Title:
Promotoren von Brassica napus für samenspezifische Genexpression
Kind Code:
T5


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel und Verfahren, die eine gewebespezifische und insbesondere samenspezifische Expression von Genen ermöglichen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Polynukleotid, das eine Expressionskontrollsequenz umfasst, die eine samenspezifische Expression einer Nukleinsäure von Interesse ermöglicht, die funktionsfähig an diese gebunden ist. Ferner zieht die vorliegende Erfindung Vektoren, Wirtszellen, nicht-humane transgene Organismen in Betracht, die das oben genannte Polynukleotid umfassen, wie auch Verfahren und Verwendungen eines solchen Polynukleotids.




Inventors:
BAUER, Jörg (67117, Limburgerhof, DE)
Senger, Toral (69126, Heidelberg, DE)
Application Number:
DE112009001585T
Publication Date:
02/23/2012
Filing Date:
06/30/2009
Assignee:
BASF Plant Science GmbH, 67063 (DE)
International Classes:



Foreign References:
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Attorney, Agent or Firm:
Herzog Fiesser & Partner, 68167, Mannheim, DE
Claims:
1. Polynukleotid, umfassend eine Expressionskontrollsequenz, die eine samenspezifische Expression einer Nukleinsäure von Interesse ermöglicht, die funktionsfähig an diese gebunden ist, wobei die Expressionskontrollsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
(a) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz wie in einer von SEQ ID NO: 1, 6, 9, 14, 16, 22, 25, 70, 77, 85, 95, 103, 111, 119, 124 oder 131 dargestellt;
(b) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die wenigstens 80% mit einer Nukleinsäuresequenz identisch ist, die in einer von SEQ ID NO 1, 6, 9, 14, 16, 22, 25, 70, 77, 85, 95, 103, 111, 119, 124 oder 131 dargestellt ist;
(c) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wie in einer von SEQ ID NO 1, 6, 9, 14, 16, 22, 25, 70, 77, 85, 95, 103, 111, 119, 124 oder 131 dargestellt;
(d) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz liegt, die in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt ist;
(e) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz liegt, die wenigstens 80% mit einer offenen Leserahmen-Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt;
(f) einer Expressionskontrollsequenz, die durch 5' Genome Walking oder durch TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction) an genomischer DNA von dem ersten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz erhältlich ist, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt ist; und
(g) einer Expressionskontrollsequenz, die durch 5' Genome Walking oder durch TAIL-PCR an genomischer DNA von dem ersten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz erhältlich ist, die wenigstens 80% mit einem offenen Leserahmen identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt.

2. Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die Expressionskontrollsequenz mindestens 1.000 Nukleotide umfasst.

3. Polynukleotid, umfassend eine Expressionsterminationssequenz, die eine Beendigung einer Transkription einer Nukleinsäure von Interesse, die funktionsfähig an diese gebunden ist, ermöglicht, wobei die Expressionsterminationssequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
(a) einer Expressionsterminationssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer von SEQ ID NO: 2, 7, 10, 15, 17, 23, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt;
(b) einer Expressionsterminationssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die wenigstens 80% mit einer Nukleinsäuresequenz identisch ist, die in einer von SEQ ID NO: dargestellt ist, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wie in einer von SEQ ID NO: 2, 7, 10, 15, 17, 23, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt;
(c) einer Expressionsterminationssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wie in einer von SEQ ID NO: 2, 7, 10, 15, 17, 23, 71, 78, 86, 96, 104, 112, oder 125 dargestellt;
(d) einer Expressionsterminationssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromabwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz angeordnet ist, die in einer von SEQ ID NOs: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt ist;
(e) einer Expressionsterminationssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromabwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz angeordnet ist, die wenigstens 80% mit einer offenen Leserahmen-Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NOs: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt;
(f) einer Expressionsterminationssequenz, die durch 3' Genome Walking oder durch TAIL-PCR an genomischer DNA von dem letzten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz erhältlich ist, wie in einer von SEQ ID NOs: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt; und
(g) einer Expressionsterminationssequenz, die durch 3' Genome Walking oder durch TAIL-PCR an genomischer DNA von dem letzten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz erhältlich ist, die wenigstens 80% mit einem offenen Leserahmen identisch ist, wie in einer von SEQ ID NOs: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt.

4. Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polynukleotid des Weiteren eine Nukleinsäure von Interesse umfasst, die funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden ist.

5. Vektor, umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Vektor nach Anspruch 5, wobei der Vektor ein Expressionsvektor ist.

7. Wirtszelle, umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder den Vektor nach Anspruch 5 oder 6.

8. Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.

9. Nicht-humaner transgener Organismus, umfassend das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder den Vektor nach Anspruch 5 oder 6.

10. Nicht-humaner transgener Organismus nach Anspruch 9, wobei der Organismus eine Pflanze oder ein Samen davon ist.

11. Verfahren zum Exprimieren einer Nukleinsäure von Interesse in einer Wirtszelle, umfassend
(a) Einführen des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des Vektors nach Anspruch 5 oder 6 in die Wirtszelle, wobei die Nukleinsäuresequenz von Interesse funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden wird; und
(b) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in der Wirtszelle.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.

13. Verfahren zum Exprimieren einer Nukleinsäure von Interesse in einem nicht-humanen Organismus, umfassend
(a) Einführen des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des Vektors nach Anspruch 5 oder 6 in den nicht-humanen Organismus, wobei die Nukleinsäuresequenz von Interesse funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden wird; und
(b) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in dem nicht-humanen transgenen Organismus.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der nicht-humane transgene Organismus eine Pflanze oder ein Samen davon ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Nukleinsäure von Interesse samenspezifisch exprimiert wird.

16. Verwendung des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4, des Vektors nach Anspruch 5 oder 6, der Wirtszelle nach Anspruch 7 oder 8 oder des nicht-humanen transgenen Organismus nach Anspruch 9 oder 10 für die Expression einer Nukleinsäure von Interesse.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Expression samenspezifisch ist.

18. Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, des Vektors nach Anspruch 5 oder 6, der Wirtszelle nach Anspruch 7 oder 8, des nicht-humanen transgenen Organismus nach Anspruch 9 oder 10, des Verfahrens nach einem der Ansprüche 11 bis 15 oder die Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Nukleinsäure von Interesse für ein Samenspeicherprotein kodiert oder an der Modulation von Samenspeicherverbindungen beteiligt ist.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel und Verfahren, die eine gewebespezifische und insbesondere samenspezifische Expression von Genen ermöglichen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Polynukleotid, das eine Expressionskontrollsequenz umfasst, die eine samenspezfische Expression einer Nukleinsäure von Interesse ermöglicht, die funktionsfähig an diese gebunden ist. Ferner zieht die vorliegende Erfindung Vektoren, Wirtszellen, nicht-humane transgene Organismen in Betracht, die das oben genannte Polynukleotid umfassen, wie auch Verfahren und Anwendungen eines solchen Polynukleotids.

Im Bereich der ”grünen” (landwirtschaftlichen) Biotechnologie werden Pflanzen genetisch manipuliert, um ihnen günstige Merkmale zu verleihen. Diese günstigen Merkmale können eine höhere Ausbeute, höhere Toleranz, verringerte Abhängigkeit von Düngemitteln, Herbizid-, Pestizid- oder Fungizidresistenz oder die Fähigkeit sein, chemische Spezialitäten, wie Nahrungsbestandteile, Arzneimittel, Öle für Nahrungsmittel und Petrochemie, usw. zu erzeugen.

In vielen Fällen ist es notwendig, ein heterologes Gen in den genetisch modifizierten Pflanzen an einer ziemlich spezfischen Stelle zu exprimieren, um eine Pflanze zu erhalten, die das gewünschte günstige Merkmal aufweist. Eine Hauptstelle für eine Genexpression ist der Pflanzensamen. In den Samen verlaufen viele wichtige Synthesewege, z. B., in der Fettsäuresynthese. Daher ermöglicht eine Expression heterologer Gene in Samen die Manipulation von Fettsäuresynthesewegen und somit die Bereitstellung verschiedener Fettsäurederivate und Verbindungen auf Lipidbasis.

Für viele heterologe Gene jedoch ist eine samenspezifische Expression erforderlich. Promotoren, die eine samenspezifische Expression ermöglichen, sind nach dem Stand der Technik bekannt. Solche Promotoren enthalten den Napin-Promotor aus Raps (US 5,608,152), den USP Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459–67), den Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), den Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), den Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder den Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233–9), und Promotoren, die eine samenspezfische Expression in monocotyledonen Pflanzen bewirken, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis und dergleichen. Geeignete, nennenswerte Promotoren sind der Gerste Ipt2- oder Ipt1-Gen-Promotor (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die Promotoren von dem Gerste-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, dem Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen oder dem Roggen-Secalin-Gen, die in WO 99/16890 beschrieben sind.

Es besteht jedoch ein eindeutiger Bedarf an weiteren Expressionskontrollsequenzen, wie Promotoren und Terminatoren, die eine zuverlässige und effiziente Kontrolle der Expression von Fremdnukleinsäuren in Samen ermöglichen.

Das technische Problem, das dieser Erfindung zugrunde liegt, kann als die Bereitstellung von Mitteln und Verfahren erachtet werden, die den oben genannten Bedürfnissen gerecht werden. Das technische Problem wird durch die Ausführungsformen gelöst, die in den Ansprüchen und in der Folge dargestellt sind.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Polynukleotid, umfassend eine Expressionskontrollsequenz, die eine samenspezifische Expression einer Nukleinsäure von Interesse ermöglicht, die funktionsfähig an diese gebunden ist, wobei die Expressionskontrollsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

  • (a) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz wie in einer von SEQ ID NO: 1, 6, 9, 14, 16, 22, 25, 70, 77, 85, 95, 103, 111, 119, 124 oder 131 dargestellt;
  • (b) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die wenigstens 80% mit einer Nukleinsäuresequenz identisch ist, die in einer von SEQ ID NO 1, 6, 9, 14, 16, 22, 25, 70, 77, 85, 95, 103, 111, 119, 124 oder 131 dargestellt ist;
  • (c) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wie in einer von SEQ ID NO 1, 6, 9, 14, 16, 22, 25, 70, 77, 85, 95, 103, 111, 119, 124 oder 131 dargestellt;
  • (d) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz liegt, die in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt ist;
  • (e) einer Expressionskontrollsequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz liegt, die wenigstens 80% mit einer offenen Leserahmen-Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt;
  • (f) einer Expressionskontrollsequenz, die durch 5' Genome Walking oder durch TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction) an genomischer DNA von dem ersten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz erhältlich ist, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt ist; und
  • (g) einer Expressionskontrollsequenz, die durch 5' Genome Walking oder durch TAIL-PCR an genomischer DNA von dem ersten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz erhältlich ist, die wenigstens 80% mit einem offenen Leserahmen identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt.

