Title:
Prozessierung amplifizierter DNA-Fragmente zur Sequenzierung
Kind Code:
T5
Abstract:

Ein Prozessierungsverfahren zum Trimmen der Enden von DNA-Fragmenten zur Freilegung des inneren DNA-Teils zur Weitergabe der ursprünglichen DNA-Sequenzinformation, das die Anwendung von Sequenzierung der nächsten Generation für DNA-Proben ermöglicht, die durch DOP-PCR oder andere Primer-abhängige Amplifizierungsverfahren amplifiziert werden sollen. Im Einzelnen werden Nukleinsäuren unter Verwendung von Primern amplifiziert, die eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym umfassen, z. B. BpmI oder MmeI. Die Primersequenzen werden durch Schnitt mit dem Restriktionsenzym entfernt.



Inventors:
Muratani, Masafumi (Singapore, SG)
NG, Huck Hui (Singapore, SG)
Application Number:
DE112010004821T
Publication Date:
10/04/2012
Filing Date:
12/15/2010
Assignee:
Agency for Science, Technology and Research (Singapore, SG)
International Classes:
Attorney, Agent or Firm:
BOEHMERT & BOEHMERT, 28209, Bremen, DE
Claims:
1. Ein Verfahren zum Trimmen von Nukleinsäurefragmenten zur Sequenzierung, die Schritte umfassend:
a. Amplifizierung eines Nukleinsäurefragments mit einem Primer, der eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym umfasst;
b. Verdau des amplifizierten Nukleinsäurefragments mit einem Restriktionsenzym, um die Primersequenz zu entfernen und damit die Zielsequenz freizulegen.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Restriktionsenzym die Sequenz außerhalb der Erkennungsstelle schneidet.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Restriktionsenzym aus BpmI oder MmeI ausgewählt ist.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1 umfasst, und das Restriktionsenzym SEQ ID NO: 2 umfasst.

5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter umfassend den Schritt eines zweiten oder eines mehrfachen Verdaus des amplifizierten Nukleinsäurefragments mit einem Restriktionsenzym.

6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiter umfassend den Schritt der Bildung einer Nukleinsäurebibliothek unter Verwendung von Gesamtgenom-Amplifizierung.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, weiter umfassend den Schritt der computerbasierten Entfernung jeglicher Verzerrung (Bias) in der Nukleinsäurebibliothek.

8. Eine Primersequenz, umfassend eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym.

9. Die Primersequenz nach Anspruch 8, wobei das Restriktionsenzym die Sequenz außerhalb der Erkennungsstelle schneidet.

10. Die Primersequenz nach Anspruch 8, wobei die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1 umfasst.

11. Ein Kit zur Probenvorbereitung, umfassend eine Primersequenz, umfassend eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym, nach einem der Ansprüche 8 bis 10 und ein Restriktionsenzym.

12. Das Kit nach Anspruch 11, wobei das Restriktionsenzym die Sequenz außerhalb der Erkennungsstelle schneidet.

13. Das Kit nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Restriktionsenzym ausgewählt ist aus BpmI oder MmeI.

14. Das Kit nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1 umfasst, und das Restriktionsenzym SEQ ID NO: 2 umfasst.

Description:
Querverweis auf zugehörige Anmeldung

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der singapurischen Patentanmeldung Nr. 200908342-9, eingereicht am 15. Dezember 2009, deren Inhalte hiermit durch Bezugnahme miteinbezogen werden.

Gebiet

DNA-Amplifizierung und/oder -Prozessierung zur Verwendung zur Genom-Sequenzierung, Epigenetik- und/oder Transkriptom-Analyse.

Hintergrund

Massiv-parallele Sequenzierung und Sequenzierungsplattformen der nächsten Generation verwandeln die Datenerhebung und Analyse in der Genom-, Epigenom- und Transkriptom-Forschung rapide. Die meisten dieser Sequenzierungstechnologien lesen relativ kurze Oligonukleotid-Sequenzen von den Enden von DNA-Fragmenten. Zum Beispiel ermöglichen Sequenzierungsautomaten von Illumina und Applied Biosystems das zuverlässige Lesen von bis zu ungefähr 50 Basen, und das Paired-End-Tag (PET) Verfahren liest nur 20 oder 27 Basen. Der Grund hierfür sind die DNA-Prozessierungsenzyme MmeI oder EcoP151, die zur Erzeugung der Tags verwendet werden.

Die Effizienz eines ChIP-Assays ist gewöhnlich niedrig, wobei normalerweise nur zwei Kopien der Targets pro Zelle möglich sind. Die Bindung des Transkriptionsfaktors kann bei solch niedrigen Werten instabil sein. 1% = ~ 20 Moleküle/Locus in finaler IP-Probe.

Degenerate Oligonucleotide Primed-Polymerasekettenreaktion (DOP-PCR) ist ein robustes Verfahren, um eine Spurenmenge von DNA für verschiedene nachgeordnete Anwendungen, wie etwa Sequenzierung und Genotypisierung, zu amplifizieren. Dieses Verfahren beruht jedoch auf der Hinzufügung von Sequenzen (> 18 Basen) an die Enden ursprünglicher DNA-Fragmente, welche es unvorteilhaft für die Sequenzierung der nächsten Generation machen, da sie nur kurze Sequenzleselängen produzieren. DOP-PCR verwendet. einen 3' degenerierten Sequenzteil von Primern für die initiale Bibliothekssynthese und eine festgelegte 5'-Sequenz für die darauffolgende exponentielle Amplifizierung durch PCR (siehe 8). DOP-PCR weist mehrere Probleme auf:

  • (i) Festgelegte 5'-Primersequenz an den Enden der amplifizierten Fragmente. Jedes Amplifizierungsprodukt hat als ein Resultat der PCR-Amplifizierung eine Primersequenz an beiden Enden.
  • (ii) Mutationen, eingeführt durch degeneriertes Priming und PCR-Amplifizierung. Nicht perfekte Anlagerung (Annealing) der degenerierten Oligo-Primer während der Bibliothekssynthese und Mispriming-Ereignisse während der PCR verursachen Mutation und Hinzufügung von Sequenzen an den Enden der amplifizierten Fragmente.

Zusammenfassung

Die Erfindung strebt an, einige der Probleme aus dem Stand der Technik zu verbessern.

