Title:
Prozessierung amplifizierter DNA-Fragmente zur Sequenzierung
Kind Code:
T5
Abstract:

Ein Prozessierungsverfahren zum Trimmen der Enden von DNA-Fragmenten zur Freilegung des inneren DNA-Teils zur Weitergabe der ursprünglichen DNA-Sequenzinformation, das die Anwendung von Sequenzierung der nächsten Generation für DNA-Proben ermöglicht, die durch DOP-PCR oder andere Primer-abhängige Amplifizierungsverfahren amplifiziert werden sollen. Im Einzelnen werden Nukleinsäuren unter Verwendung von Primern amplifiziert, die eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym umfassen, z. B. BpmI oder MmeI. Die Primersequenzen werden durch Schnitt mit dem Restriktionsenzym entfernt.



Inventors:
Muratani, Masafumi (Singapore, SG)
NG, Huck Hui (Singapore, SG)
Application Number:
DE112010004821T
Publication Date:
10/04/2012
Filing Date:
12/15/2010
Assignee:
Agency for Science, Technology and Research (Singapore, SG)
International Classes:
Attorney, Agent or Firm:
BOEHMERT & BOEHMERT, 28209, Bremen, DE
Claims:
1. Ein Verfahren zum Trimmen von Nukleins?urefragmenten zur Sequenzierung, die Schritte umfassend:
a. Amplifizierung eines Nukleins?urefragments mit einem Primer, der eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym umfasst;
b. Verdau des amplifizierten Nukleins?urefragments mit einem Restriktionsenzym, um die Primersequenz zu entfernen und damit die Zielsequenz freizulegen.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Restriktionsenzym die Sequenz au?erhalb der Erkennungsstelle schneidet.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Restriktionsenzym aus BpmI oder MmeI ausgew?hlt ist.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1 umfasst, und das Restriktionsenzym SEQ ID NO: 2 umfasst.

5. Das Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 4, weiter umfassend den Schritt eines zweiten oder eines mehrfachen Verdaus des amplifizierten Nukleins?urefragments mit einem Restriktionsenzym.

6. Das Verfahren nach einem der Anspr?che 1 bis 5, weiter umfassend den Schritt der Bildung einer Nukleins?urebibliothek unter Verwendung von Gesamtgenom-Amplifizierung.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, weiter umfassend den Schritt der computerbasierten Entfernung jeglicher Verzerrung (Bias) in der Nukleins?urebibliothek.

8. Eine Primersequenz, umfassend eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym.

9. Die Primersequenz nach Anspruch 8, wobei das Restriktionsenzym die Sequenz au?erhalb der Erkennungsstelle schneidet.

10. Die Primersequenz nach Anspruch 8, wobei die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1 umfasst.

11. Ein Kit zur Probenvorbereitung, umfassend eine Primersequenz, umfassend eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym, nach einem der Anspr?che 8 bis 10 und ein Restriktionsenzym.

12. Das Kit nach Anspruch 11, wobei das Restriktionsenzym die Sequenz au?erhalb der Erkennungsstelle schneidet.

13. Das Kit nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Restriktionsenzym ausgew?hlt ist aus BpmI oder MmeI.

14. Das Kit nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1 umfasst, und das Restriktionsenzym SEQ ID NO: 2 umfasst.

Description:
Querverweis auf zugeh?rige Anmeldung

Diese Anmeldung beansprucht die Priorit?t der singapurischen Patentanmeldung Nr. 200908342-9, eingereicht am 15. Dezember 2009, deren Inhalte hiermit durch Bezugnahme miteinbezogen werden.

Gebiet

DNA-Amplifizierung und/oder -Prozessierung zur Verwendung zur Genom-Sequenzierung, Epigenetik- und/oder Transkriptom-Analyse.

Hintergrund

Massiv-parallele Sequenzierung und Sequenzierungsplattformen der n?chsten Generation verwandeln die Datenerhebung und Analyse in der Genom-, Epigenom- und Transkriptom-Forschung rapide. Die meisten dieser Sequenzierungstechnologien lesen relativ kurze Oligonukleotid-Sequenzen von den Enden von DNA-Fragmenten. Zum Beispiel erm?glichen Sequenzierungsautomaten von Illumina und Applied Biosystems das zuverl?ssige Lesen von bis zu ungef?hr 50 Basen, und das Paired-End-Tag (PET) Verfahren liest nur 20 oder 27 Basen. Der Grund hierf?r sind die DNA-Prozessierungsenzyme MmeI oder EcoP151, die zur Erzeugung der Tags verwendet werden.

Die Effizienz eines ChIP-Assays ist gew?hnlich niedrig, wobei normalerweise nur zwei Kopien der Targets pro Zelle m?glich sind. Die Bindung des Transkriptionsfaktors kann bei solch niedrigen Werten instabil sein. 1% = ~ 20 Molek?le/Locus in finaler IP-Probe.

Degenerate Oligonucleotide Primed-Polymerasekettenreaktion (DOP-PCR) ist ein robustes Verfahren, um eine Spurenmenge von DNA f?r verschiedene nachgeordnete Anwendungen, wie etwa Sequenzierung und Genotypisierung, zu amplifizieren. Dieses Verfahren beruht jedoch auf der Hinzuf?gung von Sequenzen (> 18 Basen) an die Enden urspr?nglicher DNA-Fragmente, welche es unvorteilhaft f?r die Sequenzierung der n?chsten Generation machen, da sie nur kurze Sequenzlesel?ngen produzieren. DOP-PCR verwendet. einen 3' degenerierten Sequenzteil von Primern f?r die initiale Bibliothekssynthese und eine festgelegte 5'-Sequenz f?r die darauffolgende exponentielle Amplifizierung durch PCR (siehe 8). DOP-PCR weist mehrere Probleme auf:

  • (i) Festgelegte 5'-Primersequenz an den Enden der amplifizierten Fragmente. Jedes Amplifizierungsprodukt hat als ein Resultat der PCR-Amplifizierung eine Primersequenz an beiden Enden.
  • (ii) Mutationen, eingef?hrt durch degeneriertes Priming und PCR-Amplifizierung. Nicht perfekte Anlagerung (Annealing) der degenerierten Oligo-Primer w?hrend der Bibliothekssynthese und Mispriming-Ereignisse w?hrend der PCR verursachen Mutation und Hinzuf?gung von Sequenzen an den Enden der amplifizierten Fragmente.

Zusammenfassung

Die Erfindung strebt an, einige der Probleme aus dem Stand der Technik zu verbessern.