Der Begriff ”Polynukleotid”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein lineares oder kreisförmiges Nukleinsäuremolekül. Er beinhaltet DNA- wie auch RNA-Moleküle. Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es eine Expressionskontrollsequenz umfasst, wie anderwärts in dieser Beschreibung definiert. Zusätzlich zu der Expressionskontrolisequenz umfasst das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise des Weiteren mindestens eine Nukleinsäure von Interesse, die funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden ist, und/oder eine Terminationssequenz oder Transkription. Somit umfasst das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Expressionskassette für die Expression mindestens einer Nukleinsäure von Interesse. Als Alternative könnte das Polynukleotid zusätzlich zu der Expressionskontrollsequenz mehrere Klonierungsstellen und/oder eine Terminationssequenz für die Transkription umfassen. In einem solchen Fall ist die mehrfache Klonierungsstelle vorzugsweise derart angeordnet, dass eine funktionsfähige Verbindung einer Nukleinsäure, die in die mehrfache Klonierungsstelle eingeführt werden soll, mit der Expressionskontrollsequenz möglich ist. Zusätzlich zu den oben genannten Komponenten könnte das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Komponenten umfassen, die für eine homologe Rekombination erforderlich sind, d. h., flankierende genomische Sequenzen einer Zielstelle. Ebenso vorzugsweise jedoch kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung im Wesentlichen aus der Expressionskontrollsequenz bestehen.

Der Begriff ”Expressionskontrollsequenz”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die imstande ist, die Expression einer anderen Nukleinsäure zu steuern, die funktionsfähig an diese gebunden ist, z. B. einer Nukleinsäure von Interesse, auf die anderwärtig in dieser Beschreibung ausführlich Bezug genommen wird. Eine Expressionskontrollsequenz, auf die gemäß der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, umfasst vorzugsweise Sequenzmotive, die von Polypeptiden, d. h. Transkriptionsfaktoren, erkannt und gebunden werden. Die Transkriptionsfaktoren sollen bei einer Bindung RNA-Polymerasen, vorzugsweise, RNA-Polymerase I, II oder III, insbesondere RNA-Polymerase II oder III, und ganz besonders RNA-Polymerase II rekrutieren. Dadurch wird die Expression einer Nukleinsäure, die funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden ist, eingeleitet. Es ist klar, dass abhängig von der Art einer zu exprimierenden Nukleinsäure, d. h. der Nukleinsäure von Interesse, eine Expression, im vorliegenden Sinn, eine Transkription von RNA-Polynukleotiden von der Nukleinsäuresequenz umfassen kann (wie zum Beispiel für Antisense-Methoden oder RNAi-Methoden geeignet) oder eine Transkription von RNA-Polynukleotiden, gefolgt von einer Translation der RNA-Polynukleotide in Polypeptide umfassen kann (wie z. B. für die Genexpression und rekombinante Polypeptidproduktionsmethoden geeignet). Zur Steuerung der Expression einer Nukleinsäure kann sich die Expressionskontrollsequenz unmittelbar neben der zu exprimierenden Nukleinsäure befinden, d. h. physisch an die Nukleinsäure an ihrem 5'-Ende gebunden sein. Als Alternative kann sie in physischer Nähe liegen. Im letztgenannten Fall muss sie jedoch so angeordnet sein, dass sie eine funktionelle Interaktion mit der zu exprimierenden Nukleinsäure ermöglicht. Eine Expressionskontrollsequenz, auf die hier Bezug genommen wird, umfasst vorzugsweise zwischen 200 und 5.000 Nukleotide in der Länge. Insbesondere umfasst sie zwischen 500 und 2.500 Nukleotide und ganz besonders mindestens 1.000 Nukleotide. Wie oben erwähnt, umfasst eine Expressionskontrollsequenz vorzugsweise mehrere Sequenzmotive, die für eine Transkriptionsfaktorbindung oder zur Verleihung einer gewissen Struktur an das Polynukleotid, das die Expressionskontrollsequenz umfasst, erforderlich sind. Sequenzmotive werden manchmal auch als cis-regulatorische Elemente bezeichnet und enthalten, im vorliegenden Sinn, Promotorelemente wie auch Enhancer-Elemente. Bevorzugte Expressionskontrollsequenzen, die in einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung enthalten sein sollen, haben eine Nukleinsäuresequenz, wie in einer der SEQ ID NO: 1, 6, 9, 14, 16, 22, 25, 70, 77, 85, 95, 103, 111, 119, 124 und 131 dargestellt ist.

Des Werteren hat eine Expressionskontrollsequenz, die aus einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung besteht, eine Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmensequenz liegt, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 und 125 dargestellt, d. h. ist eine variante Expressionskontrollsequenz. Es ist klar, dass sich die Expressionskontrollsequenzen aufgrund von allelischen Variationen geringfügig in ihren Sequenzen unterscheiden können. Daher zieht die vorliegende Erfindung auch eine Expressionskontrollsequenz in Betracht, die von einem offenen Leserahmen abgeleitet werden kann, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 und 125 dargestellt ist. Die Expressionskontrollsequenzen sind imstande, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, an die stromaufwärts liegenden Sequenzen der offenen Leserahmen zu hybridisieren, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 und 125 dargestellt ist, d. h. die Expressionskontrollsequenzen, die in einer von SEQ ID NO: 1, 6, 9, 14, 16, 22, 25, 70, 77, 85, 95, 103, 111, 119, 124 und 131 dargestellt sind. Stringente Hybridisierungsbedingungen im vorliegenden Sinn sind vorzugsweise Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 53 bis 65°C, vorzugsweise bei 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C oder 65°C. Der Fachmann weiß, dass sich diese Hybridisierungsbedingungen abhängig von der Art der Nukleinsäure unterscheiden und, zum Beispiel wenn organische Lösemittel vorhanden sind, in Bezug auf die Temperatur und Konzentration des Puffers. Zum Beispiel variiert unter ”Standard-Hybridisierungsbedingungen” die Temperatur abhängig von der Art der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 to 5 × SSC (pH 7,2). Wenn ein organisches Lösemittel in dem oben genannten Puffer vorhanden ist, zum Beispiel 50% Formamid, ist die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride sind vorzugsweise zum Beispiel 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride sind vorzugsweise zum Beispiel 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben genannten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaaren) Länge und einen G + C Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Solche hybridisierenden Expressionskontrollsequenzen sind insbesondere zu mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94% mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% mit den Expressionskontrollsequenzen, wie in einer von SEQ ID NO.: 1, 6, 9, 14, 16, 22, 25, 70, 77, 85, 95, 103, 111, 119, 124 und 131 dargestellt, identisch. Die prozentuellen Identitätswerte werden vorzugsweise über die gesamte Nukleinsäuresequenzregion berechnet. Eine Reihe von Programmen, die auf einer Vielzahl von Algorithmen basieren, steht dem Fachmann für einen Vergleich verschiedener Sequenzen zur Verfügung. In diesem Zusammenhang liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Zur Ausführung von Sequenzausrichtungen sind das Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351–360, 1987, Higgins 1989, CABIOS, 5: 151–153) oder die Programme Gap und BestFit (Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48; 443–453 und Smith 1981, Adv. Appl. Math. 2; 482–489), die Teil des GCG Software-Pakets sind (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 Version 1991), zu verwenden. Die oben in Prozent (%) angegebenen Sequenzidentitätswerte sind vorzugsweise unter Verwendung des Programms GAP über die gesamte Sequenzregion mit den folgenden Einstellungen zu bestimmen: Lückengewichtung: 50, Längengewichtung: 3, durchschnittliche Übereinstimmung: 10,000 und durchschnittliche Fehlübereinstimmung: 0,000, die, falls nicht anders angegeben, immer als Standardeinstellungen für Sequenzausrichtungen verwendet werden sollen.

Ferner können Expressionskontrollsequenzen, die eine samenspezifische Expression ermöglichen, nicht nur stromaufwärts der oben genannten offenen Leserahmen mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer von SEQ ID NO. 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 und 125 dargestellt, gefunden werden. Vielmehr können Expressionskontrollsequenzen, die eine samenspezifische Expression ermöglichen, auch stromaufwärts von orthologen, paralogen oder homologen Genen (d. h. offenen Leserahmen) gefunden werden. Somit hat auch vorzugsweise eine variante Expressionskontrollsequenz, die aus einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung besteht, eine Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmensequenz liegt, die zu mindestens 70%, bevorzugter mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94% mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% mit einer Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 und 125 dargestellt. Der variante offene Leserahmen soll für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität des entsprechenden Polypeptids kodieren, für das der offene Leserahme kodiert, der in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 und 125 dargestellt ist. In diesem Zusammenhang sollte erwähnt werden, dass der offene Leserahmen, der in SEQ ID NO: 5 dargestellt ist, für ein Polypeptid, das Ähnlichkeit mit auf Gibberlin ansprechenden Proteinen aufweist, kodiert, der offene Leserahmen, der in SEQ ID NO: 13 dargestellt ist, für ein Polypeptid, das zu der Pektinersterasefamilie gehört, kodiert, der offene Leserahmen, der in SEQ ID NO: 20 dargestellt ist, für ”Sinapoyl-Cholin-Transferase 1” (SCT1) kodiert, und der offene Leserahmen, der in SEQ ID NO: 21 dargestellt ist, für für ”Sinapoyl-Cholin-Transferase 2” (SCT2) kodiert. Diese biologischen Aktivitäten können vom Fachmann ohne Weiteres bestimmt werden. Die offenen Leserahmen, die in SEQ ID NO: 27 und 28 dargestellt sind, kodieren für Polypeptide, die Homologie mit Samenproteinen mit noch unbekannten Funktionen aufweisen. Tabelle 1: Proteinfunktion von Genen, die als samenspezifisch exprimiert identifiziert wurden

SEQ IDProteinfunktion5Mutmaßliches, auf Gibberelin ansprechendes Protein13Mutmaßliche Pektinesterase20Sinapoyl-Cholin-Transferase21Sinapoyl-Cholin-Transferase27Samenprotein28Samenprotein72Samenprotein80CRU4 Subeinheit von Cruciferin (Samenspeicherprotein)88Myrosinase98Samenprotein106Serinproteinase-Inhibitor114Transkriptionsfaktor, der an embryonaler Entwicklung beteiligt ist121Glutathion-S-Transferase133Samenprotein

Ebenso ist vorzugsweise eine variante Expressionskontrollsequenz, die aus einem Polynukleotid der voliegenden Erfindung besteht, (i) durch 5' Genome Walking oder TAIL-PCR von einer offenen Leserahmensequenz erhältlich, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 und 125 dargestellt ist, oder (ii) durch 5' Genome Walking oder TAIL-PCR von einer offenen Leserahmensequenz erhältlich, die zu mindestens 80% mit einem offenen Leserahmen identisch ist, wie in einer von SEQ ID NO: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 und 125 dargestellt ist. Variante Expressionskontrollsequenzen sind ohne Weiteres durch die Genome Walking Technologie oder durch TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction) erhältlich, die wie in den beiliegenden Beispielen beschrieben ausgeführt werden kann, z. B. unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits.

Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 110, mindestens 120, mindestens 130, mindestens 140 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 1 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 110 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 2 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 9 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 40, mindestens 50, mindestens 60 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 3 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 14 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 4 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 16 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70, mindestens 80, mindestens 90 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 5 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 22 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 80, mindestens 90, mindestens 100, mindestens 110, mindestens 120, mindestens 130 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 6 angeführt sind. Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung für die Expressionskontrollsequenz Bezug genommen wird, die in SEQ ID NO: 25 dargestellt ist, umfassen vorzugsweise mindestens 80, mindestens 100, mindestens 120, mindestens 130, mindestens 140, mindestens 150 oder alle der Sequenzmotive, die in Tabelle 7 angeführt sind.

Variante Expressionskontrollsequenzen, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, umfassen vorzugsweise auch mindestens die cis-regulatorischen Elemente, auf die in der folgenden Tabelle 8 Bezug genommen wird. Noch bevorzugter umfassen die varianten regulatorischen Expressionskontrollsequenzen die Elemente mit derselben Frequenz und Verteilung, die in Tabelle 9 für die einzelnen regulatorischen Sequenzen angeführt sind.

Der Begriff ”samenspezifisch”, wie hierin verwendet, bedeutet, dass eine Nukleinsäure von Interesse, die funktionsfähig an die hierin genannte Expressionskontrollsequenz gebunden ist, vorwiegend in Samen exprimiert wird, wenn sie in einer Pflanze vorhanden ist. Eine vorwiegende Expression im vorliegenden Sinn ist durch ein statistisch signifikant höheres Maß an detektierbarer Transkription in den Samen in Bezug auf andere Pflanzengewebe gekennzeichnet. Ein statistisch signfikantes höheres Maß an Transkription ist vorzugsweise ein Maß, das mindestens das Zweifache, Dreifache, Vierfache, Fünffach, Zehnfache, Hundertfache, Fünfhundertfache oder Tausendfache des Maßes ist, das in mindestens einem der anderen Gewebe mit detektierbarer Transkription vorgefunden wird. Als Alternative ist es eine Expression in Samen, wobei das Maß an Transkription in Nicht-Samengeweben geringer ist als 1%, 2%, 3%, 4% oder besonders bevorzugt 5% des gesamten (ganze Pflanze) Maßes an Expression. Das Maß an Transkription korreliert direkt mit der Menge an Transkripten (d. h. RNA) oder Potypeptiden, für die die Transkripte kodieren, die in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden sind. Geeignete Techniken zum Messen der Transkription, die entweder auf RNA oder Polypeptiden basieren, sind im Stand der Technik gut bekannt. Samenspezfisch, als Alternative und vorzugsweise zusätzlich zu dem oben Gesagten, bedeutet, dass die Expression auf Samen beschränkt oder nahezu beschränkt ist, d. h. es gibt im Wesentlichen keine detektierbare Transkription in anderen Geweben. Nahezu beschränkt bedeutet im vorliegenden Sinn, dass eine unspezifische Expression in weniger als zehn, weniger als fünf, weniger als vier, weniger als drei, weniger als zwei oder einem anderen Gewebe(n) detektierbar ist. Eine samenspezifische Expression, wie hierin verwendet, enthält eine Expression in Samenzellen oder deren Vorläufern, wie Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos.

Eine Expressionskontrollsequenz kann auf samenspezifische Expression durch Bestimmen des Expressionsmusters einer Nukleinsäure von Interesse, z. B. einer Nukleinsäure, die für ein Reporterprotein kodiert, wie GFP, in einer transgenen Pflanze getestet werden. Transgene Pflanzen können durch Techniken erzeugt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind und anderwärtig in dieser Beschreibung besprochen werden. Die oben genannten Mengen oder Expressionsmuster werden vorzugsweise, durch Northern Blot- oder in situ Hybridisierungstechniken, wie in WO 02/102970 beschrieben ist, in Brassica napus Pflanzen bestimmt, bevorzugter 20, 25, 30, 35 oder 40 Tage nach der Blüte. Bevorzugte Expressionsmuster für die Expressionskontrollsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung sind in der Figur dargestellt oder in den beiliegenden Beispielen in der Folge beschrieben.

Der Begriff ”Nukleinsäure von Interesse” bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die unter der Kontrolle der hierin genannten Expressionskontrollsequenz exprimiert werden soll. Vorzugsweise kodiert eine Nukleinsäure von Interesse für ein Polypeptid, dessen Gegenwart in einer Zelle oder einem nicht-humanen Organismus erwünscht ist, wie hierin angegeben, und insbesondere in einem Pflanzensamen. Ein solches Polypeptid kann ein Enzym sein, das für die Synthese von Samenspeicherverbindungen erforderlich ist, oder kann ein Samenspeicherprotein sein. Es ist klar, dass, wenn die Nukleinsäure von Interesse für ein Polypeptid kodiert, die Transkription der Nukleinsäure in RNA und Translation der transkribierten RNA in das Polypeptid erforderlich sein könnte. Eine Nukleinsäure von Interesse enthält auch vorzugsweise biologisch aktive RNA-Moleküle und insbesondere Antisense-RNAs, Ribozyme, Mikro-RNAs oder siRNAs. Die biologisch aktiven RNA-Moleküle können zum Modifizieren der Menge eines Zielpolypeptids verwendet werden, das in einer Zelle oder in einem nicht-humanen Organismus vorhanden ist. Zum Beispiel kann eine unerwünschte enzymatische Aktivität in einem Samen aufgrund der samenspezifischen Expression von Antisense-RNAs, Ribozymen, Mikro-RNAs oder siRNAs reduziert werden. Die zugrunde liegenden biologischen Wirkungsprinzipien der oben genannten, biologisch aktiven RNA-Moleküle sind im Stand der Technik gut bekannt. Ferner ist dem Fachmann wohl bewusst, wie Nukleinsäuren zu erhalten sind, die für solche biologisch aktiven RNA-Moleküle kodieren. Es ist klar, dass die biologisch aktiven RNA-Moleküle direkt durch Transkription der Nukleinsäure von Interesse erhalten werden können, d. h. ohne Translation in ein Polypeptid. Es ist klar, dass die Expressionskontrollsequenz auch die Expression von mehr als einer Nukleinsäure von Interesse steuern kann, d. h., von mindestens einer, mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf usw. Nukleinsäuren von Interesse.

Der Begriff ”funktionsfähig gebunden”, wie hierin verwendet, bedeutet, dass die Expressionskontrollsequenz der vorliegenden Erfindung und eine Nukleinsäure von Interesse so gebunden sind, dass die Expression durch die Expressionskontrollsequenz gesteuert werden kann, d. h., die Expressionskontrollsequenz soll funktionell an die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz gebunden sein. Daher können die Expressionskontrollsequenz und die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz physisch aneinander gebunden sein, z. B. durch Einsetzen der Expressionskontrollsequenz am 5'-Ende der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz. Als Alternative können die Expressionskontrollsequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure nur in physischer Nähe sein, so dass die Expressionskontrollsequenz die Expression mindestens einer Nukleinsäuresequenz von Interesse steuern kann. Die Expressionskontrollsequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure sind vorzugsweise nicht mehr als 500 bp, 300 bp, 100 bp, 80 bp, 60 bp, 40 bp, 20 bp, 10 bp oder 5 bp getrennt.

Es hat sich in vorteilhafter Weise in den Studien, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen, gezeigt, dass die samenspezfische Expression einer Nukleinsäure von Interesse durch Expression der Nukleinsäure von Interesse unter der Kontrolle einer Expressionskontrollsequenz von Brassica napus oder einer varianten Expressionskontrollsequenz, wie oben spezifiziert, erreicht werden kann. Die Expressionskontrollsequenzen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, ermöglichen eine zuverlässige und hoch spezifische Expression von Nukleinsäuren von Interesse. Dank der vorliegenden Erfindung ist es möglich, (i) spezifisch biochemische Prozesse in Samen zu manipulieren, z. B. durch Expression heterologer Enzyme oder biologisch aktiver RNAs, oder (ii) heterologe Proteine in Samen zu erzeugen. im Prinzip zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung des Polynukleotids, des Vektors, der Wirtszelle oder des nicht-humanen, transgenen Organismus für die Expression einer Nukleinsäure von Interesse in Betracht. Vorzugsweise ist die angestrebte Expression samenspezifisch. Insbesondere kodiert die Nukleinsäure von Interesse, die in den verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, für ein Samenspeicherprotein oder ist an der Modulation von Samenspeicherverbindungen beteiligt

Wie hierin verwendet, enthalten Samenspeicherverbindungen Fettsäuren und Triacylglyceride, die zahlreiche Anwendungen in der Nahrungsmittelindustrie, Tiernahrung, Kosmetik und im pharmakologischen Sektor haben. Abhängig davon, ob sie freie gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren oder sonst Triacylglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren sind, sind sie für verschiedene unterschiedliche Anwendungen geeignet Insbesondere wird das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, das die oben genannte Expressionskontrollsequenz umfasst, für die Herstellung von polyungesättigten Fettsäuren (”polyunsaturated fatty acids” – PUFAs) verwendet. Für die Herstellung von PUFAs in Samen muss die Aktivität von Enzymen, die an deren Synthese beteiligt sind, insbesondere Elongasen und Desaturasen, moduliert werden. Dies wird durch samenspezifische Expression der Nukleinsäuren von Interesse erreicht, die für die oben genannte Enzyme kodieren, oder durch samenspezifische Expression von Antisense-, Ribozym-, RNAi Molekülen, die die Aktivität der Enzyme abwärts regulieren, indem sie deren Proteinsynthese stören. PUFAs sind Samenspeicherverbindungen, die durch einen anschließend angewandten Reinigungsprozess unter Verwendung der oben genannten Samen isoliert werden können.

Besonders bevorzugte PUFAs gemäß der vorliegenden Erfindung sind polyungesättigte langkettige ω-3-Fettsäuren, wie Eicosapentaensäure (= EPA, C20:5Δ5,8,11,14,17) ω-3 Eicostetraensäure (= ETA, C20:4Δ8,11,14,17), Arachidonsäure (= ARA C20:4Δ5,8,11,14) oder Docosahexaensäure (= DHA, C22:Δ4,7,10,13,16,19). Sie sind wichtige Komponenten der menschlichen Emährung aufgrund ihrer verschiedenen Rollen in Gesundheitsaspekten, einschließlich der Entwicklung des kindlichen Gehirns, der Funktionalität der Augen, der Synthese von Hormonen und anderer Signalsubstanzen, und der Vorbeugung bei kardiovaskulären Beschwerden, Krebs und Diabetes (Poulos, A Lipids 30: 1–14, 14Δ8,11,14,17995; Horrocks, LA und Yeo YK Pharmacol Res 40: 211–225, 1999). Es besteht daher ein Bedarf an der Herstellung polyungesättigter langkettiger Fettsäuren.

