Title:
Verfahren und Vorrichtung zur Unterscheidung des Differenzierungsgrades von pluripotenten Stammzellen
Kind Code:
B3


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung des Differenzierungsgrades pluripotenter Stammzellen, umfassend: einen Schritt zur Kultivierung einer Stammzelle; einen Schritt zur Erfassung eines Bildes der kultivierten Stammzelle; einen Schritt zur Bestimmung einer Ebenheit der kultivierten Stammzelle auf Basis des Bildes; und einen Schritt zur Bestimmung des Differenzierungsgrads der kultivierten Stammzelle auf Basis der Ebenheit.




Inventors:
Sugiyama, Norikazu (Shizuoka, Hamamatsu-shi, JP)
Yamauchi, Toyohiko (Shizuoka, Hamamatsu-shi, JP)
Fukami, Tadashi (Shizuoka, Hamamatsu-shi, JP)
Iwai, Hidenao (Shizuoka, Hamamatsu-shi, JP)
Application Number:
DE112013006966T
Publication Date:
06/22/2017
Filing Date:
08/09/2013
Assignee:
Hamamatsu Photonics K.K. (Shizuoka, Hamamatsu-shi, JP)
International Classes:



Foreign References:
WO2012115153A12012-08-30
Other References:
HAUPT, S. [u.a.]: Automated selection and collection of pluripotent stem cell colonies using the CellCelector™. Nat. Methods (Juni 2009) 6, iii-iv
TAKAHASHI, K. [u.a.]: Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols (2007) 2 (12) 3081-3089
Attorney, Agent or Firm:
Grünecker Patent- und Rechtsanwälte PartG mbB, 80802, München, DE
Claims:
1. Verfahren zur Bestimmung des Differenzierungsgrades von Stammzellen, umfassend:
einen Schritt zur Kultivierung einer Stammzelle;
einen Schritt zur Erfassung eines Bildes der kultivierten Stammzelle;
einen Schritt zur Bestimmung einer Ebenheit der kultivierten Stammzelle auf Basis des Bildes; und
einen Schritt zur Bestimmung des Differenzierungsgrads der kultivierten Stammzelle auf Basis der Ebenheit.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ebenheit eine Ebenheit einer Fläche von wenigstens einer der Stammzellen umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ebenheit eine Ebenheit einer Oberfläche einer Zellpopulation mit mehreren Stammzellen umfasst.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die Ebenheit eine Ebenheit in einem Sichtfeld eines Mikroskops umfasst.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die Ebenheit eine Ebenheit in einem Bereich von Interesse innerhalb eines Sichtfelds eines Mikroskops umfasst.

6. Eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Differenzierungsgrades einer kultivierten Stammzelle, umfassend:
Mittel zur Erfassung eines Bildes der kultivierten Stammzelle;
Mittel zur Bestimmung der Ebenheit der kultivierten Stammzelle basierend auf dem Bild;
Mittel zur Bestimmung des Differenzierungsgrades der kultivierten Stammzelle basierend auf der Ebenheit.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Ebenheit eine Ebenheit einer Fläche von wenigstens einer der Stammzellen umfasst.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Ebenheit eine Ebenheit einer Oberfläche einer Zellpopulation mit mehreren Stammzellen umfasst.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6–8, wobei die Ebenheit eine Ebenheit in einem Sichtfeld eines Mikroskops umfasst.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6–8, wobei die Ebenheit eine Ebenheit in einem Bereich von Interesse innerhalb eines Sichtfelds eines Mikroskops umfasst.

Description:
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und eine Vorrichtung zur Feststellung des Differenzierungsgrades von Stammzellen.

Stand der Technik

Eine embryonale Stammzelle weist eine Pluripotenz zur Aufteilung in unterschiedliche Zellen auf, so dass deren Anwendung zum Beispiel auf dem Gebiet der regenerativen Medizin zur Erneuerung oder Regeneration verschiedener Gewebe möglich wäre. Da die Zellen jedoch einem Fötus entnommene werden, ist deren praktische Umsetzung in der Medizin, aufgrund des begrenzten Zellvorkommens, der kontroversen ethischen Fragen und dergleichen, wahrscheinlich mit Schwierigkeiten verbunden. Zur Lösung solcher Probleme wurde eine induzierte pluripotente Stammzelle (nachstehend auch als ”iPS-Zelle” bezeichnet) entwickelt. Eine iPS-Zelle ist eine pluripotente Stammzelle, die künstlich aus einer adulten Zelle erzeugt wird und die Fähigkeit der Selbstreplikation und der Pluripotenz aufweist. Da eine iPS-Zelle aus einer adulten Zelle erzeugt wird, ist das Zellenvorkommen im Verhältnis größer als das einer embryonalen Stammzelle, und ferner treten nur wenige ethische Fragen auf, wodurch deren Verwendung in der regenerativen Medizin oder dergleichen als geeigneter erachtet wird.

ZitationslisteNicht-Patentliteratur

  • Nicht-Patentliteratur 1: Mitsui, K. et al, Cell, Vol. 113 (2003): p. 631–642.
  • Nicht-Patentliteratur 2: Xu, R. et al, Nature Methods, Vol. 2 (2005): p. 185–190.

Zusammenfassung der ErfindungDurch die Erfindung zu lösende Probleme

Eine iPS-Zelle unterscheidet sich jedoch von einer bestehenden kultivierten Zelle dahingehend, dass die iPS-Zelle dazu neigt, unspezifisch und auf einfache Weise während einer Subkultivierung in eine reifere Zelle zu differenzieren. Es besteht das Problem, dass es allmählich unmöglich wird, eine differenzierte iPS-Zelle zu subkultivieren und dass eine weitere Pluripotenz verlorengeht, so dass sie für die Anwendung in der regenerativen Medizin oder dergleichen nicht geeignet ist. Daher ist bei der Kultivierung von iPS-Zellen eine zelluläre Qualitätskontrolle durch Bestimmen ihrer Differenzierungsgrade notwendig, um Zellen mit einem ungeeigneten Differenzierungsgrad zu entfernen.

Herkömmlicherweise ist ein Verfahren zur Bestimmung des Differenzierungsgrades durch visuelle Beobachtung auf der Grundlage eines Phasenkontrastmikroskop-Bildes bekannt; jedoch fehlt es einem Phasenkontrastmikroskop an Quantitativität und spiegelt somit den Differenzierungsgrad von Zellen nicht genau wider.