Folglich umfasst ein erster Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Trimmen von Nukleins?urefragmenten zur Sequenzierung, die Schritte umfassend:

  • (i) Amplifizierung eines Nukleins?urefragments mit einem Primer, der eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym umfasst;
  • (ii) Verdau des amplifizierten Nukleins?urefragments mit einem Restriktionsenzym, um die Primersequenz zu entfernen und damit die Zielsequenz freizulegen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst eine Primersequenz, die eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym umfasst.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst ein Kit zur Probenvorbereitung, das eine erfindungsgem??e Primersequenz, umfassend eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym, und ein Restriktionsenzym umfasst.

Kurzbeschreibung der Figuren

Bevorzugte Ausf?hrungsformen der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben:

1: Chromatin-Immunpr?zipitations-Assay.

2: ChIP-Assay mit einer begrenzten Probe von (a) einem fr?hen Embryo, (b) einer seltenen Zellpopulation und (c) einer menschlichen Probe.

3: Modifizierungen am ChIP-Protokoll f?r einen kleinformatigen Assay.

4: Modifizierungen am ChIP-Protokoll f?r einen kleinformatigen Assay.

5: Modifizierungen am ChIP-Protokoll f?r einen kleinformatigen Assay.

6: Oct4-ChIP mit 10.000 M?use-ES-Zellen.

7: Gesamtgenom-Amplifizierung (engl. whole genome amplification, WGA).

8: Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR (DOP-PCR).

9: WGA-Test mit ChIP Input DNA, ChIP Input DNA ohne Amplifizierung.

10: WGA-Test mit ChIP Input DNA.

11: Oct4-ChIP-qPCR-Assay mit 10.000 and 1.000 M?use-ES-Zellen.

12: Prozessierung von ChIP-Material f?r Solexa-Sequenzierung.

13: BpmI Restriktionsenzym.

14: Prozessierung von ChIP-Material f?r Solexa-Sequenzierung.

15: Niedrige Kartierungseffizienz der WGA-Bibliothek.

16: Fehlerraten am 5'-Ende.

17: WGA-Bibliotheksfragmente sind T/G-reich am 5'-Ende.

18: Topo-Klonierung und Sequenzierung des Sigma-WGA-Fragments.

19: Topo-Klonierung und Sequenzierung des Sigma-WGA-Fragments.

20: Zweiter Verdau der WGA-Produkte.

21: Zweiter BpmI-Verdau verbesserte die Kartierung der WGA-Bibliothek.

22: ChIP mit Embryonalgewebe.

23: Verifizierung der WGA durch Real-Time-PCR.

24: 11.5 dpc Vorderhirn H3K4me3 ChIP-Sequenzierungsergebnisse.

25: (A) 11.5 dpc Vorderhirn ChIP-Sequenzierungsergebnisse (B) ChIP-DNA-Probe wurde unter Verwendung eines Antik?rpers gegen Tri-Methyl-Lysin 4 von Histon H3 (H3K4me3) mit M?useembryonalen Stammzellen erzeugt. Vierte Reihe zeigt Input, nicht angereicherte Kontrollprobenbibliothek. Jede Probe wurde mit Hilfe der Illumina-Sequenzierungsplattform von GIS sequenziert, und durch standardm??ige Computerprozessierung kartiert und annotiert.

26: 11.5 dpc Vorderhirn ChIP-Sequenzierungsergebnisse.

27: 11.5 dpc Vorderhirn ChIP-Sequenzierungsergebnisse.

28: Verifizierung der ChIP-Sequenzierungsergebnisse durch Real-Time-PCR.

29: Aufrechterhaltung der embryonalen Stammzellen.

30: Oct4-ChIP mit M?useblastozysten.

31: Oct4-ChIP: ES-Zellen vs. ICM.

32: Verifizierung der ChIP-Sequenzierungsergebnisse durch Real-Time-PCR.

33: GC-Verzerrung (Bias) bei ChIP-Sequenzierung und WGA-ChIP-Sequenzierung.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausf?hrungsformen

Um dieses Problem zu l?sen, entwickelten wir ein Prozessierungsverfahren zum Trimmen der Enden von DNA-Fragmenten. Somit wird der interne DNA-Teil zur Weitergabe der urspr?nglichen DNA-Sequenzinformation (13, 14 und 20) freigelegt, was die Anwendung von Sequenzierung der n?chsten Generation f?r DNA-Proben erm?glicht, die durch DOP-PCR oder andere Primer-abh?ngige Amplifizierungsverfahren amplifiziert werden sollen.

Folglich umfasst ein erster Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Trimmen von Nuldeins?urefragmenten zur Sequenzierung, die Schritte umfassend:

  • (i) Amplifizierung eines Nukleins?urefragments mit einem Primer, der eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym umfasst;
  • (ii) Verdau des amplifizierten Nukleins?urefragments mit einem Restriktionsenzym, um die Primersequenz zu entfernen und damit die Zielsequenz freizulegen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst eine Primersequenz, die eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym umfasst.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst ein Kit zur Probenvorbereitung, das eine erfindungsgem??e Primersequenz, umfassend eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym, und ein Restriktionsenzym umfasst.

Vorzugsweise verwendet das Verfahren ein Restriktionsenzym, das die Sequenz au?erhalb der Erkennungsstelle schneidet, wie etwa ein Restriktionsenzym, das aus BpmI oder MmeI oder irgendeinem anderen solchen, aus dem Stand der Technik bekannten Restriktionsenzym ausgew?hlt ist. Es gibt viele Restriktionsenzyme, die au?erhalb der Erkennungsstelle schneiden, so gibt es zum Beispiel mehr als 50 solcher Enzyme im Produktkatalog von New England Biolabs, und es sind noch weitere aus dem Stand der Technik bekannt.

In einer bevorzugten Ausf?hrungsform umfasst die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1, und das Restriktionsenzym umfasst SEQ ID NO: 2.

Das Verfahren kann au?erdem den Schritt eines zweiten oder eines mehrfachen Verdaus des amplifizierten Nukleins?urefragments mit einem Restriktionsenzym umfassen.

Das Verfahren kann ferner den Schritt der Bildung einer Nukleins?urebibliothek mittels Gesamtgenom-Amplifizierung umfassen. In einer Ausf?hrungsform kann das Verfahren ferner den Schritt der computerbasierten Entfernung jeglicher Verzerrung (Bias) in der Nukleins?urebibliothek umfassen.

In einer bevorzugten Ausf?hrungsform kann der Primer so angepasst werden, dass er mittels einer Restriktionsenzymsequenz au?erhalb der Erkennungsstelle geschnitten wird.

In einer bevorzugten Ausf?hrungsform umfasst die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1.

