Title:
Multiplexpyrosequenzierung unter Verwendung nichtinterferierender, rauschbeendender Polynukleotididentifikationstags
Kind Code:
T5
Abstract:

Die vorliegende Offenbarung bezieht sich allgemein auf ein Multiplexverfahren zum Analysieren von Proben, umfassend die Polynukleotidamplifikation zur Produktion von amplifizierten Produkten, wobei eine oder mehrere Zielsequenzen mit einem nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstag getaggt sind, das Pyrosequenzieren der amplifizierten Produkte über die Sequenz des nichtauslöschenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags zur Detektion der Anwesenheit eines oder mehrerer spezifischer Polynukleotididentifikationstags. Die Anwesenheit eines spezifischen Polynukleotididentifikationstags ist mit der Anwesenheit einer spezifischen Zielsequenz korreliert.



Inventors:
Han, Jian, Ala. (Huntsville, US)
Wang, Chunlin, Calif. (Menlo Park, US)
Application Number:
DE112013004650T
Publication Date:
06/18/2015
Filing Date:
09/24/2013
Assignee:
CB Biotechnologies, Inc. (Ala., Huntsville, US)
International Classes:
Attorney, Agent or Firm:
Dehns Germany, 80331, München, DE
Claims:
1. Multiplexamplifikationsverfahren zum Analysieren von Proben, die gemischte Polynukleotidpopulationen enthalten können, wobei das Verfahren die Verwendung einer Polynukleotidamplifikation zur Erzeugung amplifizierter Produkte, wobei eine oder mehrere Zielsequenzen mit einem nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstag getaggt werden bzw. sind, und die Pyrosequenzierung der amplifizierten Produkte über die Sequenz des nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags zur Detektion der Anwesenheit eines oder mehrerer spezifischer Polynukleotididentifikationstags umfasst, wobei die Anwesenheit eines oder mehrerer spezifischer Polynukleotididentifikationstags mit der Anwesenheit einer spezifischen Zielsequenz korreliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polynukleotidpopulation DNA enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polynukleotidpopulation RNA enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polynukleotidpopulation eine gemischte Population aus DNA und RNA ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polynukleotidamplifikation PCR umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polynukleotidamplifikation RT-PCR umfasst.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das nichtinterferierende, nichtbeendende, zielspezifische Polynukleotididentifikationstag aus einer Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60 besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus viralen, bakteriellen and pilzlichen Nukleinsäuren besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer menschlichen klinischen Probe erhalten werden.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer klinischen Probe eines Tiers erhalten werden.

11. Verfahren, das die Schritte umfasst
a. Anfügen eines zieleindeutigen, nichtinterferierenden, nichtbeendenden Polynukleotididentifkationstags an einen zielspezifischen Primer,
b. Hybridisieren des zielspezifischen Primers/des Identifikationstags mit einer Zielpolynukleotidsequenz,
c. Durchführen einer Polynukleotidamplifikation zur Amplifikation der Zielpolynukleotidsequenz und zum Hinzufügen des zieleindeutigen Polynukleotididentifikationstags zu der Zielpolynukleotidsequenz, und
d. Pyrosequenzieren des zieleindeutigen, nichtinterferierenden, nichtbeendenden Polynukleotididentifikationstags, wobei das Identifizieren des zieleindeutigen, nichtinterferierenden, nichtbeendenden Polynukleotididentifikationstags die Anwesenheit des Zielpolynukleotids anzeigt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polynukleotidpopulation DNA enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polynukleotidpopulation RNA enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polynukleotidpopulation eine gemischte Population aus DNA und RNA ist.

15. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polynukleotidamplifikation PCR umfasst.

16. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polynukleotidamplifikation RT-PCR umfasst.

17. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das nichtinterferierende, nichtauslöschende, zielspezifische zielspezifischen Polynukleotididentifikationstag aus einer Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60 besteht

18. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer Gruppe ausgewählt sind, die aus viralen, bakteriellen and pilzlichen Nukleinsäuren besteht.

19. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer menschlichen klinischen Probe erhalten werden.

20. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer klinischen Probe eines Tiers erhalten werden.

21. Polynukleotidsequenz, die ein nichtinterferierendes, nichtauslöschendes, zielspezifisches Polynukleotididentifikationstag umfasst, das aus einer Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60 besteht.

Description:
Querverweis auf verwandte Anmeldung

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 61/705.089, mit dem Titel ”Multiplex Pyrosequencing Using Non-Interfering Noise-Cancelling Polynucleotide Identification Tags”, und eingereicht am 24. September 2012, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.

