Title:
NEUE FETTSÄURE-ELONGATIONS-KOMPONENTEN UND ANWENDUINGEN DAVON
Kind Code:
T5


Abstract:

Die Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, welche eine neue Fettsäure-nECR codieren. Die Erfindung stellt ebenfalls rekombinante Expressionsvektoren, die nECR-Nukleinsäuremoleküle enthalten, Wirtszellen, in welche die Expressionsvektoren eingebracht worden sind, und Verfahren zur großtechnischen Herstellung von langkettigen mehrfach-ungesättigten Fettsäuren (LCPUFAs), z. B. ARA, EPA und DHA, bereit.




Inventors:
Sayanova, Olga (Redbourn, St. Albans AL3 7HF, GB)
Beaudoin, Frederic (St. Albans, GB)
Napier, Johnathan A. (Preston, Hertfordshire SG4 7TR, GB)
Application Number:
DE112010002353T
Publication Date:
08/09/2012
Filing Date:
05/20/2010
Assignee:
BASF Plant Science Company GmbH, 67063 (DE)
International Classes:



Foreign References:
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Attorney, Agent or Firm:
Herzog Fiesser & Partner, 68167, Mannheim, DE
Claims:
1. Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit einer Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NRn: 1 oder 3 gezeigt;
b) einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NRn: 2 oder 4 gezeigt;
c) einer Nukleinsäuresequenz, die mindestens 50% identisch zur Nukleinsäuresequenz von a) oder b) ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit nECR-Aktivität codiert;
d) einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid mit nECR-Aktivität und mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens 50% identisch zur Aminosäuresequenz von einem Beliebigen von a) bis c) ist; und
e) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an ein Beliebiges von a) bis d) in der Lage ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit nECR-Aktivität codiert.

2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid ferner eine Expressions-Steuerungssequenz umfasst, die operativ an die Nukleinsäuresequenz verknüpft ist.

3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid ferner eine Terminatorsequenz umfasst, die operativ an die Nukleinsäuresequenz verknüpft ist.

4. Vektor, welcher das Polynukleotid gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.

5. Wirtszelle, die das Polynukleotid von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 oder den Vektor gemäß Anspruch 4 umfasst.

6. Verfahren zur Herstellung eines, durch ein Polynukleotid gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 codierten Polypeptids, umfassend:
a) Kultivieren der Wirtszelle gemäß Anspruch 5 unter Bedingungen, welche die Herstellung des Polypeptids gestatten; und
b) Gewinnen des Polypeptids aus der Wirtszelle von Schritt a).

7. Polypeptid, welches durch das Polynukleotid gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird oder welches durch das Verfahren von Anspruch 6 erhältlich ist.

8. Nicht-menschlicher transgener Organismus, der das Polynukleotid gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 oder den Vektor gemäß Anspruch 4 umfasst.

9. Nicht-menschlicher transgener Organismus gemäß Anspruch 8, bei dem es sich um eine Pflanze, einen Pflanzenteil oder Pflanzensamen handelt.

10. Verfahren zur Herstellung von mehrfach-ungesättigten Fettsäuren, des Folgendes umfasst:
a) Kultivieren der Wirtszelle gemäß Anspruch 5 unter Bedingungen, welche die Herstellung von mehrfach-ungesättigten Fettsäuren in der Wirtszelle gestatten; und
b) Gewinnen der mehrfach-ungesättigten Fettsäuren aus der Wirtszelle.

11. Verfahren zur Herstellung von mehrfach-ungesättigten Fettsäuren, das Folgendes umfasst:
a) Kultivieren des nicht-menschlichen transgenen Organismus gemäß Anspruch 8 oder 9 unter Bedingungen, welche die Herstellung von mehrfach-ungesättigten Fettsäuren in der Wirtszelle gestatten; und
b) Gewinnen der mehrfach-ungesättigten Fettsäuren aus dem nicht-menschlichen transgenen Organismus.

12. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei die mehrfach-ungesättigte Fettsäure Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA) ist.

13. Verfahren zur Herstellung einer Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung, welches die Schritte des Verfahrens gemäß einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 12 und den weiteren Schritt des Formulierens der mehrfach-ungesättigten Fettsäure als Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung umfasst.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung für Futter, Nahrungsmittel, Kosmetika oder Medikamente verwendet werden soll.

15. Öl, umfassend eine mehrfach-ungesättigte Fettsäure, die durch das Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 10 bis 12 erhältlich ist.

Description:

Die Erfindung betrifft im Prinzip das Gebiet der rekombinanten Herstellung von Fettsäuren. Sie stellt Nukleinsäuremoleküle bereit, welche neue Mitglieder der Fettsäure-Dehydratase/Enoyl-CoA-Reduktase (nECR)-Familie codieren. Die Erfindung stellt ebenfalls rekombinante Expressionsvektoren, die nECR-Nukleinsäuremoleküle enthalten, Wirtszellen, in welche die Expressionsvektoren eingebracht worden sind, und Verfahren zur großtechnischen Herstellung von langkettigen mehrfach-ungesättigten Fettsäuren (LCPUFAs), z. B. ARA, EPA und DHA, bereit.

Fettsäuren sind Carbonsäuren mit langkettigen Kohlenwasserstoff-Seitengruppen, welche eine grundlegende Rolle in zahlreichen biologischen Prozessen spielen. Fettsäuren werden selten frei in der Natur gefunden, sondern treten vielmehr in veresterter Form als die Hauptkomponente von Lipiden auf. Als solches sind Lipide/Fettsäuren Energiequellen (z. B. b-Oxidation). Darüber hinaus sind Lipide/Fettsäuren ein integraler Teil von Zellmembranen und sind deshalb für die Verarbeitung von biologischer oder biochemischer Information unverzichtbar.

Fettsäuren können in zwei Gruppen eingeteilt werden: gesättigte Fettsäuren, gebildet aus Einzel-Kohlenstoffbindungen, und die ungesättigte Fettsäuren, welche eine oder mehrere Kohlenstoffdoppelbindungen in cis-Konfiguration enthalten. Ungesättigte Fettsäuren werden durch terminale Desaturasen erzeugt, welche der Klasse der Nicht-Häm-Eisenenzyme angehören. Sämtliche dieser Enzyme sind Teil eines Elektronen-Transportsystems, welches zwei weitere Proteine enthält, nämlich Cytochrom b5 und NADH-Cytochrom b5-Reduktase. Im Genauen katalysieren solche Enzyme die Bildung von Doppelbindungen zwischen den Kohlenstoffatomen eines Fettsäuremoleküls, zum Beispiel, durch Katalysieren der Sauerstoff-abhängigen Dehydrierung von Fettsäuren (Sperling et al., 2003). Menschen und andere Säuger besitzen ein begrenztes Spektrum an Desaturasen, welche für die Bildung von bestimmten Doppelbindungen in ungesättigten Fettsäuren erforderlich sind, und weisen daher ein beschränktes Vermögen zum Synthetisieren von essentiellen Fettsäuren, z. B. langkettigen mehrfach-ungesättigten Fettsäuren (LCPUFAs), auf. Somit müssen Menschen gewisse Fettsäuren über ihre Nahrung aufnehmen. Derartige essentielle Fettsäuren schließen zum Beispiel Linolsäure (C18:2), Linolensäure (C18:3) ein. Im Gegensatz dazu sind Insekten, Mikroorganismen und Pflanzen in der Lage, eine wesentlich größere Vielfalt an ungesättigten Fettsäuren und deren Derivative zu synthetisieren. Tatsächlich ist die Biosynthese von Fettsäuren eine Hauptaktivität von Pflanzen und Mikroorganismen.

Langkettige mehrfach-ungesättigte Fettsäuren (LCPUFAs), wie Docosahexaensäure (DHA, 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19)) sind essentielle Komponenten von Zellmembranen von verschiedenen Geweben und Organellen in Säugern (Nerven, Retina, Hirn und Immunzellen). Zum Beispiel sind über 30% der Fettsäuren in Hirn-Phospholipid 22:6 (n-3) und 20:4 (n-6) (Crawford, M. A., et al., (1997) Am. J. Clin. Nutr. 66: 1032S–1041S). In der Retina macht DHA mehr als 60% der gesamten Fettsäuren im Stäbchen-Außensegment, dem lichtempfindlichen Teil der Photorezeptor-Zelle, aus (Giusto, N. M. et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315–391). Klinische Studien haben gezeigt, dass DHA für das Wachstum und die Entwicklung des Gehirns bei Kleinkindern und für die Beibehaltung der normalen Hirnfunktion bei Erwachsenen wesentlich ist (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120: S129–S138). DHA besitzt auch signifikante Auswirkungen auf die Photorezeptorfunktion, die an dem Signaltransduktions-Prozess, an der Rhodopsinaktivierung und an der Entwicklung von Stäbchen und Zäpfchen beteiligt sind (Giusto, N. M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315–391). Darüber hinaus wurden auch einige positive Effekte von DHA gegenüber Erkrankungen, wie Bluthochdruck, Arthritis, Atherosklerose, Depression, Thrombose und Krebserkrankungen, gefunden (Horrocks, L. A. und Yeo, Y. K. (1999) Pharmacol. Res. 40: 211–215). Deshalb ist eine angemessene nahrungsgebundene Zufuhr der Fettsäure für die Gesundheit des Menschen bedeutsam. Weil solche Fettsäuren nicht effizient von Kleinkindern, jungen Kindern und älteren Menschen synthetisiert werden können, ist es besonders wichtig für diese Individuen, diese Fettsäuren angemessen mit der Nahrung aufzunehmen (Spector, A. A. (1999) Lipids 34: S1–S3).

Gegenwärtig sind die Hauptquellen von DHA Öle aus Fisch und Algen. Fischöl ist eine hauptsächliche und traditionelle Quelle für diese Fettsäure, wobei es jedoch zum Verkaufszeitpunkt in der Regel oxidiert ist. Darüber hinaus ist das Angebot an Fischöl in hohem Maße variabel, insbesondere in Hinsicht auf die schrumpfenden Fischpopulationen. Darüber hinaus ist die Algenquelle für Öl wegen des niedrigen Ertrags und den hohen Kosten der Extraktion kostspielig.

Sowohl EPA als auch ARA sind essentielle Fettsäuren. Sie bilden eine einzigartige Klasse von Nahrangs- und Futtermittelbestandteilen für Menschen und Tiere. EPA gehört zur n-3-Serie mit fünf Doppelbindungen in der Acylkette. EPA wird in Nahrungsmitteln aus dem Meer gefunden und kommt in öligem Fisch aus dem Nordatlantik reichlich vor. ARA gehört zur n-6-Serie mit vier Doppelbindungen. Das Fehlen einer Doppelbindung in der ω-3-Position verleiht ARA andere Eigenschaften als jene, die in EPA gefunden werden. Die aus ARA produzierten Eicosanoide weisen starke entzündliche und Blutplättchen-aggregierende Eigenschaften auf, wohingegen jene, die aus EPA abgeleitet sind, entzündungshemmende und gegen die Blutplättchen-Aggregierung gerichtete Eigenschaften aufweisen. ARA kann aus manchen Nahrungsmitteln, wie Fleisch, Fisch und Eiern, aufgenommen werden, aber die Konzentration ist niedrig.

Gamma-Linolensäure (GLA) ist eine weitere, in Säugern vorgefundene essentielle Fettsäure. GLA ist die metabolische Zwischenstufe für sehr langkettige n-6-Fettsäuren und für diverse aktive Moleküle. In Menschen ist die Geschwindigkeit der Bildung von langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren durch die Δ6-Entsättigung beschränkt. Es wurde nachgewiesen, dass zahlreiche physiologische und pathologische Zustände, wie Altern, Stress, Diabetes, Ekzem und manche Infektionen, den Δ6-Entsättigungsschritt senken bzw. unterdrücken. Darüber hinaus wird GLA leicht durch die Oxidation und rasche Zellteilung katabolisiert, welche mit bestimmten Erkrankungen, z. B. Krebs oder Entzündung, einhergehen. Deswegen kann eine Nahrungsergänzung mit GLA die Gefahren dieser Krankheiten verringern. Klinische Studien haben gezeigt, dass die Nahrungsergänzung mit GLA zur Behandlung einiger pathologischer Zustände, wie etwa atopischem Ekzem, prämenstruellem Syndrom, Diabetes, Hypercholesterinämie und entzündlichen sowie kardiovaskulären Krankheiten, wirksam ist.

Obwohl die Biotechnologie einen attraktiven Weg zur Herstellung von speziellen Fettsäuren bietet, versagen derzeitige Techniken darin, einen effizienten Weg für die großtechnische Herstellung von ungesättigten Fettsäuren zur Verfügung zu stellen. Dementsprechend besteht ein Bedarf an einem verbesserten und effizienten Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren, wie DHA, EPA und ARA.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

  • a) einer Nukleinsäuresequenz mit einer Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NRn: 1 oder 3 gezeigt;
  • b) einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NRn: 2 oder 4 gezeigt;
  • c) einer Nukleinsäuresequenz, die mindestens 50% identisch zur Nukleinsäuresequenz von a) oder b) ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit Dehydratase/Enoyl-CoA-Reduktase (nECR)-Aktivität codiert;
  • d) einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid mit nECR-Aktivität codiert und eine Aminosäuresequenz aufweist, welche mindestens 50% identisch zur Aminosäuresequenz von einem beliebigen von a) bis c) ist; und
  • e) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an ein beliebiges von a) bis d) in der Lage ist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid mit nECR-Aktivität codiert.