In einer bevorzugten Ausf?hrungsform schneidet das Restriktionsenzym des Kits die Sequenz au?erhalb der Erkennungsstelle, wie etwa ein Restriktionsenzym, das aus BpmI oder MmeI oder irgendeinem anderen solchen, aus dem Stand der Technik bekannten Restriktionsenzym ausgew?hlt ist. Es gibt viele ?hnliche Enzyme ? zum Beispiel gibt es im Produktkatalog von New England Biolabs mehr als 50 solcher Enzyme, und es sind noch weitere aus dem Stand der Technik bekannt.

Vorzugsweise wird das Restriktionsenzym des Kits aus BpmI oder MmeI ausgew?hlt. In einer Ausf?hrungsform umfasst die Erkennungsstelle des Kits SEQ ID NO: 1, und das Restriktionsenzym des Kits umfasst SEQ ID NO: 2.

Dies ist ein Verfahren zum Trimmen der Enden von DNA-Fragmenten, um den inneren Teil der DNA-Sequenz freizulegen. Dieses Verfahren kann zur Herstellung einer DNA-Bibliothek angewendet werden, die durch DOP-PCR und andere auf PCR basierende Amplifizierungsverfahren amplifiziert werden.

Das Verfahren kann ein ChIP-Protokoll f?r einen kleinformatigen Assay, dann Gesamtgenom-Amplifizierung f?r ChIP-DNA, gefolgt von Prozessierung der WGA-Bibliothek zur Solexa-Sequenzierung, verwenden.

DNA-Fragmente werden mit einem Primer amplifiziert. Der Primer enth?lt die urspr?ngliche PCR-Primersequenz, wie etwa einen Zielprimer von Interesse, und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym, das au?erhalb der Erkennungsstelle schneidet. Es gibt viele Restriktionsenzyme, die au?erhalb der Erkennungsstelle schneiden. Das Restriktionsenzym schneidet die amplifizierten DNA-Fragmente vorzugsweise au?erhalb der Erkennungsstelle, wie etwa BpmI- und MmeI-Restriktionsenzyme, die au?erhalb der Erkennungsstelle schneiden. Nach der Amplifizierung werden DNA-Fragmente mit dem Restriktionsenzym verdaut, um die Primersequenz, die zur Amplifizierung verwendet wird, zu entfernen. Vorzugsweise umfasst die Erkennungsstelle SEQ ID NO. 1: 3' GACCTCNNNNNNNNNNNNNN 5'. Vorzugsweise umfasst die Restriktionsenzymsequenz SEQ ID NO. 2: 5' CTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNN 3'.

Auf diese DNA-Prozessierung kann ferner die Ligation eines Adapters mit der Restriktionsstelle und eine Wiederholung des Verdaus folgen, wenn weiteres Trimmen des amplifizierten DNA-Fragments erforderlich ist.

Wir haben experimentell best?tigt, dass dieser zweite Verdau die Kartierung von Sequenzen aus amplifizierten genomischen DNA-Fragmenten weiter verbessert (16, 21 und 25).

Das Verfahren hat den Vorteil, die Verwendung amplifizierter DNA-Proben f?r Sequenzierung der n?chsten Generation zu erm?glichen.

Dieses Verfahren ist n?tzlich, wenn eine begrenzte Menge an DNA-Proben amplifiziert wird und durch massiv-parallele Sequenzierung und andere Sequenzierungsverfahren analysiert wird. Zum Beispiel kann die Probenvorbereitung f?r eine umfassende Identifizierung oder DNA-Sequenzierung bei forensischen Proben, klinischen Proben (Blut, Gewebe, Haut, etc.) und Umweltproben (Luft, Boden und Wasser etc.) durch eine Kombination von DOP-PCR und dem hierin beschriebenen DNA-Prozessierungsverfahren effizient durchgef?hrt werden.

Somit kann dieses Verfahren einen kommerziellen Wert haben, da es mit Kits zur Probenvorbereitung verwendet werden kann. Dieses Verfahren kann auch f?r das Bereitstellen von Sequenzierungsdienstleistungen bez?glich klinischer Proben und Umweltproben n?tzlich sein, da diese begrenzten Proben m?glicherweise keine ausreichende DNA-Menge f?r konventionelle Verfahren zur Probenvorbereitung f?r Sequenzierung der n?chsten Generation zur Verf?gung stellen.

Das Verfahren w?re f?r Produkte einschlie?lich Kits f?r Gesamtgenom-Amplifizierung n?tzlich, die DOP-PCR zur DNA-Amplifizierung verwenden.

Verzerrung (Bias) in der Darstellung der DNA-Bibliothek aufgrund des Restriktionsenzyms, das in diesem Verfahren verwendet wird, k?nnen computergest?tzt entfernt werden.

Das Verfahren ist effektiv bei der Reduzierung der Kosten und der Dauer der Sequenzierung.

Sequenzierung der n?chsten Generation

Sequenzierung der n?chsten Generation umfasst Verfahren zur massiv-parallelen Sequenzierung, wie etwa das Solexa-System, welches auf der Synthese durch eine DNA-Polymerase basiert, und das SOLiD-System, welches auf Ligation basiert, und andere ?hnliche Sequenzierungsverfahren.

Chromatin-Immunpr?zipitationsassay

Chromatin-Immunpr?zipitation (ChIP) ist ein Verfahren, welches zur Bestimmung der Lage von DNA-Bindungsstellen im Genom f?r ein bestimmtes Protein von Interesse, der Zielsequenz, verwendet wird. Diese Technik ergibt ein Bild der Protein-DNA-Interaktionen, die innerhalb des Kerns lebender Zellen oder von Geweben auftreten. Der in vivo-Charakter dieses Verfahrens steht in Kontrast zu anderen Ans?tzen, die traditionell zur Beantwortung der gleichen Fragen verwendet wurden.