Sequenzprotokoll

Die vorliegende Anmeldung enthält ein Sequenzprotokoll, das im ASCII-Format über EFS-Web eingereicht wurde und hiermit durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen wird. Besagte ASCII-Kopie, am 23. September 2013 erstellt, ist mit 15892-0002_SL.txt bezeichnet und weist eine Größe von 15.781 Bytes auf.

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf Methodiken zur Analyse und Sequenzierung von Nukleinsäureproben. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Verfahren zur Sequenzierung amplifizierter Nukleinsäureproben über die Verwendung von spezifischen Polynukleotididentifikationstags bzw. Polynukleotididentifikationsmarkierungen.

Hintergrund der Erfindung

Die Entwicklung von Nukleinsäureamplifikationsmethodiken, beispielsweise der Polymerasekettenreaktion (PCR), ermöglicht den Einsatz der DNA-Amplifikation für eine Vielzahl von Anwendungen, darunter die molekulardiagnostische Testung. Mit der Verwendung der PCR für molekulare, differenzialdiagnostische(MDD-)Assays sind jedoch Herausforderungen verbunden. Die PCR nutzt spezifische Primer oder Primersätze, Temperaturbedingungen und Enzyme. Beispielsweise werden PCR-Reaktionen leicht kontaminiert, die Primerbindung kann unterschiedliche Bedingungen für unterschiedliche Primer und Primersätze erfordern, und Primer sollten spezifisch für eine Zielsequenz bzw. Targetsequenz sein, um nur diese Zielsequenz zu amplifizieren. Diese Beschränkungen machen es noch schwieriger, mehrere Sequenzen aus einer einzigen Probe zu amplifizieren.

Die diagnostische Testung klinischer Proben, um einen oder mehrere kausale Krankheitserreger zu finden, hat in der Vergangenheit erfordert, dass Mikroorganismen isoliert und kultiviert werden. Dies kann aber Tage dauern, und in vielen Fällen muss auf eine Diagnose in wenigen Stunden reagiert werden, wenn das Leben des Patienten gerettet werden soll. Die Analyse einer einzigen klinischen Probe, um mehrere Organismen zu identifizieren, um zu bestimmen, welcher der kausale oder welche die kausalen Krankheitserreger sind, ist das gewünschte Verfahren für die MDD, und Verfahren sind entwickelt worden, um dieses Ziel besser zu erreichen. Beispielsweise sind Multiplex-PCR-Verfahren entwickelt worden, um mehrere Nukleinsäuren in einer Probe zu amplifizieren, so dass genügend DNA/RNA hergestellt wird, um den Nachweis und die Identifizierung von mehreren Organismen zu ermöglichen. Die Multiplex-PCR hat jedoch Nachteile. Zum Beispiel erfordert jedes Ziel bzw. Target in einer Multiplex-PCR-Reaktion seine eigenen, optimalen Reaktionsbedingungen, so dass eine Erhöhung der Anzahl der Ziele erfordert, dass die Reaktionsbedingungen für jedes einzelne Ziel suboptimal sind. Ferner bilden mehrere Sätze von hochkonzentrierten Primern in einem System häufig Primerdimere oder führen zur unspezifischen Amplifikation des Hintergrunds. Dieser Mangel an Spezifität erfordert auch zusätzliche Schritte der Aufreinigung nach der PCR und mehrere Wäschen nach der Hybridisierung.

In großer Menge vorliegende Primer reduzieren die Amplifikationseffizienz, indem sie die verfügbaren Enzyme erfordern bzw. aufbrauchen und Substrate verbrauchen. Unterschiede in der Amplifikationseffizienz können zu erheblichen Abweichungen in den Amplifikatausbeuten bzw. Amplikonausbeuten führen. Zum Beispiel können einige Loci sehr effizient amplifizieren, während andere sehr ineffizient amplifizieren oder in ihrer Amplifizierung vollständig versagen. Dieses Potential für eine unausgeglichene Amplifikation macht es auch schwierig bis unmöglich, eine präzise, quantitative Endpunktanalyse durchzuführen.

