Title:
Verwendung von Nanoporen-Arrays zur Multiplex-Sequenzierung von Nukleinsäuren
Kind Code:
T5


Abstract:

Es werden Methoden zur optischen Detektion von Einzelmolekülsignalen von einem Nanoporen-Array zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen beschrieben. Diese Methoden sind zur schnellen gemultiplexten DNA-Sequenzierung brauchbar.




Inventors:
Weng, Zhiping, Mass. (Wellesley, US)
Singer, Alon, Mass. (Brighton, US)
Meller, Amit, Mass. (Brookline, US)
Mcnally, Benjamin, Mass. (Brighton, US)
Application Number:
DE112011101618T
Publication Date:
03/21/2013
Filing Date:
05/11/2011
Assignee:
Trustees of Boston University (Mass., Boston, US)
International Classes:



Foreign References:
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Attorney, Agent or Firm:
Patentanwälte Freischem, 50677, Köln, DE
Claims:
1. Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren, umfassend:
(a) Verdrängen einer Vielzahl von optisch markierten Oligonukleotiden von einer Vielzahl von Trägermolekülen während kontrollierter Translokation der Trägermoleküle durch eine Vielzahl von Nanoporen in einem Nanoporen-Array, wobei jedes Trägermolekül durch eine andere Nanopore in dem Nanoporen-Array dringt; und
(b) Detektieren einer Vielzahl von optischen Signalen von den optisch markierten Oligonukleotiden, wenn die optisch markierten Oligonukleotide von anderen Trägermolekülen verdrängt werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Nanoporen in einem Nanoporen-Array sich in einer Festkörpermembran mit einer Dicke von etwa 0,1 nm bis etwa 1 μm befinden.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Festkörpermembran ein Material umfasst, das eine mechanisch stabile Membran schafft.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei die Membran Silizium, Siliziumnitrid, Siliziumoxid, Titanoxid, Aluminiumoxid oder Graphen umfasst.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei die Nanoporen einen Durchmesser von etwa 1 bis etwa 20 nm aufweisen.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, wobei die Nanoporen etwa 0,5 bis etwa 10 μ voneinander beabstandet sind.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–6, wobei das Nanoporen-Array von 2 bis etwa 100.000 Nanoporen umfasst.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–7, welches ferner Anregen mit einer Lichtquelle der optischen Markierungen, die mit den optisch markierten Oligonukleotiden verbunden sind, umfasst.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Lichtquelle ein Laser ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die optischen Markierungen mit einer Vielzahl von Lichtquellen angeregt werden, wobei jede Lichtquelle ein anderes Lichtemissionsspektrum aufweist.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–10, wobei die optischen Signale von der Oberfläche der Membran detektiert werden.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–11, wobei die optischen Signale mit einer Vorrichtung detektiert werden, die zum Aufzeichnen von mindestens 500 Bildern pro Sekunde fähig ist.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–12, wobei die optischen Signale mit einer Vorrichtung detektiert werden, die zum Aufzeichnen von mindestens 1000 Bildern pro Sekunde fähig ist.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–13, wobei optische Detektion Paralleldetektion mehrerer Spektren, die auf unterschiedliche Bereiche eines Aufnahmesensors aufgespalten werden, umfasst.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Anzahl der Bereiche 2 beträgt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Anzahl der Bereiche 4 beträgt.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14–16, wobei jeder Bereich auf dem Aufnahmesensor eine einzelne Abbildung pro aufgenommenem Bild erzeugt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei jede Abbildung eine einzelne Nukleobase in einer Nukleinsäuresequenz von Interesse darstellt.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–18, wobei die optischen Signale mit einer CCD-basierten Kamera detektiert werden.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–18, wobei die optischen Signale mit einer EM-CCD-basierten Kamera detektiert werden.

21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–18, wobei die optischen Signale mit einer CMOS-basierten Kamera detektiert werden.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–21, wobei die optischen Signale von beiden Seiten der Membran detektiert werden.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–21, wobei die optischen Signale von der cis-Seite der Membran detektiert werden.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–23, wobei Verdrängen eines optisch markierten Oligonukleotids von einem Trägermolekül, das durch eine einzelne Nanopore in dem Nanoporen-Array dringt, eine einzelnes detektierbares optisches Signal erzeugt.

25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–24, wobei die optischen Signale Fluoreszenzsignale sind.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei die Fluoreszenzsignale von einzelnen Nanoporen mit einer Rate von mindestens 500 Photonenbursts pro Sekunde erzeugt werden.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25–26, wobei jedes Fluoreszenzsignal eine einzelne Nukleobase in einer Nukleinsäuresequenz von Interesse darstellt.

28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25–27, wobei das Fluoreszenzsignal Nukleotididentifizierung auf der Grundlage von Fluoreszenzintensitätsverhältnissen ermöglicht.

29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–28, wobei die gesteuerte Translokation durch eine Nanopore in dem Nanoporen-Array über die Verdrängung von diskreten optisch markierten Oligonukleotiden von dem Trägermolekül selbstreguliert ist.

30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–29, wobei das Trägermolekül DNA oder RNA umfasst.

31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–30, welches ferner Erzeugen des Trägermoleküls aus einer Nukleinsäuresequenz von Interesse durch einen zirkulären DNA-Umwandlungsprozess umfasst.

32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–31, wobei das Trägermolekül eine Länge von etwa 100 bis etwa 50.000 Nukleotiden aufweist.

33. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–32, wobei jedes optisch markierte Oligonukleotid eine einzelne Nukleobase in einer Nukleinsäuresequenz von Interesse darstellt.

34. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–33, wobei die gesteuerte Translokation durch eine Nanopore in dem Nanoporen-Array kein Enzym oder Protein einsetzt.

35. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–34, wobei von etwa 100 bis etwa 500 optisch markierte Oligonukleotide pro Nanopore von einem einzelnen Trägermolekül verdrängt werden.

36. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–35, wobei mindestens 500 optisch markierte Oligonukleotide von einem einzelnen Trägermolekül verdrängt werden.

37. Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei die Selbstregulierung auf einen oder mehreren der folgenden Faktoren basiert: (i) an die Membran angelegter Spannungsgradient; (ii) Temperatur; (iii) Anzahl von Nukleobasen in den verdrängten optisch markierten Oligonukleotiden; (iv) der GC-Gehalt des verdrängten optisch markierten Oligonukleotids; (v) chemische Zusammensetzung des verdrängten optisch markierten Oligonukleotids; und (vi) Elektrolytbedingungen auf beiden Seiten der Membran.

38. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–38, wobei der Nanoporendurchmesser die Geschwindigkeit des Einfangens von Trägermolekülen steuert.

39. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–38, wobei die Nanoporen in dem Nanoporen-Array chemisch oder biologisch unmodifiziert sind.

40. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–39, wobei die optisch markierten Oligonukleotide DNA, RNA, PNA oder LNA umfassen.

41. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–40, wobei das Trägermolekül die Sequenzinformationen von einer Nukleinsäuresequenz von Interesse darstellt.

42. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–41, welches ferner Erhalten der Sequenz einer Nukleinsäuresequenz von Interesse aus der sequenziellen Detektion von optischen Signalen, die durch Verdrängen des optisch markierten Oligonukleotids von den Trägermolekülen erzeugt wird, umfasst.

43. Verfahren gemäß Anspruch 42, wobei die Nukleinsäuresequenz von Interesse DNA umfasst.

44. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–43, wobei die optischen Signale von optisch markierten Oligonukleotiden, die mit unterschiedlichen Trägermolekülen verbunden sind, gleichzeitig detektiert werden.

45. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–44, welches ferner Verbinden eines optischen Signals mit einer bestimmten Nanopore in dem Nanoporen-Array umfasst.

46. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1–45.

Description:
QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 61/395,323, eingereicht am 11. Mai 2010, deren gesamte Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird.

STAATLICHE UNTERSTÜTZUNG

Diese Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter dem von den National Institutes of Health gewährten Vertrag Nr. HG-004128 gemacht. Der Staat hat gewisse Rechte an der Erfindung.

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Nukleinsäureanalyse. Insbesondere betrifft die Erfindung optische Bildgebung von Einzelmolekülsignalen von einem Nanoporen-Array zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen.

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK

Nanoporenbasierte DNA-Sequenzierung wird weithin als eine vielversprechende Sequenzierungsplattform der nächsten Generation angesehen (Literaturverweise [1, 2]). Zwei Hauptmerkmale des Nanoporenverfahrens machen es besonders für einzelmolekülbasierte Genomanalysen brauchbar: erstens, die Fähigkeit des Verfahrens extrem lange DNA-Moleküle aus der Gesamtmenge heraus elektrophoretisch zu konzentrieren und in die Nanopore einzufädeln, wodurch es möglich wird, winzige DNA-Proben zu analysieren (Literaturverweis [3]), und zweitens werden Nanoporen kleiner 5 nm nun routinemäßig verwendet, um lange DNA-Coils zu linearisieren, was bedeutet, dass im Prinzip Nanoporen eingesetzt werden können, um Informationen entlang eines langen Genoms wirksam zu scannen. Diese Merkmale sowie die Tatsache, dass Festkörpernanoporen in einem hochdichten Array gefertigt werden können (Literaturverweise [4, 5]), ermöglichen die Entwicklung massiv paralleler Detektion und sind entscheidend für die Verwirklichung einer amplifikationsfreien, kostengünstigen Hochdurchsatzsequenzierung (Literaturverweise [2, 6–9]).