Das diesem Assay zugrundeliegende Prinzip ist, dass DNA-bindende Proteine (einschlie?lich Transkriptionsfaktoren und Histone) in lebenden Zellen mit der DNA, an die sie binden, quervernetzt werden k?nnen. Durch Verwendung eines Antik?rpers, der spezifisch f?r ein mutma?liches DNA-bindendes Protein ist, ist es m?glich, den Protein-DNA-Komplex aus zellul?ren Lysaten immunzupr?zipitieren. Die Quervernetzung (engl. crosslinking) wird h?ufig durch die Anwendung von Formaldehyd auf die Zellen (oder das Gewebe) erreicht, obwohl es manchmal vorteilhaft ist, einen definierteren und gleichm??igeren Quervernetzer, wie etwa DTBP, zu verwenden. Nach der Quervernetzung werden die Zellen lysiert und die DNA durch Ultraschallbehandlung in St?cke mit einer L?nge von 0,2 bis 1 kb aufgebrochen. An dieser Stelle wird die Immunpr?zipitation durchgef?hrt, was zur Aufreinigung der Protein-DNA-Komplexe f?hrt. Die aufgereinigten Protein-DNA-Komplexe werden dann erhitzt, um die Formaldehyd-Quervernetzung der Protein- und DNA-Komplexe r?ckg?ngig zu machen, was die Trennung der DNA von den Proteinen erm?glicht. Die Identit?t und Quantit?t der isolierten DNA-Fragmente kann dann mittels PCR bestimmt werden. Die Einschr?nkung der Durchf?hrung von PCR an den isolierten Fragmenten besteht darin, dass man eine Ahnung haben muss, auf welche genomische Region abgezielt wird, um die korrekten PCR-Zielprimer zu erzeugen. Diese Einschr?nkung kann sehr leicht umgangen werden, in dem die isolierte genomische DNA in einen Plasmidvektor kloniert wird, und dann Primer verwendet werden, die spezifisch f?r die Klonierungsregion dieses Vektors sind. Als Alternative, wenn man herausfinden will, wo die Proteine in einem Genom-weiten Ma?stab binden, kann ein DNA-Microarray verwendet werden (ChIP-on-Chip oder ChIP-Chip), der die Charakterisierung des Cistroms erm?glicht. Ebenso hat sich in letzter Zeit ChIP-Sequenzierung als eine neue Technologie entwickelt, die Protein-Bindungsstellen in einem Hochdurchsatzverfahren und auf kosteneffektive Art und Weise lokalisieren k?nnen. 1 skizziert einen typischen Chromatin-Immunpr?zipitations(ChIP)-Assay.

Dieses Verfahren kann zur Detektion mit einer begrenzten Probe, wie zum Beispiel in 2 dargestellt, unter Verwendung des in 3 bis 5 skizzierten Assays modifiziert werden.

Gesamtgenom-Amplifizierung

Gesamtgenom-Amplifizierung (engl. whole genome amplification, WGA) kann eine Technik sein, die angelegt ist, um die gesamte DNA oder einen Teil der DNA in einer Probe zu amplifizieren. Mehrere Gesamtgenom-Amplifizierungs(WGA)-Techniken wurden als in der Lage pr?sentiert, DNA aus Spurenmengen und mit einer geringeren Fehlerrate als traditionelle PCR zu amplifizieren. Ein typisches WGA-Protokoll wird in 7 beschrieben. Einige bevorzugte Verfahren zur Durchf?hrung von WGA k?nnen Multiple-Displacement-Amplifizierung (MDA) beinhalten, die hoch-prozessive ?29 DNA-Polymerase und exonuklease-resistente Zufallsprimer in einer isothermischen Amplifizierungsreaktion verwendet. Dieses Verfahren basiert auf einer Strang-Dislokationssynthese (engl. stranddisplacement synthesis). Es gibt kommerziell erh?ltliche MDA-Kits, wie etwa das GE MDA-Kit und das Sigma WGA-Kit. Andere bevorzugte Verfahren k?nnen PCR-basierte Verfahren zur Gesamtgenom-Amplifizierung (WGA) beinhalten, einschlie?lich Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR (DOP-PCR) und Primer-Extension-PCR und Ligationsvermittelte PCR (LM-PCR). Das WGA-Kit (Sigma) kann ein kommerziell erh?ltliches Kit zur Durchf?hrung von Gesamtgenom-Amplifizierung sein. Ein neues WGA-Verfahren, welches als OmniPlex bekannt ist, wandelt zuf?llig-fragmentierte genomische DNA in eine Bibliothek inh?rent amplifizierbarer DNA-Fragmente einer definierten Gr??e um. Diese Bibliothek kann mit Hilfe einer High-Fidelity-DNA-Polymerase mehrere tausendfach effektiv amplifiziert werden. Die Bibliothek kann re-amplifiziert werden, um eine finale Amplifizierung von ?ber einer millionenfach ohne Degradation der Repr?sentierung zu erreichen. In ?hnlicher Weise kann jede im Stand der Technik bekannte Gesamtgenom-Amplifizierung f?r die Erfindung geeignet sein.

M?gliche Vorteile der Gesamtgenom-Amplifizierung (WGA) schlie?en die Amplifizierung von DNA aus Picogramm-Mengen und gro?e Kosten- und Zeitersparnisse im Vergleich zu Alternativen, wie etwa die Erzeugung von Zelllinien von Individuen, ein. Typischerweise k?nnen zwischen 0,1 und 10 ng der anf?nglichen genomischen DNA f?r Gesamtgenom-Amplifizierung verwendet werden.

Degenerste Oligonucleotide Primed-PCR (DOP-PCR)

Das Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR (DOP-PCR) Verfahren erm?glicht die komplette Abdeckung eines Genoms in einer einzigen Reaktion. Im Gegensatz zu den Paaren zielspezifischer Primersequenzen, wie sie bei der traditionellen PCR verwendet werden, wird hier nur ein einziger Primer verwendet, der definierte Sequenzen an seinem 5'-Ende und seinem 3'-Ende und eine Zufalls-Hexamer-Sequenz zwischen ihnen aufweist. DOP-PCR umfasst zwei verschiedene Zyklus-Phasen. In Phase 1 (niedrige Stringenz), tritt Niedrigtemperatur-Annealing und Verl?ngerung in den ersten f?nf bis acht Zyklen an vielen Bindungsstellen im Genom auf. Das 3'-Ende des Primers bindet an Stellen im Genom, die komplement?r zu der 6-bp gut-definierten Sequenz am 3'-Ende des Primers ist (~ 106 Stellen im menschlichen Genom). Die angrenzende Zufalls-Hexamer-Sequenz (die alle m?glichen Kombinationen der Nukleotide A, G, C und T aufweist), kann sich dann anlagern und markiert diese Sequenzen mit dem DOP-Primer. In Phase 2 (hohe Stringenz; > 25 Zyklen) wird die PCR-Annealing-Temperatur erh?ht, was die Primer-Spezifizit?t w?hrend der Amplifizierung der markierten Sequenz erh?ht. DOP-PCR erzeugt einen Bereich von DNA-Fragmenten (200?1000 bp). 8 skizziert ein typisches Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR (DOP-PCR) Verfahren.