Folglich umfasst ein erster Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Trimmen von Nukleinsäurefragmenten zur Sequenzierung, die Schritte umfassend:

  • (i) Amplifizierung eines Nukleinsäurefragments mit einem Primer, der eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym umfasst;
  • (ii) Verdau des amplifizierten Nukleinsäurefragments mit einem Restriktionsenzym, um die Primersequenz zu entfernen und damit die Zielsequenz freizulegen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst eine Primersequenz, die eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym umfasst.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst ein Kit zur Probenvorbereitung, das eine erfindungsgemäße Primersequenz, umfassend eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym, und ein Restriktionsenzym umfasst.

Kurzbeschreibung der Figuren

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben:

1: Chromatin-Immunpräzipitations-Assay.

2: ChIP-Assay mit einer begrenzten Probe von (a) einem frühen Embryo, (b) einer seltenen Zellpopulation und (c) einer menschlichen Probe.

3: Modifizierungen am ChIP-Protokoll für einen kleinformatigen Assay.

4: Modifizierungen am ChIP-Protokoll für einen kleinformatigen Assay.

5: Modifizierungen am ChIP-Protokoll für einen kleinformatigen Assay.

6: Oct4-ChIP mit 10.000 Mäuse-ES-Zellen.

7: Gesamtgenom-Amplifizierung (engl. whole genome amplification, WGA).

8: Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR (DOP-PCR).

9: WGA-Test mit ChIP Input DNA, ChIP Input DNA ohne Amplifizierung.

10: WGA-Test mit ChIP Input DNA.

11: Oct4-ChIP-qPCR-Assay mit 10.000 and 1.000 Mäuse-ES-Zellen.

12: Prozessierung von ChIP-Material für Solexa-Sequenzierung.

13: BpmI Restriktionsenzym.

14: Prozessierung von ChIP-Material für Solexa-Sequenzierung.

15: Niedrige Kartierungseffizienz der WGA-Bibliothek.

16: Fehlerraten am 5'-Ende.

17: WGA-Bibliotheksfragmente sind T/G-reich am 5'-Ende.

18: Topo-Klonierung und Sequenzierung des Sigma-WGA-Fragments.

19: Topo-Klonierung und Sequenzierung des Sigma-WGA-Fragments.

20: Zweiter Verdau der WGA-Produkte.

21: Zweiter BpmI-Verdau verbesserte die Kartierung der WGA-Bibliothek.

22: ChIP mit Embryonalgewebe.

23: Verifizierung der WGA durch Real-Time-PCR.

24: 11.5 dpc Vorderhirn H3K4me3 ChIP-Sequenzierungsergebnisse.

25: (A) 11.5 dpc Vorderhirn ChIP-Sequenzierungsergebnisse (B) ChIP-DNA-Probe wurde unter Verwendung eines Antikörpers gegen Tri-Methyl-Lysin 4 von Histon H3 (H3K4me3) mit Mäuseembryonalen Stammzellen erzeugt. Vierte Reihe zeigt Input, nicht angereicherte Kontrollprobenbibliothek. Jede Probe wurde mit Hilfe der Illumina-Sequenzierungsplattform von GIS sequenziert, und durch standardmäßige Computerprozessierung kartiert und annotiert.

26: 11.5 dpc Vorderhirn ChIP-Sequenzierungsergebnisse.

27: 11.5 dpc Vorderhirn ChIP-Sequenzierungsergebnisse.

28: Verifizierung der ChIP-Sequenzierungsergebnisse durch Real-Time-PCR.

29: Aufrechterhaltung der embryonalen Stammzellen.

30: Oct4-ChIP mit Mäuseblastozysten.

31: Oct4-ChIP: ES-Zellen vs. ICM.

32: Verifizierung der ChIP-Sequenzierungsergebnisse durch Real-Time-PCR.

33: GC-Verzerrung (Bias) bei ChIP-Sequenzierung und WGA-ChIP-Sequenzierung.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Um dieses Problem zu lösen, entwickelten wir ein Prozessierungsverfahren zum Trimmen der Enden von DNA-Fragmenten. Somit wird der interne DNA-Teil zur Weitergabe der ursprünglichen DNA-Sequenzinformation (13, 14 und 20) freigelegt, was die Anwendung von Sequenzierung der nächsten Generation für DNA-Proben ermöglicht, die durch DOP-PCR oder andere Primer-abhängige Amplifizierungsverfahren amplifiziert werden sollen.

Folglich umfasst ein erster Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Trimmen von Nuldeinsäurefragmenten zur Sequenzierung, die Schritte umfassend:

  • (i) Amplifizierung eines Nukleinsäurefragments mit einem Primer, der eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym umfasst;
  • (ii) Verdau des amplifizierten Nukleinsäurefragments mit einem Restriktionsenzym, um die Primersequenz zu entfernen und damit die Zielsequenz freizulegen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst eine Primersequenz, die eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym umfasst.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst ein Kit zur Probenvorbereitung, das eine erfindungsgemäße Primersequenz, umfassend eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym, und ein Restriktionsenzym umfasst.

Vorzugsweise verwendet das Verfahren ein Restriktionsenzym, das die Sequenz außerhalb der Erkennungsstelle schneidet, wie etwa ein Restriktionsenzym, das aus BpmI oder MmeI oder irgendeinem anderen solchen, aus dem Stand der Technik bekannten Restriktionsenzym ausgewählt ist. Es gibt viele Restriktionsenzyme, die außerhalb der Erkennungsstelle schneiden, so gibt es zum Beispiel mehr als 50 solcher Enzyme im Produktkatalog von New England Biolabs, und es sind noch weitere aus dem Stand der Technik bekannt.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1, und das Restriktionsenzym umfasst SEQ ID NO: 2.

Das Verfahren kann außerdem den Schritt eines zweiten oder eines mehrfachen Verdaus des amplifizierten Nukleinsäurefragments mit einem Restriktionsenzym umfassen.

Das Verfahren kann ferner den Schritt der Bildung einer Nukleinsäurebibliothek mittels Gesamtgenom-Amplifizierung umfassen. In einer Ausführungsform kann das Verfahren ferner den Schritt der computerbasierten Entfernung jeglicher Verzerrung (Bias) in der Nukleinsäurebibliothek umfassen.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Primer so angepasst werden, dass er mittels einer Restriktionsenzymsequenz außerhalb der Erkennungsstelle geschnitten wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1.