Der Begriff ”Polynukleotid”, wie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, betrifft ein Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein Polypeptid mit Dehydratase/Enoyl-CoA-Reduktase(nECR)-Aktivität codiert. Vorzugsweise soll das von dem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung codierte Polypeptid mit nECR-Aktivität nach der Expression in einer Pflanze zur Erhöhung der Menge an PUFA und insbesondere LCPUFA, z. B. in Samenölen oder der ganzen Pflanze oder Teilen davon, in der Lage sein. Eine derartige Erhöhung ist vorzugsweise statistisch signifikant, wenn mit einer LCPUFA-produzierenden transgenen Kontrollpflanze verglichen wird, die den zur LCPUFA-Synthese erforderlichen minimalen Satz an Desaturasen und Elongasen exprimiert, aber nicht das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung exprimiert. Ob eine Erhöhung signifikant ist, kann durch im Fachgebiet allgemein bekannte statistische Tests bestimmt werden, einschließlich z. B. dem t-Test nach Student. Weiter bevorzugt ist die Erhöhung eine Erhöhung der Menge von LCPUFA-enthaltenden Triglyceriden um mindestens 5%, mindestens 10%, mindestens 15%, mindestens 20% oder mindestens 30% im Vergleich zu der Kontrolle. Vorzugsweise ist das oben genannte LCPUFA eine mehrfach-ungesättigte Fettsäure mit einem C-20-, C-22- oder C24-Fettsäurekörper, weiter bevorzugt ARA, EPA oder DHA. Geeignete Testverfahren zur Messung der oben genannten Aktivitäten sind in den begleitenden Beispielen beschrieben.

Der Begriff ”nECR-Aktivität” oder ”Dehydratase/Enoyl-CoA-Reduktase-Aktivität”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die kombinierte Aktivität einer Enoyl-CoA-Reduktase und einer Dehydratase, d. h. das Enzym mit der kombinierten Aktivität soll zum Entfernen einer Hydroxylgruppe aus 3-Hydroxy-Acyl-CoA und zum Reduzieren der gebildeten Doppelbindung, als Teil des Elongationsprozesses für Fettsäuren, in der Lage sein. Eine Fettsäure-Elongation wird in vier Schritten katalysiert, die durch vier Enzyme repräsentiert werden: KCS (Keto-Acyl-CoA-Synthase), KCR (Keto-Acyl-CoA-Reduktase), DH (Dehydratase) und ECR (Enoyl-CoA-Reduktase). Im ersten Schritt wird ein Fettsäure-CoA-Ester mit Malonyl-CoA kondensiert, wobei ein Keto-Acyl-CoA-Intermediat, das um zwei Kohlenstoffatome verlängert ist, und CO2 erzeugt werden. Die Ketogruppe des Intermediats wird dann durch die KCR zu einer Hydroxylgruppe reduziert. Im nächsten Schritt spaltet die DH die Hydroxylgruppe ab (H2O wird erzeugt), wobei ein Acyl-2-en-CoA-Ester (delta-2-Enoyl-CoA) gebildet wird. Im letzten Schritt wird die Doppelbindung an Position 2, 3 durch die ECR reduziert, wobei der elongierte Acyl-CoA-Ester gebildet wird (Buchanan, Gruissem, Jones (2000) Biochemistry & Molecular biology of plants, American Society of Plant Physiologists). In den dieser Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen ist eine natürlich vorkommende Fusion von DH und ECR mit überlegenen katalytischen Aktivitäten und Spezifitäten für LCPUFA bereitgestellt worden.

Weiter bevorzugt zeigen Polynukleotide mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in SEQ ID NRn: 1 oder 3 gezeigt, welche Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, wie in SEQ ID NRn: 2 oder 4 gezeigt, codieren, oder Varianten davon, vorzugsweise nECR-Aktivität.

Ein Polynukleotid, das ein Polypeptid mit einer nECR-Aktivität, wie oben spezifiziert, codiert, wurde in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung vorzugsweise aus Thalassiosira pseudonana oder Phaeodactylum tricornutum erhalten. Allerdings können Orthologe, Paraloge oder andere Homologe aus anderen Spezies identifiziert werden. Vorzugsweise werden sie aus Pflanzen, wie Algen, zum Beispiel Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium, Algen/Diatomeen wie Phaeodactylum, Thalassiosira oder Thraustochytrium, Moosen, wie Physcomitrella oder Ceratodon, oder höheren Pflanzen, wie den Primulaceae, wie Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens oder Osteospermum hyoseroides, Mikroorganismen wie Pilzen, wie Aspergillus, Phytophthora, Entomophthora, Mucor oder Mortierella, Bakterien, wie Shewanella, Hefen oder Tieren erhalten. Bevorzugte Tiere sind Nematoden, wie Caenorhabditis, Insekten oder Wirbeltiere. Unter den Wirbeltieren können die Nukleinsäuremoleküle vorzugsweise aus Euteleostami, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae oder Oncorhynchus, weiter bevorzugt aus der Ordnung der Salmoniformes, am meisten bevorzugt der Familie Salmonidae, wie der Gattung Salmo, zum Beispiel aus den Gattungen und Spezies Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta oder Salmo trutta fario, abgeleitet werden. Außerdem können die Nukleinsäuremoleküle aus den Diatomeen, wie etwa den Gattungen Thallasiosira oder Phaeodactylum, erhalten werden.

Somit beinhaltet der Begriff ”Polynukleotid”, wie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, fernerhin Varianten der oben erwähnten spezifischen Polynukleotide, welche Orthologe, Paraloge oder sonstige Homologe des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung repräsentieren. Außerdem schließen Varianten des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung auch künstlich erzeugte Muteine ein. Die Muteine schließen z. B. Enzyme, welche durch Mutagenesetechniken erzeugt werden und welche verbesserte oder veränderte Substratspezifität zeigen, oder Codonoptimierte Polynukleotide ein. Die Polynukleotidvarianten umfassen vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz von den oben genannten spezifischen, in einer beliebigen von SEQ ID NRn: 1 oder 3 gezeigten Nukleinsäuresequenzen oder von einem Polynukleotid, das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID NRn: 2 oder 4 gezeigt, codiert, durch mindestens eine Nukleotidsubstitution, -addition und/oder -deletion abgeleitet sein kann, wobei die Varianten-Nukleinsäuresequenz immer noch ein Polypeptid mit einer nECR-Aktivität, wie oben spezifiziert, codieren soll. Varianten beinhalten auch Polynukleotide, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, welche, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, zum Hybridisieren an die zuvor erwähnten spezifischen Nukleinsäuresequenzen in der Lage ist. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6, gefunden werden. Ein bevorzugtes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C. Der Fachmann weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen abhängig vom Typ der Nukleinsäure und, zum Beispiel, bei Gegenwart von organischen Lösungsmitteln, in Bezug auf die Temperatur und Konzentration des Puffers abweichen. Zum Beispiel variiert unter ”Standard-Hybridisierungsbedingungen” die Temperatur abhängig vom Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Wenn organisches Lösungsmittel, zum Beispiel 50% Formamid, in dem oben erwähnten Puffer vorhanden ist, beträgt die Temperatur unter Standardbedingungen ungefähr 42°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride sind vorzugsweise 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride sind vorzugsweise 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben erwähnten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure mit ungefähr 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G+C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie man die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen bestimmt, indem man auf Lehrbücher Bezug nimmt, wie das oben erwähnte Textbuch, oder die folgenden Lehrbücher: Sambrook et al., ”Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames und Higgins (Hrsg.) 1985, ”Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.) 1991, ”Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford. Alternativ dazu, sind Polynukleotidvarianten durch PCR-basierte Techniken erhältlich, wie etwa gemischte Oligonukleotidprimer-basierte Amplifikation von DNA, d. h. unter Verwendung degenerierter Primer gegen konservierte Domänen der Polypeptide der vorliegenden Erfindung. Konservierte Domänen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung können durch einen Sequenzvergleich der Nukleinsäuresequenzen der Polynukleotide oder der Aminosäuresequenzen der Polypeptide der vorliegenden Erfindung identifiziert werden. Oligonukleotide, die als PCR-Primer geeignet sind, sowie geeignete PCR-Bedingungen sind in den begleitenden Beispielen beschrieben. Als Matrize kann DNA oder cDNA aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Tieren verwendet werden. Ferner schließen Varianten Polynukleotide ein, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, welche mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch zu den, in einer beliebigen von SEQ ID NRn: 1 oder 3 gezeigten Nukleinsäuresequenzen sind, die vorzugsweise Polypeptide codieren, welche eine nECR-Aktivität, wie oben spezifiziert, beibehalten. Außerdem sind auch Polynukleotide eingeschlossen, welche Nukleinsäuresequenzen umfassen, die ein Polypeptid mit Aminosäuresequenzen codieren, welche mindestens 50%, mindestens 55%, mindestens 60%, mindestens 65%, mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch zu den Aminosäuresequenzen sind, die in einer beliebigen von SEQ ID NRn: 2 oder 4 gezeigt sind, wobei das Polypeptid vorzugsweise nECR-Aktivität, wie oben spezifiziert, beibehält. Die prozentualen Identitätswerte werden vorzugsweise über die gesamte Aminosäure- oder Nukleinsäure-Sequenzregion berechnet. Eine Reihe von Programmen, basierend auf einer Vielzahl von Algorithmen, steht dem Fachmann zum Vergleichen verschiedener Sequenzen zur Verfügung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Algorithmus von Needleman und Wunsch (Needleman 1970, J. Mol. Biol. (48): 444–453) bestimmt, der in das Needle-Programm im EMBOSS-Software-Paket (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I., und Bleasby, A., Trends in Genetics 16(6), 276–277, 2000) eingebunden wurde, wobei entweder eine BLOSUM 45- oder PAM250-Wertungsmatrix für entfernt verwandte Proteine, oder entweder eine BLOSUM 62- oder PAM160-Wertungsmatrix für näher verwandte Proteine, und ein Lückenöffnungs-Strafwert von 16, 14, 12, 10, 8, 6, oder 4 und ein Lückenerweiterungs-Strafwert von 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, oder 6 zur Anwendung kommen. Anleitungen zur lokalen Installation des EMBOSS-Pakets sowie Links zu WEB-Services kann man unter http://emboss.sourceforge.net finden. Ein bevorzugtes, nicht-einschränkendes Beispiel von Parametern, die zum Alignieren von zwei Aminosäuresequenzen mit Hilfe des Needle-Programms verwendet werden sollen, sind die Vorgabeparameter, welche die EBLOSUM62-Wertungsmatrix, einen Lückenöffnungsstrafwert von 10 und einen Lückenerweiterungsstrafwert von 0,5 einschließen. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotidsequenzen unter Verwendung des Needle-Programms im EMBOSS-Softwarepaket (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I. und Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276–277, 2000), mit Hilfe der EDNAFULL-Wertungsmatrix und einem Lückenöffnungsstrafwert von 16, 14, 12, 10, 8, 6, oder 4 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, oder 6 bestimmt. Ein bevorzugtes, nicht-einschränkendes Beispiel von Parametern, die zusammenwirkend zur Alignierung zweier Sequenzen mit Hilfe des Needle-Programms zu verwenden sind, sind die Vorgabeparameter, welche die EDNAFULL-Wertungsmatrix, einen Lückenöffnungsstrafwert von 10 und einen Lückenerweiterungsstrafwert von 0,5 einschließen. Die Nukleinsäure- und Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung können ferner als eine ”Suchsequenz” verwendet werden, um eine Suche gegen öffentliche Datenbanken durchzuführen, um zum Beispiel andere Familienmitglieder oder verwandte Sequenzen zu identifizieren. Derartige Suchen können unter Verwendung der BLAST-Programmserie (Version 2.2) von Altschul et al. (Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–10) durchgeführt werden. BLAST unter Verwendung von nECR-Nukleinsäuresequenzen der Erfindung als Suchsequenz kann mit BLASTn, BLASTx oder dem Programm tBLASTx unter Verwendung von Standardparametern durchgeführt werden, um entweder Nukleotidsequenzen (BLASTn, tBLASTx) oder Aminosäuresequenzen (BLASTx) zu erhalten, welche homolog zu nECR-Sequenzen der Erfindung sind. BLAST unter Verwendung von nECR-Proteinsequenzen der Erfindung als Suchsequenz kann mit dem BLASTp- oder dem tBLASTn-Programm unter Verwendung von Standardparametern durchgeführt werden, um entweder Aminosäuresequenzen (BLASTp) oder Nukleinsäuresequenzen (tBLASTn) zu erhalten, welche homolog zu nECR-Sequenzen der Erfindung sind. Zum Erhalt von lückenhaltigen Alignments zu Vergleichszwecken kann ”Gapped BLAST” unter Verwendung von Standardparametern angewandt werden, wie in Altschul et al. (Altschul 1997, Nucleic Acids Res. 25(17): 3389–3402) beschrieben. Tabelle 1: Beziehung der Sequenztypen von Such- und Treffer-Sequenzen für verschiedene BLAST-Programme

Input-Suchsequenzkonverierte SucheAlgorithmuskonvertierter TrefferTatsächliche DatenbankDNABLASTnDNAPRTBLASTpPRTDNAPRTBLASTxPRTPRTtBLASTnPRTDNADNAPRTtBLASTxPRTDNA

Ein Polynukleotid, das ein Fragment von beliebigen der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen umfasst, ist ebenfalls als ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung inbegriffen. Das Fragment soll ein Polypeptid codieren, das immer noch nECR-Aktivität, wie oben spezifiziert, aufweist. Demzufolge kann das Polypeptid die Domänen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, welche die besagte biologische Aktivität verleihen, umfassen oder daraus bestehen. Ein Fragment, wie hierin gemeint, umfasst vorzugsweise mindestens 50, mindestens 100, mindestens 250 oder mindestens 500 aufeinanderfolgende Nukleotide von einer beliebigen der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen oder codiert eine Aminosäuresequenz, die mindestens 20, mindestens 30, mindestens 50, mindestens 80, mindestens 100 oder mindestens 150 aufeinanderfolgende Aminosäuren von einer beliebigen der oben erwähnten Aminosäuresequenzen umfasst.