Nukleins?uren

Eine ?isolierte? oder ?im Wesentlichen reine? Nukleins?ure (z. B. eine RNA, DNA oder ein gemischtes Polymer) ist eine Nukleins?ure, welche im Wesentlichen von anderen zellul?ren Bestandteilen, die nat?rlicherweise eine native humane Sequenz oder ein natives humanes Protein begleiten, z. B. Ribosomen, Polymerasen, viele andere humane Genomsequenzen und Proteine, abgetrennt ist. Der Begriff umfasst eine Nukleins?uresequenz oder eine ein Protein kodierende Sequenz, die aus ihrer nat?rlich auftretenden Umgebung entfernt wurde, und beinhaltet rekombinante oder klonierte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte Analoge oder Analoge, die durch heterologe Systeme biologisch synthetisiert wurden.

Die ?Polynukleotid?-Zusammensetzungen dieser Erfindung schlie?en RNA, cDNA, genomische DNA, synthetische Formen und gemischte Polymere, sowohl Sense- als auch Antisense-Str?nge, ein und k?nnen chemisch oder biochemisch modifiziert sein oder nicht-nat?rliche oder derivatisierte Nukleotidbasen enthalten, was von Fachleuten sofort erkannt werden wird. Solche Modifizierungen schlie?en, zum Beispiel, Labels, Methylierung, Substituierung eines oder mehrere der nat?rlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, internukleotid?re Modifizierungen, wie etwa ungeladene Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate, etc.), geladene Bindungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate, etc.), h?ngende Reste (z. B. Polypeptide), Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen, etc.), Chelatoren, Alkylatoren und modifizierte Bindungen (z. B. alpha-anomerische Nukleins?uren etc.) ein. Ebenfalls eingeschlossen sind synthetische Molek?le, die Polynukleotide in ihrer F?higkeit an eine bestimmte Sequenz ?ber Wasserstoffbr?cken und andere chemische Interaktionen zu binden imitieren. Solche Molek?le sind aus dem Stand der Technik bekannt und schlie?en zum Beispiel jene mit ein, in denen Peptidbindungen die Phosphatbindungen im R?ckgrat des Molek?ls ersetzen.

Diese Technik kann, zum Beispiel, DNA oder RNA, einschlie?lich Boten-RNA (mRNA), amplifizieren, wobei DNA oder RNA einzelstr?ngig oder doppelstr?ngig sein k?nnen. Wenn RNA als Vorlage/Template verwendet werden soll, w?rden Enzyme und/oder Bedingungen verwendet werden, die optimal f?r die reverse Transkription der Vorlage in DNA sind. Zus?tzlich kann ein DNA-RNA-Hybrid verwendet werden, der jeweils einen Strang von DNA und RNA enth?lt. Eine Mischung von Nukleins?uren kann ebenfalls verwendet werden, oder die Nukleins?uren, die in einer vorherigen hierin beschriebenen Amplifizierungsreaktion hergestellt wurden, k?nnen unter Verwendung der gleichen oder unterschiedlicher Primer so verwendet werden.

Die spezifische zu amplifizierende Nukleins?uresequenz, d. h. die Zielgensequenz, kann zu Beginn als ein Teil eines gr??eren Molek?ls oder als ein eigenst?ndiges Molek?l vorliegen, so dass die spezifische Sequenz die ganze Nukleins?ure darstellt. Es ist nicht notwendig, dass die zu amplifizierende Sequenz anfangs in einer reinen Form vorliegt; sie kann eine kleinere Fraktion einer komplexen Mischung sein, zum Beispiel in der humanen Gesamt-DNA enthalten sein.

Die hierin verwendete DNA kann durch eine Vielzahl von Techniken, wie etwa diejenigen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, aus einer K?rperprobe, wie etwa Blut, Gewebematerial und dergleichen, extrahiert werden. Wenn die extrahierte Probe nicht aufgereinigt wurde, kann sie vor Amplifizierung mit einer Menge eines Reagenz behandelt werden, die effektiv ist, die Zellen oder tierischen Zellmembranen der Probe zu ?ffnen und den Strang/die Str?nge der Nukleins?ure(n) freizulegen und/oder aufzutrennen. Dieser Schritt der Lysierung und Nukleins?ure-Denaturierung zur Freilegung und Auftrennung der Str?nge wird es erlauben, dass die Amplifizierung viel schneller erfolgt.

Die Deoxyribonukleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP k?nnen entweder getrennt oder zusammen mit den Primer in geeigneten Mengen zur Synthesemischung hinzuf?gt werden, und die resultierende Mischung wird f?r etwa 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 1 bis 4 Minuten, auf etwa 90 bis 100?C erhitzt. Nach diesem Erhitzungszeitraum l?sst man die L?sung abk?hlen, was f?r die Primer-Hybridisierung bevorzugt ist. Zu der abgek?hlten Mischung wird ein geeignetes Agens zur Bewirkung der Primer-Verl?ngerungsreaktion hinzugef?gt (hierin bezeichnet als ?Agens zur Polymerisierung?), und man l?sst die Reaktion unter aus dem Stand der Technik bekannten Bedingungen ablaufen. Das Agens zur Polymerisierung kann auch zusammen mit den anderen Reagenzien hinzugef?gt werden, wenn es hitzestabil ist. Diese Synthese-(oder Amplifizierungs-)Reaktion kann bei Raumtemperatur bis zu einer Temperatur, ?ber der das Agens zur Polymerisierung nicht l?nger funktioniert, ablaufen. Wenn, zum Beispiel, DNA-Polymerase als das Agens verwendet wird, ist die Temperatur folglich normalerweise nicht h?her als etwa 40?C. Am zweckdienlichsten l?uft die Reaktion bei Raumtemperatur ab.

Primer

Primer der Erfindung umfassen eine Primersequenz, die eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle f?r ein Restriktionsenzym umfasst. Vorzugsweise schneidet das Restriktionsenzym die Sequenz au?erhalb der Erkennungsstelle. Vorzugsweise umfasst die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1.

Spezifische Oligonukleotid-Primer k?nnen von der Zielgensequenz abgeleitet werden. Primer steuern die Amplifizierung eines Zielpolynukleotids vor der Sequenzierung. Primer, die in irgendwelchen von der vorliegenden Erfindung abgeleiteten diagnostischen Assays verwendet werden, sollten von ausreichender L?nge und geeigneter Sequenz sein, um die Initiation der Polymerisierung zu erreichen. Umgebende Bedingungen, die der Synthese f?rderlich sind, schlie?en das Vorhandensein von Nukleosidtriphosphaten und eines Agens zur Polymerisierung, wie etwa DNA-Polymerase, sowie eine geeignete Temperatur und einen geeigneten pH-Wert ein.

