin ein Verfahren zum Verringern (z.B. um wenigstens 20, 30, 40, 50 oder 60 % oder 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder > 90%) oder vollständigen Inhibieren einer Bindung von hOX40L an OX40 bei einem Subjekt (z.B. einem menschlichen Subjekt) bereitgestellt, das das Verabreichen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments davon an das Subjekt beinhaltet, der/das sich spezifisch an hOX40L (z.B. ein Zelloberflächen-exprimierter oder löslicher hOX40L) bindet.

In einem Aspekt wird hierin ein Verfahren zur Behandlung oder Verhütung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands bei einem Subjekt (z.B. einem menschlichen Subjekt) bereitgestellt, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments davon an das Subjekt beinhaltet, der/das sich spezifisch an hOX40L (z.B. Zelloberflächen-exprimiertes oder lösliches hOX40L) bindet, wobei die Krankheit oder der Zustand mit dem Antikörper oder Fragment behandelt oder verhütet wird. In einem Beispiel beinhaltet das Verfahren das Verringern oder Inhibieren einer biologischen hOX40L-Aktivität, wie z.B. der Sekretion von einem, mehreren oder allen der Folgenden: IL-2, IL-8, TNF-alpha und Interferon-gamma, bei dem Subjekt. In einem Beispiel ist die biologische Aktivität ausgewählt aus der Sekretion von einem, mehreren oder allen der Folgenden: IL-2, TNF-alpha und Interferon-gamma. In einem Beispiel ist die biologische Aktivität ausgewählt aus der Sekretion von einem, mehreren oder allen der Folgenden: IL-8, CCL20 und RANTES.

In einem Aspekt wird hierin ein Verfahren zum Verringern oder Inhibieren einer biologischen hOX40L-Aktivität, z.B. der Sekretion von einem, mehreren oder allen der Folgenden: IL-2, IL-8, TNF-alpha und Interferon-gamma, bei einem (z.B. ein menschliches Subjekt) bereitgestellt, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments davon, der sich spezifisch an hOX40L (z.B. ein Zelloberflächen-exprimiertes oder lösliches hOX40L) bindet, an das Subjekt beinhaltet, wobei die biologische hOX40L-Aktivität durch den Antikörper oder das Fragment verringert wird. In einem Beispiel ist die biologische Aktivität ausgewählt aus der Sekretion von einem, mehreren oder allen der Folgenden: IL-2, TNF-alpha und Interferon-gamma. In einem Beispiel ist die biologische Aktivität aus der Sekretion von einem, mehreren oder allen der Folgenden ausgewählt: IL-8, CCL20 und RANTES.

Das Wort “etwa” oder “zirka” bedeutet innerhalb von 20 %, vorzugsweise innerhalb von 10 % und bevorzugter innerhalb von 10 % und bevorzugter innerhalb von 5 % (oder 4 % oder 3 % oder 2 % oder, in einem Beispiel, 1 % oder weniger) eines bestimmten Werts oder Bereichs.

Das hierin verwendete Wort “verabreichen” oder “Verabreichung” bezieht sich auf die Handlung des Injizierens oder anderweitigen physikalischen Zuführens einer Substanz, so wie sie außerhalb des Körpers vorliegt (z.B. ein hierin bereitgestellter Anti-hOX40L-Antikörper), in einen Patienten, z.B. durch mukosale, intradermale, intravenöse, intramuskuläre Zuführung und/oder einem beliebigen anderen Verfahren der physikalischen Zuführung, das hierin beschrieben oder in der Technik bekannt ist. Wenn eine Krankheit oder ein Symptom davon behandelt wird, dann erfolgt die Verabreichung der Substanz typischerweise nach dem Ausbruch der Krankheit oder der Symptome davon. Wenn eine Krankheit oder Symptome davon verhütet wird/werden, dann erfolgt die Verabreichung der Substanz typischerweise vor dem Ausbruch der Krankheit oder der Symptome davon.

Zum Bestimmen der prozentualen Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder zwei Nucleinsäuresequenzen werden die Sequenzen für einen optimalen Vergleich abgeglichen (z.B. können Lücken in die Sequenz einer ersten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz für einen optimalen Abgleich mit einer zweiten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz eingebracht werden). Dann werden die Aminosäurereste oder Nucleotide an entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nucleotidpositionen verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz durch den/das gleiche(n) Aminosäurerest oder Nucleotid wie die entsprechende Position in der zweiten Sequenz belegt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen den zwei Sequenzen ist von der Anzahl identischer Positionen abhängig, die die Sequenzen gemeinsam haben (d.h. % Identität = Anzahl identischer überlappender Positionen/Gesamtzahl von Positionen × 100 %). In einer Ausgestaltung haben die beiden Sequenzen die gleiche Länge.

Die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen (z.B. Aminosäuresequenzen oder Nucleinsäuresequenzen) kann auch mit einem mathematischen Algorithmus erreicht werden. Ein bevorzugtes nicht begrenzendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von zwei Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264 2268, modifiziert wie in Karlin und Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873 5877. Ein solcher Algorithmus ist in den NBLAST- und XBLAST-Programmen von Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403 integriert. BLAST-Nucleotid-Suchen können durchgeführt werden, mit den NBLAST-Nucleotid-Programmparametern auf z.B. Score = 100, Wortlänge = 12 eingestellt, um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die mit einem Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung homolog sind. BLAST-Protein-Suchen können durchgeführt werden, mit den XBLAST-Programmparametern auf z.B. Score 50, Wortlänge = 3 eingestellt, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die mit einem Proteinmolekül der vorliegenden Erfindung homolog sind. Für mit Lücken versehene Abgleiche für Vergleichszwecke kann Gapped BLAST wie in Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389 3402 beschrieben verwendet werden. Alternativ kann PSI BLAST für eine iterative Suche verwendet werden, die entfernte Beziehungen zwischen Molekülen detektiert (Id.). Bei der Verwendung der BLAST-, Gapped BLAST- und PSI Blast-Programme können die Vorgabeparameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden (siehe z.B. National Center for Biotechnology Information (NCBI) im Internet, ncbi.nlm.nih.gov). Ein weiteres bevorzugtes nicht begrenzendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller, 1988, CABIOS 4: 11 17. Ein solcher Algorithmus ist im ALIGN-Programm (Version 2.0) integriert, das Teil des GCG-Sequenzabgleich-Softwarepakets ist. Bei der Verwendung des ALIGN-Programms für den Vergleich von Aminosäuresequenzen kann eine PAM120 Gewichtungsrest-Tabelle, eine Gap-Längen-Penalty (Strafe) von 12 und eine Gap-Penalty von 4 verwendet werden.

Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen kann mit Methoden bestimmt werden, die den oben beschriebenen ähnlich sind, mit oder ohne Zulassung von Gaps. Beim Berechnen der prozentualen Identität werden typischerweise nur exakte Übereinstimmungen (Matches) gezählt.

Die hierin verwendeten Begriffe “Antagonist” oder “Inhibitor” von hOX40L beziehen sich auf einen Liganden (z.B. Antikörper oder Fragment), der in der Lage ist, eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten von hOX40L, z.B. in einer hOX40L exprimierenden Zelle oder in einer einen hOX40L-Liganden exprimierenden Zelle, zu inhibieren oder anderweitig zu verringern. In bestimmten Ausgestaltungen sind erfindungsgemäße Antikörper z.B. antagonistische Antikörper, die die Sekretion von CCL20, IL-8 und/oder RANTES aus einer Zelle mit einem Zelloberflächen-exprimierten OX40 inhibieren oder anderweitig verringern, wenn der genannte Antikörper mit der genannten Zelle in Kontakt gebracht wird. In einigen Ausgestaltungen kann ein Antagonist von hOX40L (z.B. ein erfindungsgemäßer antagonistischer Antikörper) z.B. durch Inhibieren oder anderweitiges Verringern der Aktivierung und/oder Zellsignalisierungspfade der OX40L exprimierenden Zelle wirken, so dass eine hOX40L-vermittelte biologische Aktivität der Zelle relativ zur hOX40L-vermittelten biologischen Aktivität ohne Antagonist ist. In bestimmten Ausgestaltungen sind die hierin bereitgestellten Antikörper völlig humane, antagonistische Anti-hOX40L-Antikörper, vorzugsweise völlig humane, monoklonale, antagonistische Anti-hOX40L-Antikörper.

Die Begriffe “Antikörper” und “Immunglobulin” oder “Ig” können hierin untereinander austauschbar verwendet werden. Ein Antikörper oder ein Fragment davon, der/das sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen bindet, kann mit verwandten Antigenen kreuzreaktiv sein. Vorzugsweise tritt ein Antikörper oder ein Fragment davon, der/das sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen bindet, nicht in Kreuzreaktion mit anderen Antigenen (sondern kann optional mit OX40L einer anderen Spezies, z.B. Rhesusaffe oder Maus, in Kreuzreaktion treten). Ein Antikörper oder ein Fragment davon, der/das sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen bindet, kann beispielsweise durch Immunoassays, BIAcoreTM oder andere der Fachperson bekannte Methoden identifiziert werden. Ein Antikörper oder ein Fragment davon bindet sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen, wenn er/es sich an ein hOX40L- Antigen mit höherer Affinität bindet als an irgendein kreuzreaktives Antigen, wie mit Versuchsmethoden wie Radioimmunoassays (RIA) und enzymgekoppelten Immunadsorptionsassays (ELISAs) bestimmt. Typischerweise beinhaltet eine spezifische oder selektive Reaktion wenigstens ein zweifaches Hintergrundsignal oder -geräusch oder noch typischer mehr als 10fachen Hintergrund (siehe z.B. Paul, Hrsg., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York auf den Seiten 332–336 für eine Erörterung bzgl. der Antikörperspezifität).

Zu erfindungsgemäßen Antikörpern gehören z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, synthetische Antikörper, monoklonale Antikörper, rekombinant produzierte Antikörper, multispezifische Antikörper (inkl. bispezifischer Antikörper), humane Antikörper, humanisierte Antikörper, chimäre Antikörper, Intrakörper, einkettige Fvs (scFv) (z.B. inkl. monospezifisch, bispezifisch usw.), kamelisierte Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab′)-Fragmente, disulfidverknüpfte Fvs (sdFv), anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper und Epitopbindungsfragmente von beliebigen der obigen. Insbesondere schließen erfindungsgemäße Antikörper Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Abschnitte von Immunglobulinmolekülen ein, d.h. Antigenbindungsdomänen oder Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen bindet (z.B. eine oder mehrere Komplementarität bestimmende Regionen (CDRs) eines Anti-hOX40L-Antikörpers). Die erfindungsgemäßen Antikörper können von einem beliebigen Typ (z.B. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA und IgY), einer beliebigen Klasse (z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und IgA2, insbesondere IgG4) oder einer beliebigen Unterklasse (z.B. IgG2a und IgG2b) eines Immunglobulinmoleküls sein. In bevorzugten Ausgestaltungen sind die hOX40L-Antikörper völlig human, z.B. völlig humane monoklonale hOX40L-Antikörper. In bestimmten Ausgestaltungen sind erfindungsgemäße Antikörper IgG-Antikörper oder eine Klasse (z.B. humanes IgG1 oder IgG4) oder eine Subklasse davon. In bestimmten Ausgestaltungen beinhalten die erfindungsgemäßen Antikörper eine humane konstante Gamma-4-Region. In einer anderen Ausgestaltung bindet die konstante Region der Schwerkette Fc-γ-Rezeptoren nicht und beinhaltet z.B. eine Leu235Glu-Mutation. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet die konstante Region der Schwerkette eine Ser228Pro-Mutation zum Erhöhen der Stabilität. In einer anderen Ausgestaltung ist die konstante Region der Schwerkette IgG4-PE.

Die Begriffe “Antigenbindungsdomäne”, “Antigenbindungsregion”, “Antigenbindungsfragment” und ähnliche Begriffe beziehen sich auf den Abschnitt eines Antikörpers, der die Aminosäurereste beinhaltet, die mit einem Antigen interagieren und dem Bindungsmittel ihre Spezifität für das und Affinität zu dem Antigen (z.B. die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs)) übertragen. Die Antigenbindungsregion kann von einer beliebigen Tierspezies abgeleitet sein, wie Nagetiere (z.B. Kaninchen, Ratte oder Hamster) und Menschen. Vorzugsweise ist die Antigenbindungsregion menschlichen Ursprungs.

Der hierin verwendete Begriff “Zusammensetzung” soll ein Produkt einschließen, das die angegebenen Inhaltsstoffe (z.B. ein erfindungsgemäßer Antikörper) in, optional, den angegebenen Mengen sowie jegliche Produkte enthält, die sich, direkt oder indirekt, aus der Kombination der angegebenen Inhaltsstoffe in, optional, den angegebenen Mengen ergeben.

In Zusammenhang mit einem Polypeptid bezieht sich der hierin verwendete Begriff “Derivat” auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz eines hOX40L-Polypeptids, ein Fragment eines hOX40L-Polypeptids oder einen Antikörper beinhaltet, der sich spezifisch an ein hOX40L-Polypeptid bindet, das durch Einführen von Aminosäurerestsubstitutionen, -deletionen oder -additionen verändert wurde. Der hierin verwendete Begriff „Derivat“ bezieht sich auch auf ein hOX40L-Polypeptid, ein Fragment eines hOX40L-Polypeptids oder einen Antikörper, der sich spezifisch an ein hOX40L-Polypeptid bindet, das chemisch modifiziert wurde, z.B. durch kovalentes Anbringen eines beliebigen Molekültyps am Polypeptid. Beispielsweise, aber ohne Begrenzung, kann ein hOX40L-Polypeptid, ein Fragment eines hOX40L-Polypeptids oder ein hOX40L-Antikörper z.B. durch Glykosylierung, Acetylierung, Pegylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisierung durch bekannte Schutz-/Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung, Verknüpfung mit einem zellulären Liganden oder einem andere Protein usw. chemisch modifiziert werden. Die Derivate werden in einer Weise modifiziert, die sich von natürlich vorkommenden oder Ausgangs-Peptiden oder Polypeptiden unterscheidet, und zwar entweder bezüglich des Typs oder der Lage der angefügten Moleküle. Derivate beinhalten ferner eine Deletion von einer oder mehreren chemischen Gruppen, die auf dem Peptid oder Polypeptid natürlich vorliegen. Ein Derivat eines hOX40L-Polypeptids, eines Fragments eines hOX40L-Polypeptids oder eines hOX40L-Antikörpers kann durch chemische Modifikationen mit der Fachperson bekannten Methoden chemisch modifiziert werden, wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, spezifische chemische Spaltung, Acetylierung, Formulierung, metabolische Synthese von Tunicamycin usw. Ferner kann ein Derivat eines hOX40L-Polypeptids, ein Fragment eines hOX40L-Polypeptids oder ein hOX40L-Antikörper eine oder mehrere nicht klassische Aminosäuren enthalten. Ein Polypeptidderivat weist ähnliche oder identischen Funktionen wie ein hierin beschriebenes/r hOX40L-Polypeptid, ein Fragment eines hOX40L-Polypeptids oder ein hOX40L-Antikörper auf.

Der hierin verwendete Begriff “wirksame Menge” bezieht sich auf die Menge einer Therapie (z.B. eines/einer hierin bereitgestellten Antikörpers oder pharmazeutischen Zusammensetzung), die ausreicht, um die Schwere und/oder Dauer einer bestimmten Krankheit und/oder eines damit verbundenen Symptoms zu verringern und/oder zu lindern. Dieser Begriff schließt außerdem eine Menge ein, die zum Verringern oder Bessern des Fortschritts oder Verlaufs einer bestimmten Krankheit, Verringerung oder Besserung der Rückkehr, Entwicklung oder des Ausbruchs einer bestimmten Krankheit und/oder zum Verbessern oder Erhöhen des/der prophylaktischen oder therapeutischen Wirkung(en) einer anderen Therapie (z.B. eine andere Therapie als der hierin bereitgestellte Anti-hOX40L-Antikörper) notwendig ist. In einigen Ausgestaltungen liegt die wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Antikörpers bei etwa 0,1 mg/kg (mg Antikörper pro kg Gewicht des Subjekts) bis etwa 100 mg/kg. In bestimmten Ausgestaltungen liegt eine wirksame Menge eines hierin bereitgestellten Antikörpers bei etwa 0,1 mg/kg, etwa 0,5 mg/kg, etwa 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, etwa 10 mg/kg, etwa 15 mg/kg, etwa 20 mg/kg, etwa 25 mg/kg, etwa 30 mg/kg, etwa 35 mg/kg, etwa 40 mg/kg, etwa 45 mg/kg, etwa 50 mg/kg, etwa 60 mg/kg, etwa 70 mg/kg, etwa 80 mg/kg, etwa 90 mg/kg oder etwa 100 mg/kg (oder einem Bereich darin). In einigen Ausgestaltungen bezieht sich der hierin verwendete Begriff “wirksame Menge” auch auf die Menge eines erfindungsgemäßen Antikörpers, um ein angegebenes Ergebnis zu erreichen (z.B. Inhibition einer biologischen hOX40L-Aktivität einer Zelle, wie z.B. Inhibition der Sekretion von CCL20, IL-8 oder RANTES oder INF-γ, TNF-α oder IL-2, insbesondere INF-γ, aus der Zelle).

Der hierin verwendete Begriff “Epitop” bezieht sich auf eine lokalisierte Region auf der Oberfläche eines Antigens, wie hOX40L-Polypeptid oder hOX40L-Polypeptidfragment, die an eine oder mehrere Antigenbindungsregionen eines Antikörpers gebunden werden kann und die eine antigene oder immunogene Aktivität in einem Tier, vorzugsweise einem Säugetier, und am meisten bevorzugt in einem Menschen, hat, die eine Immunreaktion hervorrufen kann. Ein Epitop mit einer immunogenen Aktivität ist ein Abschnitt eines Polypeptids, der eine Antikörperreaktion in einem Tier hervorruft. Ein Epitop mit einer antigenen Aktivität ist ein Abschnitt eines Polypeptids, an den sich ein Antikörper spezifisch bindet, wie durch ein beliebiges in der Technik gut bekanntes Verfahren, z.B. durch die hierin beschriebenen Immunosassays, bestimmt. Antigene Epitope müssen nicht zwangsläufig immunogen sein. Epitope bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und haben spezifische dreidimensionale strukturelle Charakteristiken sowie spezifische Ladungscharakteristiken. Eine Region eines Polypeptids, die zu einem Epitop beiträgt, können zusammenhängende Aminosäuren des Polypeptids sein, oder das Epitop kann aus zwei oder mehreren nicht zusammenhängenden Regionen des Polypeptids zusammengesetzt sein. Das Epitop kann ein dreidimensionales Oberflächenmerkmal des Antigens sein oder nicht. In bestimmten Ausgestaltungen ist ein hOX40L-Epitop ein dreidimensionales Oberflächenmerkmal eines hOX40L-Polypeptids (z.B. in trimerer Form eines hOX40L-Polypeptids). In anderen Ausgestaltungen ist ein hOX40L-Epitop ein lineares Merkmal eines hOX40L-Polypeptids (z.B. in trimerer Form oder monomerer Form des hOX40L-Polypeptids). Hierin bereitgestellte Antikörper können sich spezifisch an ein Epitop der monomeren (denaturierten) Form von hOX40L, ein Epitop der trimeren (nativen) Form von hOX40L oder sowohl der monomeren (denaturierten) Form als auch der trimeren (nativen) Form von hOX40L binden. In spezifischen Ausgestaltungen binden sich die hierin bereitgestellten Antikörper an ein Epitop der trimeren Form von hOX40L, binden sich aber nicht spezifisch an die monomere Form von hOX40L.

Der hierin verwendete Begriff “Exzipienten” bezieht sich auf inerte Substanzen, die gewöhnlich als Verdünnungsmittel, Vehikel, Konservierungsmittel, Bindemittel oder Stabilisierungsmittel für Arzneimittel verwendet werden, und beinhaltet z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Proteine (z.B. Serumalbumin usw.), Aminosäuren (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Glycin, Histidin usw.), Fettsäuren und Phospholipide (z.B. Alkylsulfonate, Caprylat usw.), Tenside (z.B. SDS, Polysorbat, nichtionisches Tensid usw.), Saccharide (z.B. Saccharose, Maltose, Trehalose usw.) und Polyole (z.B. Mannitol, Sorbitol usw.) (siehe auch Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa., das hiermit in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist).

In Zusammenhang mit einem Peptid oder Polypeptid bezieht sich der hierin verwendete Begriff „Fragment“ auf ein Peptid oder Polypeptid, das weniger als die Volllängen-Aminosäuresequenz beinhaltet. Ein solches Fragment kann z.B. aus einer Verkürzung am Aminoterminus, einer Verkürzung am Carboxyterminus und/oder einer internen Deletion von (einem) Rest(en) von der Aminosäuresequenz entstehen. Fragmente können sich z.B. aus einer alternativen RNA-Spleißung oder aus einer In-vivo-Proteaseaktivität ergeben. In bestimmten Ausgestaltungen schließen hOX40L-Fragmente Polypeptide ein, die eine Aminosäuresequenz von wenigstens 5 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 10 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 15 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 20 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 25 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 40 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 50 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 60 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 70 zusammenhängenden Aminosäurereste, wenigstens 80 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 90 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 100 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 125 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 150 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 175 zusammenhängenden Aminosäureresten, wenigstens 200 zusammenhängenden Aminosäureresten oder wenigstens 250 zusammenhängenden Aminosäureresten der Aminosäuresequenz eines hOX40L-Polypeptids oder eines Antikörpers beinhalten, der sich spezifisch an ein hOX40L-Polypeptid bindet. In einer spezifischen Ausgestaltung behält ein Fragment eines hOX40L-Polypeptids oder eines Antikörpers, der sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen bindet, wenigstens 1, wenigstens 2 oder wenigstens 3 Funktionen des Polypeptids oder Antikörpers bei.

Die Begriffe “völlig humaner Antikörper” oder “humaner Antikörper” werden hierin untereinander austauschbar verwendet und beziehen sich auf einen Antikörper, der eine humane variable Region und am bevorzugtesten eine humane konstante Region beinhaltet. In spezifischen Ausgestaltungen bezieht sich der Begriff auf einen Antikörper, der eine variable Region und eine konstante Region humanen Ursprungs beinhaltet. “Völlig humane” Anti-hOX40L-Antikörper können in bestimmten Ausgestaltungen auch Antikörper einschließen, die hOX40L-Polypeptide binden und durch Nucleinsäuresequenzen kodiert sind, die natürlich vorkommende somatische Varianten einer humanen Keimbahn-Immunglobulin-Nucleinsäuresequenz sind. In einer spezifischen Ausgestaltung sind die hierin bereitgestellten Anti-hOX40L-Antikörper völlig humane Antikörper. Der Begriff “völlig humaner Antikörper” beinhaltet Antikörper mit variablen und konstanten Regionen, die humanen Keimbahn-Immunglobulinsequenzen wie von Kabat et al. beschrieben entsprechen (siehe Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fünfte Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication Nr. 91-3242). Beispielhafte Verfahren zur Produktion völlig humaner Antikörper werden z.B. in den Beispielen hierin bereitgestellt, es kann aber jedes beliebige in der Technik bekannte Verfahren angewendet werden.

Der Ausdruck “rekombinanter humaner Antikörper” schließt humane Antikörper ein, die durch rekombinante Mittel hergestellt, exprimiert, erzeugt oder isoliert werden, wie Antikörper, die mit einem in einer Wirtszelle transfizierten rekombinanten Expressionsvektor exprimiert werden, Antikörper, die von einer rekombinanten, kombinatorischen humanen Antikörperbibliothek isoliert werden, Antikörper, die von einem Tier (z.B. einer Maus oder Kuh) isoliert werden, das transgen und/oder transchromosomal für humane Immunglobulingene ist (siehe z.B. Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287–6295), oder Antikörper, die durch ein beliebiges anderes Mittel hergestellt, exprimiert, erzeugt oder isoliert werden, das Spleißen humaner Immunglobulingensequenzen mit anderen DNA-Sequenzen involviert. Solche rekombinanten humanen Antikörper können variable oder konstante Regionen haben, die von humanen Keimbahn-Immunglobulinsequenzen abgeleitet sind (siehe Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fünfte Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication Nr. 91-3242). In bestimmten Ausgestaltungen unterliegen solche rekombinanten humanen Antikörper jedoch einer In-vitro-Mutagenese (oder, wenn ein für humane Ig-Sequenzen transgenes Tier verwendet wird, einer somatischen In-vivo-Mutagenese), so dass die Aminosäuresequenzen der VH- und VL-Regionen der rekombinanten Antikörper Sequenzen sind, die zwar von humanen Keimbahn-VH- und VL-Sequenzen abgeleitet sind und damit verwandt sind, aber möglicherweise in den humanen Antikörperkeimbahn-Repertoires in vivo nicht natürlich existieren.

Der hierin verwendete Begriff “Fusionsprotein” bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz eines Antikörpers und eine Aminosäuresequenz eines heterologen Polypeptids oder Proteins beinhaltet (d.h. ein Polypeptid oder Protein, das normalerweise kein Teil des Antikörpers ist (z.B. ein Nicht-Anti-hOX40L-Antigen-Antikörper)). Wenn der Begriff “Fusion” in Verbindung mit hOX40L oder mit einem Anti-hOX40L-Antikörper verwendet wird, dann bezieht er sich auf die Verbindung eines Peptids oder Polypeptids oder Fragments, einer Variante und/oder eines Derivats davon mit einem heterologen Peptid oder Polypeptid. Vorzugsweise behält das Fusionsprotein die biologische Aktivität des hOX40L- oder Anti-hOX40L-Antikörpers bei. In bestimmten Ausgestaltungen beinhaltet das Fusionsprotein eine hOX40L-Antikörper-VH-Domäne, VL-Domäne, VH CDR (eine, zwei oder drei VH CDRs) und/oder VL CDR (eine, zwei oder drei VL CDRs), wobei sich das Fusionsprotein spezifisch an ein hOX40L-Epitop bindet.

Wenn der Begriff “Schwerkette” mit Bezug auf einen Antikörper verwendet wird, dann bezieht er sich auf fünf verschiedene Typen mit den Bezeichnungen Alpha (α), Delta (δ), Epsilon (ε), Gamma (γ) und Mu (μ), auf der Basis der Aminosäuresequenz der konstanten Schwerkettendomäne.

Diese verschiedenen Typen von Schwerketten sind gut bekannt und führen zu fünf Klassen von Antikörpern, jeweils IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, die vier Unterklassen von IgG, nämlich IgG1, IgG1, IgG3 und IgG4, beinhalten. Vorzugsweise ist die Schwerkette eine humane Schwerkette. In einem Beispiel ist die Schwerkette ein deaktivierter IgG-Isotyp, z.B. ein deaktiviertes IgG4. In bestimmten Ausgestaltungen beinhalten die Antikörper der Erfindung eine humane konstante Gamma-4-Region. In einer anderen Ausgestaltung bindet die konstante Schwerkettenregion Fc-γ-Rezeptoren nicht und beinhaltet z.B. eine Leu235Glu-Mutation. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet die konstante Schwerkettenregion eine Ser228Pro-Mutation zum Erhöhen der Stabilität. In einer anderen Ausgestaltung ist die konstante Schwerkettenregion IgG4-PE.

Der hierin verwendete Begriff “Wirt” bezieht sich auf ein Tier, vorzugsweise ein Säugetier und am bevorzugtesten einen Menschen.

Der hierin verwendete Begriff “Wirtszelle” bezieht sich auf die mit einem Nucleinsäuremolekül transfizierte spezielle Subjektzelle und die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen einer solchen Zelle. Nachkommen einer solchen Zellen sind aufgrund von Mutationen oder Umwelteinflüssen, die in Folgegenerationen auftreten können, oder einer Integration des Nucleinsäuremoleküls in das Wirtszellgenom möglicherweise nicht mit der mit dem Nucleinsäuremolekül transfizierten Mutterzelle identisch.

Der Begriff “Immunmodulationsmittel” und Variationen davon, der/die z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, hierin verwendete Immunmodulationsmittel beinhaltet/beinhalten, bezieht sich auf ein Mittel, das das Immunsystem eines Wirts moduliert. In bestimmten Ausgestaltungen ist ein Immunmodulationsmittel ein Immunosuppressivum. In bestimmten anderen Ausgestaltungen ist ein Immunmodulationsmittel ein Immunstimulationsmittel. Gemäß der Erfindung beinhaltet ein in den erfindungsgemäßen Kombinationstherapien verwendetes Immunmodulationsmittel keinen Anti-hOX40L-Antikörper und kein Antigenbindungsfragment. Zu Immunmodulationsmittel gehören z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, kleine Moleküle, Peptide, Polypeptide, Proteine, Fusionsproteine, Antikörper, anorganische Moleküle, Mimetika und organische Moleküle.

Der hierin verwendete Begriff “in Kombination” bezieht sich in Zusammenhang mit der Verabreichung anderer Therapien auf die Verwendung von mehr als einer Therapie. Die Verwendung des Begriffs “in Kombination” beschränkt nicht die Reihenfolge, in der Therapien einem Subjekt mit einer Infektion verabreicht werden. Eine erste Therapie kann vor (z.B. 1 Minute, 45 Minuten, 30 Minuten, 45 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunde, 4 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 96 Stunden, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen, 4 Wochen, 5 Wochen, 6 Wochen, 8 Wochen oder 12 Wochen), gleichzeitig mit oder nach (z.B. 1 Minute, 45 Minuten, 30 Minuten, 45 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 96 Stunden, 1 Woche, 2 Wochen, 3 Wochen, 4 Wochen, 5 Wochen, 6 Wochen, 8 Wochen oder 12 Wochen) der Verabreichung einer zweiten Therapie an ein Subjekt verabreicht werden, das eine hOX40L-vermittelte Krankheit hatte, hat oder dafür empfänglich ist. Es kann jede beliebige zusätzliche Therapie in einer beliebigen Reihenfolge mit den anderen zusätzlichen Therapien verabreicht werden. In bestimmten Ausgestaltungen können die erfindungsgemäßen Antikörper in Kombination mit einer oder mehreren Therapien verabreicht werden (z.B. Therapien, die nicht die erfindungsgemäßen Antikörper sind, die derzeit verabreicht werden, um eine hOX40L-vermittelte Krankheit zu verhüten, behandeln, bewältigen und/oder zu lindern). Nicht begrenzende Beispiele für Therapien, die in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Antikörper verabreicht werden können, schließen Analgetika, Anästhetika, Antibiotika oder Immunmodulationsmittel oder ein beliebiges anderes Mittel ein, das in der amerikanischen Pharmakopöe und/oder in einem Nachschlagewerk des Arztes aufgeführt ist.

Ein “isolierter” oder “gereinigter” Antikörper ist beispielsweise im Wesentlichen frei von Zellmaterial oder anderen kontaminierenden Proteinen von der Zell- oder Gewebequelle, von der der Antikörper stammt, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, im Falle einer chemischen Synthese. Die Formulierung “im Wesentlichen frei von Zellmaterial” schließt Präparate eines Antikörpers ein, bei denen der Antikörper von Zellkomponenten der Zellen, von denen er isoliert wird, getrennt ist oder rekombinant produziert wird. Folglich schließt ein Antikörper, der im Wesentlichen frei von Zellmaterial ist, Präparate eines Antikörper mit weniger als etwa 30 %, 20 %, 10 % oder 5 % (bezogen auf das Trockengewicht) an heterologem Protein (hierin auch “kontaminierendes Protein” genannt) ein. Wenn der Antikörper rekombinant produziert wird, dann ist er vorzugsweise auch im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d.h. das Kulturmedium macht weniger als etwa 20 %, 10 % oder 5 % des Volumens des Proteinpräparats aus. Wenn der Antikörper durch chemische Synthese produziert wird, dann ist er vorzugsweise im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, d.h. er wird von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien getrennt, die in der Synthese des Proteins involviert sind. Demzufolge haben solche Präparate des Antikörpers weniger als etwa 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (bezogen auf das Trockengewicht) an chemischen Vorläufern oder anderen Verbindungen als dem Antikörper von Interesse. In einer bevorzugten Ausgestaltung sind die erfindungsgemäßen Antikörper isoliert oder gereinigt.

Ein “isoliertes” Nucleinsäuremolekül ist eines, das von anderen Nucleinsäuremolekülen getrennt ist, die in der natürlichen Quelle des Nucleinsäuremoleküls vorhanden sind. Ferner kann ein “isoliertes” Nucleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, im Wesentlichen frei von anderem Zellmaterial oder Kulturmedium sein, wenn es durch Rekombinationsmethoden produziert wird, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien im Falle einer chemischen Synthese. In einer spezifischen Ausgestaltung ist/sind (ein) Nucleinsäuremolekül(e), das/die einen erfindungsgemäßen Antikörper kodiert/kodieren, isoliert oder gereinigt.

Der Begriff „humaner OX40L”, “hOX40L” oder “hOX40L-Polypeptid” und ähnliche Begriffe beziehen sich auf die Polypeptide (“Polypeptide”, “Peptide” und “Proteine” werden hierin untereinander austauschbar verwendet), die die Aminosäuresequenz in der Sequenzauflistung, und verwandte Polypeptide, inkl. SNP-Varianten davon beinhalten. Zu verwandten Polypeptiden gehören Allelvarianten (z.B. SNP-Varianten); Spleißvarianten; Fragmente; Derivate; Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten; Fusionspolypeptide; und artübergreifende Homologe, die vorzugsweise hOX40L-Aktivität beibehalten und/oder ausreichen, um eine Anti-hOX40L-Immunantwort zu erzeugen. Ebenfalls eingeschlossen sind lösliche Formen von hOX40L, die ausreichen, um eine immunologische Anti-hOX40L-Reaktion zu erzeugen. Die Fachperson wird verstehen, dass sich ein erfindungsgemäßer Anti-hOX40L-Antikörper an ein hOX40L-Polypeptid, Polypeptidfragment, Antigen und/oder Epitop binden kann, da ein Epitop Teil des größeren Antigens ist, das Teil des größeren Polypeptidfragments ist, das wiederum Teil des größeren Polypeptids ist. hOX40L kann in trimerer (nativer) oder monomerer (denaturierter) Form vorliegen.

Der Begriff “Kabat-Nummerierung” und ähnliche Begriffe sind in der Technik anerkannt und beziehen sich auf ein Nummerierungssystem für Aminosäurereste, die variabler (d.h. hypervariabel) als andere Aminosäurereste in den variablen Schwerkettenregionen eines Antikörpers oder eines Antigenbindungsabschnitts davon sind (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382–391 und Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, fünfte Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication Nr. 91–3242). Für die variable Schwerkettenregion reicht die hypervariable Region typischerweise von Aminosäurepositionen 31 bis 35 für CDR1, Aminosäurepositionen 50 bis 65 für CDR2 und Aminosäurepositionen 95 bis 102 für CDR3.

Der Begriff “monoklonaler Antikörper” bezieht sich auf einen Antikörper, der von einer Population homogener oder im Wesentlichen homogener Antikörper erhalten wurde, und jeder monoklonale Antikörper erkennt typischerweise ein einzelnes Epitop auf dem Antigen. In bevorzugten Ausgestaltungen ist der hierin verwendete “monoklonale Antikörper” ein Antikörper, der durch ein einzelnes Hybridom oder eine andere Zelle produziert wird, wobei sich der Antikörper spezifisch nur an ein hOX40L-Epitop bindet, wie z.B. durch ELISA oder einen anderen Antigenbindungs- oder kompetitiven Bindungsassays bestimmt, wie aus der Technik oder den hierin aufgeführten Beispielen bekannt. Der Begriff „monoklonal“ ist nicht auf irgendein spezielles Verfahren zur Herstellung des Antikörpers begrenzt. Erfindungsgemäße monoklonale Antikörper können beispielsweise mit dem in Kohler et al.; Nature, 256: 495 (1975) beschriebenen Hybridomverfahren hergestellt oder von Phagenbibliotheken z.B. mit den hierin beschriebenen Methoden isoliert werden. Andere Verfahren zur Herstellung von klonalen Zelllinien und davon exprimierten monoklonalen Antikörpern sind in der Technik gut bekannt (siehe z.B. Kapitel 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5. Ausg., Ausubel et al., Hrsg., John Wiley and Sons, New York). Andere exemplarische Verfahren zur Produktion anderer monoklonaler Antikörper sind in den Beispielen hierin enthalten.

Der Begriff “natürlich vorkommend” oder “nativ” bezieht sich in Verbindung mit biologischen Materialien wie Nucleinsäuremoleküle, Polypeptide, Wirtszellen und dergleichen auf solche, die in der Natur zu finden sind und nicht vom Menschen manipuliert wurden.

Der hierin verwendete Begriff “pharmazeutisch akzeptabel” bedeutet für den Gebrauch mit Tieren, insbesondere Menschen, von einer Regulierungsbehörde einer Bundes- oder Staatsregierung zugelassen oder in der amerikanischen Pharmakopöe, europäischen Pharmakopöe oder einer anderen allgemein anerkannten Pharmakopöe aufgeführt.

Der hierin verwendete Begriff “polyklonale Antikörper” bezieht sich auf eine Antikörperpopulation, die in einer immunogenen Reaktion auf ein Protein mit vielen Epitopen erzeugt wird und die folglich eine Reihe verschiedener Antikörper beinhaltet, die auf dasselbe und auf unterschiedliche Epitop(e) innerhalb des Proteins gerichtet sind. Verfahren zum Produzieren polyklonaler Antikörper sind in der Technik bekannt (siehe z.B. Kapitel 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5. Ausg., Ausubel et al., Hrsg., John Wiley and Sons, New York).

Die hierin verwendeten Begriffe “Polynucleotid”, “Nucleotid”, “Nucleinsäure”, “Nucleinsäuremolekül” und andere ähnliche Begriffe werden untereinander austauschbar verwendet und schließen DNA, RNA, mRNA und dergleichen ein.

Die hierin verwendeten Begriffe “verhüten”, “verhütend” und “Verhütung” beziehen sich auf die gesamte oder teilweise Inhibition der Entstehung, Rückkehr, des Ausbruchs oder der Verbreitung einer hOX40L-vermittelten Krankheit und/oder eines damit verbundenen Symptoms, die sich aus der Verabreichung einer hierin bereitgestellten Therapie oder Kombination von Therapien (z.B. eine Kombination von prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln, z.B. ein erfindungsgemäßer Antikörper) ergibt.

Der hierin verwendete Begriff “prophylaktisches Mittel” bezieht sich auf ein beliebiges Mittel, das ganz oder teilweise die Entstehung, Rückkehr, den Ausbruch oder die Verbreitung einer hOX40L-vermittelten Krankheit und/oder eines damit verbundenen Symptoms bei einem Subjekt inhibieren kann. In bestimmten Ausgestaltungen bezieht sich der Begriff “prophylaktisches Mittel” auf einen erfindungsgemäßen Antikörper. In bestimmten anderen Ausgestaltungen bezieht sich der Begriff “prophylaktisches Mittel” auf ein anderes Mittel als den erfindungsgemäßen Antikörper. Vorzugsweise ist ein prophylaktisches Mittel ein Mittel, das bekanntlich zum Verhüten einer hOX40L-vermittelten Krankheit und/oder eines damit verbundenen Symptoms oder zum Verzögern des Ausbruchs, der Entstehung, des Fortschritts und/oder der Schwere einer hOX40L-vermittelten Krankheit und/oder eines damit verbundenen Symptoms nützlich ist oder dazu verwendet wurde oder derzeit verwendet wird. In spezifischen Ausgestaltungen ist das prophylaktische Mittel ein völlig humaner Anti-hOX40L-Antikörper, wie z.B. ein völlig humaner monoklonaler Anti-hOX40L-Antikörper.

In einer Ausgestaltung verhindert die Prophylaxe den Ausbruch der Krankheit oder des Zustands oder der Symptome der Krankheit oder des Zustands. In einer Ausgestaltung verhindert die prophylaktische Behandlung die Verschlimmerung oder den Ausbruch der Krankheit oder des Zustands. In einer Ausgestaltung verhindert die prophylaktische Behandlung die Verschlimmerung der Krankheit oder des Zustands.