Oft ist der Zeitfaktor essentiell, Patienteninfektionen umfassen mehr als eine Bakterienart, und die Menge der Ziel-DNA in einer klinischen Probe ist begrenzt. Technologien wie die Multiplex-PCR wurden entwickelt, um diese Probleme anzugehen. Jedoch sind Verbesserungen in diesem Bereich immer noch erforderlich, um die Zeit und den Aufwand zu reduzieren, eine schnelle und genaue Analyse von klinischen Proben zu erreichen. Automatisierbare Verfahren, insbesondere durch die Verwendung eines geschlossenen Kassette für die Probenvorbereitung und Analyse, sind besonders wichtig, da sie die zusätzlichen Vorteile einer Verringerung einer möglichen Kontamination von Proben und die Zeit und den Aufwand, die bzw. den ein Labortechniker bei der Herstellung und Analyse jeder Probe investieren muss, verringern.

Wenngleich es signifikante Verbesserungen in Multiplexsequenzierungstechnologien und deren Verwendung bei der Probenanalyse gibt, wäre es sehr vorteilhaft, wenn diese weiter verfeinert werden könnten, um die Analyse und Detektion einfacher zu machen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Multiplexverfahren für die Analyse von Proben, die gemischte DNA- oder RNA-Populationen umfassen können, wobei das Verfahren die Verwendung einer Polynukleotidamplifikation zur Herstellung amplifizierter Produkte umfasst, wobei eine oder mehrere Zielsequenzen mit nichtinterferierenden, nichtabbrechenden bzw. nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags getaggt sind, und eine Pyrosequenzierung der amplifizierten Produkte über die Sequenz des nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags zur Bestimmung der Anwesenheit eines oder mehrerer spezifischer Polynukleotididentifikationstags, wobei die Anwesenheit eines spezifischen Polynukleotididentifikationstags mit der Anwesenheit einer spezifischen Zielsequenz korreliert. In einer Ausführungsform kann das Polynukleotid DNA, RNA oder eine gemischte DNA/RNA-Population umfassen. In einer zusätzlichen Ausführungsform umfasst die Multiplexreaktion eine PCR-Reaktion.

Aspekte der Erfindung beziehen sich auch ein Multiplexverfahren zur Analyse einer Probe, die eine oder mehrere unidentifizierte Polynukleotide enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, an einen zielspezifischen Primer ein zieleindeutiges, nichtinterferierendes, nichtbeendendes Identifikationstag anzuhängen, den zielspezifischen Primer mit einer Zielpolynukleotidsequenz zu hybridisieren, eine Polynukleotidamplifizierung durchzuführen, um die Zielpolynukleotidsequenz zu amplifizieren und das zieleindeutige, nichtinterferierende, nichtbeendende Polynukleotididentifikationstag zu der Zielpolynukleotidsequenz hinzuzufügen, und das zieleindeutige, nichtinterferierende, nichtbeendende, zielspezifische Polynukleotididentifikationstag zu pyrosequenzieren, wobei die Identifizierung eines zieleindeutigen, nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags die Anwesenheit des Zielpolynukleotids anzeigt. In einer Ausführungsform kann das Polynukleotid DNA, RNA oder eine gemischte DNA/RNA-Population umfassen. In einer weiteren umfasst die Multiplexreaktion eine PCR-Reaktion.

Aspekte der Erfindung beziehen sich auch auf ein Verfahren zur Multiplex-PCR-Pyrosequenzierung, wobei das zieleindeutige, nichtinterferierende, nichtbeendende Polynukleotididentifikationstag aus einer Gruppe von Sequenzen, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60, ausgewählt ist.

Ein Aspekt der Erfindung nutzt verschachtelte bzw. nested, zielspezifische Primer. Zielnukleinsäuren können DNA und/oder RNA umfassen und können DNA und/oder RNA viralen, bakteriellen und/oder pilzlichen Ursprungs umfassen, sowie genomische DNA und/oder RNA menschlichen oder anderen tierischen Ursprungs. Eine Amplifikation kann durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder RT-PCR durchgeführt werden. Die Quelle der Zielnukleinsäuren kann eine oder mehrere klinische, Umwelt- oder Nahrungsmittelproben sein und das Verfahren kann in einer Vielzahl von Weisen, einschließlich beispielsweise der klinischen Diagnose, der Umweltbeprobung, der Pflanzentestung, der Lebensmittelsicherheitsanalyse, dem Nachweis von genetischen Erkrankungen und/oder dem Nachweis von Krankheitszuständen verwendet werden. Das Verfahren kann für die menschliche und/oder tiermedizinische Diagnose verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 ist eine Veranschaulichung eines Beispiels des Verfahrens zum Anbringen eines zielspezifischen oder zieleindeutigen Polynukleotididentifikationstags mittels PCR. In 1 bezeichnet ”Indextag” das zielspezifische (zieleindeutige) Polynukleotididentifikationstag. Fo, Fi, Fc, Ro, Ri und Rc zeigen Primersequenzen und Primerpositionen an.