Die oben genannten Variantenpolynukleotide oder Fragmente codieren vorzugsweise Polypeptide, welche nECR-Aktivität zu einem signifikanten Ausmaß, vorzugsweise zu mindestens 10%, mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% oder mindestens 90% der nECR-Aktivität, welche von einem beliebigen der in einer beliebigen von SEQ ID NRn: 2 oder 4 gezeigten Polypeptide aufgezeigt wird, beibehalten. Die Aktivität kann wie in den begleitenden Beispielen beschrieben getestet werden.

Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung bestehen entweder im Wesentlichen aus den oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen oder umfassen die oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen. Somit können sie auch weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten. Vorzugsweise kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu einem offenen Leserahmen weitere untranslatierte Sequenz am 3'- und am 5'-Ende der codierenden Genregion umfassen: mindestens 500, vorzugsweise 200, weiter bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes der codierenden Region und mindestens 100, vorzugsweise 50, weiter bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes der der codierenden Genregion. Darüber hinaus können die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung Fusionsproteine codieren, worin ein Partner des Fusionsproteins ein Polypeptid ist, das durch eine oben genannte Nukleinsäuresequenz codiert wird. Solche Fusionsproteine können als zusätzlichen Teil andere Enzyme der Fettsäure- oder PUFA-Biosynthesewege, Polypeptide zur Überwachung der Expression (z. B. grün, gelb, blau oder rot fluoreszierende Proteine, alkalische Phosphatase und dergleichen) oder sogenannte ”Tags” umfassen, die als ein detektierbarer Marker oder als Hilfsmaßnahme zu Reinigungszwecken dienen können. Tags für die verschiedenen Zwecke sind im Fachgebiet allgemein bekannt und umfassen FLAG-Tags, 6-Histidin-Tags, MYC-Tags und dergleichen.

Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung soll vorzugsweise entweder als ein isoliertes Polynukleotid (d. h. gereinigt oder zumindest isoliert aus seinem natürlichen Kontext, wie etwa seinem natürlichen Gen-Locus) oder in genetisch modifizierter oder exogen (d. h. künstlich) manipulierter Form bereitgestellt werden. Ein isoliertes Polynukleotid kann zum Beispiel weniger als ungefähr 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen umfassen, welche das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure abgeleitet ist, von Natur aus flankieren. Das Polynukleotid wird vorzugsweise in der Form eines doppel- oder einzelsträngigen Moleküls bereitgestellt. Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung mit der Bezugnahme auf beliebige der oben erwähnten Polynukleotide der Erfindung ebenfalls komplementäre oder reverse komplementäre Stränge der spezifischen Sequenzen oder Varianten davon, welche vorangehend aufgeführt wurden, betrifft. Das Polynukleotid schließt DNA, einschließlich cDNA und genomischer DNA, oder RNA-Polynukleotide ein.

Allerdings betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls Polynukleotidvarianten, welche aus den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind und zur Störung bzw. Querbeeinflußung der Transkription oder Translation der Polynukleotide der vorliegenden Erfindung in der Lage sind. Derartige Variantenpolynukleotide schließen Antisense-Nukleinsäuren, Ribozyme, siRNA-Moleküle, Morpholino-Nukleinsäuren (Phosphordiamidat-Morpholino-Oligos), Tripelhelix bildende Oligonukleotide, inhibitorische Oligonukleotide, oder Mikro-RNA-Moleküle ein, von denen alle das Polynukleotid der Erfindung aufgrund der Anwesenheit von komplementären oder im Wesentlichen komplementären Sequenzen spezifisch erkennen sollen. Diese Techniken sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Geeignete Variantenpolynukleotide der oben genannten Art können leicht auf Grundlage der Struktur der Polynukleotide dieser Erfindung entworfen werden.

Darüber hinaus sind auch chemisch modifizierte Polynukleotide, einschließlich natürlich vorkommenden modifizierten Polynukleotiden, wie etwa glycosylierten oder methylierten Polynukleotiden, oder künstlich modifizierten, wie etwa biotinylierten Polynukleotiden, eingeschlossen.

In den der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen wurden in vorteilhafter Weise Polynukleotide identifiziert, welche Dehydratasen von Thalassiosira pseudonana und Phaeodactylum tricornumtum codieren. Insbesondere sind die Thalassiosira pseudonana- und Phaeodactylum-Dehydratase/Enoyl-CoA-Reduktase nECR identifiziert worden [nECR(Tp) und nECR(Pt)]. Jede dieser nECR ist zum Entfernen einer Hydroxylgruppe aus 3-Hydroxyacyl-CoA und zum Reduzieren der gebildeten Doppelbindung als Teil des Elongationsprozesses für Fettsäuren in der Lage. So wurde zum Beispiel herausgefunden, dass die Expression der nECR(Tp) und nECR(Pt) in einer Saccharomyces cerevisae-Mutante, die nicht zum Elongieren von Fettsäuren fähig gewesen ist, den Elongationsprozess wiederherstellt. Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung sind besonders für die rekombinante Herstellung von LCPUFAs und insbesondere von ARA, EPA und/oder DHA geeignet.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung umfasst das Polynukleotid ferner eine Expressions-Steuerungssequenz, die operativ an die Nukleinsäuresequenz verknüpft ist.

Der Begriff ”Expressions-Steuerungssequenz”, wie hierin verwendet, bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, welche zum Regeln, d. h. Initiieren und Steuern, der Transkription einer Nukleinsäuresequenz von Interesse, im vorliegenden Fall der oben genannten Nukleinsequenzen, in der Lage ist. Eine derartige Sequenz umfasst üblicherweise einen Promotor oder eine Kombination von einem Promotor und Enhancersequenzen, oder besteht daraus. Die Expression eines Polynukleotids umfasst die Transkription des Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise in eine translatierbare mRNA. Zusätzliche regulatorische Elemente können transkriptionelle sowie translationale Enhancer einschließen. Die folgenden Promotoren und Expressions-Steuerungssequenzen können vorzugsweise in einem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Promotoren cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR oder λ-PL werden vorzugsweise in gramnegativen Bakterien verwendet. Für grampositive Bakterien können die Promotoren amy und SPO2 verwendet werden. Unter den Hefe- oder Pilz-Promotoren werden vorzugsweise ADC1, AOX1r, GAL1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH verwendet. Für tierische Zell- oder Organismus-Expression werden vorzugsweise die Promotoren CMV-, SV40-, RSV-Promotor (Rous-Sarkom-Virus), CMV-Enhancer, SV40-Enhancer verwendet. Aus Pflanzen die Promotoren CaMV/35S (Franck 1980, Cell 21: 285–294), PRP1 (Ward 1993, Plant. Mol. Biol. 22), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Ebenfalls bevorzugt in diesem Kontext sind induzierbare Promotoren, wie die Promotoren, welche in EP 0 388 186 A1 (d. h. ein Benzylsulfonamid-induzierbarer Promotor), Gatz 1992, Plant J. 2: 397–404 (d. h. ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor), EP 0 335 528 A1 (d. h. ein Abscisinsäure-induzierbarer Promotor) oder WO 93/21334 (d. h. ein Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbarer Promotor) beschrieben sind. Weitere geeignete pflanzliche Promotoren sind der Promotor von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI-Promotor aus Kartoffel (Stockhaus 1989, EMBO J. 8, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphat-Amidotransferase-Promotor aus Glycine max (Genbank Zugangs-Nr. U87999) oder der Nodus-spezifische Promotor, der in EP 0 249 676 A1 beschrieben ist. Besonders bevorzugt sind Promotoren, welche die Expression in Geweben ermöglichen, die an der Biosynthese von Fettsäuren beteiligt sind. Ebenfalls besonders bevorzugt sind Samen-spezifische Promotoren, wie der USP-Promotor, je nach der Praxis bzw. Ausführung, aber auch andere Promotoren, wie die LeB4-, DC3-, Phaseolin- oder Napin-Promotoren. Weitere besonders bevorzugte Promotoren sind Samen-spezifische Promotoren, welche für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und welche beschrieben sind in US 5 608 152 (Napin-Promotor aus Ölsamenraps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arabidopsis, US 5 504 200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica), bei Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233–239 (LeB4-Promotor aus einer Leguminose), wobei diese Promotoren für Dikotyle geeignet sind. Die folgenden Promotoren sind für Monokotyle geeignet: Ipt-2- oder Ipt-1-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), Hordein-Promotor aus Gerste, und andere Promotoren, welche geeignet sind und welche in WO 99/16890 beschrieben sind. Im Prinzip, ist es möglich, für das neue Verfahren alle natürlichen Promotoren zusammen mit ihren regulatorischen Sequenzen, wie jenen, die oben erwähnt wurden, zu verwenden. In gleicher Weise ist es möglich und vorteilhaft, synthetische Promotoren zu verwenden, entweder zusätzlich oder allein, insbesondere wenn sie eine Samen-spezifische Expression vermitteln, zum Beispiel wie es in WO 99/16890 beschrieben ist. In einer besonderen Ausführungsform werden Samen-spezifische Promotoren verwendet, um die Herstellung der gewünschten PUFA oder LCPUFA zu steigern.

Der Begriff ”operativ verknüpft”, wie hierin verwendet, bedeutet, dass die Expressions-Steuerungssequenz und die Nukleinsäure von Interesse so verknüpft sind, dass die Expression der Nukleinsäure von Interesse von der Expressions-Steuerungssequenz reguliert werden kann, d. h. die Expressions-Steuerungssequenz soll funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein. Demgemäß können die Expressions-Steuerungssequenz und die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz physikalisch miteinander verknüpft sein, z. B. durch Inserieren der Expressions-Steuerungssequenz am 5'-Ende der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz. Alternativ dazu können die Expressions-Steuerungssequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure lediglich in physikalischer Nähe liegen, so dass die Expressions-Steuerungssequenz zum Regulieren der Expression von mindestens einer Nukleinsäuresequenz von Interesse in der Lage ist. Die Expressions-Steuerungssequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure sind vorzugsweise durch nicht mehr als 500 bp, 300 bp, 100 bp, 80 bp, 60 bp, 40 bp, 20 bp, 10 bp oder 5 bp getrennt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung umfasst das Polynukleotid ferner eine Terminatorsequenz, die operativ mit der Nukleinsäuresequenz verknüpft ist.

Der Begriff ”Terminator”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, welche zum Beenden der Transkription in der Lage ist. Diese Sequenzen verursachen die Dissoziation der Transkriptionsmachinerie von der zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz. Vorzugsweise soll der Terminator in Pflanzen, und insbesondere in Pflanzensamen, aktiv sein. Geeignete Terminatoren sind im Fachgebiet bekannt und schließen vorzugsweise Polyadenylierungssignale, wie die SV40-poly-A-Stelle oder die tk-poly-A-Stelle oder eines der pflanzenspezifischen Signale, die in Loke et al. (Loke 2005, Plant Physiol 138, S. 1457–1468) aufgeführt sind, stromabwärts der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ein.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor, der das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst.

Der Begriff ”Vektor” beinhaltet vorzugsweise Phagen-, Plasmid-, virale Vektoren sowie künstliche Chromosomen, wie künstliche Bakterien- oder Hefe-Chromosomen. Außerdem bezieht sich der Begriff auch auf Targetingkonstrukte, welche die zufällige oder ortsgerichtete Integration des Targetingkonstrukts in genomische DNA erlauben. Solche Targetingkonstrukte umfassen vorzugsweise DNA von ausreichender Länge für eine entweder homologe oder heterologe Rekombination, wie es nachstehend im Einzelnen beschrieben wird. Der Vektor, der das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung beinhaltet, umfasst vorzugsweise ferner selektierbare Marker zur Vermehrung und/oder zur Selektion in einem Wirt. Der Vektor kann durch verschiedene im Fachgebiet allgemein bekannte Techniken in eine Wirtszelle eingeführt werden. Nachdem er in eine Wirtszelle eingebracht worden ist, kann der Vektor im Cytoplasma vorliegen oder kann in das Genom eingebaut werden. Im letztgenannten Fall versteht es sich, dass der Vektor ferner Nukleinsäuresequenzen umfassen kann, die eine homologe Rekombination oder heterologe Insertion erlauben. Vektoren können über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken in prokaryotische oder eukaryotische Zellen eingebracht werden. Die Begriffe ”Transformation” und ”Transfektion”, Konjugation und Transduktion, wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (zum Beispiel DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat-, Rubidiumchlorid- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, Kohlenstoff-basierten Clustern, chemisch vermitteltem Transfer, Elektroporation oder Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, können in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laborhandbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, gefunden werden. Alternativ kann ein Plasmidvektor durch Hitzeschock- oder Elektroporationstechniken eingeführt werden. Sollte es sich bei dem Vektor um ein Virus handeln, kann es mit Hilfe einer passenden Verpackungs-Zelllinie vor dem Anwenden auf Wirtszellen in vitro verpackt werden.