In einer bevorzugten Ausführungsform schneidet das Restriktionsenzym des Kits die Sequenz außerhalb der Erkennungsstelle, wie etwa ein Restriktionsenzym, das aus BpmI oder MmeI oder irgendeinem anderen solchen, aus dem Stand der Technik bekannten Restriktionsenzym ausgewählt ist. Es gibt viele ähnliche Enzyme – zum Beispiel gibt es im Produktkatalog von New England Biolabs mehr als 50 solcher Enzyme, und es sind noch weitere aus dem Stand der Technik bekannt.

Vorzugsweise wird das Restriktionsenzym des Kits aus BpmI oder MmeI ausgewählt. In einer Ausführungsform umfasst die Erkennungsstelle des Kits SEQ ID NO: 1, und das Restriktionsenzym des Kits umfasst SEQ ID NO: 2.

Dies ist ein Verfahren zum Trimmen der Enden von DNA-Fragmenten, um den inneren Teil der DNA-Sequenz freizulegen. Dieses Verfahren kann zur Herstellung einer DNA-Bibliothek angewendet werden, die durch DOP-PCR und andere auf PCR basierende Amplifizierungsverfahren amplifiziert werden.

Das Verfahren kann ein ChIP-Protokoll für einen kleinformatigen Assay, dann Gesamtgenom-Amplifizierung für ChIP-DNA, gefolgt von Prozessierung der WGA-Bibliothek zur Solexa-Sequenzierung, verwenden.

DNA-Fragmente werden mit einem Primer amplifiziert. Der Primer enthält die ursprüngliche PCR-Primersequenz, wie etwa einen Zielprimer von Interesse, und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym, das außerhalb der Erkennungsstelle schneidet. Es gibt viele Restriktionsenzyme, die außerhalb der Erkennungsstelle schneiden. Das Restriktionsenzym schneidet die amplifizierten DNA-Fragmente vorzugsweise außerhalb der Erkennungsstelle, wie etwa BpmI- und MmeI-Restriktionsenzyme, die außerhalb der Erkennungsstelle schneiden. Nach der Amplifizierung werden DNA-Fragmente mit dem Restriktionsenzym verdaut, um die Primersequenz, die zur Amplifizierung verwendet wird, zu entfernen. Vorzugsweise umfasst die Erkennungsstelle SEQ ID NO. 1: 3' GACCTCNNNNNNNNNNNNNN 5'. Vorzugsweise umfasst die Restriktionsenzymsequenz SEQ ID NO. 2: 5' CTGGAGNNNNNNNNNNNNNNNN 3'.

Auf diese DNA-Prozessierung kann ferner die Ligation eines Adapters mit der Restriktionsstelle und eine Wiederholung des Verdaus folgen, wenn weiteres Trimmen des amplifizierten DNA-Fragments erforderlich ist.

Wir haben experimentell bestätigt, dass dieser zweite Verdau die Kartierung von Sequenzen aus amplifizierten genomischen DNA-Fragmenten weiter verbessert (16, 21 und 25).

Das Verfahren hat den Vorteil, die Verwendung amplifizierter DNA-Proben für Sequenzierung der nächsten Generation zu ermöglichen.

Dieses Verfahren ist nützlich, wenn eine begrenzte Menge an DNA-Proben amplifiziert wird und durch massiv-parallele Sequenzierung und andere Sequenzierungsverfahren analysiert wird. Zum Beispiel kann die Probenvorbereitung für eine umfassende Identifizierung oder DNA-Sequenzierung bei forensischen Proben, klinischen Proben (Blut, Gewebe, Haut, etc.) und Umweltproben (Luft, Boden und Wasser etc.) durch eine Kombination von DOP-PCR und dem hierin beschriebenen DNA-Prozessierungsverfahren effizient durchgeführt werden.

Somit kann dieses Verfahren einen kommerziellen Wert haben, da es mit Kits zur Probenvorbereitung verwendet werden kann. Dieses Verfahren kann auch für das Bereitstellen von Sequenzierungsdienstleistungen bezüglich klinischer Proben und Umweltproben nützlich sein, da diese begrenzten Proben möglicherweise keine ausreichende DNA-Menge für konventionelle Verfahren zur Probenvorbereitung für Sequenzierung der nächsten Generation zur Verfügung stellen.

Das Verfahren wäre für Produkte einschließlich Kits für Gesamtgenom-Amplifizierung nützlich, die DOP-PCR zur DNA-Amplifizierung verwenden.

Verzerrung (Bias) in der Darstellung der DNA-Bibliothek aufgrund des Restriktionsenzyms, das in diesem Verfahren verwendet wird, können computergestützt entfernt werden.

Das Verfahren ist effektiv bei der Reduzierung der Kosten und der Dauer der Sequenzierung.

Sequenzierung der nächsten Generation

Sequenzierung der nächsten Generation umfasst Verfahren zur massiv-parallelen Sequenzierung, wie etwa das Solexa-System, welches auf der Synthese durch eine DNA-Polymerase basiert, und das SOLiD-System, welches auf Ligation basiert, und andere ähnliche Sequenzierungsverfahren.

Chromatin-Immunpräzipitationsassay

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein Verfahren, welches zur Bestimmung der Lage von DNA-Bindungsstellen im Genom für ein bestimmtes Protein von Interesse, der Zielsequenz, verwendet wird. Diese Technik ergibt ein Bild der Protein-DNA-Interaktionen, die innerhalb des Kerns lebender Zellen oder von Geweben auftreten. Der in vivo-Charakter dieses Verfahrens steht in Kontrast zu anderen Ansätzen, die traditionell zur Beantwortung der gleichen Fragen verwendet wurden.