Eine Nanopore ist eine nanometergroße Pore in einer ultradünnen Membran, die zwei Kammern trennt, die eine ionische Lösung enthalten. Ein an der Membran angelegtes externes elektrisches Feld erzeugt einen Ionenstrom und einen lokalen elektrischen Potentialgradienten nahe der Pore, der Biopolymere hereinzieht und hintereinander in die Pore einfädelt (Literaturverweise [3, 10]). Wenn ein Biopolymer in eine Pore eintritt, verdrängt es einen Bruchteil der Elektrolyte, was Anlass zu einer Änderung der Leitfähigkeit der Pore gibt, die unter Verwendung eines Elektrometers direkt gemessen werden kann. In letzter Zeit wurde eine Reihe von nanoporenbasierten DNA-Sequenzierungsverfahren vorgeschlagen und heben zwei große Herausforderungen hervor (wie in den Literaturverweisen [1, 11] beschrieben): (1) die Fähigkeit, zwischen einzelnen Nukleotiden zu unterscheiden, d. h. das System muss zur Differenzierung der vier Basen auf einer Einzelmolekülebene fähig sein; und (2) das Verfahren muss ein paralleles Auslesen ermöglichen. Da eine einzelne Nanopore nur ein einzelnes Molekül zu einem Zeitpunkt abtasten kann, besteht ein Bedarf an einer Strategie zum Herstellen eines Arrays von Nanoporen und deren gleichzeitiger Überwachung.

Bis heute wurde ein paralleles Auslesen durch ein nanoporenbasiertes Verfahren noch nicht erreicht. Eine große Anzahl von aktuellen und auch zukünftigen Sequenzierungsmethodiken beruhen in dem Ausleseprozess auf der Verwendung eines Enzyms (Polymerase, Exonuklease usw.). Die Kinetik der Enzymaktivität ist jedoch ein wesentlicher Engpass beider Erhöhung der Auslesegeschwindigkeit, und diese Methoden sind von der ungestörten Aktivität von Enzymen abhängig.

KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, dass ein nanoporenbasiertes Verfahren für die Hochdurchsatzerkennung von Basen, ohne die Notwendigkeit für Enzyme während der Auslesestufe möglich ist; und teilweise auf der Entwicklung eines Verfahrens, das optische Detektion von Signalen von mehreren Nanoporen ermöglicht.

Es versteht sich, dass beliebige der im Folgenden beschriebenen Ausführungsformen in beliebiger Weise kombiniert werden können, es sei denn, sie schließen sich gegenseitig aus. Es versteht sich auch, dass jede Ausführungsform oder Kombination von Ausführungsformen auf jeden der nachfolgend beschriebenen Aspekte angewendet werden kann.

In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren bereit, das Folgendes umfasst: (a) Verdrängen einer Vielzahl von optisch markierten Oligonukleotiden von einer Vielzahl von Trägermolekülen während kontrollierter Translokation der Trägermoleküle durch eine Vielzahl von Nanoporen in einem Nanoporen-Array, wobei jedes Trägermolekül durch eine andere Nanopore in dem Nanoporen-Array dringt; und (b) Detektieren einer Vielzahl von optischen Signalen von den optisch markierten Oligonukleotiden, wenn die optisch markierten Oligonukleotide von anderen Trägermolekülen verdrängt werden.

In einigen Ausführungsformen befinden sich die Nanoporen in einem Nanoporen-Array in einer Festkörpermembran mit einer Dicke von etwa 0,1 nm bis etwa 1 μm.

In einigen Ausführungsformen umfasst die Festkörpermembran ein Material, das eine mechanisch stabile Membran schafft. In einigen Ausführungsformen umfasst die Membran Silizium, Siliziumnitrid, Siliziumoxid, Titanoxid, Aluminiumoxid oder Graphen.

In einigen Ausführungsformen weisen die Nanoporen einen Durchmesser von etwa 1 bis etwa 20 nm auf. In einigen Ausführungsformen sind die Nanoporen etwa 0,5 bis etwa 10 μm voneinander beabstandet. In einigen Ausführungsformen umfasst das Nanoporen-Array von 2 bis etwa 100.000 Nanoporen.

In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner Anregen mit einer Lichtquelle der optischen Markierungen, mit den optisch markierten Oligonukleotiden verbunden sind. In einigen Ausführungsformen ist die Lichtquelle ein Laser.

In einigen Ausführungsformen werden die optischen Markierungen mit einer Vielzahl von Lichtquellen angeregt, wobei jede Lichtquelle ein anderes Lichtemissionsspektrum aufweist. In einigen Ausführungsformen werden die optischen Signale von der Oberfläche der Membran detektiert.

In einigen Ausführungsformen werden die optischen Signale mit einer Vorrichtung detektiert, die zum Aufnehmen von mindestens 500 Bildern pro Sekunde fähig ist. In einigen Ausführungsformen werden die optischen Signale mit einer Vorrichtung detektiert, die zum Aufnehmen von mindestens 1000 Bildern pro Sekunde fähig ist.

In einigen Ausführungsformen umfasst optische Detektion Paralleldetektion mehrerer Spektren, die auf unterschiedliche Bereiche eines Aufnahmesensors aufgespalten werden. In einigen Ausführungsformen beträgt die Anzahl der Bereiche 2. In anderen Ausführungsformen beträgt die Anzahl der Bereiche 4.

In einigen Ausführungsformen erzeugt jeder Bereich auf dem Aufnahmesensor eine individuelle Abbildung pro aufgenommenen Bild. In einigen Ausführungsformen stellt jede Abbildung eine einzelne Nukleobase in einer Nukleinsäuresequenz von Interesse dar.

In einigen Ausführungsformen werden die optischen Signale mit einer CCD-basierten Kamera detektiert. In anderen Ausführungsformen werden die optischen Signale mit einer EM-CCD-basierten Kamera detektiert. In noch anderen Ausführungsformen werden die optischen Signale mit einer CMOS-basierten Kamera detektiert.

In einigen Ausführungsformen werden die optischen Signale von beiden Seiten der Membran detektiert. In einigen Ausführungsformen werden die optischen Signale von der cis-Seite der Membran detektiert.

In einigen Ausführungsformen erzeugt Verdrängen eines optisch markierten Oligonukleotids von einem Trägermolekül, das durch eine einzelne Nanopore in dem Nanoporen-Array dringt, eine einzelnes detektierbares optisches Signal.

In einigen Ausführungsformen sind die optischen Signale Fluoreszenzsignale.

In einigen Ausführungsformen werden die Fluoreszenzsignale von einzelnen Nanoporen mit einer Rate von mindestens 500 Photonenbursts pro Sekunde erzeugt.

In einigen Ausführungsformen stellt jedes Fluoreszenzsignal eine einzelne Nukleobase in einer Nukleinsäuresequenz von Interesse dar. In einigen Ausführungsformen ermöglicht das Fluoreszenzsignal Nukleotididentifizierung auf der Basis von Fluoreszenzintensitätsverhältnissen.

In einigen Ausführungsformen ist die gesteuerte Translokation durch eine Nanopore in dem Nanoporen-Array über die Verdrängung von diskreten optisch markierten Oligonukleotiden von dem Trägermolekül selbstreguliert.

In einigen Ausführungsformen umfasst das Trägermolekül DNA oder RNA.

In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner Erzeugen des Trägermoleküls aus einer Nukleinsäuresequenz von Interesse durch einen zirkulären DNA-Umwandlungsprozess.

In einigen Ausführungsformen weist das Trägermolekül eine Länge von etwa 100 bis etwa 50.000 Nukleotiden auf. In einigen Ausführungsformen stellt jedes optisch markierte Oligonukleotid eine einzelne Nukleobase in einer Nukleinsäuresequenz von Interesse dar.

In einigen Ausführungsformen setzt die gesteuerte Translokation durch eine Nanopore in dem Nanoporen-Array kein Enzym oder Protein ein.

In einigen Ausführungsformen werden von etwa 100 bis etwa 500 optisch markierte Oligonukleotide pro Nanopore von einem einzelnen Trägermolekül verdrängt. In einigen Ausführungsformen werden mindestens 500 optisch markierte Oligonukleotide von einem einzelnen Trägermolekül verdrängt.

In einigen Ausführungsformen basiert die Selbstregulierung auf einen oder mehreren der folgenden Faktoren: (i) an die Membran angelegter Spannungsgradient; (ii) Temperatur; (iii) Anzahl von Nukleobasen in den verdrängten optisch markierten Oligonukleotiden; (iv) der G-C-Gehalt des verdrängten optisch markierten Oligonukleotids; (v) chemische Zusammensetzung des verdrängten optisch markierten Oligonukleotids; und (vi) Elektrolytbedingungen auf beiden Seiten der Membran.

In einigen Ausführungsformen steuert der Nanoporendurchmesser die Geschwindigkeit des Einfangens von Trägermolekülen.

In einigen Ausführungsformen sind die Nanoporen in dem Nanoporen-Array chemisch oder biologisch unmodifiziert.

In einigen Ausführungsformen umfassen die optisch markierten Oligonukleotide DNA, RNA, PNA oder LNA.

In einigen Ausführungsformen stellt das Trägermolekül die Sequenzinformation einer Nukleinsäuresequenz von Interesse dar.

In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Erhalten der Sequenz einer Nukleinsäuresequenz von Interesse aus der sequenziellen Detektion von optischen Signalen, die durch Verdrängen des optisch markierten Oligonukleotids von den Trägermolekülen erzeugt wird.