Vorzugsweise ist der hier umschriebene Vektor als Klonierungsvektor geeignet, d. h. in mikrobiellen Systemen replizierbar. Derartige Vektoren sichern eine effiziente Klonierung in Bakterien, und, vorzugsweise, Hefen oder Pilzen, und ermöglichen die stabile Transformation von Pflanzen. Insbesondere müssen hierbei diverse binäre und co-integrierte Vektorsysteme genannt werden, die für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignet sind. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakterium-vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen, wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit denen entsprechend transformierte Wirtszellen oder Organismen identifiziert werden können. Während bei co-integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA, und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen, trägt. Als Folge davon sind die letztgenannten Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren, und können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterium repliziert werden. Zu diesen binären Vektoren zählen Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden Bin19, pBl101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung kann in Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451, gefunden werden. Ferner können die Polynukleotide durch Verwenden entsprechender Klonierungsvektoren in Wirtszellen oder Organismen, wie Pflanzen oder Tiere, eingebracht werden und somit bei der Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie jenen, die in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 205–225, veröffentlicht und zitiert sind.

Weiter bevorzugt ist der Vektor der vorliegenden Erfindung ein Expressionsvektor. In einem solchen Expressionsvektor, d. h. einem Vektor, der das Polynukleotid der Erfindung umfasst, ist die Nukleinsäuresequenz operativ mit einer Expressions-Steuerungssequenz verbunden (ebenfalls als ”Expressionskassette” bezeichnet), welche die Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder isolierten Fraktionen davon erlaubt. Geeignete Expressionsvektoren sind im Fachgebiet bekannt, wie etwa der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene) oder pSPORT1 (GIBCO BRL). Weitere Beispiele von typischen Fusions-Expressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith 1988, Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), worin Glutathion-S-transferase (GST), Maltose-Ebindendes Protein bzw. Protein A mit dem rekombinanten Zielprotein fusioniert sind. Beispiele von geeigneten induzierbaren Nichtfusion-E. coli-Expressionsvektoren sind, unter anderem, pTrc (Amann 1988, Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier 1990, Methods in Enzymology 185, 60–89). Die Zielgenexpression des pTrc-Vektors basiert auf der Transkription von einem hybriden trp-lac-Fusionspromotor aus durch Wirts-RNA-Polymerase. Die Zielgenexpression aus dem pET 11d-Vektor basiert auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusionspromotor aus, welche von einer coexprimierten viralen RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) aus einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der transkriptionellen Steuerung des lacUV 5-Promotors beherbergt. Der Fachmann ist mit anderen Vektoren vertraut, welche in prokaryotischen Organismen geeignet sind; diese Vektoren sind zum Beispiel, in E. coli, pLG338, pACYC184, die pBR-Serie, wie pBR322, die pUC-Serie, wie pUC18 oder pUC19, die M113mp-Serie, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 oder pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667. Beispiele von Vektoren für die Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYep Sec1 (Baldari 1987, Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan 1982, Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz 1987, Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren für die Konstruktion von Vektoren, welche zur Verwendung in anderen Pilzen geeignet sind, wie etwa den filamentäsen Pilzen, umfassen diejenigen, welche ausführlich beschrieben sind in: van den Hondel, C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991) ”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi”, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi (J. W. Bennett & L. L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego). Weitere geeignete Hefevektoren sind zum Beispiel pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Als Alternative können die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung auch in Insektenzellen unter Anwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, welche für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (zum Beispiel Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Serie (Smith 1983, Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Serie (Lucklow 1989, Virology 170: 31–39).

Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung kann in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239–251, und die darin zitierten Bezugsstellen, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (zum Beispiel Spermatophyten, wie anbaufähigen Nutzpflanzen) durch Verwendung von Pflanzenexpressionsvektoren exprimiert werden. Beispiele von Pflanzenexpressionsvektoren umfassen diejenigen, welche ausführlich in: Becker 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; Bevan 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, beschrieben werden. Eine Pflanzenexpressionskassette umfasst vorzugsweise regulatorische Sequenzen, welche zur Steuerung der Genexpression in Pflanzenzellen in der Lage sind, und welche funktionell so verknüpft sind, dass jede Sequenz ihre Funktion, wie etwa transkriptionelle Termination, erfüllen kann, zum Beispiel Polyadenylierungs-Signale. Bevorzugte Polyadenylierungs-Signale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA abgeleitet sind, wie dem Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5, das als Octopin-Synthase bekannt ist (Gielen 1984, EMBO J. 3, 835) oder funktionale Äquivalente derselben, aber alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell aktiv sind, sind auch geeignet. Da Pflanzen-Genexpression sehr häufig nicht auf transkriptionelle Spiegel beschränkt ist, umfasst eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere funktionell verknüpfte Sequenzen, wie Translationsenhancer, zum Beispiel die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Tabakmosaikvirus-Leadersequenz umfasst, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht (Gallie 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711). Wie oben beschrieben, muss Pflanzen-Genexpression funktionell mit einem geeigneten Promotor verknüpft sein, der die Expression des Gens in einer zeitlichen, zellspezifischen oder gewebespezifischen Weise ausführt. Promotoren, die verwendet werden können, sind konstitutive Promotoren (Benfey 1989, EMBO J. 8: 2195–2202) wie jene, die aus Pflanzenviren abgeleitet sind, wie etwa 35S CAMV (Franck 1980, Cell 21: 285–294), 19S CaMV (siehe US 5 352 605 und WO 84/02913) oder pflanzliche Promotoren, wie der Promotor der kleinen Rubisco-Untereinheit, der in US 4 962 028 beschrieben ist. Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Lenkung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment (siehe eine Übersicht in Kermode 1996, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4: 285–423 und darin zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen, notwendig sind. Die Pflanzengenexpression kann, wie oben beschrieben, auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtert werden (siehe eine Übersicht in Getz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass Gene auf zeitspezifische Weise exprimiert werden. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Getz 1992, Plant J. 2, 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor. Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1-Gen-Promotor (Ward 1993, Plant Mol. Biol. 22: 361–366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor aus Tomate (US 5 187 267), der kälteinduzierbare Alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinII-Promotor (EP 0 375 091 A). Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Expression von Genen in Geweben und Organen, in denen die Fettsäure-, Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos, herbeiführen. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Ölsamenraps (US 5 608 152), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein 1991, Mol. Gen. Genet. 225 (3): 459–67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5 504 200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Baeumlein 1992, Plant Journal, 2 (2): 233–9), sowie Promotoren, welche die Samen-spezifische Expression in monokotylen Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis und dergleichen herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der Ipt2- oder Ipt1-Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gerste-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen). Dergleichen sind Promotoren besonders geeignet, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Synthetisierung der Vorläufer und mancher Endprodukte der Lipidbiosynthese erfolgt. Geeignete Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind in WO 95/16783 und WO 97/06250 beschrieben, und der clpP-Promotor aus Arabidopsis wird in WO 99/46394 beschrieben.

Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über Vektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen. Weitere Vektoren sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsg.: Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Für weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe die Kapitel 16 und 17 von Sambrook, a. a. O.

Aus dem oben genannten ergibt sich, dass der Vektor vorzugsweise ein Expressionsvektor ist. Weiter bevorzugt steht das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung unter der Steuerung eines Samen-spezifischen Promotors in dem Vektor der vorliegenden Erfindung. Ein bevorzugter Samen-spezifischer Promotor, wie hierin gemeint, wird gewählt aus der Gruppe, die aus Conlinin 1, Conlinin 2, Napin, LuFad3, USP, LeB4, Arc, Fae, ACP, LuPXR und SBP besteht. Zu Einzelheiten sehe z. B. US 2003-0159174.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, welche das Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst.

Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine pflanzliche Zelle und, weiter bevorzugt, eine aus einer Ölsaat-Nutzpflanze erhaltene pflanzliche Zelle. Weiter bevorzugt wird die Ölsaat-Nutzpflanze aus der Gruppe gewählt, die aus Flachs (Linum sp.), Raps (Brassica sp.), Sojabohne (Glycine und Soja sp.), Sonnenblume (Helianthus sp.), Baumwolle (Gossypium sp.), Mais (Zea mays), Olive (Olea sp.), Saflor (Carthamus sp.), Kakao (Theobroma cacoa), Erdnuss (Arachis sp.), Hanf, Camelina, Crambe, Ölpalme, Kokosnüssen, Erdnüssen, Sesamsaat, Kastorbohne, Lesquerella, Talgbaum, Sheanuss, Turgnuss, Kapok-Frucht, Mohnsamen, Jojobasamen und Perilla besteht.

Ebenfalls bevorzugt, ist die Wirtszelle ein Mikroorganismus. Weiter bevorzugt handelt es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium, einen Pilz oder Algen. Weiter bevorzugt wird er aus der Gruppe gewählt, die aus Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Yerrowia und Schizochytrium besteht.

Außerdem kann eine Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung auch eine tierische Zelle sein. Vorzugsweise ist die tierische Wirtszelle eine Wirtszelle aus einem Fisch oder eine daraus erhaltene Zelllinie. Weiter bevorzugt stammt die Fisch-Wirtszelle aus Hering, Lachs, Sardine, Rotbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch.

Im Allgemeinen werden die Regulierungsschritte bei der Herstellung von LCPUFAs, d. h. dem Weg der Biosynthese von langkettigen ungesättigten Fettsäuren, durch Membran-assoziierte Fettsäure-Elongase-Komplexe katalysiert. Pflanzen und die meisten anderen eukaryotischen Organismen besitzen ein spezialisiertes Elongasesystem für die Verlängerung von Fettsäuren über 18 C-Atome hinaus. Diese Elongasereaktionen haben mehrere wichtige Merkmale mit dem Fettsäuresynthase-Komplex (FAS) gemeinsam. Allerdings ist der Elongase-Komplex verschieden vom FAS-Komplex, da der Komplex im Cytosol lokalisiert ist und membrangebunden ist, ACP nicht beteiligt ist, und die Elongase 3-Keto-acyl-CoA-Synthase die Kondensation von Malonyl-CoA mit einem Acyl-Primer katalysiert. Der Elongase-Komplex besteht aus vier Komponenten mit unterschiedlichen katalytischen Funktionen, der Keto-acyl-CoA-Synthase (KCS, Kondensationsreaktion von Malonyl-CoA zu Acyl-CoA, Erzeugung einer um 2 C-Atome längeren Keto-acyl-CoA-Fettsäure), der Keto-acyl-CoA-Reduktase (KCR, Reduktion der 3-Ketogruppe zu einer 3-Hydroxygruppe), der Dehydratase (DH, Dehydratation führt zu einer delta-2-Enoyl-acyl-CoA-Fettsäure) und der Enoyl-CoA-Reduktase (ECR, Reduktion der Doppelbindung an Position 2, Freisetzung aus dem Komplex). Für die Herstellung von LCPUFAs, einschließlich ARA, EPA und/oder DHA, könnte die Elongationsreaktion essentiell sein. Höhere Pflanzen besitzen nicht den notwendigen Enzym-Satz, um LCPUFAs (4 oder mehr Doppelbindungen, 20 oder mehr C-Atome) herzustellen. Deshalb müssen die katalytischen Aktivitäten an die Pflanzen oder Pflanzenzellen verliehen werden. Ein kritischer Schritt im Vorgang der Elongation ist die Dehydratations- und Reduktionsreaktion. Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung katalysieren überraschenderweise die Dehydratations- und Reduktionsaktivität vermittels eines Enzyms. Durch Zuführen dieser nECR werden erhöhte Spiegel an PUFAs und LCPUFAs hergestellt.