In einer anderen Ausgestaltung wird ein Anti-OX40L-Antikörper der Erfindung intravenös verabreicht (z.B. vor oder gleichzeitig mit einem Transplantat, z.B. Blut- oder Organtransplantat). In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper in einer Dosis von etwa 5–10 mg/kg (z.B. etwa 8 mg/kg) verabreicht. In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper in einer Dosis verabreicht, die ausgewählt ist aus etwa 0,1 mg/kg, etwa 0,5 mg/kg, etwa 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, etwa 10 mg/kg, etwa 15 mg/kg, etwa 20 mg/kg, etwa 25 mg/kg, etwa 30 mg/kg, etwa 40 mg/kg, etwa 50 mg/kg, etwa 60 mg/kg, etwa 70 mg/kg, etwa 80 mg/kg, etwa 90 mg/kg oder etwa 100 mg/kg, insbesondere etwa 1 mg/kg oder etwa 3 mg/kg.

In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper 1–4 Tage vor der Transplantation (z.B. von Blut oder Organen), z.B. 1–3 Tage vor der Transplantation oder 1–2 Tage vor der Transplantation verabreicht. In einer anderen Ausgestaltung wird der genannte Antikörper wöchentlich, zweiwöchentlich oder monatlich nach der Transplantation verabreicht, z.B. zweiwöchentlich. In einer weiteren Ausgestaltung wird der genannte Antikörper intravenös prophylaktisch 1–3 Tage vor der Transplantation in einer Dosis von etwa 5–10 mg/kg (z.B. etwa 8 mg/kg) und dann intravenös zweiwöchentlich in einer Dosis von etwa 5–10 mg/kg (z.B. etwa 8 mg/kg) verabreicht.

In einer anderen Ausgestaltung wird der Patient nach der Transplantation regelmäßig auf Anwesenheit eines Biomarkers überwacht, der für eine Entstehung einer Transplantatabstoßung oder von GvHD (z.B. akutve GvHD) prädiktiv ist, und der Anti-OX40L-Antikörper der Erfindung wird verabreicht, sobald die Biomarker-Niveaus derart sind, dass für den Patienten die Gefahr für die Entstehung einer Transplantatabstoßung oder von GvHD (z.B. akute GvHD) besteht. Diese Strategie würde eine unnötige Arzneimitteldosierung und eine unnötige Unterdrückung des Immunsystems verhindern. Beispiele für Biomarker, die als prädiktive Biomarker für akute GvHD von Nutzen sind, können die in Levine et al., “A prognostic score for acute graft-versus-host disease based on biomarkers: a multicentre study”, Lancet Haematol 2015; 2: e21–29, angegebenen sein. Zu diesen Biomarkern gehören z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, TNFR1, ST-2, Elafin und IL2Rα und Reg3α.

Eine Region eines hOX40, die zu einem Epitop beiträgt, können zusammenhängende Aminosäuren des Polypeptids sein, oder das Epitop kann aus zwei oder mehreren nicht zusammenhängenden Regionen des Polypeptids zusammengesetzt sein. Das Epitop kann ein dreidimensionales Oberflächenmerkmal des Antigens sein oder nicht. Eine lokalisierte Region auf der Oberfläche eines hOX40L-Antigens, die eine Immunreaktion hervorrufen kann, ist ein hOX40L-Epitop. Das Epitop kann ein dreidimensionales Oberflächenmerkmal des Antigens sein oder nicht.

Die Begriffe “hOX40L-vermittelte Krankheit” und “hOX40L-vermittelter Zustand” werden untereinander austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine(n) beliebige(n) Krankheit oder Zustand, die/der völlig oder teilweise durch hOX40L verursacht wird oder daraus resultiert. In bestimmten Ausgestaltungen wird hOX40L abweichend (z.B. hoch) auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert. In einigen Ausgestaltungen kann hOX40L abweichend auf einem speziellen Zelltyp hochreguliert werden. In anderen Ausgestaltungen wird eine normale, abweichende oder exzessive Zellsignalisierung durch eine Bindung von hOX40L an einen hOX40L-Liganden bewirkt. In bestimmten Ausgestaltungen ist der hOX40L-Ligand z.B. OX40, der auf der Oberfläche einer Zelle wie einer Kolonepithelzelle exprimiert wird. In bestimmten Ausgestaltungen ist die hOX40L-vermittelte Krankheit eine entzündliche Darmkrankheit (CED) wie die Crohn-Krankheit (CD) oder Colitis ulcerosa (UC). In anderen Ausgestaltungen ist die hOX40L-vermittelte Krankheit die Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GVHD). In anderen Ausgestaltungen ist die hOX40L-vermittelte Krankheit ausgewählt aus Pyoderma gangrenosum, Riesenzellarteriitis, Schnitzler-Syndrom, nicht infektiöser Skleritis und Uveitis (nicht infektiös/autoimmun und/oder systemisch). In anderen Ausgestaltungen ist ein(e) hOX40L-vermittelte Krankheit oder Zustand ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer/einem systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthyperempfindlichkeit, multiple Sklerose und Atherosklerose, insbesondere GvHD.

Die Begriffe “hOX40L-Rezeptor” oder “hOX40L-Bindungsrezeptor” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Rezeptorpolypeptid, das sich an hOX40L bindet. In spezifischen Ausgestaltungen ist der hOX40L-Rezeptor Hox40. In einigen Ausgestaltungen wird der hOX40L-Rezeptor auf der Oberfläche einer Zelle, wie z.B. einer Kolonepithelzelle, exprimiert; oder auf einem Verpflanzungs- oder Transplantatgewebe oder auf einem Wirtsgewebe.

Die hierin verwendeten Begriffe “Subjekt” und “Patient” werden untereinander austauschbar verwendet. Das hierin verwendete Subjekt ist vorzugsweise ein Säugetier wie ein Nicht-Primat (z.B. Kühe, Schweine, Pferde, Katzen, Hunde, Ratten usw.) oder ein Primat (z.B. Affe und Mensch), am bevorzugtesten ein Mensch. In einer Ausgestaltung ist das Subjekt ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch, mit einer hOX40L-vermittelten Krankheit. In einer anderen Ausgestaltung ist das Subjekt ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch, bei dem die Gefahr der Entstehung einer hOX40L-vermittelten Krankheit besteht.

Der hierin verwendete Begriff “im Wesentlichen alle” bezieht sich auf wenigstens etwa 60 %, wenigstens etwa 70 %, wenigstens etwa 75 %, wenigstens etwa 80 %, wenigstens etwa 85 %, wenigstens etwa 90 %, wenigstens etwa 95 %, wenigstens etwa 98 %, wenigstens etwa 99 % oder etwa 100 %.

Der hierin verwendete Begriff “im Wesentlichen frei von Tensid” bezieht sich auf eine Formulierung eines Antikörpers, der sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen bindet, wobei die genannte Formulierung weniger als 0,0005 %, weniger als 0,0003 % oder weniger als 0,0001 % Tenside und/oder weniger als 0,0005 %, weniger als 0,0003 % oder weniger als 0,0001 % Tenside enthält.

Der hierin verwendete Begriff “im Wesentlichen frei von Salz” bezieht sich auf eine Formulierung eines Antikörpers, der sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen bindet, wobei die genannte Formulierung weniger als 0,0005 %, weniger als 0,0003 % oder weniger als 0,0001 % anorganische Salze enthält.

Der hierin verwendete Begriff “Tensid” bezieht sich auf organische Substanzen mit amphipathischen Strukturen; und zwar bestehen sie aus Gruppen entgegengesetzter Löslichkeitstendenzen, typischerweise einer öllöslichen Kohlenwasserstoffkette und einer wasserlöslichen ionischen Gruppe. Tenside können je nach Ladung des oberflächenaktiven Anteils in anionische, kationische und nicht ionische Tenside unterteilt werden. Tenside werden oft als Benetzungs-, Emulgierungs-, Solubilisierungs- und Dispergiermittel für verschiedene pharmazeutische Zusammensetzungen und Präparate biologischen Materials verwendet.

Der hierin verwendete Begriff “Tag” bezieht sich auf einen beliebigen Anteiltyp, der z.B. an ein Polypeptid und/oder ein Polynucleotid angefügt ist, das einen hOX40L- oder hOX40L-Antikörper oder ein Antigenbindungsfragment davon kodiert. Ein Polynucleotid, das hOX40L, hOX40L-Antikörper oder ein Antigenbindungsfragment davon kodiert, kann beispielsweise eine oder mehrere zusätzliche Tag-kodierende Nucleotidsequenzen enthalten, die z.B. einen detektierbaren Anteil oder einen Anteil kodieren, der die Affinitätsreinigung unterstützt. Wenn translatiert, können das Tag und der Antikörper in Form eines Fusionsproteins vorliegen. Der Begriff “detektierbar” oder “Detektion” bezieht sich mit Bezug auf ein Tag auf ein beliebiges Tag, das sichtbar gemacht oder dessen Anwesenheit des Tags anderweitig bestimmt und/oder gemessen werden kann (z.B. durch Quantifizierung). Ein nicht begrenzendes Beispiel für ein detektierbares Tag ist ein fluoreszierendes Tag.

Der hierin verwendete Begriff “Therapeutikum” bezieht sich auf ein beliebiges Mittel, das bei Behandlung, Management oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit und/oder damit verbundenen Symptoms verwendet werden kann. In bestimmten Ausgestaltungen bezieht sich der Begriff “Therapeutikum” auf einen erfindungsgemäßen Antikörper. In bestimmten anderen Ausgestaltungen bezieht sich der Begriff “Therapeutikum” auf ein anderes Mittel als einen erfindungsgemäßen Antikörper. Vorzugsweise ist ein Therapeutikum ein Mittel, das bekanntlich für die Behandlung, das Management oder die Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit oder von einem oder mehreren damit verbundenen Symptome nützlich ist oder dafür verwendet wurde oder derzeit verwendet wird. In spezifischen Ausgestaltungen ist das Therapeutikum ein völlig humaner Anti-hOX40L-Antikörper, wie z.B. ein völlig humaner monoklonaler Anti-hOX40L-Antikörper.

Die Kombination von Therapien (z.B. Verwendung prophylaktischer oder therapeutischer Mittel), die effektiver ist als die additiven Wirkungen von beliebigen zwei oder mehreren einzelnen Therapien. Eine synergistische Wirkung einer Kombination von prophylaktischen und/oder therapeutischen Mitteln gestattet beispielsweise die Verwendung geringerer Dosierungen von einem oder mehreren der Mittel und/oder eine weniger häufige Verabreichung der genannten Mittel an ein Subjekt mit einer hOX40L-vermittelten Krankheit. Durch die Fähigkeit, geringere Dosierungen prophylaktischer oder therapeutischer Therapien zu verwenden und/oder die genannten Therapien weniger häufig zu verabreichen, wird die Toxizität in Verbindung mit der Verabreichung der genannten Therapien an ein Subjekt verringert, ohne dass die Wirksamkeit der genannten Therapien bei Verhütung, Management, Behandlung oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit verringert wird. Darüber hinaus kann eine synergistische Wirkung in einer verbesserten Wirksamkeit von Therapien bei der Verhütung oder beim Management, bei der Behandlung oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit resultieren. Schließlich kann eine synergistische Wirkung einer Kombination von Therapien (z.B. prophylaktische oder therapeutische Mittel) ungünstige oder unerwünschte Nebenwirkungen in Verbindung mit der Verwendung einer einzelnen Therapie verhindern oder verringern.

In einer Ausgestaltung beinhaltet die Kombination einen erfindungsgemäßen Anti-OX40L-Antikörper und weitere Therapeutika, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat Mofetil und Anti-CD28-Antikörpern, Anti-IL12/IL-23-Antikörpern (z.B. Ustekinumab), Anti-CD20-Antikörpern (z.B. Rituximab), Anti-CD30-Antikörpern (z.B. Brentuximab), CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), CCR5-Rezeptor-Antagonisten (z.B. Maraviroc), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-VLA4-Antikörpern (z.B. Natalizumab), Anti-LFA1-Antikörpern, Fludarabin, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Anti-CD45-Antikörpern, Cyclophosphamid, Anti-Thymozyten-Globulinen, Anti-Komplement-C5-Antikörpern (z.B. Eculizumab), Anti-a4b7-Integrin-Antikörpern (z.B. Vedolizumab), Anti-IL6-Antikörpern (z.B. Tocilizumab), Anti-IL2R-Antikörpern (z.B. Basilixumab), Anti-CD25-Antikörpern (z.B. Daclizumab), Anti-TNFa-/TNFa-Fc-Molekülen (z.B. Etanercept, Adalimumab, Infliximab, Golimumab oder Certolizumab Pegol) und Vorinostat. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet die Kombination einen Anti-OX40L-Antikörper der Erfindung und ein weiteres Therapeutikum, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat Mofetil, Anti-CD28-Antikörpern, CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-LFA1-Antikörpern, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Cyclophosphamid und Anti-Thymozyten-Globulinen.

Der hierin verwendete Begriff “Therapie” bezieht sich auf ein beliebiges Protokoll, Verfahren und/oder Mittel, das bei Verhütung, Management, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit (z.B. CED oder GVHD) verwendet werden kann. In bestimmten Ausgestaltungen beziehen sich die Begriffe “Therapien” und “Therapie” auf eine biologische Therapie, unterstützende Therapie und/oder andere Therapien, die bei Verhütung, Management, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit von Nutzen und der Fachperson, wie medizinisches Personal, bekannt sind.

Die hierin verwendeten Begriffe “behandeln”, “Behandlung” und “behandelnd” beziehen sich auf die Verringerung oder Besserung des Fortschritts, der Schwere und/oder Dauer einer hOX40L-vermittelten Krankheit (z.B. CED oder GVHD), der/die sich aus der Verabreichung von einer oder mehreren Therapien ergibt (z.B. inkl., aber ohne darauf beschränkt zu sein, die Verabreichung von einem oder mehreren prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln, wie ein erfindungsgemäßer Antikörper). In spezifischen Ausgestaltungen beziehen sich solche Begriffe auf die Verringerung oder Inhibition der Bindung von hOX40L an OX40, die Verringerung oder Inhibition der Produktion oder Sekretion von CCL20 aus einer Zelle, die hOX40 oder hOX40L exprimiert, die Verringerung oder Inhibition der Produktion oder Sekretion von IL-8 aus einer Zelle, die hOX40 oder hOX40L exprimiert, die Verringerung oder Inhibition der Produktion oder Sekretion von RANTES aus einer Zelle, die hOX40 oder hOX40L exprimiert, und/oder die Inhibition oder Verringerung von einem oder mehreren Symptomen in Verbindung mit einer hOX40L-vermittelten Krankheit wie CED oder GVHD. In spezifischen Ausgestaltungen beziehen sich solche Begriffe auf die Verringerung oder Inhibition der Bindung von hOX40L an OX40, die Verringerung oder Inhibition der Produktion oder Sekretion von INF-γ aus einer Zelle, die hOX40 oder hOX40L exprimiert, die Verringerung oder Inhibition der Produktion oder Sekretion von TNF-α aus einer Zelle, die hOX40 oder hOX40L exprimiert, die Verringerung oder Inhibition der Produktion oder Sekretion von IL-2 aus einer Zelle, die hOX40 oder hOX40L exprimiert und/oder die Inhibition oder Verringerung von einem oder mehreren Symptomen in Verbindung mit einer hOX40L-vermittelten Krankheit wie CED oder GVHD (insbesondere GvHD). In einem Beispiel ist die Zelle eine humane Zelle. In spezifischen Beispielen ist ein prophylaktisches Mittel ein völlig humaner Anti-hOX40L-Antikörper, wie ein völlig humaner monoklonaler Anti-hOX40L-Antikörper.

Der Begriff “variable Region” oder “variable Domäne” bezieht sich auf einen Abschnitt des OX40L und der Schwerketten, typischerweise etwa die aminoterminalen 120 bis 130 Aminosäuren in der Schwerkette und etwa 100 bis 110 Aminosäuren in der Leichtkette, die sich mit Bezug auf die Sequenz zwischen Antikörpern stark unterscheiden und bei der Bindung und Spezifität jedes speziellen Antikörpers für sein spezielles Antigen verwendet werden. Die Variabilität der Sequenz ist in Regionen mit der Bezeichnung Komplementarität bestimmende Regionen (CDRs) konzentriert, während die stärker konservierten Regionen in der variablen Domäne Framework-Regionen (FR) genannt werden. Die CDRs von OX40L und der Schwerketten sind in erster Linie für die Interaktion zwischen Antikörper und Antigen verantwortlich. Die hierin verwendete Nummerierung der Aminosäurepositionen entspricht dem EU-Index wie in Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5. Ausg. (“Kabat et al.”)). In bevorzugten Ausgestaltungen ist die variable Region eine humane variable Region.

Antikörper

Zu erfindungsgemäßen Antikörpern gehören z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, synthetische Antikörper, monoklonale Antikörper, rekombinant produzierte Antikörper, multispezifische Antikörper (inkl. bispezifischer Antikörper), humane Antikörper, humanisierte Antikörper, chimäre Antikörper, Intrakörper, einkettige Fvs (scFv) (z.B. inkl. monospezifisch, bispezifisch usw.), kamelisierte Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab′)-Fragmente, disulfidverknüpfte Fvs (sdFv), anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper und Epitopbindungsfragmente von beliebigen der obigen.

Insbesondere gehören zu hierin bereitgestellten Antikörpern Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Abschnitte von Immunglobulinmolekülen, d.h. Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen bindet. Die hierin bereitgestellten Immunglobulinmoleküle können von einem/einer beliebigen Typ (z.B. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA und IgY), Klasse (z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und IgA2) oder Unterklasse von Immunglobulinmolekülen sein. In einer spezifischen Ausgestaltung ist ein hierin bereitgestellter Antikörper ein IgG-Antikörper, vorzugsweise ein IgG1 oder IgG4. In bestimmten Ausgestaltungen beinhalten die erfindungsgemäßen Antikörper eine humane konstante Gamma-4-Region. In einer anderen Ausgestaltung bindet die konstante Schwerkettenregion Fc-γ-Rezeptoren nicht und beinhaltet z.B. eine Leu235Glu-Mutation. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet die konstante Schwerkettenregion eine Ser228Pro-Mutation zum Erhöhen der Stabilität. In einer anderen Ausgestaltung ist die konstante Schwerkettenregion IgG4-PE.

Varianten und Derivate der Antikörper schließen Antikörperfragmente ein, die die Fähigkeit beibehalten, sich spezifisch an ein Epitop zu binden. Zu bevorzugten Fragmenten gehören Fab-Fragmente; Fab′ (ein Antikörperfragment mit einer einzelnen Anti-Bindungsdomäne, die ein Fab und einen zusätzlichen Abschnitt der Schwerkette über die Gelenkregion beinhaltet); F(ab′)2 (zwei Fab′-Moleküle, die durch Zwischenketten-Disulfidbindungen in den Gelenkregionen der Schwerketten verbunden sind; die Fab′-Moleküle können in Richtung auf die gleichen oder unterschiedliche Epitope gerichtet sein); ein bispezifisches Fab (ein Fab-Molekül mit zwei Antigenbindungsdomänen, die jeweils auf ein unterschiedliches Epitop gerichtet sein können); eine einkettige Fab-Kette, die eine variable Region beinhaltet, auch bekannt als sFv; ein disulfidverknüpftes Fv oder dsFv; eine kamelisierte VH (die variable Antigenbindung bestimmende Region einer einzelnen Schwerkette eines Antikörpers, wobei einige Aminosäuren an der VH-Schnittstelle diejenigen sind, die in der Schwerkette natürlich vorkommender Antikörper zu finden sind); ein bispezifisches sFv (ein sFv- oder ein dsFv-Molekül mit zwei Antigenbindungsdomänen, die jeweils auf ein unterschiedliches Epitop gerichtet sein können); ein Diabody (ein dimerisiertes sFv, das gebildet wird, wenn sich die VH-Domäne eines ersten sFv mit der VL-Domäne eines zweiten sFv zusammenfügt und sich die VL-Domäne des ersten sFv mit der VH-Domäne des zweiten sFv zusammenfügt; die beiden Antigenbindungsregionen des Diabody können auf die gleichen oder unterschiedliche Epitope gerichtet sein); und ein Triabody (ein trimerisiertes sFv, das in einer ähnlichen Weise wie ein Diabody gebildet wird, wobei jedoch drei Antigenbindungsdomänen in einem einzelnen Komplex erzeugt werden; die drei Antigenbindungsdomänen können auf die gleichen oder unterschiedliche Epitope gerichtet sein). Zu Derivaten von Antikörpern gehören auch eine oder mehrere CDR-Sequenzen einer Antikörperkombinationsstelle. Die CDR-Sequenzen können auf einem Gerüst miteinander verknüpft sein, wenn zwei oder mehr CDR-Sequenzen vorhanden sind. In bestimmten Ausgestaltungen beinhaltet der mit der Erfindung zu verwendende Antikörper ein Einzelketten-Fv (“scFv”). scFvs sind Antikörperfragmente, die die VH- und VL-Domänen eines Antikörpers beinhalten, wobei diese Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette vorliegen. Im Allgemeinen beinhaltet das scFv-Polypeptid ferner einen Polypeptid-Linker zwischen den VH- und VL-Domänen, der es ermöglicht, dass das scFv die gewünschte Struktur für die Antigenbindung bildet. Für eine Übersicht über scFvs siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg und Moore Hrsg. Springer-Verlag, New York, S. 269–315 (1994).

Die erfindungsgemäßen Antikörper können von einer beliebigen tierischen Quelle stammen, inkl. Vögel und Säugetiere (z.B. Mensch, Maus, Esel, Schaf, Kaninchen, Ziege, Meerschweinchen, Kamel, Pferd oder Huhn). In bestimmten Ausgestaltungen sind die erfindungsgemäßen Antikörper humane oder humanisierte monoklonale Antikörper. Zu den hierin verwendeten “humanen” Antikörpern gehören Antikörper mit der Aminosäuresequenz eines humanen Immunglobulins und Antikörper, die von humanen Immunglobulinbibliotheken oder von Mäusen isoliert sind, die Antikörper von humanen Genen exprimieren.

In bevorzugten Ausgestaltungen sind die erfindungsgemäßen Antikörper völlig humane Antikörper wie völlig humane Antikörper, die sich spezifisch an ein hOX40L-Polypeptid, ein hOX40L-Polypeptidfragment oder ein hOX40L-Epitop binden. Solche völlig humanen Antikörper wären gegenüber vollständigen Maus- (oder anderen Antikörpern völlig oder teilweise nicht humaner Spezies), humanisierten Antikörpern oder chimären Antikörpern von Vorteil, um die Entstehung unerwünschter oder unnötiger Nebenwirkungen zu minimieren, wie gegen nicht völlig humane Antikörper (z.B. Anti-hOX40L-Antikörper von anderen Spezies) gerichtete Immunreaktionen, wenn sie dem Subjekt verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können monospezifisch, bispezifsich, trispezifisch oder von höherer Multispezifität sein. Multispezifische Antikörper können für verschiedene Epitope eines hOX40L-Polypeptids spezifisch sein oder sie können für sowohl ein hOX40L-Polypeptid als auch für ein heterologes Epitop, wie ein heterologes Polypeptid oder festes Trägermaterial, spezifisch sein. In bevorzugten Ausgestaltungen sind die hierin bereitgestellten Antikörper für ein bestimmtes Epitop eines hOX40L-Polypeptids monospezifisch und binden sich nicht spezifisch an andere Epitope.

Außerdem wird hierin eine B-Zelle (z.B. eine immortalisierte B-Zelle) oder ein Hybridom bereitgestellt, das ein(en) hierin beschriebenen/s Anti-hOX40L-Antikörper oder Fragment produziert.

In bestimmten Ausgestaltungen wird hierin ein isolierter Antikörper bereitgestellt, der sich spezifisch an ein hOX40L-Epitop bindet, wobei die Bindung an das hOX40L-Epitop durch den Antikörper kompetitiv (z.B. in einer dosisabhängigen Weise) durch einen Antikörper oder ein Fragment der Erfindung blockiert wird. Der Antikörper kann ein völlig humaner Antikörper sein oder nicht. In bevorzugten Ausgestaltungen ist der Antikörper ein völlig humaner monoklonaler Anti-hOX40L-Antikörper und noch bevorzugter ein völlig humaner, monoklonaler, antagonistischer Anti-hOX40L-Antikörper. Beispielhafte kompetitive Blockierungstests, die angewendet werden können, sind in den Beispielen hierin enthalten.

In einigen Ausgestaltungen konkurriert der Antikörper oder das Fragment der Erfindung (z.B. in einer dosisabhängigen Weise) mit dem OX40-Rezeptor (oder einem Fusionsprotein davon) um die Bindung an Zelloberflächen-exprimiertes hOX40L. In anderen Ausgestaltungen konkurriert der Antikörper oder das Fragment der Erfindung (z.B. in einer dosisabhängigen Weise) mit dem OX40-Rezeptor (oder einem Fusionsprotein davon) um eine Bindung an lösliches hOX40L. Beispielhafte kompetitive Bindungsassays, die angewendet werden können, sind in den Beispielen hierin enthalten. In einer Ausgestaltung inhibiert der Antikörper oder das Fragment teilweise oder vollständig die Bindung von hOX40 an Zelloberflächen-exprimiertes OX40L, wie hOX40L. In einer anderen Ausgestaltung inhibiert der Antikörper teilweise oder vollständig eine Bindung von hOX40 an lösliches hOX40L. In einigen Ausgestaltungen inhibiert der Antikörper oder das Fragment teilweise oder vollständig die Sekretion von CCL20, IL-8 und/oder RANTES oder INF-γ, TNF-α oder IL-2, insbesondere INF-γ, aus einer Zelle mit Zelloberflächen-exprimiertem OX40. In bestimmten Ausgestaltungen ist die OX40-exprimierende Zelle eine Kolonepithelzelle.

Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Antikörper völlig humane, monoklonale Antikörper, wie völlig humane, monoklonale antagonistische Antikörper, die sich spezifisch an hOX40L binden.

In einigen Ausgestaltungen bindet sich der hierin bereitgestellte Antikörper oder das Fragment an ein hOX40L-Epitop, das ein dreidimensionales Oberflächenmerkmal eines hOX40L-Polypeptids ist (z.B. in trimerer Form eines hOX40L-Polypeptids). Eine Region eines hOX40L-Polypeptids, die zu einem Epitop beiträgt, kann zusammenhängende Aminosäuren des Polypeptids beinhalten oder das Epitop kann von zwei oder mehr nicht zusammenhängenden Regionen des Polypeptids zusammenkommen. Ein hOX40L-Epitop kann in (a) der trimeren Form (“ein trimeres hOX40L-Epitop”) von hOX40L, (b) der monomeren Form (“ein monomeres hOX40L-Epitop”) von hOX40L, (c) sowohl der trimeren als auch monomeren Form von hOX40L, (d) der trimeren Form, aber nicht der monomeren Form von hOX40L, oder (e) der monomeren Form, aber nicht der trimeren Form von hOX40L vorliegen.

In einigen Ausgestaltungen ist das Epitop z.B. nur zur Bindung in trimerer (nativer) Form vorhanden oder verfügbar, aber nicht zur Bindung in monomerer (denaturierter) Form durch einen Anti-hOX40L-Antikörper vorhanden oder verfügbar. In anderen Ausgestaltungen ist das hOX40L- Epitop ein lineares Merkmal des hOX40L-Polypeptids (z.B. in trimerer Form oder monomerer Form des hOX40L-Polypeptids). Hierin bereitgestellte Antikörper können sich spezifisch an (a) ein Epitop der monomeren Form des hOX40L-Polypeptids, (b) ein Epitop der trimeren Form von hOX40L, (c) ein Epitop der monomeren aber nicht trimeren Form von hOX40L, (d) ein Epitop der trimeren aber nicht monomeren Form von hOX40L oder (e) sowohl die monomere Form als auch die trimere Form von hOX40L binden. In bevorzugten Ausgestaltungen binden sich die hierin bereitgestellten Antikörper an ein Epitop der trimeren Form von hOX40L, aber nicht spezifisch an ein Epitop der monomeren Form von hOX40L.

Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper bereit, die sich spezifisch an ein hOX40L-Epitop binden, wobei die Antikörper Derivate der hierin beschriebenen VH-Domänen, VH CDRs, VL-Domänen und VL CDRs beinhalten, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen binden. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Antikörper bereit, die Derivate von in den Beispielen offenbarten Antikörpern beinhalten, wobei sich die genannten Antikörper spezifisch an ein hOX40L-Epitop binden. Mit der Fachperson bekannten Standardmethoden können Mutationen in die Nucleotidsequenz eingeführt werden, die ein erfindungsgemäßes Molekül kodiert, wie z.B. ortsgerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, woraus sich Aminosäuresubstitutionen ergeben. Vorzugsweise beinhalten die Derivate weniger als 25 Aminosäuresubstitutionen, weniger als 20 Aminosäuresubstitutionen, weniger als 15 Aminosäuresubstitutionen, weniger als 10 Aminosäuresubstitutionen, weniger als 5 Aminosäuresubstitutionen, weniger als 4 Aminosäuresubstitutionen, weniger als 3 Aminosäuresubstitutionen oder weniger als 2 Aminosäuresubstitutionen relativ zum ursprünglichen Molekül. In einer anderen Ausgestaltung haben die Derivate konservative Aminosäuresubstitutionen. In einer bevorzugten Ausgestaltung haben die Derivate konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren vorhergesagten nicht essentiellen Aminosäureresten. Alternativ können Mutationen zufällig entlang der gesamten oder einem Teil der Kodierungssequenz eingeführt werden, wie z.B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können mit Bezug auf biologische Aktivität gescreent werden, um Mutanten zu identifizieren, die Aktivitäten beibehalten. Im Anschluss an die Mutagenese kann das kodierte Protein exprimiert und die Aktivität des Proteins bestimmt werden.

In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet ein Antikörper, der sich spezifisch an ein hOX40L-Epitop bindet, eine Aminosäuresequenz mit variabler Domäne, die wenigstens 35 %, wenigstens 40 %, wenigstens 45 %, wenigstens 50 %, wenigstens 55 %, wenigstens 60 %, wenigstens 65 %, wenigstens 70 %, wenigstens 75 %, wenigstens 80 %, wenigstens 85 %, wenigstens 90 %, wenigstens 95 % oder wenigstens 99 % mit einer Aminosäuresequenz mit variabler Domäne der Sequenzauflistung identisch ist.

In spezifischen Ausgestaltungen ist der Antikörper ein völlig humaner Anti-Human-Antikörper, wie z.B. ein völlig humaner monoklonaler Antikörper. Völlig humane Antikörper können mit einem beliebigen in der Technik bekannten Verfahren produziert werden. Zu beispielhaften Verfahren gehören die Immunisierung mit einem hOX40L-Antigen (jedes beliebige hOX40L-Polypeptid, das eine Immunreaktion hervorrufen kann und optional mit einem Träger konjugiert ist) von transgenen Tieren (z.B. Mäusen), die in der Lage sind, ein Repertoire von humanen Antikörpern ohne endogene Immunglobulinproduktion zu produzieren; siehe z.B. Jakobovits et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 2551; Jakobovits et al., (1993) Nature, 362: 255 258 (1993); Bruggermann et al., (1993) Year in Immunol., 7: 33. Andere Verfahren für die Produktion völlig humaner Anti-hOX40L-Antikörper sind in den hierin bereitgestellten Beispielen zu finden.

Alternativ können völlig humane Antikörper über das In-vitro-Screening von Phagen-Display-Antikörperbibliotheken erzeugt werden; siehe z.B. Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Es wurden verschiedene antikörperhaltige Phagen-Display-Bibliotheken beschrieben, die ohne weiteres von der Fachperson hergestellt werden können. Bibliotheken können eine Vielfalt humaner Antikörpersequenzen enthalten, wie humane Fab-, Fv- und scFv-Fragmente, die gegen ein zweckmäßiges Target gescreent werden können.

Die erfindungsgemäßen Antikörper und Fragmente schließen Antikörper und Fragmente ein, die chemisch modifiziert sind, d.h. durch kovalentes Anbringen eines beliebigen Molekültyps an den Antikörper. Die Antikörperderivate schließen z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Antikörper ein, die chemisch modifiziert wurden, z.B. durch Glykosylierung, Acetylierung, Pegylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisierung durch bekannte Schutz-/Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung, Verknüpfung mit einem zellulären Liganden oder einem anderen Protein usw. Beliebige aus zahlreichen chemischen Modifikationen können mit bekannten Methoden durchgeführt werden, wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, spezifische chemische Spaltung, Acetylierung, Formulierung, metabolische Synthese von Tunicamycin usw. Darüber hinaus kann der Antikörper eine oder mehrere nicht klassische Aminosäuren enthalten.

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Antikörper bereit, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen binden und eine der Fachperson bekannte Framework-Region beinhalten (z.B. ein humanes oder nicht humanes Fragment). Die Framework-Region kann z.B. natürlich vorkommen oder Consensus-Framework-Regionen beinhalten. Am bevorzugtesten ist die Framework-Region eines erfindungsgemäßen Antikörpers human (siehe z.B. Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: 457–479 für eine Auflistung humaner Framework-Regionen, hierin in der Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen) (siehe auch Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5. Ausg.).

In einer spezifischen Ausgestaltung stellt die vorliegende Erfindung Antikörper bereit, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen binden, wobei die genannten Antikörper die Aminosäuresequenz von einer oder mehreren der CDRs in der Sequenzauflistung beinhalten (d.h. Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 36, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 68, Seq ID Nr. 74, Seq ID Nr. 96 oder Seq ID Nr. 102, insbesondere Seq ID Nr. 36 oder Seq ID Nr. 42 für HCDR1; Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 38, Seq ID Nr. 44, Seq ID Nr. 70, Seq ID Nr. 76, Seq ID Nr. 98 oder Seq ID Nr. 104, insbesondere Seq ID Nr. 38 oder Seq ID Nr. 44 für HCDR2; Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 40, Seq ID Nr. 46, Seq ID Nr. 72, Seq ID Nr. 78, Seq ID Nr. 100 oder Seq ID Nr. 106, insbesondere Seq ID Nr. 40 oder Seq ID Nr. 46 für HCDR3; Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 50, Seq ID Nr. 56, Seq ID Nr. 82, Seq ID Nr. 88, Seq ID Nr. 110 oder Seq ID Nr.116, insbesondere Seq ID Nr. 50 oder Seq ID Nr. 56 für LCDR1; Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 26, Seq ID Nr. 52, Seq ID Nr. 58, Seq ID Nr. 84, Seq ID Nr. 90, Seq ID Nr. 112 oder Seq ID Nr. 118, insbesondere Seq ID Nr. 52 oder Seq ID Nr. 58 für LCDR2; und Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 28, Seq ID Nr. 54, Seq ID Nr. 60, Seq ID Nr. 86, Seq ID Nr. 92, Seq ID Nr. 114 oder Seq ID Nr. 120, insbesondere Seq ID Nr. 54 oder Seq ID Nr. 60 für LCDR3) und humane Framework-Regionen mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen an einem, zwei, drei oder mehreren der folgenden Reste: (a) seltene Framework-Reste, die sich zwischen dem murinen Antikörper-Framework (d.h. Spender-Antikörper-Framework) und dem humanen Antikörper-Framework (d.h. Empfänger-Antikörper-Framework) unterscheiden; (b) Vernier-Zonenreste beim Unterscheiden zwischen Spender-Antikörper-Framework und Empfänger-Antikörper-Framework; (c) Zwischenketten-Packungsreste an der VH/VL-Schnittstelle, die sich zwischen dem Spender-Antikörper-Framework und dem Empfänger-Antikörper-Framework unterscheiden; (d) kanonische Reste, die sich zwischen den Spender-Antikörper-Framework- und den Empfänger-Antikörper-Framework-Sequenzen unterscheiden, insbesondere die Framework-Regionen, die für die Definition der kanonischen Klasse der murinen Antikörper-CDR-Schleifen entscheiden sind; (e) Reste, die neben einer CDR liegen; (g) Reste, die mit dem Antigen interagieren können; (h) Reste, die mit der CDR interagieren können; und (i) Kontaktreste zwischen der VH-Domäne und der VL-Domäne. In bestimmten Ausgestaltungen sind Antikörper, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen binden, das die humanen Framework-Regionen mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen an einem, zwei, drei oder mehreren der oben identifizierten Reste beinhaltet, antagonistische hOX40L-Antikörper.

Die vorliegende Erfindung schließt Antikörper ein, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen binden, wobei die genannten Antikörper die Aminosäuresequenz der VH-Domäne und/oder VL-Domäne in der Sequenzauflistung beinhalten (d.h. Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 34, Seq ID Nr. 66 oder Seq ID Nr. 94, insbesondere Seq ID Nr. 34 für VH-Domänen; Seq ID Nr. 16, Seq ID Nr. 48, Seq ID Nr. 80 oder Seq ID Nr. 108, insbesondere Seq ID Nr. 48 für VL-Domänen), allerdings mit Mutationen (z.B. eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen) in den Framework-Regionen. In bestimmten Ausgestaltungen beinhalten Antikörper, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen binden, die Aminosäuresequenz der VH-Domäne und/oder VL-Domäne oder ein Antigenbindungsfragment davon eines Antikörpers, der in den Beispielen offenbart ist, mit einer oder mehreren Aminosäurerestsubstitutionen in den Framework-Regionen der VH- und/oder VL-Domänen.

In einigen Ausgestaltungen verringern oder inhibieren hierin bereitgestellte Antikörper die Bindung von hOX40L hOX40 und/oder sie verringern oder inhibieren eine biologische hOX40L- Aktivität, wie die Sekretion von CCL20, IL8 und/oder RANTES oder INF-γ, TNF-α oder IL-2, insbesondere INF-γ, bei einem Subjekt (z.B. einem humanen Subjekt). In bestimmten Ausgestaltungen verringern oder inhibieren hierin bereitgestellte Antikörper, wie ein humaner monoklonaler Anti-hOX40L-Antikörper, die Bindung eines löslichen oder Zelloberflächen-exprimierten hOX40L an hOX40 und/oder verringern oder inhibieren die Sekretion von CCL20 und/oder RANTES, oder INF-γ, TNF-α oder IL-2, insbesondere INF-γ, nach einem Kontakt mit einem löslichen oder Zelloberflächen-exprimierten hOX40L bei einem Subjekt. Die Blockierungsaktivität eines hierin bereitgestellten Antikörpers der hOX40L-Bindung an hOX40 kann mit einem Assay wie in den Beispielen beschrieben detektiert werden. Die Inhibition der biologischen Aktivität von Zellen, die OX40 exprimieren, durch einen hierin bereitgestellten hOX40L-Antikörper kann mit einem Assay wie in den Beispielen beschrieben detektiert werden.

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Fusionsproteine bereit, die einen hierin bereitgestellten Antikörper beinhalten, der sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen und ein heterologes Polypeptid bindet. In einigen Ausgestaltungen ist das heterologe Polypeptid, mit dem der Antikörper fusioniert, zum Targetieren des Antikörpers auf Zellen mit Zelloberflächen-exprimiertem hOX40L von Nutzen.

Antikörperkonjugate und Fusionsproteine

Die folgende Erörterung zu Konjugaten und Fusionsproteinen trifft auch auf Fragmente zu, so dass in der Offenbarung erwähnte Antikörper auch mutatis mutandis auf Fragmente der Erfindung zutreffen können.

In einigen Ausgestaltungen werden erfindungsgemäße Antikörper mit einem diagnostischen, detektierbaren oder therapeutischen Mittel oder einem beliebigen anderen Molekül konjugiert oder rekombinant fusioniert. Die konjugierten oder rekombinant fusionierten Antikörper können z.B. zum Überwachen oder Prognostizieren des Ausbruchs, der Entstehung, des Fortschritts und/oder der Schwere einer hOX40L-vermittelten Krankheit im Rahmen eines klinischen Testverfahrens nützlich sein, z.B. zum Bestimmen der Wirksamkeit einer speziellen Therapie.

Eine solche Diagnose und Detektion kann z.B. durch Koppeln des Antikörpers mit detektierbaren Substanzen erreicht werden, wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, verschiedene Enzyme wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; prosthetische Gruppen wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; fluoreszierende Materialien wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocynat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phykoerythrin; lumineszierende Materialien wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Luminol; biolumineszierende Materialien wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Luciferase, Luciferin und Aequorin; radioaktive Materialien wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Iod (131I, 125I, 123I und 121I), Kohlenstoff (14C), Schwefel (35S), Tritium (3H), Indium (115In, 113In, 112In und 111In), Technetium (99Tc), Thallium (201Ti), Gallium (68Ga, 67Ga), Palladium (103Pd), Molybdän (99Mo), Xenon (133Xe), Fluor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn und 117Sn; und Positronen emittierende Metalle unter Verwendung von verschiedenen Positronenemissionstomographien und nicht radioaktive paramagnetische Metallionen.