Darüber hinaus sind als ein Verfahren zur genaueren Bestimmung des Differenzierungsgrades von Zellen im Allgemeinen ein Verfahren, bei dem die Zellen mit einem Antikörper gefärbt werden, und ein Verfahren, bei dem die Zellen mit einer alkalischen Phosphatase oder dergleichen gefärbt werden, wie zum Beispiel in der Nicht-Patentliteratur 1 offenbart, bekannt. Jedoch erfordern diese Verfahren die Zerstörung der Zellen. Zusätzlich sind als ein Verfahren für eine Bestimmung an lebenden Zellen ein Verfahren, bei dem spezifische Zellenoberflächenmarker anhand eines Antikörper, der mit einer Fluoreszenzmarkierung oder dergleichen gekennzeichnet wird, kenntlich gemacht werden, und ein Verfahren bei dem Zellen mit einem Antikörper gegen einen undifferenzierte Marker kenntlich gemacht und mit FACS gemessen werden, wie beispielsweise in der Nicht-Patentliteratur 2 offenbart, bekannt. Jedoch reagiert eine pluripotente Stammzelle, wie beispielsweise eine iPS Zelle, empfindlich auf Umweltveränderungen, und ein externes Reagenz, wie ein Fluoreszenz-Reagenz, kann die Differenzierung und die Beschaffenheit der pluripotenten Stammzelle beeinflussen. Ferner sollte im Falle der Verwendung einer solchen Zelle in der regenerativen Medizin oder dergleichen, und der Transplantation der Zelle in einen menschlichen Körper, das Risiko einer Kontaminierung externer Reagenzien oder dergleichen und einer Verschmutzung aufgrund der Komplexität des Vorgangs vermieden werden. Daher wird ein Verfahren zur Bestimmung des Differenzierungsgrades von Zellen benötigt, das nicht-invasiv ist und kein Einfärben verwendet.

Die vorliegende Erfindung, die im Hinblick auf die oben erwähnten Umstände konzipiert wurde, stellt ein Verfahren zur Bestimmung des Differenzierungsgrades von Zellen bereit, das nicht-invasiv ist und kein Färben verwendet.

Mittel zur Lösung der Probleme

Zur Lösung dieser Aufgabenstellung stellt die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung des Differenzierungsgrades von Stammzellen mit den Merkmalen des Anspruchs 1 bzw. 6 bereit. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen genannt.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass die Oberfläche einer kultivierten undifferenzierten pluripotenten Stammzelle flacher als die einer differenzierten Zelle ist. Auf der Grundlage der obigen Feststellungen konzipierten die Erfinder die vorliegende Erfindung. In dem oben erwähnten Bestimmungsverfahren dient die Ebenheit als ein Indikator für den Differenzierungsgrad, d. h., je flacher eine Oberfläche einer Zelle oder eine Oberfläche einer Zellpopulation ist, desto weniger differenziert ist die Zelle, und je weniger flach die Oberfläche der Zelle oder die Oberfläche der Zellpopulation ist, desto differenzierter ist die Zelle. Daher kann unter Verwendung des oben genannten Bestimmungsverfahrens bestimmt werden, ob es sich um eine undifferenzierte pluripotente Stammzelle oder um eine differenzierte pluripotente Stammzelle handelt, und somit kann ferner der Differenzierungsgrad bestimmt werden. Es sollte beachtet werden, dass in der vorliegenden Beschreibung die Ebenheit eine Ebenheit einer Oberfläche einer einzelnen Zelle oder eine Ebenheit einer Oberfläche einer Zellpopulation umfasst.

Die Ebenheit der Oberfläche der Zellpopulation kann insbesondere eine Ebenheit in einer mikroskopischen Sichtfeldeinheit oder eine Ebenheit in einem Bereich von Interesse (im Nachfolgenden auch als ”ROI”, engl. Region Of Interest) innerhalb eines mikroskopischen Sichtfeldes sein.

Durch Verwenden der Ebenheit in einer mikroskopischen Sichtfeldeinheit kann der Differenzierungsgrad in dem gesamten Kultursystem bestimmt werden, wodurch es möglich ist, die Ebenheit auf einfache und effiziente Weise und auch den Differenzierungsgrad effektiver zu bestimmen.

Durch Verwenden der Ebenheit in einem Bereich von Interesse innerhalb eines mikroskopischen Sichtfelds kann die Anzahl der Proben auf einfache Weise erhöht werden.

Die Ebenheit kann auch eine Ebenheit einer Zelle (einer einzelnen Zelle) umfassen. Für Zellen in einem mikroskopischen Sichtfeld kann mit Hilfe der Ebenheit jeder Zelle die Ebenheit in genauerer physiologischer, naturbasierter Weise ermittelt werden, wodurch der Differenzierungsgrad genauer bestimmt werden kann.

Die Ebenheit kann auch eine Standardabweichung der Höhe der Zellenoberfläche oder der Zellpopulationsoberfläche umfassen. Dementsprechend kann die Ebenheit leicht bestimmt werden. Es sollte beachtet werden, dass die Höhe der Zellenoberfläche einen Abstand von einer Bodenfläche der Zelle, die an einer Kulturschale anhaftet, bis zu einer Oberfläche der Zelle, die nicht an der Kulturschale anhaftet, umfasst, und dass die Höhe der Oberfläche der Zellpopulation einen Abstand von einer Bodenfläche der Zellpopulation, die an einer Kulturschale anhaftet, bis zu einer Oberfläche der Zellpopulation, die nicht an der Kulturschale anhaftet, umfasst.

Die Ebenheit kann auch ein Wert einer mittleren quadratischen Höhendifferenz (im Nachfolgenden auch als ”MSHD” bezeichnet) eines vorgegebenen horizontalen Abstands sein. Dementsprechend kann ein Wert der Ebenheit, der die Position des Objekts im Raum reflektiert, erhalten werden, wodurch der Differenzierungsgrad einer pluripotenten Stammzelle genauer bestimmt werden kann.

Darüber hinaus kann die Ebenheit auch eine Steigung eines Variogramms in einem horizontalen Abstand zwischen zwei vorbestimmten Punkte sein. Auf diese Weise kann ein Verfahren zur Bestimmung des Differenzierungsgrades einer pluripotenten Stammzelle mit besserer Bestimmungsfähigkeit zur Verfügung gestellt werden.

Die Ebenheit kann mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche oder der Zellpopulationsoberfläche standardisiert werden. Demgemäß kann eine Beeinträchtigung durch Unterschiede in einer Durchschnittshöhe der Zellen- oder Zellpopulationsoberfläche korrigiert werden.

Die Ebenheit kann mit Hilfe eines quantitativen Reflexionsphasenmikroskops bestimmt werden. Demgemäß kann eine dreidimensionale Zellenform mit einem Auflösungsvermögen gleich oder kleiner als 1 Mikrometer erhalten werden.