Es versteht sich jedoch, dass abhängig von der Wirtszelle, weitere enzymatische Aktivitäten an die Wirtszellen vermittelt werden können, z. B. durch rekombinante Technologien. Folglich betrachtet die vorliegende Erfindung vorzugsweise eine Wirtszelle, welche zusätzlich zu dem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung Polynukleotide umfasst, die solche Desaturasen und/oder Elongasen codieren, wie sie in Abhängigkeit von der gewählten Wirtszelle benötigt werden. Bei bevorzugten Desaturasen und/oder Elongasen, welche in der Wirtszelle vorhanden sein sollen, handelt es sich um wenigstens ein Enzym, gewählt aus der Gruppe, die aus folgendem besteht: Δ-4-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-5-Elongase, Δ-6-Desaturase, Δ12-Desaturase, Δ15-Desaturase, ω3-Desaturase und Δ-6-Elongase. Besonders bevorzugt sind die bifunktionalen d12d15-Desaturasen d12d15Des(Ac) aus Acanthamoeba castellanii (WO 2007042510), d12d15Des(Cp) aus Claviceps purpurea (WO 2008006202) und d12d15Des(Lg)1 aus Lottia gigantea (WO 2009016202), die d12-Desaturasen d12Des(Co) aus Calendula officinalis (WO 200185968), d12Des(Lb) aus Laccaria bicolor (WO 2009016202), d12Des(Mb) aus Monosiga brevicollis (WO 2009016202), d12Des(Mg) aus Mycosphaerella graminicola (WO 2009016202), d12Des(Nh) aus Nectria haematococca (WO 2009016202), d12Des(Ol) aus Ostreococcus lucimarinus (WO 2008040787), d12Des(Pb) aus Phycomyces blakesleeanus (WO 2009016202), d12Des(Ps) aus Phytophthora sojae (WO 2006100241) und d12Bes(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO 2006069710), die d15-Desaturasen d15Des(Hr) aus Helobdella robusta (WO 2009016202), d15Des(Mc) aus Microcoleus chthonoplastes (WO 2009016202), d15Des(Mf) aus Mycosphaerella fijiensis (WO 2009016202), d15Des(Mg) aus Mycosphaerella graminicola (WO 2009016202) und d15Des(Nh)2 aus Nectria haematococca (WO 2009016202), die d4-Desaturasen d4Des(Eg) aus Euglena gracilis (WO 2004090123), d4Des(Tc) aus Thraustochytrium sp. (WO 2002026946) und d4Des(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO 2006069710), die d5-Desaturasen d5Des(Ol)2 aus Ostreococcus lucimarinus (WO 2008040787), d5Des(Pp) aus Physcomitrella patens (WO 2004057001), d5Des(Pt) aus Phaeodactylum tricornutum (WO 2002057465), d5Des(Tc) aus Thraustochytrium sp. (WO 2002026946), d5Des(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO 2006069710) und die d6-Desaturasen d6Des(Cp) aus Ceratodon purpureus (WO 2000075341), d6Des(Ol) aus Ostreococcus lucimarinus (WO 2008040787), d6Des(Ot) aus Ostreococcus tauri (WO 2006069710), d6Des(Pf) aus Primula farinosa (WO 2003072784), d6Des(Pir)_BO aus Pythium irregulare (WO 2002026946), d6Des(Pir) aus Pythium irregulare (WO 2002026946), d6Des(Plu) aus Primula luteola (WO 2003072784), d6Des(Pp) aus Physcomitrella patens (WO 200102591), d6Des(Pt) aus Phaeodactylum tricornutum (WO 2002057465), d6Des(Pv) aus Primula vialii (WO 2003072784) und d6Des(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO 2006069710), die d8-Desaturasen d8Des(Ac) aus Acanthamoeba castellanii (EP 1790731), d8Des(Eg) aus Euglena gracilis (WO 200034439) und d8Des(Pm) aus Perkinsus marinus (WO 2007093776), die o3-Desaturasen o3Des(Pi) aus Phytophthora infestans (WO 2005083053), o3Des(Pir) aus Pythium irregulare (WO 2008022963), o3Des(Pir)2 aus Pythium irregulare (WO 2008022963) und o3Des(Ps) aus Phytophthora sojae (WO 2006100241), die bifunktionalen d5d6-Elongasen d5d6Elo(Om)2 aus Oncorhynchus mykiss (WO 2005012316), d5d6Elo(Ta) aus Thraustochytrium aureum (WO 2005012316) und d5d6Elo(Tc) aus Thraustochytrium sp. (WO 2005012316), die d5-Elongasen d5Elo(At) aus Arabidopsis thaliana (WO 2005012316), d5Elo(At)2 aus Arabidopsis thaliana (WO 2005012316), d5Elo(Ci) aus Ciona intestinalis (WO 2005012316), d5Ela(Ol) aus Ostreococcus lucimarinus (WO 2008040787), d5Elo(Ot) aus Ostreococcus tauri (WO 2005012316), d5Elo(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO 2005012316) und d5Elo(Xl) aus Xenopus laevis (WO 2005012316), die d6-Elongasen d6Elo(Ol) aus Ostreococcus lucimarinus (WO 2008040787), d6Elo(Ot) aus Ostreococcus tauri (WO 2005012316), d6Elo(Pi) aus Phytophthora infestans (WO 2003064638), d6Elo(Pir) aus Pythium irregulare (WO 2009016208), d6Elo(Pp) aus Physcomitrella patens (WO 2001059128), d6Elo(Ps) aus Phytophthora sojae (WO 2006100241), d6Elo(Ps)2 aus Phytophthora sojae (WO 2006100241), d6Elo(Ps)3 aus Phytophthora sojae (WO 2006100241), d6Elo(Pt) aus Phaeodactylum tricornutum (WO 2005012316), d6Elo(Tc) aus Thraustochytrium sp. (WO 2005012316) und d6Elo(Tp) aus Thalassiosira pseudonana (WO 2005012316), die d9-Elongasen d9Elo(Ig) aus Isochrysis galbana (WO 2002077213), d9Elo(Pm) aus Perkinsus marinus (WO 2007093776) und d9Elo(Ro) aus Rhizopus oryzae (WO 2009016208). Insbesondere wenn die Herstellung von ARA in höheren Pflanzen in Betracht gezogen wird, können die in der nachstehenden Tabelle 3 genannten Enzyme (d. h. zusätzlich eine d6-Desaturase, d6-Elongase, d5-Elongase, d5-Desaturase, d12-Desaturase und d6-Elongase) oder Enzyme mit im Wesentlichen der gleichen Aktivität in einer Wirtszelle kombiniert werden. Wenn die Herstellung von EPA in höheren Pflanzen in Betracht gezogen wird, können die in der nachstehenden Tabelle 4 genannten Enzyme (d. h. zusätzlich eine d6-Desaturase, d6-Elongase, d5-Desaturase, d12-Desaturase, d6-Elongase, Omega-3-Desaturase und d15-Desaturase) oder Enzyme mit im Wesentlichen der gleichen Aktivität in einer Wirtszelle kombiniert werden. Wenn die Herstellung von DHA in höheren Pflanzen in Betracht gezogen wird, können die in der nachstehenden Tabelle 5 genannten Enzyme (d. h. zusätzlich eine d6-Desaturase, d6-Elongase, d5-Desaturase, d12-Desaturase, d6-Elongase, Omega-3-Desaturase, d15-Desaturase, d5-Elongase und d4-Desaturase), oder Enzyme mit im Wesentlichen der gleichen Aktivität in einer Wirtszelle kombiniert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine Zelle, vorzugsweise eine Wirtszelle, wie oben beschrieben, oder eine Zelle von einem nicht-menschlichen Organismus, die an anderer Stelle hierin spezifiziert wird, wobei die Zelle ein Polynukleotid umfasst, das aus dem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung durch eine Punktmutation, eine Verkürzung, eine Inversion, eine Deletion, eine Addition, eine Substitution sowie homologe Rekombination erhalten wird. Wie man derartige Modifikationen an einem Polynukleotid ausführt, ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und ist an anderer Stelle in dieser Patentbeschreibung ausführlich beschrieben worden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, codiert von einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, das folgendes umfasst

  • a) Kultivieren der Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen, welche die Herstellung des Polypeptids gestatten; und
  • b) Gewinnen des Polypeptids aus der Wirtszelle von Schritt a).

Geeignete Bedingungen, welche die Expression des von der Wirtszelle enthaltenen Polynukleotids der Erfindung gestatten, hängen von der Wirtszelle sowie der Expressions-Steuerungssequenz ab, die zur Regelung der Expression des Polynukleotids verwendet wird. Diese Bedingungen und wie man sie auswählt, sind dem Fachmann auf dem Gebiet sehr genau bekannt. Das exprimierte Polypeptid kann zum Beispiel durch alle herkömmliche Reinigungstechniken, einschließlich Affinitätschromatographie, Größenausschlußchromatographie, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Präzipitationstechniken, einschließlich Antikörperpräzipitation, gewonnen werden. Es versteht sich, dass das Verfahren – obwohl bevorzugt – nicht notwendigerweise eine im Wesentlichen reine Präparation des Polypeptids ergeben kann. Es versteht sich, dass abhängig von der Wirtszelle, welche für das oben erwähnte Verfahren verwendet wird, die davon hergestellten Polypeptide posttranslational modifiziert oder anderweitig prozessiert werden können.

Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Polypeptid, das von dem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung codiert wird oder das durch das oben erwähnte Verfahren erhältlich ist.

Der Begriff ”Polypeptid”, wie hierin verwendet, schließt im Wesentlichen gereinigte Polypeptide oder Polypeptidpräparationen ein, die zusätzlich andere Proteine umfassen. Ferner bezieht sich der Begriff auch auf die Fusionsproteine oder Polypeptidfragmente, die zumindest teilweise von dem oben genannten Polynukleotid der vorliegenden Erfindung codiert werden. Darüber hinaus schließt er chemische modifizierte Polypeptide ein. Derartige Modifikationen können künstliche Modifikationen oder natürlich vorkommende Modifikationen, wie Phosphorylierung, Glykosylierung, Myristylierung und dergleichen, sein (Übersicht in Mann 2003, Nat. Biotechnol. 21, 255–261, Übersicht mit Fokus auf Pflanzen in Huber 2004, Curr. Opin. Plant Biol. 7, 318–322). Gegenwärtig sind mehr als 300 posttranslationale Modifikationen bekannt (siehe vollständige ABFRC Delta-Massen-Liste unter http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home). Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung soll die oben dargelegte nECR-Aktivität aufzeigen.

Die vorliegende Erfindung beinhaltet ferner einen Antikörper, welcher das Polypeptid der Erfindung spezifisch erkennt.

Antikörper gegen die Polypeptide der Erfindung können durch allgemein bekannte Verfahren unter Verwendung eines gereinigten Polypeptids gemäß der Erfindung oder eines geeigneten, daraus abgeleiteten Fragments als Antigen hergestellt werden. Ein Fragment, welches als ein Antigen geeignet ist, kann durch Antigenizitäts-ermittelnde Algorithmen, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, identifiziert werden. Derartige Fragmente können entweder aus dem Polypeptid der Erfindung durch proteolytischen Verdau erhalten werden oder können ein synthetisches Peptid sein. Vorzugsweise ist der Antikörper der vorliegenden Erfindung ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein Einzelkettenantikörper, ein chimärisierter Antikörper oder ein Fragment von beliebigen dieser Antikörper, wie Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente, etc.. Ebenfalls als Antikörper durch die vorliegende Erfindung inbegriffen sind bispezifische Antikörper, synthetische Antikörper oder chemisch modifizierte Derivate von beliebigen der oben genannten Antikörper. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung soll spezifisch an das Polypeptid der Erfindung binden (d. h. er zeigt keine signifikante Kreuzreaktion mit anderen Polypeptiden oder Peptiden). Die spezifische Bindung kann durch verschiedene allgemein bekannte Techniken getestet werden. Antikörper oder Fragmente davon können durch Anwendung von Verfahren erhalten werden, welche z. B. in Harlow und Lane ”Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988, beschrieben sind. Monoklonale Antikörper können durch die Techniken hergestellt werden, welche ursprünglich beschrieben wurden in Köhler 1975, Nature 256, 495, und Galfré 1981, Meth. Enzymol. 73, 3, welche die Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen, die aus immunisierten Säugern abgeleitet sind, umfassen. Die Antikörper können zum Beispiel für die Immunpräzipitation, Immunlokalisierung oder Reinigung (z. B. durch Affinitätschromatographie) der Polypeptide der Erfindung sowie für die Überwachung des Vorhandenseins der Varianten-Polypeptide, zum Beispiel in rekombinanten Organismen, und für die Identifizierung von Proteinen oder Verbindungen, welche mit den Proteinen gemäß der Erfindung wechselwirken, verwendet werden.

