Title:
Multiplexpyrosequenzierung unter Verwendung nichtinterferierender, rauschbeendender Polynukleotididentifikationstags
Kind Code:
T5
Abstract:

Die vorliegende Offenbarung bezieht sich allgemein auf ein Multiplexverfahren zum Analysieren von Proben, umfassend die Polynukleotidamplifikation zur Produktion von amplifizierten Produkten, wobei eine oder mehrere Zielsequenzen mit einem nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstag getaggt sind, das Pyrosequenzieren der amplifizierten Produkte über die Sequenz des nichtauslöschenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags zur Detektion der Anwesenheit eines oder mehrerer spezifischer Polynukleotididentifikationstags. Die Anwesenheit eines spezifischen Polynukleotididentifikationstags ist mit der Anwesenheit einer spezifischen Zielsequenz korreliert.



Inventors:
Han, Jian, Ala. (Huntsville, US)
Wang, Chunlin, Calif. (Menlo Park, US)
Application Number:
DE112013004650T
Publication Date:
06/18/2015
Filing Date:
09/24/2013
Assignee:
CB Biotechnologies, Inc. (Ala., Huntsville, US)
International Classes:
Attorney, Agent or Firm:
Dehns Germany, 80331, München, DE
Claims:
1. Multiplexamplifikationsverfahren zum Analysieren von Proben, die gemischte Polynukleotidpopulationen enthalten k?nnen, wobei das Verfahren die Verwendung einer Polynukleotidamplifikation zur Erzeugung amplifizierter Produkte, wobei eine oder mehrere Zielsequenzen mit einem nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstag getaggt werden bzw. sind, und die Pyrosequenzierung der amplifizierten Produkte ?ber die Sequenz des nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags zur Detektion der Anwesenheit eines oder mehrerer spezifischer Polynukleotididentifikationstags umfasst, wobei die Anwesenheit eines oder mehrerer spezifischer Polynukleotididentifikationstags mit der Anwesenheit einer spezifischen Zielsequenz korreliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polynukleotidpopulation DNA enth?lt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polynukleotidpopulation RNA enth?lt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polynukleotidpopulation eine gemischte Population aus DNA und RNA ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polynukleotidamplifikation PCR umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polynukleotidamplifikation RT-PCR umfasst.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das nichtinterferierende, nichtbeendende, zielspezifische Polynukleotididentifikationstag aus einer Gruppe von Sequenzen ausgew?hlt ist, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60 besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer Gruppe ausgew?hlt sind, die aus viralen, bakteriellen and pilzlichen Nukleins?uren besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer menschlichen klinischen Probe erhalten werden.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer klinischen Probe eines Tiers erhalten werden.

11. Verfahren, das die Schritte umfasst
a. Anf?gen eines zieleindeutigen, nichtinterferierenden, nichtbeendenden Polynukleotididentifkationstags an einen zielspezifischen Primer,
b. Hybridisieren des zielspezifischen Primers/des Identifikationstags mit einer Zielpolynukleotidsequenz,
c. Durchf?hren einer Polynukleotidamplifikation zur Amplifikation der Zielpolynukleotidsequenz und zum Hinzuf?gen des zieleindeutigen Polynukleotididentifikationstags zu der Zielpolynukleotidsequenz, und
d. Pyrosequenzieren des zieleindeutigen, nichtinterferierenden, nichtbeendenden Polynukleotididentifikationstags, wobei das Identifizieren des zieleindeutigen, nichtinterferierenden, nichtbeendenden Polynukleotididentifikationstags die Anwesenheit des Zielpolynukleotids anzeigt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polynukleotidpopulation DNA enth?lt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polynukleotidpopulation RNA enth?lt.

14. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polynukleotidpopulation eine gemischte Population aus DNA und RNA ist.

15. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polynukleotidamplifikation PCR umfasst.

16. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polynukleotidamplifikation RT-PCR umfasst.

17. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das nichtinterferierende, nichtausl?schende, zielspezifische zielspezifischen Polynukleotididentifikationstag aus einer Gruppe von Sequenzen ausgew?hlt ist, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60 besteht

18. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer Gruppe ausgew?hlt sind, die aus viralen, bakteriellen and pilzlichen Nukleins?uren besteht.

19. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer menschlichen klinischen Probe erhalten werden.

20. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die eine oder die mehreren Zielsequenzen aus einer klinischen Probe eines Tiers erhalten werden.

21. Polynukleotidsequenz, die ein nichtinterferierendes, nichtausl?schendes, zielspezifisches Polynukleotididentifikationstag umfasst, das aus einer Gruppe von Sequenzen ausgew?hlt ist, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60 besteht.

Description:
Querverweis auf verwandte Anmeldung

Diese Anmeldung beansprucht die Priorit?t der vorl?ufigen US-Patentanmeldung Nr. 61/705.089, mit dem Titel ?Multiplex Pyrosequencing Using Non-Interfering Noise-Cancelling Polynucleotide Identification Tags?, und eingereicht am 24. September 2012, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.

Sequenzprotokoll

Die vorliegende Anmeldung enth?lt ein Sequenzprotokoll, das im ASCII-Format ?ber EFS-Web eingereicht wurde und hiermit durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen wird. Besagte ASCII-Kopie, am 23. September 2013 erstellt, ist mit 15892-0002_SL.txt bezeichnet und weist eine Gr??e von 15.781 Bytes auf.

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf Methodiken zur Analyse und Sequenzierung von Nukleins?ureproben. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Verfahren zur Sequenzierung amplifizierter Nukleins?ureproben ?ber die Verwendung von spezifischen Polynukleotididentifikationstags bzw. Polynukleotididentifikationsmarkierungen.

Hintergrund der Erfindung

Die Entwicklung von Nukleins?ureamplifikationsmethodiken, beispielsweise der Polymerasekettenreaktion (PCR), erm?glicht den Einsatz der DNA-Amplifikation f?r eine Vielzahl von Anwendungen, darunter die molekulardiagnostische Testung. Mit der Verwendung der PCR f?r molekulare, differenzialdiagnostische(MDD-)Assays sind jedoch Herausforderungen verbunden. Die PCR nutzt spezifische Primer oder Primers?tze, Temperaturbedingungen und Enzyme. Beispielsweise werden PCR-Reaktionen leicht kontaminiert, die Primerbindung kann unterschiedliche Bedingungen f?r unterschiedliche Primer und Primers?tze erfordern, und Primer sollten spezifisch f?r eine Zielsequenz bzw. Targetsequenz sein, um nur diese Zielsequenz zu amplifizieren. Diese Beschr?nkungen machen es noch schwieriger, mehrere Sequenzen aus einer einzigen Probe zu amplifizieren.

Die diagnostische Testung klinischer Proben, um einen oder mehrere kausale Krankheitserreger zu finden, hat in der Vergangenheit erfordert, dass Mikroorganismen isoliert und kultiviert werden. Dies kann aber Tage dauern, und in vielen F?llen muss auf eine Diagnose in wenigen Stunden reagiert werden, wenn das Leben des Patienten gerettet werden soll. Die Analyse einer einzigen klinischen Probe, um mehrere Organismen zu identifizieren, um zu bestimmen, welcher der kausale oder welche die kausalen Krankheitserreger sind, ist das gew?nschte Verfahren f?r die MDD, und Verfahren sind entwickelt worden, um dieses Ziel besser zu erreichen. Beispielsweise sind Multiplex-PCR-Verfahren entwickelt worden, um mehrere Nukleins?uren in einer Probe zu amplifizieren, so dass gen?gend DNA/RNA hergestellt wird, um den Nachweis und die Identifizierung von mehreren Organismen zu erm?glichen. Die Multiplex-PCR hat jedoch Nachteile. Zum Beispiel erfordert jedes Ziel bzw. Target in einer Multiplex-PCR-Reaktion seine eigenen, optimalen Reaktionsbedingungen, so dass eine Erh?hung der Anzahl der Ziele erfordert, dass die Reaktionsbedingungen f?r jedes einzelne Ziel suboptimal sind. Ferner bilden mehrere S?tze von hochkonzentrierten Primern in einem System h?ufig Primerdimere oder f?hren zur unspezifischen Amplifikation des Hintergrunds. Dieser Mangel an Spezifit?t erfordert auch zus?tzliche Schritte der Aufreinigung nach der PCR und mehrere W?schen nach der Hybridisierung.