In einigen Ausführungsformen umfasst die Nukleinsäuresequenz von Interesse DNA.

In einigen Ausführungsformen werden die optischen Signale von optisch markierten Oligonukleotiden, die mit unterschiedlichen Trägermolekülen verbunden sind, gleichzeitig detektiert.

In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner Verbinden eines optischen Signals mit einer bestimmten Nanopore in dem Nanoporen-Array.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Vorrichtung zum Durchführen der oben beschriebenen Verfahren bereit.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

1(a) ist eine schematische Veranschaulichung der zwei Schritte in der DNA-Sequenzierungsmethodik. Erstens, die biochemische Massenumwandlung jedes Nukleotids der Ziel-DNA-Sequenz in ein bekanntes Oligonukleotid, gefolgt von Hybridisierung mit Molecular Beacons. Zweitens, Einfädeln des DNA/Beacon-Komplexes in eine Nanopore ermöglicht den optischen Nachweis der Ziel-DNA-Sequenz.

1(b) ist eine schematische Veranschaulichung des konzeptionellen Parallelausleseschemas. Jede Nanopore besitzt eine bestimmte Stelle im Sichtfeld des EM-CCD und ermöglicht daher das gleichzeitige Auslesen eines Arrays von Nanoporen.

2 ist eine graphische Darstellung der elektro/optischen Detektion des Entpackens einer sperrigen Gruppe (a) Repräsentative Ereignisse des Entpackens von 1-Bit- und 2-Bit-Komplexen mit Nanoporen kleiner 5 nm. Der elektrische Strom ist oben, während sich das optische Signal unten befindet. (b) Histogramme (n > 600 für jede Probe) der Gesamtphotonenzahl pro Ereignis zeigen, dass die meisten Komplexe in der 1-Bit-Probe (dunkleres Grau) einen Photonen-Burst erzeugen, während die meisten Komplexe in der 2-Bit-Probe (helleres Grau) zwei Photon-Bursts erzeugen. Durchgezogene Linien repräsentieren die Poisson-Anpassungen an die Histogramme mit Mittelwerten von 1,30 ± 0,06 und 2,65 ± 0,08 für die 1-Bit- bzw. 2-Bit-Proben. (c) Klassifizierung von Ereignissen unter Verwendung einer einzelnen Intensitätsschwelle, um die Anzahl von Photonen-Bursts pro Ereignis zu zählen. Die 1-Bit-Probe (die linken drei Spalten) zeigt, dass ~90% der Ereignisse 1 Photon-Burst aufweisen. Die 2-Bit-Probe (die rechten drei Spalten) zeigt, dass ~80% 2 Photonen-Bursts aufweisen.

3 ist eine graphische Veranschaulichung von Zweifarben-Entpackungsversuchen mit A647- (helleres Grau) und A680-Fluorophoren (dunkleres Grau). (a) Gesamtphotonenintensität. In jedem Kanal wird ein einzelner, deutlicher Peak beobachtet, was die Nanoporenlage wie auf dem EM-CCD abgebildet anzeigt. Die R-Werte, die Verhältnisse der gemessenen Fluoreszenzintensität in Kanal 1 vs. Kanal 2 betragen 0,2 und 0,4 für die beiden Fluorophore. (b) Elektro/optische Signale für charakteristische Entpackungsereignisse mit A647 (oben) und A680 (unten). (c) Das Akkumulieren Hunderter von Kurven für jede Probe ergab R = 0,20 ± 0,06 und 0,40 ± 0,05 für A647 bzw. A680. Die Kurven sind Anpassungen an Gauß-Funktionen.

4 ist eine graphische Veranschaulichung der optischen Nanoporennukleotididentifizierung mit zwei Fluorophoren. (a) 2 Farben ermöglichen den Aufbau von 2-Bit-Proben, die allen vier DNA-Nukleobasen entsprechen. (b) Die mit > 2000 Ereignissen erzeugte R-Verteilung offenbart zwei Modi bei 0,21 ± 0,05 und 0,41 ± 0,06, die den A647- bzw. A680-Fluorophoren entsprechen, in hervorragender Übereinstimmung mit Kontrolluntersuchungen. Die Kurve stellt eine doppelte Gauß-Anpassungsfunktion dar. (c) Charakteristische intensitätskorrigierte Fluoreszenzkurven von einzelnen 2-Farben-2-Bit-Entpackungsereignissen mit dem entsprechenden Bit benannt, der entsprechenden Base benannt und Angabe der Sicherheitsbewertung über dem Ereignis. Nach Benennen eines Bits werden die Intensitäten in den zwei Kanälen automatisch durch einen Computer-Code unter Verwendung eines R-Werts mit festgelegtem Schwellenwert korrigiert. Die Werte in Klammern stellen Sicherheitswerte für jede automatisch extrahierte Basis dar.

5 ist eine graphische Veranschaulichung von Multiporennachweis von DNA-Entpackungsereignissen. (a) Oberflächen-Plot, der die akkumulierte optische Intensität zeigt, zeigt deutlich die Positionen von drei Nanoporen, wie durch EM-CCD abgebildet, die in der SiN-Membran hergestellt wurden. Die hochauflösenden TEM-Aufnahmen der drei Nanoporen (jeweils ~5 nm) werden gezeigt. (b) Vier charakteristische Kurven zeigen das gleichzeitige Entpacken an zwei verschiedenen Nanoporen. Kurven des elektrischen Stroms enthalten keine Information über die Position von Nanoporen, während optische Kurven (verschiedene Grautöne) das Bestimmen der Position des Entpackungsereignisses ermöglichen.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Vorrichtung bereit, die ein Festkörpernanoporen-Array, eine Bildgebungsvorrichtung, die zum optischen Aufzeichnen von Signalen von einzelnen Molekülen fähig ist und ein Datenaufzeichnungssystem zur Bildaufnahme und-verarbeitung für Hochdurchsatzanalyse von optischen Signalen, die zur Analyse von Nukleinsäuren und insbesondere kostengünstiger DNA-Sequenzierung führen, umfasst. In einigen Ausführungsformen sind die optischen Signale Fluoreszenzsignale, die über Anregen mit einer Lichtquelle von optisch detektierbaren Oligonukleotiden, wenn diese während der Translokation eines Trägermoleküls durch eine Nanopore verdrängt (entpackt) werden, erzeugt werden. Die Verwendung der hier beschriebenen Festkörpernanoporen-Arrays ohne zusätzliche Modifizierung durch Enzyme, Proteine oder andere chemische Substanzen ist vorteilhaft. Da die Signale optisch im Gegensatz zu elektrisch detektiert werden, ist es darüber hinaus nicht notwendig, jede Nanopore über elektrische Schaltkreise zu verbinden oder anzusteuern.

Literaturverweise und Begriffsbestimmungen

Die Patent- und wissenschaftliche Literatur, auf die hier Bezug genommen wird, legt Wissen dar, das Fachleuten auf dem Gebiet zugänglich ist. Die hier zitierten US-Patente, veröffentlichten US-Anmeldungen, veröffentlichten ausländischen und internationalen Anmeldungen und Literaturverweise werden hiermit durch Bezugnahme in demselben Umfang aufgenommen, als wenn jede konkret und einzeln als durch Bezugnahme aufgenommen angegeben würde.

Wie hier verwendet, ist die „cis-Seite” die Membranseite, auf der sich die Probe anfänglich befindet und die „trans”-Seite ist die Membranseite, auf der sich die Probe oder ein Teil davon nach Translokation durch die Nanopore befindet.

Wie hier verwendet, ist „eine mechanisch stabile Membran” eine Membran, in der ein Array von Nanoporen hergestellt werden kann und die nicht reißt, wenn eine elektrische Kraft an die Membran angelegt wird.

Wie hier verwendet, ist „ein Trägermolekül” ein Polymer, das Monomereinheiten umfasst mit denen optisch detektierbare, markierte Moleküle reversibel binden können. In einigen Ausführungsformen umfasst das Trägermolekül 10–100.000 Monomereinheiten. Die Monomereinheiten sind elektrisch geladen, entweder positiv oder negativ, so dass auf sie in einem elektrischen Feld eingewirkt werden kann, um eine Translokation durch die Festkörper-Nanopore zu bewirken. In einigen Ausführungsformen sind Trägermoleküle negativ geladene Stränge einzelsträngiger Nukleinsäure, die entweder aus RNA- oder DNA-Monomeren besteht, an die optisch detektierbare, markierte Oligonukleotide gebunden (hybridisiert) werden können.

Wie hier verwendet, bezieht sich „ssDNA” auf einzelsträngige DNA und „dsDNA” bezieht sich auf doppelsträngige DNA.

Wie hier verwendet, soll die Angabe eines numerischen Bereichs für eine Variable vermitteln, dass die Erfindung mit der Variable gleich einem der Werte innerhalb dieses Bereichs ausgeführt werden kann. Für eine inhärent diskrete Variable, kann die Variable gleich einem beliebigen ganzzahligen Wert innerhalb des Zahlenbereichs einschließlich der Endpunkte des Bereichs sein. Ebenso kann für eine inhärent kontinuierliche Variable, die Variable gleich einem beliebigen realen Wert innerhalb des Zahlenbereichs einschließlich der Endpunkte des Bereichs sein. Beispielhaft und ohne Beschränkung kann eine Variable, die als Werte zwischen 0 und 2 aufweisend beschrieben wird, die Werte 0, 1 oder 2 annehmen, wenn die Variable inhärent diskret ist, und kann die Werte 0,0, 0,1, 0,01, 0,001 oder beliebige andere reale Werte ≥ 0 und ≤ 2, wenn die Variable inhärent kontinuierlich ist.