Das diesem Assay zugrundeliegende Prinzip ist, dass DNA-bindende Proteine (einschließlich Transkriptionsfaktoren und Histone) in lebenden Zellen mit der DNA, an die sie binden, quervernetzt werden können. Durch Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch für ein mutmaßliches DNA-bindendes Protein ist, ist es möglich, den Protein-DNA-Komplex aus zellulären Lysaten immunzupräzipitieren. Die Quervernetzung (engl. crosslinking) wird häufig durch die Anwendung von Formaldehyd auf die Zellen (oder das Gewebe) erreicht, obwohl es manchmal vorteilhaft ist, einen definierteren und gleichmäßigeren Quervernetzer, wie etwa DTBP, zu verwenden. Nach der Quervernetzung werden die Zellen lysiert und die DNA durch Ultraschallbehandlung in Stücke mit einer Länge von 0,2 bis 1 kb aufgebrochen. An dieser Stelle wird die Immunpräzipitation durchgeführt, was zur Aufreinigung der Protein-DNA-Komplexe führt. Die aufgereinigten Protein-DNA-Komplexe werden dann erhitzt, um die Formaldehyd-Quervernetzung der Protein- und DNA-Komplexe rückgängig zu machen, was die Trennung der DNA von den Proteinen ermöglicht. Die Identität und Quantität der isolierten DNA-Fragmente kann dann mittels PCR bestimmt werden. Die Einschränkung der Durchführung von PCR an den isolierten Fragmenten besteht darin, dass man eine Ahnung haben muss, auf welche genomische Region abgezielt wird, um die korrekten PCR-Zielprimer zu erzeugen. Diese Einschränkung kann sehr leicht umgangen werden, in dem die isolierte genomische DNA in einen Plasmidvektor kloniert wird, und dann Primer verwendet werden, die spezifisch für die Klonierungsregion dieses Vektors sind. Als Alternative, wenn man herausfinden will, wo die Proteine in einem Genom-weiten Maßstab binden, kann ein DNA-Microarray verwendet werden (ChIP-on-Chip oder ChIP-Chip), der die Charakterisierung des Cistroms ermöglicht. Ebenso hat sich in letzter Zeit ChIP-Sequenzierung als eine neue Technologie entwickelt, die Protein-Bindungsstellen in einem Hochdurchsatzverfahren und auf kosteneffektive Art und Weise lokalisieren können. 1 skizziert einen typischen Chromatin-Immunpräzipitations(ChIP)-Assay.

Dieses Verfahren kann zur Detektion mit einer begrenzten Probe, wie zum Beispiel in 2 dargestellt, unter Verwendung des in 3 bis 5 skizzierten Assays modifiziert werden.

Gesamtgenom-Amplifizierung

Gesamtgenom-Amplifizierung (engl. whole genome amplification, WGA) kann eine Technik sein, die angelegt ist, um die gesamte DNA oder einen Teil der DNA in einer Probe zu amplifizieren. Mehrere Gesamtgenom-Amplifizierungs(WGA)-Techniken wurden als in der Lage präsentiert, DNA aus Spurenmengen und mit einer geringeren Fehlerrate als traditionelle PCR zu amplifizieren. Ein typisches WGA-Protokoll wird in 7 beschrieben. Einige bevorzugte Verfahren zur Durchführung von WGA können Multiple-Displacement-Amplifizierung (MDA) beinhalten, die hoch-prozessive φ29 DNA-Polymerase und exonuklease-resistente Zufallsprimer in einer isothermischen Amplifizierungsreaktion verwendet. Dieses Verfahren basiert auf einer Strang-Dislokationssynthese (engl. stranddisplacement synthesis). Es gibt kommerziell erhältliche MDA-Kits, wie etwa das GE MDA-Kit und das Sigma WGA-Kit. Andere bevorzugte Verfahren können PCR-basierte Verfahren zur Gesamtgenom-Amplifizierung (WGA) beinhalten, einschließlich Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR (DOP-PCR) und Primer-Extension-PCR und Ligationsvermittelte PCR (LM-PCR). Das WGA-Kit (Sigma) kann ein kommerziell erhältliches Kit zur Durchführung von Gesamtgenom-Amplifizierung sein. Ein neues WGA-Verfahren, welches als OmniPlex bekannt ist, wandelt zufällig-fragmentierte genomische DNA in eine Bibliothek inhärent amplifizierbarer DNA-Fragmente einer definierten Größe um. Diese Bibliothek kann mit Hilfe einer High-Fidelity-DNA-Polymerase mehrere tausendfach effektiv amplifiziert werden. Die Bibliothek kann re-amplifiziert werden, um eine finale Amplifizierung von über einer millionenfach ohne Degradation der Repräsentierung zu erreichen. In ähnlicher Weise kann jede im Stand der Technik bekannte Gesamtgenom-Amplifizierung für die Erfindung geeignet sein.

Mögliche Vorteile der Gesamtgenom-Amplifizierung (WGA) schließen die Amplifizierung von DNA aus Picogramm-Mengen und große Kosten- und Zeitersparnisse im Vergleich zu Alternativen, wie etwa die Erzeugung von Zelllinien von Individuen, ein. Typischerweise können zwischen 0,1 und 10 ng der anfänglichen genomischen DNA für Gesamtgenom-Amplifizierung verwendet werden.

Degenerste Oligonucleotide Primed-PCR (DOP-PCR)

Das Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR (DOP-PCR) Verfahren ermöglicht die komplette Abdeckung eines Genoms in einer einzigen Reaktion. Im Gegensatz zu den Paaren zielspezifischer Primersequenzen, wie sie bei der traditionellen PCR verwendet werden, wird hier nur ein einziger Primer verwendet, der definierte Sequenzen an seinem 5'-Ende und seinem 3'-Ende und eine Zufalls-Hexamer-Sequenz zwischen ihnen aufweist. DOP-PCR umfasst zwei verschiedene Zyklus-Phasen. In Phase 1 (niedrige Stringenz), tritt Niedrigtemperatur-Annealing und Verlängerung in den ersten fünf bis acht Zyklen an vielen Bindungsstellen im Genom auf. Das 3'-Ende des Primers bindet an Stellen im Genom, die komplementär zu der 6-bp gut-definierten Sequenz am 3'-Ende des Primers ist (~ 106 Stellen im menschlichen Genom). Die angrenzende Zufalls-Hexamer-Sequenz (die alle möglichen Kombinationen der Nukleotide A, G, C und T aufweist), kann sich dann anlagern und markiert diese Sequenzen mit dem DOP-Primer. In Phase 2 (hohe Stringenz; > 25 Zyklen) wird die PCR-Annealing-Temperatur erhöht, was die Primer-Spezifizität während der Amplifizierung der markierten Sequenz erhöht. DOP-PCR erzeugt einen Bereich von DNA-Fragmenten (200–1000 bp). 8 skizziert ein typisches Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR (DOP-PCR) Verfahren.