Wirkungen der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung des Differenzierungsgrades von Zellen bereitgestellt, das nicht-invasiv ist und keine Färbung verwendet.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt schematische Ansichten von vertikalen Abschnitten (a) von einer undifferenzierten pluripotenten Stammzelle, und (b) bis (d) von einer differenzierungsinduzierten pluripotenten Stammzelle;

2 zeigt Ansichten, die Bodenflächen- und Oberflächenformen von Zellen darstellen, die aus tomographischen Bildern (bzw. Schichtaufnahmen) mit dreidimensionalen Daten, die durch das Aufnehmen von dreidimensionalen Bildern der Zellen in einem 60 μm × 80 μm Sichtfeld unter Verwendung einer quantitativen Reflexionsphasenmikroskops in Beispiel 1 erhalten werden, extrahiert wurden. Die verwendeten Zellen umfassten MCF7-Zellen, undifferenzierte iPS-Zellen und iPS-Zellen, die durch das Zusetzen von Retinsäure kultiviert wurden;

3 zeigt Ansichten, in denen dreidimensionale Bilder von Zellen in einem 60 μm × 80 μm Sichtfeld, die unter Verwendung eines quantitativen Reflexionsphasenmikroskops in Beispiel 1 aufgenommen wurden, numerisch umgewandelt und dargestellt sind. Die verwendeten Zellen umfassten undifferenzierte iPS-Zellen und iPS-Zellen, die durch das Zusetzen von Retinsäure kultiviert wurden;

4 zeigt eine Ansicht, die die Ebenheit der undifferenzierten iPS Zellen und der durch das Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS Zellen in Beispiel 2 darstellt. Die Ebenheit wurde als Standardabweichung der Höhe der Zellenoberfläche berechnet, die mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche in einem ROI innerhalb eines mikroskopischen Sichtfeldes standardisiert wurde;

5 zeigt Ansichten, die Variogramme darstellen, die mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche von undifferenzierten iPS Zellen und iPS Zellen, die durch das Zusetzen von Retinsäure in Beispiel 3 kultiviert wurden, standardisiert werden. Die Messung wurde für ein ROI in einem mikroskopischen Sichtfeld durchgeführt;

6 zeigt das Ergebnis einer Analyse der Variogramme für undifferenzierte iPS-Zellen und iPS-Zellen, die durch das Zusetzen von Retinsäure in Beispiel 3 kultiviert wurden. Die Ebenheit wurde als ein MSHD-Wert für einen horizontalen Abstand (Δr) von 15 μm berechnet, der mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert wurde;

7 zeigt ein Histogramm, das aus der Analyse der Variogramme undifferenzierter iPS Zellen und iPS Zellen, die durch das Zusetzen von Retinsäure (3 Kolonien pro Stück) kultiviert wurden, erhalten wurde, die mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche unter Berücksichtigung aller Zellen als eine Population in Beispiel 3 standardisiert wurden. Der Abstand Δr beträgt 15 μm;

8 zeigt Ansichten, die die Ebenheit der undifferenzierten iPS-Zellen und iPS-Zellen, die durch das Zusetzen von Retinsäure in Beispiel 4 kultiviert wurden, darstellen. Die Ebenheit wurde als eine Steigung der Variogramme für Δr innerhalb eines Bereichs von 5 μm bis 15 μm berechnet, die anhand eines Mittelwerts der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert wurden. Die Messung wurde in einem ROI innerhalb eines mikroskopischen Sichtfeldes durchgeführt;

9 zeigt Ansichten, die die Ebenheit darstellt, die unter Verwendung verschiedener Herangehensweisen für undifferenzierte iPS-Zellen und iPS-Zellen, die in einem DMEM-Medium in Beispiel 5 kultiviert wurden, berechnet wurden. Die Messung wurde in einem ROI innerhalb eines mikroskopischen Sichtfeldes durchgeführt; und

10 zeigt eine Ansicht, die die Ebenheit in Beispiel 6 darstellt. Die Messung wurde in einer mikroskopischen Sichtfeldeinheit ausgeführt. Die Flachheit wurde als ein MSHD-Wert berechnet, der anhand eines Mittelwerts der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert wurde. Der Abstand Δr beträgt 5 μm.

Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung

Im Folgenden werden einige bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung des Differenzierungsgrades von pluripotenten Stammzellen bereit, deren Ebenheit als Indikator dient, wobei das Verfahren einen Schritt zur Bestimmung der Ebenheit der gezüchteten pluripotenten Stammzellen umfasst.

Gemäß der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder unter Verwendung einer unverwechselbaren Eigenschaft festgestellt, dass die kultivierte undifferenzierte pluripotente Stammzelle flacher als die differenzierte Zelle ist, wodurch der Differenzierungsgrad der kultivierten pluripotenten Stammzelle bestimmt werden kann.

Die Ebenheit der undifferenzierten pluripotenten Stammzelle und der differenzierungsinduzierten pluripotenten Stammzelle wird unter Bezugnahme auf 1 beschrieben, die schematische Ansichten der vertikalen Abschnitte darstellt. Bei der in 1a gezeigten undifferenzierten pluripotenten Stammzelle ist die Oberfläche der Zelle oder die Oberfläche der Zellpopulation flach. Andererseits ist die Oberfläche der pluripotenten Stammzelle, in der eine Differenzierung zum Beispiel durch Zugabe von Retinsäure induziert wurde, nicht flach, und, wie in 1b gezeigt, obwohl die Ebenheit der Oberfläche der Zelle in den einzelnen Zellen aufrechthalten wird, kann die Ebenheit zwischen den Zellen in einem Sichtfeld oder einer Kolonie zerstört werden. Zusätzlich kann es vorkommen, dass die Oberfläche in den einzelnen Zellen, wie in 1c gezeigt, nicht flach ist. Tatsächlich haben die Erfinder herausgefunden, dass die Herbeiführung der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen eine Änderung des in 1a gezeigten Zustands in einen in 1b gezeigten Zustand und gleichzeitig eine Änderung von dort in einen in 1c gezeigten Zustand bewirkt, und dann die Zellen in einen in 1d gezeigten Zustand bringt.

Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann der Differenzierungsgrad der Zelle in nicht-invasiver Weise und ohne ein Färben bestimmt werden. Die differenzierte Zelle wird auf einer Zelle-für-Zelle-, Kolonie-für-Kolonie- oder Schale-für-Schale-Basis entfernt, so dass eine einfache Kontrolle der zellulären Qualität der pluripotenten Stammzellen möglich ist.

In der Beschreibung ist die Art der pluripotenten Stammzelle auf keine bestimmte beschränkt, solange die Zelle die Beschaffenheit einer Stammzellen aufweist, das heißt, die Fähigkeiten aufweist, sich bei der Züchtung für immer zu teilen und in einen oder mehrere Zelltypen zu differenzieren. Eine solche Zelle kann eine natürlich vorkommende Stammzelle oder eine künstlich induzierte pluripotente Stammzelle sein. Zusätzlich kann die oben erwähnte pluripotente Stammzelle von einem Fötus stammen oder eine dem Gewebe entnommene adulte Stammzelle sein, wie beispielsweise eine Dünndarm-Epithel-Stammzelle, eine Vorläuferzelle irgendeiner Zellenart und eine iPS Zelle, die aus einer adulten Zelle induziert wird. Vom Standpunkt der Zellherkunft und Ethik wird als pluripotente Stammzelle vorzugsweise eine Zelle, die keine embryonale Stammzelle ist, noch bevorzugter eine künstlich induzierte pluripotente Stammzelle und am meisten bevorzugt eine IPS-Zelle verwendet.