Besonders bevorzugte Enzyme, die an der Synthese von PUFAs beteiligt sind, sind in WO 91/13972 (Δ9-Desaturase), WO 93/11245 (Δ15-Desaturase), WO 94/11516 (Δ12-Desaturase), EP A 0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP A 0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144–20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200–203 oder Huang et al., Lipids 34, 1999: 649–659, offenbart. Δ6-Desaturasen sind in WO 93/06712, US 5,614,393, US 5,614,393, WO 96/21022, WO 00/21557 und WO 99/27111 beschrieben und auch die Anwendung für die Herstellung in transgenen Organismen ist in WO 98/46763, WO 98/46764 und WO 98/46765 beschrieben. Hier ist auch die Expression verschiedener Desaturasen in WO 99/64616 oder WO 98/46776 beschrieben und beansprucht, wie auch die Bildung polyungesättigter Fettsäuren. In Bezug auf die Expressionswirksamkeit von Desaturasen und ihre Wirkung auf die Bildung polyungesättigter Fettsäuren muss festgehalten werden, dass die Expression einer einzigen Desaturase, wie bisher beschrieben, nur zu geringen Gehalten an ungesättigten Fettsäuren/Lipiden geführt hat, wie zum Beispiel γ-Linolensäure und Stearidonsäure. Ferner werden für gewöhnlich Mischungen von ω-3- und ω-6-Fettsäuren erhalten.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Polynukleotid, umfassend eine Expressionsterminationssequenz, die eine Beendigung einer Transkription einer Nukleinsäure von Interesse, die funktionsfähig an diese gebunden ist, ermöglicht, wobei die Expressionsterminationssequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

  • (a) einer Expressionsterminationssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer von SEQ ID NO: 2, 7, 10, 15, 17, 23, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt;
  • (b) einer Expressionsterminationssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die wenigstens 80% mit einer Nukleinsäuresequenz identisch ist, die in einer von SEQ ID NO: dargestellt ist, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wie in einer von SEQ ID NO: 2, 7, 10, 15, 17, 23, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt;
  • (c) einer Expressionsterminationssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wie in einer von SEQ ID NO: 2, 7, 10, 15, 17, 23, 71, 78, 86, 96, 104, 112, oder 125 dargestellt;
  • (d) einer Expressionsterminationssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromabwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz angeordnet ist, die in einer von SEQ ID NOs: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt ist;
  • (e) einer Expressionsterminationssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, die an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromabwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz angeordnet ist, die wenigstens 80% mit einer offenen Leserahmen-Sequenz identisch ist, wie in einer von SEQ ID NOs: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt;
  • (f) einer Expressionsterminationssequenz, die durch 3' Genome Walking oder durch TAIL-PCR an genomischer DNA von dem letzten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz erhältlich ist, wie in einer von SEQ ID NOs: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt; und
  • (g) einer Expressionsterminationssequenz, die durch 3' Genome Walking oder durch TAIL-PCR an genomischer DNA von dem letzten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz erhältlich ist, die wenigstens 80% mit einem offenen Leserahmen identisch ist, wie in einer von SEQ ID NOs: 5, 13, 20, 21, 27, 28, 71, 78, 86, 96, 104, 112 oder 125 dargestellt.

Der Begriff ”Expressionsterminationssequenz”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die imstande ist, die Beendigung eines RNA-Transkriptionsprozesses einer Nukleinsäure zu regeln, die funktionsfähig an diese gebunden ist, z. B. eine Nukleinsäure von Interesse, die anderswo in dieser Beschreibung im Detail angeführt ist. Eine Terminationssequenz, auf die gemäß der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, enthält ein Polyadenylierungssignal und vermittelt ferner die Dissoziation von RNA-Polymerasen, vorzugsweise RNA-Potymerase I, II oder III, bevorzugter RNA-Polymerase II oder III und insbesondere RNA-Polymerase II, von der transkribierten DNA. Dadurch wird die Verlängerung eines RNA-Transkripts von einer Nukleinsäure, die funktionsfähig an die Terminationssequenz gebunden ist, beendet und die RNA wird freigesetzt. Zur Regulierung der Beendigung einer Transkription einer Nukleinsäure kann die Expressionskontrollsequenz unmittelbar neben der Nukleinsäure angeordnet sein, deren Expression zu beenden ist, d. h., physisch an die Nukleinsäure an ihrem 3'-Ende gebunden sein. Als Alternative kann sie in physischer Nähe angeordnet sein. Im letztgenannten Fall muss die Sequenz jedoch so angeordnet sein, dass sie eine funktionelle Interaktion mit der Nukleinsäure ermöglicht, deren Transkription zu beenden ist. Eine Terminationssequenz, auf die hierin Bezug genommen wird, umfasst eine Länge von 50 bis 2.000 Nukleotiden. Bevorzugter umfasst sie zwischen 100 und 800 Nukleotiden und insbesondere mindestens 100 Nukleotiden. Bevorzugte Expressionsterminationssequenzen sind jene, die in dem oben genannten Polynukleotid enthalten sind.

Ferner gelten die oben angeführten Definitionen und Erklärungen der Begriffe mutatis muandis, außer wie hier in der Folge spezifiziert.

Für Terminationssequenzen bedeutet der Begriff ”funktionsfähig gebunden”, dass die Terminationssequenz der vorliegenden Erfindung und eine Nukleinsäure von Interesse so gebunden sind, dass die Beendigung einer Transkription der mRNA von der Terminationssequenz reguliert werden kann, d. h., die Terminationssequenz soll funktionell an die Nukleinsäuresequenz gebunden sein, deren Transkription beendet werden soll. Daher könnten die Expressionskontrollsequenz, die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz und die Terminationssequenz physisch aneinander gebunden sein, z. B. durch Einsetzen der Expressionskontrollsequenz am 5'-Ende der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und/oder Einsetzen der Terminationssequenz am 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz, deren Transkription beendet werden soll. Als Alternative könnten die Expressionskontrollsequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure nur in physischer Nähe sein, so dass die Expressionskontrollsequenz imstande ist, die Expression von mindestens einer Nukleinsäuresequenz von Interesse zu regulieren. Die Terminationssequenz und die Nukleinsäuresequenz, deren Transkription beendet werden soll, sind vorzugsweise um nicht mehr als 50 bp, 40 bp, 20 bp, 10 bp oder 5 bp getrennt.

Vorzugsweise kann das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, das eine Expressionsterminationssequenz umfasst, auch für eine wirksame Expressionskontrolle in Pflanzen angewendet werden und insbesondere in Pflanzensamen. Im Besonderen ermöglicht die Expressionsterminationssequenz eine exakte Beendigung der Transkription der DNA zu RNA, nachdem die Nukleinsäuresequenz von Interesse transkribiert wurde. Somit wird die Transkription unerwünschter Nukleinsäuresequenzen vermieden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor, der das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst.

Der Begriff ”Vektor” umfasst vorzugsweise Phage-, Plasmid-, virale oder retrovirale Vektoren wie auch künstliche Chromosome, wie bakterielle oder künstliche Hefechromosome. Ferner betrifft der Begriff auch zielgerichtete Konstrukte, die eine zufällige oder ortsgerichtete Integration des zielgerichteten Konstrukts in genomische DNA ermöglichen. Solche Zielkonstrukte umfassen vorzugsweise DNA ausreichender Länge für entweder homologe oder heterologe Rekombination, wie ausführlich in der Folge beschrieben. Der Vektor, der die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfasst, umfasst vorzugsweise des Weiteren selektierbare Marker zur Vermehrung und/oder Selektion in einem Wirt. Der Vektor kann in eine Wirtszelle durch verschiedene Techniken eingearbeitet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Bei Einführung in eine Wirtszelle kann der Vektor im Zytoplasma liegen oder kann in das Genom eingearbeitet werden. Im letztgenannten Fall ist klar, dass der Vektor des Weiteren Nukleinsäuresequenzen umfassen kann, die eine homologe Rekombination oder heterologe Insertion ermöglichen. Vektoren können in prokaryotische oder eukaryotische Zellen durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Die Begriffe ”Transformation” und ”Transfektion”, Konjugation und Transduktion, wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, sollen mehrere Verfahren nach dem Stand der Technik zum Einführen fremder Nukleinsäure (zum Beispiel DNA) in eine Wirtszelle umfassen, einschließlich Kalziumphosphat-, Rubidiumchlorid- oder Kalziumchlorid-Co-Präzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürlicher Kompetenz, auf Kohlenstoff basierender Cluster, chemisch vermittelten Transfers, Elektroporation oder Partikelbombardement (z. B. ”gene-gun”). Geeignete Verfahren für die Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, finden sich in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laborhandbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols, Hrg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Als Alternative kann ein Plasmidvektor durch Wärmeschock- oder Elektroporationstechniken eingeführt werden. Sollte der Vektor ein Virus sein, kann er in vitro unter Verwendung einer geeigneten Verpackungszelllinie vor der Anwendung an Wirtszellen verpackt werden. Retrovirale Vektoren können replikationskompetent oder replikationsdefekt sein. Im letztgenannten Fall erfolgt die virale Vermehrung im Allgemeinen nur im/in komplementierenden Wirt/Zellen.

Vorzugsweise ist der hierin genannte Vektor als Klonierungsvektor geeignet, d. h. in mikrobiellen Systemen replizierbar. Solche Vektoren garantieren ein effizientes Klonen in Bakterien und vorzugsweise Hefen oder Pilzen, und ermöglichen die stabile Transformation von Pflanzen. Jene, die zu erwähnen sind, sind insbesondere verschiedene binäre und co-integrierte Vektorsysteme, die für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignet sind. Solche Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die vir-Gene enthalten, die für die Agrobacterium-vermittelte Transformation erforderlich sind, sowie die Sequenzen, die die T-DNA begrenzen (T-DNA Grenze). Diese Vektorsysteme umfassen vorzugsweise auch weitere cis-regulatorische Regionen, wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit welchen geeignete transformierte Wirtszellen oder Organismen identifiziert werden können. Während co-integrierte Vektorsysteme vir-Gene und T-DNA-Sequenzen aufweisen, die auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf mindestens zwei Vektoren, von welchen einer vir-Gene, aber keine T-DNA trägt, während einer zweiter T-DNA, aber kein vir-Gen trägt. Infolgedessen sind die zuletzt erwähnten Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und können sowohl in E. coli wie auch in Agrobacterium replizieren. Diese binären Vektoren enthalten Vektoren der pBIB-HYG-, pPZP-, pBecks-, pGreen-Serie. Vorzugsweise werden gemäß der Erfindung Bin19, pBl101, pBinAR, pGPTV, pSUN und pCAMBIA verwendet. Ein Überblick über binäre Vektoren und deren Verwendung findet sich in Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451. Ferner kann durch Verwendung geeigneter Klonierungsvektoren das Polynukleotid der Erfindung in Wirtszellen oder Organismen wie Pflanzen oder Tiere eingeführt werden und somit in der Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie jenen, die in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225, veröffentlicht und zitiert sind.