Nukleinsäuren

Eine „isolierte” oder „im Wesentlichen reine” Nukleinsäure (z. B. eine RNA, DNA oder ein gemischtes Polymer) ist eine Nukleinsäure, welche im Wesentlichen von anderen zellulären Bestandteilen, die natürlicherweise eine native humane Sequenz oder ein natives humanes Protein begleiten, z. B. Ribosomen, Polymerasen, viele andere humane Genomsequenzen und Proteine, abgetrennt ist. Der Begriff umfasst eine Nukleinsäuresequenz oder eine ein Protein kodierende Sequenz, die aus ihrer natürlich auftretenden Umgebung entfernt wurde, und beinhaltet rekombinante oder klonierte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte Analoge oder Analoge, die durch heterologe Systeme biologisch synthetisiert wurden.

Die „Polynukleotid”-Zusammensetzungen dieser Erfindung schließen RNA, cDNA, genomische DNA, synthetische Formen und gemischte Polymere, sowohl Sense- als auch Antisense-Stränge, ein und können chemisch oder biochemisch modifiziert sein oder nicht-natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen enthalten, was von Fachleuten sofort erkannt werden wird. Solche Modifizierungen schließen, zum Beispiel, Labels, Methylierung, Substituierung eines oder mehrere der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, internukleotidäre Modifizierungen, wie etwa ungeladene Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate, etc.), geladene Bindungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate, etc.), hängende Reste (z. B. Polypeptide), Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen, etc.), Chelatoren, Alkylatoren und modifizierte Bindungen (z. B. alpha-anomerische Nukleinsäuren etc.) ein. Ebenfalls eingeschlossen sind synthetische Moleküle, die Polynukleotide in ihrer Fähigkeit an eine bestimmte Sequenz über Wasserstoffbrücken und andere chemische Interaktionen zu binden imitieren. Solche Moleküle sind aus dem Stand der Technik bekannt und schließen zum Beispiel jene mit ein, in denen Peptidbindungen die Phosphatbindungen im Rückgrat des Moleküls ersetzen.

Diese Technik kann, zum Beispiel, DNA oder RNA, einschließlich Boten-RNA (mRNA), amplifizieren, wobei DNA oder RNA einzelsträngig oder doppelsträngig sein können. Wenn RNA als Vorlage/Template verwendet werden soll, würden Enzyme und/oder Bedingungen verwendet werden, die optimal für die reverse Transkription der Vorlage in DNA sind. Zusätzlich kann ein DNA-RNA-Hybrid verwendet werden, der jeweils einen Strang von DNA und RNA enthält. Eine Mischung von Nukleinsäuren kann ebenfalls verwendet werden, oder die Nukleinsäuren, die in einer vorherigen hierin beschriebenen Amplifizierungsreaktion hergestellt wurden, können unter Verwendung der gleichen oder unterschiedlicher Primer so verwendet werden.

Die spezifische zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz, d. h. die Zielgensequenz, kann zu Beginn als ein Teil eines größeren Moleküls oder als ein eigenständiges Molekül vorliegen, so dass die spezifische Sequenz die ganze Nukleinsäure darstellt. Es ist nicht notwendig, dass die zu amplifizierende Sequenz anfangs in einer reinen Form vorliegt; sie kann eine kleinere Fraktion einer komplexen Mischung sein, zum Beispiel in der humanen Gesamt-DNA enthalten sein.

Die hierin verwendete DNA kann durch eine Vielzahl von Techniken, wie etwa diejenigen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, aus einer Körperprobe, wie etwa Blut, Gewebematerial und dergleichen, extrahiert werden. Wenn die extrahierte Probe nicht aufgereinigt wurde, kann sie vor Amplifizierung mit einer Menge eines Reagenz behandelt werden, die effektiv ist, die Zellen oder tierischen Zellmembranen der Probe zu öffnen und den Strang/die Stränge der Nukleinsäure(n) freizulegen und/oder aufzutrennen. Dieser Schritt der Lysierung und Nukleinsäure-Denaturierung zur Freilegung und Auftrennung der Stränge wird es erlauben, dass die Amplifizierung viel schneller erfolgt.

Die Deoxyribonukleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP können entweder getrennt oder zusammen mit den Primer in geeigneten Mengen zur Synthesemischung hinzufügt werden, und die resultierende Mischung wird für etwa 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 1 bis 4 Minuten, auf etwa 90 bis 100°C erhitzt. Nach diesem Erhitzungszeitraum lässt man die Lösung abkühlen, was für die Primer-Hybridisierung bevorzugt ist. Zu der abgekühlten Mischung wird ein geeignetes Agens zur Bewirkung der Primer-Verlängerungsreaktion hinzugefügt (hierin bezeichnet als „Agens zur Polymerisierung”), und man lässt die Reaktion unter aus dem Stand der Technik bekannten Bedingungen ablaufen. Das Agens zur Polymerisierung kann auch zusammen mit den anderen Reagenzien hinzugefügt werden, wenn es hitzestabil ist. Diese Synthese-(oder Amplifizierungs-)Reaktion kann bei Raumtemperatur bis zu einer Temperatur, über der das Agens zur Polymerisierung nicht länger funktioniert, ablaufen. Wenn, zum Beispiel, DNA-Polymerase als das Agens verwendet wird, ist die Temperatur folglich normalerweise nicht höher als etwa 40°C. Am zweckdienlichsten läuft die Reaktion bei Raumtemperatur ab.

Primer

Primer der Erfindung umfassen eine Primersequenz, die eine Zielprimersequenz und eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym umfasst. Vorzugsweise schneidet das Restriktionsenzym die Sequenz außerhalb der Erkennungsstelle. Vorzugsweise umfasst die Erkennungsstelle SEQ ID NO: 1.