Die Fähigkeit der pluripotenten Stammzelle zur Differenzierung ist auf keine besondere eingeschränkt, solange die Zelle die Fähigkeit aufweist, in einen oder mehrere Zellentypen zu differenzieren. Mit anderen Worten umfassen Beispiele für eine pluripotente Stammzelle totipotente embryonale Stammzellen, Stammzellen aus verschiedenen Organen und Zellentypen sowie Vorläuferzellen von verschiedenen Zellentypen.

Vorzugsweise wird die iPS-Zellen aus einer adulten Zelle eines Tieres, noch bevorzugter aus einer adulten Zelle eines Säugetiers, wie beispielsweise einer Maus, einer Ratte und eines Menschen, und noch weiter bevorzugt aus einer adulten Zelle eines Menschen hergestellt.

Zellentyp und Gewebe, aus dem die iPS Zelle induziert wird, sind auf keine bestimmten beschränkt, und Beispiele dafür umfassen ein Fibroblast, eine Hautepithelzelle und eine hämopoetische Vorläuferzelle.

Das Herstellungsverfahren der iPS Zelle ist auf kein bestimmtes begeschränkt. Eine iPS-Zelle kann durch Einbringen eines iPS-Zellen-Inducers, wie einem Gen-Cluster bestehend aus OCT3/4, SOX2, KLF-4 und C-MYC Genen und einem Gen-Cluster bestehend aus OCT3/4, SOX2 und KLF-4 Genen, erzeugt werden.

Die hierin verwendete Differenzierung bezieht sich auf ein Verfahren der schrittweisen Transformation, durch die eine Zelle biochemische und morphologische Eigenschaften erwirbt, die erforderlich sind, um eine bestimmte Funktion auszuführen. Der hierin verwendete Differenzierungsgrad bezeichnet ein Ausmaß des Fortschreitens der Differenzierung von einer totipotenten embryonalen Stammzellen zu einer adulten Zelle, die keine Fähigkeit mehr zur Differenzierung besitzt, das heißt, eine terminal differenzierte Zelle in einem Erwachsenen. Obwohl ein solcher Differenzierungsgrad für jede Zelle und jedes Gewebe variiert, kann ein Fachmann auf dem Gebiet die Kriterien gemäß dem Anwendungszweck oder dergleichen in geeigneter Weise bestimmen. Es sollte beachtet werden, dass sich die undifferenzierte Zelle auf eine Zelle mit einem geringeren Differenzierungsgrad, das heißt, auf eine Zelle mit höherer Fähigkeit zur Differenzierung, bezieht, und sich die differenzierte Zelle auf eine Zelle mit einem höheren Differenzierungsgrad, das heißt, auf eine Zelle mit geringer Fähigkeit zur Differenzierung, bezieht.

Die oben genannte pluripotente Stammzelle umfasst eine pluripotente Stammzelle, die in einer Kulturschale, auf einem Deckglas oder dergleichen, in vitro kultiviert wird, und vorzugsweise eine pluripotente Stammzelle, die in einer Kulturschale aus Glas kultiviert wird. Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass die Oberfläche der Kulturschale mit einer Antireflexionsbeschichtung beschichtet ist. Dadurch ist es möglich, bei der Beobachtung oder der Messung der Zellen mit einem Mikroskop oder dergleichen eine Beeinträchtigung durch optische Reflexion vom Glas zu verhindern.

Die Ebenheit kann als Ebenheit für eine einzelne Zelle bestimmt werden. In diesem Fall kann die Ebenheit durch das Aufnehmen von Schichtaufnahmen in Abständen von 1 μm in wenigstens der vertikalen Richtung in einer einzelnen Zelle bestimmt werden, um zur Datenverarbeitung Querschnittschichten zu erzeugen und die Oberflächenform zu extrahieren. Die physiologische Beschaffenheit der Zelle kann durch Bestimmung der Ebenheit für jede Zelle in einem Sichtfeld genauer bestimmt werden.

Die Ebenheit kann auch als Ebenheit für eine Zellpopulation, die eine Vielzahl von Zellen umfasst, für beispielsweise eine Sichtfeldeinheit oder für eine ROI-Einheit innerhalb eines Sichtfeldes bestimmt werden. In diesem Fall kann die Ebenheit durch das Aufnehmen von Schichtaufnahmen in Abständen von 1 μm in wenigstens der vertikalen Richtung in einer Zellpopulation bestimmt werden, um zur Datenverarbeitung Querschnittschichten zu erzeugen und die Oberflächenform zu extrahieren.

Ein Fachmann auf dem Gebiet kann in geeigneter Weise den Umfang der Zellenmenge, die die Zellpopulation bildet, gemäß der Herkunft der pluripotenten Stammzellen, den Wachstumsbedingungen, dem Anwendungszweck oder dergleichen bestimmen. Wenn die pluripotenten Stammzellen iPS Zellen umfassen, die menschlichen adulten Fibroblasten entstammen, dann ist eine solche Zellpopulation eine Zellpopulation, die vorzugsweise wenigstens 20 Zellen umfasst, und noch bevorzugter wenigstens 50 Zellen umfasst. Die Wahl einer solchen Zellpopulation ermöglicht eine Vermeidung eines Zellenbias in einem Extremzustand des Kultursystems.

Durch das Bestimmen der Ebenheit für eine Sichtfeldeinheit kann auf einfache Weise Information aus einer großen Anzahl von Zellen erhalten und der Differenzierungsgrad pluripotenter Stammzellen in dem gesamten Kultursystem leicht bestimmt werden. In diesem Fall wird zur Verbesserung der Zuverlässigkeit eine Entscheidung hinsichtlich der Ebenheit für eine einzelne Zellpopulation für vorzugsweise wenigstens 4 Sichtfelder, und noch bevorzugter wenigstens 7 Sichtfelder, getroffen.

Beispiele für das Stichprobenverfahren für die Sichtfelder in einer Zellpopulation, die aufgenommen werden sollen, umfassen ein Zufallsstichprobenverfahren, bei dem die Sichtfelder in der Nähe des Zentrums zufällig gesammelt werden, und ein sequenzielles Stichprobenverfahren, bei dem die Sichtfelder nacheinander in einer Richtung übertragen werden. Die Verwendung des Zufallsstichprobenverfahrens ermöglicht eine leichter Bestimmung des Differenzierungsgrades pluripotenter Stammzellen im gesamten Kultursystem. Die Verwendung des sequentiellen Stichprobenverfahrens ermöglicht eine genauere Ermittlung des Differenzierungsgrades pluripotenter Stammzellen, die die gesamte Zellpopulation bilden.

Durch das Bestimmen der Ebenheit für eine ROI-Einheit innerhalb eines Sichtfeldes können Informationen aus vielen Zellpopulationen leichter erhalten und der Differenzierungsgrad der Zellen genauer bestimmt werden. Auf diese Weise kann nur durch eine Stichprobenprüfung der Differenzierungsgrad pluripotenter Stammzellen in dem gesamten Kultursystem bestimmt wird. Darüber hinaus kann durch Unterteilung eines Sichtfeldes in eine Vielzahl von ROIs eine Analyse für jeweils jede ROI Einheit, die unabhängig von der Gerätespezifikation einstellbar ist, durchgeführt werden, wodurch die Einsatzflexibilität verbessert wird.