Die vorliegende Erfindung schließt ferner Verwendungen der erfindungsgemäßen Antikörper ein, die mit einem therapeutischen Anteil (oder einem oder mehreren therapeutischen Anteilen) konjugiert oder rekombinant fusioniert sind. Der Antikörper kann mit einem therapeutischen Anteil, z.B. ein Zytotoxin, z.B. ein zytostatisches oder zelltötendes Mittel, ein Therapeutikum oder ein radioaktives Metallion, z.B. Alphastrahler, konjugiert oder rekombinant fusioniert sein. Ein Zytotoxin oder zytotoxisches Mittel schließt jedes Mittel ein, das für Zellen schädlich ist. Zu therapeutischen Anteilen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Antimetabolite (z.B. Methotrexat, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Cytarabin, 5-Fluorouracil, Decarbazin); Alkylierungsmittel (z.B. Mechlorethamin, Thioepachlorambucil, Melphalan, Carmustin (BCNU) und Lomustin (CCNU), Cyclothosphamid, Busulfan, Dibrommannitol, Streptozotocin, Mitomycin C und Cisdichlordiaminplatin (II) (DDP) und Cisplatin); Anthracycline (z.B. Daunorubicin (ehemals Daunomycin) und Doxorubicin); Antibiotika (z.B. Actinomycin D (ehemals Actinomycin), Bleomycin, Mithramycin und Anthramycin (AMC)); Auristatin-Moleküle (z.B. Auristatin PHE, Bryostatin 1 und Solastatin 10; siehe Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46: 3802–8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45: 3580–4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12: 735–40 (2001), Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 266: 76–80 (1999), Mohammad et al., Int. J. Oncol. 15: 367–72 (1999), alle hierin durch Bezugnahme eingeschlossen); Hormone (z.B. Glucocorticoide, Progestine, Androgene und Östrogene), DNA-Reparatur-Enzyminhibitoren (z.B. Etoposid oder Topotecan), Kinaseinhibitoren (z.B. Verbindung ST1571, Imatinib Mesylat (Kantarjian et al., Clin Cancer Res. 8(7): 2167–76 (2002)); zytotoxische Mittel (z.B. Paclitaxel, Cytochalasin B, Gramicidin D, Ethidiumbromid, Emetin, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Colchicin, Doxorubicin, Daunorubicin, Dihydroxyanthracindion, Mitoxantron, Mithramycin, Actinomycin D, 1-Dehydrotestosteron, Glucorticoide, Procain, Tetracain, Lidocain, Propranolol und Puromycin und Analoga oder Homologe davon und die in den US-Pat. Nr. 6,245,759, 6,399,633, 6,383,790, 6,335,156, 6,271,242, 6,242,196, 6,218,410, 6,218,372, 6,057,300, 6,034,053, 5,985,877, 5,958,769, 5,925,376, 5,922,844, 5,911,995, 5,872,223, 5,863,904, 5,840,745, 5,728,868, 5,648,239, 5,587,459) offenbarten Verbindungen; Farnesyltransferaseinhibitoren (z.B. R115777, BMS-214662, und die z.B. in den US-Pat. Nr. 6,458,935, 6,451,812, 6,440,974, 6,436,960, 6,432,959, 6,420,387, 6,414,145, 6,410,541, 6,410,539, 6,403,581, 6,399,615, 6,387,905, 6,372,747, 6,369,034, 6,362,188, 6,342,765, 6,342,487, 6,300,501, 6,268,363, 6,265,422, 6,248,756, 6,239,140, 6,232,338, 6,228,865, 6,228,856, 6,225,322, 6,218,406, 6,211,193, 6,187,786, 6,169,096, 6,159,984, 6,143,766, 6,133,303, 6,127,366, 6,124,465, 6,124,295, 6,103,723, 6,093,737, 6,090,948, 6,080,870, 6,077,853, 6,071,935, 6,066,738, 6,063,930, 6,054,466, 6,051,582, 6,051,574 und 6,040,305) offenbarten; Topoisomeraseinhibitoren (z.B. Camptothecin; Irinotecan; SN-38; Topotecan; 9-Aminocamptothecin; GG-211 (GI 147211); DX-8951f; IST-622; Rubitecan; Pyrazoloacridin; XR-5000; Saintopin; UCE6; UCE1022; TAN-1518A; TAN 1518B; KT6006; KT6528; ED-110; NB-506; ED-110; NB-506; und Rebeccamycin); Bulgarein; DNA Kleine-Furche-Binder wie Hoescht-Farbstoff 33342 und Hoechst-Farbstoff 33258; Nitidin; Fagaronin; Epiberberin; Coralyn; Beta-Lapachon; BC-4-1; Bisphosphonate (z.B. Alendronat, Cimadront, Clodronat, Tiludronat, Etidronat, Ibandronat, Neridronat, Olpandronat, Risedronat, Piridronat, Pamidronat, Zolendronat) HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren (z.B. Lovastatin, Simvastatin, Atorvastatin, Pravastatin, Fluvastatin, Statin, Cerivastatin, Lescol, Lupitor, Rosuvastatin und Atorvastatin); Antisense-Oligonucleotide (z.B. die in den US-Nr. 6,277,832, 5,998,596, 5,885,834, 5,734,033 und 5,618,709 offenbarten); Adenosindeaminaseinhibitoren (z.B. Fludarabinphosphat und 2-Chlordesoxyadenosin); Ibritumomabtiuxetan (Zevalin®); Tositumomab (Bexxar®)) und pharmazeutisch akzeptable Salze, Solvate, Clathrate und Prodrogen davon.

Ferner kann ein erfindungsgemäßer Antikörper mit einem therapeutischen Anteil oder Arzneimittelanteil, der eine bestimmte biologische Reaktion modifiziert, konjugiert oder rekombinant fusioniert werden. Therapeutische Anteile oder Arzneimittelanteile sind nicht so auf klassische chemische Therapeutika begrenzt auszulegen. Der Arzneimittelanteil kann beispielsweise ein Protein, Peptid oder Polypeptid sein, das eine gewünschte biologische Aktivität besitzt. Solche Proteine können z.B. Folgendes beinhalten: ein Toxin wie Abrin, Ricin A, Pseudomonas-Exotoxin, Choleratoxin oder Diphtherietoxin; ein Protein wie Tumornekrosefaktor, γ-Interferon, α-Interferon, Nervenwachstumsfaktor, von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor, Gewebeplasminogenaktivator, ein apoptotisches Mittel, z.B. TNF-γ, AIM I (siehe internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/33899), AIM II (siehe internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/34911), Fas-Ligand (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6: 1567–1574) und VEGF (siehe internationale Veröffentlichung Nr. WO 99/23105), ein Anti-Angiogenese-Mittel, z.B. Angiostatin, Endostatin oder eine Komponente des Koagulationspfades (z.B. Gewebefaktor); oder ein biologischer Reaktionsmodifizierer wie z.B. ein Lymphokin (z.B. Interferon-gamma, Interleukin-1 (“IL-1”), Interleukin-2 (“IL-2”), Interleukin-5 (“IL-5”), Interleukin-6 (“IL-6”), Interleukin-7 (“IL-7”), Interleukin 9 (“IL-9”), Interleukin-10 (“IL-10”), Interleukin-12 (“IL-12”), Interleukin-15 (“IL-15”), Interleukin-23 (“IL-23”), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (“GM-CSF”) und Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (“G-CSF”)) oder ein Wachstumsfaktor (z.B. Wachstumshormon (“GH”)) oder ein Koagulationsmittel (z.B. Calcium, Vitamin K, Gewebefaktoren wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Hageman-Faktor (Faktor XII), hochmolekulares Kininogen (HMWK), Prekallikrein (PK), Koagulationsproteine Faktor II (Prothrombin), Faktor V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, Phospholipid und Fibrinmonomer).

Die vorliegende Erfindung schließt erfindungsgemäße Antikörper ein, die mit einem heterologen Protein oder Polypeptid (oder Fragment davon, vorzugsweise ein Polypeptid mit etwa 10, etwa 20, etwa 30, etwa 40, etwa 50, etwa 60, etwa 70, etwa 80, etwa 90 oder etwa 100 Aminosäuren) rekombinant fusioniert oder chemisch konjugiert werden, um Fusionsproteine zu erzeugen. Insbesondere stellt die Erfindung Fusionsproteine bereit, die ein Antigenbindungsfragment oder einen erfindungsgemäßen Antikörper (z.B. ein Fab-Fragment, Fd-Fragment, Fv-Fragment, F(ab)2-Fragment, eine VH-Domäne, eine VH CDR, eine VL-Domäne oder eine VL CDR) und ein heterologes Protein, Polypeptid oder Peptid beinhalten. In einer Ausgestaltung ist das heterologe Protein, Polypeptid oder Peptid, mit dem der Antikörper fusioniert ist, dazu nützlich, den Antikörper auf einen speziellen Zelltyp zu richten, z.B. eine Zelle, die hOX40L oder einen hOX40L-Rezeptor exprimiert. Ein Antikörper, der sich spezifisch an einen Zelloberflächenrezeptor bindet, der durch einen speziellen Zelltyp (z.B. eine Immunzelle) exprimiert wird, kann beispielweise mit einem modifizierten Antikörper der Erfindung fusioniert oder konjugiert werden.

Ein konjugiertes oder Fusionsprotein der Erfindung beinhaltet einen beliebigen hierin beschriebenen Antikörper der Erfindung und ein heterologes Polypeptid. In einer Ausgestaltung beinhaltet ein konjugiertes oder Fusionsprotein der Erfindung die variablen Domänen eines in den Beispielen offenbarten Antikörpers und ein heterologes Polypeptid.

Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßer Antikörper mit therapeutischen Anteilen wie einem radioaktiven Metallion, wie Alphastrahler wie 213Bi oder makrozyklische Chelatoren, die zum Konjugieren von Radiometallionen wie, aber ohne darauf beschränkt zu sein, 131In, 131Lu, 131Y, 131Ho, 131Sm, mit Polypeptiden nützlich sind, mit therapeutischen Anteilen konjugiert werden. In bestimmten Ausgestaltungen ist der makrozyklische Chelator 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N′,N″,N″′-tetraessigsäure (DOTA), die über ein Linker-Molekül an dem Antikörper angebracht werden kann. Solche Linker-Moleküle sind in der Technik allgemein bekannt und in Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10): 2483–90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4): 553–7; und Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol., 26(8): 943–50, hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben.

Ferner können erfindungsgemäße Antikörper mit Markersequenzen wie einem Peptid zum Erleichtern der Reinigung fusioniert werden. In bevorzugten Ausgestaltungen ist die Markeraminosäuresequenz ein Hexahistidinpeptid wie unter anderem das in einem pQE-Vektor (QIAGEN, Inc.) bereitgestellte Tag, von denen viele im Handel erhältlich sind. Wie in Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821–824 beschrieben, bietet Hexahistidin zum Beispiel eine praktische Reinigung des Fusionsproteins. Zu anderen Peptid-Tags, die zur Reinigung nützlich sind, gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, das Hämagglutinin-(“HA”)-Tag, das einem Epitop entspricht, das von dem Influenza-Hämagglutininprotein abgeleitet ist (Wilson et al., 1984, Cell 37: 767), und das “FLAG”-Tag.

Verfahren zum Fusionieren oder Konjugieren von therapeutischen Anteilen (inkl. Polypeptide) mit Antikörpern sind gut bekannt (siehe z.B. Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Hrsg.), S. 243–56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2. Ausg.), Robinson et al. (Hrsg.), S. 623–53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (Hrsg.), S. 475–506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (Hrsg.), S. 303–16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119–58; US-Pat. Nr. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,723,125, 5,783,181, 5,908,626, 5,844,095, und 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; PCT-Veröffentlichungen WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 und WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535–10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331: 84–86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154: 5590–5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11337–11341, 1992, hierin in ihrer jeweiligen Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen.

Fusionsproteine können z.B. mit den Methoden des Gen-Shuffling, Motiv-Shuffling, Exon-Shuffling und/oder Codon-Shuffling (kollektiv “DNA-Shuffling” genannt) erzeugt werden. DNA-Shuffling kann angewendet werden, um die Aktivitäten von erfindungsgemäßen Antikörpern (z.B. Antikörper mit höheren Affinitäten und geringeren Dissoziationsraten) zu verändern (siehe allgemein US. Pat. Nr. 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252 und 5,837,458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724–33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76–82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287: 265–76; und Lorenzo und Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308–313 (jede(s) dieser Patente und Veröffentlichungen ist hiermit in ihrer/seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen). Antikörper oder kodierte Antikörper können verändert werden, indem sie einer Zufallsmutagenese durch fehlerbehaftete PCR, zufällige Nucleotidinsertion oder anderen Verfahren vor der Rekombination unterzogen werden. Ein Polynucleotid, das einen erfindungsgemäßen Antikörper kodiert, kann mit einer oder mehreren Komponenten, Motiven, Sektionen, Teilen, Domänen, Fragmenten usw. von einem oder mehreren heterologen Molekülen rekombiniert werden.

Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann außerdem mit einem zweiten Antikörper konjugiert werden, um ein Antikörperheterokonjugat wie im US-Pat. Nr. 4,676,980, das hierin in seiner Gesamheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben.

Der/das therapeutische Anteil oder Arzneimittel, der/das mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, der sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen bindet, konjugiert oder rekombinant fusioniert wird, sollte so gewählt werden, dass die gewünschte(n) prophylaktische(n) oder therapeutische(n) Wirkung(en) erzielt wird/werden. In bestimmten Ausgestaltungen ist der Antikörper ein modifizierter Antikörper. Ein Kliniker oder anderes medizinisches Personal sollte bei der Entscheidung darüber, welcher/welches therapeutische Anteil oder Arzneimittel mit einem erfindungsgemäßen Antikörper konjugiert oder rekombinant fusioniert werden soll, Folgendes berücksichtigen: die Art der Krankheit, die Schwere der Krankheit und die Verfassung des Subjekts.

Erfindungsgemäße Antikörper können auch an festen Trägern angebracht werden, die vor allem für Immunoassays oder die Reinigung des Zielantigens von Nutzen sind. Zu solchen festen Trägern gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Glas, Cellulose, Polyacrylamid, Nylon, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Polypropylen.

Pharmazeutische Zusammensetzungen

Die folgende Erörterung über Zusammensetzungen trifft auch auf Fragmente zu, so dass in der Offenbarung erwähnte Antikörper mutatis mutandis auch auf Fragmente der Erfindung zutreffen können.

Therapeutische Formulierungen, die einen oder mehrere hierin bereitgestellte Antikörper der Erfindung enthalten, können zur Aufbewahrung hergestellt werden, indem der Antikörper mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch akzeptablen Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen gemischt werden. Akzeptable Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und beinhalten Puffer wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien wie Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl oder Benzylalkohol; Alkylparabene wie Methyl- oder Propylparaben; Catechol; Resorcinol; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Cresol); niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, inkl. Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zucker wie Saccharose, Mannitol, Trehalose oder Sorbitol; salzbildende Gegenionen wie Natrium; Metallkomplexe (z.B. Zn-Protein-Komplexe); und/oder nichtionische Tenside wie TWEENTM, PLURONICSTM oder Polyethylenglykol (PEG).

Die hierin bereitgestellten erfindungsgemäßen Antikörper können z.B. auch in Liposomen formuliert werden. Liposomen, die das Molekül von Interesse enthalten, werden mit in der Technik bekannten Verfahren hergestellt, wie z.B. in Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030; und U.S. Pat. Nos. 4,485,045 und 4,544,545 beschrieben. Liposomen mit erhöhter Zirkulationszeit sind im US-Pat. Nr. 5,013,556 beschrieben.

Besonders nützliche Immunoliposomen können mit dem Umkehrphasenverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung erzeugt werden, die Phosphatidylcholin, Cholesterol und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) enthält.

Liposomen werden durch Filter mit definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem gewünschten Durchmesser zu erhalten. Fab′-Fragmente eines hierin bereitgestellten Antikörpers können mit den Liposomen wie in Martin et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 286–288 über eine Disulfidaustauschreaktion konjugiert werden. Ein Chemotherapeutikum (wie Doxorubicin) ist optional innerhalb des Liposoms enthalten; siehe Gabizon et al., (1989) J. National Cancer Inst. 81(19): 1484.

Formulierungen wie die hierin beschriebenen können auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, wie für die jeweilige behandelte Indikation erforderlich. In bestimmten Ausgestaltungen beinhalten Formulierungen einen erfindungsgemäßen Antikörper und eine oder mehrere aktive Verbindungen mit komplementären Aktivitäten, die sich nicht gegenseitig ungünstig beeinflussen. Solche Moleküle liegen geeigneterweise in Kombination in Mengen vor, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind. Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann beispielsweise mit einem oder mehreren anderen Therapeutika kombiniert werden. Eine solche kombinierte Therapie kann dem Patienten seriell oder gleichzeitig oder der Reihe nach verabreicht werden.

In einer Ausgestaltung beinhaltet die Kombination einen erfindungsgemäßen Anti-OX40L-Antikörper und ein weiteres Therapeutikum, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat Mofetil und Anti-CD28-Antikörpern, Anti-IL12/IL-23-Antikörpern (z.B. Ustekinumab), Anti-CD20-Antikörpern (z.B. Rituximab), Anti-CD30-Antikörpern (z.B. Brentuximab), CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), CCR5-Rezeptorantagonisten (z.B. Maraviroc), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-VLA4-Antikörpern (z.B. Natalizumab), Anti-LFA1-Antikörpern, Fludarabin, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Anti-CD45-Antikörpern, Cyclophosphamid, Anti-Thymozyten-Globulinen, Anti-Komplement-C5-Antikörpern (z.B. Eculizumab), Anti-a4b7-Integrin-Antikörpern (z.B. Vedolizumab), Anti-IL6-Antikörpern (z.B. Tocilizumab), Anti-IL2R-Antikörpern (z.B. Basilixumab), Anti-CD25-Antikörpern (z.B. Daclizumab), Anti-TNFa / TNFa-Fc-Molekülen (z.B. Etanercept, Adalimumab, Infliximab, Golimumab oder Certolizumab Pegol) und Vorinostat. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet die Kombination einen erfindungsgemäßen Anti-OX40L-Antikörper und ein weiteres Therapeutikum, das unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rapamycin (Sirolimus), Racrolimus, Ciclosporin, Corticosteroiden (z.B. Methylprednisolon), Methotrexat, Mycophenolat Mofetil, Anti-CD28-Antikörpern, CTLA4-Fc-Molekülen (z.B. Abatacept), Anti-CD40L-Antikörpern, Anti-LFA1-Antikörpern, Anti-CD52-Antikörpern (z.B. Alemtuzumab), Cyclophosphamid und Anti-Thymozyten-Globulinen.

Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann auch in einer Mikrokapsel, die z.B. mit Koazervierungsmethoden oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt wird, z.B. jeweils eine Hydroxymethylcellulose- oder Gelatinemikrokapsel und Poly-(methylmethacrylat)mikrokapsel, in kolloidalen Arzneimittelzuführungssystemen (z.B. Liposomen, Albuminmikrosphären, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen werden. Solche Methoden sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa offenbart.

Die für die In-vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen können steril sein. Dies wird ohne weiteres durch eine Filtration durch z.B. sterile Filtrationsmembranen erreicht.

Es können auch Präparate mit anhaltender Freisetzung hergestellt werden. Zu geeigneten Beispielen für Präparate mit anhaltender Freisetzung gehören halbdurchlässige Matrizen fester hydrophober Polymere, die den Antagonist enthalten, wobei die Matrizen in Form geformter Artikel, z.B. Folien oder Mikrokapsel, vorliegen. Beispiele für Matrizen mit anhaltender Freisetzung sind Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethyl-methacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Pat. Nr. 3,773,919), Copolymere von L-Glutaminsäure und Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylen-vinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie LUPRON DEPOTTM (injizierbare Mikrosphären, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat bestehen) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine für kürzere Zeiträume frei. Wenn eingekapselte Antikörper für lange Zeit im Körper bleiben, können sie infolge der Einwirkung von Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, so dass es zu einem Verlust biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen bei der Immunogenität kommt. Es können sinnvolle Strategien je nach dem involvierten Mechanismus entwickelt werden. Wird zum Beispiel festgestellt, dass der Aggregationsmechanismus die Bildung einer intermolekularen S-S-Bindung über Thiodisulfidaustausch ist, kann eine Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Regulieren des Feuchtigkeitsgehalts, Verwenden zweckmäßiger Additive und Entwickeln spezifischer Polymermatrixzusammensetzungen erreicht werden.

Die hierin bereitgestellten pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten therapeutisch wirksame Mengen von einem oder mehreren der hierin bereitgestellten erfindungsgemäßen Antikörper und optional ein oder mehrere zusätzliche prophylaktische oder therapeutische Mittel in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen sind bei Verhütung, Behandlung, Management oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit, wie eine entzündliche Darmkrankheit, Transplantatabstoßung, GvHD oder ein oder mehrere Symptome davon, von Nutzen.

Zu pharmazeutischen Trägern, die zum Verabreichen der hierin bereitgestellten Verbindungen geeignet sind, gehören Träger wie solche, die der Fachperson bekannt und für die jeweilige Verabreichungsweise geeignet sind.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Antikörper als einziger pharmazeutisch aktiver Inhaltsstoff in der Zusammensetzung formuliert werden oder sie können mit anderen aktiven Inhaltsstoffen (wie ein oder mehrere andere prophylaktische oder therapeutische Mittel) kombiniert werden.

Die Zusammensetzungen können ein oder mehrere erfindungsgemäße Antikörper enthalten. In einer Ausgestaltung werden die Antikörper zu geeigneten pharmazeutischen Präparaten wie Lösungen, Suspensionen, Tabletten, dispergierbare Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Formulierungen mit anhaltender Freisetzung oder Elixiere zur oralen Verabreichung oder zu sterilen Lösungen oder Suspensionen zur parenteralen Verabreichung sowie als transdermale Pflasterpräparate und Trockenpulverinhalatoren formuliert. In einer Ausgestaltung werden die oben beschriebenen Antikörper zu pharmazeutischen Zusammensetzungen mit in der Technik gut bekannten Methoden und Verfahren formuliert (siehe z.B. Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4. Ausg., S. 126).

In den Zusammensetzungen werden wirksame Konzentrationen von einem oder mehreren Antikörpern oder Derivaten davon mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger gemischt. Die Konzentrationen der Verbindungen in den Zusammensetzungen sind zur Lieferung einer Menge nach dem Verabreichen geeignet, die eine hOX40L-vermittelte Krankheit oder ein Symptom davon behandelt, verhütet oder bessert.

In einer Ausgestaltung werden die Zusammensetzungen für die Verabreichung einer einzelnen Dosierung formuliert. Zum Formulieren einer Zusammensetzung wird die Gewichtsfraktion der Verbindung in einem ausgewählten Träger in einer wirksamen Konzentration gelöst, suspendiert, dispergiert oder anderweitig gemischt, so dass der behandelte Zustand gelindert, verhütet oder ein oder mehrere Symptome gebessert wird/werden.

Ein erfindungsgemäßer Antikörper ist in dem pharmazeutisch akzeptablen Träger in einer wirksamen Menge enthalten, die ausreicht, um einen therapeutisch nützlichen Effekt ohne unerwünschte Nebenwirkungen bei dem behandelten Patienten zu bewirken. Die therapeutisch wirksame Konzentration kann empirisch bestimmt werden, indem die Verbindungen in In-vitro- und In-vivo-Systemen mit Routineverfahren getestet und davon dann Dosierungen für Menschen abgeleitet werden.

Die Antikörperkonzentration in der pharmazeutischen Zusammensetzung ist z.B. von den physikochemischen Charakteristiken des Antikörpers, dem Dosierungsplan und der verabreichten Menge sowie von anderen der Fachperson bekannten Faktoren abhängig.

In einer Ausgestaltung produziert eine therapeutisch wirksame Dosierung eine Antikörper-Serumkonzentration von etwa 0,1 ng/ml bis etwa 50–100 μg/ml. In einer anderen Ausgestaltung stellen die pharmazeutischen Zusammensetzungen eine Dosierung von etwa 0,001 mg bis etwa 2000 mg Antikörper pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag bereit. Es können pharmazeutische Dosierungseinheitsformen hergestellt werden, um etwa 0,01 mg, 0,1 mg oder 1 mg bis etwa 500 mg, 1000 mg oder 2000 mg und in einer Ausgestaltung etwa 10 mg bis etwa 500 mg des Antikörpers und/oder einer Kombination von anderen optionalen wesentlichen Inhaltsstoffen pro Dosierungseinheitsform bereitzustellen.

Der Antikörper kann auf einmal verabreicht werden oder er kann in eine Anzahl kleinerer Dosen unterteilt werden, die in Zeitabständen verabreicht werden. Es ist zu verstehen, dass die genaue Dosierung und Dauer der Behandlung von der behandelten Krankheit abhängig ist und empirisch mit bekannten Testprotokollen oder durch Extrapolation anhand In-vivo- oder In-vitro-Testdaten bestimmt werden kann. Es ist anzumerken, dass Konzentrationen und Dosierungswerte auch je nach der Schwere des zu lindernden Zustands variieren können. Es ist ferner zu verstehen, dass die spezifischen Dosierungspläne für ein bestimmtes Subjekt im Laufe der Zeit je nach dem individuellen Bedarf und dem professionellen Urteil der Person, die die Zusammensetzungen verabreicht oder deren Verabreichung überwacht, angepasst werden können und dass die hierin dargelegten Konzentrationsbereiche nur beispielhaft sind und den Umfang oder die Anwendung der beanspruchten Zusammensetzungen nicht begrenzen sollen.

Nach dem Mischen oder Zugeben des Antikörpers kann das resultierende Gemisch eine Lösung, Suspension, Emulsion oder dergleichen sein. Die Form des resultierenden Gemischs ist von einer Reihe von Faktoren abhängig, inkl. der beabsichtigten Verabreichungsweise und der Löslichkeit der Verbindung in dem ausgewählten Träger oder Vehikel. Die wirksame Konzentration reicht aus, um die Symptome der/des behandelten Krankheit, Störung oder Zustands zu bessern und kann empirisch bestimmt werden.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden zur Verabreichung an Menschen und Tiere in Einheitsdosierungsformen wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver, Körnchen, sterile parenterale Lösungen oder Suspensionen und orale Lösungen oder Suspensionen und Öl-Wasser-Emulsionen mit geeigneten Mengen der Verbindungen oder pharmazeutischen akzeptablen Derivate davon bereitgestellt. Der Antikörper wird in einer Ausgestaltung in Einheitsdosierungsformen oder Mehrfachdosierungsformen formuliert und verabreicht. Hierin verwendete Einheitsdosisformen beziehen sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die für menschliche und tierische Subjekte geeignet sind und einzeln verpackt werden, wie in der Technik bekannt ist. Jede Einheitsdosis enthält eine vorbestimmte Menge des Antikörpers, die ausreicht, um die gewünschte therapeutische Wirkung hervorzurufen, in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger, Vehikel oder Verdünnungsmittel. Beispiele für Einheitsdosisformen sind Ampullen und Spritzen und individuell verpackte Tabletten oder Kapseln. Einheitsdosisformen können in Fraktionen oder Vielfachen davon verabreicht werden. Eine Mehrfachdosisform beinhaltet mehrere identische Einheitsdosierungsformen, die in einem einzelnen Behälter verpackt und in getrennter Einheitsdosisform zu verabreichen sind. Beispiele für Mehrfachdosisformen schließen Phiolen, Flaschen mit Tabletten oder Kapseln oder Pint- oder Gallonen-Flaschen ein. Folglich beinhaltet eine Mehrfachdosisform mehrere Einheitsdosen, die nicht getrennt verpackt sind.

In bevorzugten Ausgestaltungen liegen ein oder mehrere Anti-hOX40L-Antikörper der Erfindung in einer flüssigen pharmazeutischen Formulierung vor. Flüssige pharmazeutisch verabreichbare Zusammensetzungen können z.B. durch Lösen, Dispergieren oder anderweitiges Mischen einer aktiven Verbindung wie oben definiert und optionaler pharmazeutischer Adjuvanzien in einem Träger wie z.B. Wasser, Salzlösung, wässrige Dextrose, Glycerol, Glykole, Ethanol und dergleichen hergestellt werden, um so eine Lösung oder Suspension zu bilden. Falls gewünscht, kann die zu verabreichende pharmazeutische Zusammensetzung auch geringfügige Mengen nicht toxischer Hilfsstoffe wie Benetzungsmittel, Emulgierungsmittel, Solubilisierungsmittel, pH-Puffermittel und dergleichen, z.B. Acetat, Natriumcitrat, Cyclodextrinderivate, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminnatriumacetat, Triethanolaminoleat, und andere solche Mittel enthalten.

Tatsächliche Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder leuchten der Fachperson ein; siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.

Es können Dosierungsformen oder Zusammensetzungen hergestellt werden, die Antikörper im Bereich von 0,005 % bis 100 % enthalten, wobei den Rest ein nicht toxischer Träger bildet. Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen sind der Fachperson bekannt.

Orale pharmazeutische Dosierungsformen sind entweder fest, gelig oder flüssig. Die festen Dosierungsformen sind Tabletten, Kapseln, Körnchen und Schüttpulver. Zu oralen Tablettenarten gehören komprimierte, kaubare Pastillen und Tabletten, die enterisch beschichtet, zuckerbeschichtet oder filmbeschichtet sein können. Kapseln können harte oder weiche Gelatinekapseln sein, während Körnchen oder Pulver in nicht sprudelnder oder sprudelnder Form mit der Kombination anderer Inhaltsstoffe bereitgestellt werden können, wie der Fachperson bekannt ist.

In bestimmten Ausgestaltungen sind die Formulierungen feste Dosierungsformen. In bestimmten Ausgestaltungen sind die Formulierungen Kapseln oder Tabletten. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, runden Tabletten und dergleichen können einen oder mehrere der folgenden Inhaltsstoffe oder Verbindungen ähnlicher Beschaffenheit enthalten: ein Bindemittel; ein Schmiermittel; ein Verdünnungsmittel; ein Fließregulierungsmittel; ein Zerfallsmittel; einen Farbstoff; einen Süßstoff; einen Aromastoff; ein Benetzungsmittel, eine emetische Beschichtung; und eine Filmbeschichtung. Beispiele für Bindemittel sind mikrokristalline Cellulose, Gummitragant, Glucoselösung, Akazienschleim, Gelatinelösung, Melasse, Polyvinylpyrrolidin, Povidon, Crospovidone, Saccharose und Stärkepaste. Schmiermittel beinhalten Talk, Stärke, Magnesium oder Calciumstearat, Lykopodium und Stearinsäure. Verdünnungsmittel beinhalten z.B. Lactose, Saccharose, Stärke, Kaolin, Salz, Mannitol und Dicalciumphosphat. Zu Fließregulierungsmitteln gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, kolloidales Siliziumdioxid. Zerfallsmittel beinhalten Crosscarmellose-Natrium, Natriumstärkeglykolat, Alginsäure, Maisstärke, Kartoffelstärke, Bentonit, Methylcellulose, Agar und Carboxymethylcellulose. Zu Farbstoffen gehören beispielsweise alle zugelassenen und zertifizierten wasserlöslichen FD- und C-Farbstoffe und Gemische davon; und wasserunlösliche FD-und C-Farbstoffe, suspendiert auf Aluminiumoxidhydrat. Süßstoffe beinhalten Saccharose, Lactose, Mannitol und künstliche Süßungsmittel wie Saccharin und alle möglichen sprühgetrockneten Aromen. Zu Aromastoffen gehören natürliche Aromen, die von Pflanzen wie Früchten extrahiert werden, und synthetische Mischungen von Verbindungen, die eine angenehme Wahrnehmung hervorrufen, wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Pfefferminze und Methylsalicylat. Benetzungsmittel beinhalten Propylenglykolmonostearat, Sorbitanmonooleat, Diethylenglykolmonolaurat und Polyoxyethylenlauralether. Zu emetischen Beschichtungen gehören Fettsäuren, Fette, Wachse, Schellack, ammonisierter Schellack und Celluloseacetatphthalate. Zu Filmbeschichtungen gehören Hydroxyethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Polyethylenglykol 4000 und Celluloseacetatphthalat.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können in einer Zusammensetzung bereitgestellt werden, die sie vor der sauren Umgebung des Magens schützt. Die Zusammensetzung kann beispielsweise in einer enterischen Beschichtung formuliert werden, die ihre Integrität im Magen aufrechterhält und die aktive Verbindung im Darm freisetzt. Die Zusammensetzung kann auch in Kombination mit einem Antazidum oder einem anderen solchen Inhaltsstoff formuliert werden.

Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, dann kann sie zusätzlich zu Material des obigen Typs einen flüssigen Träger wie ein Fettöl enthalten. Darüber hinaus können Dosierungseinheitsformen verschiedene andere Materialien enthalten, die die physikalische Form der Dosierungseinheit modifizieren, z.B. Beschichtungen aus Zucker und andere enterische Mittel. Die Verbindungen können auch als Komponente eines Elixiers, einer Suspension, eines Sirups, einer Oblate, eines Streupulvers, eines Kaugummis oder dergleichen verabreicht werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Saccharose als Süßstoff und bestimmte Konservierungsmittel, Farbstoffe und Färbemittel und Aromen enthalten.

Der Antikörper kann auch mit anderen aktiven Materialien gemischt werden, die die gewünschte Wirkung nicht beeinträchtigen, oder mit Materialien, die die gewünschte Wirkung ergänzen, wie Antazida, H2-Blocker und Diuretika. Der aktive Inhaltsstoff ist ein Antikörper oder pharmazeutisch akzeptables Derivat davon, wie hierin beschrieben. Es können höhere Konzentrationen eingeschlossen werden, bis zu etwa 98 Gew.-% des aktiven Inhaltsstoffs.

In allen Ausgestaltungen können Tabletten- und Kapselformulierungen, wie die Fachperson weiß, beschichtet werden, um die Auflösung des aktiven Inhaltsstoffs zu modifizieren oder zu unterstützen. Sie können somit z.B. mit einer herkömmlichen enterisch verdaubaren Beschichtung wie Phenylsalicylat, Wachse und Celluloseacetatphthalat beschichtet werden.

In bevorzugten Ausgestaltungen sind die Formulierungen flüssige Dosierungsformen. Flüssige orale Dosierungsformen beinhalten wässrige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Lösungen und/oder Suspensionen, rekonstituiert aus nicht sprudelnden Körnchen und sprudelnden Präparaten, rekonstituiert aus sprudelnden Körnchen. Wässrige Lösungen schließen z.B. Elixiere und Sirups ein. Emulsionen sind entweder Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl.

Elixiere sind klare, gesüßte, alkoholisch-wässrige Präparate. Pharmazeutisch akzeptable Träger, die in Elixieren verwendet werden, beinhalten Lösungsmittel. Sirups sind konzentrierte wässrige Lösungen eines Zuckers, z.B. Saccharose, und können ein Konservierungsmittel enthalten.

Eine Emulsion ist ein Zwei-Phasen-System, in dem eine Flüssigkeit in Form kleiner Kügelchen in einer anderen Flüssigkeit dispergiert ist. In Emulsionen verwendete pharmazeutisch akzeptable Träger sind nicht wässrige Flüssigkeiten, Emulgierungsmittel und Konservierungsmittel. Suspensionen verwenden pharmazeutisch akzeptable Suspendiermittel und Konservierungsmittel.

Pharmazeutisch akzeptable Substanzen, die in nicht sprudelnden Körnchen zum Rekonstituieren in einer flüssigen oralen Dosierungsform verwendet werden, schließen Verdünnungsmittel, Süßstoffe und Benetzungsmittel ein. Pharmazeutisch akzeptable Substanzen, die in sprudelnden Körnchen zum Rekonstituieren in einer flüssigen oralen Dosierungsform verwendet werden, schließen organische Säuren und eine Kohlendioxidquelle ein. Färbemittel und Aromastoffe werden in allen obigen Dosierungsformen verwendet.

Zu Lösungsmitteln gehören Glycerin, Sorbitol, Ethylalkohol und Sirup. Beispiele für Konservierungsmittel sind Glycerin, Methyl und Propylparaben, Benzoesäure, Natriumbenzoat und Alkohol. Zu Beispielen für nicht wässrige Flüssigkeiten, die in Emulsionen verwendet werden, gehören Mineralöl und Baumwollkernöl. Zu Beispielen für Emulgierungsmittel gehören Gelatine, Akazie, Traganth, Bentonit und Tenside wie Polyoxyethylensorbitanmonooleat. Suspendiermittel beinhalten Natriumcarboxymethylcellulose, Pektin, Traganth, Veegum und Akazie. Süßstoffe beinhalten Saccharose, Sirups, Glycerin und künstliche Süßstoffe wie Saccharin. Benetzungsmittel beinhalten Propylenglykolmonostearat, Sorbitanmonooleat, Diethylenglykolmonolaurat und Polyoxyethylenlaurylether. Organische Säuren beinhalten Zitronen- und Weinsäure. Kohlendioxdquellen beinhalten Natriumbicarbonat und Natriumcarbonat. Färbemittel beinhalten beliebige der zugelassenen und zertifizierten wasserlöslichen FD- und C-Farbstoffe und Gemische davon. Aromastoffe schließen natürliche Aromen, extrahiert von Pflanzen wie Früchten, und synthetische Mischungen von Verbindungen ein, die ein angenehmes Geschmacksempfinden hervorrufen.

Für eine feste Dosierungsform wird die Lösung oder Suspension z.B. in Propylencarbonat, Pflanzenölen oder Triglyceriden in einer Ausgestaltung in einer Gelatinekapsel eingekapselt. Solche Lösungen und deren Herstellung und Einkapselung sind in den US-Patenten Nr. 4,328,245; 4,409,239; und 4,410,545 offenbart. Für eine flüssige Dosierungsform kann die Lösung z.B. in einem Polyethylenglykol mit einer ausreichenden Menge eines pharmazeutisch akzeptablen flüssigen Trägers, z.B. Wasser, verdünnt werden, um für die Verabreichung leicht abgemessen zu werden.

Alternativ können flüssige oder halbfeste orale Formulierungen durch Lösen oder Dispergieren der/des aktiven Verbindung oder Salzes in Pflanzenölen, Glykolen, Triglyceriden, Propylenglykolestern (z.B. Propylencarbonat) und anderen solcher Träger und Einkapseln dieser Lösungen oder Suspensionen in harten oder weichen Gelatinekapselhüllen hergestellt werden. Andere nützliche Formulierungen beinhalten die in den US-Patenten Nr. RE28,819 und 4,358,603 dargelegten. Kurz gesagt, zu solchen Formulierungen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, solche, die Folgendes enthalten: eine hierin bereitgestellte Verbindung, ein dialkyliertes Mono- oder Polyalkylenglykol wie, aber ohne darauf beschränkt zu sein, 1,2-Dimethoxymethan, Diglyme, Triglyme, Tetraglyme, Polyethylenglykol-350-dimethylether, Polyethylenglykol-550-dimethylether, Polyethylenglykol-750-dimethylether, wobei sich 350, 550 und 750 auf das ungefähre durchschnittliche Molekülgewicht des Polyethylenglykols beziehen, und ein oder mehrere Antioxidantien wie butyliertes Hydroxytoluol (BHT), butyliertes Hydroxyanisol (BHA), Propylgallat, Vitamin E, Hydrochinon, Hydroxycumarine, Ethanolamin, Lecithin, Cephalin, Ascorbinsäure, Apfelsäure, Sorbitol, Phosphorsäure, Thiodipropionsäure und ihre Ester und Dithiocarbamate.

Zu anderen Formulierungen gehören wässrige alkoholische Lösungen wie ein pharmazeutisch akzeptables Acetal. Die in diesen Formulierungen verwendeten Alkohole sind beliebige pharmazeutisch akzeptable wassermischbare Lösungsmittel mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen wie, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Propylenglykol und Ethanol. Zu Acetalen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, (Di(Niederalkyl)acetale niederer Alkylaldehyde wie Acetaldehyddiethylacetal.

Eine durch eine Injektion, entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös, gekennzeichnete parenterale Verabreichung ist in einer Ausgestaltung ebenfalls hierin vorgesehen. Injektionsmittel können in herkömmlicher Form, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, oder als Emulsionen hergestellt werden. Die Injektionsmittel, Lösungen und Emulsionen enthalten auch einen oder mehrere Exzipienten. Geeignete Exzipienten sind z.B. Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerol oder Ethanol. Darüber hinaus können die zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzungen, falls gewünscht, auch geringfügige Mengen nicht toxischer Hilfssubstanzen wie Benetzungs- oder Emulgierungsmittel, pH-Puffermittel, Stabilisatoren, Löslichkeitsverbesserer und andere solche Mittel, wie z.B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat und Cyclodextrine, enthalten.