Spezifische Oligonukleotid-Primer können von der Zielgensequenz abgeleitet werden. Primer steuern die Amplifizierung eines Zielpolynukleotids vor der Sequenzierung. Primer, die in irgendwelchen von der vorliegenden Erfindung abgeleiteten diagnostischen Assays verwendet werden, sollten von ausreichender Länge und geeigneter Sequenz sein, um die Initiation der Polymerisierung zu erreichen. Umgebende Bedingungen, die der Synthese förderlich sind, schließen das Vorhandensein von Nukleosidtriphosphaten und eines Agens zur Polymerisierung, wie etwa DNA-Polymerase, sowie eine geeignete Temperatur und einen geeigneten pH-Wert ein.

Für eine maximale Effizienz bei der Amplifizierung sind die Primer vorzugsweise einzelsträngig, können aber doppelsträngig sein. Wenn sie doppelsträngig sind, können die Primer zuerst zur Trennung der Stränge behandelt werden, bevor sie zur Herstellung von Verlängerungsprodukten verwendet werden. Die Primer sollten ausreichend lang sein, um die Synthese der Zielverlängerungsprodukte in Anwesenheit des die Polymerisierung induzierenden Agens zu fördern. Die exakte Länge eines Primers wird von vielen Faktoren abhängig sein, einschließlich Temperatur, Puffer und Nukleotidzusammensetzung. Oligonukleotid-Primer werden typischerweise 12 bis 20 oder mehr Nukleotide enthalten, obwohl sie weniger Nukleotide enthalten können.

Primer, die in von der vorliegenden Erfindung abgeleiteten diagnostischen Assays verwendet werden können, sollten so entworfen sein, dass sie im Wesentlichen komplementär zu jedem Strang der genomischen Zielgensequenz sind. Das bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren entsprechenden Strängen unter Bedingungen, die es dem Agens zur Polymerisation erlauben, zu arbeiten, zu hybridisieren. In anderen Worten sollen die Primer ausreichende Komplementarität mit den 5'- und 3'-Sequenzen aufweisen, die die Detektionsstelle flankieren, um damit zu hybridisieren und die Amplifizierung der genomischen Zielgensequenz zu erlauben.

Typischerweise wird ein Primer komplementär zum negativen (–)-Strang der Zielgensequenz sein und der andere komplementär zum positiven (+)-Strang sein. Die Anlagerung der Primer an die denaturierte Nukleinsäure, gefolgt von der Verlängerung mit einem Enzym, wie etwa das große Fragment von DNA-Polymerase I (Klenow), und Nukleotiden, resultiert in neu-synthetisierten + und – Strängen, die die Zielgensequenz enthalten. Da diese neu-synthetisierten Sequenzen ebenfalls Vorlagen sind, resultieren wiederholte Zyklen der Denaturierung, Primer-Anlagerung und Verlängerung in einer exponentiellen Produktion der durch die Primer definierten Region. Das Produkt der Kettenreaktion ist ein eigenständiger Nukleinsäure-Duplex mit Enden, die den Enden der verwendeten spezifischen Primer entsprechen.

Oligonukleotid-Primer können unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie etwa konventionelle Phosphotriester- und Phosphodiester-Verfahren oder ihre automatisierten Ausführungsformen. In einer solchen automatisierten Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite als Startmaterialien verwendet und, wie aus dem Stand der Technik bekannt, synthetisiert.

Das Agens zur Polymerisierung kann jegliche Verbindung oder jegliches System sein, welches funktionieren wird, um die Synthese der Primerverlängerungsprodukte zu erreichen, einschließlich Enzyme. Für diesen Zweck geeignete Enzyme schließen, zum Beispiel, E. coli DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase, Polymerase-Muteine, reverse Transkriptase und andere Enzyme, einschließlich hitzestabiler Enzyme (d. h. jene Enzyme, welche die Primerverlängerung durchführen, nachdem sie Temperaturen unterworfen wurden, die ausreichend erhöht wurden, um Denaturierung zu verursachen), wie etwa Taq-Polymerase, ein. Ein geeignetes Enzym wird die Kombination der Nukleotide in der richtigen Weise erlauben, um die Primerverlängerungsprodukte zu bilden, die komplementär zu jedem Nukleinsäurestrang der Zielgensequenz sind. Gewöhnlich wird die Synthese am 3'-Ende jedes Primers initiiert werden und sich in 5'-Richtung entlang des Vorlagenstrangs fortsetzen bis die Synthese endet, wodurch Moleküle von unterschiedlichen Längen produziert werden.

Der neu-synthetisierte Zielstrang und sein komplementärer Nukleinsäurestrang werden unter den oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen ein doppelsträngiges Molekül bilden, und dieser Hybrid wird in den nachfolgenden Schritten des Verfahrens verwendet. Im nächsten Schritt wird das neu-synthetisierte doppelsträngige Molekül unter Verwendung irgendeines der oben beschriebenen Verfahren Denaturierungsbedingungen unterworfen, um einzelsträngige Moleküle zur Verfügung zu stellen.

Die Schritte der Denaturierung, Anlagerung und Verlängerungsproduktsynthese können so oft wie nötig wiederholt werden, um die Nukleinsäuresequenz der polymorphen Zielgensequenz bis zu einem für die Detektion erforderlichen Umfang zu amplifizieren. Die Menge der produzierten spezifischen Nukleinsäuresequenz wird in einer exponentiellen Art und Weise anwachsen.

Die Amplifizierungsprodukte können durch Southern-Blot-Analyse ohne Verwendung radioaktiver Sonden detektiert werden. In einem solchen Verfahren wird, zum Beispiel, eine kleine DNA-Probe, die ein sehr geringes Niveau der Nukleinsäuresequenz der Zielgensequenz enthält, amplifiziert, und mittels einer Southern-Blot-Technik oder, auf ähnliche Weise, unter Verwendung einer Dotblot-Analyse analysiert. Die Verwendung nicht-radioaktiver Sonden oder Markierungen (Labels) wird durch das hohe Niveau des amplifizierten Signals ermöglicht. Alternativ können zur Detektion der amplifizierten Produkte verwendete Sonden direkt oder indirekt nachweisbar, wie hierin beschrieben, markiert werden.

Durch die Verfahren der Erfindung amplifizierte Sequenzen können durch die oben diskutierten Methoden und dergleichen weiter evaluiert, detektiert, kloniert und sequenziert werden, entweder in Lösung oder nach Bindung an einen festen Träger, durch jedes Verfahren, das gewöhnlich zur Detektion einer spezifischen DNA-Sequenz angewendet wird, wie etwa PCR, Oligomer-Restriktion, Allel-spezifische Oligonukleotid (ASO), Sondenanalyse, Oligonukleotid-Ligationsassays (OLAs) und dergleichen.