Wird die Ebenheit für eine ROI-Einheit Innerhalb eines Sichtfeld bestimmt, kann ein Fachmann auf dem Gebiet entsprechend die Größe der ROIs und die Anzahl der Unterteilungen in einem Sichtfeld gemäß der Herkunft der pluripotenten Stammzellen, den Kultivierungsbedingungen, dem Verwendungszweck oder dergleichen bestimmen. Unter dem Gesichtspunkt der Zuverlässigkeit und der physiologischen Bedeutung, beträgt die Größe des ROI vorzugsweise in etwa die Größe der Zelle. Wenn die pluripotenten Stammzellen iPS Zellen sind, die aus Fibroblasten gewonnenen werden, beträgt die Größe des ROI vorzugsweise in etwa 10 μm × 10 μm bis 30 μm × 30 μm, und noch bevorzugter 23 μm × 23 μm. Darüber hinaus ist es wünschenswert, dass die Größe eines einzelnen Sichtfeldes eine ausreichende Fläche aufweist, um 6 oder mehr ROIs aufzunehmen, und noch bevorzugter ist die Fläche 80 μm × 60 μm oder mehr.

Wird der Differenzierungsgrad pluripotenter Stammzellen auf der Grundlage der Ebenheit als Indikator bestimmt, zeigt sich, dass je flacher die Oberfläche der Zelle oder die Oberfläche der Zellpopulation ist, desto weniger differenziert ist die Zelle, und je weniger flach die Oberfläche der Zelle oder die Oberfläche der Zellpopulation ist, desto differenzierter ist die Zelle. Die Ebenheit kann durch Mikroskopie bestätigt werden, jedoch werden für eine objektive Beurteilung eine Berechnung und eine numerische Konvertierung bevorzugt. Das Verfahren zur Berechnung der Ebenheit ist auf kein bestimmtes beschränkt, solange das Verfahren die Ebenheit der undifferenzierten pluripotenten Stammzelle von der der differenzierten Zelle unterscheiden kann. Beispiele für ein solches Verfahren umfassen ein Berechnungsverfahren, das im Nachfolgenden beschrieben wird. Beachten Sie, dass, wenn nicht anders angegeben, die Beschreibung der Zelle eine Zellpopulation umfasst, die Beschreibung einer Oberfläche der Zelle eine Oberfläche einer Zellpopulation umfasst und die Beschreibung einer Bodenfläche der Zelle eine Bodenfläche einer Zellpopulation umfasst.

Die Ebenheit kann als eine Standardabweichung der Höhe der Zellenoberfläche berechnet werden. In diesem Fall ist, wenn der numerische Wert kleiner ist, die Zelle flacher und weniger differenziert, und wenn der numerische Wert größer ist, die Zelle weniger flach und differenzierter. Die Ebenheit kann mit dieser Methode leicht berechnet werden.

Die Ebenheit kann auch einen MSHD-Wert in einem vorgegebenen horizontalen Abstand sein. Wenn eine Oberflächenform Z (x, y) gegeben ist und zwei Punkte, A (x1, y1) und B (x2, y2), die einen Abstand Δr in der horizontalen Richtung auf Z voneinander beabstandet sind, ausgewählt sind, kann der MSHD-Wert durch Formel (I) dargestellt werden. MSHD(Δr) = <(z(x1, y1) – z(x2, y2))2>(I)wobei z(x1, y1) eine Höhe einer Oberfläche der Zelle bei A ist, z(x2, y2) eine Höhe einer Oberfläche der Zelle bei B ist und <> ein Ensemble-Mittelwert ist. Zusätzlich können (x1, y1) und (x2, y2) in einer beliebigen Kombination vorkommen, die die Formel (II) erfüllt. Δr = ((x1 – x2)2 + (y1 – y2)2))1/2(II)

Durch die Berechnung der Ebenheit als MSHD-Wert in einem vorgegebenen horizontalen Abstand, kann ein Wert der Ebenheit, der eine Position des Objekts im Raum reflektiert, erhalten und der Differenzierungsgrad pluripotenter Stammzellen genauer bestimmt werden. In diesem Fall ist, wenn der numerische Wert kleiner ist, die Zelle flacher und weniger differenziert, und wenn der numerische Wert größer ist, die Zelle weniger flach und differenzierter.

Die Darstellung als eine Funktion der MSHD in einem horizontalen Abstand wird im Allgemeinen als ein Variogramm bezeichnet. Das heißt, wenn eine Oberflächenform Z (x, y) gegeben ist und zwei Punkte, A (x1, y1) und B (x2, y2), die Δr in der horizontalen Richtung auf Z voneinander beabstandet sind, ausgewählt sind, obwohl Punkt A und Punkt B auf verschiedene Weise gewählt werden können, bildet der Ensemble-Mittelwert des Quadrats der Differenz zwischen den auf diese Weise gewählten Höhen das Variogramm. Ein Variogramm wird beispielsweise, wie in Glenn, N. et al, Geomorphology 73 (2006): 131–148 beschrieben, als Indikator verwendet, wobei die Ebenheit der Oberflächenform in der Oberflächenformanalyse der Topographie oder SEM-Aufnahme, der Fraktalanalyse oder dergleichen numerisch konvertiert wird.

Δr ist nicht besonders eingeschränkt, solange Δr zwischen Punkten liegt, die ausreichen, um eindeutig den Unterschied zwischen undifferenzierten pluripotenten Stammzellen und differenzierten Zellen zu bestimmen. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann in geeigneter Weise Δr gemäß der Herkunft der pluripotenten Stammzellen, dem Verwendungszweck oder ähnlichem bestimmen.

Die Ebenheit kann auch eine Steigung eines Variogramms in einem horizontalen Abstand zwischen den vorgegebenen zwei Punkte sein. In diesem Fall ist, wenn der numerische Wert kleiner ist, die Zelle flacher und weniger differenziert, und wenn der numerische Wert größer ist, die Zelle weniger flach und differenzierter. Der horizontale Abstand zwischen den vorgegebenen zwei Punkten ist nicht besonders eingeschränkt, solange der Abstand zwischen Punkten liegt, die ausreichen, um eindeutig den Unterschied zwischen undifferenzierten pluripotenten Stammzellen und differenzierten Zellen zu bestimmen. Die Beziehung zwischen der mittleren quadratischen Höhendifferenz und einer Steigung eines Variogramms kann durch die Formel (III) dargestellt werden. MSHD(Δr) ∝ ΔrS(III)wobei S ist eine Steigung einer Kurve ist, die ein Variogramm in einer doppellogarithmischen Weise darstellt. Es sollte beachtet werden, dass aufgrund der Art der log-log Kurve, selbst bei ständigem Multiplizieren der Abszisse Δr oder Ordinate MSHD durch die Standardisierung, die Kurve nur parallel verschoben wird und die Steigung S in Bezug auf die ständig multiplizierte Abszisse oder Ordinate konstant ist. Zusätzlich ist, wie in dem zuvor erwähnten Dokument von Glenn, N. et al. gezeigt, der mathematische Ansatz bekannt, ein Variogramm durch eine log-log-Kurvendarstellung darzustellen und die statistische Natur der Oberflächenform durch Steigung S auszuwerten.