Die Implantation eines Systems mit langsamer Freisetzung oder anhaltender Freisetzung, so dass ein konstantes Dosierungsniveau beibehalten wird (siehe z.B. US-Pat. Nr. 3,710,795), ist ebenfalls hierin vorgesehen. Kurz gesagt, eine hierin bereitgestellte Verbindung wird in einer festen inneren Matrix dispergiert, z.B. Polymethylmethacrylat, Polybutylmethacrylat, plastifiziertes oder nicht plastifiziertes Polyvinylchlorid, plastifiziertes Nylon, plastifiziertes Polyethylenterephthalat, Naturkautschuk, Polyisopren, Polyisobutylen, Ppolybutadien, Polyethylen, Ethylen-Vinylacetat-Copolymere, Silikonkautschuk, Polydimethylsiloxane, Silikon-Carbonat-Copolymere, hydrophile Polymere wie Hydrogele von Acryl- und Methacrylsäureestern, Kollagen, vernetzter Polyvinylalkohol und vernetztes, teilweise hydrolysiertes Polyvinylacetat, das von einer äußeren Polymermembran umgeben ist, z.B. Polyethylen, Polypropylen, Ethylen/Propylen-Copolymere, Ethylen/Ethylacrylat-Copolymere, Ethylen/Vinylacetat-Copolymere, Silikonkautschuk, Polydimethylsiloxane, Neoprenkautschuk, chloriertes Polyethylen, Polyvinylchlorid, Vinylchloridcopolymere mit Vinylacetat, Vinylidenchlorid, Ethylen und Propylen, Ionomer-Polyethylenterephthalat, Butylkautschuk, Epichlorhydrinkautschuk, Ethylen/Vinylalkohol-Copolymer, Ethylen/Vinylacetat/Vinylalkohol-Terpolymer und Ethylen/Vinyloxyethanol-Copolymer, die in Körperflüssigkeiten unlöslich ist. Der Antikörper diffundiert durch die äußere Polymermembran in einem Schritt mit Regulierung der Freisetzungsrate. Die Menge des in solchen parentalen Zusammensetzungen enthaltenen Antikörpers ist stark von dessen spezifischer Beschaffenheit sowie von der Aktivität der Verbindung und den Bedürfnissen des Subjekts abhängig.

Präparate zur parenteralen Verabreichung beinhalten injektionsfertige sterile Lösungen, sterile trockene lösliche Produkte wie lyophilisierte Pulver, die für eine Kombination mit einem Lösungsmittel kurz vor der Verwendung bereit sind, inkl. hypodermischer Tabletten, injektionsfertige sterile Suspensionen, sterile trockene unlösliche Produkte, die für eine Kombination mit einem Vehikel kurz vor der Verwendung bereit sind, und sterile Emulsionen. Die Lösungen können wässrig oder nichtwässrig sein.

Bei intravenöser Verabreichung beinhalten geeignete Träger physiologische Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) sowie Lösungen mit Verdickungs- und Solubilisierungsmitteln wie Glucose, Polyethylenglykol und Polypropylenglykol und Gemische davon.

In parenteralen Präparaten verwendete pharmazeutisch akzeptable Träger beinhalten wässrige Vehikel, nicht wässrige Vehikel, antimikrobielle Mittel, isotonische Mittel, Puffer, Antioxidantien, Lokalanästhetika, Suspendier- und Dispergiermittel, Emulgierungsmittel, Sequestiermittel oder Chelatbildner und andere pharmazeutisch akzeptable Substanzen.

Beispiele für wässrige Vehikel sind Natriumchloridinjektion, Ringer-Injektion, isotonische Dextroseinjektion, sterile Wasserinjektion, Dextrose- und laktierte Ringerinjektion. Nicht wässrige parenterale Vehikel beinhalten Fettöle pflanzlichen Ursprungs, Baumwollkernöl, Maisöl, Sesamöl und Erdnussöl. Antimikrobielle Mittel in bakteriostatischen oder fungistatischen Konzentrationen können zu parenteralen Präparaten gegeben werden, die in Mehrfachdosisbehältern verpackt sind, und beinhalten Phenole oder Kresole, Quecksilberverbindungen, Benzylalkohol, Chlorbutanol, Methyl-und Propyl p-hydroxybenzoesäureester, Thimerosal, Benzalkoniumchlorid und Benzethoniumchlorid. Isotonische Mittel schließen Natriumchlorid und Dextrose ein. Zu Puffern gehören Phosphat und Citrat. Zu Antioxidantien gehört Natriumbisulfat. Lokalanästhetika schließen Procain-Hydrochlorid ein. Suspendier- und Dispergiermittel schließen Natriumcarboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Polyvinylpyrrolidon ein. Zu Emulgierungsmitteln gehören Polysorbat 80 (TWEEN® 80). Ein Sequestiermittel oder Chelatbildner von Metallionen schließt EDTA ein. Zu pharmazeutischen Trägern gehören außerdem Ethylalkohol, Polyethylenglykol und Propylenglykol für wassermischbare Vehikel; und Natriumhydroxid, Chlorwasserstoffsäure, Zitronensäure oder Milchsäure zur pH-Wert-Einstellung.

Die Konzentration der pharmazeutisch aktiven Verbindung wird so eingestellt, dass eine Injektion eine wirksame Menge liefert, um den gewünschten pharmakologischen Effekt hervorzurufen. Die genaue Dosis ist von Alter, Gewicht und Verfassung des Patienten oder Tieres abhängig, wie in der Technik bekannt ist.

Das parenterale Einheitsdosispräparat kann in einer Ampulle, einer Phiole oder einer Spritze mit einer Nadel verpackt werden. Alle Präparate für die parenterale Verabreichung können steril sein, wie in der Technik bekannt ist und praktiziert wird.

Illustrativ ist die intravenöse oder intraarterielle Infusion einer sterilen wässrigen Lösung, die eine aktive Verbindung enthält, eine wirksame Verabreichungsweise. Eine andere Ausgestaltung ist eine sterile wässrige oder ölige Lösung oder Suspension, die ein aktives Material enthält, das zum Hervorrufen der gewünschten pharmakologischen Wirkung notwendig ist.

Injektionsmittel sind zur lokalen und systemischen Verabreichung vorgesehen. In einer Ausgestaltung ist eine therapeutisch wirksame Dosierung so formuliert, dass sie eine Konzentration von wenigstens etwa 0,1 % w/w bis zu etwa 90 % w/w oder mehr enthält, in bestimmten Ausgestaltungen mehr als 1 % w/w der aktiven Verbindung bezogen auf das/die behandelte(n) Gewebe.

Der Antikörper kann in mikronisierter oder anderer geeigneter Form suspendiert werden. Die Form des resultierenden Gemischs ist von einer Reihe von Faktoren abhängig, einschließlich der beabsichtigten Verabreichungsweise und der Löslichkeit der Verbindung in dem ausgewählten Träger oder Vehikel. Die effektive Konzentration ist zur Besserung der Symptome des Zustands ausreichend und kann empirisch bestimmt werden.

In anderen Ausgestaltungen sind die pharmazeutischen Formulierungen lyophilisierte Pulver, die zur Verabreichung als Lösungen, Emulsionen und andere Gemische rekonstituiert werden können. Sie können auch als Feststoffe oder Gele rekonstituiert und formuliert werden.

Das lyophilisierte Pulver wird durch Lösen eines hierin bereitgestellten Antikörpers oder eines pharmazeutisch akzeptablen Derivats davon in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt. In einigen Ausgestaltungen ist das lyophilisierte Pulver steril. Das Lösungsmittel kann einen Exzipienten enthalten, der die Stabilität verbessert, oder eine andere pharmakologische Komponente des Pulvers oder der rekonstituierten Lösung, die aus dem Pulver hergestellt wird. Zu verwendbaren Exzipienten gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Dextrose, Sorbital, Fructose, Maissirup, Xylitol, Glycerin, Glucose, Saccharose oder ein anderes geeignetes Mittel. Das Lösungsmittel kann auch einen Puffer enthalten, wie Citrat, Natrium- oder Kaliumphosphat, oder einen anderen solchen der Fachperson bekannten Puffer, in einer Ausgestaltung mit einem in etwa neutralen pH-Wert. Eine anschließende Sterilfiltration der Lösung, gefolgt von einer Lyophilisation unter der Fachperson bekannten Standardbedingungen erbringt die gewünschte Formulierung. In einer Ausgestaltung wird die resultierende Lösung in Phiolen zur Lyophilisierung verteilt. Jede Phiole enthält eine einzelne Dosierung oder Mehrfachdosierungen der Verbindung. Das lyophilisierte Pulver kann unter zweckmäßigen Bedingungen, wie etwa 4°C bis Raumtemperatur, aufbewahrt werden.

Eine Rekonstitution dieses lyophilisierten Pulvers mit Wasser für Injektionszwecke liefert eine Formulierung zur Verwendung bei der parenteralen Verabreichung. Zur Rekonstitution wird das lyophilisierte Pulver zu sterilem Wasser und einem anderen geeigneten Träger gegeben. Die genaue Menge ist von der ausgewählten Verbindung abhängig. Eine solche Menge kann empirisch bestimmt werden.

Topische Gemische werden wie für die lokale und systemische Verabreichung beschrieben hergestellt. Das resultierende Gemisch kann eine Lösung, Suspension, Emulsion oder dergleichen sein und als Creme, Gel, Salbe, Emulsion, Lösung, Elixier, Lotion, Suspension, Tinktur, Paste, Schaum, Aerosol, Spülung, Spray, Zäpfchen, Verband, Hautpflaster oder eine beliebige andere Formulierung formuliert werden, die für die topische Verabreichung geeignet ist.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können als Aerosole für die topische Anwendung, z.B. durch Inhalation, formuliert werden (siehe z.B. US-Pat. Nr. 4,044,126, 4,414,209 und 4,364,923, die Aerosole zur Zuführung eines Steroids beschreiben, das für die Behandlung von Entzündungserkrankungen, insbesondere Asthma, nützlich ist). Diese Formulierungen zur Verabreichung an die Atemwege können in Form eines Aerosols oder einer Lösung für einen Nebulisator oder als mikrofeines Pulver für Insufflationen allein oder in Kombination mit einem inerten Träger wie Lactose vorliegen. In diesem Fall haben die Partikel der Formulierung in einer Ausgestaltung einen Durchmesser von weniger als 50 Mikron, in einer Ausgestaltung von weniger als 10 Mikron.

Die Verbindungen können für die lokale oder topische Anwendung formuliert werden, z.B. für die topische Anwendung auf der Haut und den Schleimhäuten, z.B. im Auge, in Form von Gelen, Cremes und Lotionen, und zur Anwendung am Auge oder für eine intrazisternale oder intraspinale Anwendung. Die topische Verabreichung ist für eine transdermale Zuführung und auch für eine Verabreichung am Auge oder an der Schleimhaut oder für Inhalationstherapien vorgesehen. Es können auch Nasenlösungen der aktiven Verbindung allein oder in Kombination mit anderen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten verabreicht werden.

Diese Lösungen, vor allem solche, die für den opthalmischen Gebrauch vorgesehen sind, können als 0,01 %–10 % isotonische Lösungen, pH etwa 5–7, mit zweckmäßigen Salzen formuliert werden.

Andere Verabreichungsrouten, wie transdermale Pflaster, die iontophoretische und elektrophoretische Vorrichtungen beinhalten, und rektale Verabreichungen sind ebenfalls hierin vorgesehen.

Transdermale Pflaster, inkl. iontophoretischer und elektrophoretischer Vorrichtungen, sind der Fachperson gut bekannt. Solche Pflaster sind z.B. in den US-Pat. Nr. 6,267,983, 6,261,595, 6,256,533, 6,167,301, 6,024,975, 6,010715, 5,985,317, 5,983,134, 5,948,433 und 5,860,957 offenbart.

Pharmazeutische Dosierungsformen für die rektale Verabreichung sind z.B. rektale Suppositorien, Kapseln und Tabletten für eine systemische Wirkung. Hierin verwendete rektale Suppositorien sind feste Körper zum Einfügen in das Rektum, die bei Körpertemperatur schmelzen oder weich werden und einen oder mehrere pharmakologisch oder therapeutisch aktive Inhaltsstoffe freisetzen. Pharmazeutisch akzeptable Substanzen, die in rektalen Suppositorien verwendet werden, sind Basen oder Vehikel und Mittel zum Erhöhen des Schmelzpunktes. Zu Beispielen für Basen gehören Kakaobutter (Theobroma-Öl), Glycerin-Gelatine, Carbowachs (Polyoxyethylenglykol) und zweckmäßige Gemische aus Mono-, Di- und Triglyceriden von Fettsäuren. Es können Kombinationen der verschiedenen Basen verwendet werden. Mittel zum Erhöhen des Schmelzpunktes von Suppositorien sind Walrat und Wachs. Rektale Suppositorien können entweder mit einem Komprimierungsverfahren oder Formverfahren hergestellt werden. Das Gewicht eines rektalen Suppositoriums beträgt in einer Ausgestaltung etwa 2 bis 3 g.

Tabellen und Kapseln für die rektale Verabreichung können mit der gleichen pharmazeutisch akzeptablen Substanz und mit den gleichen Verfahren wie für Formulierungen für die orale Verabreichung hergestellt werden.

Die hierin bereitgestellten Antikörper und anderen Zusammensetzungen können auch so formuliert werden, dass sie auf ein(en) spezielles/n Gewebe, Rezeptor oder auf einen anderen Bereich des Körpers des zu behandelnden Subjekts gerichtet (Targeting) werden. Viele solcher Targeting-Verfahren sind der Fachperson gut bekannt. Alle diese Targeting-Verfahren sind hierin zur Anwendung mit den vorliegenden Zusammensetzungen vorgesehen. Nicht begrenzende Beispiele für Targeting-Verfahren sind in den US-Pat. Nr. 6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751, 6,071,495, 6,060,082, 6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900,252, 5,840,674, 5,759,542 und 5,709,874 enthalten. In einigen Ausgestaltungen werden die Anti-hOX40L-Antikörper der Erfindung auf das Kolon gerichtet (oder anderweitig verabreicht), wie z.B. bei einem Patienten, der eine CED hat oder dafür gefährdet ist. In einigen Ausgestaltungen werden die erfindungsgemäßen Anti-hOX40L-Antikörper auf das Auge gerichtet (oder anderweitig verabreicht), wie bei einem Patienten, der Uveitis hat oder dafür gefährdet ist.

In einer Ausgestaltung können liposomale Suspensionen, inkl. gewebegerichteter Liposomen, wie z.B. tumorgerichtete Liposomen, ebenfalls als pharmazeutisch akzeptable Träger geeignet sein. Diese können mit der Fachperson bekannten Verfahren hergestellt werden. Liposomformulierungen können z.B. wie im US-Pat. Nr. 4,522,811 beschrieben hergestellt werden. Kurz gesagt, Liposomen wie multilamelläre Vesikel (MLVs) können durch Trocknen von Ei-Phosphatidylcholin und Gehirn-Phosphatidylserin (Molverhältnis 7:3) auf der Innenseite eines Kolbens gebildet werden. Eine Lösung einer hierin bereitgestellten Verbindung in phosphatgepufferter Salzlösung, der zweiwertige Kationen fehlen (PBS), wird zugegeben und der Kolben wird geschüttelt, bis der Lipidfilm dispergiert ist. Die resultierenden Vesikel werden gewaschen, um nicht eingekapselte Verbindung zu entfernen, durch Zentrifugation pelletiert und dann in PBS resuspendiert.

Verabreichungs- und Dosierungsverfahren

Die vorliegende Erfindung stellt ferner Zusammensetzungen bereit, die einen oder mehrere Antikörper oder Fragmente der Erfindung zur Verwendung bei Verhütung, Management, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit (oder einem Symptom davon) beinhalten. Die Erörterung mit Bezug auf Antikörper trifft mutatis mutandis auch auf Fragmente der Erfindung zu. Alternativ stellt die vorliegende Erfindung ferner Zusammensetzungen bereit, die einen oder mehrere Antikörper oder Fragmente der Erfindung zur Verwendung bei Verhütung, Management, Behandlung und/oder Besserung einer OX40L-vermittelten Krankheit (oder einem Symptom davon) bei einem Subjekt beinalten, wobei der OX40L nicht human ist (z.B. canin, felin, equin, bovin, ovin oder porcin) und das Subjekt jeweils ein Hund, eine Katze, ein Pferd, eine Kuh, ein Schaf oder ein Schwein ist.

In bestimmten Ausgestaltungen werden hierin Zusammensetzungen bereitgestellt, die einen oder mehrere erfindungsgemäße Antikörper zur Verwendung bei Verhütung, Management, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit wie CED (z.B. Colitis ulcerosa oder Crohn-Krankheit) oder eines Symptoms davon beinhalten. CED-Symptome können je nach dem beteiligten Darmkanal von schwach bis schwer reichen. Zu beispielhaften Symptomen von CED gehören Bauchkrämpfe und -schmerzen, blutiger Durchfall, dringendes Stuhlgangbedürfnis, Fieber, Appetitverlust, Gewichtsverlust, Anämie, Müdigkeit und/oder Geschwüre an den Schenkeln, Fußknöcheln, Waden, Oberschenkel und Armen. Zu beispielhaften intestinalen Komplikationen von CED gehören eine profuse Blutung von den Geschwüren, Perforation oder Ruptur des Darms, Strikturen und Verstopfung, Fisteln (anomale Passage) und perianale Erkrankung, toxisches Megakolon (z.B. akute nicht obstruktive Dilatation des Kolons) und/oder Malignom (z.B. Kolon- oder Dünndarmkrebs). Zu beispielhaften extraintestinalen Komplikationen von CED gehören Arthritis, Hautleiden, Augenentzündung, Leber- und Nierenstörungen und/oder Knochenverlust. Jede beliebige Kombination dieser Symptome kann mit den hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und Verfahren verhütet, bewältigt, behandelt und/oder gebessert werden.

In bestimmten Ausgestaltungen werden hierin Zusammensetzungen bereitgestellt, die einen oder mehrere erfindungsgemäße Antikörper zur Verwendung bei Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit wie GVHD oder eines Symptoms davon beinhalten. GVHD tritt im Allgemeinen nach allogenen oder abgestimmten unverwandten Knochenmarktransplantationen (BMT) auf.

In einigen Ausgestaltungen ist die GVHD eine akute GVHD. Die Symptome der akuten GVHD können rasch auftreten und leicht oder schwer sein. In bestimmten Fällen entsteht eine akute GVHD innerhalb von etwa drei Monaten nach der Transplantation, wenn sich z.B. das Blutbild nach der Transplantation erholt. In bestimmten Fällen wirkt sich die akute GVHD auf die Haut, den Magen- Darm-(GI)-Trakt und/oder die Leber aus. Bei einigen Patienten beginnt die akute Haut-GVHD z.B. mit einem Ausschlag auf den Handflächen des Patienten, den Fußsohlen oder Schultern. Der Ausschlag kann jedoch großflächig werden und juckend und schmerzhaft sein und/oder Blasen werfen und zu einer Ablösung führen. Die akute Leber-GVHD kann sich auf die normalen Funktionen der Leber, z.B. die Leberenzyme, auswirken und wiederum Gelbsucht verursachen. Die akute Leber-GVHD kann auch dazu führen, dass der Bauchraum aufbläht und schmerzhaft wird, wenn sich die Leber vergrößert. Schließlich können die Symptome der akuten Bauch-GVHD (oder GVHD des Verdauungssystems) Durchfall, Schleim oder Blut im Stuhl, Krämpfe oder Bauchschmerzen, Verdauungsstörungen, Übelkeit und/oder Appetitverlust beinhalten. Andere allgemeine Symptome der akuten GVHD können Anämie, leichtes Fieber und/oder eine Infektionsanfälligkeit beinhalten. Jede beliebige Kombination dieser Symptome der akuten GVHD kann mit den hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und Verfahren verhütet, bewältigt, behandelt und/oder gebessert werden.

In anderen Ausgestaltungen ist die GVHD eine chronische GVHD. Die chronische GVHD kann etwa drei Monate bis etwa ein Jahr oder länger nach der Transplantation auftreten. Die chronische GVHD kann leicht oder schwer sein und beinhaltet im Allgemeinen Symptome, die denen der akuten GVHD ähnlich sind. Die chronische GVHD kann sich auf die Haut und das Verdauungssystem, inkl. der Leber, auswirken, kann aber auch andere Organe und das Immunsystem (z.B. so dass der Patient infektionsanfälliger wird) und/oder Bindegewebe einbeziehen. Symptome der chronischen Haut-GVHD können Ausschlag, trockene Haut, gespannte Haut, juckende Haut, Verdunklung der Hautfarbe, Verdickung der Haut beinhalten und/oder Haare (z.B. Haarausfall, Ergrauung) oder Nägel (z.B. harte oder brüchige Nägel) betreffen. Die chronische Darm-GVHD kann sich auf das Verdauungssystem, den Mund, die Speiseröhre, die Magenschleimhaut und/oder die Darmschleimhaut auswirken und die Symptome können Durchfall, Mundtrockenheit und -entzündung, Schmerzen beim Schlucken, eine geringe Nährstoffabsorption durch den Magen, Völlegefühl, Magenkrämpfe beinhalten. Die chronische Leber-GVHD kann zu einer Schädigung und Vernarbung der Leber (Zirrhose) führe. Die chronische GVHD der Augen kann sich auf die Drüsen auswirken, die die Tränen bilden, so dass die Augen trocken werden, brennen und schmerzen oder empfindlich gegenüber hellem Licht werden. Die chronische Lungen-GVHD kann Kurzatmigkeit, Pfeifen, hartnäckigen Husten und/oder eine Anfälligkeit für Brustkorbinfektionen bewirken. Die chronische GVHD wirkt sich auf die Sehnen aus (z.B. Entzündung), die Muskeln und Knochen verbinden, so dass das Strecken und Beugen der Arme und Beine erschwert wird. Jede beliebige Kombination dieser Symptome der chronischen GVHD kann mit den hierin bereitgestellten Zusammensetzungen und Verfahren verhütet, bewältigt, behandelt und/oder gebessert werden.

In bestimmten Ausgestaltungen werden hierin Zusammensetzungen bereitgestellt, die einen oder mehrere erfindungsgemäße Antikörper zur Verwendung bei Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit, wie Uveitis, oder eines Symptoms davon beinhalten.

In bestimmten Ausgestaltungen werden hierin Zusammensetzungen bereitgestellt, die einen oder mehrere erfindungsgemäße Antikörper zur Verwendung bei Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit wie Pyoderma gangrenosum, Riesenzellarteriitis, Schnitzler-Syndrom oder nicht infektiöse Skleritis beinhalten.

In bestimmten Ausgestaltungen werden hierin Zusammensetzungen bereitgestellt, die einen oder mehrere erfindungsgemäße Antikörper zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer/eines hOX40L-vermittelten Krankheit oder Zustands beinhalten, ausgewählt aus einer/einem Autoimmunkrankheit oder -zustand, einer systemischen Entzündungskrankheit oder -zustand oder einer Transplantatabstoßung; z.B. entzündliche Darmkrankheit (CED), Crohn-Krankheit, Rheumatoidarthritis, Transplantatabstoßung, allogene Transplantatabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GvHD), Colitis ulcerosa, systemischer Lupus erythematodes (SLE), Diabetes, Uveitis, Spondylitis ankylosans, Kontakthyperempfindlichkeit, multiple Sklerose und Atherosklerose, insbesondere GvHD.

In einer bestimmten Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit die OX40L-Bindungsstellen eines erfindungsgemäßen Antikörpers, z.B. einen in den Beispielen offenbarten Antikörper.

In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VH-Domänen mit einer Aminosäuresequenz von einer der VH-Domänen in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 34, Seq ID Nr. 66 oder Seq ID Nr. 94, insbesondere Seq ID Nr. 34) beinhalten. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VH CDR1s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VH CDR1s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 36, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 68, Seq ID Nr. 74, Seq ID Nr. 96 oder Seq ID Nr. 102, insbesondere Seq ID Nr. 36 oder Seq ID Nr.42) beinhalten. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VH CDR2s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VH CDR2s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 6, Seq ID Nr. 12, Seq ID Nr. 38, Seq ID Nr. 44, Seq ID Nr. 70, Seq ID Nr. 76, Seq ID Nr. 98 oder Seq ID Nr. 104, insbesondere Seq ID Nr. 38 oder Seq ID Nr. 44) beinhalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VH CDR3s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VH CDR3s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 8, Seq ID Nr. 14, Seq ID Nr. 40, Seq ID Nr. 46, Seq ID Nr. 72, Seq ID Nr. 78, Seq ID Nr. 100 oder Seq ID Nr. 106, insbesondere Seq ID Nr. 40 oder Seq ID Nr. 46) beinhalten.

In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VL-Domänen mit einer Aminosäuresequenz von einer der VL-Domänen in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 16, Seq ID Nr. 48, Seq ID Nr. 80 oder Seq ID Nr. 108, insbesondere Seq ID Nr. 48) beinhalten (die optional auch die kognate VH-Domäne wie in der Sequenzauflistung aufgeführt (d.h. Seq ID Nr. 2/16, Seq ID Nr. 34/48, Seq ID Nr. 66/80 oder Seq ID Nr. 94/108, insbesondere Seq ID Nr. 34/48) beinhaltet). In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VL CDR1s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VL CDR1s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 50, Seq ID Nr. 56, Seq ID Nr. 82, Seq ID Nr. 88, Seq ID Nr. 110 oder Seq ID Nr. 116, insbesondere Seq ID Nr. 50 oder Seq ID Nr. 56) beinhalten. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VL CDR2s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VL CDR2s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 26, Seq ID Nr. 52, Seq ID Nr. 58, Seq ID Nr. 84, Seq ID Nr. 90, Seq ID Nr. 112 oder Seq ID Nr. 118, insbesondere Seq ID Nr. 52 oder Seq ID Nr. 58) beinhalten. In einer bevorzugten Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VL CDR3s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VL CDR3s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 28, Seq ID Nr. 54, Seq ID Nr. 60, Seq ID Nr. 86, Seq ID Nr. 92, Seq ID Nr. 114 oder Seq ID Nr. 120, insbesondere Seq ID Nr. 54 oder Seq ID Nr. 60) beinhalten.

In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VH-Domänen mit einer Aminosäuresequenz von einer der VH-Domänen in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 2, Seq ID Nr. 34, Seq ID Nr. 66 oder Seq ID Nr. 94, insbesondere Seq ID Nr. 34) und eine oder mehrere VL-Domänen mit einer Aminosäuresequenz nach einem der VL-Domänen in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 16, Seq ID Nr. 48, Seq ID Nr. 80 oder Seq ID Nr. 108, insbesondere Seq ID Nr. 48) beinhalten.

In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VH CDR1s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VH CDR1s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 36, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 68, Seq ID Nr. 74, Seq ID Nr. 96 oder Seq ID Nr. 102, insbesondere Seq ID Nr. 36 oder Seq ID Nr. 42) und eine oder mehrere VL CDR1s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VL CDR1s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 18, Seq ID Nr. 24, Seq ID Nr. 50, Seq ID Nr. 56, Seq ID Nr. 82, Seq ID Nr. 88, Seq ID Nr. 110 oder Seq ID Nr. 116, insbesondere Seq ID Nr. 50 oder Seq ID Nr. 56) beinhaltet. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VH CDR1s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VH CDR1s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 36, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 68, Seq ID Nr. 74, Seq ID Nr. 96 oder Seq ID Nr. 102, insbesondere Seq ID Nr. 36 oder Seq ID Nr. 42) und eine oder mehrere VL CDR2s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VL CDR2s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 20, Seq ID Nr. 26, Seq ID Nr. 52, Seq ID Nr. 58, Seq ID Nr. 84, Seq ID Nr. 90, Seq ID Nr. 112 oder Seq ID Nr. 118, insbesondere Seq ID Nr. 52 oder Seq ID Nr. 58) beinhalten. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit einen oder mehrere Antikörper, die eine oder mehrere VH CDR1s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VH CDR1s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 4, Seq ID Nr. 10, Seq ID Nr. 36, Seq ID Nr. 42, Seq ID Nr. 68, Seq ID Nr. 74, Seq ID Nr. 96 oder Seq ID Nr. 102, insbesondere Seq ID Nr.36 oder Seq ID Nr. 42) und eine oder mehrere VL CDR3s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VL CDR3s mit einer Aminosäuresequenz von einer der VL CDR3s in der Sequenzauflistung (d.h. Seq ID Nr. 22, Seq ID Nr. 28, Seq ID Nr. 54, Seq ID Nr. 60, Seq ID Nr. 86, Seq ID Nr. 92, Seq ID Nr. 114 oder Seq ID Nr. 120, insbesondere Seq ID Nr. 54 oder Seq ID Nr. 60) beinhalten.

Wie an anderer Stelle hierin ausführlicher erörtert, kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung entweder allein oder in Kombination mit anderen Verbindungen oder Zusammensetzungen verwendet werden. Ferner können die Antikörper mit einem heterologen Polypeptid am N- oder C-Terminus rekombinant fusioniert oder mit Polypeptiden oder anderen Zusammensetzungen chemisch konjugiert werden (inkl. kovalenter und nicht kovalenter Konjugationen). Erfindungsgemäße Antikörper können z.B. mit Molekülen, die als Marker in Detektionsassays von Nutzen sind, und Effektormolekülen wie heterologe Polypeptide, Arzneimittel, Radionukleotide oder Toxine rekombinant fusioniert oder konjugiert werden (siehe z.B. PCT-Veröffentlichungen WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; US-Pat. Nr. 5,314,995; und EP 396,387).

In einigen Ausgestaltungen werden hierin Verfahren zum Verringern oder Inhibieren der Bindung von hOX40L an einen OX40L-Rezeptor oder kognaten Liganden (z.B. OX40) bei einem Subjekt (z.B. ein menschliches Subjekt) bereitgestellt, die das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Antikörpers, der sich spezifisch an ein hOX40L-Polypeptid (z.B. ein Zelloberflächen-exprimierter oder löslicher hOX40L) bindet, an das Subjekt beinhalten. In einigen Ausgestaltungen wird eine biologische hOX40L-Aktivität, wie die Sekretion von CCL20, IL8 und/oder RANTES oder INF-γ, TNF-α oder IL-2, insbesondere INF-γ oder einem anderen hierin offenbarten Zytokin, ebenfalls in dem Subjekt verringert, z.B. um wenigstens 10, 20, 30, 40, 50 oder 60 % oder 70 % oder 80 % oder 90 % oder 95 % oder > 95 %.

In bestimmten Ausgestaltungen werden hierin Verfahren zum Verringern oder Inhibieren einer biologischen hOX40L-Aktivität, wie die Sekretion von Interferon-gamma, IL-2, CCL20, IL8 und/oder RANTES oder einem anderen Zytokin oder INF-γ, TNF-α oder IL-2, insbesondere INF-γ, bei einem Subjekt (z.B. einem humanen Subjekt) bereitgestellt, die das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Antikörpers, der sich spezifisch an ein hOX40L-Polypeptid (z.B. ein Zelloberflächen-exprimiertes hOX40L) bindet, beinhalten, wobei die biologische hOX40L-Aktivität durch den Antikörper verringert wird.

In anderen Ausgestaltungen werden hierin Verfahren zum Verringern oder Inhibieren der Bindung von hOX40L an einen OX40L-Rezeptor oder kognaten Liganden (z.B. OX40) in einer Zelle mit Zelloberflächen-exprimiertem hOX40L und Kontaktieren der Zelle mit einer wirksamen Menge eines Antikörpers bereitgestellt, der sich spezifisch an ein hOX40L-Polypeptid (z.B. ein Zelloberflächen-exprimiertes oder lösliches hOX40L) wie ein hOX40L-Polypeptid, ein hOX40L-Polypeptidfragment oder ein hOX40L-Epitop bindet. In einigen Ausgestaltungen wird eine biologische hOX40L-Aktivität wie die Sekretion von Interferon-gamma, IL-2, CCL20, IL8 und/oder RANTES oder INF-γ, TNF-α oder IL-2, insbesondere INF-γ, oder einem anderen hierin offenbarten Zytokin, ebenfalls in der Zelle verringert.

In bestimmten Ausgestaltungen werden hierin Verfahren zum Verringern oder Inhibieren einer biologischen hOX40L-Aktivität, wie die Sekretion von Interferon-gamma, IL-2, CCL20, IL8 und/oder RANTES oder einem anderen hierin offenbarten Zytokin, in einer Zelle mit einem Zelloberflächen-exprimierten hOX40L-Rezeptor (wie OX40) und Kontaktieren der Zelle mit einer wirksamen Menge eines Antikörpers bereitgestellt, der sich spezifisch an ein hOX40L-Polypeptid (z.B. ein Zelloberflächen-exprimiertes oder lösliches hOX40L) bindet, wobei die biologische hOX40L-Aktivität durch den Antikörper verringert wird.

Erfindungsgemäße Antikörper können z.B. zum Reinigen, Detektieren und zielgerichteten Lenken von hOX40L-Antigenen sowohl in In-vitro- als auch in In-vivo-Diagnose- und Therapieverfahren verwendet werden. Die modifizierten Antikörper sind beispielsweise in Immunoassays zum qualitativen und quantitativen Messen der Niveaus von hOX40L in biologischen Proben von Nutzen (siehe z.B. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausg. 1988) (hierin in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen).

Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zum Verhüten, Bewältigen, Behandeln und/oder Bessern einer hOX40L-vermittelten Krankheit durch Verabreichen einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen Antikörper beinhaltet, an ein Subjekt bereit. In einem Aspekt ist ein Antikörper im Wesentlichen gereinigt (d.h. im Wesentlichen frei von Substanzen, die seine Wirkung begrenzen oder unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen). In bevorzugten Ausgestaltungen ist der Antikörper ein völlig humaner monoklonaler Antikörper, wie ein völlig humaner monoklonaler antagonistischer Antikörper. Das Subjekt, dem eine Therapie verabreicht wird, ist vorzugsweise ein Säugetier wie ein Nicht-Primat (z.B. Kuh, Schwein, Pferd, Katze, Hund, Nagetier, Maus oder Ratte) oder ein Primat (z.B. ein Affe, wie ein Rhesus- oder Javaneraffe, oder ein Mensch). In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Subjekt ein Mensch. In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung ist das Subjekt ein menschlicher Säugling oder ein zu früh geborener menschlicher Säugling. In einer anderen Ausgestaltung ist das Subjekt ein Mensch mit einer hOX40L-vermittelten Krankheit.

Es sind verschiedene Zuführungssysteme bekannt, die zum Verabreichen eines prophylaktischen oder therapeutischen Mittels (z.B. ein erfindungsgemäßer Antikörper) verwendet werden können, wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Einkapselung in Liposomen, Mikropartikeln, Mikrokapseln, rekombinanten Zellen, die den Antikörper exprimieren können, rezeptorvermittelte Endozytose (siehe z.B. Wu und Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432 (1987)), Konstruktion einer Nucleinsäure als Teil eines retroviralen oder anderen Vektors usw. Verfahren zum Verabreichen eines prophylaktischen oder therapeutischen Mittels (z.B. ein erfindungsgemäßer Antikörper) oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung beinhalten, aber ohne darauf beschränkt zu sein, eine parenterale Verabreichung (z.B. intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös und subkutan), epidurale und mukosale (z.B. intranasal und orale) Routen. In einer spezifischen Ausgestaltung wird ein prophylaktisches oder therapeutisches Mittel (z.B. ein erfindungsgemäßer Antikörper) oder eine pharmazeutische Zusammensetzung intranasal, intramuskulär, intravenös oder subkutan verabreicht. Die prophylaktischen oder therapeutischen Mittel oder Zusammensetzungen können über eine beliebige geeignete Route, z.B. durch Infusion oder Bolusinjektion, durch Absorption über epitheliale oder mukokutane Auskleidungen (z.B. Mundschleimhaut, intranasale Schleimhaut, rektale und intestinale Schleimhaut usw.) verabreicht werden, und sie können zusammen mit anderen biologisch aktiven Mitteln verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal erfolgen. Darüber hinaus kann auch eine pulmonale Verabreichung erfolgen, z.B. mit einem Inhalator oder Nebulisator und einer Formulierung mit einem Aerosolisierungsmittel (siehe z.B. US-Pat. Nr. 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540 und 4,880,078; und PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 und WO 99/66903, jeweils hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen).

In einer spezifischen Ausgestaltung kann es wünschenswert sein, ein prophylaktisches oder therapeutisches Mittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung lokal dem behandlungsbedürftigen Bereich zu verabreichen. Dies kann z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, durch lokale Infusion, topische Verabreichung (z.B. mit einem intranasalen Spray), Injektion oder mit Hilfe eines Implantats erreicht werden, wobei das genannte Implantat aus einem porösen, nicht porösen oder gelartigen Material besteht, inkl. Membranen, wie sialastische Membranen, oder Fasern. Bei der Verabreichung eines erfindungsgemäßen Antikörpers ist vorzugsweise darauf zu achten, dass Materialien verwendet werden, an die der Antikörper nicht absorbiert.

In einer anderen Ausgestaltung kann ein prophylaktisches oder therapeutisches Mittel oder eine Zusammensetzung der Erfindung in einem Vesikel, insbesondere einem Liposom, zugeführt werden (siehe Langer, 1990, Science 249: 1527–1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein und Fidler (Hrsg.), Liss, New York, S. 353–365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., S. 317–327; siehe allgemein ibid.).

In einer anderen Ausgestaltung kann ein prophylatisches oder therapeutisches Mittel oder eine Zusammensetzung der Erfindung in einem System mit kontrollierter oder anhaltender Freisetzung zugeführt werden. In einer Ausgestaltung kann eine Pumpe zum Erreichen einer kontrollierten oder anhaltenden Freisetzung verwendet werden (siehe Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). In einer anderen Ausgestaltung können Polymermaterialien zum Erreichen einer kontrollierten oder anhaltenden Freisetzung eines prophylaktischen oder therapeutischen Mittels (z.B. ein erfindungsgemäßer Antikörper) oder einer Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden (siehe z.B. Medical Applications of Controlled Release, Langer und Wise (Hrsg.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen und Ball (Hrsg.), Wiley, New York (1984); Ranger und Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; siehe auch Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1: 105); US-Pat. Nr. 5,679,377; US-Pat. Nr. 5,916,597; US-Pat. Nr. 5,912,015; US-Pat. Nr. 5,989,463; US-Pat. Nr. 5,128,326; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 99/15154; und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 99/20253. Zu Polymeren, die in Formulierungen mit anhaltender Freisetzung verwendet werden, gehören z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), Poly(methylmethacrylat), Poly(acrylsäure), Poly(ethylen-co-vinylacetat), Poly(methacrylsäure), Polyglycolide (PLG), Polyanhydride, Poly(N-vinylpyrrolidon), Poly(vinylalkohol), Polyacrylamid, Poly(ethylenglykol), Polylactide (PLA), Poly(lactid-co-glycolides) (PLGA) und Polyorthoester. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das in einer Formulierung mit anhaltender Freisetzung verwendete Polymer inert, frei von herauslösbaren Unreinheiten, lagerstabil, steril und biologisch abbaubar. In noch einer anderen Ausgestaltung kann ein System mit kontrollierter oder anhaltender Freisetzung in der Nähe des therapeutischen Targets, d.h. Nasengänge oder Lunge, platziert werden, so dass nur ein Bruchteil der systemischen Dosis nötig ist (siehe z.B. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, Bd. 2, S. 115–138 (1984)). Systeme mit kontrollierter Freisetzung werden in der Übersicht von Langer (1990, Science 249: 1527–1533) erörtert. Es kann eine beliebige der Fachperson bekannte Methode angewendet werden, um Formulierungen mit anhaltender Freisetzung zu produzieren, die einen oder mehrere erfindungsgemäße Antikörper beinhalten (siehe z.B. US-Pat. Nr. 4,526,938, PCT-Veröffentlichung WO 91/05548, PCT-Veröffentlichung WO 96/20698, Ning et al., 1996, “Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39: 179–189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372–397, Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853–854, and Lam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759–760, jeweils hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen.