Vorzugsweise ist das Verfahren zur Amplifizierung der Nukleinsäuren WGA, wie sie hierin beschrieben wird, oder Real-Time-PCR und wie es normalerweise von gewöhnlichen Fachleuten verwendet wird. Alternative Amplifizierungsverfahren wurden beschrieben und können ebenfalls angewendet werden, solange bei diesen Alternativverfahren die Gensequenz unter Verwendung der Primer der Erfindung amplifiziert wird. Solche alternativen Amplifizierungssysteme schließen selbstaufrechterhaltende Sequenzreplikation (engl. selfsustained sequence replication), welche mit einer kurzen Sequenz einer RNA von Interesse und einem T7-Promotor beginnt, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Reverse Transkriptase kopiert die RNA in cDNA und degradiert die RNA, gefolgt von der Polymerisierung eines zweiten Strangs von DNA durch die reverse Transkriptase. Eine weitere Nukleinsäureamplifizierungstechnik ist Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifizierung (engl. nucleic acid sequence-based amplification, NASBA), welche reverse Transkription und T7-RNA-Polymerase verwendet und zwei Primer einbaut, um ihr Zyklusschema gezielt zu steuern. NASBA kann entweder mit DNA oder RNA beginnen und mit beiden enden, und amplifiziert bis zu 108 Kopien innerhalb von 60 bis 90 Minuten. Alternativ kann die Nukleinsäure durch Ligations-aktivierte Transkription (LAT) amplifiziert werden. LAT arbeitet ausgehend von einer einzelsträngigen Vorlage mit einem einzigen Primer, der teils einzelsträngig und teils doppelsträngig ist. Die Amplifizierung wird durch das Ligieren einer cDNA an das Promotor-Oligonukleotid initiiert, und innerhalb weniger Stunden ist die Amplifizierung 108 bis 109-fach. Das QB-Replikasesystem kann durch das Anbringen einer MDV-1 genannten RNA-Sequenz an eine RNA, die komplementär zu der DNA-Sequenz von Interesse ist, verwendet werden. Nach Mischung mit einer Probe findet die Hybrid-RNA ihr Komplementär unter den mRNAs der Probe und bindet, wodurch die Replikase aktiviert wird, die mitkommende Sequenz von Interesse zu kopieren. Eine weitere Nukleinsäureamplifizierungstechnik, Ligase-Kettenreaktion (engl. ligase chain reaction, LCR), funktioniert durch die Verwendung zweier unterschiedlich markierter Hälften einer Sequenz von Interesse, die durch eine Ligase in Anwesenheit der zusammenhängenden Sequenz in einer Probe kovalent verbunden werden und somit ein neues Ziel bilden. Die Reparatur-Kettenreaktion (engl. repair chain reaction, RCR) Nukleinsäureamplifizierungstechnik verwendet zwei komplementäre und zielspezifische Oligonukleotid-Sondenpaare, thermostabile Polymerase und Ligase und DNA-Nukleotide, um Zielsequenzen geometrisch zu amplifizieren. Eine 2-Basen-Lücke trennt die Oligonukleotid-Sondenpaare, und die RCR füllt und verbindet die Lücke und ahmt damit die normale DNA-Reparatur nach. Nukleinsäureamplifizierung durch Strand Displacement Activation (SDA) verwendet einen kurzen Primer, der eine Erkennungsstelle für HincII mit einem kurzen Überhang am 5'-Ende enthält, der an die Ziel-DNA bindet. Eine DNA-Polymerase füllt den Teil des Primers, der dem Überhang gegenüberliegt, mit Schwefel-enthaltenden Adenin-Analogen. HincII wird hinzugefügt, schneidet aber nur den nicht-modifizierten DNA-Strang. Eine DNA-Polymerase, der die 5'-Exonukleaseaktivität fällt, tritt an der Stelle der Kerbe (engl. nick) ein und beginnt mit der Polymerisierung, wodurch der anfängliche Primer-Strang flussabwärts entfernt wird und ein neuer Strang gebildet wird, der als weiterer Primer dient. SDA produziert in 2 Stunden bei 37°C eine Amplifizierung, die größer ist als 107-fach. Anders als PCR und LCR benötigt SDA keinen instrumentalisierten periodischen Temperaturdurchlauf. Ein weiteres Amplifizierungssystem, welches im Zusammenhang mit der Erfindung nützlich ist, ist das QB-Replikasesystem. Diese anderen Verfahren können ebenfalls verwendet werden, um die Gensequenz wie in dem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben, zu amplifizieren.

Bevorzugte AusführungsformenBeispiel 1: Prozessierung amplifizierter Fragmente zur Freilegung des inneren Teils

Dieses Verfahren verwendet BpmI oder andere Enzyme, die außerhalb der Erkennungsstelle schneiden. Das Beispiel des BpmI-Enzyms zeigt, dass dieses Enzym 16 Basenpaare entfernt von seiner Erkennungssequenz schneidet (13).

DOP-PCR-Produkte, (14) zeigt ein Beispiel eines amplifizierten Produkts unter Verwendung des Sigma Gesamtgenom-Amplifizierungskits, PCR-amplifiziert mit einem Primer, der aus einer festen Primersequenz für das Gesamtgenom-Amplifizierungskit (angezeigt mit der dunkleren Farbe) und einer BpmI-Stelle (markiert) besteht. Nach der Amplifizierung wird der feste Primerteil durch BpmI-Verdau getrimmt.

Wenn ein Schnitt nicht ausreichend ist, den ursprünglichen DNA-Probensequenzteil freizulegen, kann ein zweiter BpmI-Adaptor an die dephosphorylierte Bibliothek ligiert werden. Dieses Ligations-Produkt kann wiederum durch ein BpmI-Enzym verdaut werden (20).