Vorzugsweise wird die Ebenheit standardisiert, wie beispielsweise mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche. Dies ermöglicht es, den Einfluss durch die Höhendifferenz der Zellenoberfläche zwischen Zellen oder Zellpopulationen zu korrigieren, wodurch nicht nur der genauere Differenzierungsgrad dargestellt wird, sondern auch die Differenzierungsgrade aus einer Vielzahl von Zellen oder Zellpopulationen verglichen und bestimmt werden.

Ein Verfahren zur Bestimmung des Differenzierungsgrades wird im Nachfolgenden genauer beschrieben. Beispiele für ein solches Verfahren umfassen ein Verfahren, das eine Bestimmung durchführen kann, bei der undifferenzierte pluripotente Stammzellen als Positivkontrolle betrachtet werden, die mit den Zellen verglichen werden sollen und für die Bestimmung vorgesehen sind. In diesem Fall, wenn die für die Bestimmung vorgesehene Zelle so flach wie oder flacher als die Positivkontrolle der pluripotenten Stammzellen ist, kann bestimmt werden, dass die Zelle, die zur Bestimmung vorgesehen ist, undifferenziert ist.

Darüber hinaus gibt es ein Verfahren, bei dem die differenzierten Zellen als Negativkontrolle berücksichtigt werden, die mit den Zellen verglichen werden sollen und für die Bestimmung vorgesehen sind. In diesem Fall, wenn die für die Bestimmung vorgesehene Zelle so flach wie oder nicht flacher als die Negativkontrolle der Zellen ist, kann bestimmt werden, dass die Zelle, die zur Bestimmung vorgesehen ist, differenziert ist.

Darüber hinaus gibt es ein weiteres Bestimmungsverfahren, bei dem die Ebenheit der undifferenzierten pluripotenten Stammzellen als Positivkontrolle und die Ebenheit der differenzierten Zellen als Negativkontrolle im voraus individuell berechnet werden und ein Standardwert für die Bestimmung darauf basierend eingestellt werden kann. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann auf geeignete Weise so einen Standardwert für die Bestimmung gemäß der Herkunft der pluripotenten Stammzelle, den Wachstumsbedingungen, dem Verwendungszweck oder ähnlichem festlegen.

Es sollte beachtet werden, dass ein Fachmann auf dem Gebiet die Zellen passend für die Positiv- und Negativkontrolle gemäß dem Verwendungszweck der pluripotenten Stammzelle oder dergleichen bestimmen kann, beispielsweise kann ein Fachmann auf dem Gebiet die undifferenzierten pluripotenten Stammzellen als Positivkontrolle und die terminal differenzierten pluripotenten Stammzellen als Negativkontrolle berücksichtigen. Diese Zellen werden vorzugsweise demselben Zellentyp und noch bevorzugter derselben undifferenzierten pluripotenten Stammzelle entnommen. Darüber hinaus kann ein Fachmann auf diesem Gebiet so ein Bestimmungsverfahren, Standardwert für die Bestimmung, und dergleichen, gemäß dem Verwendungszweck oder dergleichen wählen.

Ein Verfahren zum Extrahieren der Oberflächenform einer Zelle ist nicht besonders eingeschränkt, aber um die Zellenform genau darzustellen, wird vorzugsweise ein Verfahren unter Verwendung einer dreidimensionalen Bildgebungsvorrichtung verwendet. Dadurch können jene Probleme behoben werden, die bei der Verwendung eines herkömmlichen Phasenkontrastmikroskops, bei dem intrazelluläre Materialien übertragenes Licht brechen, entstehen, und es kann die Zellenoberfläche genau gemessen werden.

Darüber hinaus ist es noch wünschenswerter, dass die dreidimensionale Bildgebungsvorrichtung nicht-invasive dreidimensionale Bildgebungsvorrichtungen umfasst, wobei diese noch bevorzugter ein quantitatives Phasenmikroskop, ein Niederkohärenz-Interferenzmikroskop, ein Tomographie-Phasenmikroskop und ein Rastersondenmikroskop, besonders bevorzugt eine quantitatives Reflexionsphasenmikroskop, und am meisten bevorzugt ein quantitatives Niederkohärenz-Reflexionsphasenmikroskop umfassen. Durch Verwendung dieser Vorrichtungen kann das Risiko einer Kontamination und Beeinträchtigung der pluripotenten Stammzellen minimiert werden, und werden somit vom Gesichtspunkt der medizinischen Anwendung als besser geeignet erachtet.

Beispiele für das quantitative Phasenmikroskop umfassen jene, die im japanischen Patent Nr. 4.090.244 und in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 2.010-48.619 offenbart sind. Durch die Verwendung des quantitativen Phasenmikroskops können eine optische Feldstärke und Phase mit Hilfe der Phasenverschiebungsinterferometrie quantitativ gemessen werden. Darüber hinaus ist es aus der Sicht der richtigen Messung einer Zellenoberfläche vorzuziehen, dass ein quantitatives Reflexionsphasenmikroskop verwendet wird. Durch die Verwendung des quantitativen Reflexionsphasenmikroskops kann ein dreidimensionales Bild der Zellenform mit einem Auflösungsvermögen gleich oder kleiner als 1 Mikrometer erhalten werden.

Unter Verwendung des Niederkohärenz-Interferenzmikroskops ist es möglich, eine bestimmte Schnittebene in einer Zelle zu untersuchen, wobei das Einstellen einer Längsposition einer Kohärenzschranke (engl. coherence gate) an einer Zellmembran nur Licht, das durch die Zellmembran reflektiert wird, unabhängig von der intrazellulären Struktur, an der Interferenz teilnehmen lässt.

Durch Verwendung des Tomographiephasenmikroskops kann ein dreidimensionales Bild einer Zellenform rekonstruiert werden.

Durch Verwendung des Rastersondenmikroskops kann eine Entfernung zwischen einer untere Fläche einer Zelle und einer Oberfläche einer Zelle direkt gemessen werden.

Durch die Verwendung des quantitativen Niederkohärenz-Reflexionsphasenmikroskops kann die Oberflächenform einer Zelle mit einem hohen Grad an Genauigkeit extrahiert werden. Beispiele des quantitativen Niederkohärenz-Reflexionsphasenmikroskops umfassen jene, die in Yamauchi T. et al., Proc. of SPIE Vol. 8225: 82250G-1 und Yamauchi T. et al., Proc. of SPIE Vol. 8225: 82250A-1 offenbart sind.

Beispiele

Im Folgenden wird die vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf einige Beispiele genauer beschrieben, wobei die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt werden soll.