F?r eine maximale Effizienz bei der Amplifizierung sind die Primer vorzugsweise einzelstr?ngig, k?nnen aber doppelstr?ngig sein. Wenn sie doppelstr?ngig sind, k?nnen die Primer zuerst zur Trennung der Str?nge behandelt werden, bevor sie zur Herstellung von Verl?ngerungsprodukten verwendet werden. Die Primer sollten ausreichend lang sein, um die Synthese der Zielverl?ngerungsprodukte in Anwesenheit des die Polymerisierung induzierenden Agens zu f?rdern. Die exakte L?nge eines Primers wird von vielen Faktoren abh?ngig sein, einschlie?lich Temperatur, Puffer und Nukleotidzusammensetzung. Oligonukleotid-Primer werden typischerweise 12 bis 20 oder mehr Nukleotide enthalten, obwohl sie weniger Nukleotide enthalten k?nnen.

Primer, die in von der vorliegenden Erfindung abgeleiteten diagnostischen Assays verwendet werden k?nnen, sollten so entworfen sein, dass sie im Wesentlichen komplement?r zu jedem Strang der genomischen Zielgensequenz sind. Das bedeutet, dass die Primer ausreichend komplement?r sein m?ssen, um mit ihren entsprechenden Str?ngen unter Bedingungen, die es dem Agens zur Polymerisation erlauben, zu arbeiten, zu hybridisieren. In anderen Worten sollen die Primer ausreichende Komplementarit?t mit den 5'- und 3'-Sequenzen aufweisen, die die Detektionsstelle flankieren, um damit zu hybridisieren und die Amplifizierung der genomischen Zielgensequenz zu erlauben.

Typischerweise wird ein Primer komplement?r zum negativen (?)-Strang der Zielgensequenz sein und der andere komplement?r zum positiven (+)-Strang sein. Die Anlagerung der Primer an die denaturierte Nukleins?ure, gefolgt von der Verl?ngerung mit einem Enzym, wie etwa das gro?e Fragment von DNA-Polymerase I (Klenow), und Nukleotiden, resultiert in neu-synthetisierten + und ? Str?ngen, die die Zielgensequenz enthalten. Da diese neu-synthetisierten Sequenzen ebenfalls Vorlagen sind, resultieren wiederholte Zyklen der Denaturierung, Primer-Anlagerung und Verl?ngerung in einer exponentiellen Produktion der durch die Primer definierten Region. Das Produkt der Kettenreaktion ist ein eigenst?ndiger Nukleins?ure-Duplex mit Enden, die den Enden der verwendeten spezifischen Primer entsprechen.

Oligonukleotid-Primer k?nnen unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie etwa konventionelle Phosphotriester- und Phosphodiester-Verfahren oder ihre automatisierten Ausf?hrungsformen. In einer solchen automatisierten Ausf?hrungsform werden Diethylphosphoramidite als Startmaterialien verwendet und, wie aus dem Stand der Technik bekannt, synthetisiert.

Das Agens zur Polymerisierung kann jegliche Verbindung oder jegliches System sein, welches funktionieren wird, um die Synthese der Primerverl?ngerungsprodukte zu erreichen, einschlie?lich Enzyme. F?r diesen Zweck geeignete Enzyme schlie?en, zum Beispiel, E. coli DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase, Polymerase-Muteine, reverse Transkriptase und andere Enzyme, einschlie?lich hitzestabiler Enzyme (d. h. jene Enzyme, welche die Primerverl?ngerung durchf?hren, nachdem sie Temperaturen unterworfen wurden, die ausreichend erh?ht wurden, um Denaturierung zu verursachen), wie etwa Taq-Polymerase, ein. Ein geeignetes Enzym wird die Kombination der Nukleotide in der richtigen Weise erlauben, um die Primerverl?ngerungsprodukte zu bilden, die komplement?r zu jedem Nukleins?urestrang der Zielgensequenz sind. Gew?hnlich wird die Synthese am 3'-Ende jedes Primers initiiert werden und sich in 5'-Richtung entlang des Vorlagenstrangs fortsetzen bis die Synthese endet, wodurch Molek?le von unterschiedlichen L?ngen produziert werden.

Der neu-synthetisierte Zielstrang und sein komplement?rer Nukleins?urestrang werden unter den oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen ein doppelstr?ngiges Molek?l bilden, und dieser Hybrid wird in den nachfolgenden Schritten des Verfahrens verwendet. Im n?chsten Schritt wird das neu-synthetisierte doppelstr?ngige Molek?l unter Verwendung irgendeines der oben beschriebenen Verfahren Denaturierungsbedingungen unterworfen, um einzelstr?ngige Molek?le zur Verf?gung zu stellen.

Die Schritte der Denaturierung, Anlagerung und Verl?ngerungsproduktsynthese k?nnen so oft wie n?tig wiederholt werden, um die Nukleins?uresequenz der polymorphen Zielgensequenz bis zu einem f?r die Detektion erforderlichen Umfang zu amplifizieren. Die Menge der produzierten spezifischen Nukleins?uresequenz wird in einer exponentiellen Art und Weise anwachsen.

Die Amplifizierungsprodukte k?nnen durch Southern-Blot-Analyse ohne Verwendung radioaktiver Sonden detektiert werden. In einem solchen Verfahren wird, zum Beispiel, eine kleine DNA-Probe, die ein sehr geringes Niveau der Nukleins?uresequenz der Zielgensequenz enth?lt, amplifiziert, und mittels einer Southern-Blot-Technik oder, auf ?hnliche Weise, unter Verwendung einer Dotblot-Analyse analysiert. Die Verwendung nicht-radioaktiver Sonden oder Markierungen (Labels) wird durch das hohe Niveau des amplifizierten Signals erm?glicht. Alternativ k?nnen zur Detektion der amplifizierten Produkte verwendete Sonden direkt oder indirekt nachweisbar, wie hierin beschrieben, markiert werden.

Durch die Verfahren der Erfindung amplifizierte Sequenzen k?nnen durch die oben diskutierten Methoden und dergleichen weiter evaluiert, detektiert, kloniert und sequenziert werden, entweder in L?sung oder nach Bindung an einen festen Tr?ger, durch jedes Verfahren, das gew?hnlich zur Detektion einer spezifischen DNA-Sequenz angewendet wird, wie etwa PCR, Oligomer-Restriktion, Allel-spezifische Oligonukleotid (ASO), Sondenanalyse, Oligonukleotid-Ligationsassays (OLAs) und dergleichen.