Insbesondere ist der Vektor der vorliegenden Erfindung ein Expressionsvektor. In einem solchen Expressionsvektor umfasst das Polynukleotid eine Expressionskassette, wie oben spezifiziert, die eine Expression in eukaryotischen Zellen oder davon isolierten Fraktionen ermöglicht. Ein Expressionsvektor kann zusätzlich zu dem Polynukleotid der Erfindung auch wertere regulatorische Elemente umfassen, einschließlich transkriptionaler wie auch translationaler Enhancer. Vorzugsweise ist der Expressionsvektor auch ein Gentransfer- oder Targetingvektor. Expressionsvektoren, die von Viren abgeleitet werden, wie Retroviren, Vacciniavirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesviren oder Rinderpapillomavirus, können zur Abgabe der Polynukleotide oder des Vektors der Erfindung in eine angepeilte Zellpopulation verwendet werden. Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, können zur Konstruktion rekombinanter viraler Vektoren verwendet werden; siehe zum Beispiel die Techniken, die in Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1994) beschrieben sind.

Geeignete Expressionsvektorrückgrate werden vorzugsweise von Expressionsvektoren abgeleitet, die im Stand der Technik bekannt sind, wie Okayama-Berg cDNA Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene) oder pSPORT1 (GIBCO BRL). Weitere Beispiele für typische Fusionsexpressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B., und Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), wo Glutathion S-Transferase (GST), Maltose E-Bindungsprotein beziehungsweise Protein A mit der Nukleinsäure von Interesse fusioniert sind, die für ein zu exprimierendes Protein kodiert. Die Target-Genexpression des pTrc Vektors basiert auf der Transkription eines hybriden trp-lac Fusionpromotors durch Wirt-RNA-Polymerase. Die Target-Genexpression des pET 11d Vektors basiert auf der Transkription eines T7-gn10-lac Fusionspromotors, die durch eine co-exprimierte virale RNA-Polymerse (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird durch die Wirtstämme BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophage, der ein T7 gn1 Gen beherbergt, unter der transkriptionalen Kontrolle des lacUV 5 Promotors bereitgestellt. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeSecl (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Prozesse für die Konstruktion von Vektoren, die zur Verwendung in anderen Pilzen geeignet sind, wie den Fadenpilzen, umfassen jene, die ausführlich beschrieben sind in: van den Hondel, C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991) ”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi”, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al., Hrg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi (J. W. Bennett & L. L. Lasure, Hrg., S. 396-428: Academic Press: San Diego). Wertere geeignete Hefevektoren sind zum Beispiel pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Als Alternative können die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung auch in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (zum Beispiel Sf9 Zellen) erhältlich sind, umfassen die pAc-Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Serie (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31–39).

Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können zur Expression einer Nukleinsäure von Interesse in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 und die darin zitierten Referenzen, und Pflanzenzellen höherer Pflanzen (zum Beispiel Spermatophyten, wie Ackerfrüchte) unter Verwendung von pflanzlichen Expressionsvektoren verwendet werden. Beispiele für pflanzliche Expressionsvektoren umfassen jene, die ausführlich beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) ”New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M. W. (1984) ”Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38. Eine pflanzliche Expressionskassette umfasst vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die imstande sind, die Genexpression in Pflanzenzellen zu kontrollieren, und die funktionell so gebunden sind, dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, wie transkriptionale Termination, zum Beispiel Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind jene, die von Agrobacterium tumefaciens T-DNA abgeleitet sind, wie das Gen 3 des Ti Plasmids pTiACH5, das als Octopin-Synthase bekannt ist (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 und folgende) oder funktionelle Äquivalente von diesen, aber alle anderen Terminatoren, die funktionell in Pflanzen aktiv sind, sind auch geeignet. Da eine pflanzliche Genexpression sehr häufig nicht auf transkriptionale Ebenen beschränkt ist, umfasst eine pflanzliche Expressionskassette vorzugsweise andere funktionell gebundene Sequenzen, wie Translations-Enhancer, zum Beispiel die Overdrive-Sequenz, die die 5'-untranslatierte Tabakmosaik-Leadersequenz enthält, die das Protein/RNA Verhältnis erhöht (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711). Andere bevorzugte Sequenzen zur Verwendung in der funktionellen Bindung in pflanzlichen Genexpressionskassetten sind zielgerichtete Sequenzen, die zum Targeting des Genprodukts in sein relevantes Zellenkompartiment erforderlich sind (für einen Überblick, siehe Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285–423 und die darin zitierten Referenzen), zum Beispiel in die Vakuole, den Nukleus, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisome und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.

Die oben genannten Vektoren sind nur ein kleiner Überblick über Vektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind. Weitere Vektoren sind dem Fachmann bekannt und zum Beispiel in: Cloning Vectors (Ed., Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) beschrieben. Für wertere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe die Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Die vorliegende Erfindung zieht auch eine Wirtszelle in Betracht, die das Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst.

Wirtszellen sind Primärzellen oder Zelllinien, die von multizellulären Organismen abgeleitet sind, wie Pflanzen oder Tieren. Ferner umfassen Wirtszellen prokaryotische oder eukaryotische einzellige Organismen (auch als Mikroorganismen bezeichnet). Primärzellen oder Zelllinien, die als Wirtszellen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können von den in der Folge genannten multizellulären Organismen abgeleitet werden. Wirtszellen, die genutzt werden können, sind des Werteren erwähnt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Spezifische Expressionsstämme, die verwendet werden können, zum Beispiel jene mit einer geringeren Protease-Aktivität, sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119–128. Diese enthalten Pflanzenzellen und gewisse Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in allen ihren phänotypischen Formen, wie Staubbeutel, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, Kalli, Keimblätter, Blattstiele, geerntetes Material, Pflanzengewebe, Reproduktionsgewebe und Zellkulturen, die von der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet werden und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Vorzugsweise können die Wirtszellen von Pflanzen erhalten werden. insbesondere werden Ölpflanzen in Betracht gezogen, die große Mengen an Lipidverbindungen umfassen, wie Ölraps, Nachtkerze, Hanf, Distel, Erdnuss, Raps, Leinsamen, Sojabohne, Saflor, Sonnenblume, Borretsch oder Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniokstrauch, Pfeffer, Tagetes, Solanaceae-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Luzeme, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss) und winterharte Gräser und Futterpflanzen. Besonders bevorzugte Pflanzen gemäß der Erfindung sind Ölpflanzen, wie Sojabohne, Erdnuss Ölraps, Raps, Leinsamen, Hanf, Nachtkerze, Sonnenblume, Saflor, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Geeignete Verfahren zur Erhalten von Wirtszellen von den in der Folge genannten multizellulären Organismen wie auch Kultivierungsbedingungen für diese Zellen sind im Stand der Technik gut bekannt.

Die Mikroorganismen sind vorzugsweise Bakterien oder Pilze, einschließlich Hefen. Bevorzugte Pilze, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind ausgewählt aus der Gruppe der Familien Chaetomiaceae, Choanephoraceae, Cryptococcaceae, Cunninghamellaceae, Demetiaceae, Moniliaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pythiaceae, Sacharomycetaceae, Saprolegniaceae, Schizosacharomycetaceae, Sodariaceae oder Tuberculariaceae. Wertere bevorzugte Mikroorganismen sind ausgewählt aus der Gruppe: Choanephoraceae, wie die Gattungen Blakeslea, Choanephora, zum Beispiel Gattungen und Spezies Blakeslea tispora, Choanephora cucurbitanim, Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum, Mortierellaceae, wie Genus Mortierella, zum Beispiel Gattungen und Spezies Mortierella isabellina, Mortierella polycephala, Mortierella ramanniana, Mortierella vinacea, Mortierella zonata, Pythiaceae, wie die Gattungen Phytium, Phytdphthora, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Pythium debaryanum, Pythium intermedium, Pythium irregulare, Pythium megalacanthum, Pythium paroecandrum, Pythium sylvaticum, Pythium ultimum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora lateralis, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora nicotianae var. parasitica, Phytophthora palmivora, Phytophthora parasitica, Phytophthora syringae, Saccharomycetaceae, wie die Gattungen Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Yarrowia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Hansenula anomala, Hansenula californica, Hansenula canadensis, Hansenula capsulata, Hansenula ciferrii, Hansenula glucozyma, Hansenla henricii, Hansenla holstii, Hansenla minuta, Hansenula nonfermentans, Hansenula philodendri, Hansenla polymorpha, Hansenula satumus, Hansenula subpelliculosa, Hansenla wickerhamii, Hansenula wingei, Pichia alcoholophila, Pichia angusta, Pichia anomala, Pichia bispora, Pichia burtonii, Pichia canadensis, Pichia capsulata, Pichia carsonii, Pichia cellobiasa, Pichia cifernii, Pichia farinosa, Pichia fermientans, Pichia finlandica, Pichia glucozyma, Pichia guilliermondii, Pichia haplophila, Pichia henricii, Pichia holstii, Pichia jadinii, Pichia lindnerii, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia minuta var. minuta, Pichia minuta var. nonfermentans, Pichia norvegensis, Pichia ohmeri, Pichia pastoris, Pichia philodendri, Pichia pini, Pichia polymorpha, Pichia quercuum, Pichia rhodanensis, Pichia sargentensis, Pichia stipitis, Pichia strasburgensis, Pichia subpelliculosa, Pichia toletana, Pichia trehalophila, Pichia vini, Pichia xylosa, Saccharomyces aceti, Saccharomyces bailii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces capensis, Saaharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Sacrharomyces drosophilarum, Saccharomyces elegans, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomycaes fermentati, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces heterogenicus, Saccharomyces hienipiensis, Saccharomyces inusitatus, Saccharomyces italicus, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces krusei, Saccharomyces lactis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces microellipsoides, Saccharomyces montanus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oleaceus, Saccharomyces paradoxus, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomycodes ludwigii, Yarrowia lipolytica, Schizosacharomycetaceae, wie die Gattungen Schizosaccharomyces, z. B. die Spezies Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus, Schizosaccharomyces japonicus var. versatilis, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe var. malidevorans, Schizosaccharomyces pombe var. pombe, Thraustochytriaceae, wie die Gattungen Althornia, Aplanochytrium, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, z. B. die Spezies Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium mangrovei, Schizochytrium minutum, Schizochytrium octosporum, Thraustochytrium aggregatum, Thraustochytrium amoeboideum, Thraustochytrium antacticum, Thraustochytrium arudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium benthicola, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium indicum, Thraustochytrium kerguelense, Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium motivum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium proliferum, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium rossii, Thraustochytrium striatum oder Thraustochytrium visurgense. Weitere bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Familien Bacillaceae, Enterobacteriacae oder Rhizobiaceae. Beispiele für solche Mikroorganismen können ausgewählt werden aus der Gruppe: Bacillaceae, wie die Gattungen Bacillus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amylolyticus, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus sphaericus subsp. fusiformis, Bacillus galactophilus, Bacillus globisporus, Bacillus globisporus subsp. marinus, Bacillus halophilus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis subsp. spizizenii, Bacillus subtilis subsp. subtilis oder Bacillus thuringiensis; Enterobacteriacae, wie die Gattungen Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Salmonella oder Serratia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Citrobacter amalonaticus, Citrobacter diversus, Citrobacter freundii Citrobacter genomospecies, Citrobacter gillenii, Citrobacter intermedium, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter sp., Edwardsiella hoshinae, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Erwinia alni, Erwinia amylovora, Erwinia ananatis, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia cacticida, Erwinia cancerogena, Erwinia camegieana, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Erwinia carotovora subsp. betavasculorum, Erwinia carotovora subsp. odorifera, Erwinia carotovora subsp. wasabiae, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cypripedii, Erwinia dissolvens, Erwinia herbicola, Erwinia mallotivora, Erwinia milletiae, Erwinia nigrifluens, Erwinia nimipressuralis, Erwinia parsicina, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia quercina, Erwinia rhapontici, Erwinia rubrifaciens, Erwinia salicis, Erwinia stewartii, Erwinia tracheiphila, Erwinia uredovora, Escherichia adecarboxylata, Escherichia anindolica, Escherichia aurescens, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia coli var. communior, Escherichia coli-mutabile, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia sp., Escherichia vulneris, Klebsiella aeroGenen, Klebsiella edwardsii subsp. atlantae, Klebsiella ornithinolytica, Klabsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Klabsiella sp., Klebsiella terrigena, Klebsiella travisanii, Salmonella abony, Salmonella arizonae, Salmonella bongori, Salmonella choleraesuis subsp. arizonae, Salmonella choleraesuis subsp. bongori, Salmonella choleraesuis subsp. cholereasuis, Salmonella choleraesuis subsp. diarizonae, Salmonella choleraesuis subsp. houtenae, Salmonella choleraesuis subsp. indica, Salmonella choleraesuis subsp. salamae, Salmonella daressalaam, Salmonella enterica subsp. houtenae, Salmonella enterica subsp. salamae, Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarum, Salmonella heidelberg, Salmonella panama, Salmonella senftenberg, Salmonella typhimurium, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia marcescens subsp. marcescens, Serratia marinorubra, Serratia odorifera, Serratia plymouthensis, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia proteamaculans subsp. quinovora, Serratia quinivorans oder Serratia rubidaea; Rhizobiaceae, wie die Gattungen Agrobacterium, Carbophilus, Chelatobacter, Ensifer, Rhizobium, Sinorhizobium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium ferrugineum, Agrabacterium gelatinovorum, Agrobacterium larrymoorei, Agrobacterium meteori, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizoGenen, Agrobacterium rubi, Agrobacterium stellulatum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobaderium vitis, Carbophilus carboxidus, Chelatobacter heintzii Ensifer adhaerens, Ensifer arboris, Ensifer fredii, Ensifer kostiensis, Ensifer kummerowiae, Ensifer medicae, Ensifer meliloti, Ensifer saheli, Ensifer terangae, Ensifer xinjiangensis, Rhizobium ciceri Rhizobium etli, Rhizobium fredii, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhiobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium huakuii, Rhizobium huautlense, Rhizobium indigoferae, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium loessense, Rhizobium loti, Rhizobium lupini, Rhizobium mediterraneum, Rhizobium meliloti, Rhizobium mongolense, Rhizobium phaseoli, Rhizobium radiobacter, Rhizobium rhizoGenen, Rhizobium rubi, Rhizobium sullae, Rhizobium tianshanense, Rhizobium trifolii, Rhizobium tropici, Rhizobium undicola, Rhizobium vitis, Sinorhiobium adhaerens, Sinorhizobium arboris, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium kostiense, Sinorhizobium kummerowiae, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium morelense, Sinorhizobium saheli oder Sinorhizobium xinjiangense.