[Beispiel 1]

Auf einer antireflexbeschichteten Glasbodenschale mit 35 mm Durchmesser wurde eine 253G1 iPS-Zelllinie, die einem menschlichen adulten Fibroblasten entnommen wurde, mit 10 bis 20 Kolonien/Schale angesiedelt und auf Fütter-Zellen mit einem Primaten-ES-Medium (hergestellt von ReproCELL Incorporated, Handelsname: RCHEMD001) kultiviert, das einen 4 ng/ml menschlichen basischen FGF in der Endkonzentration enthielt. Die Größe einer Kolonie betrug rund 200 μm. Als Fütter-Zellen wurden Mauslungen-Fibroblasten verwendet. Die Zellen wurden bis zum dritten Tag nach der Ansiedelung kultiviert. Das Medium wurde ein Mal am Tag ersetzt.

Eine Probe der iPS-Zellen zur Differenzierung, deren Medium mit einem Primaten-ES-Medium umfassend 4 ng/ml menschlichen basischen FGF und 12,5 μM Retinsäure in der Endkonzentration am zweiten Tag nach der Ansiedelung ersetzt wurde, wurde für 4 Tage kultiviert. Retinsäure wurde im Allgemeinen als Reagenz für die Herbeiführung einer Differenzierung verwendet. Darüber hinaus wurden für eine Kontrolle der differenzierten Zellen MCF7-Zellen verwendet, die menschliche Brustkrebs-Epithelzellen umfassten. Die MCF7-Zellen wurden mit 20% Zelldichte angesiedelt und für 3 Tage bis zur Konfluenz unter Verwendung eines 10% FBS enthaltenden DMEM-Mediums kultiviert. In jedem Kultursystem, außer im MCF7 Zellkultivierungssystem, wurde das Medium ein Mal am Tag ersetzt.

Die Form der Zellen wurde unter Verwendung eines quantitativen Reflexionsphasenmikroskops beobachtet. Schematische Darstellungen der vertikalen Abschnitte der Zellen sind in 1 gezeigt. Die Zellenoberflächen der durch Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS-Zellen waren nicht flach, und wiesen die in 1b bis 1d gezeigte Oberflächenform auf. Im Gegensatz dazu waren die Zellenoberflächen der undifferenzierten iPS-Zellen relativ flach, und wiesen die in 1a gezeigte Oberflächenform auf.

In den folgenden Beispielen sind als Angabe der Ebenheit, vier Indizes, umfassend einen Wert einer Standardabweichung der Höhe der Zellenoberfläche, der mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert ist, einen Wert der MSHD, der mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert ist, ein Variogramm, das mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert ist, und eine Steigung des Variogramms, gezeigt. Anhand dieser vier Indizes wird, wie oben erwähnt, gezeigt, dass bei kleiner werdendem Wert, die Zelle und die Zellpopulation flacher sind, und bei größer werdendem Wert, die Zelle und die Zellpopulation nicht flacher sind.

Die Bodenflächen- und die Oberflächenform der Zelle wurden wie folgt extrahiert. Durch die Verwendung eines quantitativen Reflexionsphasenmikroskops wurden alle 0,125 μm in der Horizontalrichtung und alle 0,32 μm in der Vertikalrichtung dreidimensionale Daten für die Zellen in einem 60 μm × 80 μm Sichtfeld erhalten, und von den erhaltenen Daten wurden Schichtaufnahmen erstellt. Aus den erstellten Schichtaufnahmen wurden, wie in 2 bis 3 gezeigt, die Bodenflächen- und die Oberflächenform extrahiert und numerisch konvertiert. Durch Ausführen dieses Vorgangs im gesamten Sichtfeld wurden die Bodenflächen- und Oberflächenformen in dem gesamten Sichtfeld erhalten. Von den erhaltenen Bodenflächen- und Oberflächenformen wurde die Höhe der Oberfläche der Zellen gemessen. Die Ebenheit wurde als Standardabweichung der Höhe der Oberfläche der Zellen berechnet, die mit einem Mittelwert der Höhe der Oberfläche der Zellen standardisiert wurde, und es wurde eine statistische Verarbeitung durchgeführt. Die berechnete Ebenheit jeder Probe ist in Tabelle 1 dargestellt Die Ebenheit der durch Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS-Zellen war höher als die Ebenheit der undifferenzierten iPS-Zellen und niedriger als die Ebenheit der MCF7-Zellen. [Table 1]

Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche (μm)Standardabweichung der Höhe der ZellenoberflächeEbenheit (%)Undifferenzierte iPS Zellen12,30,725,85Retinsäure versetzte iPS Zellen6,251,1818,9MCF75,801,6628,6

[Beispiel 2]

Bezüglich der 3 Kolonien der undifferenzierten iPS Zellen und der 3 Kolonien der durch Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS Zellen wurden 7 bis 15 Sichtfelder in der Nähe des Zentrums jeder Kolonie analysiert. Jedes Sichtfeld wurde in sechs ROIs unterteilt und es wurden die Bodenflächen- und Oberflächenformen der Zellen für jede ROI-Einheit extrahiert, um die Höhe der Oberfläche der Zellen unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 zu messen. Die Größe des ROI war 23 μm × 23 μm. Die Flachheit wurde als Standardabweichung der Höhe der Oberfläche der Zellen berechnet, die mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert wurde, und es wurde eine statistische Verarbeitung zur Durchführung einer studentischen t-Verteilung durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 und 4 gezeigt. Die Ebenheit der durch Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS-Zellen war höher als die Ebenheit der undifferenzierten iPS-Zellen, wobei der Unterschied i signifikant war. [Tabelle 2]

Undifferenzierte iPS ZellenRetinsäure versetzt iPS ZellenCont-1Cont-2Cont-3RA-1RA-2RA-3Ebenheit0,0430,0450,0380,1300,1070,123Standardabweichung0,0160,0140,0110,0620,0340,047

[Beispiel 3]

Unter denselben Bedingung wie in Beispiel 2 wurden alle 0,125 μm in der Horizontalrichtung und alle 0,32 μm in der Vertikalrichtung dreidimensionale Daten für die undifferenzierte iPS-Zellen und die durch Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS-Zellen erhalten, und aus den erhaltenen Daten wurden Schichtaufnahmen erstellt. Aus den erstellten Schichtaufnahmen wurden die Bodenflächen- und Oberflächenformen der Zellen extrahiert und eine Variogramm-Analyse durchgeführt. Insbesondere wurde ein MSHD-Wert für Δr innerhalb eines Bereichs von 0,25 μm bis 15 μm unter Verwendung von Formel (I), wie oben beschrieben, berechnet und mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert. Wie in 5 gezeigt, war die Ebenheit der durch Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS-Zellen höher als die Ebenheit der undifferenzierten iPS-Zellen.