Vorzugsweise ist das Verfahren zur Amplifizierung der Nukleins?uren WGA, wie sie hierin beschrieben wird, oder Real-Time-PCR und wie es normalerweise von gew?hnlichen Fachleuten verwendet wird. Alternative Amplifizierungsverfahren wurden beschrieben und k?nnen ebenfalls angewendet werden, solange bei diesen Alternativverfahren die Gensequenz unter Verwendung der Primer der Erfindung amplifiziert wird. Solche alternativen Amplifizierungssysteme schlie?en selbstaufrechterhaltende Sequenzreplikation (engl. selfsustained sequence replication), welche mit einer kurzen Sequenz einer RNA von Interesse und einem T7-Promotor beginnt, ein, sind aber nicht darauf beschr?nkt. Reverse Transkriptase kopiert die RNA in cDNA und degradiert die RNA, gefolgt von der Polymerisierung eines zweiten Strangs von DNA durch die reverse Transkriptase. Eine weitere Nukleins?ureamplifizierungstechnik ist Nukleins?uresequenz-basierte Amplifizierung (engl. nucleic acid sequence-based amplification, NASBA), welche reverse Transkription und T7-RNA-Polymerase verwendet und zwei Primer einbaut, um ihr Zyklusschema gezielt zu steuern. NASBA kann entweder mit DNA oder RNA beginnen und mit beiden enden, und amplifiziert bis zu 108 Kopien innerhalb von 60 bis 90 Minuten. Alternativ kann die Nukleins?ure durch Ligations-aktivierte Transkription (LAT) amplifiziert werden. LAT arbeitet ausgehend von einer einzelstr?ngigen Vorlage mit einem einzigen Primer, der teils einzelstr?ngig und teils doppelstr?ngig ist. Die Amplifizierung wird durch das Ligieren einer cDNA an das Promotor-Oligonukleotid initiiert, und innerhalb weniger Stunden ist die Amplifizierung 108 bis 109-fach. Das QB-Replikasesystem kann durch das Anbringen einer MDV-1 genannten RNA-Sequenz an eine RNA, die komplement?r zu der DNA-Sequenz von Interesse ist, verwendet werden. Nach Mischung mit einer Probe findet die Hybrid-RNA ihr Komplement?r unter den mRNAs der Probe und bindet, wodurch die Replikase aktiviert wird, die mitkommende Sequenz von Interesse zu kopieren. Eine weitere Nukleins?ureamplifizierungstechnik, Ligase-Kettenreaktion (engl. ligase chain reaction, LCR), funktioniert durch die Verwendung zweier unterschiedlich markierter H?lften einer Sequenz von Interesse, die durch eine Ligase in Anwesenheit der zusammenh?ngenden Sequenz in einer Probe kovalent verbunden werden und somit ein neues Ziel bilden. Die Reparatur-Kettenreaktion (engl. repair chain reaction, RCR) Nukleins?ureamplifizierungstechnik verwendet zwei komplement?re und zielspezifische Oligonukleotid-Sondenpaare, thermostabile Polymerase und Ligase und DNA-Nukleotide, um Zielsequenzen geometrisch zu amplifizieren. Eine 2-Basen-L?cke trennt die Oligonukleotid-Sondenpaare, und die RCR f?llt und verbindet die L?cke und ahmt damit die normale DNA-Reparatur nach. Nukleins?ureamplifizierung durch Strand Displacement Activation (SDA) verwendet einen kurzen Primer, der eine Erkennungsstelle f?r HincII mit einem kurzen ?berhang am 5'-Ende enth?lt, der an die Ziel-DNA bindet. Eine DNA-Polymerase f?llt den Teil des Primers, der dem ?berhang gegen?berliegt, mit Schwefel-enthaltenden Adenin-Analogen. HincII wird hinzugef?gt, schneidet aber nur den nicht-modifizierten DNA-Strang. Eine DNA-Polymerase, der die 5'-Exonukleaseaktivit?t f?llt, tritt an der Stelle der Kerbe (engl. nick) ein und beginnt mit der Polymerisierung, wodurch der anf?ngliche Primer-Strang flussabw?rts entfernt wird und ein neuer Strang gebildet wird, der als weiterer Primer dient. SDA produziert in 2 Stunden bei 37?C eine Amplifizierung, die gr??er ist als 107-fach. Anders als PCR und LCR ben?tigt SDA keinen instrumentalisierten periodischen Temperaturdurchlauf. Ein weiteres Amplifizierungssystem, welches im Zusammenhang mit der Erfindung n?tzlich ist, ist das QB-Replikasesystem. Diese anderen Verfahren k?nnen ebenfalls verwendet werden, um die Gensequenz wie in dem erfindungsgem??en Verfahren beschrieben, zu amplifizieren.

Bevorzugte Ausf?hrungsformenBeispiel 1: Prozessierung amplifizierter Fragmente zur Freilegung des inneren Teils

Dieses Verfahren verwendet BpmI oder andere Enzyme, die au?erhalb der Erkennungsstelle schneiden. Das Beispiel des BpmI-Enzyms zeigt, dass dieses Enzym 16 Basenpaare entfernt von seiner Erkennungssequenz schneidet (13).

DOP-PCR-Produkte, (14) zeigt ein Beispiel eines amplifizierten Produkts unter Verwendung des Sigma Gesamtgenom-Amplifizierungskits, PCR-amplifiziert mit einem Primer, der aus einer festen Primersequenz f?r das Gesamtgenom-Amplifizierungskit (angezeigt mit der dunkleren Farbe) und einer BpmI-Stelle (markiert) besteht. Nach der Amplifizierung wird der feste Primerteil durch BpmI-Verdau getrimmt.

Wenn ein Schnitt nicht ausreichend ist, den urspr?nglichen DNA-Probensequenzteil freizulegen, kann ein zweiter BpmI-Adaptor an die dephosphorylierte Bibliothek ligiert werden. Dieses Ligations-Produkt kann wiederum durch ein BpmI-Enzym verdaut werden (20).

Beispiel 2: Verbesserte Kartierungseffizienz durch zweiten Restriktionsenzym-Verdau

Dieses Prozessierungsverfahren wurde erfolgreich f?r das Sequenzieren der Chromatin-Immunpr?zipitations-DNA mittels Illuminas-Plattform angewendet. 21 (c) zeigt verbesserte Kartierungseffizienz durch einen zweiten BpmI-Verdau bei der Kartierung von Solexa Sequenzauslesungen. 21 (b) best?tigt auch eine reduzierte Kartierungsfehlerrate am 5'-Ende der Sequenzierung. Wie in 26 gezeigt, machte es dieses Verfahren m?glich, den epigenetischen Modifikationsstatus von Chromatin im sich entwickelnden M?usevorderhirn zu analysieren (ChIP-Seq Ansicht der Histon H3K4me3-Modifizierung; 11.5: embryonales Vorderhirn und Adult Brain-Daten von der Broad Institute-Datenbank als Referenz).