Darüber hinaus betrachtet die vorliegende Erfindung einen nicht-menschlichen transgenen Organismus, der das Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem nicht-menschlichen transgenen Organismus um eine Pflanze, einen Pflanzenteil oder Pflanzensamen. Bevorzugte Pflanzen, die zur Einbringung des Polynukleotids oder des Vektors der Erfindung verwendet werden sollen, sind Pflanzen, welche zum Synthetisieren von Fettsäuren in der Lage sind, wie alle dikotylen oder monokotylen Pflanzen, Algen oder Moose. Es versteht sich, dass Wirtszellen, die aus einer Pflanze abgeleitet sind, ebenfalls für die Erzeugung einer Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Bevorzugte Pflanzen sind ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzenfamilien Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Prasinophyceae oder Gemüsepflanzen oder Zierpflanzen, wie Tagetes. Beispiele, welche genannt werden können, sind die folgenden Pflanzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Adelotheciaceae, wie die Gattungen Physcomitrella, wie die Gattung und Spezies Physcomitrella patens, Anacardiaceae, wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium, zum Beispiel die Gattung und Spezies Pistacia vera [Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew], Asteraceae, wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, zum Beispiel die Gattung und Spezies Calendula officinalis [Garten-Ringelblume], Carthamus tinctorius [Saflor], Centaurea cyanus [Kornblume], Cichorium intybus [Chicoree], Cynara scolymus [Artischoke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Salat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [”African”- oder ”French”-Studentenblume], Apiaceae, wie die Gattung Daucus, zum Beispiel die Gattung und Spezies Daucus carota [Karotte], Betulaceae, wie die Gattung Corylus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Corylus avellana oder Corylus colurna [Haselnuss], Boraginaceae, wie die Gattung Borago, zum Beispiel die Gattung und Spezies Borago officinalis [Borretsch], Brassicaceae, wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Ölsamenraps], Sinapis arvensis, Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae, wie die Gattungen Anana, Bromelia (Ananas), zum Beispiel die Gattungen und Spezies Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas], Caricaceae, wie die Gattung Carica, wie die Gattung und Spezies Carica papaya [Papaya], Cannabaceae, wie die Gattung Cannabis, wie die Gattung und Spezies Cannabis sativa [Hanf], Convolvulaceae, wie die Gattungen Ipomea, Convolvulus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süßkartoffel, Batate], Chenopodiaceae, wie die Gattung Beta, wie die Gattungen und Spezies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe], Crypthecodiniaceae, wie die Gattung Crypthecodinium, zum Beispiel die Gattung und Spezies Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae, wie die Gattung Cucurbita, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Kürbis/-Gartenkürbis], Cymbellaceae, wie die Gattungen Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria, zum Beispiel die Gattung und Spezies Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae, wie die Gattungen Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon, purpureus spp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus oder Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae, wie die Gattung Elaeagnus, zum Beispiel die Gattung und Spezies Olea europaea [Olive], Ericaceae, wie die Gattung Kalmia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Berglorbeer], Euphorbiaceae, wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Maniok] oder Ricinus communis [Rizinus], Fabaceae, wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [Seidenbaum], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Alfalfa], Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne], Funariaceae, wie die Gattungen Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jamesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae, wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokosnuss], Gramineae, wie die Gattung Saccharum, zum Beispiel die Gattung und Spezies Saccharum officinarum, Juglandaceae, wie die Gattungen Juglans, Wallia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Walnuss], Lauraceae, wie die Gattungen Persea, Laurus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Laurus nobilis [Lorbeer], Persea americana, Persea gratissima oder Persea persea [Avocado], Leguminosae, wie die Gattung Arachis, zum Beispiel die Gattung und Spezies Arachis hypogaea [Erdnuss], Linaceae, wie die Gattungen Linum, Adenolinum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Leinsamen], Lythrarieae, wie die Gattung Punica, zum Beispiel die Gattung und Spezies Punica granatum [Granatapfel], Malvaceae, wie die Gattung Gossypium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle], Marchantiaceae, wie die Gattung Marchantia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae, wie die Gattung Musa, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane], Onagraceae, wie die Gattungen Camissonia, Oenothera, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Nachtkerze], Palmae, wie die Gattung Elacis, zum Beispiel die Gattung und Spezies Elaeis guineensis [Ölpalme], Papaveraceae, wie die Gattung Papaver, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn], Pedaliaceae, wie die Gattung Sesamum, zum Beispiel die Gattung und Spezies Sesamum indicum [Sesam], Piperaceae, wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [Cayenne-Pfeffer], Poaceae, wie die Gattungen Hordeum, Secale, Averia, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (Mais), Triticum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais], Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen], Porphyridiaceae, wie die Gattungen Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Porphyridium cruentum, Proteaceae, wie die Gattung Macadamia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Macadamia intergrifolia [Macadamia], Prasinophyceae, wie die Gattungen Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae, wie die Gattung Cofea, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee], Scrophulariaceae, wie die Gattung Verbascum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze], Solanaceae, wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [Chilischote], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine], Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate], Sterculiaceae, wie die Gattung Theobroma, zum Beispiel die Gattung und Spezies Theobroma cacao [Kakao] oder Theaceae, wie die Gattung Camellia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Camellia sinensis [Tee]. Insbesondere sind bevorzugte Pflanzen, die als transgene Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, Ölfrucht-Nutzpflanzen, welche große Mengen an Lipidverbindungen umfassen, wie Erdnuss, Ölsamenraps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Castoröl-Pflanze bzw. Rizinus, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avokado, Lorbeer, Kürbis/Gartenkürbis, Leinsamen, Sojabohne, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss) oder Nutzpflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Cassava, Pfeffer bzw. Paprika, Tagetes, Nachtschattengewächse wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa oder buschartige Pflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies und mehrjährige Gräser und Futterpflanzen. Bevorzugte Pflanzen gemäß der Erfindung sind Ölnutzpflanzen, wie Erdnuss, Ölsamenraps, Canola, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Castoröl-Pflanze, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis/Gartenkürbis, Leinsamen, Sojabohne, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Besonders bevorzugt werden Sonnenblume, Saflor, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis/Gartenkürbis, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Leinsamen, Hanf, Distel oder Saflor. Ganz besonders bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen, wie Saflor, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Leinsamen oder Hanf.

Bevorzugte Moose sind Physcomitrella oder Ceratodon. Bevorzugte Algen sind Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium, und Algen/Diatomeen, wie Phaeodactylum oder Thraustochytrium. Weiter bevorzugt sind die Algen oder Moose gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Phaeodactylum, Cryphthecodinium, spezifisch aus den Gattungen und Spezies Thallasiosira pseudonona, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Phaeodactylum tricornutum oder Caenorhabditis elegans oder, besonders vorteilhaft, Phytophtora infestans, Thallasiosira pseudonona und Cryptocodinium cohnii.

Transgene Pflanzen können durch Transformationstechniken erhalten werden, wie an anderer Stelle in dieser Beschreibung. Vorzugsweise können transgene Pflanzen durch T-DNA-vermittelte Transformation erhalten werden. Solche Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die vir-Gene, welche für die Agrobacterium-vermittelte Transformation erforderlich sind, und die Sequenzen, welche die T-DNA begrenzen (T-DNA-Border), enthalten. Geeignete Vektoren sind andernorts in der Beschreibung in Einzelheiten beschrieben.

Ebenfalls inbegriffen sind transgene nicht-menschliche Tiere, die den Vektor oder das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfassen. Bevorzugte nicht-menschliche transgene Tiere, die von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, sind Fische, wie Hering, Lachs, Sardine, Rotbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Tuna.

Es versteht sich jedoch, dass, abhängig von dem oben spezifizierten nicht-menschlichen transgenen Organismus, weitere enzymatische Aktivitäten an den Organismus, z. B. durch rekombinante Technologien, vermittelt werden können. Folglich betrachtet die vorliegende Erfindung vorzugsweise einen oben spezifizierten, nicht-menschlichen transgenen Organismus, der zusätzlich zu dem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung Polynukleotide umfasst, welche derartige Desaturasen und/oder Elongasen codieren, wie sie in Abhängigkeit von der gewählten Wirtszelle erforderlich sind. Bei bevorzugten Desaturasen und/oder Elongasen, welche in dem Organismus vorhanden sein sollen, handelt es sich um wenigstens ein Enzym, gewählt aus der Gruppe von Desaturasen und/oder Elongasen oder den Kombinationen, welche spezifisch an anderer Stelle in dieser Beschreibung aufgeführt sind (siehe oben und die Tabellen 3, 4 und 5).

Außerdem schließt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von mehrfach-ungesättigten Fettsäuren ein, das folgendes umfasst:

  • a) Kultivieren der Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen, welche die Herstellung von mehrfach-ungesättigten Fettsäuren in der Wirtszelle gestatten; und
  • b) Gewinnen der mehrfach-ungesättigten Fettsäuren aus der Wirtszelle.

Der Begriff ”mehrfach-ungesättigte Fettsäuren (PUFA)”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Fettsäuren, welche mindestens zwei, vorzugsweise, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen umfassen. Darüber hinaus versteht es sich, dass solche Fettsäuren vorzugsweise 18 bis 24 Kohlenstoffatome in der Fettsäurekette umfassen. Weiter bevorzugt bedeutet der Begriff langkettige PUFA (LCPUFA) mit 20 bis 24 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette. Bevorzugte ungesättigte Fettsäuren im Sinn der vorliegenden Erfindung sind aus der Gruppe gewählt, bestehend aus DGLA 20:3 (8, 11, 14), ARA 20:4 (5, 8, 11, 14), iARA 20:4 (8, 11, 14, 17), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), DPA 22:5 (4, 7, 10, 13, 16), DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19), 20:4 (8, 11, 14, 17), weiter bevorzugt Arachidonsäure (ARA) 20:4 (5, 8, 11, 14), Eicosapentaensäure (EPA) 20:5 (5, 8, 11, 14, 17), und Docosahexaensäure (DHA) 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19). Somit versteht es sich, dass die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Verfahren, am meisten bevorzugt, die Herstellung von ARA, EPA oder DHA betreffen. Außerdem sind ebenfalls die Intermediate von LCPUFA inbegriffen, welche während der Synthese vorkommen. Solche Intermediate werden vorzugsweise durch die nECR-Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung aus Substraten gebildet. Vorzugsweise schließen Substrate LA 18:2 (9, 12), GLA 18:3 (6, 9, 12), DGLA 20:3 (8, 11, 14), ARA 20:4 (5, 8, 11, 14), Eicosadiensäure 20:2 (11, 14), Eicosatetraensäure 20:4 (8, 11, 14, 17), Eicosapentaensäure 20:5 (5, 8, 11, 14, 17) ein.

Der Begriff ”Kultivieren”, wie hierin verwendet, bedeutet Halten und Wachsenlassen der Wirtszellen unter Kulturbedingungen, welche den Zellen gestatten, die mehrfach-ungesättigte Fettsäure, d. h. die oben erwähnte PUFA und/oder LCPUFA, herzustellen. Dies impliziert, dass das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung in der Wirtszelle exprimiert wird, so dass die nECR-Aktivität vorhanden ist. Geeignete Kulturbedingungen zur Kultivierung der Wirtszelle sind nachstehend ausführlicher beschrieben.

Der Begriff ”Gewinnen”, wie hierin verwendet, beinhaltet die Bereitstellung der Zellkultur, welche die Wirtszellen und das Kulturmedium einschließt, sowie die Bereitstellung von gereinigten oder teilweise gereinigten Präparationen davon, welche die mehrfach-ungesättigten Fettsauren, vorzugsweise ARA, EPA, DHA, in freier oder in -CoA-gebundener Form, als Membranphospholipide oder als Triacylglyceridester, umfassen. Weiter bevorzugt sollen die PUFA und LCPUFA als Triglyceridester, z. B. in Form eines Öls, gewonnen werden. Mehr Einzelheiten bezüglich Reinigungstechniken können andernorts hierin nachstehend gefunden werden.

Die im Verfahren der Erfindung zu verwendenden Wirtszellen werden auf die Weise, mit der der Fachmann vertraut ist, abhängig vom Wirtsorganismus wachsen gelassen oder kultiviert. In der Regel werden Wirtszellen in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle, üblicherweise in der Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle, üblicherweise in der Form von organischen Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt oder Salzen, wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente, wie Salze von Eisen, Mangan und Magnesium, und, falls zutreffend, Vitamine umfasst, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, vorzugsweise zwischen 10°C und 60°C, unter Sauerstoff oder anaerober Atmosphäre, abhängig vom Typ des Organismus, wachsen gelassen. Der pH-Wert des flüssigen Mediums kann entweder konstant gehalten werden, d. h. während der Kulturdauer reguliert werden, oder nicht. Die Kulturen können satzweise, halbsatzweise oder kontinuierlich wachsen gelassen werden. Nährstoffe können am Beginn der Fermentierung bereitgestellt oder halbkontinuierlich oder kontinuierlich verabreicht werden: Die erzeugten PUFA oder LCPUFA können aus den Wirtszellen wie oben beschrieben durch dem Fachmann bekannte Verfahren, z. B. durch Extraktion, Destillation, Kristallisation, falls zutreffend Präzipitation mit Salz, und/oder Chromatographie, isoliert werde. Es könnte erforderlich sein, die Wirtszellen vor der Reinigung aufzubrechen. Zu diesem Zweck können die Wirtszellen zuvor aufgebrochen werden. Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Anforderungen der betreffenden Wirtszellen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen, welche als Wirtszellen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. können in dem Lehrbuch ”Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) gefunden werden. Kulturmedien können ebenfalls von diversen kommerziellen Anbietern erhalten werden. Alle Medienkomponenten werden sterilisiert, entweder durch Wärme oder durch Filtersterilisierung. Alle Medienkomponenten können am Beginn der Kultivierung vorhanden sein oder kontinuierlich oder satzweise zugegeben werden, wie gewünscht. Wenn das Polynukleotid oder der Vektor der Erfindung, welches/r in die Wirtszelle eingebracht worden ist, ferner einen exprimierbaren Selektionsmarker, wie ein Antibiotikumresistenzgen, umfasst, könnte es notwendig sein, der Kultur ein Selektionsmittel, wie ein Antibiotikum, zuzugegeben, um die Stabilität des eingebrachten Polynukleotids aufrecht zu erhalten. Die Kultur wird fortgesetzt, bis die Bildung des gewünschten Produkts am Maximum ist. Dies wird normalerweise innerhalb von 10 bis 160 Stunden erreicht. Die Fermentationsnährlösungen können direkt verwendet werden oder können weiter verarbeitet werden. Die Biomasse kann, gemäß der Forderung, vollständig oder teilweise aus der Fermentationsnährlösung durch Trennungsverfahren, wie zum Beispiel Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder eine Kombination dieser Verfahren, entfernt werden oder vollständig in der Nährlösung gelassen werden. Die durch das Verfahren der Erfindung erhaltenen Fettsäurepräparationen, z. B. Öle, welche die gewünschte PUFA oder LCPUFA als Triglyceridester umfassen, sind ebenfalls als Ausgangsmaterial für die chemische Synthese weiterer Produkte von Interesse geeignet. Zum Beispiel können sie in Kombination miteinander oder allein für die Herstellung von pharmazeutischen oder kosmetischen Zusammensetzungen, Nahrungsmitteln oder Tierfutter verwendet werden. Chemisch reine Triglyceride, welche die gewünschte PUFA oder LCPUFA umfassen, können ebenfalls durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Zu diesem Zweck werden die Fettsäurepräparationen durch Extraktion, Destillation, Kristallisation, Chromatographie oder Kombinationen dieser Verfahren weiter gereinigt. Um die Fettsäurereste aus den Triglyceriden freizusetzen, kann auch eine Hydrolyse erforderlich sein. Die chemisch reinen Triglyceride oder freien Fettsäuren sind insbesondere für Anwendungen in der Lebensmittelindustrie oder für kosmetische und pharmakologische Zusammensetzungen geeignet.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von mehrfach-ungesättigten Fettsäuren, das folgendes umfasst:

  • a) Kultivieren des nicht-menschlichen transgenen Organismus der Erfindung unter Bedingungen, welche die Herstellung von mehrfach-ungesättigten Fettsäuren in der Wirtszelle gestatten; und
  • b) Gewinnen der mehrfach-ungesättigten Fettsäuren aus dem nicht-menschlichen transgenen Organismus.