In einer spezifischen Ausgestaltung, bei der die Zusammensetzung der Erfindung eine Nucleinsäure ist, die ein prophylaktisches oder therapeutisches Mittel (z.B. ein erfindungsgemäßer Antikörper) beinhaltet, kann die Nucleinsäure in vivo verabreicht werden, um die Expression ihres kodierten prophylaktischen oder therapeutischen Mittels zu unterstützen, indem sie als Teil eines zweckmäßigen Nucleinsäureexpressionsvektors konstruiert und so verabreicht wird, dass sie intrazellulär wird, z.B. unter Verwendung eines retroviralen Vektors (siehe US-Pat. Nr. 4,980,286) oder durch direkte Injektion oder mit Mikropartikelbeschuss (z.B. eine Genkanone; Biolistic, Dupont) oder durch Beschichtung mit Lipiden oder Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektionsmitteln oder durch Verabreichen in Verbindung mit einem Homöobox-artigen Peptid, das bekanntlich in den Nukleus eintritt (siehe z.B. Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864–1868) usw. Alternativ kann eine Nucleinsäure intrazellulär eingeführt und innerhalb der Wirtszell-DNA zur Expression durch homologe Rekombination integriert werden.

In einer spezifischen Ausgestaltung beinhaltet eine erfindungsgemäße Zusammensetzung einen, zwei oder mehrere Antikörper oder Fragmente der Erfindung. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet eine erfindungsgemäße Zusammensetzung einen, zwei oder mehrere Antikörper oder Fragmente der Erfindung und ein anderes prophylaktisches oder therapeutisches Mittel als erfindungsgemäßen Antikörper. Vorzugsweise sind die Mittel bekanntlich für die Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit von Nutzen oder wurden oder werden derzeit dafür verwendet. Zusätzlich zu prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch einen Träger beinhalten.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen schließen Arzneimittelzusammensetzungen in Großgebinden (Bulkware) ein, die zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen (z.B. Zusammensetzungen, die zur Verabreichung an ein Subjekt oder einen Patienten geeignet sind) nützlich sind, die zur Herstellung von Einheitsdosierungsformen verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist eine erfindungsgemäße Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung. Solche Zusammensetzungen beinhalten eine prophylaktisch oder therapeutisch wirksame Menge von einem oder mehreren prophylaktischen oder therapeutischen Mitteln (z.B. ein erfindungsgemäßer Antikörper oder ein anderes prophylaktisches oder therapeutisches Mittel) und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen so formuliert, dass sie für die Verabreichungsroute an ein Subjekt geeignet sind.

In einer spezifischen Ausgestaltung bezieht sich der Begriff “Träger” auf ein Verdünnungsmittel, ein Adjuvans (z.B. Freund-Adjuvans (komplett und inkomplett)), einen Exzipienten oder ein Vehikel, mit dem das Therapeutikum verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten wie Wasser und Öle sein, inkl. solcher erdölbürtigen, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, wie Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Salzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerollösungen können ebenfalls als flüssige Träger verwendet werden, insbesondere für injizierbare Lösungen. Zu geeigneten pharmazeutischen Exzipienten gehören Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kalk, Silikagel, Natriumstearat, Glycerolmonostearat, Talk, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glycerol, Propylen, Glykol, Wasser, Ethanol und dergleichen. Die Zusammensetzung kann, falls gewünscht, auch geringfügige Mengen von Benetzungs- oder Emulgierungsmitteln oder pH-Puffermitteln enthalten. Diese Zusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Formulierungen mit anhaltender Freisetzung und dergleichen vorliegen. Die orale Formulierung kann Standardträger wie Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat usw. pharmazeutischer Güte beinhalten. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa. beschrieben. Solche Zusammensetzungen enthalten eine prophylaktische oder therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers, vorzugsweise in gereinigter Form, zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers, um die Form für die richtige Verabreichung an den Patienten bereitzustellen. Die Formulierung sollte sich für die Verabreichungsweise eignen.

In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die Zusammensetzung mit Routineverfahren als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die für eine intravenöse Verabreichung an Menschen geeignet ist. Typischerweise sind Zusammensetzungen für die intravenöse Verabreichung Lösungen in sterilem isotonischem wässrigem Puffer. Gegebenenfalls kann die Zusammensetzung auch ein Solubilisierungsmittel und ein lokales Anästhetikum wie Lignocaine beinhalten, um an der Injektionsstelle Schmerzen zu lindern. Solche Zusammensetzungen können jedoch über eine andere als die intravenöse Route verabreicht werden.

Im Allgemeinen werden die Inhaltsstoffe der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen entweder getrennt oder miteinander vermischt in Einheitsdosierungsform, z.B. als lyophilisiertes Trockenpulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch versiegelten Behälter wie einer Ampulle oder einem Tütchen geliefert, der die Menge an aktivem Mittel angibt. Wenn die Zusammensetzung per Infusion verabreicht werden soll, kann sie mit einer Infusionsflasche, die sterile(s) Wasser oder Salzlösung pharmazeutischer Güte enthält, abgegeben werden. Wenn die Zusammensetzung per Injektion verabreicht wird, dann kann eine Ampulle mit sterilem Wasser für Injektionszwecke oder Salzlösung bereitgestellt werden, so dass die Inhaltsstoffe vor dem Verabreichen gemischt werden können.

Die Erfindung sieht außerdem vor, dass ein erfindungsgemäßer Antikörper in einem hermetisch versiegelten Behälter wie einer Ampulle oder einem Tütchen verpackt wird, der die Antikörpermenge angibt. In einer Ausgestaltung wird der Antikörper als sterilisiertes lyophilisiertes Trockenpulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch versiegelten Behälter geliefert und kann z.B. mit Wasser oder Salzlösung auf die zweckmäßige Konzentration für eine Verabreichung an ein Subjekt rekonstituiert werden. Vorzugsweise wird der Antikörper als steriles lyophilisiertes Trockenpulver in einem hermetisch versiegelten Behälter in einer Einheitsdosierung von wenigstens 0,1 mg, wenigstens 0,5 mg, wenigstens 1 mg, wenigstens 2 mg oder wenigstens 3 mg und bevorzugter wenigstens 5 mg, wenigstens 10 mg, wenigstens 15 mg, wenigstens 25 mg, wenigstens 30 mg, wenigstens 35 mg, wenigstens 45 mg, wenigstens 50 mg, wenigstens 60 mg, wenigstens 75 mg, wenigstens 80 mg, wenigstens 85 mg, wenigstens 90 mg, wenigstens 95 mg oder wenigstens 100 mg geliefert. Der lyophilisierte Antikörper kann bei 2 bis 8°C in seinem Originalbehälter aufbewahrt werden und der Antikörper kann innerhalb von 12 Stunden, vorzugsweise innerhalb von 6 Stunden, innerhalb von 5 Stunden, innerhalb von 3 Stunden oder innerhalb von 1 Stunde nach dem Rekonstituieren verabreicht werden. In einer alternativen Ausgestaltung wird ein Antikörper in flüssiger Form in einem hermetisch versiegelten Behälter geliefert, der die Menge und Konzentration des Antikörpers angibt. Vorzugsweise wird die flüssige Form des Antikörpers in einem hermetisch versiegelten Behälter zu wenigstens 0,1 mg/ml, wenigstens 0,5 mg/ml oder wenigstens 1 mg/ml und bevorzugter wenigstens 5 mg/ml, wenigstens 10 mg/ml, wenigstens 15 mg/ml, wenigstens 25 mg/ml, wenigstens 30 mg/ml, wenigstens 40 mg/ml, wenigstens 50 mg/ml, wenigstens 60 mg/ml, wenigstens 70 mg/ml, wenigstens 80 mg/ml, wenigstens 90 mg/ml oder wenigstens 100 mg/ml geliefert.

Die Zusammensetzungen der Erfindung können als neutrale oder Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen solche ein, die mit Anionen gebildet werden, wie z.B. solche, die von Chlorwasserstoff-, Phosphor-, Essig-, Oxal-, Weinsäure usw. abgeleitet sind, und solche, die mit Kationen gebildet werden, wie z.B. solche, die von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Eisenhydroxiden, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminethanol, Histidin, Procain usw. abgeleitet sind.

Die Menge eines prophylaktischen oder therapeutischen Mittels (z.B. eines erfindungsgemäßen Antikörpers) oder einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die bei der Verhütung, Bewältigung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit wirksam ist, kann mit standardmäßigen klinischen Methoden bestimmt werden.

Folglich kann eine Dosierung eines Antikörpers oder einer Zusammensetzung, die in einem Serumtiter von etwa 0,1 μg/ml bis etwa 450 μg/ml und in einigen Ausgestaltungen wenigstens 0,1 μg/ml, wenigstens 0,2 μg/ml, wenigstens 0,4 μg/ml, wenigstens 0,5 μg/ml, wenigstens 0,6 μg/ml, wenigstens 0,8 μg/ml, wenigstens 1 μg/ml, wenigstens 1,5 μg/ml und vorzugsweise wenigstens 2 μg/ml, wenigstens 5 μg/ml, wenigstens 10 μg/ml, wenigstens 15 μg/ml, wenigstens 20 μg/ml, wenigstens 25 μg/ml, wenigstens 30 μg/ml, wenigstens 35 μg/ml, wenigstens 40 μg/ml, wenigstens 50 μg/ml, wenigstens 75 μg/ml, wenigstens 100 μg/ml, wenigstens 125 μg/ml, wenigstens 150 μg/ml, wenigstens 200 μg/ml, wenigstens 250 μg/ml, wenigstens 300 μg/ml, wenigstens 350 μg/ml, wenigstens 400 μg/ml oder wenigstens 450 μg/ml resultiert, einem Menschen zur Verhütung, Bewältigung, Behandlung und/oder Besserung einer hOX40L-vermittelten Krankheit verabreicht werden. Darüber hinaus können In-vitro-Assays optional verwendet werden, um die Ermittlung optimaler Dosierungsbereiche zu unterstützen. Die genaue in der Formulierung zu verwendende Dosis ist außerdem von der Verabreichungsroute und dem Schweregrad der hOX40L-vermittelten Krankheit abhängig und sollte gemäß dem Urteil des Arztes und der jeweiligen Situation des Patienten bestimmt werden.

Wirksame Dosen können von Dosis-Wirkungs-Kurven extrapoliert werden, die von In-vitro- oder Tiermodelltestsystemen abgeleitet werden.

Für die erfindungsgemäßen Antikörper liegt die einem Patienten verabreichte Dosierung typischerweise bei 0,1 mg/kg bis 100 mg/kg des Körpergewichts des Patienten. In einigen Ausgestaltungen liegt die dem Patienten verabreichte Dosierung bei etwa 1 mg/kg bis etwa 75 mg/kg des Körpergewichts des Patienten. Vorzugsweise liegt die einem Patienten verabreichte Dosierung zwischen 1 mg/kg und 20 mg/kg des Körpergewichts des Patienten, bevorzugter bei 1 mg/kg bis 5 mg/kg des Körpergewichts des Patienten. Im Allgemeinen haben humane Antikörper eine längere Halbwertszeit im menschlichen Körper als Antikörper von anderen Spezies, und zwar aufgrund der Immunreaktion auf die fremden Polypeptide. Folglich sind oft niedrigere Dosierungen humaner Antikörper und eine weniger häufige Verabreichung möglich. Ferner können Dosierung und Verabreichungshäufigkeit der erfindungsgemäßen Antikörper durch Erhöhen der Aufnahme und Gewebepenetration der Antikörper durch Modifikationen wie z.B. Lipidierung verringert werden.

In einer Ausgestaltung werden etwa 100 mg/kg oder weniger, etwa 75 mg/kg oder weniger, etwa 50 mg/kg oder weniger, etwa 25 mg/kg oder weniger, etwa 10 mg/kg oder weniger, etwa 5 mg/kg oder weniger, etwa 1 mg/kg oder weniger, etwa 0,5 mg/kg oder weniger oder etwa 0,1 mg/kg oder weniger eines Antikörpers oder Fragments der Erfindung 5 Mal, 4 Mal, 3 Mal, 2 Mal oder vorzugsweise 1 Mal verabreicht, um eine hOX40L-vermittelte Krankheit zu bewältigen. In einigen Ausgestaltungen wird ein erfindungsgemäßer Antikörper etwa 1–12 Mal verabreicht, wobei die Dosen gegebenenfalls z.B. wöchentlich, zweiwöchentlich, monatlich, alle zwei Monate, alle drei Monate usw., wie von einem Arzt bestimmt, verabreicht werden. In einigen Ausgestaltungen kann eine geringere Dosis (z.B. 1–15 mg/kg) häufiger (z.B. 3–6 Mal) verabreicht werden. In anderen Ausgestaltungen kann eine höhere Dosis (z.B. 25–100 mg/kg) weniger häufig (z.B. 1–3 Mal) verabreicht werden. Wie der Fachperson einleuchten wird, sind andere Dosierungsmengen und -pläne jedoch ohne weiteres bestimmbar und liegen im Rahmen der Erfindung.

In einer spezifischen Ausgestaltung werden etwa 100 mg/kg, etwa 75 mg/kg oder weniger, etwa 50 mg/kg oder weniger, etwa 25 mg/kg oder weniger, etwa 10 mg/kg oder weniger, etwa 5 mg/kg oder weniger, etwa 1 mg/kg oder weniger, etwa 0,5 mg/kg oder weniger, etwa 0,1 mg/kg oder weniger eines Antikörpers oder Fragments der Erfindung in einer Formulierung mit anhaltender Freisetzung einem Subjekt, vorzugsweise einem Menschen, zum Verhüten, Bewältigen, Behandeln und/oder Bessern einer hOX40L-vermittelten Krankheit verabreicht. In einer anderen spezifischen Ausgestaltung wird ein Bolus mit etwa 100 mg/kg, etwa 75 mg/kg oder weniger, etwa 50 mg/kg oder weniger, etwa 25 mg/kg oder weniger, etwa 10 mg/kg oder weniger, etwa 5 mg/kg oder weniger, etwa 1 mg/kg oder weniger, etwa 0,5 mg/kg oder weniger oder etwa 0,1 mg/kg oder weniger eines erfindungsgemäßen Antikörpers nicht in einer Formulierung mit anhaltender Freisetzung einem Subjekt, vorzugsweise einem Menschen, zum Verhüten, Bewältigen, Behandeln und/oder Bessern einer hOX40L-vermittelten Krankheit verabreicht, und nach einem bestimmten Zeitraum werden etwa 100 mg/kg, etwa 75 mg/kg oder weniger, etwa 50 mg/kg oder weniger, etwa 25 mg/kg oder weniger, etwa 10 mg/kg oder weniger, etwa 5 mg/kg oder weniger, etwa 1 mg/kg oder weniger, etwa 0,5 mg/kg oder weniger oder etwa 5 mg/kg oder weniger eines erfindungsgemäßen Antikörpers in einer anhaltenden Freisetzung dem genannten Subjekt (z.B. intranasal oder intramuskulär) zwei, drei oder vier Mal (vorzugsweise ein Mal) verabreicht. Gemäß dieser Ausgestaltung kann ein bestimmter Zeitraum 1 bis 5 Tage, eine Woche, zwei Wochen oder ein Monat sein.

In einigen Ausgestaltungen wird eine einzelne Dosis eines Antikörpers oder Fragments der Erfindung einem Patienten zum Verhüten, Bewältigen, Behandeln und/oder Bessern einer hOX40L-vermittelten Krankheit zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechszehn, siebzehn, achtzehn, neunzehn, zwanzig, einundzwanzig, zweiundzwanzig, dreiundzwanzig, vierundzwanzig, fünfundzwanzig oder sechsundzwanzig Mal in zweiwöchentlichen (z.B. etwa 14 Tage) Abständen im Laufe eines Jahres verabreicht, wobei die Dosis ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus etwa 0,1 mg/kg, etwa 0,5 mg/kg, etwa 1 mg/kg, etwa 5 mg/kg, etwa 10 mg/kg, etwa 15 mg/kg, etwa 20 mg/kg, etwa 25 mg/kg, etwa 30 mg/kg, etwa 35 mg/kg, etwa 40 mg/kg, etwa 45 mg/kg, etwa 50 mg/kg, etwa 55 mg/kg, etwa 60 mg/kg, etwa 65 mg/kg, etwa 70 mg/kg, etwa 75 mg/kg, etwa 80 mg/kg, etwa 85 mg/kg, etwa 90 mg/kg, etwa 95 mg/kg, etwa 100 mg/kg oder einer Kombination davon (d.h. jede monatliche Dosis kann identisch sein oder nicht).

In einer anderen Ausgestaltung wird eine einzelne Dosis eines erfindungsgemäßen Antikörpers dem Patienten zum Verhüten, Bewältigen, Behandeln und/oder Bessern einer hOX40L-vermittelten Krankheit zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf oder zwölf Mal in etwa monatlichen Abständen (z.B. etwa 30 Tage) im Laufe eines Jahres verabreicht, wobei die Dosis ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus etwa 0,1 mg/kg, etwa 0,5 mg/kg, etwa 1 mg/kg, etwa 5 mg/kg, etwa 10 mg/kg, etwa 15 mg/kg, etwa 20 mg/kg, etwa 25 mg/kg, etwa 30 mg/kg, etwa 35 mg/kg, etwa 40 mg/kg, etwa 45 mg/kg, etwa 50 mg/kg, etwa 55 mg/kg, etwa 60 mg/kg, etwa 65 mg/kg, etwa 70 mg/kg, etwa 75 mg/kg, etwa 80 mg/kg, etwa 85 mg/kg, etwa 90 mg/kg, etwa 95 mg/kg, etwa 100 mg/kg oder einer Kombination davon (d.h. jede monatliche Dosis kann identisch sein oder nicht).

In einer Ausgestaltung wird eine einzelne Dosis eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments einem Patienten zum Verhüten, Bewältigen, Behandeln und/oder Bessern einer hOX40L-vermittelten Krankheit zwei, drei, vier, fünf oder sechs Mal in Abständen von etwa zwei Monaten (z.B. etwa 60 Tage) im Laufe eines Jahres verabreicht, wobei die Dosis ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus etwa 0,1 mg/kg, etwa 0,5 mg/kg, etwa 1 mg/kg, etwa 5 mg/kg, etwa 10 mg/kg, etwa 15 mg/kg, etwa 20 mg/kg, etwa 25 mg/kg, etwa 30 mg/kg, etwa 35 mg/kg, etwa 40 mg/kg, etwa 45 mg/kg, etwa 50 mg/kg, etwa 55 mg/kg, etwa 60 mg/kg, etwa 65 mg/kg, etwa 70 mg/kg, etwa 75 mg/kg, etwa 80 mg/kg, etwa 85 mg/kg, etwa 90 mg/kg, etwa 95 mg/kg, etwa 100 mg/kg oder einer Kombination davon (d.h. jede zweimonatliche Dosis kann identisch sein oder nicht).

In einigen Ausgestaltungen wird eine einzelne Dosis eines Antikörpers oder Fragments der Erfindung einem Patienten zum Verhüten, Bewältigen, Behandeln und/oder Bessern einer hOX40L-vermittelten Krankheit zwei, drei oder vier Mal etwa alle drei Monate (z.B etwa 120 Tage) im Laufe eines Jahres verabreicht, wobei die Dosis ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus etwa 0,1 mg/kg, etwa 0,5 mg/kg, etwa 1 mg/kg, etwa 5 mg/kg, etwa 10 mg/kg, etwa 15 mg/kg, etwa 20 mg/kg, etwa 25 mg/kg, etwa 30 mg/kg, etwa 35 mg/kg, etwa 40 mg/kg, etwa 45 mg/kg, etwa 50 mg/kg, etwa 55 mg/kg, etwa 60 mg/kg, etwa 65 mg/kg, etwa 70 mg/kg, etwa 75 mg/kg, etwa 80 mg/kg, etwa 85 mg/kg, etwa 90 mg/kg, etwa 95 mg/kg, etwa 100 mg/kg oder einer Kombination davon (d.h. jede dreimonatliche Dosis kann identisch sein oder nicht).

In bestimmten Ausgestaltungen ist die Verabreichungsroute für eine Dosis eines Antikörpers oder Fragments der Erfindung an einen Patienten intranasal, intramuskulär, intravenös oder eine Kombination davon, aber es sind auch andere hierin beschriebene Routen akzeptabel. In bestimmten Ausgestaltungen ist die Verabreichungsroute intraokular. Jede Dosis kann über eine identische Verabreichungsroute verabreicht werden oder nicht. In einigen Ausgestaltungen kann ein Antikörper oder Fragment der Erfindung über mehrere Verabreichungsrouten gleichzeitig oder nacheinander in Verbindung mit anderen Dosen desselben oder eines unterschiedlichen erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragments verabreicht werden.

In bestimmten Ausgestaltungen werden Antikörper oder Fragmente der Erfindung prophylaktisch oder therapeutisch einem Subjekt verabreicht. Antikörper oder Fragmente der Erfindung können einem Subjekt prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden, um eine hOX40L-vermittelte Krankheit oder ein Symptom davon zu verhüten, abmildern oder zu bessern.

Gentherapie

In einer spezifischen Ausgestaltung werden Nucleinsäuren oder Nucleotidsequenzen der Erfindung zum Verhüten, Bewältigen, Behandeln und/oder Bessern einer hOX40L-vermittelten Krankheit über eine Gentherapie verabreicht. Gentherapie bezieht sich auf eine Therapie durch Verabreichen einer exprimierten oder exprimierbaren Nucleinsäure an ein Subjekt. In einer Ausgestaltung der Erfindung produzieren Nucleinsäuren ihren kodierten Antikörper und der Antikörper vermittelt eine prophylaktische oder therapeutische Wirkung.

Beliebige der in der Technik verfügbaren Gentherapieverfahren können gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet werden.

Diagnostische Verwendung von Antikörpern

Obwohl Antikörper mit Bezug auf diagnostische Anwendungen erwähnt werden, ist die vorliegende Offenbarung so zu verstehen, dass sie mutatis mutandis auch auf die Fragmente der Erfindung zutrifft.

Markierte oder erfindungsgemäße Antikörper und Derivate und Analoga davon, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen binden, können für Diagnosezwecke zum Detektieren, Diagnostizieren oder Überwachen einer hOX40L-vermittelten Krankheit verwendet werden. Die Erfindung stellt Verfahren zum Detektieren einer hOX40L-vermittelten Krankheit bereit, die Folgendes beinhalten: (a) Untersuchen der Expression eines hOX40L-Antigens in Zellen oder einer Gewebeprobe eines Subjekts unter Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Antikörpern, die sich spezifisch an das hOX40L-Antigen binden; und (b) Vergleichen des Niveaus des hOX40L-Antigens mit einem Kontrollniveau, z.B. Niveaus in normalen Gewebeproben (z.B. von einem Patienten ohne hOX40L-vermittelte Krankheit oder von demselben Patienten vor Ausbruch der Krankheit), wobei eine Erhöhung des untersuchten Niveaus von hOX40L-Antigen im Vergleich zum Kontrollniveau des hOX40L-Antigens auf eine hOX40L-vermittelte Krankheit hinweist.

Die Erfindung stellt einen diagnostischen Assay zur Diagnose einer hOX40L-vermittelten Krankheit bereit, der Folgendes beinhaltet: (a) Untersuchen des Niveaus eines hOX40L-Antigens in Zellen oder einer Gewebeprobe eines Individuums unter Verwendung von einem oder mehreren Antikörpern der Erfindung, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen binden; und (b) Vergleichen des Niveaus des hOX40L-Antigens mit einem Kontrollniveau, z.B. Niveaus in normalen Gewebeproben, wobei eine Erhöhung in dem untersuchten hOX40L-Antigenniveau im Vergleich zum Kontrollniveau des hOX40L-Antigens auf eine hOX40L-vermittelte Krankheit hinweist. Anhand einer eindeutigeren Diagnose einer hOX40L-vermittelten Krankheit können Therapeuten früher Präventivmaßnahmen ergreifen oder eine aggressive Behandlung durchführen, so dass die Entstehung oder ein weiterer Fortschritt der hOX40L-vermittelten Krankheit verhindert wird.

Erfindungsgemäße Antikörper können zum Untersuchen der hOX40L-Antigenniveaus in einer biologischen Probe mit klassischen immunhistologischen Verfahren, wie hierin beschrieben oder der Fachperson bekannt, verwendet werden (siehe z.B. Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 976–985; und Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105: 3087–3096). Zu anderen antikörperbasierten Verfahren, die zum Detektieren der Proteingenexpression von Nutzen sind, gehören Immunoassays wie der enzymgekoppelte Immunadsorptionsassay (ELISA) und der Radioimmunassay (RIA). Geeignete Antikörperassaymarker sind in der Technik bekannt und beinhalten Enzymmarker wie Glucoseoxidase; Radioisotope wie Iod (125I, 121I), Kohlenstoff (14C), Schwefel (3S), Tritium (35H), Indium (121In) und Technetium (99Tc); lumineszierende Marker wie Luminol; und fluoreszierende Marker wie Fluorescein und Rhodamin und Biotin.

Ein Aspekt der Erfindung ist die Detektion und Diagnose einer hOX40L-vermittelten Krankheit bei einem Menschen. In einer Ausgestaltung beinhaltet die Diagnose Folgendes: a) Verabreichen (z.B. parenteral, subkutan oder intraperitoneal) einer wirksamen Menge eines markierten Antikörpers, der sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen bindet, an ein Subjekt; b) Warten für einen Zeitraum nach der Verabreichung, damit sich der markierte Antikörper vorzugsweise an Stellen in dem Subjekt konzentriert, wo das hOX40L-Antigen exprimiert wird (und ungebundenes markiertes Molekül auf Hintergrundniveau beseitigt wird); c) Bestimmen des Hintergrundniveaus; und d) Detektieren des markierten Antikörpers im Subjekt, so dass die Detektion des markierten Antikörpers oberhalb des Hintergrundniveaus anzeigt, dass das Subjekt eine hOX40L-vermittelte Krankheit hat. Das Hintergrundniveau kann mit verschiedenen Verfahren bestimmt werden, wie z.B. durch Vergleichen der Menge an detektiertem markiertem Molekül mit einem Standardwert, der zuvor für ein spezielles System festgelegt wurde.

In der Technik wird verstanden, dass die Größe des Subjekts und das verwendete Abbildungssystem die Menge des Abbildungsanteils bestimmen werden, der zum Produzieren von Diagnosebildern benötigt wird. Im Falle eines Radioisotopanteils liegt die Menge der injizierten Radioaktivität für ein menschliches Subjekt normalerweise bei etwa 5 bis 20 Millicurie von 99Tc. Der markierte Antikörper sammelt sich dann vorzugsweise an der Position der Zellen an, die das spezifische Protein enthalten. Die In-vivo-Tumorabbildung ist in S. W. Burchiel et al., “Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.” (Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S. W. Burchiel and B. A. Rhodes, Hrsg., Masson Publishing Inc. (1982), beschrieben.

In Abhängigkeit von mehreren Variablen, inkl. des verwendeten Markertyps und der Verabreichungsweise, liegt der Zeitraum nach der Verabreichung, damit sich der markierte Antikörper vorzugsweise an Stellen in dem Subjekt konzentrieren kann und ungebundener markierter Antikörper auf Hintergrundniveau beseitigt wird, bei 6 bis 48 Stunden oder 6 bis 24 Stunden oder 6 bis 12 Stunden. In einer anderen Ausgestaltung liegt der Zeitraum nach der Verabreichung bei 5 bis 20 Tagen oder 5 bis 10 Tagen.

In einer Ausgestaltung erfolgt die Überwachung einer hOX40L-vermittelten Krankheit durch Wiederholen des Verfahrens zum Diagnostizieren einer hOX40L-vermittelten Krankheit, z.B. einen Monat nach der ersten Diagnose, sechs Monate nach der ersten Diagnose, ein Jahr nach der ersten Diagnose usw.

Die Anwesenheit des markierten Moleküls kann in dem Subjekt mit in der Technik zum In-vivo-Scannen bekannten Verfahren detektiert werden. Diese Verfahren sind von dem verwendeten Markertyp abhängig. Die Fachperson wird in der Lage sein, das zweckmäßige Verfahren zum Detektieren eines speziellen Markers zu bestimmen. Zu Verfahren und Vorrichtungen, die in den Diagnoseverfahren der Erfindung verwendet werden können, gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, CT-Schichtaufnahme (CT), Ganzkörperscans wie Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Magnetresonanzbildgebung (MRI) und Sonographie.

In einer spezifischen Ausgestaltung wird das Molekül mit einem Radioisotop markiert und in dem Patienten mit einem auf Strahlung ansprechenden chirurgischen Instrument detektiert (Thurston et al., US-Pat. Nr. 5,441,050). In einer anderen Ausgestaltung wird das Molekül mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert und in dem Patienten mit einem auf Fluoreszenz ansprechenden Scanninginstrument detektiert. In einer anderen Ausgestaltung wird das Molekül mit einem Positronen-Emissions-Metall markiert und in dem Patienten mit Positronen-Emissions- Tomographie detektiert. In noch einer anderen Ausgestaltung wird das Molekül mit einem paramagnetischen Marker markiert und in einem Patienten mit Magnetresonanzbildgebung (MRI) detektiert.

Verfahren zur Herstellung von Antikörpern

Antikörper und Fragmente der Erfindung, die sich spezifisch an ein Antigen (OX40L) binden, können mit einem beliebigen in der Technik zur Synthese von Antikörpern bekannten Verfahren produziert werden, insbesondere durch chemische Synthese oder vorzugsweise durch rekombinante Expressionsmethoden. Die Praxis der Erfindung setzt, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Methoden der Molekularbiologie, Mikrobiologie, Genanalyse, DNA-Rekombinationstechnik, organischen Chemie, Biochemie, PCR, Oligonucleotidsynthese und -modifikation, Nucleinsäurehybridisierung und verwandte Bereiche innerhalb der Fähigkeiten der Technik ein. Diese Methoden sind in den hierin angeführten Referenzen beschrieben und in der Literatur ausführlich erklärt (siehe z.B. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 und jährliche Aktualisierungen); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 und jährliche Aktualisierungen) Gait (Hrsg.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (Hrsg.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (Hrsg.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Polyklonale Antikörper, die sich spezifisch an ein Antigen binden, können mit verschiedenen in der Technik gut bekannten Verfahren produziert werden. Ein humanes Antigen kann beispielsweise verschiedenen Wirtstieren verabreicht werden, wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Kaninchen, Mäuse, Ratten usw., um die Produktion von Seren zu induzieren, die polyklonale Antikörper enthalten, die für das humane Antigen spezifisch sind. Es können verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die immunologische Reaktion je nach den Wirtsspezies zu erhöhen, die z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, Freund-Adjuvans (komplett und inkomplett), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanoinen, Peptide, Ölemulsionen, Schlitzschnecken-Hämocyanine, Dinitrophenol und potentiell nützliche humane Adjuvanzien wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum beinhalten. Solche Adjuvanzien sind in der Technik auch gut bekannt.

Monoklonale Antikörper können mit einer Vielfalt von in der Technik bekannten Methoden hergestellt werden, inkl. der Verwendung von Hybridom-, Rekombinations- und Phagen-Display-Technik oder einer Kombination davon. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper mit Hybridomtechniken produziert werden, wie den in der Technik bekannten und z.B. in Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausg. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N. Y., 1981) gelehrten (wobei die genannten Referenzen in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen sind). Der hierin verwendete Begriff “monoklonaler Antikörper” ist nicht auf Antikörper begrenzt, die durch Hybridomtechnik produziert werden. Andere beispielhafte Verfahren für die Produktion monoklonaler Antikörper werden an anderer Stelle hierin erörtert, wie z.B. die Verwendung von KM MouseTM. Weitere beispielhafte Verfahren zur Produktion monoklonaler Antikörper werden in den Beispielen hierin bereitgestellt.

Verfahren zum Produzieren und Screenen von spezifischen Antikörpern unter Anwendung von Hybridomtechnik sind eine Routinesache und in der Technik gut bekannt. Kurz gesagt, Mäuse können mit einem hOX40L-Antigen immunisiert werden, und sobald eine Immunreaktion detektiert wird, z.B. für hOX40L-Antigen spezifische Antikörper werden im Mausserum detektiert, wird die Mausmilz geerntet und Splenozyten werden isoliert. Die Splenozyten werden dann über gut bekannte Methoden mit beliebigen geeigneten Myelomzellen fusioniert, z.B. Zellen von der Zelllinie SP20, erhältlich von der ATCC. Hybridome werden selektiert und durch begrenzte Verdünnung kloniert.

Darüber hinaus kann eine RIMMS-(repetitive Immunisierung mehrerer Stellen)-Methode zum Immunisieren eines Tieres angewendet werden (Kilptrack et al., 1997 Hybridoma 16: 381–9, in der Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen). Die Hybridomklone werden dann mit in der Technik bekannten Verfahren mit Bezug auf Zellen, die Antikörper sekretieren, die sich an ein erfindungsgemäßes Polypeptid binden können, untersucht. Aszitesfluid, das im Allgemeinen hohe Antikörperniveaus enthält, können durch Immunisieren von Mäusen mit positiven Hybridomklonen erzeugt werden.

Folglich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Erzeugen von Antikörpern durch Kultivieren einer Hybridomzelle bereit, die einen modifizierten Antikörper der Erfindung sekretiert, wobei das Hybridom vorzugsweise erzeugt wird, indem Splenozyten, die von einer mit einem hOX40L-Antigen immunisierten Maus isoliert wurden, fusioniert und dann die Hybridome, die sich aus der Fusion ergeben, bzgl. Hybridomklone gescreent werden, die einen Antikörper sekretieren, der ein hOX40L-Antigen binden kann.

Antikörperfragmente, die spezifische hOX40L-Antigene erkennen, können mit einer beliebigen der Fachperson bekannten Methode erzeugt werden. Fab- und F(ab′)2-Fragmente der Erfindung können durch proteolytische Spaltung von Immunglobulinmolekülen mit Enzymen wie Papain (zum Produzieren von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zum Produzieren von F(ab′)2-Fragmenten) produziert werden. F(ab′)2-Fragmente enthalten die variable Region, die konstante Leichtkettenregion und die CH1-Domäne der Schwerkette. Ferner können die erfindungsgemäßen Antikörper auch mit verschiedenen in der Technik bekannten Phagen-Display-Verfahren erzeugt werden.

Antikörper können zum Beispiel auch mit verschiedenen Phagen-Display-Verfahren erzeugt werden. Bei Phagen-Display-Verfahren werden funktionelle Antikörperdomänen auf der Oberfläche von Phagenpartikeln gezeigt, die die Polynucleotidsequenzen tragen, die sie kodieren. Insbesondere werden DNA-Sequenzen, die VH- und VL-Domänen kodieren, von Tier-cDNA-Bibliotheken (z.B. humane oder murine cDNA-Bibliotheken von betroffenem Gewebe) amplifiziert. Die die VH- und VL-Domänen kodierenden DNAs werden mit einem scFv-Linker durch PCR rekombiniert und in einen Phagemid-Vektor kloniert. Der Vektor wird in E. coli elektroporiert und das E. coli wird mit Helfer- Phage infiziert. Die in diesen Verfahren verwendeten Phagen sind typischerweise filamentöse Phagen, die fd und M13 beinhalten, und die VH- und VL-Domänen werden gewöhnlich mit Phagen-Gen III oder -Gen VIII rekombinant fusioniert. Phagen, die eine Antigenbindungsdomäne exprimieren, die sich an ein spezielles Antigen bindet, können mit Antigen selektiert oder identifiziert werden, z.B. mit markiertem Antigen oder einem an einer Feststoffoberfläche oder -kügelchen gebundenen oder gefangenen Antigen. Beispiele für Phagen-Display-Verfahren, die angewendet werden können, um die Antikörper der vorliegenden Erfindung zu bilden, sind die in Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182: 41–50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184: 177–186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 952–958; Persic et al., 1997, Gene 187: 9–18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: 191–280; PCT-Anmeldung Nr. PCT/GB91/01134; Internationale Veröffentlichungen Nr. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 und WO 97/13844; und US-Pat. Nr. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 und 5,969,108; jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen, offenbarten.

Wie in den obigen Referenzen beschrieben, können die Antikörperkodierungsregionen vom Phagen nach der Phagenselektion isoliert und zum Erzeugen ganzer Antikörper, inkl. humaner Antikörper, oder eines beliebigen anderen gewünschten Antigenbindungsfragments verwendet und in einem beliebigen gewünschten Wirt, inkl. Säugetierzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, Hefe und Bakterien, z.B. wie nachfolgend beschrieben, exprimiert werden. Methoden zum rekombinanten Produzieren von Fab-, Fab′- und F(ab′)2-Fragmenten können auch mit in der Technik bekannten Verfahren angewendet werden, wie den in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6): 864–869; Sawai et al., 1995, AJRI 34: 26–34; und Better et al., 1988, Science 240: 1041–1043 (wobei die genannten Referenzen in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen sind) beschriebenen.

Zum Erzeugen ganzer Antikörper können PCR-Primer mit VH- oder VL-Nucleotidsequenzen, eine Restriktionsstelle und eine Flankierungssequenz zum Schützen der Restriktionsstelle verwendet werden, um die VH- oder VL-Sequenzen in scFv-Klonen zu amplifizieren. Mit der Fachperson bekannten Klonierungsmethoden können die PCR-amplifizierten VH-Domänen in Vektoren kloniert werden, die eine konstante VH-Region, z.B. die humane konstante Gamma-4-Region, exprimieren, und die PCR-amplifizierten VL-Domänen können in Vektoren kloniert werden, die eine konstante VL-Region exprimieren, z.B. humane konstante Kappa- oder Lambda-Regionen. Die VH- und VL-Domänen können auch in einen Vektor kloniert werden, der die notwendigen konstanten Regionen exprimiert. Die Schwerkettenumwandlungsvektoren und Leichtkettenumwandlungsvektoren werden dann in Zelllinien cotransfiziert, um stabile oder transiente Zelllinien, die Volllängenantikörper exprimieren, z.B. IgG, mit der Fachperson bekannten Methoden zu erzeugen.

Für einige Verwendungsmöglichkeiten, wie die In-vivo-Verwendung von Antikörpern in Menschen und In-vitro-Detektionsassays, kann es von Vorteil sein, humane oder chimäre Antikörper zu verwenden. Völlig humane Antikörper sind vor allem für die therapeutische Behandlung humaner Subjekte erwünscht. Humane Antikörper können mit einer Vielfalt von in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, inkl. der oben beschriebenen Phagen-Display-Verfahren unter Verwendung von Antikörperbibliotheken, die von humanen Immunglobulinsequenzen abgeleitet sind (siehe auch US-Pat. Nr. 4,444,887 und 4,716,111; und Internationale Veröffentlichungen Nr. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 und WO 91/10741; jeweils hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen).

In bevorzugten Ausgestaltungen werden humane Antikörper produziert. Humane Antikörper und/oder völlig humane Antikörper können mit jedem beliebigen in der Technik bekannten Verfahren produziert werden, einschließlich der hierin bereitgestellten Beispiele. Zum Beispiel transgene Mäuse, die funktionelle endogene Immunglobuline exprimieren können, die aber humane Immunglobulingene exprimieren können. Die humanen Schwer- und Leichtketten- Immunglobulingenkomplexe können beispielsweise zufällig oder durch homologe Rekombination in embryonale Mausstammzellen eingeführt werden. Alternativ können die humane variable Region, konstante Region und Diversitätsregion in embryonale Maus-Stammzellen zusätzlich zu den humanen Schwer- und Leichtkettengenen eingeführt werden. Die Maus-Schwer- und Leichtketten-Immunglobulingene können getrennt oder gleichzeitig mit der Einführung von humanen Immunglobulinloci durch homologe Rekombination nicht funktionsfähig gemacht werden. Insbesondere verhindert die homozygote Deletion der JH-Region die endogene Antikörperproduktion. Die modifizierten embryonalen Stammzellen werden expandiert und in Blastozyten mikroinjiziert, um chimäre Mäuse zu produzieren. Die chimären Mäuse werden dann aufgezogen, um homozygote Nachkommen zu produzieren, die humane Antikörper exprimieren. Die transgenen Mäuse werden auf normale Weise mit einem ausgewählten Antigen, z.B. das gesamte oder ein Teil eines erfindungsgemäße(n) Polypeptid(s), immunisiert. Gegen das Antigen gerichtete monoklonale Antikörper können mit herkömmlicher Hybridomtechnik von den immunisierten, transgenen Mäusen erhalten werden. Die von den transgenen Mäusen beherbergten humanen Immunglobulintransgene ordnen sich während der B-Zelldifferenzierung neu und durchlaufen anschließend einen Klassenwechsel und eine somatische Mutation. Mit einer solchen Methode ist es daher möglich, therapeutisch nützliche IgG-, IgA-, IgM- und IgE-Antikörper zu produzieren. Für eine Übersicht über diese Technik zum Produzieren humaner Antikörper siehe Lonberg und Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65–93). Für eine ausführliche Erörterung dieser Technik zum Produzieren humaner Antikörper und humaner monoklonaler Antikörper und Protokolle zum Produzieren solcher Antikörper siehe z.B. PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 98/24893, WO 96/34096 und WO 96/33735; und US-Pat. Nr. 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318 und 5,939,598, die in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind. Andere Verfahren sind in den Beispielen hierin ausführlich beschrieben. Darüber hinaus können Unternehmen wie Abgenix, Inc/Amgen. (Thousand Oaks, Kalif.) OMT (Paolo Alto, Calif.), Argen-x (Breda, Niederlande), Ablexis (San Francisco, Kalif.) oder Harbour Antibodies (Cambridge, Mass.) beauftragt werden, gegen ein ausgewähltes Antigen gerichtete humane Antikörper unter Anwendung einer Technik bereitzustellen, die der oben beschriebenen ähnlich ist.

Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, bei dem verschiedene Abschnitte des Antikörpers von verschiedenen Immunglobulinmolekülen abgeleitet sind. Verfahren zum Produzieren von chimären Antikörpern sind in der Technik bekannt (siehe z.B. Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191–202; und US-Pat. Nr. 5,807,715, 4,816,567, 4,816,397 und 6,331,415, die in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind).

Ein humanisierter Antikörper ist ein Antikörper oder seine Variante oder ein Fragment davon, der/die/das in der Lage ist, sich an ein vorbestimmtes Antigen zu binden, und der/die/das eine Framework-Region mit im Wesentlichen der Aminosäuresequenz eines humanen Immunglobulins und einer CDR mit im Wesentlichen der Aminosäuresequenz eines nicht humanen Immunglobulins beinhaltet. Ein humanisierter Antikörper beinhaltet im Wesentlichen alle von wenigstens einer und typischerweise zwei variablen Domänen (Fab, Fab′, F(ab′)2, Fabc, Fv), wobei alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen solchen eines nicht humanen Immunglobulins (d.h. Spenderantikörper) entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der Framework-Regionen solche einer humanen Immunglobulin-Consensus-Sequenz sind. Vorzugsweise beinhaltet ein humanisierter Antikörper auch wenigstens einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise den eines humanen Immunglobulins. Gewöhnlich enthält der Antikörper sowohl die Leichtkette als auch wenigstens die variable Domäne einer Schwerkette. Der Antikörper kann auch die CH1-, Gelenk-, CH2-, CH3- und CH4-Regionen der Schwerkette enthalten. Der humanisierte Antikörper kann aus einer beliebigen Klasse von Immunglobulinen ausgewählt sein, inkl. IgM, IgG, IgD, IgA und IgE, und einem beliebigen Isotyp, inkl. IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4. Normalerweise ist die konstante Domäne eine komplementfixierende konstante Domäne, wobei es erwünscht ist, dass der humanisierte Antikörper zytotoxische Aktivität aufweist, und die Klasse ist typischerweise IgG1. Wenn eine solche zytotoxische Aktivität nicht erwünscht ist, kann die konstante Domäne zur IgG2-Klasse gehören. In bestimmten Ausgestaltungen beinhalten die erfindungsgemäßen Antikörper eine humane konstante Gamma-4-Region. In einer anderen Ausgestaltung bindet die konstante Schwerketten-Region Fc-γ-Rezeptoren nicht und beinhaltet z.B. eine Leu235Glu-Mutation. In einer anderen Ausgestaltung beinhaltet die konstante Schwerkettenregion eine Ser228Pro-Mutation zum Erhöhen der Stabilität. In einer anderen Ausgestaltung ist die konstante Schwerkettenregion IgG4-PE. Zu konstanten VL- und VH-Domänen, die in bestimmten Ausgestaltungen der Erfindung verwendet werden können, gehören z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, C-Kappa und C-Gamma-1 (nG1m), beschrieben in Johnson et al. (1997) J. Infect. Dis. 176, 1215–1224, und die im US-Pat. Nr. 5,824,307 beschriebenen. Der humanisierte Antikörper kann Sequenzen von mehr als einer Klasse oder einem Isotyp beinhalten, und die Auswahl spezieller konstanter Domänen zur Optimierung gewünschter Effektorfunktionen liegt im Kompetenzbereich der durchschnittlichen Fachperson. Framework und CDR-Regionen eines humanisierten Antikörpers brauchen nicht genau mit den Parentalsequenzen übereinzustimmen, z.B. kann die Spender-CDR oder das Consensus-Framework durch Substitution, Insertion oder Deletion von wenigstens einem Rest mutagenisiert werden, so dass der CDR- oder Framework-Rest an dieser Stelle weder mit dem Consensus- noch mit dem Import-Antikörper übereinstimmt. Solche Mutationen sind jedoch nicht umfangreich. Gewöhnlich stimmen wenigstens 75 % der humanisierten Antikörperreste mit solchen der FR- und CDR-Parentalsequenzen überein, häufiger 90 % und am meisten bevorzugt mehr als 95 %. Humanisierte Antikörper können mit einer in der Technik bekannten Vielfalt von Methoden produziert werden, wie z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, CDR-Pfropfung (Europäisches Patent Nr. EP 239,400; Internationale Veröffentlichung Nr. WO 91/09967; und US-Pat. Nr. 5,225,539, 5,530,101 und 5,585,089), Verblendung oder Oberflächenerneuering (Europäische Patente Nr. EP 592,106 und EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489–498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805–814; und Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969–973), Ketten-Shuffling (US-Pat. Nr. 5,565,332) und in z.B. US-Pat. Nr. 6,407,213, US-Pat. Nr. 5,766,886, WO 9317105, Tan et al., J. Immunol. 169: 1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5): 353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10): 895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s–5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8): 1717–22 (1995), Sandhu J S, Gene 150(2): 409–10 (1994), und Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3): 959–73 (1994) offenbarte Methoden. Siehe auch US-Patentveröffentlichung Nr. US 2005/0042664 A1 (Feb. 24, 2005), die in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist. Oft werden Framework-Reste in den Framework-Regionen durch die entsprechenden Reste von dem CDR-Spenderantikörper substituiert, um die Antigenbindung zu verändern, vorzugsweise zu verbessern. Diese Framework-Substitutionen werden durch in der Technik gut bekannte Verfahren z.B. durch Modellieren der Interaktionen der CDR und der Framework-Reste identifiziert, um Framework-Reste zu identifizieren, die für Antigenbindung und Sequenzvergleich wichtig sind, um ungewöhnliche Framework-Reste an speziellen Positionen zu identifizieren (siehe z.B. Queen et al., US-Pat. Nr. 5,585,089; und Reichmann et al., 1988, Nature 332: 323, die in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind).

Einzeldomänenantikörper, z.B. Antikörper, denen die Leichtketten fehlen, können mit in der Technik gut bekannten Verfahren produziert werden (siehe Riechmann et al., 1999, J. Immunol. 231: 25–38; Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3): 253–263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4): 277302; US-Pat. Nr. 6,005,079; und Internationale Veröffentlichungen Nr. WO 94/04678, WO 94/25591 und WO 01/44301, die jeweils in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind).

Ferner können die Antikörper, die sich spezifisch an ein hOX40L-Antigen binden, wiederum zum Erzeugen von antiidiotypischen Antikörpern, die ein Antigen “nachahmen”, mit der Fachperson gut bekannten Methoden verwendet werden (siehe z.B. Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7(5): 437–444; und Nissinoff, 1991, J. Immunol., 147(8): 2429–2438).

Kits

Die Erfindung stellt außerdem eine(n) pharmazeutische(n) oder diagnostische(n) Packung oder Kit bereit, die/der einen oder mehrere Behälter beinhaltet, die mit einem oder mehreren der Inhaltsstoffe der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind, wie z.B. ein oder mehrere hierin bereitgestellte Antikörper oder Fragmente. Optional kann mit (einem) solchen Behälter(n) eine Mitteilung in der Form assoziiert sein, wie sie von einer Regierungsbehörde, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten reguliert, vorgeschrieben wird, wobei die Mitteilung die Zulassung von Herstellung, Verwendung oder Verkauf seitens der Behörde für die humane Verabreichung wiedergibt, z.B. eine Zulassungsnummer.

Die vorliegende Erfindung stellt Kits bereit, die in den obigen Verfahren verwendet werden können. In einer Ausgestaltung beinhaltet ein Kit einen Antikörper der Erfindung, vorzugsweise einen gereinigten Antikörper, in einem oder mehreren Behältern. In einer spezifischen Ausgestaltung enthalten die Kits der vorliegenden Erfindung ein im Wesentlichen isoliertes hOX40L-Antigen als Kontrolle. Vorzugsweise beinhalten die Kits der vorliegenden Erfindung einen Kontrollantikörper, der nicht mit dem hOX40L-Antigen reagiert. In einer anderen spezifischen Ausgestaltung enthalten die Kits der vorliegenden Erfindung ein Mittel zum Detektieren der Bindung eines modifizierten Antikörpers an ein hOX40L-Antigen (z.B. kann der Antikörper mit einem detektierbaren Substrat wie einer fluoreszierenden Verbindung, einem enzymatischen Substrat, einer radioaktiven Verbindung oder einer lumineszierenden Verbindung konjugiert werden oder ein zweiter Antikörper, der den ersten Antikörper erkennt, kann mit einem detektierbaren Substrat konjugiert werden). In spezifischen Ausgestaltungen kann der Kit ein rekombinant produziertes oder chemisch synthetisiertes hOX40L-Antigen beinhalten. Das im Kit bereitgestellte hOX40L-Antigen kann auch an einen festen Träger angebracht werden. In einer spezifischeren Ausgestaltung beinhaltet das Detektionsmittel des oben beschriebenen Kits einen festen Träger, an den das hOX40L-Antigen angefügt wird. Ein solcher Kit kann auch einen nicht angefügten Reporter-markierten Anti-Human-Antikörper beinhalten. In dieser Ausgestaltung kann eine Bindung des Antikörpers an das hOX40L-Antigen durch eine Bindung des genannten Reporter-markierten Antikörpers detektiert werden.

"Konservative Aminosäuresubstitutionen" ergeben sich aus dem Ersetzen von einer Aminosäure durch eine andere mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, wie dem Ersetzen eines Leucins durch ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat oder eines Threonins durch ein Serin. Folglich bezieht sich eine "konservative Substitution" einer speziellen Aminosäuresequenz auf die Substitution solcher Aminosäuren, die für die Polypeptidaktivität nicht entscheidend sind, oder die Substitution von Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (z.B. sauer, basisch, positiv oder negativ geladen, polar oder nicht polar usw.), so dass die Substitution von selbst kritischen Aminosäuren die Aktivität des Peptids nicht reduziert (d.h. die Fähigkeit des Peptids, die Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu penetrieren). Konservative Substitutionstabellen, die funktionell ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind in der Technik gut bekannt. Die folgenden sechs Gruppen enthalten zum Beispiel jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander sind: 1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T); 2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lysin (K); 5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und 6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W) (siehe auch Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984), hierin in der Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen). In einigen Ausgestaltungen können individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren verändern, hinzufügen oder deletieren, auch als "konservative Substitutionen" angesehen werden, wenn die Veränderung nicht die Aktivität des Peptids reduziert. Insertionen oder Deletionen liegen typischerweise im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren. Die Wahl der konservativen Aminosäuren kann auf der Basis der Lage der zu substituierenden Aminosäure in dem Peptid erfolgen, z.B. wenn die Aminosäure im Außenbereich des Peptids liegt und gegenüber Lösungsmitteln exponiert ist oder im Innenbereich liegt und nicht gegenüber Lösungsmitteln exponiert ist.

In alternativen Ausgestaltungen kann die Aminosäure, die eine bestehende Aminosäure substituiert, anhand der Lage der bestehenden Aminosäure, d.h. ihrer Exposition gegenüber Lösungsmitteln, ausgewählt werden (d.h. wenn die Aminosäure gegenüber Lösungsmitteln exponiert ist oder auf der Außenfläche des Peptids oder Polypeptids vorliegt, im Vergleich zu intern befindlichen Aminosäuren, die nicht gegenüber Lösungsmitteln exponiert sind). Die Auswahl solcher konservativer Aminosäuresubstitutionen ist in der Technik gut bekannt, z.B. wie in Dordo et al, J. Mol Biol, 1999, 217, 721–739 und Taylor et al., J. Theor. Biol. 119(1986); 205–218 und S. French und B. Robson, J. Mol. Evol., 19(1983)171, offenbart. Folglich können konservative Aminosäuresubstitutionen ausgewählt werden, die für Aminosäuren im Außenbereich eines Proteins oder Peptids geeignet sind (d.h. Aminosäuren, die gegenüber einem Lösungsmittel exponiert sind), und die folgenden Substitutionen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, können verwendet werden: Substitution von Y durch F, T durch S oder K, P durch A, E durch D oder Q, N durch D oder G, R durch K, G durch N oder A, T durch S oder K, D durch N oder E, I durch L oder V, F durch Y, S durch T oder A, R durch K, G durch N oder A, K durch R, A durch S, K oder P.

In alternativen Ausgestaltungen können auch konservative Aminosäuresubstitutionen ausgewählt werden, die für Aminosäuren im Innenbereich eines Proteins oder Peptids geeignet sind, z.B. können geeignete konservative Substitutionen für Aminosäuren im Innenbereich eines Proteins oder Peptids (d.h. die Aminosäuren sind nicht gegenüber einem Lösungsmittel exponiert) verwendet werden und es können z.B., aber ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden konservativen Substitutionen verwendet werden: wobei Y durch F substituiert wird, T durch A oder S, I durch L oder V, W durch Y, M durch L, N durch D, G durch A, T durch A oder S, D durch N, I durch L oder V, F durch Y oder L, S durch A oder T und A durch S, G, T oder V. In einigen Ausgestaltungen sind nicht konservative Aminosäuresubstitutionen ebenfalls im Rahmen des Varianten-Begriffs eingeschlossen.

Der hierin verwendete Begriff “Antikörper” bezieht sich auf IgG-, IgM-, IgA-, IgD- oder IgE-Moleküle oder antigenspezifische Antikörperfragmente davon (inkl., aber ohne darauf beschränkt zu sein, ein Fab, F(ab')2, Fv, Disulfid-verknüpftes Fv, scFv, Einzeldomänenantikörper, multispezifischer Antikörper mit geschlossener Konformation, Disulfid-verknüpftes scfv, Diabody), unabhängig davon, ob von einer beliebigen Spezies, die natürlich einen Antikörper produziert, abgeleitet oder durch DNA-Rekombinationstechnik erzeugt; ob von Serum, B-Zellen, Hybridomen, Transfektomen, Hefe oder Bakterien isoliert. Antikörper können mit Routinetechnik humanisiert werden.

Wie hierin beschrieben, ist ein "Antigen" ein Molekül, das durch eine Bindungsstelle an ein Antikörperagens gebunden wird. Typischerweise werden Antigene durch Antikörperliganden gebunden und können eine Antikörperreaktion in vivo hervorrufen. Ein Antigen kann ein Polypeptid, Protein, eine Nucleinsäure oder ein anderes Molekül oder ein Abschnitt davon sein. Der Begriff "antigene Determinante" bezieht sich auf ein Epitop auf dem Antigen, das durch ein Antigenbindungsmolekül und insbesondere durch die Antigenbindungsstelle des genannten Moleküls erkannt wird.

Der hierin verwendete Begriff “Antikörperfragment" bezieht sich auf ein Polypeptid, das wenigstens eine variable Immunglobulindomäne oder variable Immunglobulindomänensequenz beinhaltet und sich spezifisch an ein bestimmtes Antigen bindet. Ein Antikörperfragment kann einen Antikörper oder ein Polypeptid beinhalten, der/das eine Antigenbindungsdomäne eines Antikörpers beinhaltet. In einigen Ausgestaltungen kann ein Antikörperfragment einen monoklonalen Antikörper oder ein Polypeptid beinhalten, der/das eine Antigenbindungsdomäne eines monoklonalen Antikörpers beinhaltet. Beispielsweise kann ein Antikörper eine variable Schwerketten-(H)-Region (hierin mit VH abgekürzt) und eine variable OX40L-(L)-Ketten-Region (hierin mit VL abgekürzt) beinhalten. In einem anderen Beispiel beinhaltet ein Antikörper zwei variable Schwerketten-(H)-Regionen und zwei variable OX40L-(L)-Ketten-Regionen. Der Begriff "Antikörperfragment" schließt Antigenbindungsfragmente von Antikörpern ein (z.B. einkettige Antikörper, Fab- und sFab-Fragmente, F(ab')2, Fd-Fragmente, Fv-Fragmente, scFv und Domänenantikörper-(dAb)-Fragmente (siehe z.B. de Wildt et al., Eur J. Immunol., 1996; 26(3): 629–39; in der Gesamtheit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen)) sowie komplette Antikörper. Ein Antikörper kann die strukturellen Merkmale von IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (sowie Subtypen und Kombinationen davon) haben. Antikörper können von einer beliebigen Quelle stammen, inkl. Maus-, Kaninchen-, Schweine-, Ratten- und Primaten- (humane und nicht humane Primaten) und primatisierter Antikörper. Antikörper beinhalten auch Midikörper, humanisierte Antikörper, chimäre Antikörper und dergleichen.

Der hierin verwendete Begriff "variable Antikörperdomäne" bezieht sich auf die Abschnitte des OX40L und Schwerketten von Antikörpermolekülen, die Aminosäuresequenzen von Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs; d.h. CDR1, CDR2 und CDR3) und Framework-Regionen (FRs) beinhalten. VH bezieht sich auf die variable Domäne der Schwerkette. VL bezieht sich auf die variable Domäne der Leichtkette. In Übereinstimmung mit den in der vorliegenden Erfindung angewendeten Verfahren können die den CDRs und FRs zugeordneten Aminosäurepositionen gemäß Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 und 1991)) oder gemäß IMGT-Nomenklatur definiert sein.

Der hierin verwendete Begriff “Antikörperbindungsstelle” bezieht sich auf ein Polypeptid oder eine Domäne, das/die eine oder mehrere CDRs eines Antikörpers beinhaltet und ein Antigen binden kann. Das Polypeptid beinhaltet z.B. eine CDR3 (z.B. HCDR3). Das Polypeptid beinhaltet z.B. CDRs 1 und 2 (z.B. HCDR1 und 2) oder CDRs 1–3 einer variablen Domäne eines Antikörpers (z.B. HCDRs1–3). In einem Beispiel wird die Antikörperbindungsstelle durch eine einzelne variable Domäne (z.B. eine VH- oder VL-Domäne) bereitgestellt. In einem anderen Beispiel beinhaltet die Bindungsstelle ein VH/VL-Paar oder zwei oder mehrere solcher Paare.

Der hierin verwendete Begriff “Genotypisierung” bezieht sich auf einen Prozess zum Bestimmen der spezifischen Allelzusammensetzung einer Zelle und/oder eines Subjekts an einer oder mehreren Positionen innerhalb des Genoms, z.B. durch Bestimmen der Nucleinsäuresequenz an dieser Position. Genotypisierung bezieht sich auf eine Nucleinsäureanalyse und/oder Analyse auf Nucleinsäureebene. Der hierin verwendete Begriff “Phänotypisierung” bezieht sich auf einen Prozess zum Bestimmen der Identität und/oder Zusammensetzung eines Expressionsprodukts einer Zelle und/oder eines Subjekts, z.B. durch Bestimmen der Polypeptidsequenz eines Expressionsprodukts. Phänotypisierung bezieht sich auf eine Proteinanalyse und/oder eine Analyse auf Proteinebene.

Die hierin verwendeten Begriffe "behandeln”, "Behandlung", "behandelnd” oder “Besserung” beziehen sich auf therapeutische Behandlungen, wobei das Ziel darin besteht, den Fortschritt oder die Schwere eines Zustands in Verbindung mit einer Krankheit oder Störung umzukehren, zu lindern, zu bessern, zu inhibieren, verlangsamen oder zu stoppen. Der Begriff “behandelnd" beinhaltet das Verringern oder Lindern von wenigstens einem nachteiligen Effekt oder Symptom eines Zustands, einer Krankheit oder Störung. Die Behandlung ist im Allgemeinen “wirksam", wenn ein oder mehrere Symptome oder klinische Marker verringert werden. Alternativ ist die Behandlung “wirksam", wenn der Fortschritt einer Krankheit verringert oder angehalten wird. Das heißt, “Behandlung" schließt nicht nur die Verbesserung von Symptomen oder Markern ein, sondern auch einen Stillstand oder zumindest eine Verlangsamung des Fortschritts oder einer Verschlimmerung von Symptomen im Vergleich zu dem, was man ohne die Behandlung erwarten würde. Zu vorteilhaften oder erwünschten klinischen Ergebnissen gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, die Linderung von einem oder mehreren Symptom(en), die Verringerung des Ausmaßes der Krankheit, ein stabilisierter (d.h. nicht verschlimmernder) Krankheitsstatus, eine Verzögerung oder Verlangsamung des Krankheitsfortschritts, eine Besserung oder Linderung des Krankheitsstatus, eine Remission (teilweise oder vollständig) und/oder eine verringerte Mortalität, ob nachweisbar oder nicht nachweisbar. Der Begriff "Behandlung" einer Krankheit schließt auch die Linderung von Symptomen oder Nebenwirkungen der Krankheit ein (inkl. palliativer Behandlung). Eine komplette Heilung ist für eine wirksame Behandlung nicht vorgesehen. Das Verfahren kann in bestimmten Aspekten auch eine Heilung beinhalten.

Der hierin verwendete Begriff “pharmazeutische Zusammensetzung” bezieht sich auf das aktive Mittel in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, z.B. einem Träger, der üblicherweise in der Pharmaindustrie verwendet wird. Der hierin verwendete Ausdruck "pharmazeutisch akzeptabel" bezieht sich auf solche Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen, die im Rahmen eines gesunden medizinischen Urteils zur Verwendung in Kontakt mit den Geweben von Menschen und Tieren geeignet sind, ohne übermäßige Toxizität, Irritation, allergische Reaktion oder andere Probleme oder Komplikationen, entsprechend einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnisses.

Der hierin verwendete Begriff "Verabreichen" bezieht sich auf die Platzierung einer hierin offenbarten Verbindung in einem Subjekt durch ein Verfahren oder eine Route, das/die in wenigstens einer teilweisen Zuführung des Mittels zu einer gewünschten Stelle resultiert. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die hierin offenbarten Verbindungen beinhalten, können über jede beliebige zweckmäßige Route verabreicht werden, die in einer wirksamen Behandlung bei dem Subjekt resultiert.

Mehrere Zusammensetzungen können getrennt oder gleichzeitig verabreicht werden. Die getrennte Verabreichung bezieht sich auf eine Verabreichung von zwei Zusammensetzungen zu unterschiedlichen Zeiten, z.B. wenigstens 10, 20, 30 oder 10–60 Minuten auseinander oder 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 Stunden auseinander. Zusammensetzungen können auch 24 Stunden oder noch länger auseinander verabreicht werden. Alternativ können zwei oder mehrere Zusammensetzungen gleichzeitig, z.B. weniger als 10 oder weniger als 5 Minuten auseinander, verabreicht werden. Gleichzeitig verabreichte Zusammensetzungen können in einigen Aspekten als Gemisch verabreicht werden, mit oder ohne ähnliche oder verschiedene Depotmechanismen für jede der Komponenten.

Der hierin verwendete Begriff “Zulassungsnummer” oder “Zulassungsnummer für das Inverkehrbringen” bezieht sich auf eine Nummer, die von einer Regulierungsbehörde erteilt wird, nachdem diese Behörde entschieden hat, dass ein(e) bestimmte(s) medizinische(s) Produkt und/oder Zusammensetzung im Zuständigkeitsbereich der Behörde auf den Markt gebracht und/oder zum Verkauf angeboten werden darf. Der hierin verwendete Begriff “Regulierungsbehörde” bezieht sich auf eine der Behörden, die für die Beurteilung, z.B. der Sicherheit und Wirksamkeit eines/einer medizinischen Produkts und/oder Zusammensetzung, und Kontrolle des Verkaufs/der Vermarktung solcher Produkte und/oder Zusammensetzungen in einem bestimmten Gebiet zuständig ist. Die Food and Drug Administration (FDA) in den USA und die European Medicines Agency (EPA) in Europa sind nur zwei Beispiele für solche Regulierungsbehörden. Andere nicht begrenzende Beispiele können SDA, MPA, MHPRA, IMA, ANMAT, Hong Kong Department of Health-Drug Office, CDSCO, Medsafe und KFDA gehören.

Der hierin verwendete Begriff "Injektionsvorrichtung" bezieht sich auf eine Vorrichtung, die zum Durchführen von Injektionen vorgesehen ist, wobei eine Injektion die Schritte des vorübergehenden fluidischen Koppelns der Injektionsvorrichtung mit dem Gewebe, typischerweise subkutanes Gewebe, einer Person beinhaltet. Eine Injektion beinhaltet ferner das Verabreichen einer Menge eines flüssigen Arzneimittels in das Gewebe und Abkoppeln oder Entfernen der Injektionsvorrichtung von dem Gewebe. In einigen Ausgestaltungen kann eine Injektionsvorrichtung eine intravenöse Vorrichtung oder IV-Vorrichtung sein, die eine Art Injektionsvorrichtung ist, die verwendet wird, wenn das Zielgewebe das Blut innerhalb des Zirkulationssystems ist, z.B. das Blut in einer Vene. Ein gängiges, aber nicht begrenzendes Beispiel für eine Injektionsvorrichtung ist eine Nadel und eine Spritze.

Der hierin verwendete Begriff "Puffer" bezieht sich auf ein chemisches Mittel, das eine bestimmte Menge einer Säure oder Base absorbieren kann, ohne dabei eine starke pH-Schwankung durchzumachen.

Der hierin verwendete Begriff “Verpackung” bezieht sich darauf, wie die Komponenten in einer für den Vertrieb und/oder die Verwendung geeigneten Einheit angeordnet und/oder festgehalten werden. Die Verpackung kann z.B. Schachteln, Beutel, Spritzen, Ampullen, Phiolen, Röhrchen, Clamshell-Verpackungen, Barrieren und/oder Behälter zum Aufrechterhalten von Sterilität, Etikettierung usw. beinhalten.

Der hierin verwendete Begriff “Anweisungen” bezieht sich auf die Anzeige von geschriebenem, gedrucktem oder graphischem Material auf dem unmittelbaren Behälter eines Artikels, z.B. das auf einer Phiole, die ein pharmazeutisch aktives Mittel enthält, angezeigte geschriebene Material, oder Einzelheiten über die Zusammensetzung und den Gebrauch eines Produkts von Interesse, die in einem Kit enthalten sind, der eine Zusammensetzung von Interesse enthält. Anweisungen legen das Behandlungsverfahren dar, das verabreicht oder durchgeführt werden soll.

Der hierin verwendete Begriff "beinhaltend" oder "beinhaltet" wird mit Bezug auf Antikörper, Fragmente, Verwendungen, Zusammensetzungen, Verfahren und (eine) jeweilige Komponente(n) davon verwendet, die für das Verfahren oder die Zusammensetzung wesentlich, dabei aber für den Einschluss unspezifischer Elemente, ob wesentlich oder nicht, offen sind.

Der Begriff "bestehend aus" bezieht sich auf Antikörper, Fragmente, Verwendungen, Zusammensetzungen, Verfahren und jeweilige Komponenten davon, wie hierin beschrieben, ausschließlich jeglicher Elemente, die in der Beschreibung der Ausgestaltung nicht aufgeführt sind.

Der hierin verwendete Begriff "im Wesentlichen bestehend aus" bezieht sich auf Elemente, die für eine bestimmte Ausgestaltung erforderlich sind. Der Begriff lässt die Anwesenheit von Elementen zu, die die grundlegende(n) und neuartige(n) oder funktionelle(n) Charakteristik(en) dieser Ausgestaltung nicht wesentlich beeinflussen.

Die Singularwörter "ein/eine/einer/eines" und "die/der/das" schließen Pluralreferenten ein, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes anzeigt. Ebenso soll das Wort "oder" "und" einschließen, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes anzeigt. Obschon Verfahren und Materialien in der Praxis oder Überprüfung dieser Offenbarung verwendet werden können, die den hierin beschriebenen ähnlich sind oder diesen entsprechen, sind geeignete Verfahren und Materialien im Folgenden beschrieben. Die Abkürzung "e.g.“ (z.B.) steht für das lateinische exempli gratia und wird hierin verwendet, um auf ein nicht begrenzendes Beispiel hinzuweisen. Folglich ist die Abkürzung "e.g." synonym mit dem Begriff "zum Beispiel."

Definitionen gängiger Begriffe der Zellbiologie und Molekularbiologie sind in “The Merck Manual of Diagnosis and Therapy”, 19. Ausgabe, veröffentlicht von Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (Hrsg.), The Encyclopedia of Molecular Biology, veröffentlicht von Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, veröffentlicht von Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (Hrgs.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, veröffentlicht von VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) und Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., Hrsg., zu finden.

Sofern nicht anders angegeben, wurde die vorliegende Erfindung mit Standardverfahren ausgeführt, wie z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. Ausg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., USA (2012); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995); oder Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Bd. 152, S. L. Berger und A. R. Kimmel, Hrsg., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et al., Hrsg., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et al. Hrsg., John Wiley and Sons, Inc.), und Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5. Ausgabe (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Bd. 57, Jennie P. Mather und David Barnes, Herausgeber, Academic Press, 1. Ausgabe, 1998) beschrieben, die alle hierin in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen sind.

Andere Begriffe sind hierin im Rahmen der Beschreibung der verschiedenen Aspekte der Erfindung definiert.

Alle Patente und anderen Veröffentlichungen; inkl. Literaturhinweise, erteilter Patente, veröffentlichter Patentanmeldungen und mitanhängiger Patentanmeldungen; die im Laufe der vorliegenden Anmeldung aufgeführt sind, sind hierin ausdrücklich durch Bezugnahme zwecks Beschreibung und Offenbarung eingeschlossen, z.B. die in solchen Veröffentlichungen beschriebenen Methodiken, die in Verbindung mit der hierin beschriebenen Technik angewendet werden können. Diese Veröffentlichungen werden ausschließlich für ihre Offenbarung vor dem Einreichungsdatum der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. In dieser Hinsicht ist nichts als ein Zugeständnis auszulegen, dass die Erfinder nicht berechtigt sind, eine solche Offenbarung aufgrund einer vorherigen Erfindung oder aus irgendeinem anderen Grund zu antedatieren. Alle Aussagen mit Bezug auf das Datum oder die Repräsentation mit Bezug auf den Inhalt dieser Dokumente beruhen auf den Informationen, die den Anmeldern zur Verfügung stehen, und stellten kein Zugeständnis mit Bezug auf die Korrektheit der Daten oder Inhalte dieser Dokumente dar.

Die Beschreibung von Ausgestaltungen der Offenbarung soll nicht erschöpfend sein oder die Offenbarung auf die offenbarte präzise Form begrenzen. Zwar werden spezifische Ausgestaltungen der und Beispiele für die Offenbarung hierin für Veranschaulichungszwecke beschrieben, doch sind verschiedene äquivalente Modifikationen im Rahmen der Offenbarung möglich, wie die Fachperson erkennen wird. Verfahrensschritte oder Aufgaben werden zwar z.B. in einer bestimmten Reihenfolge präsentiert, doch können alternative Ausgestaltungen Aufgaben in einer anderen Reihenfolge ausführen oder Funktionen können im Wesentlichen gleichzeitig ausgeführt werden. Die Lehren der hierin gegebenen Offenbarung können gegebenenfalls auf andere Verfahren oder Verfahren angewendet werden. Die hierin beschriebenen verschiedenen Ausgestaltungen können kombiniert werden, um weitere Ausgestaltungen bereitzustellen. Aspekte der Offenbarung können, falls erforderlich, modifiziert werden, um die Zusammensetzungen, Aufgaben und Konzepte der obigen Referenzen und Anmeldung zu verwenden, um noch weitere Ausgestaltungen der Offenbarung bereitzustellen. Ferner können aufgrund von Überlegungen bzgl. der biologischen funktionellen Gleichwertigkeit Änderungen an der Proteinstruktur vorgenommen werden, ohne die biologische oder chemische Wirkung mit Bezug auf Art oder Menge zu beeinflussen. Diese und andere Änderungen können an der Offenbarung von OX40L der ausführlichen Beschreibung vorgenommen werden. Alle diese Modifikationen gelten als in den Rahmen der angefügten Ansprüche fallend.

Spezifische Elemente von beliebigen der vorangehenden Ausgestaltungen können kombiniert oder durch Elemente in anderen Ausgestaltungen ersetzt werden. Ferner wurden zwar Vorteile in Verbindung mit bestimmten Ausgestaltungen der Offenbarung im Kontext dieser Ausgestaltungen beschrieben, doch können andere Ausgestaltungen ebenfalls diese Vorteile aufweisen und nicht alle Ausgestaltungen müssen zwangsläufig solche Vorteile aufweisen, um in den Rahmen der Offenbarung zu fallen.

Man wird verstehen, dass spezielle hierin beschriebene Konfigurationen, Aspekte, Beispiele, Klauseln und Ausgestaltungen zur Veranschaulichung und nicht als Begrenzungen der Erfindung dargelegt sind. Die Hauptmerkmale der vorliegenden Erfindung können in verschiedenen Ausgestaltungen verwendet werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Die Fachperson wird zahlreiche Äquivalente zur den hierin beschriebenen spezifischen Verfahren erkennen oder in der Lage sein, sie lediglich mit routiemäßigen Studien zu bestimmen. Solche Äquivalente werden als in den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallend und von den Ansprüchen abgedeckt angesehen. Alle in der Spezifikation erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen lassen auf das Kompetenzniveau der Fachperson schließen, an die diese Erfindung gerichtet ist. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin durch Bezugnahme im gleichen Maße eingeschlossen, als wäre angegeben, dass jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Verwendung der Wörter "ein/eine/einer/eines" in Verbindung mit dem Wort "beinhaltend" in den Ansprüchen und/oder der Spezifikation kann "eins" bedeuten, kann aber auch mit der Bedeutung von "ein oder mehrere", "wenigstens eins" und "eins oder mehr als eins" übereinstimmen. Die Verwendung des Wortes "oder" in den Ansprüchen ist als "und/oder" zu verstehen, sofern nicht ausdrücklich angegeben wird, dass es sich nur auf Alternativen bezieht oder die Alternativen sich gegenseitig ausschließen, obschon die Offenbarung eine Definition befürwortet, die sich nur auf Alternativen und "und/oder" bezieht. Das Wort "etwa" wird in der vorliegenden Anmeldung durchweg verwendet, um anzuzeigen, dass ein Wert die inhärente Fehlerabweichung für die Vorrichtung, das zum Bestimmen des Wertes angewendete Verfahren oder die Abweichung beinhaltet, die unter den Studiensubjekten vorliegt.

Die in der vorliegenden Spezifikation und dem/den Anspruch/Ansprüchen verwendeten Wörter "umfassend" (und jede Form von umfassend wie "umfassen" und "umfasst"), "aufweisend" (und jede Form von aufweisend wie "aufweisen" und "aufweist"), "beinhaltend" (und jede Form von beinhaltend wie "beinhaltet" und "beinhalten") oder "enthaltend" (und jede Form von enthaltend wie "enthält" und "enthalten") sind inklusiv und offen zu verstehen und schließen zusätzliche, nicht aufgeführte Elemente oder Verfahrensschritte nicht aus.

Jeder Teil der vorliegenden Offenbarung kann in Kombination mit einem beliebigen anderen Teil der Offenbarung gelesen werden, sofern nichts anderes anhand des Kontextes offensichtlich ist.

Alle hierin offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und/oder Verfahren können ohne unnötiges Experimentieren an OX40L der vorliegenden Offenbarung ausgeführt werden. Zwar wurden die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf bevorzugte Ausgestaltungen beschrieben, aber es wird der Fachperson einleuchten, dass Änderungen an den Zusammensetzungen und/oder Verfahren und den Schritten oder der Folge der Schritte des hierin beschriebenen Verfahrens möglich sind, ohne von Konzept, Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen. Alle diese ähnlichen Substitute und Modifikationen, die der Fachperson einleuchten, werden als innerhalb des Wesens, des Umfangs und Konzepts der Erfindung liegend angesehen, wie von den angefügten Ansprüchen definiert.

BEISPIELEBeispiel 1Antigenherstellung, Immunisierungsverfahren und Hybridomerzeugung

Das folgende Beispiel liefert eine ausführliche Beschreibung der Erzeugung und Identifizierung einer Serie von monoklonalen antihumanen OX40L-Antikörpern mit dem KyMouseTM-System (siehe z.B. WO2011/004192). Zu diesem Zweck wurden genmanipulierte Mäuse, die eine große Anzahl humaner Immunglobulingene enthielten, mit löslichem rekombinantem humanem OX40L (handelsüblich oder werksintern produziert) oder oberflächenexprimiertem humanem OX40L, präsentiert auf embryonalen Mausfibroblasten-(MEF)-Zellen, immunisiert. Es wurden verschiedene Immunisierungsregime, inkl. herkömmlicher intraperitonealer Injektionen sowie eines schnellen Immunisierungsregimes an mehreren Stellen, verwendet, wobei die Tiere über mehrere Wochen einem Boosting unterzogen wurden. Am Ende jedes Regimes wurde sekundäres lymphatisches Gewebe wie die Milz und in einigen Fällen die Lymphknoten entfernt. Aus Gewebe wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt, die mit SP2/0-Zellen fusioniert wurde, um eine stabile Hybridomzelllinie zu erzeugen.

Materialien und Verfahren Klonierungsexpression und Reinigung von rekombinantem Rhesus- und humanem OX40L

cDNA, die die extrazelluläre Domäne von humanem OX40L kodiert, wurde mit standardmäßigen Methoden der Molekularbiologie in ein pREP4-Expressionsplasmid (Invitrogen) kloniert. Die Konstrukte enthielten auch ein FLAG-Peptidmotiv, um die Reinigung zu unterstützen, und ein Isoleucin-Zipper-Motiv, um Trimerisierung zu unterstützen. Konstrukte wurden sequenziert, um ihre korrekte Sequenzzusammensetzung zu gewährleisten.

Rhesus-(Macaca mulatta)-OX40L wurde mit dem oben erzeugten humanen OX40L-Plasmid als Matrize und unter Anwendung von ortsgerichteter Mutagenese erzeugt, um die Aminosäureänderungen einzuführen.

Humanes OX40L sowie Rhesusaffen-OX40L wurden unter Verwendung der FreeStyleTM CHO-S suspensionsadaptierten Zelllinie von Invitrogen transient exprimiert, um rekombinantes Protein zu produzieren. Plasmide wurden in die Zellen mit PEI (Polyethylenimin MW 40000) transfiziert und 13 Tage lang überwuchern gelassen, bevor der Überstand zur Reinigung entnommen wurde. Zellen wurden während des Überwucherungsprozesses mit ActiCHOTM Nahrung A und B von GE Healthcare gefüttert, um die Produktivität anzukurbeln und die Langlebigkeit der Zellen zu unterstützen. Im Laufe des Überwucherungsprozesses wurden regelmäßig Proben genommen, um Zellwachstum und Lebensfähigkeit zu überwachen.

Mit FLAG-Tag versehene OX40L-Proteine wurden in einem Zweistufenverfahren gereinigt; zuerst wurden die geklärten Gewebekulturüberstände von der CHO-S-Expression mit M2 Anti-FLAG – Affinitätschromatographie gereinigt. Die eluierten Fraktionen mit dem OX40L-Protein wurden dann einer Größenausschlusschromatographie unterzogen und hinsichtlich Reinheit durch SDS-PAGE-Analyse beurteilt und durch eine Spektrophotometermessung bei OD280 nm quantifiziert.

Klonierungsexpression und Reinigung von rekombinantem humanem OX40-Rezeptor

cDNA, die die extrazelluläre Domäne des humanen OX40-Rezeptors kodiert, wurde mit standardmäßigem Restriktionsenzymverdau und Ligation in ein pREP4-Expressionsplasmid (Invitrogen) kloniert. Das Konstrukt enthielt einen humanen Fc-Abschnitt, um die Reinigung zu unterstützen. Konstrukte wurden sequenziert, um ihre korrekte Sequenzzusammensetzung zu gewährleisten.