Wie hier verwendet, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, wird das Wort „oder” im einschließenden Sinn von „und/oder” und nicht im ausschließenden Sinn von „entweder/oder” verwendet.

Festkörpernanoporen-Arrays

Ein Array von Nanoporen oder Löchern wird in einer Festkörpermembran erzeugt, die von etwa 0,1 nm bis etwa 1 um dick ist. Die Festkörpermembran kann aus Silizium, Siliziumnitrid, Siliziumoxid, Titanoxid, Aluminiumoxid oder Graphem hergestellt werden. In einer konkreten Ausführungsform ist die Festkörpermembran aus Siliziumnitrid gefertigt. In einigen Ausführungsformen wird die Festkörpermembran aus einem geeigneten Material gefertigt, das die Erzeugung einer mechanisch stabilen Membran ermöglicht. Nach der Bildung eines Nanoporen-Arrays ist die Membran in der Regel gegenüber aufgebrachten Kräften stabil, d. h., der elektrischen Kraft die zur Translokation des Trägermoleküls verwendet wird und kollabiert während des Translokationsprozesses nicht.

In einigen Ausführungsformen weisen die Nanoporen einen Durchmesser im Bereich von etwa 1 bis etwa 20 nm, 1–5 nm, 3–5 nm, 2–6 nm, 3–6 nm oder 2–10 nm auf. Die Nanoporen können in einem geordneten Array angeordnet werden oder ein statistisch verteiltes Muster aufweisen. Der Abstand der Nanoporen kann fest oder variabel sein. In einigen Ausführungsformen werden die Nanoporen in einem festen Abstand von 0,5–10 μm voneinander, 1–8 μm voneinander, 2–10 μm voneinander, 1–2 μm voneinander oder 1,8–7,7 μm voneinander beabstandet.

Die Anzahl an Nanoporen in einem Nanoporen-Array kann variieren. In einigen Ausführungsformen umfasst ein Nanoporen-Array von 2 bis 1.000, von 1.000–10.000, von 10.000–100 oder mehr als 100.000 Nanoporen. Die Anzahl an Nanoporen in einem bestimmten Array ist variabel und hängt von der konkreten Anwendung ab. In einigen Ausführungsformen ist die Anzahl an Nanoporen derart, dass das Sichtfeld der Bildgebungsvorrichtung nicht überschritten wird, wodurch es der Vorrichtung ermöglicht wird, Abbildungen des gesamten Arrays aufzunehmen, ohne entweder die Bildgebungsvorrichtung oder das Array zu verschieben, um zusätzliche Sichtfelder aufzunehmen.

In einigen Ausführungsformen werden Festkörpernanoporen-Array-Chips ausgehend von einer doppelseitig polierten Siliziumscheibe mit einer Beschichtung von 30 nm dickem stressarmem Si3N4 (SiN) hergestellt. 30 × 30 μm2 große Fenster, bei denen beide Seiten der SiN-Membran freigelegt sind, können durch nasses KOH-Ätzen erzeugt werden. Nanoporen (3–5 nm Durchmesser) können unter Verwendung eines fokussierten Elektronenstrahls hergestellt werden, beispielsweise wie näher in Literaturverweis [16] beschrieben. Die gebohrten Nanoporen-Array-Chips werden gereinigt und unter kontrollierter Temperatur und Feuchtigkeit auf einer speziell entworfenen Teflonzelle mit Deckglasboden zusammengebaut (wie näher in Literaturverweis [13] beschrieben). Nanoporen werden unter Zugabe von entgastem und filtriertem 1 M KCl-Elektrolyt in die cis-Kammer und 1 M KCl mit 8,6 M Harnstoff in die trans-Kammer hydratisiert, um innere Totalreflexion(TIR)-Bildgebung zu ermöglichen. Ag/AgCl-Elektroden werden in jede Kammer der Zelle eingetaucht und an einen Headstage Axon 200B angeschlossen, der verwendet wird, um eine feste Spannung (300 mV für alle Versuche) an die Membran anzulegen und den Ionenstrom gegebenenfalls zu messen. Der Nanoporenstrom kann unter Verwendung eines 50 kHz Butterworth-Tiefpassfilters gefiltert werden und über eine DAQ-Karte bei 250 kHz/16 Bit abgetastet werden (PCI-6154, National Instruments, TX). Elektrische Signale können mit einem benutzerdefinierten LabView-Programm aufgenommen werden, wie in Literaturverweis [15] beschrieben.

In einigen Ausführungsformen werden Festkörpernanoporen wie in US-Pat. Nrn. 7,258,838, 7,846,738 und veröffentlichten US-Pat. Anm. Nrn. 2011-0053284 und von 2006-0003458 beschrieben hergestellt.

In einigen Ausführungsformen werden die Nanoporen-Arrays in Festkörpermaterialien hergestellt, wie näher in Literaturverweisen [19, 20] beschrieben.

Trägermoleküle

In einigen Ausführungsformen ist das Trägermolekül eine einzelsträngige Nukleinsäure, die DNA, RNA oder Analoga davon umfasst. DNA- und RNA-Analoga sind natürliche oder synthetische Varianten der 5 Nukleobasen (Adenin, Guanin, Cytidin, Thymidin und Uracil), Zucker (Ribose oder 2'-Desoxyribose) oder Phosphateinheiten. Das Trägermolekül kann natives genetisches Material sein oder synthetisch hergestellt werden, beispielsweise durch einen zirkulären DNA-Umwandlungsprozess. Das Trägermolekül ist mit optisch markierten Oligonukleotiden hybridisiert, so dass jedes optisch markierte Oligomer für eine einzelne Nukleobase oder eine einzelne Zielsequenz in der DNA von Interesse indikativ ist.

In einigen Ausführungsformen wird das Trägermolekül durch den Prozess der zirkulären DNA-Umwandlung hergestellt, wobei die Reihenfolge (Sequenz) jeder Nukleobase der Nukleinsäureprobe unter Erzeugung eines Polymers umgewandelt wird, wobei die Monomereinheiten die komplementäre Sequenz zu einer von vier entsprechenden, optisch markierten Oligomeren umfasst. Das Trägermolekülpolymer behält die geordnete Sequenz von Nukleobasen, wie sie in der ursprünglichen Nukleinsäureprobe vorhanden war, bei. Verfahren dafür sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden beispielsweise in WO 2010/053820 beschrieben.

In einigen Ausführungsformen hybridisiert das optisch markierte Oligomer bzw. hybridisieren die optisch markierten Oligomere direkt mit den Zielbereichen, d. h. kleinen Gensequenzen, Exons, Introns, regulatorischen Einheiten usw., die für eine genetische Veränderung oder einer Mutation in der Nukleinsäureprobe indikativ sind. In diesem Beispiel wird die relative Position von zwei oder mehr optisch markierten Oligomeren entlang der Nukleinsäureträgermolekülprobe verwendet, um genetische Anomalien zu identifizieren. Während des Verdrängens eines optisch markierten Oligonukleotids von dem Trägermolekül wird ein Photon-Burst von einem markierten Oligonukleotid erzeugt, der von dem Bildgebungssystem abgebildet wird. Jede einzelne Nanopore ist zur Translokation von Trägermolekülen unabhängig von anderen Nanoporen im Array in der Lage. Ein bestimmtes Trägermolekül kann Hunderte von Verdrängungsereignissen erzeugen, die während eines Translokationsereignisses aufgezeichnet werden. Die aufgenommenen Signale werden verarbeitet und können zur Erzeugung der Nukleinsäuresequenzinformationen verwendet werden.

Optisch markierte Oligonukleotide

In einigen Ausführungsformen ist das optisch markierte Oligonukleotid eine einzelsträngige Nukleinsäure aus 10–20, 20–30 oder 30–50 Nukleotiden. In einigen Ausführungsformen umfasst das optisch markierte Oligonukleotid DNA, RNA, PNA, LNA oder ein Analogon davon mit einem oder mehreren daran angebrachten optischen Markierungen. In einigen Ausführungsformen ist an dem optisch markierten Oligonukleotid ein Fluorophor und einen Quencher angebracht. Analoga davon sind natürliche oder synthetische Varianten der 5 Nukleobasen (Adenin, Guanin, Cytidin, Thymidin und Uracil), Zucker (Ribose oder 2'-Desoxyribose) oder Phosphateinheiten.

In einigen Ausführungsformen weist das optisch markierte Oligonukleotid die Konfiguration eines Molecular Beacon auf. Molecular Beacons sind haarnadelförmige Moleküle mit einem intern gequenchten Fluorophor, dessen Fluoreszenz wiederhergestellt wird, wenn sie mit einer komplementären Zielnukleinsäuresequenz binden. Ein Molecular Beacon ist ein Oligonukleotid mit einer Gesamtlänge von 12–30 Nukleotiden, einem Fluorophor an oder nahe einem Ende und einem Quencher-Molekül an oder nahe dem anderen Ende, wobei die Enden in der Lage sind, eine intramolekulare doppelsträngige Konfiguration im Bereich von 4–10 Basen an jedem Ende zu bilden, wodurch der Fluorophor und der Quencher zusammengeführt werden.