Ausführliche Beschreibung

Die Pyrosequenzierung ist eine Nukleinsäuresequenzierungstechnik, die auf dem Nachweis freigesetzten Pyrophosphats während der Nukleinsäuresynthese beruht. Sichtbares Licht wird bei dieser enzymatischen Reaktion erzeugt und ist proportional zu der Anzahl der eingebauten Nukleotide. Anorganisches Pyrophosphat wird infolge des Nukleotideinbaus durch das Enzym Polymerase freigesetzt. In einigen Ausführungsformen wird Luciferase verwendet, um Licht zu erzeugen, das einfach durch eine Photodiode, ein Photovervielfacherrohr oder eine Kamera mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) erfasst werden kann. Die Sequenz der Templatenukleinsäure bzw. Musternukleinsäure kann bestimmt werden, da das zugegebene Nukleotid bekannt ist. Die Pyrosequenzierung ist sowohl mit DNA als auch mit RNA möglich. Im Wesentlichen ermöglicht das Verfahren die Sequenzierung eines einzigen Nukleinsäurestrangs durch Synthetisieren seines komplementären Strangs, Basenpaar für Basenpaar, und das Erfassen, welche Base bei jedem Schritt hinzugefügt wurde, indem das während des Nukleotideinbaus emittierte Licht gemessen wird. Die Pyrosequenzierung stellt ein schnelles, genaues Verfahren zur Nukleinsäureapplikation aus bakteriellen, viralen, pilzlichen und anderen ähnlichen Quellen dar, um bei Identifizierungen aus klinischen Proben zu helfen. Allerdings ist die Pyrosequenzierung ein paralleles Sequenzierverfahren – das i. d. R. mehrere parallele Sequenzierungsläufe erfordert, um eine Mischprobe zu analysieren. Die Durchführung dieses Sequenzierungsverfahrens in einem einzigen Aufnahmebehälter, wie beim Multiplex-PCR-Sequenzierverfahren, könnte die Kosten und den Zeitaufwand zur Erzeugung der benötigten Ergebnisse wesentlich verkürzen. Die Erfinder haben ein Verfahren entwickelt, mit dem es möglich sein wird, die Pyrosequenzierung in einer echten Multiplexart durchzuführen – Sequenzierung und Detektion mehrerer Proben in einer einzigen Multiplexreaktion anstelle mehrerer Parallelreaktionen.

Die Erfinder haben erkannt, dass der Vorteil der Pyrosequenzierung – die Tatsache, dass die Detektion der Sequenzierungsergebnisse auf der Erfassung von Licht beruht, welches emittiert wird, wenn freigesetztes Pyrophosphat erzeugt wird, wenn bei der DNA-Synthese Nukleotide hinzugefügt werden – im Allgemeinen die Verwendung der Multiplex-PCR und der Multiplexsequenzierung ausschließt, weil der Nachweis von mehreren unterschiedlichen Sequenzen relativ unmöglich wird. Allerdings haben sie eine Methode entwickelt, die dieses Hindernis überwindet. Dabei haben sie ein Verfahren zur Multiplexpolynukleotidamplifikation und Multiplexpolynukleotidpyrosequenzierung bereitgestellt, das innerhalb des Raums einer einzelnen Kassette durchgeführt werden kann, wie in jener, die in dem Verfahren eingesetzt wird, das in der WO 2010/132834 A1 (Apparatus for Performing Amplicon Rescue Multiplex PCR), die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird, beschrieben wird.

Es versteht sich, dass der Begriff ”umfassen”, wie er hier verwendet wird, durch die Begriffe ”im Wesentlichen bestehend aus” und ”bestehend aus” ersetzt werden kann.