Wie die oben genannten Mikroorganismen zu kultivieren sind, ist dem Fachmann gut bekannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen nicht-humanen transgenen Organismus, vorzugsweise eine Pflanze oder einen Samen davon, umfassend das Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung.

Der Begriff ”nicht-humaner transgener Organismus” betrifft vorzugsweise eine Pflanze, einen Pflanzensamen, einen nicht-humanen tierischen oder einen multizellulären Mikroorganismus. Das Polynukleotid oder der Vektor können im Zytoplasma des Organismus vorhanden sein oder können in das Genom entweder heterolog oder durch homologe Rekombination eingegliedert werden. Wirtszellen, insbesondere jene, die von Pflanzen oder Tieren erhalten werden, können in einen sich entwickelnden Embryo eingeführt werden, um Mosaik- oder chimäre Organismen zu erhalten, d. h., nicht-humane transgene Organismen, die die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung umfassen. Geeignete transgene Organismen sind vorzugsweise alle Organismen, die für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind.

Bevorzugte Pflanzen, die zur Herstellung nicht-humaner transgener Organismen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind alle Dicotyledon- oder Monocotyledon-Pflanzen, Algen oder Moose. Vorteilhafte Pflanzen sind ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzenfamilien Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Prasinophyceae oder Gemüsepflanzen oder Zierpflanzen wie Tagetes. Beispiele, die erwähnt werden können, sind die folgenden Pflanzen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Adelotheciaceae, wie die Gattungen Physcomitrella, wie die Gattungen und Spezies Physcomitrella patens, Anacardiaceae, wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium, zum Beispiel die Gattung und Spezies Pistacia vera [Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Kaschu], Asteraceae, wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, zum Beispiel die Gattung und Spezies Calendula officinalis [gemeine Ringelblume], Carthamus tinctorius [Saflor], Centaurea cyanus [Komblume], Cichorium intybus [Chicoree], Cynara scolymus [Artischocke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Feldsalat], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [afrikanische oder französische Ringelblume], Apiaceae, wie die Gattung Daucus, zum Beispiel die Gattung und Spezies Daucus carota [Karotte], Betulaceae, wie die Gattung Corylus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Corylus avellana oder Corylus columa [Haselnuss], Boraginaceae, wie die Gattung Borago, zum Beispiel die Gattung und Spezies Borago officinalis [Borretsch], Brassicaceae, wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Raps], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterkohl] oder Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae, wie die Gattungen Anana, Bromelia (Ananas), zum Beispiel die Gattungen und Spezies Anana comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas], Caricaceae, wie die Gattung Carica, wie die Gattung und Spezies Carica papaya [Papaya], Cannabaceae, wie die Gattung Cannabis, die Gattung und Spezies Cannabis sativa [Hanf], Convolvulaceae, wie die Gattungen Ipomea, Convolvulus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süßkartoffel, Batate], Chenopodiaceae, wie die Gattung Beta, wie die Gattungen und Spezies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. Vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var. conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe], Crypthecodiniaceae, wie die Gattung Crypthecodinium, zum Beispiel die Gattung und Spezies Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae, wie die Gattung Cucurbita, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Kürbis/Speisekürbis], Cymbellaceae, wie die Gattungen Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria, zum Beispiel die Gattung und Spezies Phaeodactylum tricomutum, Ditrichaceae, wie die Gattungen Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon, purpureus spp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus oder Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae, wie die Gattung Elaeagnus, wie die Gattung und Spezies Olea europaea [Olive], Ericaceae, wie die Gattung Kalmia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Berglorbeer], Euphorbiaceae, wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Maniok] oder Ricinus communis [Rizinus], Fabaceae, wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Fewilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [Seidenbaum], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Luzerne], Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne], Funariaceae, wie die Gattungen Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entasthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jamesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitnium washingtoniense, Geraniaceae, wie die Gattungen Pelargonium, Kokos, Oleum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cocos nucifera, Pelargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokosnuss], Gramineae, wie die Gattung Saccharum, zum Beispiel die Gattung und Spezies Saccharum officinarum, Juglandaceae, wie die Gattungen Juglans, Wallia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Walsnuss], Lauraceae, wie die Gattungen Persea, Laurus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Laurus nobilis [Lorbeer], Persea americana, Persea gratissima oder Persea persea [Avocado], Leguminosae, wie die Gattung Arachis, zum Beispiel die Gattung und Spezies Arachis hypogaea [Erdnuss], Linaceae, wie die Gattungen Linum, Adenolinum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Leinsamen], Lythrarieae, wie die Gattung Punica, zum Beispiel die Gattung und Spezies Punica granatum [Granatapfel], Malvaceae, wie die Gattung Gossypium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle], Marchantiaceae, wie die Gattung Marchantia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae, wie die Gattung Musa, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane], Onagraceae, wie die Gattungen Camissonia, Oenothera, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Nachtkerze], Palmae, wie die Gattung Elacis, zum Beispiel die Gattung und Spezies Elaeis guineensis [Ölpalme], Papaveraceae, wie die Gattung Papaver, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn], Pedaliaceae, wie die Gattung Sesamum, zum Beispiel die Gattung und Spezies Sesamum indicum [Sesam], Piperaceae, wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [Cayennepfeffer], Poaceae, wie die Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (Mais), Triticum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais], Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen], Porphyridiaceae, wie die Gattungen Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Porphyridium cruentum, Proteaceae, wie die Gattung Macadamia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Macadamia intergrifolia [Macadamia], Prasinophyceae, wie die Gattungen Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae, wie die Gattung Cofea, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cofea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee], Scrophulariaceae, wie die Gattung Verbascum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Königskerze], Solanaceae, wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [Pfeffer], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine], Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate], Sterculiaceae, wie die Gattung Theobroma, zum Beispiel die Gattung und Spezies Theobroma cacao [Kakao] oder Theaceae, wie die Gattung Camellia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Camellia sinensis [Tee]. Insbesondere sind bevorzugte Pflanzen, die als transgene Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, Ölfrüchte, die große Mengen an Lipidverbindungen umfassen, wie Erdnuss, Ölraps, Raps, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Rizinus, Olive, Sesam, Ringelblume, Granatapfel, Nachtkerze, Königskerze, Distel, wilde Rosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis/Speisekürbis, Leinsamen, Sojabohne, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss) oder Nutzpflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniokstrauch, Pfeffer, Tagetes, Solanaceae-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Luzerne oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies und winterharte Gräser und Futterpflanzen. Bevorzugte Pflanzen gemäß der Erfindung sind Ölpflanzen, wie Erdnuss, Ölraps, Raps, Sonnenblume, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Rizinus, Olive, Ringelblume, Granatapfel, Nachtkerze, Kürbis/Speisekürbis, Leinsamen, Sojabohne, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss). Besonders bevorzugt sind Pflanzen, die reich an C18:2- und/oder C18:3-Fettsäuren sind, wie Sonnenblume, Saflor, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis/Speisekürbis, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Leinsamen, Hanf, Distel oder Saflor. Ganz besonders bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen wie Saflor, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Leinsamen oder Hanf.

Bevorzugte Moose sind Physcomitrella oder Ceratodon. Bevorzugte Algen sind Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium und Algen/Diatomeen wie Phaeodactylum oder Thraustochytrium. Bevorzugter sind die Algen und Moose ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Phaeodactylum, Cryphthecodinium, insbesondere von den Gattungen und Spezies Thallasiosira pseudonona, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Phaeodactylum tricomutum oder Caenorhabditis elegans oder besonders bevorzugt Phytophtora infestans, Thallasiosira pseudonona und Cryptocodinium cohnii.