Humaner OX40-Rezeptor wurde unter Verwendung der FreeStyleTM CHO-S suspensionadaptierten Zelllinie von Invitrogen transient exprimiert, um rekombinantes Protein zu produzieren. Plasmide wurden in die Zellen mit PEI (Polyethylenimin MW 40000) transfiziert und 13 Tage lang überwuchern gelassen, bevor der Überstand zur Reinigung entnommen wurde. Zellen wurden während des Überwucherungsprozesses mit ActiCHOTM Nahrung A und B von GE Healthcare gefüttert, um die Produktivität anzukurbeln und die Langlebigkeit der Zellen zu unterstützen. Im Laufe des Überwucherungsprozesses wurden regelmäßig Proben genommen, um Zellwachstum und Lebensfähigkeit zu überwachen.

Das mit Fc-Tag versehene OX40-Rezeptorprotein wurde in einem Zweistufenverfahren gereinigt; zuerst wurden die geklärten Gewebekulturüberstände von der CHO-S-Expression mit Protein-G-Affinitätschromatographie gereinigt. Die das OX40-Rezeptorpotein enthaltenden eluierten Fraktionen wurden dann einer Größenausschlusschromatographie unterzogen und durch SDS-PAGE-Analyse auf Reinheit beurteilt und durch Spektrophotometermessung bei OD280 nm quantifiziert.

Erzeugung stabil transfizierter MEF- und CHO-S-Zellen, die humanes OX40L exprimieren

Die völlig humanen OX40L-Sequenzen wurden zur Säugetierexpression Codon-optimiert (Seq ID Nr. 173) und in einen Expressionsvektor unter dem CMV-Promotor, flankiert von 3’ und 5’ PiggyBac-spezifischen terminalen Wiederholungssequenzen zur Erleichterung einer stabilen Integration in das Zellgenom, kloniert (siehe: “A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications”; Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL. Proc Natl Acad Sci USA. 25. Jan 2011). Ferner enthielt der Expressionsvektor entweder eine Puromycin- oder Neomycin-Selektionskassette zum Erleichtern einer stabilen Zelllinienerzeugung. Das hOX40L-Expressionsplasmid wurde mit einer plasmidkodierenden PiggyBac-Transposase in einer hausintern abgeleiteten embryonalen Maus-Fibroblasten-(MEF)-Zelllinie (Embryos, die zum Erzeugen dieser Linie verwendet wurden, wurden von einer mit C57BL6 gekreuzten weiblichen 129S5-Maus gewonnen) und CHO-S-Zellen mit dem FreeStyle Max Transfektionsreagens (Invitrogen) gemäß Herstelleranweisungen cotransfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium mit G418 oder Neomycin angereichert und wenigstens 2 Wochen lang kultiviert, um eine stabile Zelllinie zu selektieren, wobei das Medium alle 3–4 Tage ausgetauscht wurde. Die Expression von hOX40L wurde per Durchflusszytometrie mit einem Anti-Human-OX40L-PE-konjugierten Antikörper (eBioscience) beurteilt. Komplettes MEF-Medium wurde aus Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (Gibco), angereichert mit 10 % v/v fötalem Rinderserum (Gibco), gebildet. Komplettes CHO-S-Medium wurde aus CD-CHO-Medium, angereichert mit 8 mM Glutamax (Gibco), gebildet.

Erzeugung von HT1080, die OX40R und NF-Kappa-Reportergen exprimiert

Die völlige humane OX40-Rezeptorsequenz wurde zur Säugetierexpression Codon-optimiert (Seq ID Nr. 175) und in einen Expressionsvektor unter dem CMV-Promotor, flankiert von 3’ und 5’ PiggyBac-spezifischen terminalen Wiederholungssequenzen zur Erleichterung einer stabilen Integration in das Zellgenom, kloniert (siehe: “A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications”; Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL. Proc Natl Acad Sci USA. 25. Jan 2011). Ferner enthielt der Expressionsvektor eine Puromycin-Selektionskassette zum Erleichtern einer stabilen Zelllinienerzeugung. Das hOX40L-Rezeptor-Expressionsplasmid wurde mit einer plasmidkodierenden PiggyBac-Transposase in HT1080-Zellen (ATCC® CCL-121) mit dem FreeStyle Max Transfektionsreagens (Invitrogen) gemäß Herstelleranweisungen cotransfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium mit Puromycin angereichert und wenigstens 2 Wochen lang kultiviert, um eine stabile Zelllinie zu selektieren, wobei das Medium alle 3–4 Tage ausgetauscht wurde. Die Expression des OX40-Rezeptors wurde per Durchflusszytometrie mit einem Anti-Human-OX40-Rezeptor-PE-konjugierten Antikörper (R&D, Klon 443318) beurteilt. Nach dem Erzeugen einer stabilen Zelllinie, die den OX40-Rezeptor exprimierte, wurden Zellen mit dem pNiFty-2-SEAP-Plasmid (Invivogen), das 5 wiederholte NFkB-Transkriptionsfaktorbindungsstellen enthielt, gefolgt von sekretierter alkalischer Phosphatase, transfiziert. Stabile Zellen wurden unter Zugabe von Zeocin zum Medium selektiert, wobei alle 3–4 Tage frisches Medium zugegeben wurde. Komplettes HT1080-Medium wurde aus MEM, angereichert mit 10 % fötalem Kälberserum, gebildet.

Herstellung von MEF-Zellen für Maus-Immunisierungen:

Zellkulturmedium wurde entfernt und Zellen wurden einmal mit 1 × PBS gewaschen. Zellen wurden 5 Minuten lang mit Trypsin behandelt, um Zellen von Gewebekulturflächen zu lösen. Zellen wurden aufgefangen und Trypsin wurde durch Zugabe von komplettem Medium mit 10 % v/v fötalem Rinderserum (FCS) neutralisiert. Zellen wurden dann bei 300 xg 10 Minuten lang zentrifugiert und mit 25 ml 1 × PBS gewaschen. Zellen wurden gezählt und mit der zweckmäßigen Konzentration in 1 × PBS resuspendiert.

Immunisierungsverfahren:

Transgene Ky-Mäuse wurden mit hOX40L in löslicher rekombinanter Form, exprimiert durch CHO-S-Zellen, oder membrangebundener Form, exprimiert durch stabil transfizierte MEF-Zellen, immunisiert.

Bei der Immunisierung mit Zellen wurde das Adjuvans mit Zellen in einem Verhältnis von 1:1 v/v gemischt und vorsichtig durch Pipettieren gemischt, dann intraperitoneal injiziert. Bei der Immunisierung mit Protein wurde das Adjuvans mit Protein in einem Verhältnis von 1:1 v/v gemischt und wiederholt verwirbelt. Allen Mäusen wurde vor der Grundimmunisierung (Priming) Blut entnommen und sie erhielten dann alle drei Wochen eine Auffrischung (Boost). Wenigstens 3 aufeinanderfolgende Blutentnahmen in einem Abstand von wenigstens 2 Wochen wurden gesammelt und mit Bezug auf einen hOX40L-spezifischen IgG-Titer mit ELISA oder einem auf Durchflusszytometrie beruhenden Assay analysiert.

Bestimmung der Serumtiter durch FACS mit CHO-S-exprimiertem hOX40L

CHO-S-Zellen, die hOX40L exprimierten, oder nicht transfizierte CHO-S-Zellen, verdünnt in FACS-Puffer (PBS + 1 % w/v BSA + 0,1 % w/v NaN3), wurden auf einer 96-Well-V-Boden-Platte 5(Greiner) in einer Dichte von 1 × 10 Zellen pro Well verteilt. Die Zellen wurden mit 150 µl PBS gewaschen und bei 300 xg 3 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und 150 µl PBS wurden zugegeben. Dieser Schritt wurde wiederholt. Es erfolgte eine Titration von Mausserum, wobei Proben in FACS-Puffer verdünnt wurden. 50 μl/Well dieser Titration wurden dann zur Zellplatte gegeben. Zum Bestimmen der Veränderung hinsichtlich des Aktivitätsniveaus infolge der Immunisierung wurde Serum von jedem Tier vor der Immunisierung auf 1 zu 100 in FACS-Puffer verdünnt und 50 µl/Well wurden zu den Zellen gegeben. Ein geeigneter Referenzantikörper (Anti- OX40L-Antikörper MAB10541, R&D Systems) oder Maus-IgG1-Kontrollantikörper (Sigma) wurde in FACS-Puffer (1–9 µg/m) verdünnt und 50 µl wurden zu Zellen gegeben. Zellen wurden 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Zellen wurden zweimal mit 150 µl PBS gewaschen, wobei nach jedem Waschschritt zentrifugiert und Überstand abgesaugt wurde (Zentrifugation bei 300 xg für 3 Minuten). Zum Detektieren der Antikörperbindung wurde APC-Ziege- -Anti-Maus-IgG (Jackson ImmunoResearch) 1 zu 500 in FACS-Puffer verdünnt und es wurden 50 µl zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden 30 Minuten lang bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Zellen wurden zweimal mit 150 µl PBS gewaschen, wobei nach jedem Waschschritt zentrifugiert und Überstand abgesaugt wurde (Zentrifugation bei 300 xg für 3 Minuten). Zum Fixieren von Zellen wurden 100 µl 2 % v/v Paraformaldehyd zugegeben und die Zellen wurden 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert, die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 300 xg pelletiert und die Platten wurden in 50 µl FACS-Puffer resuspendiert. Die APC-Signalintensität (Geomittel) wurde per Durchflusszytometrie mit einem BD FACS Array-Instrument gemessen.

Bestimmung der Serumtiter per DELFIA-Immunosassay mit rekombinantem hOX40L

Titer in Mausserumproben wurden mit einem reversen OX40L ELISA-Protokoll bestimmt. Anti-Maus-IgG-Fangantikörper (Southern Biotech) (4 μg/ml, verdünnt in PBS, 50 μl/Well) wurde an 96-Well-Platten mit geringer Autofluoreszenz und hoher Proteinbindung (Costar) über Nacht bei 4°C adsorbiert. Überschüssiges IgG wurde durch eine Wäsche mit PBS-Tween (0,1 % v/v) entfernt und die Wells wurden mit 1 % w/v Rinderserumalbumin (BSA, Sigma) in PBS 1 h lang bei RT blockiert, wonach die Platten wie zuvor beschrieben gewaschen wurden. Es wurde eine Titration von Mausserum vorgenommen, wobei Proben in Reagensverdünnungsmittel (0,1 % w/v BSA/PBS) verdünnt wurden. 50 μl/Well dieser Titration wurden dann zu ELISA-Platten gegeben. Zum Bestimmen der Veränderung hinsichtlich des Aktivitätsniveaus infolge der Immunisierung wurde Serum von jedem Tier vor der Immunisierung auf 1 zu 100 in Reagensverdünnungsmittel verdünnt und 50 µl/Well wurden zu den ELISA-Platten gegeben. Als positive Kontrolle für eine biotinylierte OX40L-Bindung wurde ein auf 1 µg/ml verdünnter Anti-OX40L-Antikörper (MAB10541, R&D Systems) zu den Platten mit 50 µl gegeben. Eine Maus-IgG1-Isotyp-Kontrolle (Sigma) wurde als negative Kontrolle einbezogen und in Reagensverdünnungsmittel auf 1 µg/ml verdünnt, und 50 µl/Well wurden zur ELISA-Platte gegeben. In einigen Fällen wurde eine Serumprobe von einer Maus, die mit einem nicht relevanten Antigen immunisiert wurde, 1 zu 1000 verdünnt, und 50 µl/Well wurden zur ELISA-Platte gegeben. Die Platten wurden wenigstens 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten wie zuvor gewaschen, um ungebundene Proteine zu entfernen. Biotinyliertes OX40L (100 ng/ml in Reagensverdünnungsmittel; 50 μl/Well) wurde dann zu den Platten gegeben und 1 Stunde lang bei RT inkubiert. Ungebundenes biotinyliertes OX40L wurde durch eine Wäsche mit PBS-Tween (0,1 % v/v) entfernt, während der restliche biotinylierte OX40L durch Streptavidin-Europium3 + Konjugat (DELFIA® Detektion, PerkinElmer), verdünnt in DELFIA® Assaypuffer (Perkin Elmer), oder Streptavidin-HRP, verdünnt in Reagensverdünnungsmittel detektiert wurde.

Im Falle von Streptavidin-HRP wurden die Platten wie zuvor beschrieben gewaschen und 50 μl TMB (Sigma) wurden zur Platte gegeben. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 1 M Schwefelsäure (Fluka Analytical) gestoppt. Die OD bei 450 nm wurde auf einem Envision-Plattenleser (PerkinElmer) gelesen.

Im Falle von Streptavidin-Europium3 wurden die Platten mit TBS (Tris-gepufferte Salzlösung)-Tween (0,1 % v/v) und 200 μl/Well an DELFIA Enhancement-Lösung (Perkin Elmer) wurden zur Platte gegeben. Die zeitaufgelöste Fluoreszenz wurde bei 615 nm auf einem Envision-Plattenleser (PerkinElmer) gemessen. Fluoreszenzdaten wurden als Europium-Counts aufgetragen.

Isolierung und Präparation von murinem Gewebe:

Milze wurden aus immunisierten Mäusen herausgeschnitten und in 1 × PBS gewaschen und bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis aufbewahrt. Die Gewebe wurden in Puffer mit 1 × PBS (Invitrogen) und 3 % hitzeinaktiviertem FBS (Invitrogen) präpariert. Splenozyten wurden dispergiert, indem das Gewebe durch ein 45-μm-Sieb (BD Falcon) zerdrückt wurde und eine Spülung mit 30 ml 3 %FBS/PBS-Puffer vor der Zentrifugation bei 700 g für 10 Minuten bei 4°C erfolgte. Zum Entfernen der roten Blutkörperchen wurden die pelletierten Splenozyten in 4 ml Red Blood Cell Lysis Buffer (Sigma) resuspendiert. Nach 4-minütiger Inkubation wurde die Lysereaktion durch Zugabe von 3 % FBS/1 × PBS-Puffer gestoppt. Zellklumpen wurden mit einem 45-μm-Sieb herausgefiltert. Die restlichen Splenozyten wurden für weitere Verfahren pelletiert.

Hybridomfusion

Für das KM055-Experiment wurden pelletierte Splenozyten sofort zur Fusion überführt, ohne Selektion oder Übernacht-CpG-Stimulation. Für das KM040-Experiment wurden B-Zellen einem positiven Selektionsverfahren mit dem MACS® Abscheidesystem unterzogen. Zellen wurden in 80 µl 73 % FBS/PBS-Puffer je 1 × 10 Zellen resuspendiert, bevor die Anti-Maus-IgG1 plus Anti-Maus-IgG2a + b MicroBeads (Miltenyi Biotec) zugegeben wurden und eine 15-minütige Inkubation bei 4°C erfolgte. Das Zell/MicroBeads-Gemisch wurde dann auf eine zuvor befeuchtete LS-Säule gegeben, die in einem magnetischen MACS-Abscheider platziert und mit 3 % FBS/PBS-Puffer gewaschen wurde. IgG-positive Zellen wurden in der markierten, säulengebundenen Fraktion in 3 % FBS/PbS-Puffer aufgefangen.

Für das KM040-Experiment wurden angereicherte B-Zellen über Nacht mit CpG (Endkonzentration 25 µM) behandelt und am folgenden Tag einmal in BSA-Fusionspuffer (0,3 M D-Sorbitol, 0,11 mM Calciumacetathydrat, 0,5 mM Magnesiumacetattetrahydrat und 0,1 % BSA (v/w), eingestellt auf pH 7,2) gewaschen. Für das KM055-Experiment wurden pelletierte Splenozyten von der Lyse roter Blutkörperchen am selben Tag wie die Gewebepräparation einmal in BSA-Fusionspuffer gewaschen. Die Fusion ging danach bei beiden Experimenten in derselben Weise vonstatten. Gewaschene Zellen wurden in 200 µl BSA-Fusionspuffer resuspendiert und die Zellzahl wurde bestimmt. SP2/0-Zellen wurden in derselben Weise behandelt, allerdings zweimal mit BSA-Fusionspuffer gewaschen. B-Zellen wurden in einem Verhältnis von 3:1 mit Myelomzellen durch Elektrofusion mit einem BTX ECM 2001 Electro Cell Manipulator (Harvard Apparatus) fusioniert. Jede Fusion wurde über Nacht in Wiederherstellungsmedium (Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium – hohe Glucosekonzentration (kein Phenolrot, kein L-G) mit OPI (Sigma), L-Glutamax (Gibco), 20 % FBS (Gibco, chargenweise auf Hybridom getestet) und 2-Mercaptoethanol) gelassen. Am letzten Tag wurden die Zellen pelletiert und in 1 Teil Wiederherstellungsmedium zu 9 Teilen halbfestem Medium (ClonaCell-HY Hybridoma Selection Medium D, Stemcell Technologies) resuspendiert und dann auf Petrischalen (10 cm) geimpft. Kolonien wurden 12 Tage später entnommen und in 96-Well-Platten gegeben und 2–3 Tage lang vor dem Screenen kultiviert.

Beispiel 2Hybridom-Überstand-Screening

Nach der Erzeugung von Hybridomklonen wurde der Hybridomüberstand in einem sequenziellen primären und sekundären Screening beurteilt und zweckmäßige Hybridomklone wurden anhand der Kriterien von Antikörperbindung an CHO-exprimiertem hOX40L und Rezeptorneutralisationsaktivität selektiert (Details siehe in Materialien und Verfahren) (Tabelle 1).

Für das primäre Screening arbeiteten die Erfinder die folgenden Selektionskriterien aus: Wells, die Hybridomklone enthielten, wurden selektiert, wenn sich im Überstand anwesende Antikörper an auf der Zelloberfläche exprimiertes, nativ präsentiertes hOX40L binden konnten. Im Rahmen dieses Assays wurden CHO-S-Zellen, die hOX40L auf der Zelloberfläche exprimierten, plattiert und anschließend erfolgte eine Inkubation mit Hybridomüberstand, gefolgt von einem fluoreszierenden Detektionsantikörper. Die Anwesenheit eines Anti-OX40L-Antikörpers im Überstand wurde mit einem Plattenleser abgelesen, der die zweckmäßige Fluoreszenz ablesen konnte. Ferner beurteilten die Erfinder den Hybridomüberstand mit Bezug auf eine Bindung an rekombinant exprimiertes humanes OX40L unter Verwendung eines HTRF-(homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz)-Assays. Die Erfinder bestimmten außerdem, ob der Hybridomüberstand die Fähigkeit hatte, die Bindung von humanem rekombinantem OX40L an humanes OX40R Fc zu verringern. Klone, die anhand von Daten aus den oben erwähnten drei primären Screeningassays bestimmte Selektionskriterien erfüllten (siehe nachfolgende weitere ausführliche Beschreibung), wurden dann herausgepickt und zu einem sekundären Screening übertragen, bei dem die Fähigkeit jedes Antikörpers bestimmt wurde, die Bindung von hOX40L an seine Rezeptoren, OX40 Rezeptor (aka CD134) zu neutralisieren. Die Erfinder beschlossen, dies mit einem Rezeptorneutralisations-HTRF-Assay und einem auf Durchflusszytometrie beruhenden Rezeptorneutralisationsassay zu beurteilen. Zuletzt beschlossen die Erfinder, den Hybridomüberstand durch SPR zu analysieren, um apparente Affinität der Antikörper zu rekombinanten trimeren humanen OX40L sowie Kreuzreaktivität mit Rhesusaffen-OX40L zu beurteilen.

Antikörper wurden als sekundärer Treffer definiert, wenn sich Antikörper in Hybridomüberstand an hOX40L banden, mit hoher apparenter Affinität sowie mit rekombinantem Rhesusaffen-OX40L kreuzreagiert. Außerdem mussten die Antikörper im Überstand die Fähigkeit zum Neutralisieren der OX40L-Bindung an ihren Rezeptor, d.h. OX40-Rezeptor (aka CD134), im HTRF- oder auf Durchflusszytometrie beruhenden Assay aufweisen.

Materialien und Verfahren Primäres Screeining – Bindung an zellexprimiertes humanes OX40L

Von Hybridomzellen gesammelte Überstände wurden getestet, um die Fähigkeit sekretierter Antikörper zur Bindung an hOX40L, exprimiert auf der Oberfläche von CHO-S-Zellen, zu beurteilen. Zum Bestimmen der CHO-S hOX40L-Bindung wurden Zellen in mit Gewebekultur behandelten 384-Well-Klarbodenplatten (Costar oder BRAND) zu 2 × 104 Zellen/Well in F12-Medium (GIBCO), angereichert mit 10 % v/v FBS (GIBCO), plattiert und über Nacht kultiviert. Kulturmedium wurde von 384-Well-Assayplatten entfernt. Wenigstens 40 µl Hybridomüberstand oder Positivkontrollen-Anti-Human-OX40L-Referenzantikörper (mit einer Endkonzentration von 1 µg/m) oder Isotyp-IgG1-Kontrollantikörper (in einigen Fällen als Cm7, Sigma M9269, bezeichnet, mit einer Endkonzentration von 1 µg/ml), verdünnt in Hybridomerhaltungsmedium (HMM), wurden zu jedem Well gegeben. Hybridomerhaltungsmedium wurde aus Advanced DMEM (Gibco), angereichert mit 1× Glutamax (Gibco), 20 % v/v FBS (Gibco), 0,05 mM β-Mercaptoethanol, 1× HT Zusatz (Gibco) und 1× Penicillin/Streptomycin (Gibco) gebildet. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert. Kulturmedium wurde abgesaugt und 50 µl Ziege-Anti-Maus-Alexa Fluor 790 (Jackson ImmunoResearch, 115-655-071) zu 1000 ng/ml angereichert mit 0,2 μM DRAQ5 (Biostatus), verdünnt in FACS-Puffer (PBS + 1 % w/v BSA + 0,1 % v/v NaN3), wurden zugegeben. Platten wurden wieder 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert. Überstand wurde abgesaugt und es wurden 25 µl 4 % v/v Paraformaldehyd zugegeben, und die Platten wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden zweimal mit 100 µl PBS gewaschen und anschließend wurde der Waschpuffer vollständig entfernt. Die Fluoreszenzintensität wurde mit Scanning-Platten mit einem Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR®) abgelesen. Die Anti-Maus-Bindung (800 nm Kanal) wurde gemäß dem LI-COR®-empfohlenen Algorithmus auf eine Zellzahl (700 nm Kanal) normalisiert. Die prozentuale Wirkung wurde wie nachfolgend ausführlich beschrieben (Gleichung 1) berechnet. Die Gesamtbindung wurde mit dem Referenzantikörper bei einer endgültigen Assaykonzentration von 1 µg/ml definiert. Unspezifische Bindung wurde mit der Maus-IgG1-Isotyp-Kontrolle (Sigma) bei einer endgültigen Assaykonzentration von 1 µg/ml definiert. Wells wurden als Treffer definiert, wenn die prozentuale Wirkung größer als oder gleich 5 % war.

Gleichung 1: Berechnung der prozentualen Wirkung vom primären Screening (LI-COR) und HTRF

(Mit 800 % Resp-Werten (LI-COR) oder 665/620 nm Verhältnis (siehe Gleichung 2) (HTRF) Prozentuale Wirkung = Proben-Well – unspez. BindungGesamtbindung – unspez. Bindung
Unspezifische Bindung = Werte von Wells mit Isotyp-Kontroll-Maus-IgG1 oder HMM oder Puffer
Gesamtbindung (Bindung HTRF und LICOR) = Werte von Wells mit Referenzantikörper
Gesamtbindung (OX40L/OX40RFc Assay) = OX40L und OX40RFc

Primäres Screening: Bindung an rekombinantes humanes OX40L:

Parallel zum Screenen im Hinblick auf eine Bindung an CHO-S-exprimiertes OX40L wurden auch von Hybridom-Wells gesammelte Überstände getestet, um die Fähigkeit sekretierter Antikörper zur Bindung an hOX40L, exprimiert als rekombinantes Protein (hausintern produziert, siehe Einzelheiten in Beispiel 1), zu beurteilen. Die Bindung sekretierter Antikörper an rekombinantes hOX40L wurde mit dem HTRF®-(homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz, Cisbio)-Assayformat mit biotinyliertem hOX40L identifiziert. 5 µl Hybridomüberstand wurden in eine kleinvolumige weiße 384-Well-Polystyrolplatte mit nicht bindender Oberfläche (Greiner) gegeben. Anschließend wurden 5 µl biotinyliertes hOX40L (Arbeitskonzentration 20 nM), verdünnt in HTRF-Puffer (PBS (Sigma) + 0,53 M KF (Sigma) + 0,1 % w/v BSA (Sigma), zugegeben. Es wurden 5 μl kombinierte Detektionsreagenzien Streptavidin D2 (Cisbio), 1:100 verdünnt in HTRF-Assaypuffer für eine Endverdünnung von 1:400 und Ziege-Anti-Maus-IgG (Southern Biotech), markiert mit Europium-Kryptat (Cisbio), verdünnt 1:100 in HTRF-Assaypuffer für eine Endverdünnung von 1:400, zugegeben. Die Konzentration von Ziege-Anti-Maus-IgG (Southern Biotech), markiert mit Europium-Kryptat, war chargenabhängig, und in einigen Fällen erfolgte eine Verdünnung von 1:1000, um eine endgültige Assaykonzentration von 1:4000 zu erhalten. Zum Einstellen des Gesamtassayvolumens auf 20 μl wurden 5 μl HTRF-Assaypuffer zu allen Wells gegeben. Zum Definieren unspezifischer Bindung wurde die Zugabe von positivem Kontrollantikörper oder Hybridommedium durch HTRF-Assaypuffer oder HMM ersetzt. Die Platte wurde 3 Stunden lang im Dunkeln inkubieren gelassen, bevor die zeitaufgelöste Fluoreszenz bei einer Emissionswellenlänge von 620 nm und 665 nm mit einem EnVision-Plattenleser (Perkin Elmer) abgelesen wurde. Weitere Einzelheiten bzgl. der HTRF® Assaytechnologie sind in Mathis (1995) Clinical Chemistry 41(9), 1391–1397, zu finden. Daten wurden durch Berechnen des 665/620-Verhältnisses und der prozentualen Wirkung für jede Probe mit jeweils Gleichung 2 und Gleichung 1 analysiert.

Gleichung 2: Berechnung des 665/620-Verhältnisses

  • 665/620-Verhältnis = (Probe 665/620 nm Wert) × 10.000

Für von KM040-1 und KM055-1 abgeleitete Klone wurde von den Erfindern ein Selektionskriterium von einer Wirkung von mehr als oder gleich 20 Prozent angewendet, um ein Well als Treffer von einer rekombinanten hOX40L-Bindung wie in Tabelle 1 beschrieben zu definieren.

Primäres Screening: humaner OX40L/humaner OX40R Fc-Bindungsassay:

Zum Bestimmen, ob von Hybridom-Wells gesammelte Überstände die Bindung von OX40L an OX40RFc inhibierten, wurden sekretierte Antikörper in einem OX40L/OX40RFc-Bindungs-HTRF-Assay getestet. 5 µL Hybridomüberstand wurden zu einer kleinvolumigen weißen 384-Well-Polystyrolplatte mit nicht bindender Oberfläche (Greiner) übertragen. Biotinyliertes OX40L wurde in HTRF-Assaypuffer auf eine Arbeitskonzentration von 2,4 nM verdünnt und 5 µl wurden zugegeben. OX40RFc wurde dann auf eine Arbeitskonzentration von 4,8 nM verdünnt und 5 µl wurden zugegeben. Unspezifische Bindung wurde definiert, indem OX40RFc durch Assaypuffer oder HMM ersetzt wurde. Streptavidin-Kryptat (CISBIO) und Anti-Human-Fc D2 (CISBIO) wurden in HTRF-Assaypuffer auf eine Arbeitskonzentration von jeweils 1:100 und 5 nM verdünnt. Die Platten wurden abgedeckt, vor Licht geschützt und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die zeitaufgelöste Fluoreszenz bei Emissionswellenlängen von 620 nm und 665 nm mit einem EnVision Plattenleser (Perkin Elmer) abgelesen wurde. Daten wurden durch Berechnen des 665/620-Verhältnisses und der prozentualen Wirkung für jede Probe mit jeweils Gleichung 2 und Gleichung 5 analysiert.

Für von KM040-1 und KM055-1 abgeleitete Klone wurde von den Erfindern ein Selektionskriterium von einem Assaysignal von OX40-Rezeptor-Fc-Bindung an OX40L von weniger als oder gleich 90 Prozent angewendet, um ein Well als Treffer wie in Tabelle 1 beschrieben zu definieren.

Sekundäres Screening: Bindung an zellexprimiertes und rekombinantes humanes OX40L

Zum Bestimmen, ob mit dem Selektionskriterium des primären Screenings selektierte Wells die von den Erfindern festgelegten erforderlichen Charakteristiken hatten, wurde eine Reihe von Assays durchgeführt. Als Treffer selektierte Hybridomklone aus dem primären Screening wurden 3 Tage lang kultiviert und die von Hybridomzellen aufgefangenen Überstände wurden getestet, um zu beurteilen, ob die sekretierten Antikörper, die sich an CHO-S-exprimierten hOX40L binden, sich in einigen Fällen an nicht transfizierte CHO-S-Zellen binden und ob sie rekombinante OX40R Fc-Bindung an CHO-S hOX40L neutralisieren und die Fähigkeit haben, OX40R-Bindung an rekombinantes biotinyliertes hOX40L zu neutralisieren.

Bindung an CHO-S-exprimiertes hOX40L und Rezeptorneutralisation:

CHO-S-Zellen, die hOX40L exprimieren, oder nicht transfizierte CHO-S-Zellen, verdünnt in FACS-Puffer (PBS + 1 % w/v BSA + 0,1 % w/v NaN3), wurden auf einer 96-Well-V-Bodenplatte 5(Greiner) in einer Dichte von 1 × 10 Zellen pro Well verteilt. Zellen wurden mit 150 µl PBS gewaschen und 3 min lang bei 300 xg zentrifugiert. Überstand wurde abgesaugt und 150 µl PBS wurden zugegeben. Dieser Waschschritt wurde wiederholt.

25 µl Hybridomüberstand oder gereinigter Antikörper vom Hybridomüberstand, verdünnt in FACS-Puffer, wurden zu den gewaschenen Zellen gegeben und 10–15 Minuten lang inkubiert. Referenzantikörper oder Maus-IgG1-Kontrollantikörper (Sigma) wurden in FACS-Puffer auf 20 µg/ml verdünnt und 25 µl wurden zu Zellen gegeben. 25 µl humaner OX40R Fc (hausintern), verdünnt auf 1000 ng/ml in FACS-Puffer, wurden dann zu den Wells gegeben. Zellen wurden 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert.

Zellen wurden zweimal mit 150 µl PBS gewaschen, wobei nach jedem Waschschritt zentrifugiert und Überstand abgesaugt wurde (Zentrifugation bei 300 xg für 3 Minuten).

Zum Detektieren von Antikörper- und Rezeptorbindung wurden 50 µl Ziege-Anti-Human-IgG-PE (Jackson ImmunoResearch) und APC-Anti-Maus-IgG (Jackson ImmunoResearch), verdünnt 1 zu 500 in FACS-Puffer, zu den Zellen gegeben. Zellen wurden 30 Minuten lang bei 4°C im Dunkeln inkubiert.

Die Zellen wurden zweimal mit 150 µl PBS gewaschen, wobei nach jedem Waschschritt zentrifugiert und Überstand abgesaugt wurde (Zentrifugation bei 300 xg für 3 Minuten).

Zum Fixieren von Zellen wurden 100 µl 2 % v/v Paraformaldehyd zugegeben und Zellen wurden 30 Minuten lang bei 4°C durch Zentrifugation bei 300 xg pelletiert und die Platten und in 50 µl FACS-Puffer resuspendiert. Die PE- und APC-Signalintensität (Geomittel) wurde per Durchflusszytometrie mit einem BD FACS Array-Instrument gemessen.

Die prozentuale Kontrollbindung wurde mit der Geomittel-Fluoreszenz wie in Gleichung 1 beschrieben berechnet, wobei die Gesamtbindung als Referenzantikörper bei 10 µg/ml und unspezifische Bindung als Maus-IgG1-Antikörper bei 10 µg/ml definiert wurde. Die prozentuale Rezeptorbindung wurde mit Gleichung 3 berechnet.

Gleichung 3: Prozentuale Rezeptorbindung (FACS)

Auf der Basis der Geomittel-Fluoreszenz % Rezeptorbindung = Probenwert – unspezifische BindungGesamtbindung – unspezifische Bindung × 100
Unspezifische Bindung = Kein Antikörper, kein Rezeptor
Gesamtbindung = Rezeptor (OX40R) nur Bindung (kein Inhibitor) + Isotypkontrolle bei 10 µg/ml

Sekundäres Screening – HTRF Ligand/Rezeptor-Neutralisation

Zum Bestimmen, ob im primären Screening identifizierte Antikörper OX40L-Bindung an OX40RFc neutralisieren, wurde ein humaner OX40L/humaner OX40R Fc-Bindungsassay wie für das primäre Screening beschrieben durchgeführt.

Platten wurden 3 Stunden lang im Dunkeln inkubieren gelassen, bevor die zeitaufgelöste Fluoreszenz bei Emissionswellenlängen von 620 nm und 665 nm mit einem EnVision Plattenleser (Perkin Elmer) gemessen wurde. Weitere Einzelheiten zur HTRF® Assaytechnologie sind in Mathis (1995) Clinical Chemistry 41(9), 1391–1397, zu finden. Daten wurden durch Berechnen von Delta F wie in Gleichung 4 beschrieben und des prozentualen Anteils des Rezeptors für jede Probe mit Gleichung 5 analysiert.

Gleichung 4: Berechnung von prozentualem DeltaF

  • % Delta F = (Probe 665/620 nm Verhältniswert) – (unspezifische Kontrolle 665/620 nm Verhältniswert)(unspezifische Kontrolle 665/620 nm Verhältnis) × 100

Gleichung 5: Prozentuale Rezeptorbindung (HTRF)

Beruhend auf % DeltaF (Gleichung 4) oder 665/620 Verhältnis (Gleichung 2) % Rezeptorbindung = Probenwert – unspezifische BindungGesamtbindung – unspezifische Bindung × 100
Unspezifische Bindung = HMM oder Puffer + OX40L (kein Rezeptor)
Gesamtbindung = Rezeptor (OX40R) und OX40L (kein Inhibitor)

Trefferkriterienauswahl aus sekundärem Screening:

Eine Reihe von Treffern wurde anhand von Bindungs- und Neutralisationsassays ausgewählt. Treffer im CHO-S OX40L-Bindungsassay wurden von den Erfindern als signifikante Bindung an CHO-S OX40L-Zellen und keine Bindung an CHO-S-Zellen durch FACS definiert. Treffer wurden ferner so definiert, dass sie die Fähigkeit zu einer signifikanten Verringerung der OX40RFc-Bindung an rekombinanten OX40L (HTRF) und einer signifikanten Verringerung der OX40RFc-Bindung an auf CHO-Zellen exprimiertes hOX40L haben. Daten sind in Tabelle 1 aufgeführt. Apparente Affinitätsmessungen durch SPR wurden ebenfalls in Betracht gezogen.

Beispiel 3Antikörperleitcharakterisierung

Anhand des Screenings wurden ausgewählte Wells expandiert und murine/humane chimäre Antikörper wurden per standardmäßiger Protein-G-basierter Affinitätschromatographiereinigung (siehe Verfahren unten) gereinigt. Die Antikörper wurden verschiedenen Assays unterzogen, um ihre Fähigkeit zum Blockieren der Bindung von hOX40L an seinen Rezeptor OX40R sowie die Fähigkeit jedes Antikörper zur Bindung an humanes sowie Rhesusaffen-OX40L mit hoher apparenter Affinität zu beurteilen. Zum Ermitteln der besten Antikörper wurden ausgewählte Klone mit dem OX40L/OX40RFc HTRF-Assay und OX40L-induzierter IL2-Freisetzung aus primären humanen T-Zellen getestet. Tabelle 1: mAb-Leitübersicht

Antikörper FACS-Bindung HTRF-Rezeptor-Neutralisation IC50 nM (+/– SEM) Primärer T-Zell-Assay IC50 nM (+/– SEM) Apparente Affinität hOX40L (nM) Apparente Affinität RhsOX40L (nM)10A07 (Hybridom)JA +++ +++ CNROR CNROR10A07 (human) ND+++
1,2nM (+/– 0,17)
+++
0,83nM (+/– 1,2)
CNROR CNROR
2D10 (Hybridom)JA+++ ND CNROR CNROR2D10 (human)ND+++
0,75nM (+/– 0,04)
+++
0,81nM (+/– 0,06)
CNROR CNROR
9H04 (Hybridom)JA + ND 5,3 ND19H01 (Hybridom)JA ++ ND 2,2 ND
CNROR = Kann Off-Rate nicht lösen

IC50-Daten repräsentieren arithmetisches Mittel +/– Standardfehler des Mittelwerts (SEM) für drei unabhängige Experimente oder Spender.

Materialien und Verfahren:Reinigung von Antikörpern aus Hybridomüberstand:

Antikörper wurden mit Protein-G-Affinitätschromatographie gereinigt. Antikörper wurden aus Protein-G-Medium mit IgG Elute-Reagens (Pierce) eluiert und die eluierten Antikörper wurden vor dem Verwendung gegen PBS puffergetauscht. Die Antikörperreinheit wurde per SDS-PAGE-Analyse beurteilt und mit einer Spektrophotometermessung bei OD280 nm quantifiziert.

Die Bindung von aus dem Hybridomüberstand gereinigten Antikörpern wurde wie hierin beschrieben durchgeführt.

HTRF-Ligand/Rezeptorneutralisation:

Die folgenden Verfahren wurden mit einer Inhibitortitration durchgeführt, um die Klonpotenz zu ermitteln, wie anhand IC50-Werte im Assay gemessen. Aus Hybridom gereinigter Antikörper wurde durch Verdünnen in HTRF-Assaypuffer titriert und 5 µl dieser Titration wurden zu einer kleinvolumigen weißen 384-Well-Polystyrolplatte mit nicht bindender Oberfläche (Greiner) übertragen. Biotinyliertes OX40L wurde in HTRF-Assaypuffer auf eine Arbeitskonzentration von 2,4 mM verdünnt und 5 µl wurden zugegeben. OX40RFc wurde dann auf eine Arbeitskonzentration von 4,8 nM verdünnt und 5 µl wurden zugegeben. Unspezifische Bindung wurde definiert, indem OX40RFc durch Assaypuffer oder HMM ersetzt wurde. Streptavidin-Kryptat (CISBIO) und Anti-Human-Fc D2 (CISBIO) wurden in HTRF-Assaypuffer auf eine Arbeitskonzentration von jeweils 1:100 und 5 nM verdünnt. Platten wurden abgedeckt, vor Licht geschützt und 3 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die zeitaufgelöste Fluoreszenz bei Emissionswellenlängen von 620 nm und 665 mit einem EnVision Plattenleser (Perkin Elmer) gemessen wurde. Die Daten wurden durch Berechnen von Delta F wie in Gleichung 4 beschrieben und des Rezeptorprozentsatzes für jede Probe mit Gleichung 5 oder in einigen Fällen Gleichung 6 analysiert. IC50-Werte wurden mit GraphPad Prism-Software durch Kurvenanpassung mit einer logistischen Vierparametergleichung (Gleichung 7) bestimmt.

Gleichung 6: Prozentuale Rezeptorbindung (HTRF)

Beruhend auf Berechnung von % DeltaF (Gleichung 8) % Rezeptorbindung = ProbenwertGesamtbindung × 100
Gesamtbindung = Rezeptor (OX40R) und OX40L (kein Inhibitor)

Gleichung 7: Logistische Vierparameterberechnung

Y = Unten + (Oben-Unten)/(1 + 10^((LogIC50-X)·HillSlope))

X
= Logarithmus von Konzentration
Y
= spezifische Bindung (Gleichung 6)
Oben und Unten
= Plateaus in gleichen Einheiten wie Y (spezifische Bindung)

Log IC50 in gleichen Einheiten wie X. Y beginnt unten (Bottom) und geht nach oben (Top) mit einer S-förmigen Gestalt. Spezifische Bindung nimmt mit Zunahme von X ab.