In gro?er Menge vorliegende Primer reduzieren die Amplifikationseffizienz, indem sie die verf?gbaren Enzyme erfordern bzw. aufbrauchen und Substrate verbrauchen. Unterschiede in der Amplifikationseffizienz k?nnen zu erheblichen Abweichungen in den Amplifikatausbeuten bzw. Amplikonausbeuten f?hren. Zum Beispiel k?nnen einige Loci sehr effizient amplifizieren, w?hrend andere sehr ineffizient amplifizieren oder in ihrer Amplifizierung vollst?ndig versagen. Dieses Potential f?r eine unausgeglichene Amplifikation macht es auch schwierig bis unm?glich, eine pr?zise, quantitative Endpunktanalyse durchzuf?hren.

Oft ist der Zeitfaktor essentiell, Patienteninfektionen umfassen mehr als eine Bakterienart, und die Menge der Ziel-DNA in einer klinischen Probe ist begrenzt. Technologien wie die Multiplex-PCR wurden entwickelt, um diese Probleme anzugehen. Jedoch sind Verbesserungen in diesem Bereich immer noch erforderlich, um die Zeit und den Aufwand zu reduzieren, eine schnelle und genaue Analyse von klinischen Proben zu erreichen. Automatisierbare Verfahren, insbesondere durch die Verwendung eines geschlossenen Kassette f?r die Probenvorbereitung und Analyse, sind besonders wichtig, da sie die zus?tzlichen Vorteile einer Verringerung einer m?glichen Kontamination von Proben und die Zeit und den Aufwand, die bzw. den ein Labortechniker bei der Herstellung und Analyse jeder Probe investieren muss, verringern.

Wenngleich es signifikante Verbesserungen in Multiplexsequenzierungstechnologien und deren Verwendung bei der Probenanalyse gibt, w?re es sehr vorteilhaft, wenn diese weiter verfeinert werden k?nnten, um die Analyse und Detektion einfacher zu machen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Multiplexverfahren f?r die Analyse von Proben, die gemischte DNA- oder RNA-Populationen umfassen k?nnen, wobei das Verfahren die Verwendung einer Polynukleotidamplifikation zur Herstellung amplifizierter Produkte umfasst, wobei eine oder mehrere Zielsequenzen mit nichtinterferierenden, nichtabbrechenden bzw. nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags getaggt sind, und eine Pyrosequenzierung der amplifizierten Produkte ?ber die Sequenz des nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags zur Bestimmung der Anwesenheit eines oder mehrerer spezifischer Polynukleotididentifikationstags, wobei die Anwesenheit eines spezifischen Polynukleotididentifikationstags mit der Anwesenheit einer spezifischen Zielsequenz korreliert. In einer Ausf?hrungsform kann das Polynukleotid DNA, RNA oder eine gemischte DNA/RNA-Population umfassen. In einer zus?tzlichen Ausf?hrungsform umfasst die Multiplexreaktion eine PCR-Reaktion.

Aspekte der Erfindung beziehen sich auch ein Multiplexverfahren zur Analyse einer Probe, die eine oder mehrere unidentifizierte Polynukleotide enth?lt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, an einen zielspezifischen Primer ein zieleindeutiges, nichtinterferierendes, nichtbeendendes Identifikationstag anzuh?ngen, den zielspezifischen Primer mit einer Zielpolynukleotidsequenz zu hybridisieren, eine Polynukleotidamplifizierung durchzuf?hren, um die Zielpolynukleotidsequenz zu amplifizieren und das zieleindeutige, nichtinterferierende, nichtbeendende Polynukleotididentifikationstag zu der Zielpolynukleotidsequenz hinzuzuf?gen, und das zieleindeutige, nichtinterferierende, nichtbeendende, zielspezifische Polynukleotididentifikationstag zu pyrosequenzieren, wobei die Identifizierung eines zieleindeutigen, nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags die Anwesenheit des Zielpolynukleotids anzeigt. In einer Ausf?hrungsform kann das Polynukleotid DNA, RNA oder eine gemischte DNA/RNA-Population umfassen. In einer weiteren umfasst die Multiplexreaktion eine PCR-Reaktion.