Transgene Pflanzen können durch Transformationstechniken erhalten werden, wie in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrg: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Ed.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225, veröffentlicht und zitiert. Vorzugsweise können transgene Pflanzen durch T-DNA-vermittelte Transformation erhalten werden. Solche Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die vir-Gene enthalten, die für die Agrobacterium-vermittelte Transformation erforderlich sind, und die Sequenzen, die die T-DNA abgrenzen (T-DNA Grenze). Geeignete Vektoren sind anderwärtig in der Beschreibung ausführlich beschrieben.

Vorzugsweise bezieht sich ein multizellulärer Mikroorganismus, wie hierin verwendet, auf Protisten oder Diatomeen. Insbesondere ist es ausgewählt aus der Gruppe der Familien Dinophyceae, Turaniellidae oder Oxytrichidae, wie die Gattungen und Spezies: Crypthecodinium cohnii, Phaeodactylum tricomutum, Stylonychia mytilus, Stylonychia pustulata, Stylonychia putrina, Stylonychia notophora, Stylonychia sp., Colpidium campylum oder Colpidium sp.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Expression einer Nukleinsäure von Interesse in einer Wirtszelle, umfassend

  • (a) Einführen des Polynukleatids oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in die Wirtszelle, wodurch die Nukleinsäuresequenz von Interesse funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden wird; und
  • (b) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in der Wirtszelle.

Das Polynukleotid oder der Vektor der vorliegenden Erfindung können in die Wirtszelle durch geeignete Transfektions- oder Transformationstechniken eingeführt werden, wie anderwärtig in dieser Beschreibung spezifiziert ist. Die Nukleinsäure von Interesse wird unter geeigneten Bedingungen in der Wirtszelle exprimiert. Zu diesem Zweck wird die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die im Prinzip eine Transkription von Nukleinsäuren ermöglichen. Ferner umfasst die Wirtszelle vorzugsweise die exogen zugeführte oder endogen vorhandene Transkriptionsmaschinerie, die für eine Expression einer Nukleinsäure von Interesse durch die Expressionskontrollsequenz erforderlich ist. Insbesondere ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle und ganz besonders eine Samenzelle oder ein Vorläufer davon.

Ferner umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Expression einer Nukleinsäure von Interesse in einem nicht-humanen Organismus, umfassend

  • (a) Einführen des Polynukleotids oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in den nicht-humanen Organismus, wobei die Nukleinsäuresequenz von Interesse funktionsfähig an die Expressionskontrollsequenz gebunden wird; und
  • (b) Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in dem nicht-humanen transgenen Organismus.

Das Polynukleotid oder der Vektor der vorliegenden Erfindung können in den nicht-humanen transgenen Organismus durch geeignete Techniken eingeführt werden, wie anderwärtig in dieser Beschreibung spezifiziert. Der nicht-humane, transgene Organismus umfasst vorzugsweise die exogen zugeführte oder endogen vorhandene Transkriptionsmaschinerie, die zur Expression einer Nukleinsäure von Interesse durch die Expressionskontrollsequenz erforderlich ist. Bevorzugter ist der nicht-humane transgene Organismus eine Pflanze oder ein Samen davon. Es ist klar, dass die Nukleinsäure von Interesse vorzugsweise samenspezfisch in dem nicht-humanen, transgenen Organismus exprimiert wird.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Stearidonsäure (SDA) in einem Pflanzensamen, umfassend die folgenden Schritte:

  • a) Züchten einer transgenen Pflanze, die ein Polynukleotid exprimiert, das für eine Delta-6-Desaturase unter der Kontrolle des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung kodiert; und
  • b) Erhalten der SDA aus den geernteten Samen der Pflanze.

Die SDA kann in der Form eines Triglyceridesters, eines Phospholipids oder als Acyl-CoAgebundene oder freie Fettsäure eingeführt werden, die in Samenöl- oder Samenfettsäurezubereitungen enthalten sind, die von den geernteten Samen der gezüchteten transgenen Pflanzen durch Standardtechniken, wie eine Ölmühle oder chromatographische Extraktions- und/oder Reinigungstechniken erhalten werden können.

Ferner ist allgemein im Stand der Technik bekannt, wie transgene Pflanzen zu züchten und wie ihre Samen zu ernten sind. Wie transgene Pflanzen, die ein Gen von Interesse, wie eine Delta-6-Desaturase, unter der Kontrolle des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung exprimieren, herzustellen sind, ist hier anderwärtig dargelegt.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung das Verhältnis der Omega-3-Fettsäure Stearidonsäure (SDA) zu der Omega-6-Fettsäure Linolensäure (GLA) beeinflussen. Daher sind die Samen der oben genannten transgenen Pflanzen, die eine Delta-6-Desaturase unter der Kontrolle des Promotors exprimieren, der in dem Polynukleotid der Erfindung enthalten ist, als Quelle für SDA oder SDA angereicherte Fettsäurezubereitungen, wie Öl, geeignet.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung, das die Expression einer Delta-6-Desaturase in einer transgenen Pflanze steuert, zur Erhöhung (vorzugsweise in einem statistisch signifikanten Ausmaß) der Menge an SDA auf Kosten von GLA in Pflanzensamen der Pflanzen.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Samenöl mit dem veränderten Verhältnis von SDA zu GLA (d. h., einer erhöhten SDA-Menge auf Kosten von GLA), das durch eine Ölmühle von den geernteten Samen einer transgenen Pflanze wie oben dargelegt erhältlich ist. Es ist klar, dass ein solches Öl zusätzlich zu dem geänderten Verhältnis von SDA zu GLA durch das Vorhandensein verbleibender DNA Kontaminationen gekennzeichnet ist, einschließlich des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung und/oder des für Delta-6-Desaturase kodierenden Polynukleotids.

Nukleinsäuren, die für geeignete Delta-6-Desaturasen kodieren, sind im Stand der Technik gut bekannt und sind d6-Desaturasen d6Des(Cp) von Ceratodon purpureus (WO2000075341), d6Des(Ol) von Ostreococcus lucimarinus (WO2008040787), d6Des(Ot) von Ostreococcus tauri (WO2006069710), d6Des(Pf) von Primula farinosa (WO2003072784), d6Des(Pir)_BO von Pythium irregulare (WO2002026946), d6Des(Pir) von Pythium irregulare (WO2002026946), d6Des(Plu) von Primula luteola (WO2003072784), d6Des(Pp) von Physcomitrella patens (WO200102591), d6Des(Pt) von Phaeodactylum tricornutum (WO2002057465), d6Des(Pv) von Primula vialii (WO2003072784) und d6Des(Tp) von Thalassiosira pseudonana (WO2006069710) und insbesondere jene, die in den beiliegenden Beispielen erwähnt sind.

Ferner kann eine transgene Pflanze, die ein Polynukleotid exprimiert, das für eine Delta-6-Desaturase unter der Kontrolle des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung kodiert, auch weitere Desaturasen oder Elongasen des Omega-3-Pfades umfassen, die für die Synthese von Endprodukten, wie Eicosapentaensäure (EPA) oder Docosahexaensäure (DHA) erforderlich sind.

Somit wird ein Verfahren zur Erhöhung einer Stearidonsäure in einem Pflanzensamen bereitgestellt, umfassend die Schritte des Züchtens einer transgenen Pflanze, die ein Polynukleotid exprimiert, das für eine Delta-6-Desaturase unter der Kontrolle des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung kodiert.

Durch Erhöhung der Omega-3-Pfad-Substrat SDA auf Kosten der Omega-6-Pfad-Substrat GLA können wertere Fettsäureprodukte des Omega-3-Pfades effizienter in den oben genannten transgenen Pflanzen erzeugt werden. Vorzugsweise können die Desaturasen und/oder Elongasen, die für die Produktion einer gewünschten Fettsäure erforderlich sind, auch unter der Kontrolle eines Polynukleotids der vorliegenden Erfindung exprimiert werden. Insbesondere jedoch wird in Betracht gezogen, dass die Delta-6-Desaturase und die werteren Desaturasen und/oder Elongasen unter der Kontrolle von Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, die verschiedene Expressionskontrollsequenzen in Bezug zueinander umfassen.

In den folgenden Tabellen 1 bis 9 sind die cis-regulatorischen Elemente, die in den Expressionskontrollsequenzen der vorliegenden Erfindung vorgefunden werden, dargestellt.

In der folgenden Tabelle 9 sind cis-regulatorische Elementfamilien dargestellt, die allgemein in mindestens 13 der aufgelisteten Expressionskontrollsequenzen der vorliegenden Erfindung vorgefunden werden. Tabelle 8 beschreibt die cis-regulatorischen Elementfamilien. Tabelle 8: Beschreibung von cis-regulatorischen Elementfamilien, die allgemein in Expressionskontrollsequenzen der vorliegenden Erfindung vorgefunden werden

TF-FamilieBeschreibungO$VTBPWirbeltier-TATA-BindungsproteinvektorP$AHBPArabidopsis-HomöoBox-ProteinP$DOFFDNA Bindung mit einem Finger (DOF)P$GTBXGT-Box-ElementeP$IBOXPflanzen I-Box-StellenP$L1BXL1-Box, Motiv für L1-Schicht-spezifische ExpressionP$LREMAuf Licht ansprechendes Elementmotiv, nicht durch verschiedene Lichtqualitäten moduliertP$MYBLMYB-artige ProteineP$MYBSMYB-Proteine mit einem einzigen DNA-BindungsrepeatP$NCS1Nodulin Konsensus-Sequenz 1P$CCAFCircadiane KontrollfaktorenP$GBOXPflanzen G-Box/C-Box bZIP ProteineP$IDDFD-Domäne-Faktoren, wobei die ID-Domäne einen Cluster von drei verschiedenen Arten von Zinkfingern enthält, die von einem vierten C2H2-Finger durch einen langen Spacer getrennt sindP$MADSFlorale DeterminationP$MYCLMyc-artige, basische, Helix-Loop-Helix-BindungsfaktorenP$OPAQOpaque-2 artige transkriptionale AktivatorenP$SPF1Süßkartoffel DNA-Bindungsfaktor mit zwei WRKY-DomänenP$SUCBSucrose-BoxP$WBXFW Box-FamilieO$INREKernpromotor-InitiatorelementeO$PTBPPflanzen-TATA-BindungsproteinvektorP$ABREABA ReaktionselementeP$LEGBLegumin-Box FamilieP$NACFPflanzenspezifische NAC-[NAM (”no apical meristem”), ATAF 172, CUC2 (”cup-shaped cotyledons 2”)] TranskriptionsfaktorenP$OCSEEnhancer-Element, welches das erste Mal in dem Promotor des Octopin-Synthase-Gens (OCS) der Agrobacterium tumefaciens T-DNA identifiziert wurde

Alle in dieser Beschreibung zitierten Referenzen werden hiermit zum Zwecke der Bezugnahme in Bezug auf ihren gesamten Offenbarungsinhalt und den Offenbarungsinhalt, der insbesondere in dieser Beschreibung erwähnt ist, zitiert.