Ferner folgt aus dem oben genannten, dass ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung von der vorliegenden Erfindung betrachtet wird, umfassend die Schritte von einem beliebigen der vorangehend erwähnten Verfahren und den weiteren Schritt des Formulierens von PUFA oder LCPUFA als Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung. Vorzugsweise soll die Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung für Futter, Nahrungsmittel, Kosmetika oder Medikamente verwendet werden. Folglich soll die Formulierung der PUFA oder LCPUFA gemäß den ”Gute-Herstellungs-Praxis”- bzw. GMP-Standards für die individuell beabsichtigten Produkten durchgeführt werden. Zum Beispiel kann ein Öl aus Pflanzensamen mittels einer Ölmühle erhalten werden. Allerdings kann, aus Gründen der Produktsicherheit, eine Sterilisierung gemäß des betreffenden GMP-Standards erforderlich sein. Ähnliche Standards werden für Lipid- oder Fettsäurezusammensetzungen gelten, die in kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen anzuwenden sind. Alle diese Maßnahmen zur Formulierung von Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzungen als Produkte sind bei der oben genannten Herstellung inbegriffen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Öl, umfassend eine mehrfach-ungesättigte Fettsäure, die durch die oben genannten Verfahren erhältlich ist.

Der Begriff ”Öl” bezieht sich auf ein Fettsäuregemisch, umfassend ungesättigte und/oder gesättigte Fettsäuren, welche mit Triglyceriden verestert sind. Vorzugsweise umfassen die Triglyceride im Öl der Erfindung PUFA oder LCPUFA, wie oben aufgeführt. Die Menge an verestertem PUFA und/oder LCPUFA beträgt vorzugsweise ungefähr 30%, wobei ein Gehalt von 50% bevorzugter ist, und ein Gehalt von 60%, 70%, 80% oder mehr noch weiter bevorzugt ist. Das Öl kann ferner freie Fettsäuren, vorzugsweise die oben genannten PUFA und LCPUFA, umfassen. Für die Analyse kann der Fettsäuregehalt z. B. durch GC-Analyse nach Umwandeln der Fettsäuren in die Methylester durch Umesterung bestimmt werden. Der Gehalt der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett kann, insbesondere in Abhängigkeit von der Quelle, variieren. Das Öl soll jedoch eine nicht-natürlich vorkommende Zusammensetzung in Hinsicht auf PUFA- und/oder LCPUFA-Zusammensetzung und -Gehalt aufweisen. Es versteht sich, dass eine solche einzigartige Ölzusammensetzung und das einzigartige Veresterungsmuster von PUFA und LCPUFA in den Triglyceriden des Öls nur durch Anwenden der oben angegebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich sein soll. Darüber hinaus kann das Öl der Erfindung auch andere molekulare Spezies umfassen. Im Speziellen kann es geringfügige Verunreinigungen mit dem Polynukleotid oder Vektor der Erfindung umfassen. Derartige Verunreinigungen können jedoch nur durch hoch empfindliche Techniken, wie PCR, nachgewiesen werden.

Die Inhalte sämtlicher, überall in dieser Patentanmeldung angeführten, Referenzen sind hierin durch den Bezug eingeschlossen, und zwar sowohl im Allgemeinen als auch bezüglich ihres spezifischen Offenbarungsgehaltes, welcher oben erwähnt ist.

FIGUREN

1 zeigt die Nukleotid- (SEQ ID NR: 1) und Aminosäuresequenzen von nECR aus Thalassiosira pseudonana (SEQ ID NR: 2).

2 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von nECR aus Phaeodactylum tricornutum wie folgt: A) die cDNA-Sequenz der mRNA (SEQ ID NR: 3); B) die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 4).

3 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen von nECR aus T. pseudonana und P. tricornutum mit der Dehydratase (YJL097W) und Enoyl-CoA-Reduktase (YDL015C) aus Saccharomyces cerevisae.

4 zeigt die Ähnlichkeitstabelle des Aligments aus 3. Die Identitätstabelle wurde durch ClustalW-Alignment unter Verwendung des Align-Programms aus dem Vector NTI-Saftware-Paket (Invitrogen) erstellt. Die zwei nECR aus den verschiedenen Organismen haben 65% Identität gemein, wohingegen beide nECR weniger als 30% Identität mit der bekannten Dehydratase (YJL097w) oder Enoyl-CoA-Reduktase (YDL015C) aus Hefe aufweisen.

5 zeigt die funktionelle Charakterisierung von nECR(Tp) und nECR(Pt) durch Hefe-Komplementations-Assay. Der Komplementations-Assay wurde mit nECR(Tp) und nECR(Pt) in Hefe Δydl015c, welche keine funktionelle Enoyl-CoA-Reduktase besitzt, durchgeführt. Legende: YPD, Komplettmedium, SD-Ura, Medium ohne Uracil, SD-Leu, Medium ohne Leucin, FOA, Medium mit Leucin und 5-FOA; (1) tsc13ΔTrp pTSC13 URA: Hefemutante Δydl015C ohne die Funktion der Enoyl-CoA-Reduktase, transformiert mit dem Vektor pTSC13, enthaltend das funktionelle YDL015C-Gen; (2) phs1ΔKan pPHS1 URA: Hefemutante Δyjl097w ohne die Funktion der Dehydratase, transformiert mit dem Vektor pPHS1, enthaltend das funktionelle YJL097W-Gen; (3) tsc13ΔTrp pESC-nECR(Tp): Hefemutante Δydl015C ohne die Funktion der Enoyl-CoA-Reduktase, transformiert mit dem Vektor pESC-nECR(Tp); (4) sc13ΔTrp pESC-nECR(Pt): Hefemutante Δydl015C ohne die Funktion der Enoyl-CoA-Reduktase, transformiert mit dem Vektor pESC-nECR(Pt).

6 zeigt die erhöhte Herstellung von langkettiger PUFA mit nECR(Tp). Hefen, die mit pYES-d9Elo(Ig) (A) oder pYES-d9Elo(Ig) + pESC-nECR(Tp) (B) transformiert waren, wurden mit 25 μM Linolensäure (18:3Δ9, 12, 15) im SD(-Ura-Leu)-Medium versorgt. Nach 48 h Inkubation wurden die Hefezellen zentrifugiert, und die Pellets wurden einer Gaschromatographie-Analyse unterzogen. Die Gaschromatographien zeigen die verschiedenen Fettsäuren in den zwei verschiedenen Hefestämmen ohne (A) und mit nECR(Tp) (B). Die Umsetzungsraten sind wie folgend dargestellt: (Produkt/Substrat-Produkt)*100.

7 zeigt eine Western-Blot-Analyse von subzellulären Fraktionen aus T. pseudonana. M, Proteingrößenmarker, 1, Gesamtextrakt, 2, lösliche Fraktion, 3, Membranfraktion. Die Pfeile zeigen die zwei Versionen von nECR(Tp).

8 zeigt eine Western-Blut-Analyse von subzellulären Fraktionen aus nECR(Tp) exprimierender Hefe. M, Proteingrößenmarker, 1, Gesamtextrakt, 2, lösliche Fraktion, 3, Membranfraktion. Der Pfeil zeigt das nECR(Tp)-Fusionsprotein.

9 zeigt eine Western-Blut-Analyse von subzellulären Fraktionen aus nECR(Tp) exprimierender Hefe. M, Proteingrößenmarker, 1, Gesamtextrakt, 2, lösliche Fraktion, 3, Membranfraktion. Der Pfeil zeigt das nECR(Tp)-Fusionsprotein.

Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, welche nicht als einschränkend ausgelegt werden sollten. Der Inhalt aller Bezugsstellen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen, die überall in dieser Anmeldung zitiert sind, sowie der Figuren, ist hierin durch den Bezug darauf einbezogen.

BEISPIELEBeispiel 1: Organismen und Kulturbedingungen

Für die Regeneration von Haploiden wurde das in Pan et al. 2004 (Molecular Cell 16: 487–496) geschilderte Verfahren angewandt. Kurz gesagt, wurden Kulturen über Nacht in DOB-Uracil wachsen gelassen, danach wurden ungefähr 25 OD600 von jeder Kultur gewaschen und in frischen Medien resuspendiert und 3 Stunden lang wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann in Sporulationsmedium (1% Kaliumacetat, 0,005% Zinkacetat) suspendiert, 5 Tage lang sporulieren gelassen und auf Haploid-Selektions-”magic media”-Platten ausplattiert (2% Galactose, Aminosäure-Mix-Uracil-Leucin-Histidin-Arginin, 0,17% Stickstoffbasis ohne Aminosäuren oder Ammoniumsulfat, 0,1% Natriumglutamat), welche 200 mg/l G418 und 60 mg/l Canavanin enthielten.

Beispiel 2: Neue Dehydratase/Enoyl-CoA-Reduktase-Sequenzen

PUFA-produzierende Algen wurden gescreent, um Unterschiede zwischen Nicht-PUFA-Produzenten aufzudecken Sequenzen aus Thalassiosira und Phaeodactylum wurden erhalten, welche für diese PUFA-Produzenten spezifisch sind (1 und 2). Ein Alignment mit bekannten Dehydratase- und Enoyl-CoA-Reduktase-Sequenzen aus Hefe (YJL097W und YDL015C) zeigte eine niedrige Homologie (3 und 4). Deshalb repräsentiert die neu erzeugte nECR eine neue Klasse von Enzymen. Bei Komplementations-Assays (Beispiel 3) zeigen die Sequenzen Dehydratase- und Enoyl-CoA-Reduktase-Aktiuität und wurden deshalb als nECR bezeichnet.

Eine Liste von identifizierten codierenden Volllängensequenzen ist in Tabelle 1a und 1b gezeigt. Tabelle 1a: Liste von codierenden Volllängensequenzen

SEQ ID NR:GenOrganismusLänge in bp1nECR(Tp)Thalassiosira pseudonana23673nECR(Pt)Phaeodactylum tricornutum2244
Tabelle 1b: Liste von aus in der Tabelle 1 beschriebenen Sequenzen abgeleiteten Aminosäuren,SEQ ID NR:GenOrganismusLänge in Aminosäuren2nECR(Tp)Thalassiosira pseudonana7884nECR(Pt)Phaeodactylum tricornutum747

Offene Leseraster, wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden gemäß den Reaktionsbedingungen des Herstellers in den pESC(Leu)-Vektor von Stratagene kloniert. Reaktionen wurden in E. coli DH5α transformiert, und Plasmid-DNA wurde isoliert. Die Plasmide pESC-nECR(Tp), pESC-nECR(Pt) wurden dann für die Hefetransformation verwendet. Da beide mutanten Hefestämme Δydl015C (Δtsc13) und Δyjl097w (Δphs1) letal sind, wurden die Stämme mit Plasmiden transformiert, welche die Mutante mit dem Uracil-Auxothropie-Marker URA (pTSC13 und pPHS1) komplementieren. Vektoren, welche den URA-Marker enthalten, können in Hefe durch Verwendung von 5-FOA (5-Fluororotsäure; Sadowski et al. Yeast. 2008 Aug; 25(8): 595–9) entfernt werden.

Beispiel 3: Hefe-Transformation und Wachstumsbedingungen

Der S. cerevisiae-Stamm YSC1021-674054 von Open Biosystems wurde mit den Konstrukten pESC-nECR(Tp), pESC-nECR(Pt) und pESC unter Verwendung des S. C. EasyComp Transformation-Kits (Invitrogen, Carlsbad, California) bei Selektion auf Leucin-defizientem Medium transformiert. Zur Beurteilung der Dehydratase/Enoyl-CoA-Reduktase-Aktivität wurden Komplementationsuntersuchungen vorgenommen. Für diesen Zweck wurde der heterozygote ”Magic marker”-Stamm YSC1021-674054 von Open Biosystems verwendet. Dieser Stamm zeigt keinerlei Enoyl-CoA-Reduktase-Aktivität. Da die Enoyl-CoA-Reduktase-Aktivität elongierte Fettsäuren liefert, und diese Fettsäuren für Zellwachstum und -teilung benötigt werden, wird der betreffende Hefestamm nicht auf Medium wachsen, das die elongierten Fettsäuren nicht enthält.

Folgende Transformanten wurden erzeugt:

  • 1. tsc13ΔTrp pTSC13 URA: Hefemutante Δydl015C ohne die Funktion der Enoyl-CoA-Reduktase, transformiert mit dem Vektor pTSC13, der das funktionelle YDL015C-Gen enthielt.
  • 2. phs1ΔKan pPHS1 URA: Hefemutante Δyjl097w ohne die Funktion der Dehydratase, transformiert mit dem Vektor pPHS1, der das funktionelle YJL097W-Gen enthielt.
  • 3. tsc13ΔTrp pESC-nECR(Tp): Hefemutante Δydl015C ohne die Funktion der Enoyl-CoA-Reduktase, transformiert mit dem Vektor pESC-nECR(Tp).
  • 4. sc13ΔTrp pESC-nECR(Pt): Hefemutante Δydl015C ohne die Funktion der Enoyl-CoA-Reduktase, transformiert mit dem Vektor pESC-nECR(Pt).