Aspekte der Erfindung beziehen sich auch auf ein Verfahren zur Multiplex-PCR-Pyrosequenzierung, wobei das zieleindeutige, nichtinterferierende, nichtbeendende Polynukleotididentifikationstag aus einer Gruppe von Sequenzen, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 und SEQ ID NO: 60, ausgew?hlt ist.

Ein Aspekt der Erfindung nutzt verschachtelte bzw. nested, zielspezifische Primer. Zielnukleins?uren k?nnen DNA und/oder RNA umfassen und k?nnen DNA und/oder RNA viralen, bakteriellen und/oder pilzlichen Ursprungs umfassen, sowie genomische DNA und/oder RNA menschlichen oder anderen tierischen Ursprungs. Eine Amplifikation kann durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder RT-PCR durchgef?hrt werden. Die Quelle der Zielnukleins?uren kann eine oder mehrere klinische, Umwelt- oder Nahrungsmittelproben sein und das Verfahren kann in einer Vielzahl von Weisen, einschlie?lich beispielsweise der klinischen Diagnose, der Umweltbeprobung, der Pflanzentestung, der Lebensmittelsicherheitsanalyse, dem Nachweis von genetischen Erkrankungen und/oder dem Nachweis von Krankheitszust?nden verwendet werden. Das Verfahren kann f?r die menschliche und/oder tiermedizinische Diagnose verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 ist eine Veranschaulichung eines Beispiels des Verfahrens zum Anbringen eines zielspezifischen oder zieleindeutigen Polynukleotididentifikationstags mittels PCR. In 1 bezeichnet ?Indextag? das zielspezifische (zieleindeutige) Polynukleotididentifikationstag. Fo, Fi, Fc, Ro, Ri und Rc zeigen Primersequenzen und Primerpositionen an.

Ausf?hrliche Beschreibung

Die Pyrosequenzierung ist eine Nukleins?uresequenzierungstechnik, die auf dem Nachweis freigesetzten Pyrophosphats w?hrend der Nukleins?uresynthese beruht. Sichtbares Licht wird bei dieser enzymatischen Reaktion erzeugt und ist proportional zu der Anzahl der eingebauten Nukleotide. Anorganisches Pyrophosphat wird infolge des Nukleotideinbaus durch das Enzym Polymerase freigesetzt. In einigen Ausf?hrungsformen wird Luciferase verwendet, um Licht zu erzeugen, das einfach durch eine Photodiode, ein Photovervielfacherrohr oder eine Kamera mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) erfasst werden kann. Die Sequenz der Templatenukleins?ure bzw. Musternukleins?ure kann bestimmt werden, da das zugegebene Nukleotid bekannt ist. Die Pyrosequenzierung ist sowohl mit DNA als auch mit RNA m?glich. Im Wesentlichen erm?glicht das Verfahren die Sequenzierung eines einzigen Nukleins?urestrangs durch Synthetisieren seines komplement?ren Strangs, Basenpaar f?r Basenpaar, und das Erfassen, welche Base bei jedem Schritt hinzugef?gt wurde, indem das w?hrend des Nukleotideinbaus emittierte Licht gemessen wird. Die Pyrosequenzierung stellt ein schnelles, genaues Verfahren zur Nukleins?ureapplikation aus bakteriellen, viralen, pilzlichen und anderen ?hnlichen Quellen dar, um bei Identifizierungen aus klinischen Proben zu helfen. Allerdings ist die Pyrosequenzierung ein paralleles Sequenzierverfahren ? das i. d. R. mehrere parallele Sequenzierungsl?ufe erfordert, um eine Mischprobe zu analysieren. Die Durchf?hrung dieses Sequenzierungsverfahrens in einem einzigen Aufnahmebeh?lter, wie beim Multiplex-PCR-Sequenzierverfahren, k?nnte die Kosten und den Zeitaufwand zur Erzeugung der ben?tigten Ergebnisse wesentlich verk?rzen. Die Erfinder haben ein Verfahren entwickelt, mit dem es m?glich sein wird, die Pyrosequenzierung in einer echten Multiplexart durchzuf?hren ? Sequenzierung und Detektion mehrerer Proben in einer einzigen Multiplexreaktion anstelle mehrerer Parallelreaktionen.