Beispiel 2: Verbesserte Kartierungseffizienz durch zweiten Restriktionsenzym-Verdau

Dieses Prozessierungsverfahren wurde erfolgreich für das Sequenzieren der Chromatin-Immunpräzipitations-DNA mittels Illuminas-Plattform angewendet. 21 (c) zeigt verbesserte Kartierungseffizienz durch einen zweiten BpmI-Verdau bei der Kartierung von Solexa Sequenzauslesungen. 21 (b) bestätigt auch eine reduzierte Kartierungsfehlerrate am 5'-Ende der Sequenzierung. Wie in 26 gezeigt, machte es dieses Verfahren möglich, den epigenetischen Modifikationsstatus von Chromatin im sich entwickelnden Mäusevorderhirn zu analysieren (ChIP-Seq Ansicht der Histon H3K4me3-Modifizierung; 11.5: embryonales Vorderhirn und Adult Brain-Daten von der Broad Institute-Datenbank als Referenz).

< 200 Moleküle/Locus: Zu wenig für eine Analyse mit Standardverfahren, wie etwa Real-Time-PCR, Microarray oder Solexa-Sequenzierung. Somit besteht die Notwendigkeit, die ChiP-DNA zu amplifizieren. Geringe Kartierungseffizienz einer WGA-Bibliothek

FilterdurchlaufKartiertSpur 5: keine WGA11,590,7727,904,285Spur 7: WGA 8 Zyklen12,399,7815,247,571

Dies ist ferner in 15 abgebildet.

Beispiel 3: ChIP mit Mäuseembryovorderhirn

36 sezierte Vorderhirngewebe (~ 12 M Zellen), die Zellen sind dissoziiert und in 1% Formaldehyd fixiert, gefolgt von ChIP-Histon H3K4me3-Behandlung, dann 8-Zyklen WGA (Ausbeute: 16 ng DNA) und Solexa-Bibliothek-Herstellung. Siehe Resultate, abgebildet in 22 bis 28.

Beispiel 4: ChIP mit Mäuseblastozysten

Der gefrorene Bestand von 256 Blastozysten (geschätzt ~ 5,000 ICM-Zellen) wurden mit 1% Formaldehyd fixiert. Dann wurde Oct4-spezifische ChIP durchgeführt, WGA 15 Zyklen (Ausbeute: ~ 500 ng DNA), gefolgt von Real-Time-PCR. Siehe Resultate, abgebildet in 29 bis 32.

Beispiel 5:

Eine ChIP-DNA-Probe wurde unter Verwendung eines Antikörpers gegen Tri-Methyl-Lysin 4 von Histon H3 (H3K4me3) mit embryonalen Stammzellen von Mäusen erzeugt (25 (b)). Vierte Reihe zeigt Input, nicht angereicherte Kontrollprobenbibliothek. Jede Probe wurde mit Hilfe der Illumina-Sequenzierungsplattform von GIS sequenziert, und durch standardmäßige Computerprozessierung kartiert und annotiert.

Ein Chromatin-Immunpräzipitationsexperiment kombiniert mit massiv-paralleler Sequenzierung (ChIP-seq) wurde mit einer ursprünglichen Probe in großem Umfang, d. h. 15 ng DNA-Probe, (25 (B), dritte Reihe von oben) und einer DNA-Probe in kleinem Umfang, d. h. 50 pg DNA-Probe, (25 (B) zwei obere Reihen, als Duplikat) durchgeführt. Diese Daten zeigen zwischen der ursprünglichen 15 ng-Probe und der 15-Zyklen amplifizierten Proben aus 50 pg DNA, prozessiert durch unsere DNA-Prozessierungstechnologie, ein beinahe identisches Peak-Muster und beinahe identische Peak-Größe, was die erfolgreiche praktische Anwendung der Technologie mit extrem kleinen Probenmengen bestätigt.

Während die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Verfahren und Ausführungsformen beschrieben wurde, wird man anerkennen, dass zahlreiche Modifizierungen und Veränderungen gemacht werden können, ohne von der Erfindung abzurücken.

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Die vorliegende Erfindung darf in ihrem Anwendungsbereich nicht durch irgendeine der hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen beschränkt werden. Diese Ausführungsformen dienen lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung. Funktionell äquivalente Produkte, Formulierungen und Verfahren liegen eindeutig im Geltungsbereich der hierin beschriebenen Erfindung.

Die hierin beschriebene Erfindung kann ein oder mehrere Wertbereiche (z. B. Größe, Konzentration etc.) beinhalten. Ein Wertbereich wird so verstanden werden, dass er alle Werte innerhalb des Bereichs einschließt, einschließlich der Werte, die den Bereich definieren, und Werte, die sich an diesen Bereich anschließen und die zum gleichen oder im Wesentlichen gleichen Ergebnis wie die Werte führen, die sich unmittelbar dem Wert anschließen, der die Grenze des Bereichs definiert.

In der ganzen Beschreibung wird, solange der Kontext nicht anderes erfordert, das Wort „umfassen” oder Variationen wie etwa „umfasst” oder „umfassend” so verstanden werden, dass sie die genannte Zahl oder Gruppe von Zahlen einschließen, aber keine andere Zahl oder Gruppe von Zahlen ausschließen. Es wird ebenfalls festgestellt, dass in dieser Offenbarung und insbesondere in den Ansprüchen und oder Paragraphen Begriffe, wie etwa „umfasst”, „umfasste”, „umfassend” und dergleichen die Bedeutung haben können, wie sie ihnen im US-Patentrecht zugeschrieben werden; z. B. können sie „beinhaltet”, „beinhaltete”, „beinhaltend” und dergleichen bedeuten; und dass Begriffe wie etwa „im Wesentlichen bestehend aus” und „besteht im Wesentlichen aus” die Bedeutung haben, wie sie ihnen im US-Patentrecht zugeschrieben werden, z. B., dass sie Elemente, die nicht ausdrücklich genannt sind, erlauben, aber Elemente ausschließen, die im Stand der Technik gefunden werden oder eine grundlegende oder neue Eigenschaft der Erfindung beeinträchtigen.

Andere Definitionen für ausgewählte hierin verwendete Begriffe können innerhalb der detaillierten Beschreibung der Erfindung gefunden werden und sind durchgängig anzuwenden. Solange es nicht anders definiert ist, haben alle anderen wissenschaftlichen und technischen Begriffe, wie sie hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung wie sie gewöhnlich von einem im Gebiet der Erfindung ansässigen gewöhnlichen Fachmann verstanden werden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • SG 200908342-9 [0001]