Hefen wurden nach der Transformation in Komplettmedium, das alle Aminosäuren und Nukleotide enthielt, wachsen gelassen. Dann wurden die Hefen auf unterschiedlichen Medien ausplattiert, die entweder das Komplettmedium (SD), das Komplettmedium ohne Uracil (SD-Ura), das Komplettmedium ohne Leucin (SD-Leu) oder das Komplettmedium ohne Leucin und mit 5-FOA enthielten (5). Die Plasmide 1 und 2 können auf SD und SD-Ura, aber nicht auf SD-Leu wachsen, da sie den LEU-Marker nicht aufweisen. Die Plasmide 3 und 4 können auf SD und SD-Leu, aber nicht auf SD-Ura wachsen, da ihnen der URA-Marker fehlt. Die Komplementation wird auf Platten gezeigt, welche FOA enthalten, das Plasmide mit dem URA-Marker (1 und 2) entfernt, Allerdings gibt es sogar in Abwesenheit von Plasmiden 1 oder 2 Wachstum von Kolonien mit den Plasmiden 3 und 4 (5, FOA).

Deshalb sind beide Sequenzen nECR(Tp) und nECR(Pt) in der Lage zum Komplementieren der letalen Nullmutation des 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratase-Gens in der Hefe Δydl015C.

In der Zusammenfassung, konnte es durch Komplementation einer defekten Hefemutante gezeigt werden, dass die Sequenzen nECR(Tp) und nECR(Pt) biologisch funktionell sind und Enoyl-CoA-Reduktase-Aktivität aufzeigen.

Beispiel 4: Expression von nECR(Tp) in Kombination mit der d9-Elongase aus Isochrysis galbana.

Zur Untersuchung der Nützlichkeit von nECR(Tp) in der Herstellung von mehrfach-ungesättigten Fettsäuren in Pflanzen, zum Beispiel, zur Nutrazeutikum-Verwendung, wurde das Gen in Kombination mit einer PUFA-Elongase-Komponente, der d9-Elongase aus Isochrysis galbana (WO 2002/077213), exprimiert. Dieses Enzym katalysiert die Elongation von Linol- oder Linolensäure (18:2Δ9,12 oder 18:3Δ9,12,15). Das Ziel des Experiments bestand darin, zu analysieren, ob die Hinzusetzung von nECR(Tp) die Produktivität der d9-Elongase von I. galbana erhöht. Für diesen Zweck wurden Hefezellen (INVSC von Invitrogen), die mit pESC-nECR(Tp) transformiert und auf DOB(-Leucin)-Platten kultiviert wurden, weiter mit dem Plasmid pYES(Ura)-d9Elo(Ig) transformiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und auf DOB(-Uracil, -Leucin) wachsen gelassen. Der Vektor pYES(Ura) wurde von Invitrogen abgewandelt und vermittelt Auxotrophie hinsichtlich Uracil. Der offene Leserahmen von d9Elo(Ig), wie in WO 2002/077213 beschrieben, wurde gemäß den Bedingungen des Herstellers in pYES2 kloniert. Als Kontrollexperiment wurde pYES-d9Elo(Ig) in den Kontroll-Hefestamm, der nur den pYES vector enthielt, transformiert. Überraschenderweise wurde ein Unterschied in der Menge des Elongationsprodukts 20:3 zwischen der Kontrolle (pESC-d9Elo(Ig)) und der Hefe, die zwei Komponenten des Elongationskomplexes (pESC-d9Elo(Ig) + pYES-nECR(Tp)) enthielt, beobachtet.

In 6 ist gezeigt, dass die Zusetzung des nECR(Tp)-Gens einen erheblichen Einfluss auf die Produktivität von langkettigen PUFA aufweist. Die Produktivität war im Vergleich zum Kontrollexperiment 8-fach erhöht. Die Produktivität wird mittels der Umsetzung des Substrats 18:3 (exogen dem Hefemedium zugegeben) in die elongierte PUFA-Fettsäure 20:3 gemessen.

In der Zusammenfassung verbessert nECR in großem Maße die Herstellung von elongierten Fettsäuren, wie langkettigen PUFA, die für die Gesundheit des Menschen vorteilhaft sind.

Beispiel 5: Vergleich von Hefe-exprimiertem nECR(Tp) und dem nativen Protein aus T. pseudonana.

Antikörper gegen nECR(Tp) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers (Eurogentec, Belgium; Peptid-Antikörper) erzeugt. Die Antikörper sind für nECR(Tp) in T. pseudonana und die heterologe Expression in Hefe hoch spezifisch (7 und 8). Unter Verwendung der Antikörper konnten strukturelle Unterschiede zwischen dem natürlichen Organismus und der heterologen Expression beobachtet werden (7 und 8).

Western-Blot-Experimente wurden mit Hilfe von Standardprotokollen durchgeführt: SDS-PAGE wurde gemäß Laemmli (1970) mit vorgegossenen Gelen von Biorad durchgeführt. Als Auftragspuffer wurde 0,05 M Tris/HCl pH 6,8, 0,1 M DTT, 2% (w/v) SDS, 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerol verwendet. SDS-PAGE-Gele wurden dann auf Nitrozellulose unter Verwendung einer Protean BA85-Nitrozellulosemembran (Schleicher&Schuell) geblottet. Die Übertragungen auf die Membranen wurden mit einem Puffer, der 15 mM Na2HPO4 pH 7,2, 0,05% (w/v) SDS, 20% (v/v) Methanol enthielt, während 2 h bei 200 mA, 40 V (Protean II, Biorad) durchgeführt. Für den immunologischen Test wurde die Membran während 1 h in PBS (0,14 M NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4), 5% (w/v) Milchpulver, geblockt. Das Serum, welches die Antikörper gegen nECR(Tp) enthielt, wurde bei einer Konzentration von 1:2000 zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Für den Nachweis der Antikörper wurde die Membran dreimal mit PBS gewaschen und erneut mit PBS, 5% (w/v) Milchpulver während 30 min geblockt. Eine Einheit von sekundärem Antikörper (Biorad-Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase) wurde zugegeben und während 30 min weiter inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde die Membran in ECL-Lösung eingetaucht und 1 min lang inkubiert. Dann wurde die Lösung mit einem Papiertuch entfernt, und die Membran wurde mit Saran eingewickelt. Der Nachweis der Chemoluminiszenz wurde im Biollluminator (LKB) vorgenommen.

Für die Proteinisolierung aus T. pseudonana, wurde eine Kultur von 500 ml während 14 Tagen bei 20°C in F2-Medium inkubiert (Wachstumsbedingungen und Medien für T. pseudonana, wie beschrieben in Tonon et al. (Tono 2005, FEBS J. 272: 3401–3412) wurden angewandt). Die Algen wurden durch Zentrifugation (10 min, 5000 × g) geerntet, und das Pellet wurde in einen Mörser eingebracht. Mit Hilfe eines Pistills wurde ein feines Pulver erzeugt. Das Pulver wurde mit 50 mM Tris/HCl pH 8,0, 2 mM EDTA suspendiert und durch 2 Schichten Miracloth (Merck) oder eine beliebige andere Filtermembran gefiltert. Das Filterprodukt wurde dann aliquotiert, und Aliquots von 50 μl wurden mit SDS-PAGE-Auftragspuffer (siehe oben) vermischt.

Die Analyse des durch Western-Blot in T. pseudonana nachgewiesenen nECR(Tp) (7) zeigte, dass das Protein von nECR(Tp) in den Zelltrümmern, der löslichen und der Membran-Fraktion gefunden werden kann. Überraschenderweise ist in T. pseudonana die Hauptform eine gespaltene Version, welche nur die Enoyl-CoA-Reduktase-Aktivität (ECR) enthält. Der Beweis für die ECR-Domäne wird aus der Lokalisierung der Bindungsstelle der Antikörper in der ECR-Domäne abgeleitet. Das größere Fusionsprotein von nECR(Tp) wird in der löslichen Fraktion nur in kleinen Mengen gefunden. Kein nECR(Tp) konnte in der Membranfraktion gefunden werden, selbst nach längeren Expositionszeiten.

Deshalb kann schlußgefolgert werden, dass es in T. pseudonana zwei Versionen von nECR(Tp) gibt, das Protein, wie abgeleitet aus der cDNA (SEQ ID NR 1) und eine posttranslational modifizierte kürzere Version, welche nur die ECR-Domäne enthält. Nur die ECR-Domäne ist membrangebunden und daher korrekt lokalisiert (Funktionalität der ECR im Elongasekomplex findet an den mikrosomalen Membranen statt (Napier 2007, Annu Rev Plant Biol 58: 295–319)).

Mit der heterologen Expression von nECR(Tp) in Hefe kann ein anderes Bild beobachtet werden. Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde Hefe mit pESC-nECR(Tp) für die Proteinextraktion verwendet. Hefe wurde während 3 d bei 28°C in 50 ml großen Kulturen wachsen gelassen, und Pellets wurden durch Zentrifugation (10 mm, 5000 × g) geerntet. Das Pellet wurde aliquotiert, mit flüssigem Stickstoff gefroren, und eine Stahlkugel wurde zugegeben, die mit dem Qiagen/Tresch-Mühlensystem kompatibel war. Die Pellets wurden 5 min lang in der Tresch-Mühle für die Zelldisruption behandelt. Gesamtzellextrakte wurden durch einen 30-minütigen 100000 × g-Zentrifugationsschritt in die lösliche und die Membran-Fraktion aufgetrennt. Das Pellet stellt die Membranfraktion, der Überstand die lösliche Fraktion dar. Alle drei Fraktionen wurden einer SDS-PAGE und Western-Analyse, wie oben beschrieben, unterzogen und analysiert (8). In Hefe konnte keine Spaltung von nECR(Tp) beobachtet werden. Gemäß dem Molekulargewicht läuft das Hefe-exprimierte Fusionsprotein bei ungefähr 86 kDa, was mit nECR(Tp) in T. pseudonana vergleichbar ist. Es ist keine gespaltene 59-kDa-ECR-Version vorhanden. Deshalb kann schlußgefolgert werden, dass nECR(Tp), da es die Hefe-KO-Mutanten komplementiert (Beispiel 3), in seiner ungespaltenen Form vollständig funktional ist, womit es eine neue Klasse von Proteinen repräsentiert. Außerdem wurden die löslichen und mikrosomalen Fraktionen eingehend analysiert, um zu überprüfen, ob es irgendeine lösliche Fraktion von nECR(Tp) gibt (9). Erneut wurde Überstand und mikrosomale Fraktion auf ein Gel aufgetragen und während einer längeren Zeit exponiert. Es konnte kein nECR(Tp) in der löslichen Fraktion gefunden werden, was erneut einen strukturellen Unterschied zur nativen Version aus T. pseudonana zeigt.

Als Schlußfolgerung, wurde ein neues Fusionsprotein gefunden, das überraschenderweise zwei Enzymaktivitäten des Elongationskomplexes (ECR und DH) enthält. Die SEQ ID NR. 1 führt zur Expression eines funktionellen Fusionsproteins, das andere strukturelle Eigenschaften als die nativen Proteine in T. pseudonana aufweist, in heterologen Systemen.

Beispiel 6: Expression von nECR(Tp) und nECR(Pt) in Pflanzen.

Die neuen nECR aus T. pseudonana und P. tricornutum werden in einen Pflanzentransformationsvektor kloniert, wie in WO 2003/093482, WO 2005/083093 oder WO 2007/093776 beschrieben. Beispielartige geeignete Kombinationen von Genen sind in Tabelle 3, 4 und 5 beschrieben. Tabelle 3: Genkombinationen für die Herstellung von ARA.

GenAktivitätSEQ ID NR:D6Des(Ot)Δ6-Desaturase5D6Elo(Pp)Δ6-Elongase6D5Des(Tc)Δ5-Desaturase7D12Des(Ps)Δ12-Desaturase8D6Elo(Tp)Δ6-Elongase9nECR(Tp) oder nECR(Pt)nECR1 oder 3
Tabelle 4: Genkombinationen für die Herstellung von EPA.GenAktivitätSEQ ID NR:D6Des(Ot)Δ6-Desaturase5D6Elo(Pp)Δ6-Elongase6D5Des(Tc)Δ5-Desaturase7D12Des(Ps)Δ12-Desaturase8D6Elo(Tp)Δ6-Elongase9(3-Des(Pi)Omega 3-Desaturase10D15Des(Cp)Δ15-Desaturase11nECR(Tp) oder nECR(Pt)nECR1 oder 3
Tabelle 5: Genkombinationen für die Herstellun von DHA.GenAktivitätSEQ ID NR:D6Des(Ot)Δ6-Desaturase5D6Elo(Pp)Δ6-Elongase6D5Des(Tc)Δ5-Desaturase7D12Des(Ps)Δ12-Desaturase8D6Elo(Tp)Δ6-Elongase9ω3-DeS(Pi)Omega 3-Desaturase10D15Des(Cp)Δ15-Desaturase11D5Elo(Ot)Δ5-Elongase12D4Des(Tc)Δ4-Desaturase13nECR(Tp) oder nECR(Pt)nECR1 oder 3

Transgene Rapslinien werden erzeugt, wie in Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777–4788, beschrieben, und Samen von transgenen Rapspflanzen werden analysiert, wie es in Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561–31566, beschrieben ist.

Referenzliste

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Alle in dieser Beschreibung angeführten Referenzen sind hierin durch den Bezug eingeschlossen, und zwar sowohl bezüglich ihres gesamten Offenbarungsgehaltes als auch des Offenbarungsgehaltes, welcher in dieser Beschreibung spezifisch erwähnt ist.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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