Optische Markierungen

In einigen Ausführungsformen werden Laser als Lichtquelle zur Anregung von Fluoreszenzmarkern verwendet, beispielsweise Fluorophore in optisch markierten Oligonukleotiden, die das optisch detektierbare Signal erzeugen. Organische Farbstoffe, wie beispielsweise Fluorophore, sind nur ein Beispiel der optischen Markierungen, die verwendet werden können. Andere Beispiele umfassen anorganische optische Markierungen, wie beispielsweise Goldpartikel oder Quantenpunkte. Da Fluorophore optimale Erregungswellenlängen aufweisen, können Laser mit verschiedenen Wellenlängen jeweils mit einem unterschiedlichen Emissionsspektrum verwendet werden. In einigen Ausführungsformen kann ein einziger Laser verwendet werden, um mehrere Fluorophore anzuregen. In anderen Ausführungsformen werden mehrere Laser verwendet, um mehrere Fluorophore anzuregen.

Viele aus dem Stand der Technik bekannte Fluorophore sind als optische Markierungen brauchbar, beispielsweise FAM, TET, HEX, JOE, VIC, Cy2, Cy3, TMR, Oyster-Farbstoffe, ROX, Texasrot, Cy5, Cy7, IRD700, IRD 770, IRD 800, Alexa und Atto-Farbstoffe, wobei die einzige Voraussetzung ist, dass, wenn mehrere (z. B. 2–4) Fluorophore verwendet werden, der jeweilige Fluorophor von den anderen verwendeten Fluorophoren optisch auflösbar ist. Eine etwaige spektrale Überlappung zwischen Fluorophoren gibt Anlass zu einiger Unsicherheit bezüglich seiner Fähigkeit, eindeutig identifiziert zu werden. Quencher sind ebenfalls aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt, beispielsweise Dabcyl, Eclipse, Iowaschwarz FQ und Iowaschwarz RQ, BHQ-1, BHQ-2, DDQ-I DDQ-II, QSY-7 und QSY-21. Einige Quencher, beispielsweise BHQ, verleihen zusätzlich der Oligonukleotid-Hybridisierung mit dem Träger erhöhte Stabilität mit einer Erhöhung der Schmelztemperatur um etwa 4°C. In einigen Ausführungsformen besteht die Fluorophor-Quencher-Kombination aus einem Cyanin-Fluorophor und einem Quencher aus der Familie der BHQ-Quencher.

In einigen Ausführungsformen liegt die Anzahl der einzeln optisch detektierbaren Fluorophore im Bereich von 1–5 oder beträgt mehr als 5. Jeder Fluorophor muss als einzelnes Molekül spezifisch optisch auflösbar sein. Bei der Anwendung von optischer Detektion bei der DNA-Sequenzierung entspricht bei einigen Ausführungsformen das optische Signal von einem Farbstoff einer Nukleobase und es werden insgesamt vier Fluorophore verwendet. Es ist jedoch möglich, mehrere Fluorophore für eine einzelne Nukleobase zu verwenden. Zusätzlich kann es in einigen Anwendungen erwünscht sein, eine zusätzliche Base, wie beispielsweise Uracil, so dass die fünf Nukleobasen Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C), Thymidin (T) und Uracil (U) sind.

Detektion optischer Signale

In einigen Ausführungsformen wird zur optischen Detektion ein Hochgeschwindigkeitsbildgebungsvorrichtung mit einem breiten Sichtfeld, die zum Betrachten des gesamten Arrays von Nanoporen fähig ist, verwendet. Die Bildgebungsvorrichtung ist fähig, zig Photonen aus einzelnen Fluorophoren unter Verwendung innerer Totalreflexion (TIR) von der Oberfläche der Membran optisch zu detektieren. Die Bildgebungsvorrichtung erfasst Bilder mit hoher Bildrate, zum Beispiel mit einer Rate von mindestens 500 Bildern pro Sekunde. Der Sensor der Bildgebungsvorrichtung ist in der Lage, Bereiche des Aufnahmesensors aufzuspalten, wobei jeder Bereich einem anderen Spektralbereich des Lichts entspricht, zwei Bereiche Minimum. In einigen Ausführungsformen werden jedoch vier Bereiche definiert.

Beispiele für geeignete Bildgebungsvorrichtungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine CCD-basierte Kamera, eine CMOS-CCD-basierte Kamera und eine EM-CCD-basierte Kamera. CCD steht für Charge-Coupled Device; CMOS steht für Complementary Metal-Oxide-Semiconductor. Dies sind die Chips, auf welchen durch ein Objektiv der Bildgebungsvorrichtung erfasstes Licht fokussiert wird. Diese Signale werden im Inneren der Bildgebungsvorrichtung weiter verarbeitet und schließlich wird das Bild auf einem Speichermedium aufgezeichnet, ob Magnetband, DVD oder eine interne oder externe Festplatte. Kameras mit mehreren Bildsensoren verwenden einen Chip pro Lichtprimärfarbe (rot, grün und blau) und verwenden einen separaten Bildprozessor, um die drei Signale zu einem Farbvideobild zu kombinieren. Neuere und billigere CMOS-Chips bündeln sowohl einen Bildsensor als auch einen Bildprozessor in einem einzelnen Chip. CCD-Ausgestaltungen verwenden typischerweise einen von dem eigentlichen Lichterfassungssensor getrennten Bildprozessor. EM-CCD ist eine quantitative Digitalkameratechnologie, die zum Detektieren von Einzelphotonenereignissen unter Beibehaltung hoher Quanteneffizienz fähig ist, was durch eine einzigartige in den Sensor eingebaute Elektronenvervielfachungsstruktur erreichbar ist. Im Gegensatz zu einer herkömmlichen CCD ist eine EM-CCD nicht vom Ausleserauschen des Ausgangsverstärkers beschränkt, auch nicht wenn sie bei hohen Auslesegeschwindigkeiten betrieben wird. Dies wird durch Hinzufügen eines Festkörperelektronenvervielfachungs (EM)registers an das Ende des normalen seriellen Registers erreicht; dieses Register ermöglicht es, schwache Signale zu multiplizieren, bevor ein Ausleserauschen durch den Ausgangsverstärker hinzugefügt wird, wodurch das Ausleserauschen vernachlässigbar wird. Das EM-Register weist mehrere hundert Stufen auf, die höher als normale Taktspannungen verwenden. Bei der Übertragung der Ladung durch jede Stufe wird das Phänomen der Stoßionisation verwendet, um sekundäre Elektronen zu erzeugen, und somit EM-Verstärkung. Wenn dies über mehrere hundert Stufen erfolgt, kann (Software) die erhaltene Verstärkung von einmal zu Hunderten oder sogar Tausenden von Malen gesteuert werden.

In einigen Ausführungsformen ist das optische Bildgebungssystem so gestaltet, dass sich Laser und Bildgebungsvorrichtung auf gegenüberliegenden Seiten der Membran befinden, wobei sich die Bildgebungsvorrichtung auf der cis-Seite der Membran befindet. Die cis-Seite der Membran ist diejenige Seite, auf der die Probe eingeführt wird und wo diese sich befindet, bevor sie die Membran durchdringt. In einer beispielhaften Ausgestaltung befinden sich die Laser und die Kamera auf der gleichen Seite der Nanoporenmembran. Die cis- und trans-Seite sind gegenüberliegende Seiten der Membran, an welche negative bzw. positive Polaritäten angelegt werden. Die Richtung der Polarität richtet sich nach der Ladung der zu verlagernden Probe.

In einigen Ausführungsformen zeichnet das Bildgebungssystem Signale von Photonen-Bursts von optisch markierten Oligonukleotiden auf, wenn sie während der Translokation durch eine einzelne Nanopore von einem Trägermolekül verdrängt werden (d. h. entpackt). In einer konkreten Ausführungsform sind die optischen Markierungen Fluorophore. Die Verwendung von Fluorophoren ermöglicht einem die Verbindung des Spektralsignals eines bestimmten Fluorophors mit einer bestimmten Nukleobase.

In einigen Ausführungsformen ist das optische Signal eine Intensität, wobei ein Intensitätsverhältnis verwendet wird, um das Signal einer bestimmten Nukleobase zuordnen. Die Berechnung der Intensitätsverhältnisse erfolgt durch Aufsummieren der aller Photonen, die innerhalb vordefinierter Wellenlängenbänder, die mit jedem der verwendeten Fluorophore verbunden sind, emittiert werden. Anschließend werden die Verhältnisse von jedem der Bänder zu den anderen Bändern berechnet. Dies bietet eine robuste Möglichkeit zwischen 2 oder mehr emittierten Farben unabhängig von ihrer absoluten Intensitäten zu unterscheiden.

In einigen Ausführungsformen kann eine einzelne Laserquelle verwendet werden, um zwei verschiedene Fluoreszenzmarkierungen anzuregen. Dies verringert die Anzahl an erforderlichen Laserquellen. In solchen Ausführungsformen gibt es eine bedeutsame spektrale Überlappung bei der Emission der beiden Fluorophore, und daher gibt es Cross-Talk zwischen den beiden Detektionskanälen. Durch Verwendung des relativen Verhältnisses der Intensitäten der Fluorophoren in den beiden Detektionskanälen kann man zwischen den beiden Farbstoffen unterscheiden. Ein Vorteil des optischen Nanoporen-Arrays, wie hier beschrieben, besteht darin, dass viele Tausende einzelner Translokationen parallel aufgezeichnet werden können, wodurch Ultrahochdurchsatzsequenzierung ermöglicht wird. erfass

In einigen Ausführungsformen halbiert die Einführung eines Vierfarben-Detektionssystems, das ein Fluorophor für jede Base verwendet, die Länge der umgewandelten DNA (d. h. die Länge des Trägermoleküls) und verdoppelt die Detektionsgeschwindigkeit, während gleichzeitig die Genauigkeit bei der Benennung der Basen steigt. Ein Vierfarbensystem kann auch die in dem Zweifarbensystem infolge möglicher Frameshifts erzeugten Fehler eliminieren.