Wenn der Begriff ”Reaktionssystem” verwendet wird, soll er ein Eppendorfröhrchen, eine Reaktionskammer oder eine andere Aufnahmevorrichtung beschreiben, in welche die erforderlichen Primer, Enzyme, Nukleotide, Puffer und/oder anderen Reagenzien gegeben werden, um einen oder mehrere Zyklen mindestens einer Polymerasekettenreaktion durchzuführen. Ein anderes ”Reaktionssystem” kann sich daher auf den gleichen Reaktionsaufnahmebehälter, aber eine andere Komponente von Reagenzien – insbesondere Primern – zur Durchführung des gewünschten Amplifikationsschritts beziehen. Ein ”Reaktionsaufnahmebehälter” soll ein Röhrchen, eine Vertiefung einer Platte oder ein anderes Gefäß mit einem ausreichenden Innenvolumen bedeuten, um Primer, Enzyme, Nukleotide, Puffer und/oder andere zur Bereitstellung eines Reaktionssystems erforderliche Reagenzien enthalten zu können. Der Begriff ”Rettung” bzw. ”Rescue” soll die Trennung der Amplifikaten von zumindest einem Teil der Primer der ersten Amplifikation bedeuten. ”PCR” soll die Polymerasekettenreaktion bedeuten und kann PCR- und/oder RT-PCR-Verfahren umfassen.

In einer Ausführungsform umfasst das hier beschriebene Verfahren die Verwendung einer Polynukleotidamplifizierung, um amplifizierte Produkte herzustellen, wobei eine oder mehrere Zielsequenzen mit einem nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstag getaggt sind. Ein ”nichtinterferierendes, nichtbeendendes, zielspezifisches Polynukleotididentifikationstag”, wie hierin definiert, bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz welche, wenn sie an eine Zielsequenz oder einen Primer gebunden ist, nicht mit der Funktion eines Polymeraseenzyms interferiert, die Nukleotidstruktur, die am Ende des Nukleotidtemplates oder des Primers liegt, nicht ändert, nicht mit dem Annealing des Primers an das Template interferiert, keine komplexen Strukturen in das Zielpolynukleotid einbaut, nicht anderweitig stört oder die Bindung von Primern und/oder die Amplifikation der Zielnukleotidsequenz nicht verhindert. Die hier beschriebenen Verfahren können DNA-Proben, RNA-Ziele oder Ziele mit einer gemischten DNA/RNA-Population verwenden. In zusätzlichen Ausführungsformen können die offenbarten Verfahren die PCR und/oder die Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) für die Amplifikation von Polynukleotiden einsetzen.

In einer Ausführungsform kann die Amplifikation von Produkten, die Zielsequenzen enthalten, die mit einem Identifizierungstag getaggt sind, unter Verwendung der Amplikon-Rescue-Multiplex-Polymerasekettenreaktion, wie in der WO 2009/124293 A1 beschrieben, bewerkstelligt werden, und sie können in Verfahren und Vorrichtungen wie in der WO 2010/132834 A1, deren Inhalte jeweils hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden, genutzt werden. Kurzgesagt werden hochkonzentrierte, zielspezifische, nested Primer verwendet, um eine zielspezifische erste Amplifizierungsprozedur durchzuführen. Zielspezifische Primer können verwendet werden, um beispielsweise einen oder mehrere (und vorzugsweise mehrere) Zielnukleinsäuren bakteriellen, viralen, pilzlichen und/oder anderen Ursprungs zu amplifizieren. Die Zielnukleinsäuren können menschlichen oder tierischen Ursprungs sein. In einer Ausführungsform stammen die Zielnukleinsäuren aus einer menschlichen klinischen Probe. Wie in 1 veranschaulicht, ist ein Vorwärtsprimer bzw. Forwardprimer Fi an zusätzliche Nukleotide angefügt bzw. mit diesen ”getaggt”, um eine zusätzliche Sequenz bereitzustellen, die nicht spezifisch für die Zielnukleinsäure(n) ist, so dass die Amplifikation der Zielnukleinsäure B mit einem solchen Primer in das resultierende Amplifikat auch ein nichtinterferierendes, nichtbeendendes, zielspezifisches Polynukleotididentifikationstag einbaut, auf das in 1 als die ”Indexsequenz” Bezug genommen wird. In einer Ausführungsform ist das nichtinterferierende, nichtbeendende, zielspezifische Polynukleotididentifikationstag ausgewählt aus den in Tabelle 1 aufgeführten. Das Verfahren beinhaltet zusätzliche Primer FC und F0, deren Funktion im Detail in der WO 2009/124293 A1 beschrieben wird. Die Amplifikation wird durchgeführt, die Reaktion wird beendet, und die resultierenden Amplifikate werden aus dem Reaktionsgemisch gerettet wie in der WO 2009/124293 A1 im Detail zur Verwendung in einem Verfahren zur Pyrosequenzierung beschrieben. Die Pyrosequenzierung wird in einem anderen Reaktionssystem durchgeführt, das denselben Reaktionsaufnahmebehälter nutzen kann oder nicht.