Profilierung von völlig humanen rekombinanten Anti-OX40L-Antikörpern in HTRF Ligand/Rezeptor-Neutralisationsassay

Zum Bestimmen, ob rekombinant exprimiertes völlig humanes gereinigtes IgG humane OX40L-Bindung an OX40RFc inhibiert, wurde das folgende Verfahren durchgeführt. Völlig humanes gereinigtes IgG oder ein anderer Inhibitor wurde getestet, um die Klonpotenz zu ermitteln, wie anhand von IC50-Werten im Assay gemessen. Rekombinant exprimierte und gereinigte Antikörper wurden durch Verdünnen in HTRF-Assaypuffer titriert und 5 µl dieser Titration wurden zu einer kleinvolumigen weißen 384-Well-Polystyrolplatte mit nicht bindender Oberfläche (Greiner) übertragen. Biotinyliertes OX40L wurde in HTRF-Assaypuffer auf eine Arbeitskonzentration von 2,4 nM verdünnt und 5 µl wurden zugegeben. Mit AF647 direkt markiertes OX40RFc wurde dann auf eine Arbeitskonzentration von 10 nM verdünnt und 5 µl wurden zugegeben. Unspezifische Bindung wurde definiert, indem OX40RFc-AF647 durch Assaypuffer oder HMM ersetzt wurde. Streptavidin-Kryptat (CISBIO) wurde in HTRF-Assaypuffer auf eine Arbeitskonzentration von 1:100 verdünnt und 5 µl wurden zu allen Wells der Platte gegeben. Die Platten wurden abgedeckt, vor Licht geschützt und 3 h lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die zeitaufgelöste Fluoreszenz bei Emissionswellenlängen von 620 nm und 665 nm mit einem EnVision Plattenleser (Perkin Elmer) gemessen wurde. Die Daten wurden durch Berechnen von Delta F wie in Gleichung 4 beschrieben und des Rezeptorprozentanteils für jede Probe mit Gleichung 5 oder in einigen Fällen Gleichung 6 analysiert. IC50-Werte wurden mit GraphPad Prism-Software durch Kurvenanpassung mit einer logistischen Vierparametergleichung (Gleichung 7) (1) ermittelt.

Bestimmen der Wirkung von Anti-OX40L-Antikörpern auf die durch rekombinanten OX40L induzierte IL2-Freisetzung von primären isolierten T-Zellen

Rekombinanter humaner OX40L (hausintern) wurde in Kulturmedium auf eine Konzentration von 400 ng/ml verdünnt und 50 µl wurden zu einer mit Gewebekultur behandelten 96-Well-Platte (Costar) gegeben. Anti-OX40L-Antikörper oder eine Isotypkontrolle einer geeigneten Spezies (Sigma oder hausintern) wurden/wurde in Kulturmedium in einer 96-Well-Platte (Greiner) titriert, anschließend wurden 50 µl der Titration auf die 96-Well-Platte übertragen, die 50 µl OX40L enthielt. Die Antikörpertitration wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem rekombinanten OX40L inkubiert, bevor CD3-positive T-Zellen zugegeben wurden.

PBMCs wurden von Leukoreduktionssystemkammern (NHSBT) mit Ficoll-Paque plus (GE Healthcare) durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert. CD3-positive Zellen (T-Zellen) wurden von humanen PBMC durch negative Selektion mit magnetischen Mikrokügelchen (Miltenyi Biotech) gemäß Herstelleranweisungen isoliert. Die isolierten Zellen wurden bei 300 xg/5 min zentrifugiert, in Kulturmedium resuspendiert (Kulturmedium wurde entweder als RPMI (Gibco) + 10 % v/v FBS oder RPMI + 5 % v/v humanes AB-Serum definiert) und 50 µl der Zellsuspension wurden zur 96-Well- Platte gegeben, die rekombinantes OX40L und Antikörpertitration enthielt, um eine Endkonzentration von 2 × 105 Zellen/Well zu erreichen.

Anschließend wurden 50 µl PHA zu 8 µg/ml zu allen Wells gegeben, um eine endgültige Assaykonzentration von 2 µg/ml zu erhalten. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 37°C inkubiert, bevor Überstand entnommen und auf die IL-2-Konzentration analysiert wurde. Die maximale IL-2-Freisetzung wurde anhand der OX40L-Stimulation ohne Inhibitor definiert. Die minimale IL-2-Freisetzung wurde nur anhand Kulturmedium definiert (kein OX40L).

Die IL-2-Niveaus in Überständen wurden mit dem humanen IL-2 Duoset ELISA-Kit (R & D) Systems) gemäß Herstellerempfehlungen bestimmt. IL-2-Fangantikörper (4 μg/mL verdünnt in PBS, 50 μl/well) wurde an 96-Well-Platten mit geringer Autofluoreszenz und hoher Proteinbindung (Costar) über Nacht bei 4°C adsorbiert. Überschüssiges IgG wurde durch eine Wäsche mit PBS-Tween (0,1 % v/v) entfernt und die Wells wurden mit 1 % w/v Rinderserumalbumin (BSA, Sigma) in PBS 1 h lang bei RT blockiert, wonach die Platten wie zuvor beschrieben gewaschen wurden. Dann wurden 50 μl/Well konditioniertes Kulturmedium zugegeben, IL-2-Standards (von 2000 pg/ml, 1:2 Verdünnung) wurden ebenfalls zu ELISA-Platten als ELISA-Kontrolle gegeben und die Platten wurden wenigstens 1 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die Platten wie zuvor zum Entfernen ungebundener Proteine gewaschen. Biotinylierter IL-2-Detektions-Ab (200 ng/ml in Reagensverdünnungsmittel (0,1 % BSA/PBS); 50 μl/Well) wurde dann zu den Platten gegeben und 1 h lang bei RT inkubiert. Ungebundener Detektionsantikörper wurde durch eine Wäsche mit PBS-Tween (0,1 % v/v) entfernt, während der restliche biotinylierte Antikörper durch Streptavidin-Europium3 + Konjugat (DELFIA® Detektion, PerkinElmer) detektiert wurde. Die zeitaufgelöste Fluoreszenz wurde bei 615 nm auf einem Envision Plattenleser (PerkinElmer) gemessen. Fluoreszenzdaten wurden als Europium-Counts oder Konzentration der IL-2-Freisetzung, berechnet anhand Standardkurve durch lineare Regression gemäß Herstellerempfehlungen, aufgetragen. IC50-Werte wurden mit GraphPad Prism-Software durch Kurvenanpassung mit einer logistischen Vierparametergleichung (Gleichung 7) ermittelt.

Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Analyse:

Eine SPR-Analyse wurde mit dem ProteOnTM XPR36 Array-System (BioRad) durchgeführt. Anti-Maus-IgG (GE Healthcare BR-1008-38) wurde auf einer GLM-Biosensoroberfläche mit Aminkopplung immobilisiert, die Oberfläche wurde dann mit 1 M Ethanolamin blockiert. Testantikörper wurden auf dieser Oberfläche gefangen und rekombinanter hOX40L (human und Rhesus) wurde in einer einzelnen Konzentration von 256 nM verwendet, Bindungssensogramme wurden mit einer Pufferinjektion (d.h. 0 nM) doppelt referenziert, um Basisliniendrift und Injektionsartefakte zu entfernen. Apparente Affinitäten zur OX40L-Antikörperinteraktion wurden mit dem 1:1 Modell bestimmt, das in der ProteOn XPR36 Analysesoftware enthalten ist. Der Assay owurde mit HBS-EP (Teknova) als Laufpuffer bei 25 C durchgeführt.

Beispiel 4Sequenzwiederherstellung von Leitantikörperkandidaten

Nach der Selektion und Charakterisierung von Leitkandidaten wurden ihre völlig humanen variablen Domänen mit RT-PCR unter Verwendung eines Gemischs aus Vorwärts- und Rückwärtsprimern wiederhergestellt. Antikörper wurden zu einem IgG4-Rückgrat (IgG4-PE) umformatiert und mit einem transienten Expressionssystem in CHO-S-Zellen exprimiert. Eine Übersicht über alle Sequenzen ist in der Sequenauflistung enthalten.

RNA-Isolierung von Hybridomzellen:

Gesamt-RNA wurde von Hybridomzellen mit TRIzolTM Reagens (Invitrogen) extrahiert. Menge und Qualität der isolierten RNA wurden spektrophotometrisch analysiert.

Variable Antikörperdomänen-Wiederherstellung durch RT-PCR:

Ausgewählte Klone wurden zum Herstellen von Gesamt-RNA verwendet, die in einer RT-PCR-Reaktion verwendet wurde, um die Schwerketten-V-Regionen wiederherzustellen. IgG-spezifische Rückwärtsprimer und Ig-Leitsequenz-spezifische Vorwärtsprimersätze oder, alternativ, IgG-spezifische Rückwärtsprimer und Ig 5’ untranslatierte Region-(UTR)-Sequenz-spezifische Vorwärtsprimersätze wurden für die Schwerketten verwendet. Konstante Kappa-Region-spezifische Rückwärtsprimer und Kappa-Leitsequenz-spezifische Vorwärtsprimersätze oder, alternativ, konstante Kappa-Region-spezifische Rückwärtsprimer und Kappa- 5’UTR-Sequenz-spezifische Vorwärtsprimersätze wurden für die KappaOX40L-Ketten verwendet. Die RT-PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt, wobei die DNA mit der vorhergesagten Größe in Vorwärts- und Rückwärtsrichtungen sequenziert wurde. Alternativ wurden die RT-PCR-Produkte in einen Klonierungsvektor subkloniert und DNA individueller Kolonien wurde zur Sequenzierung unterbreitet.

Klonierung rekombinanter Antikörper

DNA, die die variable Schwerkettenregion von mAb 10A7 kodierte, wurde in ein pREP4 Expressionsplasmid (Invitrogen) „in-frame“ mit der konstanten humanen IgG1-Region kloniert, und DNA, die die variable Leichtkettenregion von mAb 10A7 kodierte, wurde in ein pREP4 Expressionsplasmid „in-frame“- mit der konstanten humanen Kappa-Region mit standardmäßigem/r Restriktionsenzymverdau und Ligation kloniert.

Die Kodierungssequenzen der variablen Schwerkettenregion von mAbs 10A7 und 2D10 „in-frame“ mit der konstanten humanen IgG4-PE-Region wurden zur Säugetierexpression Codon-optimiert und in ein pXC-18.4 Expressionplasmid (Lonza) kloniert, und die Leichtketten-Kodierungssequenzen von mAbs 10A7 und 2D10 „in-frame“ mit der konstanten humanen Kappa-Region wurden zur Säugetierexpression Codon-optimiert und in ein pXC-17.4 Expressionsplasmid (Lonza) mit standardmäßigem/r Restriktionsenzymverdau und Ligation kloniert. Zur simultanen Expression der Schwer- und Leichtketten wurden die Vektoren a pXC-17.4 und a pXC-18.4 zu einem einzigen Vektor mit standardmäßigem/r Restriktionsenzymverdau und Ligation fusioniert.

Alle Konstrukte wurden sequenziert, um ihre korrekte Sequenzzusammensetzung zu gewährleisten.

Transiente Expression von OX40L-Antikörpern

Antikörper wurden mit der FreeStyleTM CHO-S suspensionsadaptierten Zelllinie von Invitrogen transient exprimiert, um rekombinates Protein zu produzieren. Plasmide wurden in die Zellen unter Verwendung von PEI (Polyethylenimin MW 40000) transfiziert und 13 Tage lang überwuchern gelassen, bevor der Überstand zur Reinigung entnommen wurde. Zellen wurden während des Überwucherungsprozesses mit ActiCHOTM Nahrung A und B von GE Healthcare gefüttert, um die Produktivität anzukurbeln und die Langlebigkeit der Zellen zu unterstützen. Im Laufe des Überwucherungsprozesses wurden regelmäßig Proben entnommen, um Zellwachstum und Lebensfähigkeit zu überwachen.

Erzeugung stabiler Lonza-Pools

Zum Produzieren der Gramm-Mengen, die für Toxizitätsstudien erforderlich sind, wurden 10A7 und 2D10 OX40L-Antikörper zum Lonza GS Xceed-System für eine stabile Expression übertragen. HC und LC für jeden Antikörper wurden zur Expression in CHO-Zellen durch Genewiz zuerst Codon-optimiert. Die HC-Kassette (mit der optimierten konstanten IgG4PE-Region) wurde dann in Lonzas pXC18.4-Vektor kloniert und die LC-Kassette (mit der optimierten konstanten Kappa-Region) wurde in Lonzas pXC17.4-Vektor mit standardmäßigem/r Restriktionsenzymverdau und Ligation kloniert. Ein Doppelgenvektor (DGV), der sowohl die HC- als auch die LC-Sequenzen kodierte, wurde dann durch Restriktionsenzymverdau und Ligation erzeugt und die Sequenz wurde vor der Expression bestätigt.

Vor der stabilen Pool-Bildung wurden die Einzelgenvektoren, die die HC und LC getrennt kodierten, sowie der DGV, der beide enthielt, in der Lonza CHOK1SVKO-Zelllinie unter Verwendung von PEI (Polyethylenimin MW 40000) transient exprimiert. Zellen wurden 13 Tage lang überwuchern gelassen, bevor der Überstand zur Reinigung entnommen wurde. Im Laufe dieses Zeitraums wurden Zellen mit ActiCHOTM Nahrung A und B von GE Healthcare gefüttert, um die Produktivität anzukurbeln und die Langlebigkeit der Zellen zu unterstützen. Im Laufe des Überwucherungsprozesses wurden regelmäßig Proben entnommen, um Zellwachstum und Lebensfähigkeit zu überwachen. Nachdem die transiente Expression bestätigt und gereinigtes Material analysiert worden war, wurden die Antikörper als stabile Pools exprimiert.

Stabile Pools wurden mit proprietären Verfahren und Medien von Lonza erzeugt. 4 Pools wurden pro Antikörper erzeugt und 10–15 Tage lang wiederherstellen gelassen. Nachdem sich die Zellen wiederhergestellt hatten, wurden Vorsaatvorräte (PSS) von Zellen für eine spätere Wiederherstellung und Erzeugung von MCB eingefroren. Dann wurden kleinformatige (50 ml) Schüttelkolben-Fed-Batch-Überwucherungen mit proprietärem Medium von Lonza eingerichtet. Zellen wurden 14 Tage lang überwuchern gelassen. Im Laufe dieses Zeitraums wurden die Zellen mit Bezug auf Wachstum, Lebensfähigkeit und Glucosewerte überwacht. Zellen wurden mit proprietärer Nahrung von Lonza und 400g/l Glucose angereichert. Außerdem wurden Proben während des gesamten Prozesses für eine grobe Probenquantifizierung entnommen. Am Ende des Überwucherungsprozesses wurde der Überstand zur Reinigung entnommen.

Stabile Pools wurden mit proprietären Verfahren und Medien von Lonza erzeugt. 4 Pools wurden pro Antikörper erzeugt und 10–15 Tage lang wiederherstellen gelassen. Nachdem sich die Zellen wiederhergestellt hatten, wurden Vorsaatvorräte (PSS) von Zellen für eine spätere Wiederherstellung und Erzeugung von MCB eingefroren. Dann wurden kleinformatige (50 ml) Schüttelkolben-Fed-Batch-Überwucherungen mit proprietärem Medium von Lonza eingerichtet. Zellen wurden 14 Tage lang überwuchern gelassen. Im Laufe dieses Zeitraums wurden die Zellen mit Bezug auf Wachstum, Lebensfähigkeit und Glucosewerte überwacht. Zellen wurden mit proprietärer Nahrung von Lonza und 400g/l Glucose angereichert. Außerdem wurden Proben während des gesamten Prozesses für eine grobe Probenquantifizierung entnommen. Am Ende des Überwucherungsprozesses wurde der Überstand zur Reinigung entnommen.

Während 2D10 und 10A07 eine ähnliche Sequenz hatten, waren die Expressionsprofile in den stabilen Lonza-Pools unterschiedlich, 10A07 exprimierte mit sehr geringen Titern, wohingegen 2D10 mit weit größeren Titern (siehe Tabelle 2) unter optimalen Bedingungen exprimierte, wenn Schüttelkolben in 4 getrennten erzeugten stabilen Pools verwendet wurden. Tabelle 2 (Konzentration in mg/l)

Stabiler PoolTag 7 Tag 8 Tag 9 Tag 10 Tag 11 Tag 12 Tag 13 Tag 142D10-1 261 492 681 993 1157 1590 1530 15752D10-2 245 461 665 983 1127 1485 2025 19952D10-3 317 528 731 1163 1367 1785 1905 18602D10-4 372 677 785 1286 1350 1935 1965 1800Kontroll-Antikörper 1 92 129 167 229 297 357 416 N/AKontroll-Antikörper 1 66 95 127 161 208 238 266 N/AKontroll-Antikörper 1 68 102 132 192 266 324 314 N/AKontroll-Antikörper 1 88 129 165 245 328 410 385 N/A

Nach der Expression wurde der im Rhesusaffen-GvHD-Modell zu verwendende Antikörper mit einem Zweistufen-Reinigungsverfahren gereinigt. Die Antikörper wurden zuerst mit MabSelect SuRe(GE Healthcare)-Affinitätschromatographie gereinigt. Antikörper wurden aus den MabSelect SuRe-Medien mit IgG Elute-Reagens (Pierce) eluiert und die eluierten Antikörper wurden in Natriumacetat-(pH 5,5)-Puffer vor dem zweiten Reinigungsschritt dialysiert. Antikörper wurden dann durch Kationenaustausch gereinigt und mit Natriumchlorid in Natriumacetatpuffer eluiert. Eluierte Antikörper wurden in PBS dialysiert. Antikörper wurden durch eine Spektrophotometermessung bei OD 280nm quantifiziert und auf die gewünschte Konzentration (10mg/ml) gebracht. Die Antikörperreinheit wurde durch SDS-PAGE-Analyse und Größenausschlusschromatographie beurteilt. Die Endotoxinkonzentration wurde mit Endosafe PTS und LAL Testkartuschen (Charles River Laboratories) gemessen.

Beispiel 5Bestimmen der Wirkung von Anti-OX40L-Antikörpern in einer allogenen PBMC Mischlymphozyten-Reaktion

PBMCs werden von Leukoreduktionssystemkammern (NHSBT) durch Ficoll-Paque plus (GE Healthcare) Dichtegradientenzentrifugation isoliert. PBMC werden mit Mitomycin C (Sigma) zu 10 oµg/ml in PBS eine Stunde lang bei 37 C vorinkubiert. Zellen wurden dann dreimal in PBS gewaschen, bei 300 xg 3 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand wird nach jeder Wäsche abgesaugt. Allogene PBMC (nicht mit Mitomycin C behandelt) werden zu einer 96-Well-Platte in RPMI, angereichert mit 610 % v/v FBS mit einer Konzentration von 2 × 10 /ml, 50 µl/Well, gegeben. Anti-OX40L-Antikörper werden in Kulturmedium verdünnt und zu einer 96-Well-Platte mit PBMC (nicht mit Mitomycin C behandelt) zu 50 µl/Well gegeben. Mit Mitomycin C behandelte PBMC werden dann zu allogenen PBMC (nicht mit Mitomycin C behandelt) in einer 96-Well-Platte in einem endgültigen Zellverhältnis zwischen Mitomycin C-behandelt und nicht mit Mitomycin C behandelt im Bereich 1:1 bis 4:1 auf der Basis der Anzahl von Zellen/Well gegeben. Die Zellen werden fünf Tage lang bei 37°C/5 % CO2 inkubiert. Nach fünf Tagen werden TNF-α, IFN-γ und IL-2 mit DuoSet ELISA (R&D Systems) gemäß Herstellerempfehlungen gemessen. Die Proliferation wird per CFSE-Verdünnung gemäß Herstellerempfehlungen gemessen.

PBMCs wurden von Leukoreduktionssystemkammern (NHSBT) durch Ficoll-Paque plus (GE Healthcare) Dichtegradientenzentrifugation isoliert. PBMC wurden mit Mitomycin C (Sigma) zu 10 oµg/ml in PBS eine Stunde lang bei 37 C vorinkubiert. Zellen wurden dann dreimal in PBS gewaschen, bei 300 xg 3 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand wurde nach jeder Wäsche abgesaugt. T-Lymphozyten (T-Zellen), in einigen Fällen CD3-positiv und in anderen Fällen CD4- und CD8-positiv, wurden von allogenen PBMC durch negative Selektion mit magnetischen Mikrokügelchen (Miltenyi Biotech) gemäß Herstellerempfehlungen isoliert. In einigen Fällen wurden nicht mit Mytomycin C behandelte PBMC anstelle von T-Zellen verwendet. Die isolierten Zellen wurden bei 300 xg/5 min lang zentrifugiert, in Kulturmedium resuspendiert (Kulturmedium war entweder als RPMI (Gibco) + 10 % v/v FBS oder RPMI + 5 % v/v humanes AB-Serum definiert) und 50 µl der Zellsuspension wurden zur 96-Well-Platte gegeben, die rekombinanten OX40L und Antikörpertitration enthielt, um 5eine Endkonzentration von 2 × 10 Zellen/Well zu erhalten. Anti-OX40L-Antikörper wurden in Kulturmedium auf eine endgültige Assaykonzentration von 100 nM verdünnt oder es wurde in einigen Fällen eine Antikörpertitration verwendet. Die Antikörper wurden zur 96-Well-Platte, die T-Zellen oder nicht mit Mitomycin C behandelte PBMC enthielt, zu 50 µl/Well gegeben. Mit Mitomycin C behandelte PBMC wurden dann zu T-Zellen oder nicht mit Mitomycin C behandelten PBMC in 96-Well-Platten in einem endgültigen Zellverhältnis zwischen mit Mitomycin C behandelten PBMC und T-Zellen (oder PBMC) im Bereich von 1:1 bis 4:1 auf der Basis der Anzahl der Zellen/Well gegeben. Die Zellen wurden fünf Tage lang bei 37°C/5 % CO2 inkubiert. Nach fünf Tagen wurde IFN-γ mit DuoSet ELISA (R&D Systems) gemäß Herstellerempfehlungen gemessen.

Anti-OX40L-Antikörper wurden als Inhibitoren in allogenen PBMC/T-Zell-MLR oder PBMC/PBMCl-MLR definiert, bei > 20 % Inhibition (siehe Gleichung 8) Faktorfreisetzung (IFN-γ,), oder relativ zu Kontroll-Wells in Abwesenheit von Antikörper beobachtet. Von vier durchgeführten Experimenten war ein Experiment ein technischer Misserfolg, definiert als keine MLR-Rückmeldung (IFN-γ Freisetzung) zwischen allogenen Spendern detektiert. Von den drei verbleibenden Experimenten wiesen alle drei Inhibition (> 20 % Inhibition der Faktorfreisetzung (IFN-γ,), relativ zu Kontroll-Wells ohne Antikörper beobachtet) mit 2D10, 10A07 und positiver Kontrolle 1 auf, allerdings wurde in einem der drei Experimente eine signifikante Inhibition auch mit dem Isotypγ Kontrollantikörper beobachtet (2). Für PBMC/PBMC-MLR wurden drei Experimente durchgeführt. Von drei Experimenten wurden zwei als technischer Misserfolg angesehen, da es keine oder eine geringe IFN-γ-Freisetzung gab. In einem anderen Experiment inhibierte 10A07 jedoch die IFN-γ-Freisetzung im Vergleich zur Isotypkontrolle.

Gleichung 8: Prozentuale Inhibition (MLR)

Anhand von Werten von der IFN-γ- oder IL2-Freisetzung (pg/mL), bestimmt wie beschrieben % Inhibition = 100 – Probenwert – kein StimulusKein IgG – kein Stimulus × 100
Kein Stimulus = Wells enthielten nur T-Zellen oder nicht mit Mitomycin C behandelte PBMC wurden zugegeben (keine mit Mitomycin C behandelte PBMC)
Kein IgG = Wells enthielten T-Zellen oder in einigen Fällen werden nicht mit Mitomycin C behandelte PBMC zusammen mit Mitomycin C behandelten PBMC zugegeben, aber kein IgG.

Beispiel 6Bestimmen der Wirkung von Anti-OX40L-Antikörpern auf C3-vorbehandelte primäre humane Tγ Lymphozyten

Um zu bestimmen, ob Anti-OX40L T-Zellreaktionen ohne OX40L induzieren konnte, wurde der folgende Assay unter Anwendung des von Wang et al., Hybridoma (Larchmt)., 2009 Aug; 28(4): 269–76, worin ein agonistischer Anti-OX40L-Antikörper beschrieben wurde, beschriebenen Verfahrens durchgeführt.

Ein Maus-Anti-Human-CD3-Antikörper (Becton Dickinson) wurde in steriler PBS auf 0,5 μg/ml verdünnt und 50 μl/Well wurden zu einer hochbindenden sterilen 96-Well-Platte gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert.

Nach der Übernachtinkubation wurde die Platte dreimal mit 100 μl steriler PBS gewaschen.

T-Zellen (CD3-positiv) wurden von PBMC isoliert, die von Leukoreduktionssystemkammer (NHSBT) wie in Beispiel 3 beschrieben gewonnen wurden. Nach der Isolierung wurden die Zellen zu 5Wells zu 100 μl gegeben, um eine Endkonzentration von 1 × 10 Zellen/Well zu erhalten.

Testantikörper wurden in RPMI + 10 % FBS verdünnt und 50 μl oder 100 μl/Well wurden zur Zellplatte gegeben, um eine endgültige Assaykonzentration von 10 μg/ml zu erhalten. In einigen Fällen wurde auch ein Maus-Anti-Human-CD28-Antikörper (Becton Dickinson) zu Wells mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml gegeben.

Das Assaymaterial wurde 5 Tage lang inkubiert. Nach 5 Tagen wurden Überstände übernommen und IFN-γ-Niveaus im Überstand wie in Beispiel 5 beschrieben bestimmt.

Der Assay wurde bei vier unabhängigen Spendern durchgeführt und es wurde keine Wirkung der Zugabe von 10A07 oder 2D10 im IgG4PE-Format (IFN-γ-Freisetzung) beobachtet, verglichen mit der, die mit der humanen IgG4PE-Isotypkontrolle beobachtet wurde.

Beispiel 7Rhesusaffen-Transplantat-gegen-Wirt-Krankheits-(GvHD)-Modell

Die Wirksamkeit des Antikörpers 2D10 IgG4PE als prophylaktische Monotherapie zur Behandlung von GvHD wurde in einem Rhesusaffenmodell einer haploidentischen hämatopoetischen Stammzellentransplantation (HSCT) untersucht. Es wurde zuvor beschrieben, dass Affen, die einer HSCT in diesem Modell unterzogen wurden, eine Überlebenszeit von 6–8 Tagen hatten (Miller, Weston P., et al. "GVHD after haploidentical transplantation: a novel, MHC-defined rhesus macaque model identifies CD28 CD8+ T cells as a reservoir of breakthrough T-cell proliferation during costimulation blockade and sirolimus-based immunosuppression." Blood, 116, 24(2010): 5403–5418.)

Alle Transplantationen fanden zwischen Halbgeschwisterpaaren statt, die an einem MHC-Haplotyp nicht übereinstimmten (“haploidentische HCTs”). Empfängertiere erhielten vor der Transplantation eine strahlungsbasierte prä-myeloablative Konditionierung mit einem linearen Beschleuniger. Dosisrate: 7cGy/min. Dosis 1020 cGy wurde in 4 Teilen gegeben. Das Leukopherese-Spendertier wurde einer GCSF-Mobilisierung unterzogen und es wurde eine Leukapherese mit der Spectra Optia-Apheresmaschine durchgeführt. Die folgende Tabelle enthält die Dosis pro kg der gesamten kernhaltigen Zell-(TNC)-Dosis von CD3+-Zellen und CD34+-Zellen für die vier erfolgreichen Experimente. Tabelle 3

Empfänger ID Nr. Tier Nr.Empfänger Körpergewicht (kg) TNC (109/kg)CD3+ T-Zellen 106/kg CD34+-Zellen 106/kgA14079
A14081
A14082
A14087
#2
#4
#5
#6
9,75
7,02
7,6
5,75
1,13
2,99
2,24
3,44
149,76
389,08
312,95
385,66
0,51
4,79
2,69
9,99

2D10 IgG4PE wurde mit 10 mg/kg gemäß einem Dosierungsplan dosiert, der Verabreichungen am Tag –2, Tag +5, Tag +12, Tag +19, Tag +26, Tag +33, Tag +40, Tag +47 nach der Transplantation vorsah. Bei keinem der Tiere wurden gravierende nachteilige Dosierungsnebenwirkungen infolge der Verabreichung von 2D10 IgG4PE beobachtet.

Proben wurden im Laufe der Studie entnommen, um Donor-Chimärismus (Tabelle 4) sowie die Zahl weißer Blutkörperchen zu überwachen. Der primäre Endpunkt war um das Überleben herum angesiedelt, wobei ein Überleben von 15 Tagen als ein Zeichen für eine erfolgreiche prophylaktische Behandlung angesehen wurde (verglichen mit dem dokumentierten Überleben von 6–8 Tagen ohne Prophylaxe). Obwohl sich eine vollständige Pathologie und Histologie mit GvHD-Bewertungspunkten, Markern von T-Zell-Aktivierung (wie Ki-67 und Granzyme B) und Gen-Array-Analyse in der Planung befindet, standen sie für eine Einbeziehung nicht zur Verfügung.

Die Verfahren für diese Studien entsprechen im Wesentlichen denen in Miller WP et al., (2010) “GVHD after haploidentical transplantation: a novel, MHC-defined rhesus macaque model identifies CD28– CD8+ T cells as a reservoir of breakthrough T-cell proliferation during costimulation blockade and sirolimus-based immunosuppression”, Blood 116: 5403–5418 beschriebenen.

Klinische Stadienbestimmung von GvHD

Die Bewertung klinischer Symptome beruhte auf empirischen Beurteilungen und klinischer Chemie, klassifiziert gemäß den in Tabelle 5 dargelegten Kriterien.

Histopathologie

Gewebe, inkl. Lunge, Leber, Haut und Magen-Darm-Trakt, wurde bei der Nekropsie entnommen und in Formalin fxiert und in Paraffin eingebettet. Stücke wurden herausgeschnitten, auf einem Objektträger befestigt und mit Hämatoxylin/Eosin oder mit T-Zell-Markern zur Visualisierung der Gewebeinfiltration durch Lymphozyten gefärbt. Präparierte Objektträger werden von einem Gewebepathologen mit spezieller Fachkenntnis mit Bezug auf GvHD unter Verwendung eines semiquantitativen Bewertungssystems gedeutet.

Durchflusszytometrie

Longitudinale periphere Blutproben wurden vor und nach der hämatopoetischen Stammzellentransplantation und bei der Nekropsie zur durchflusszytometrischen Analyse von Lymphozytenteilmengen entnommen. Gewebe von Lunge, Leber, Kolon, Milz und Lymphknoten (axillär und inguinal) wurde bei der Nekropsie entnommen und dissoziiert oder enzymatisch verdaut, wie für die anschließende Analyse von Lymphozyteninfiltraten anhand Durchflusszytometrie zweckmäßig. Proben wurden per Mehrfarben-Durchflusszytometrie mit einem LSRFortessa Zellanalysator (BD Biosciences) mit den folgenden T-Lymphozytenmarkersonden analysiert: CD3 (APC-Cy7-Marker; Klon SP34-2, BD Biosciences), CD4 (BV786-Marker; Klon L200, BD Biosciences), CD8 (BUV395-Marker; Klon RPA-T8, BD Bioscences), CD28 (PE-Cy7-Marker; Klon CD28.2, eBioscience), CD95 (BV605-Marker; Klon DX2, Biolegend). Proliferierende Zellpopulationen wurden mit Ki-67 (FITC-Marker, Dako) identifiziert. CD4+ oder CD8+ T-Zell-Subkompartimente wurden wie folgt markiert: naive T-Zellen (CD28+/CD95–), zentrale Speicher-T-Zellen (CD28+/CD95+), Effektor-Speicher-T-Zellen (CD28–/CD95+).

Chimärismus

Peripherer Blut- oder T-Zell-(CD3+/CD20–)-Chimärismus wurde mit abweichenden Spender- und Empfänger-spezifischen MHC-verknüpften Mikrosatellitenmarkern bestimmt, indem Peakhöhen der Spender- und Empfänger-spezifischen Amplikons verglichen wurden (Penedo MC et al., (2005) “Microsatellite typing of the rhesus macaque MHC region”, Imunogenetics 57: 198–209.) Tabelle 5

Stadium Haut Leber (Billirubin) GI0 Kein GVHD-Ausschlag < 4fache Zunahme gegenüber BasislinieKein Durchfall1 Ausschlag < 25 % des Oberflächenbereichs4- bis 8fache Zunahme “Schwacher” Durchfall2 Ausschlag 25–50 % des Oberflächenbereichs8- bis 20fache Zunahme “Mäßiger” Durchfall3 Ausschlag > 50 % des Oberflächenbereichs20- bis 50fache Zunahme “Starker” Durchfall4 Generalisierte Erythroderm mit Blasenbildung > 50fache Zunahme “Sehr starker ” Durchfall

Insgesamt sechs Tiere wurden für den Erhalt der HSCT ausgewählt. Von diesen 6 Tieren wurde bei zwei Tieren das Experiment als technischer Misserfolg angesehen, bei einem Tier gab es eine virale Reaktivierung, die möglicherweise das Transplantateinwachsen behindert hat, und es war erkennbar, dass der Spender-Chimärismus zuerst anstieg, aber dann abfiel, was ein Hinweis darauf war, dass die zweite Rekonstitution eine autologe Repopulation war. Gleichzeitig mit dem Rückgang von Chimärismus und autologer Repopulation war ein einzelner hoher Zytomegalovirus-(CMV)- und Rhesus macaque-Lymphocryptovirus-(rhLCV)-Messwert vorhanden. Der zweite technische Misserfolg war das Resultat eines Fehlers der Apheresemaschine beim Erzeugen eines geeigneten Transplantationsprodukts. Da das Empfängertier bereits bestrahlt worden war, musste es getötet werden. Die vier anderen Tiere überlebten bis zum primären Endpunkt von 15 Tagen und wiesen ein verlängertes Überleben im Vergleich zu sowohl historischen als auch zeitgleichen Nicht-Prophylaxe-Kontrollen auf. Die folgende Tabelle 6 enthält eine Übersicht über jedes Tier in dieser Studie.

Beispiel 8Pharmakokinetik

Rhesusaffen erhielten an Tag 0 eine Dosis von 10 mg/kg 2D10 oder eines zweckmäßigen nicht funktionellen Isotyp-Kontrollantikörpers. Proben wurden nach +15 Minuten, +1 Stunde, +8 Stunden, +24–36 Stunden, +72 Stunden, +96 Stunden, +Tag 8, +Tag 11, +Tag 15, +Tag 18, +Tag 22, +Tag 25 entnommen. An Tag 29 erhielten die Tiere eine Dosis von 3 mg/kg 2D10 oder eines zweckmäßigen nicht funktionellen Isotyp-Kontrollantikörpers. Proben wurden an Tag 29 nach +15 Minuten, +1 Stunde, +8 Stunden und dann 24–36 Stunden nach Tag 29 entnommen. Proben wurden weiterhin an +Tag 32, +Tag 33, +Tag 36, +Tag 39, +Tag 43, +Tag 46, +Tag 50, +Tag 53, +Tag 57, +Tag 60, +Tag 64, +Tag 67 und +Tag 71 entnommen.

Zum Bestimmen von PK wird Anti-Human-IgG auf 8 μg/ml in PBS verdünnt und an 96-Well-Platten mit geringer Autofluoreszenz und hoher Proteinbindung (Costar) über Nacht bei 4 °C adsorbiert. Überschüssiges IgG wird durch Waschen mit PBS-Tween entfernt und Wells werden mit 5% w/v fettfreier Trockenmilch (Blocking-Puffer) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Nach der Inkubation werden die Platten gewaschen. Plasmaproben werden in Blockin-Puffer verdünnt (mehrere Verdünnungen). Eine Standardkurve wird ebenfalls mit einer Titration von positivem Kontroll-Anti-OX40L-Antikörper erzeugt, der in Blocking-Puffer von 10 μg/ml verdünnt ist (1:3 Verdünnung). Entweder Titration oder verdünnte Plasmaprobe wird zur Platte gegeben und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Platten werden dann gewaschen und biotinyliertes humanes OX40L wird auf 500 ng/ml in Blocking-Puffer verdünnt, der 1 Stunde lang bei Raumtemperatur zugegeben wird. Platten werden dann gewaschen und Streptavidin-Europium3 + Konjugat (DELFIA®-Detektion, PerkinElmer), verdünnt in DELFIA®-Assaypuffer (Perkin Elmer), wird zugegeben. Platten werden dann dreimal in Tris-gepufferter Salzlösung +0,1 % Tween gewaschen. Anschließend wird DELFIA-Enhancement-Lösung (Perkin Elmer) zur Platte gegeben und die zeitaufgelöste Fluoreszenz wird bei 615 nm auf einem Envision-Plattenleser (PerkinElmer) gemessen. Die Konzentration von Anti-OX40L-Antikörper in Plasma wird durch Extrapolieren der Fluoreszenzwerte von Proben-Wells gegenüber den von der Standardkurve erhaltenen berechnet, die anhand der Titration des positiven Kontroll-Anti-OX40L-Antikörpers mit einem logistischen Vierparameter-Kurvenanpassungsalgorithmus erzeugt wurde. Tabelle 6

2D10 IgG4PE Rhesus-GvHD-StudieTier EinzelheitenNr. 1Überleben bis Tag 24. Erhielt 4 Dosen von 2D10 IgG4PE. Biphasische hämatopoetische Rekonstitution; Daten über peripheren Blut-Chimärismus deuteten auf ein anfängliches Spendertransplantateinwachsen gefolgt von autologer Repopulation gleichzeitig mit einem Auftreten einer CMV- und rhLCV-Infektion hin. Eine Virusinfektion wurde als möglicher Grund für den Transplantatmisserfolg angesehen. Erfasst als technischer Misserfolg.Nr. 2 Überleben bis Tag 16. Erhielt 3 Dosen von 2D10 IgG4PE. Höchster peripherer Blutspender-Chimärismus von 88 % an Tag 15. Keine Anzeichen einer CMV- oder rhLCV-Infektion. Studie wurde auf Rat des Tierarztes wegen einer Wunde an der Katheterstelle beendet (wurde nicht auf die Behandlung oder GvHD zurückgeführt). Die Bestimmung des GvHD-Stadiums bei Nekropsie: Haut 1 (Ausschlag < 25 %); Leber 0 (kein Bilirubin-Anstieg); GI 0 (kein Durchfall).Nr. 3 Als technischer Misserfolg erfasst. Ein Fehler der Aphereseanlage führte zu einem äußerst suboptimalen Spenderblutprodukt. Nr. 4Überleben bis Tag 26. Erhielt 4 Dosen von 2D10 IgG4PE. Eindeutige hämatopoetische Rekonstitution mit höchstem peripherem Blutspender-Chimärismus von 99 % bis Tag 23. Keine Anzeichen einer CMV- oder rhLCV-Infektion. Die Studie wurde auf Rat des Tierarztes wegen einem skrotalen Ödem beendet. Bestimmung des GvHD-Stadiums bei Nekropsie: Haut 2 (Ausschlag 25–50 %); Leber 0 (kein Bilirubin-Anstieg); GI 0 (kein Durchfall). Eine grobe Nekropsie bestätigte, dass keine offensichtliche viszerale GvHD vorlag. Nr. 5 Überleben bis Tag 22. Erhielt 4 Dosen von 2D10 IgG4PE. Eindeutige hämatopoetische Rekonstitution mit höchstem peripherem Blutspender-Chimärismus von 99 % bis Tag 12. Keine Anzeichen einer CMV- oder rhLCV-Infektion. Die Studie wurde wegen einer anhaltend geringen Blutplättchenzahl mit hohem Blutungsrisiko und dem Auftreten von Anzeichen einer akuten systemischen GVHD beendet. Bestimmung des GvHD-Stadiums: Haut 3 (Ausschlag > 50 %); Leber 1 (4–8facher Bilirubin-Anstieg); GI 3 (starker Durchfall).Nr. 6Überleben bis Tag 16. Erhielt 3 Dosen von 2D10 IgG4PE. Eindeutige hämatopoetische Rekonstitution mit höchstem peripherem Blutspender-Chimärismus von 100 % am Tag 12. Keine Anzeichen einer CMV- oder rhLCV-Infektion. Bestimmung des GvHD-Stadiums bei Nekropsie: Haut 2 (Ausschlag 25–50 %); Leber 1 (4–8facher Bilirubin-Anstieg); GI 2 (mäßiger Durchfall).