Die Erfinder haben erkannt, dass der Vorteil der Pyrosequenzierung ? die Tatsache, dass die Detektion der Sequenzierungsergebnisse auf der Erfassung von Licht beruht, welches emittiert wird, wenn freigesetztes Pyrophosphat erzeugt wird, wenn bei der DNA-Synthese Nukleotide hinzugef?gt werden ? im Allgemeinen die Verwendung der Multiplex-PCR und der Multiplexsequenzierung ausschlie?t, weil der Nachweis von mehreren unterschiedlichen Sequenzen relativ unm?glich wird. Allerdings haben sie eine Methode entwickelt, die dieses Hindernis ?berwindet. Dabei haben sie ein Verfahren zur Multiplexpolynukleotidamplifikation und Multiplexpolynukleotidpyrosequenzierung bereitgestellt, das innerhalb des Raums einer einzelnen Kassette durchgef?hrt werden kann, wie in jener, die in dem Verfahren eingesetzt wird, das in der WO 2010/132834 A1 (Apparatus for Performing Amplicon Rescue Multiplex PCR), die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird, beschrieben wird.

Es versteht sich, dass der Begriff ?umfassen?, wie er hier verwendet wird, durch die Begriffe ?im Wesentlichen bestehend aus? und ?bestehend aus? ersetzt werden kann.

Wenn der Begriff ?Reaktionssystem? verwendet wird, soll er ein Eppendorfr?hrchen, eine Reaktionskammer oder eine andere Aufnahmevorrichtung beschreiben, in welche die erforderlichen Primer, Enzyme, Nukleotide, Puffer und/oder anderen Reagenzien gegeben werden, um einen oder mehrere Zyklen mindestens einer Polymerasekettenreaktion durchzuf?hren. Ein anderes ?Reaktionssystem? kann sich daher auf den gleichen Reaktionsaufnahmebeh?lter, aber eine andere Komponente von Reagenzien ? insbesondere Primern ? zur Durchf?hrung des gew?nschten Amplifikationsschritts beziehen. Ein ?Reaktionsaufnahmebeh?lter? soll ein R?hrchen, eine Vertiefung einer Platte oder ein anderes Gef?? mit einem ausreichenden Innenvolumen bedeuten, um Primer, Enzyme, Nukleotide, Puffer und/oder andere zur Bereitstellung eines Reaktionssystems erforderliche Reagenzien enthalten zu k?nnen. Der Begriff ?Rettung? bzw. ?Rescue? soll die Trennung der Amplifikaten von zumindest einem Teil der Primer der ersten Amplifikation bedeuten. ?PCR? soll die Polymerasekettenreaktion bedeuten und kann PCR- und/oder RT-PCR-Verfahren umfassen.