In der Ausführungsform nach 1 werden diese Tags individuell mit einer spezifischen Zielsequenz gepaart, indem ein Polynukleotid mit einer Primersequenz Fi, einem Polynukleotididentifikationstag bzw. einer Indexsequenz, und einer zielspezifischen Sequenz A, die mit der gewünschten Zielpolynukleotidsequenz B hybridisieren wird, synthetisiert wird. Das Tag wird so ausgewählt, dass es mit einer bestimmten Zielsequenz korreliert. Insbesondere gehören zu den Amplifikationsreaktanden eine Vorwärtsprimersequenz F;, die angefügt an zusätzliche Nukleotide oder mit diesen ”getaggt” ist, d. h. das Polynukleotididentifikationstag bzw. der Indexsequenz, die nicht spezifisch für die Zielnukleinsäure(n) ist, und eine zielspezifischen Sequenz A. Der zielspezifische Primer Fi/das Identifikationstag wird dann mit der Zielpolynukleotidsequenz B hybridisiert und eine Amplifikation wird gemäß einem bekannten Verfahren eingeleitet, beispielsweise PCR und/oder RT-PCR. Die resultierende Amplifikation der Zielnukleinsäure B mit einem solchen Primer wird in das resultierende Amplifikat das nichtinterferierende, nichtbeendende, zielspezifische Polynukleotididentifikationstag inkorporieren. Unter Verwendung des synthetisierten Polynukleotids kann die Primersequenz und die Sequenz des Polynukleotididentifizierungstags in das 5'-Ende eines Polynukleotids, das als Amplifikationsprodukt erzeugt wird, eingebaut werden.

Das Verfahren umfasst ferner die Pyrosequenzierung des amplifizierten Produkts über die Sequenz des nichtauslöschenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags, zur Detektion der Anwesenheit eines oder mehrerer spezifischer Polynukleotididentifikationstags. Hier wird die Anwesenheit eines spezifischen Polynukleotididentifizierungstags mit der Anwesenheit einer spezifischen Zielsequenz korreliert. Um dies zu erreichen, haben die Erfinder eine Reihe von Zehnbasenpaarsequenzen entwickelt, die in derselben Reaktionskammer durch Pyrosequenzierung sequenziert werden können – ohne dass bei der Sequenzierung der Identifikationstags verwirrende Signale erzeugt werden (siehe Tabelle 1). Dieses Amplifikationsprodukt kann dann über die Sequenz des Polynukleotididentifikationstags pyrosequenziert werden. Das Vorhandensein der entsprechenden Sequenz des Polynukleotididentifikationstags korreliert somit mit der Anwesenheit einer spezifischen Zielsequenz, und die Identifizierung eines Ziels in einer Probe, wie einer klinischen Probe, kann vorgenommen werden, ohne die Sequenzierungsreaktion für das gesamte Zielpolynukleotid durchzuführen.

Da die Polynukleotididentifikationstags in der Multiplexpyrosequenzierungsreakion sequenziert werden, kann Licht, das durch die enzymatische Freisetzung von anorganischem Pyrophosphat infolge des Nukleotideinbaus durch Polymerase erzeugt wird, beispielsweise unter Verwendung einer Photodiode, einer Photovervielfacherröhre oder einer Kamera mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung, detektiert werden. Die Art der Sequenzen der nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags ist derart, dass sie nicht mit den unterschiedlichen einzelnen Detektionen der Tags interferieren, wenn sie in demselben Reaktionsbehälter sequenziert werden.

Das Ergebnis ist beispielsweise ein schnelleres Verfahren zur Identifizierung von Unbekannten in einer klinischen Probe. Durch die Kombination dieses Verfahrens mit einem Verfahren wie der armPCR, wie es beispielsweise in der WO 2009/124293 A1 beschrieben ist, und unter Verwendung einer Vorrichtung, wie sie in der WO 2010/132834 A1 beschrieben ist, ist es nun möglich, eine automatisierte Einkassetten-Polynukleotidamplifikationsprozedur und Polynukleotidsequenzierungsprozedur zu erreichen, die zusammen mit einer Detektion in einer einzelnen Maschine, in die eine oder mehrere Kassetten eingesetzt werden können, durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse können in wesentlich kürzerer Zeit rückgemeldet werden, weil es nur notwendig ist, einige wenige Basenpaare zu sequenzieren, anstatt zehn oder hundert Basenpaaren.

Polynukleotididentifikationstags, die die Erfinder als nichtinterferierend und nichtbeendend bestimmt haben, sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1