Da die Signale durch eine optische Bildgebungsvorrichtung aufgezeichnet werden besteht außerdem keine Notwendigkeit zum Aufzeichnen elektrischer Signale von jeder Nanopore während der Translokation, wodurch die Herstellung von kostengünstiger, niederkomplexer Festkörper-Nanoporen-Arrays.

Regulierung der Translokation durch die Nanoporen

In einigen Ausführungsformen kann der Nanoporen-Translokationsprozess reguliert werden, um die Geschwindigkeit, mit der das Trägermolekül durch die Nanopore transloziert, zu steuern. In einer Ausführungsform steuert die Ausgestaltung der optisch markierten Oligonukleotide die Verdrängungsrate, wobei Oligonukleotidlänge (Anzahl an Nukleobaseeinheiten), der G-C-Gehalt und/oder chemische Zusammensetzung (DNA, RNA, PNA, LNA oder ein Analogon davon) eine Ebene der Steuerung oder Selbstregulierung darstellt, die die Geschwindigkeit bestimmt, mit der ein Molekül durch eine bestimmte Nanopore transloziert. Die Verdrängungsrate kann auch durch externe physische Steuerelemente, wie beispielsweise Spannungsgradienten an der Membran, Temperatur und Elektrolytbedingungen auf beiden Seiten der Membran gesteuert werden. Der Nanoporendurchmesser kann auch variiert werden, um die Einfang- oder Eintrittsrate des Trägermoleküls in die Nanopore zu regulieren. Jedes dieser regulatorischen Elemente ist unabhängig voneinander variabel.

Der Entpackungsprozess eines DNA-Strangs von einem anderen wird durch eine Energiebarriere bestimmt. In einigen Ausführungsformen unterliegt der Entpackungsprozess der Selbstregulierung und hängt von einem oder mehreren der Folgenden ab: (i) an die Membran angelegter Spannungsgradient (dieser erhöht die Kraft auf das Molekül und verringert somit die Energiebarriere des Entpackens; (ii) Temperatur (Temperatur kann ebenfalls die thermodynamische Stabilität der Duplex beeinflussen und somit die Energiebarriere des Entpackens ändern; (iii) die Anzahl von Nukleobasen in den verdrängten optisch markierten Oligonukleotiden bestimmt die Höhe der Energiebarriere; (iv) der G-C-Gehalt des verdrängten optisch markierten Oligonukleotids bestimmt die Höhe der Energiebarriere; (v) die chemische Zusammensetzung des verdrängten optisch markierten Oligonukleotids (z. B. DNA, RNA, PNA, LNA oder einem Analogon davon; chemisch unterschiedliche Nukleinsäurezusammensetzungen weisen unterschiedliche Bindungsstärken auf und ändern somit die Energiebarriere des Entpackens; und (vi) Elektrolytbedingungen auf beiden Seiten der Membran haben jeweils einen Einfluss auf die aufgebrachte Kraft (in einer Weise ähnlich zu (i), während sie auch das Screening der Ladung entlang der DNA beeinflussen und somit die Energiebarriere des Entpackens beeinflussen).

In einigen Ausführungsformen erfordern die Festkörpernanoporen keine Modifizierung durch chemische oder biologische Moleküle, um funktionsfähig zu sein. Die Translokation des Trägermoleküls oder von Produkten davon unterliegt keiner Geschwindigkeitsbestimmung durch eine Enzymwirkung, wodurch eine schnelle enzymfreie Auslesung bereitgestellt wird.

Anwendungen für Nukleinsäuresequenzierung

Einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen ein Verfahren zur optischen Bildgebung einzelner Moleküle auf Nanoporen-Arrays, das zur Hochdurchsatz-, präzisen und kostengünstigen Nukleinsäureanalyse oder Nukleinsäuresequenzierung brauchbar ist. Das Verfahren bietet Vorteile, indem es die Hochdurchsatzanalyse von optischen (mehrfarbig fluoreszenten) Signalen, die die Reihenfolge einzelner, entweder in DNA oder RNA vorhandener Nukleotide darstellt, ermöglicht. Das Verfahren umfasst eine niederkomplexe Festkörpermembran, die ein Array von gebohrten Nanoporen oder Löchern (Nanoporen-Array), eine Lichtquelle, eine Bildgebungsvorrichtung und ein Datenaufzeichnungssystem, das zur Bildaufnahme und Verarbeitung der Signale fähig ist, wenn optisch detektierbare markierte Oligonukleotide während der gesteuerten Translokation durch eine Nanopore von einem Trägermolekül verdrängt (entpackt) werden, umfasst.

In einigen Ausführungsformen wandelt die biochemische Vorbereitung (zirkuläre DNA-Umwandlung) der Ziel-DNA-Moleküle jede Nukleobase in eine Form um, die direkt unter Verwendung einer modifizierten Festkörpernanopore ausgelesen werden kann. Der massiv parallele Umwandlungsprozess wird off-line durchgeführt und erfordert weder Enzymimmobilisierung noch einen Amplifikationsschritt. Aufgrund dieses biochemischen Vorbereitungsschritts unterliegen die Nanoporenauslesegeschwindigkeit und die Auslesedauer keiner Beschränkung durch Enzyme. Im Gegensatz zu Verfahren, die elektrische Signale zur Untersuchung von Biomolekülen in Nanoporen verwenden, verwenden die hier beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen optische Detektion zur DNA-Sequenzdetektion. Ein benutzerdefiniertes Total Internal Reflection (TIR)-Verfahren, das eine hohe Raum-Zeit-Auflösung und optische Weitfeld-Detektion von einzelnen, durch eine Nanopore translozierenden DNA-Molekülen ermöglicht, wird für die schnelle 2-Farben-Einzelmoleküldetektion verwendet (das TIR-Verfahren wird in Literaturverweis [13] näher beschrieben). In einigen Ausführungsformen ist die Vorrichtung in der Lage, gleichzeitig Signale von mehreren Nanoporen optisch zu detektieren.

Ein beispielhafter Ansatz zur DNA-Sequenzierung umfasst zwei Schritte (Figur Ia): in der ersten Stufe wird jedes der vier Nukleotide (A, C, G und T) in der Ziel-DNA in ein vordefiniertes Nukleinsäurepolymer umgewandelt, welches mit Molecular Beacons (z. B. optisch markierte Oligonukleotide), die einen bestimmten Fluorophor tragen, beispielsweise wie in Literaturverweis [12] beschrieben, hybridisiert wird. Diese DNA-Umwandlung kann beispielsweise unter Verwendung eines als „zirkuläre DNA-Umwandlung” (CDC) bezeichneten Verfahrens durchgeführt werden. Zirkuläre DNA-Umwandlung ist aus dem Stand der Technik bekannt und kann beispielsweise wie in US-Pat. Nr. 6,723,513 durchgeführt werden. Im zweiten Schritt (Figur Ia) wird das hybridisierte Molekül durch eine Nanopore in einem Nanoporen-Array transloziert und optische Signale werden detektiert, wenn die Molecular Beacons von dem umgewandelten DNA-Molekül (d. h. dem Trägermolekül) dissoziieren.

In Ausführungsformen, in denen Zwei-Farben-Auslesung (d. h. zwei Arten von Fluorophoren) verwendet wird, sind die vier Sequenzen Kombinationen von zwei vordefinierten einzigartigen Sequenzen, Bit „0” und Bit „1”, so dass ein A „1 1” wäre, ein G „1 0” wäre, ein T „0 1” wäre und schließlich ein C „0 0” wäre (Figur Ia). Zwei Arten von Molecular Beacons, die zwei Arten von Fluorophoren tragen, hybridisieren spezifisch mit „0”- und „1”-Sequenzen. Die umgewandelte DNA und hybridisierte Molecular Beacons werden elektrophoretisch durch eine Festkörpernanopore gefädelt, wobei die optisch markierten Oligonukleotide, die auch als Beacons bezeichnet werden, sequenziell abgestreift (verdrängt oder entpackt) werden. Jedes Mal, wenn ein Beacon abgestreift wird, wird das Quenchen eines neuen Fluorophor aufgehoben, was zu einem Burst von Photonen führt, der an dem Ort der Nanopore aufgezeichnet wird (1b). Die Sequenz von Zweifarben-Photonen-Bursts an jeder Nanoporenposition (in Figur Ib dargestellt) ist der Binärcode der Ziel-DNA-Sequenz. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit, einzelne Basen zu detektieren und ermöglicht eine enzymfreie Auslesung. Außerdem erlaubt dieses Verfahren Weitfeld-Bildgebung und raumfeste Nanoporen ermöglichen eine einfache Anpassung an die gleichzeitige Detektion mehrerer Nanoporen mit einer ladungsgekoppelten Elektronenvervielfachungsvorrichtungs (EM-CCD)-Kamera (schematisch in 1b veranschaulicht).