Als nächstes wurde ein MSHD-Wert für Δr gleich 15 μm berechnet und mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert, um die Ebenheit zu berechnen. Das Ergebnis wurde als logarithmische Kurve (6) dargestellt. In einer statistischen Analyse wurde der gemeinsame Logarithmus des Ergebnisses berechnet, um eine studentische t-Verteilung (Tabelle 3) durchzuführen. Die Ebenheit der durch Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS-Zellen war deutlich höher als die Ebenheit der undifferenzierten iPS-Zellen. Darüber hinaus wurde unter Berücksichtigung aller Kolonien 1 bis 3 in jeder Gruppe (d. h., alle Cont-1 bis Cont-3 oder alle RA-1 bis RA-3) als eine Population, bei der Darstellung einer Beziehung zwischen der Ebenheit für Δr gleich 15 μm und des Verhältnisses der Zellen als Histogramm, eine scheinbare Verschiebung entdeckt (7). [Tabelle 3]

Undifferenzierte iPS ZellenRetinsäure versetzte iPS ZellenCont-1Cont-2Cont-3RA-1RA-2RA-3Ebenheit–2,399–2,336–2,519–1,392–1,517–1,425Standardabweichung0,2940,2180,2210,3790,2920,298

[Beispiel 4]

Unter denselben Bedingung wie in Beispiel 3 wurde eine Variogramm-Analyse unter Verwendung eines MSHD-Wertes, der mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert wurde, durchgeführt, und es wurde eine Steigung des Variogramms für Δr innerhalb eines Bereichs von 5 μm bis 15 μm unter Verwendung der Formel (III), wie oben beschrieben, als Ebenheit berechnet. Dann wurde eine statistische Analyse zur Durchführung einer studentischen t-Verteilung durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 4 und 8 gezeigt. Die Ebenheit der durch Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS-Zellen war deutlich höher als die Ebenheit der undifferenzierten iPS-Zellen. [Tabelle 4]

Undifferenzierte iPS ZellenRetinsäure versetzte iPS ZellenCont-1Cont-2Cont-3RA-1RA-2RA-3Ebenheit0,4460,4100,3510,8480,7440,880Standardabweichung0,2740,2170,2010,3430,3030,264

[Beispiel 5]

Mit der Ausnahme, dass die Probe der iPS-Zellen zur Differenzierung in dem Medium kultiviert wurde, das mit 10% FBS enthaltendem DMEM-Medium am vierten Tag nach der Ansiedelung ersetzt wurde, jedoch danach nicht bis zum siebten Tag nach der Ansiedelung ersetzt wurde, wurden die Proben der Zellen in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, und die Messung wurde am siebten Tag nach der Ansiedelung durchgeführt.

Auf die gleiche Weise wie in den Beispielen 2 bis 4, wurde für jede ROI-Einheit innerhalb eines mikroskopischen Sichtfeldes die Ebenheit als Standardabweichung der Höhe der Zellenoberfläche, der mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert wurde, als ein MSHD-Wert für Δr gleich 15 μm, der mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert wurde, und als eine Steigung eines Variogramms für Δr innerhalb eines Bereichs von 5 μm bis 15 μm berechnet. Dann wurde eine statistische Analyse zur Durchführung einer studentischen t-Verteilung durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 und 9 gezeigt. Es sollte beachtet werden, dass das Variogramm den MSHD-Wert für Δr innerhalb eines Bereiches von 5 μm bis 15 μm darstellt, der mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert wurde. [Tabelle 5]

Undifferenzierte iPSkultivierte iPS in DMEMCont-1DMEM-1Standardabweichung der Höhe der ZellenoberflächeEbenheit0,0430,052Standardabweichung0,0150,021MSHD (dargestellt durch Zehner-Logarithmus)Ebenheit–2,399–2,182Standardabweichung0,2940,304Steigung des VariogrammsEbenheit0,4460,720Standardabweichung0,2740,264

[Beispiel 6]

Mit den Bildern, die unter Verwendung von jeder Probe in Beispiel 2 einer einzigen Kolonie (15 Sichtfelder) für die undifferenzierte iPS-Zellen und von 2 Kolonien (jeweils 11 und 13 Sichtfelder) für die durch Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS-Zellen aufgenommen wurden, wurde unter denselben Bedingung wie in Beispiel 2 mit Hilfe eines quantitativen Reflexionsphasenmikroskops die Höhe der Oberflächen der Zellen für jede Sichtfeld-Einheit gemessen. Ein MSHD-Wert für Δr gleich 5 μm wurde berechnet und mit einem Mittelwert der Höhe der Zellenoberfläche standardisiert, dann wurde der Zehnerlogarithmus genommen und die Ebenheit berechnet. statistische Analyse zur Durchführung einer studentischen t-Verteilung durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 6 und 10 gezeigt. Die Ebenheit der durch Zusetzen von Retinsäure kultivierten iPS-Zellen war deutlich höher als die Ebenheit der undifferenzierten iPS-Zellen. [Tabelle 6]

Undifferenzierte iPSRetinsäure versetzte iPSCont-1RA-1RA-2Ebenheit–2,567–1,657–1,796Standardabweichung0,1290,2090,151

Die folgenden Merkmalskombination sind ebenfalls möglich

  • 1. Verfahren zur Bestimmung des Differenzierungsgrades pluripotenter Stammzellen, umfassend:
    einen Schritt zur Bestimmung einer Ebenheit von kultivierten pluripotenten Stammzellen,
    wobei die Ebenheit eine Oberflächenebenheit einer Zelle oder eine Oberflächenebenheit einer Zellpopulation umfasst, und
    wobei die Ebenheit ein Maß für den Differenzierungsgrad ist.
  • 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei die Ebenheit eine Ebenheit in einer mikroskopischen Sichtfeldeinheit umfasst.
  • 3. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei die Ebenheit eine Ebenheit in einem Bereich von Interesse innerhalb eines mikroskopischen Sichtfeldes umfasst.
  • 4. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei die Ebenheit eine Ebenheit einer einzelnen Zelle umfasst.
  • 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Ebenheit eine Standardabweichung der Höhe der Oberfläche einer einzelnen Zelle oder der Oberfläche der Zellpopulation ist,
    wobei die Höhe der Oberfläche einer einzelnen Zelle ein Abstand von einer Bodenfläche der Zelle, die an einer Kulturschale anhaftet, bis zu einer Oberfläche der Zelle, die nicht an der Kulturschale anhaftet, ist, und
    wobei die Höhe der Oberfläche der Zellpopulation ein Abstand von einer Bodenfläche der Zellpopulation, die an einer Kulturschale anhaftet, bis zu einer Oberfläche der Zellpopulation, die nicht an der Kulturschale anhaftet, ist.
  • 6. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Ebenheit ein Wert einer mittleren quadratischen Höhendifferenz eines vorgegebenen horizontalen Abstands ist.
  • 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Ebenheit eine Steigung eines Variogramms in einem horizontalen Abstand zwischen zwei vorbestimmten Punkten ist.
  • 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 5 bis 7, wobei die Ebenheit mit einem Höhenmittelwert der Oberfläche einer Zelle oder der Oberfläche der Zellpopulation standardisiert wird.
  • 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 8, wobei die Ebenheit unter Verwendung eines quantitativen Reflexionsphasenmikroskops bestimmt wird.