< 200 Molek?le/Locus: Zu wenig f?r eine Analyse mit Standardverfahren, wie etwa Real-Time-PCR, Microarray oder Solexa-Sequenzierung. Somit besteht die Notwendigkeit, die ChiP-DNA zu amplifizieren. Geringe Kartierungseffizienz einer WGA-Bibliothek

FilterdurchlaufKartiertSpur 5: keine WGA11,590,7727,904,285Spur 7: WGA 8 Zyklen12,399,7815,247,571

Dies ist ferner in 15 abgebildet.

Beispiel 3: ChIP mit M?useembryovorderhirn

36 sezierte Vorderhirngewebe (~ 12 M Zellen), die Zellen sind dissoziiert und in 1% Formaldehyd fixiert, gefolgt von ChIP-Histon H3K4me3-Behandlung, dann 8-Zyklen WGA (Ausbeute: 16 ng DNA) und Solexa-Bibliothek-Herstellung. Siehe Resultate, abgebildet in 22 bis 28.

Beispiel 4: ChIP mit M?useblastozysten

Der gefrorene Bestand von 256 Blastozysten (gesch?tzt ~ 5,000 ICM-Zellen) wurden mit 1% Formaldehyd fixiert. Dann wurde Oct4-spezifische ChIP durchgef?hrt, WGA 15 Zyklen (Ausbeute: ~ 500 ng DNA), gefolgt von Real-Time-PCR. Siehe Resultate, abgebildet in 29 bis 32.

Beispiel 5:

Eine ChIP-DNA-Probe wurde unter Verwendung eines Antik?rpers gegen Tri-Methyl-Lysin 4 von Histon H3 (H3K4me3) mit embryonalen Stammzellen von M?usen erzeugt (25 (b)). Vierte Reihe zeigt Input, nicht angereicherte Kontrollprobenbibliothek. Jede Probe wurde mit Hilfe der Illumina-Sequenzierungsplattform von GIS sequenziert, und durch standardm??ige Computerprozessierung kartiert und annotiert.

Ein Chromatin-Immunpr?zipitationsexperiment kombiniert mit massiv-paralleler Sequenzierung (ChIP-seq) wurde mit einer urspr?nglichen Probe in gro?em Umfang, d. h. 15 ng DNA-Probe, (25 (B), dritte Reihe von oben) und einer DNA-Probe in kleinem Umfang, d. h. 50 pg DNA-Probe, (25 (B) zwei obere Reihen, als Duplikat) durchgef?hrt. Diese Daten zeigen zwischen der urspr?nglichen 15 ng-Probe und der 15-Zyklen amplifizierten Proben aus 50 pg DNA, prozessiert durch unsere DNA-Prozessierungstechnologie, ein beinahe identisches Peak-Muster und beinahe identische Peak-Gr??e, was die erfolgreiche praktische Anwendung der Technologie mit extrem kleinen Probenmengen best?tigt.

W?hrend die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Verfahren und Ausf?hrungsformen beschrieben wurde, wird man anerkennen, dass zahlreiche Modifizierungen und Ver?nderungen gemacht werden k?nnen, ohne von der Erfindung abzur?cken.

Jedes in diesem Text zitierte Dokument, jede Referenz, jede Patentanmeldung oder jedes Patent wird hiermit ausdr?cklich in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme miteinbezogen, was bedeutet, dass es vom Leser als Teil dieses Textes gelesen und betrachtet werden soll. Nur aus Gr?nden der Pr?gnanz wird das in diesem Text zitierte Dokument, die Referenz, die Patentanmeldung oder das Patent in diesem Text nicht wiederholt.

Alle Instruktionen des Herstellers, Beschreibungen, Produktspezifikationen und Produktbl?tter f?r alle Produkte, die hierin oder in jedem durch Bezugnahme einbezogenen Dokument erw?hnt sind, werden hiermit durch Bezugnahme miteinbezogen und k?nnen bei der Anwendung der Erfindung verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung darf in ihrem Anwendungsbereich nicht durch irgendeine der hierin beschriebenen spezifischen Ausf?hrungsformen beschr?nkt werden. Diese Ausf?hrungsformen dienen lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung. Funktionell ?quivalente Produkte, Formulierungen und Verfahren liegen eindeutig im Geltungsbereich der hierin beschriebenen Erfindung.

Die hierin beschriebene Erfindung kann ein oder mehrere Wertbereiche (z. B. Gr??e, Konzentration etc.) beinhalten. Ein Wertbereich wird so verstanden werden, dass er alle Werte innerhalb des Bereichs einschlie?t, einschlie?lich der Werte, die den Bereich definieren, und Werte, die sich an diesen Bereich anschlie?en und die zum gleichen oder im Wesentlichen gleichen Ergebnis wie die Werte f?hren, die sich unmittelbar dem Wert anschlie?en, der die Grenze des Bereichs definiert.

In der ganzen Beschreibung wird, solange der Kontext nicht anderes erfordert, das Wort ?umfassen? oder Variationen wie etwa ?umfasst? oder ?umfassend? so verstanden werden, dass sie die genannte Zahl oder Gruppe von Zahlen einschlie?en, aber keine andere Zahl oder Gruppe von Zahlen ausschlie?en. Es wird ebenfalls festgestellt, dass in dieser Offenbarung und insbesondere in den Anspr?chen und oder Paragraphen Begriffe, wie etwa ?umfasst?, ?umfasste?, ?umfassend? und dergleichen die Bedeutung haben k?nnen, wie sie ihnen im US-Patentrecht zugeschrieben werden; z. B. k?nnen sie ?beinhaltet?, ?beinhaltete?, ?beinhaltend? und dergleichen bedeuten; und dass Begriffe wie etwa ?im Wesentlichen bestehend aus? und ?besteht im Wesentlichen aus? die Bedeutung haben, wie sie ihnen im US-Patentrecht zugeschrieben werden, z. B., dass sie Elemente, die nicht ausdr?cklich genannt sind, erlauben, aber Elemente ausschlie?en, die im Stand der Technik gefunden werden oder eine grundlegende oder neue Eigenschaft der Erfindung beeintr?chtigen.

Andere Definitionen f?r ausgew?hlte hierin verwendete Begriffe k?nnen innerhalb der detaillierten Beschreibung der Erfindung gefunden werden und sind durchg?ngig anzuwenden. Solange es nicht anders definiert ist, haben alle anderen wissenschaftlichen und technischen Begriffe, wie sie hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung wie sie gew?hnlich von einem im Gebiet der Erfindung ans?ssigen gew?hnlichen Fachmann verstanden werden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Ver?ffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • SG 200908342-9 [0001]