In einigen Ausführungsformen verwendet das Auslesen eine Festkörpernanopore, um hybridisierte Molecular Beacons von umgewandelten einzelsträngigen DNA-Molekülen (Trägermolekülen) abzustreifen. Dies erfordert im Allgemeinen die Verwendung von Poren im < 2 nm-Bereich, weil der Querschnittsdurchmesser von doppelsträngiger DNA (dsDNA) 2,2 nm beträgt. Die Wahrscheinlichkeit eines DNA-Eintritts in so kleine Poren ist jedoch viel kleiner als in größere Poren, was die Verwendung einer größeren Menge an DNA erfordert. Darüber hinaus stellt die Herstellung von kleinen Poren technische Herausforderungen dar, da die Fehlertoleranz gering ist, und die Schwierigkeit bei Arrays mit hoher Nanoporendichte sprunghaft ansteigt. Es wurde entdeckt, dass das kovalente Anbringen einer 3–5 nm großen „sperrigen” Gruppe (z. B. ein Protein oder ein Nanopartikel) an dem Molecular Beacon wirksam den Molekülquerschnitt des Komplexes auf 5–7 nm erhöht, was die Verwendung von Nanoporen im Größenbereich von 3–6 nm ermöglicht. Dies erhöht die Einfangrate von DNA-Molekülen um das 10-Fache oder mehr und erleichtert den Herstellungsprozess der Nanoporen-Arrays.

In einigen Ausführungsformen wird benutzerdefinierte TIR-Bildgebung verwendet, um Hochgeschwindigkeits-Einzelmoleküldetektion einzelner Fluorophore in der Nähe der aufgehängten Siliziumnitrid-Membran zu erreichen. Der Brechungsindex der Lösung der trans-Kammer kann eingestellt werden, so dass TIR an der SiN-Membran erzeugt werden, wobei verhindert wird, dass Licht in die cis-Kammer fortschreitet, wodurch zusätzlicher Hintergrund reduziert wird. Die Zelle kann an einem Hoch-NA-Objektiv (Olympus 60X/1.45) befestigt werden und TIR kann durch Fokussieren des einfallenden 640 nm-Laserstrahls (iFlex2000, Point-Source UK) auf einen außeraxialen Punkt an seiner hinteren Brennebene optimiert werden, wodurch der Einfallswinkel gesteuert wird. Fluoreszenzemission kann mit einem dichroitischen Spiegel (z. B. Semrock, FF685Di01) in zwei getrennte optische Wege aufgespalten werden und die beiden Bilder können nebeneinander auf eine EM-CCD-Kamera (z. B. Andor, iXon DU-860) projiziert werden. Die EM-CCD arbeitet bei maximaler Verstärkung und einer Integrationszeit von 1 ms. Synchronisation zwischen den elektrischen und optischen Signalen kann durch Anschluss des „Feuer”-Impulses der Kamera an eine Zählerkarte (z. B. PCI-6602, National Instruments) erreicht werden, die den gleichen Abtasttakt und Startauslöser wie die Haupt-DAQ-Karte teilte. Der vereinte Datenstrom kann einzigartige Zeitstempel zu Beginn jedes CCD-Bilds enthalten, der mit der Ionenstromabtastung synchronisiert wurden. Zwei separate Kriterien können für die Klassifizierung jedes Ereignisses verwendet werden. Das erste Kriterium kann ein abrupter Abfall des Ionenstroms unterhalb eines benutzerdefinierten Schwellenwerts und Verbleiben auf diesem Niveau für mindestens 100 μm vor der Rückkehr zu dem ursprünglichen Zustand sein. Das zweite Kriterium kann eine Erhöhung der Photonenanzahl nur im Bereich der Nanopore während der Ereignisverweildauer (Zeit, wenn das Signal unterhalb des Schwellenwerts bleibt) in den entsprechenden CCD-Bildern sein.

Die Erfindung wird weiter durch das folgende Beispiel veranschaulicht, das nicht als beschränkend ausgelegt werden soll. Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, oder ist mit nicht mehr als Routineexperimenten in der Lage, zahlreiche Äquivalente zu den hier beschriebenen konkreten Substanzen und Verfahren zu ermitteln. Solche Äquivalente sollen im Schutzbereich der nachfolgenden Ansprüche eingeschlossen werden, die den nachfolgenden Beispielen folgen.

BEISPIELEBeispiel 1

Avidin (4,0 × 5,5 × 6,0 nm) wurde an einen biotinylierten Molecular Beacon, der ein Fluorophor-Quencher-Paar (ATT0647N-BHQ2, abgekürzt „A647-BHQ”) enthält, gebunden. Sowohl dieser Beacon und als auch ein ähnlich aufgebautes Oligonukleotids, das einen Quencher an einem Ende aber kein Fluorophor am anderen Ende enthält, wurden mit einer Ziel-ssDNA hybridisiert („1-Bit”-Probe). Ein ähnlicher Komplex wurde synthetisiert, der zwei Beacon-Moleküle enthält („2-Bit”-Probe), wie schematisch in 2a dargestellt. Untersuchungen an der Gesamtmenge zeigten, dass, im hybridisierten Zustand der A647-Fluorophor ~95% durch den benachbarten BHQ-Quencher gequencht wird. Angesichts dieser extrem hohen Quencheffizienz können Fluoreszenz-Bursts auf der Einzelmolekülebene nur detektiert werden, wenn Strangtrennung auftritt.

Nanoporenversuche sowohl für die 1-Bit-Probe (mit 1-Beacon-Molekül pro komplex) als auch für die 2-Bit-Probe (mit zwei Beacon-Molekülen pro Komplex) wurden unter Verwendung eines 640-nm-Laser durchgeführt und mit 1.000 Bildern pro Sekunde unter Verwendung einer EM-CCD-Kamera abgebildet. 2a zeigt typische Entpackungsereignisse für die beiden Proben mit einem Beacon pro Komplex in der 1-Bit-Probe und zwei Beacons pro Komplex in der 2-Bit-Probe. Elektrische Signale werden in schwarz und optische Signale, die synchron mit den elektrischen Signalen an der Nanoporenposition gemessen werden, in unterschiedlichen Graustufen dargestellt. Eine abrupte Abnahme im elektrischen Strom bezeichnet den Eintritt des Moleküls in die Pore und die Pore ist frei, wenn das elektrische Signal wieder in den offenporigen oberen Zustand zurückkehrt. Es sei angemerkt, dass die hier beobachteten Entpackungsereignisse durch die Anwesenheit der sperrigen Gruppe wesentlich länger sind als zuvor berichtet (Literaturverweis [13]). Die optischen Signale zeigen eindeutig entweder einen oder zwei Photonen-Bursts für die 1-Bit- bzw. 2-Bit-Proben. Dies ist zu erwarten, da die Fluorophore vor Erreichen der Pore gequencht sind und sofort nachdem die Beacons von dem Templat entpackt worden sind erneut selbstgequencht sind. Eine einfache Aufsummierung der optischen Intensität während eines Ereignisses, wie durch das elektrische Signal definiert, ergibt Poisson-Verteilungen für die beiden Proben (durchgezogene Linien in 2b) mit Mittelwerten von 1,30 ± 0,06 für die 1-Bit-Probe und das Doppelte 2,65 ± 0,08 für die 2-Bit-Probe (n > 600 Ereignisse in jedem Fall, Fehler stellen die STD dar). Dies beweist, dass unabhängig von einem Modell, das verwendet wird, um einen Photon-Burst zu definieren, ein einzelnes Entpackungsereignis für die 1-Bit-Probe aufgetreten ist und zwei Entpackungsereignisse für die 2-Bit-Proben aufgetreten sind. Darüber hinaus wurde durch eine Intensitätsschwellenwertanalyse (durchschnittliche Intensität + 2 STD) festgestellt, dass nahezu 90% der gesammelten Ereignisse in der 1-Bit-Probe einen einzelnen Fluoreszenz-Burst enthielten, während in der 2-Bit-Probe ~80% der gesammelten Ereignisse 2 derartige Bursts zeigten (2c). Diese Daten zeigen, dass es möglich ist, bei einzelnen Entpackungsereignissen, die unter Verwendung einer 3–5 nm-Nanopore stattfinden, optisch zwischen 1-Bit- und 2-Bit-Proben zu unterscheiden.

Zur Unterscheidung zwischen allen vier Nukleotiden wurde das System von einem 1-Farben auf ein 2-Farben-Codiersystem unter Verwendung von zwei Fluorophoren mit hoher Quantenausbeute, A647 (ATTO647N) und A680 (ATTO680), die gleichzeitig durch denselben 640 nm-Laser angeregt werden, erweitert. Das optische Emissionssignal wurde auf Kanäle 1 und 2 unter Verwendung eines dichroitischen Spiegels aufgespalten und nebeneinander auf der gleichen EM-CCD-Kamera abgebildet. Eine Zweifarbenintensitätsanalyse wurde durch Ablesen der Intensität in einem 3×3 Pixel-Bereich mittig an der Nanoporenposition durchgeführt (siehe beispielsweise3a). Da die Emissionsspektren der beiden Fluorophore überlappen, „sickert” ein Bruchteil der A647-Emission in den Kanal 2, und ein Bruchteil von A680 „sickert” in Kanal 1. Es wurden zwei Kalibrierungsmessungen mit 1-Bit-Komplexe, die mit A647- oder A680-Fluorophoren markiert waren, durchgeführt (3a). Deutlich zu erkennen ist nach einer Akkumulation von jeweils > 500 Entpackungsereignissen ein einzelner ausgeprägter Peak in jedem Kanal, der der Position der Nanopore entspricht. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten (R) in Channel 2 vs. Kanal 1 beträgt 0,2 für die A647-Probe und 0,4 für die A680-Probe.