In einer Ausf?hrungsform umfasst das hier beschriebene Verfahren die Verwendung einer Polynukleotidamplifizierung, um amplifizierte Produkte herzustellen, wobei eine oder mehrere Zielsequenzen mit einem nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstag getaggt sind. Ein ?nichtinterferierendes, nichtbeendendes, zielspezifisches Polynukleotididentifikationstag?, wie hierin definiert, bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz welche, wenn sie an eine Zielsequenz oder einen Primer gebunden ist, nicht mit der Funktion eines Polymeraseenzyms interferiert, die Nukleotidstruktur, die am Ende des Nukleotidtemplates oder des Primers liegt, nicht ?ndert, nicht mit dem Annealing des Primers an das Template interferiert, keine komplexen Strukturen in das Zielpolynukleotid einbaut, nicht anderweitig st?rt oder die Bindung von Primern und/oder die Amplifikation der Zielnukleotidsequenz nicht verhindert. Die hier beschriebenen Verfahren k?nnen DNA-Proben, RNA-Ziele oder Ziele mit einer gemischten DNA/RNA-Population verwenden. In zus?tzlichen Ausf?hrungsformen k?nnen die offenbarten Verfahren die PCR und/oder die Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) f?r die Amplifikation von Polynukleotiden einsetzen.

In einer Ausf?hrungsform kann die Amplifikation von Produkten, die Zielsequenzen enthalten, die mit einem Identifizierungstag getaggt sind, unter Verwendung der Amplikon-Rescue-Multiplex-Polymerasekettenreaktion, wie in der WO 2009/124293 A1 beschrieben, bewerkstelligt werden, und sie k?nnen in Verfahren und Vorrichtungen wie in der WO 2010/132834 A1, deren Inhalte jeweils hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden, genutzt werden. Kurzgesagt werden hochkonzentrierte, zielspezifische, nested Primer verwendet, um eine zielspezifische erste Amplifizierungsprozedur durchzuf?hren. Zielspezifische Primer k?nnen verwendet werden, um beispielsweise einen oder mehrere (und vorzugsweise mehrere) Zielnukleins?uren bakteriellen, viralen, pilzlichen und/oder anderen Ursprungs zu amplifizieren. Die Zielnukleins?uren k?nnen menschlichen oder tierischen Ursprungs sein. In einer Ausf?hrungsform stammen die Zielnukleins?uren aus einer menschlichen klinischen Probe. Wie in 1 veranschaulicht, ist ein Vorw?rtsprimer bzw. Forwardprimer Fi an zus?tzliche Nukleotide angef?gt bzw. mit diesen ?getaggt?, um eine zus?tzliche Sequenz bereitzustellen, die nicht spezifisch f?r die Zielnukleins?ure(n) ist, so dass die Amplifikation der Zielnukleins?ure B mit einem solchen Primer in das resultierende Amplifikat auch ein nichtinterferierendes, nichtbeendendes, zielspezifisches Polynukleotididentifikationstag einbaut, auf das in 1 als die ?Indexsequenz? Bezug genommen wird. In einer Ausf?hrungsform ist das nichtinterferierende, nichtbeendende, zielspezifische Polynukleotididentifikationstag ausgew?hlt aus den in Tabelle 1 aufgef?hrten. Das Verfahren beinhaltet zus?tzliche Primer FC und F0, deren Funktion im Detail in der WO 2009/124293 A1 beschrieben wird. Die Amplifikation wird durchgef?hrt, die Reaktion wird beendet, und die resultierenden Amplifikate werden aus dem Reaktionsgemisch gerettet wie in der WO 2009/124293 A1 im Detail zur Verwendung in einem Verfahren zur Pyrosequenzierung beschrieben. Die Pyrosequenzierung wird in einem anderen Reaktionssystem durchgef?hrt, das denselben Reaktionsaufnahmebeh?lter nutzen kann oder nicht.