Charakteristische Ereignisse (von mehr als 500) für jede der beiden Proben und die entsprechenden Verteilungen von R, sind in den 3b bzw. 3c dargestellt. Während eines jeden Translokationsereignisses wird ein einzelner herausragender Fluoreszenz-Peak (Stromkurven in Schwarz dargestellt) mit einer Intensität > 3 Mal größer als die Standardabweichung der Fluoreszenzgrundlinienschwankungen beobachtet. Auszählen aller Einzelmolekülereignisse ergab R = 0,20 ± 0,06 bzw. 0,40 ± 0,05 (Mittelwert ± STD) für A647 bzw. A680, in völliger Übereinstimmung mit den Verhältnissen für die in 3a gezeigte akkumulierte Fluoreszenz (für alle Ereignisse). R folgt einer Gaußschen Verteilung, die durch die durchgezogenen Linienanpassungen in 3c dargestellt wird. Diese Kontrollmessungen zeigen, dass es möglich ist, R zu verwenden, um die Identität einzelner Fluorophore zu bestimmen. Eine Unterscheidung wurde unter Verwendung der Kalibrierdaten automatisch in einem benutzerdefinierten LabView-Code durchgeführt (3c). Der Fehler bei der Bestimmung von jedem der beiden Farbstoffe kann aus dem Überlappungsbereich zwischen den Verteilungen berechnet werden und ergibt < 9% für A647 und < 13% für A680. Die Datenanalyse erfolgte mit IGOR Pro (Wavemetrics), und Anpassungen wurden erzeugt um Chi-Quadrat zu optimieren.

Unter Verwendung der in 3c angegebenen Kalibrierverteilungen wurde die Fähigkeit, die Produkte aus der zirkulären DNA-Umwandlung, die die vier 2-Bit-Kombinationen für alle vier Basen umfassen, nämlich 11(A), 00 (C), 01 (T) und 10 (G), wobei „0” und „1” den A647- bzw. A680-Beacon entsprechen, zu identifizieren getestet. Die Analyse von > 2000 Entpackungsereignissen, in denen 2 ausgeprägte Photonen-Bursts detektiert wurden, ergab eine bimodale Verteilung von R mit zwei Modi bei 0,21 ± 0,05 und 0,41 ± 0,06 (4b) in völliger Übereinstimmung mit den Kalibriermessungen (3c). Alle Photonen-Bursts mit R < 0,30 wurden als „0” und diejenigen mit R > 0,30 als „1” klassifiziert (0,30 ist das lokale Minimum der Verteilung in 4b). Die Verteilung von R wurde auch verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer falschen Klassifizierung zu berechnen. Dies bietet uns eine weitere statistische Möglichkeit, die beiden Kanäle für eine optimale Unterscheidung zwischen den beiden Fluorophoren zu kalibrieren. 4c zeigt charakteristische 2-Farben-Fluoreszenzintensitätsereignisse, die die Einzelmolekülidentifizierung aller vier DNA-Basen zeigt.

Die Robustheit der Zweifarbenidentifizierung wird in erster Linie den hervorragenden Signal/Hintergrund-Niveaus der Photonen-Bursts und der Trennung zwischen den Fluorophorintensitätsverhältnissen für die beiden Kanäle zugeschrieben. Ein Computeralgorithmus zur Durchführung einer automatischen Peak-Erkennung wurde entwickelt, der auch Zufallsrauschen (z. B. falsche Spikes) in den Fluoreszenzsignalen ausfiltert und die Bitsequenz unter Verwendung der Kalibrierverteilungen (3c) identifiziert, gefolgt von Basenbenennung. Der Algorithmus gibt zwei Sicherheitswerte aus, einen für Bit-Benennung und den anderen für die Basenbenennung. Typische Ergebnisse sind in 4c gezeigt. Der Sicherheitswert für jede aus den rohen Intensitätsdaten (Bereich zwischen 0 und 1) automatisch extrahierte Base ist in Klammern angegeben.

Einer der Vorteile eines optisch basierten Weitfelddetektionssystems liegt in der Einfachheit, mit der mehrere Nanoporen parallel untersucht werden können, was letztendlich Hochdurchsatzauslesung ermöglicht. Als Machbarkeitsnachweis für paralleles Auslesen wurden mehrere 3–5 nm großen Nanoporen auf den gleichen Siliziumnitrid-Membranen mehrere Mikrometer getrennt voneinander hergestellt. 5a zeigt Abbildungen der akkumulierten Fluoreszenzintensität, die unter Verwendung von Membranen, die drei Nanoporenenthielten, erhalten wurden. Wie bei den Versuchen mit einzelnen Nanoporen wurden Fluoreszenz-Bursts von allen Nanoporen in der Membran aufgezeichnet. Die Gesamtphotonenzahlen aus mehreren tausend Entpackungsereignissen ergaben Oberflächenkarten der Photonenintensität an jedem Pixel. Der Abstand zwischen den drei Peaks für die Dreiporenmembran betrug 1,8 μm und 7,7 μm in Übereinstimmung mit den während des Herstellungsprozesses gemessenen Abständen zwischen den Nanoporen. Diese Daten bieten direkten Beweis für die Machbarkeit eines optischen Weitfeld-Detektionsschemas.

In 5b wird die Fähigkeit des Systems, Photonen-Bursts von mehreren Nanoporen in einer einzelnen Membran gleichzeitig zu untersuchen, gezeigt. Vier charakteristische Kurven zeigen den elektrischen Strom und das optische Signal unter Verwendung der 1-Bit-Probe, die mit den drei Nanoporen untersucht wird. Der Eingangs und Entpackungsprozess jedes Moleküls an jeder Nanopore ist ein stochastischer Prozess. Es wurde festgestellt, dass unter den in diesem Versuch verwendeten Bedingungen von > 3.000 Entpackungsereignissen bei ~50 davon Moleküle beteiligt waren, die durch zwei Nanoporen gleichzeitig eintraten. Die Kurve des elektrischen Stroms, die von allen Nanoporen akkumuliert wird, zeigt zwei ausgeprägte Blockadeniveaus, welche die Gesamtzahl der belegten Nanoporen zu einem bestimmten Zeitpunkt ohne Angabe darüber, welche der Nanoporen besetzt sind, anzeigen. Die optischen Kurven zeigen besetzte Nanoporen zweifelsfrei auf. Dies führt letztlich dazu, dass die Notwendigkeit für elektrische Strommessung entfällt, wenn die hier beschriebenen Verfahren auf größere Arrays ausgeweitet werden und sich allein auf optische Messungen stützen, was die Anforderungen an die Instrumentierung vereinfacht.

Die DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Nanoporen bietet mehrere Vorteile gegenüber alternativen Verfahren. Die Auslesegeschwindigkeit kann vollständig durch Einstellen der angelegten Spannung gesteuert werden, und wird nur durch die Auflösung der Detektionsmodalität beschränkt. Zukünftige Entwicklungen von leuchtenderen Fluorophoren und CCDs mit höherer Empfindlichkeit können einfach in schnellere Auslesegeschwindigkeiten umgesetzt werden. Als Einzelmolekülverfahren weist es keine großen Vorgaben in Bezug auf Probenkonzentration und hilft somit bei der Senkung von sowohl Kosten als auch von Verstärkungsfehlern der Probe. Schließlich beinhaltet die hier gezeigte Nanoporenauslese keine Immobilisierung von Enzymen an vordefinierten oder zufälligen Positionen, wodurch die Ausleseplattform wesentlich vereinfacht wird. Hier wurde die Machbarkeit von zweifarbenkonvertierter DNA-Auslesung unter Verwendung eines Binärcodes (2 Bits pro Base) zur Darstellung jeder DNA-Base gezeigt. In einigen Ausführungsformen kann das System 50–250 Basen pro Sekunde pro Nanopore auslesen.

Es wird erwartet, dass eine einfache 4-Farben-Anpassung und die Verwendung optimierter Reagenzien das Erreichen von mindestens 500 Basen pro Sekunde pro Nanopore ermöglicht und Basenklassifizierungsfehler drastisch verringert. Selbst bei Verwendung handelsüblicher Reagenzien und dem Einsatz einer einzelnen Laserlinie beträgt der Nukleotidklassifizierungsfehler etwa 10% (pro einzelnem Lesevorgang). Da der DNA-Umwandlungsprozess eine strukturfreie DNA erzeugt, eliminiert er automatisch systematische Fehler von der Auslesestufe (d. h. Fehler hängen nicht von der Sequenz des DNA-Templats ab). Deshalb kann die vorherrschende Quelle von Auslesefehlern durch mehrfaches Auslesen der gleichen Sequenz wesentlich gesenkt werden. Schließlich wurde die Machbarkeit der Auslesung mehrerer Poren gezeigt, wovon angenommen wird, dass sie die erste für nanoporenbasierten Verfahren darstellt.

Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen die Machbarkeit der Verwendung von Festkörpernanoporen für optische DNA-Sequenzierung.

Die Ergebnisse zeigen, wovon angenommen wird, die erste reine Festkörper-DNA-Sequenzauslesung zu sein. Solch ein ultraschnelles und kostengünstiges System hat zahlreiche Anwendungen in der biomedizinischen Forschung und in der Diagnose und Behandlung von Krankheiten des Menschen.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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