In der Ausf?hrungsform nach 1 werden diese Tags individuell mit einer spezifischen Zielsequenz gepaart, indem ein Polynukleotid mit einer Primersequenz Fi, einem Polynukleotididentifikationstag bzw. einer Indexsequenz, und einer zielspezifischen Sequenz A, die mit der gew?nschten Zielpolynukleotidsequenz B hybridisieren wird, synthetisiert wird. Das Tag wird so ausgew?hlt, dass es mit einer bestimmten Zielsequenz korreliert. Insbesondere geh?ren zu den Amplifikationsreaktanden eine Vorw?rtsprimersequenz F;, die angef?gt an zus?tzliche Nukleotide oder mit diesen ?getaggt? ist, d. h. das Polynukleotididentifikationstag bzw. der Indexsequenz, die nicht spezifisch f?r die Zielnukleins?ure(n) ist, und eine zielspezifischen Sequenz A. Der zielspezifische Primer Fi/das Identifikationstag wird dann mit der Zielpolynukleotidsequenz B hybridisiert und eine Amplifikation wird gem?? einem bekannten Verfahren eingeleitet, beispielsweise PCR und/oder RT-PCR. Die resultierende Amplifikation der Zielnukleins?ure B mit einem solchen Primer wird in das resultierende Amplifikat das nichtinterferierende, nichtbeendende, zielspezifische Polynukleotididentifikationstag inkorporieren. Unter Verwendung des synthetisierten Polynukleotids kann die Primersequenz und die Sequenz des Polynukleotididentifizierungstags in das 5'-Ende eines Polynukleotids, das als Amplifikationsprodukt erzeugt wird, eingebaut werden.

Das Verfahren umfasst ferner die Pyrosequenzierung des amplifizierten Produkts ?ber die Sequenz des nichtausl?schenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags, zur Detektion der Anwesenheit eines oder mehrerer spezifischer Polynukleotididentifikationstags. Hier wird die Anwesenheit eines spezifischen Polynukleotididentifizierungstags mit der Anwesenheit einer spezifischen Zielsequenz korreliert. Um dies zu erreichen, haben die Erfinder eine Reihe von Zehnbasenpaarsequenzen entwickelt, die in derselben Reaktionskammer durch Pyrosequenzierung sequenziert werden k?nnen ? ohne dass bei der Sequenzierung der Identifikationstags verwirrende Signale erzeugt werden (siehe Tabelle 1). Dieses Amplifikationsprodukt kann dann ?ber die Sequenz des Polynukleotididentifikationstags pyrosequenziert werden. Das Vorhandensein der entsprechenden Sequenz des Polynukleotididentifikationstags korreliert somit mit der Anwesenheit einer spezifischen Zielsequenz, und die Identifizierung eines Ziels in einer Probe, wie einer klinischen Probe, kann vorgenommen werden, ohne die Sequenzierungsreaktion f?r das gesamte Zielpolynukleotid durchzuf?hren.

Da die Polynukleotididentifikationstags in der Multiplexpyrosequenzierungsreakion sequenziert werden, kann Licht, das durch die enzymatische Freisetzung von anorganischem Pyrophosphat infolge des Nukleotideinbaus durch Polymerase erzeugt wird, beispielsweise unter Verwendung einer Photodiode, einer Photovervielfacherr?hre oder einer Kamera mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung, detektiert werden. Die Art der Sequenzen der nichtinterferierenden, nichtbeendenden, zielspezifischen Polynukleotididentifikationstags ist derart, dass sie nicht mit den unterschiedlichen einzelnen Detektionen der Tags interferieren, wenn sie in demselben Reaktionsbeh?lter sequenziert werden.

Das Ergebnis ist beispielsweise ein schnelleres Verfahren zur Identifizierung von Unbekannten in einer klinischen Probe. Durch die Kombination dieses Verfahrens mit einem Verfahren wie der armPCR, wie es beispielsweise in der WO 2009/124293 A1 beschrieben ist, und unter Verwendung einer Vorrichtung, wie sie in der WO 2010/132834 A1 beschrieben ist, ist es nun m?glich, eine automatisierte Einkassetten-Polynukleotidamplifikationsprozedur und Polynukleotidsequenzierungsprozedur zu erreichen, die zusammen mit einer Detektion in einer einzelnen Maschine, in die eine oder mehrere Kassetten eingesetzt werden k?nnen, durchgef?hrt werden kann. Die Ergebnisse k?nnen in wesentlich k?rzerer Zeit r?ckgemeldet werden, weil es nur notwendig ist, einige wenige Basenpaare zu sequenzieren, anstatt zehn oder hundert Basenpaaren.

Polynukleotididentifikationstags, die die Erfinder als nichtinterferierend und nichtbeendend bestimmt haben, sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1