1 zeigt eine Entwicklungs-Expressionsanalyse. Gewebearten und Entwicklungsstufen sind wie in Tabelle 8 angeführt angegeben. Proben 10, 11, 12 (bezeichnet als 10) wie auch Proben 13, 14 15 (bezeichnet als 13) wurden gepoolt.

2 zeigt den 18: 3n-6 (GLA) Gehalt von Samenöl von Samen, die von transgenen Pflanzen geerntet wurden, die die T-DNA von Vektoren beherbergen, die in Beispiel 3 beschrieben sind. Dargestellt sind Daten von T1-Samen und T2-Samen, wie oben in der Figur angegeben. Messungen auf T1-Samen sind auf individuellen einzelnen Samen, Messungen auf T2 Samen sind auf Samenchargen. Die schwarze Linie zeigt die minimale und die maximale Beobachtung, der Kasten reicht von der 25% Quartile zu der 75 Quartile; der Medianwert ist als schwarze Linie innerhalb des Kastens angegeben. Die Anzahl einzelner Messungen ist als Zahl über jedem Kasten angegeben.

3 zeigt den 18: 3n-6 (GLA) und 18: 4n-3 (SDA) Gehalt von Samenöl von Samen, die von transgenen Arabidopsis-Pflanzen geerntet wurden, die die T-DNA von Vektoren beherbergen, die in Beispiel 3 beschrieben sind.

4 zeigt für die verschiedenen Promotoren die verschiedenen Verhältnisse der Omega-3 Fettsäure-SDA zu der Omega-3 Fettsäure-GLA.

Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die den Umfang dieser Anmeldung in keiner Weise einschränken sollen.

Beispiel 1: Allgemeine Klonierungsmethoden

Allgemeine Klonierungsmethoden, die den enzymatischen Verdau durch Restriktionsenzyme, Agarose Gel-Elektrophorese, Reinigung von DNA Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose auf Nylonmembranen, Maligation von DNA Fragmenten, Transformation von E. coli Bakterien, wie auch Kultur von Bakterien und Sequenzanalyse von rekombinanter DNA enthalten, wurden wie in Sambrook et al. (1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6) beschrieben ausgeführt.

Beispiel 2: Klonieren von Promotorelementen von Brassica napus

Für die Analyse samenspezifischer exprimierter Gene in Brassica napus, wurden verschiedene Gewebe in verschiedenen Entwicklungsstufen (Tabelle 8) untersucht.

Tabelle 10: Gewebearten, die zur Transkriptanalyse verwendet wurden

Spezifische Entwicklungsstufen sind unter Verwendung des Kodes (Meier, 1997) der Biologische Bundesanstalt. Bundessortenamt, and Chemical Industry (BBCH) angegeben.

ProbeNr.GewebeEntwicklungsstufeArt der Probe1unreife EmbryosWalking StickZweck Prio 12unreife Embryosvollständig entwickelt (etwa 20 Tage)Zweck Prio 13unreife Embryosvollständig entwickelt, vor Austrocknung, grünZweck Prio 14unreife Embryosvollständig entwickelt, Beginn der Austrocknung, gelbKontrolle/Zweck Prio 25Embryosack vollständigHerzKontrolle/Zweck Prio 26unreife Samenschale und EndospermGewichtsmischung Probe 1–3Kontrolle/Zweck Prio 27BlütenknospenBBCH 57Kontrolle/Zweck Prio 28Staubbeutel und NarbeBBCH 68Kontrolle/Zweck Prio 29Blüten (schließen Staubbeutel und Narbe aus)BBCH 67Kontrolle10BlätterBBCH 32Kontrolle11BlätterBBCH 75Kontrolle12BlätterBBCH 80, seneszierend (gelb)Kontrolle13StängelBBCH 32Kontrolle14StängelBBCH 75Kontrolle15StängelBBCH 80, seneszierend (gelb)Kontrolle16Sämling: Hypocotyl und KeimblattBBCH 12Kontrolle17Sämling: Wurzeln (Sand)BBCH 12Kontrolle18leere SchotenGewichtsmischung Probe 1–3Kontrolle

Zu diesem Zweck wurden Brassica napus cv. Kumily Pflanzen unter Standardbedingungen gezüchtet (Moloney et al. 1992, Plant Cell Reports 8: 238–242). Die Gewebe wurden zu den angegebenen Entwicklungsstufen geerntet (Tabelle 8) und zur Herstellung von RNA (RNAeasy, Qiagen) nach dem Handbuch der Hersteller verwendet. Zur Identifizierung von samenspezifisch exprimierten RNA-Transkripten in weiteren Experimenten, wurden drei Pools durch Mischen der RNA erzeugt: ein samenspezifischer Pool P-S wurde aus Probe 1, 2, 3 erzeugt (siehe Tabelle 8). Ein Kontrollpool P-C1 wurde aus Probe 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 erzeugt. Ein dritter Pool P-C2, der aus Probe 4, 5, 6 7, 8 bestand, wurde als stringentere Kontrolle verwendet Transkripte, die nicht im Kontrollpool P-C2 exprimiert werden, werden nur in der frühen Samenentwicklung und in keiner anderen Gewebe-/Entwicklungsstufe exprimiert. Unter Verwendung der Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Methode, die einem Fachmann bekannt ist, wurden 384 Primerkombinationen zur Identifizierung von 96 Kandidat-Transkriptfragmenten verwendet, die nur in Pool P-S und/oder auch schwach in Pool P-C2 vorhanden waren, aber in Pool P-C1 fehlten. Eine Auswahl von 42 Primerkombinationen, die die 55 vielversprechendsten Transkriptfragmente identifizierte, wurde zur detaillierten Analyse aller Proben verwendet, die in Tabelle 26 angeführt sind, was zu 26 Fragmenten mit einer bestätigten Expression nur in den sich entwickelnden Embryoproben 1, 2, 3 und 4 führte. Eine Sequenzierung dieser Kandidatfragmente führte zu 20 einzigartigen Sequenzen. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) wurde zur Identifizierung der mutmaßlichen Transkripte voller Länge verwendet, die den identifizierten Transkriptfragmenten entsprachen. Überraschenderweise zeigte außer den Genen, die im Stand der Technik für eine samenspezifische Expression bekannt sind, z. B. Napin- und 3-Ketoacyl-CoA-Synthase, eine Reihe von Fragmenten, die in Tabelle 9 angeführt sind, keine Homologie mit einer bekannten Brassica Sequenz oder mit Genen, von welchen bekannt ist, dass sie samenspezfisch exprimiert werden und/oder mit Genen mit unbekannter Sequenz stromaufwärts der bekannten mRNA Sequenz. Tabelle 11 Kandidatfragmente und homologe Sequenzen, die mit Hilfe von BLAST identifiziert wurden.

KandidatFragmentlängeSEQ-IDBrassica-HomologeArabidopsis-HomologBnSCP157 bp58At5g36100 (unbekanntes Protein)BnGRPL174 bp4At3g10185 (ähnlich dem Gibberelinreaktionsfähigen Protein)BnCRU4127 bp59BnCRU4m (Cruciferin)BnMYR101 bp60BnMYRmc (Myrosinase)BnSETL120 bp26At1 g03270 (unbekanntes Protein)BnSCT2172 bp19BnSCT2 (Sinapoyl-cholin Transferase 2)BnMDP273 bp61At3g20370 (unbekannt, ähnlichBnRTI-4237 bp62BnRTI-4 (Trypsin-Inhibitorfamilie)BnMTFL144 bp63At2g21650 (mutmaßlicher Myb-Faktor Transkr.-Faktor)BnGSTF186 bp64At3g62760 (AtGSTF13)BnSRP131 bp65BnPEF121 b12Pektinesterase-Familie-ProteinAt5g47500 (Pekti-nesterase-Familie-Protein)BnWSP83 bp66BnLSP164 bp67At5g62200 (schwache Ähnlichkeit mit embryospezifischem Protein 3)

Aus Blattmaterial von Brassica napus cv. Kumily wurde genomische DNA unter Verwendung des DNAeasy Kits (Qiagen) nach dem Handbuch des Herstellers isoliert. Die Kulturbedingungen für Brassica napus cv. Kumily waren wie oben besprochen. Unter Verwendung dieser genomischen DNA als Template wurden mehrere Runden einer TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction) – einer Methode, die einem Fachmann bekannt ist – durchgeführt, um Sequenzen 5' stromaufwärts und 3' stromabwärts der 20 identifizierten exprimierten Fragmente zu isolieren. Die amplifizierten Produkte wurden entweder direkt sequenziert oder in den pGEM-T (Promega) vor der Sequenzierung subkloniert. In einigen Fällen war ein Subklonieren notwendig, da Brassica napus amphidiploid ist, das heißt, Brassica napus hat 10 Chromosome mit Brassica rapa (A Genom) gemein und 9 Chromosome mit Brassica oleracea (C Genom) gemein. Ein Subklonieren von PCR-Produkten, die ein Gemisch von zwei Sequenzen enthalten, die von beiden Genomen amplifiziert sind, ermöglicht eine Trennung dieser zwei Sequenzen. Die Sequenzierung erfolgte durch Standardtechniken (Laser-Fluoreszenz-DNA-Sequenzierung, ABI nach dem Verfahren von Sanger et al., 1977 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467) Für exprimierte Kandidatsequenzen, bei welchen kein Brassica-Gen im Stand der Technik bekannt ist, wurde der offene Leserahmen mit Hilfe einer Software-Vorhersage und unter Verwendung von Ausrichtungen mit homologen Genen von Arabidospis identifiziert. Die folgenden offenen Leserahmen von Brassica napus wurden identifiziert (Tabelle 10): Table 12: Offene Leserahmen (ORF), identifiziert in Brassica napus cDNA-Sequenzen.

Brassica napus SequenzORF in bpSEQ ID NO:BnGRPL3605BnPEF108313BnSCT1140120BnSCT2140121BnSETL1151227BnSETL2151228BnSCP77372BnCRU4110780BnMYR164488BnMDP115298BnRTI-4300106BnMTFL303114BnGSTF660121BnLSP574133

Für die exprimierte Sequenz SEQ-ID 126 konnte kein offener Leserahmen identifiziert werden.

Die folgenden Brassica napus Sequenzen stromaufwärts der exprimierten Sequenz SEQ ID 126 der identifizierten, exprimierten offenen Leserahmen (ORF) wurden erhalten (Tabelle 13): Tabelle 13: Genomische 5' stromaufwärts liegende Sequenzen von den Brassica napus cDNA-Sequenzen

Brassica napus Sequenzgenomische 5' Sequenz in bpSEQ ID NO:p-BnGRPL17901p-BnPEF-var120276p-BnPEF-var26369p-BnSCT2-var1101914p-BnSCT2-var299616p-BnSETL-var1149022p-BnSETL-var2201025p-BnSCP205270p-BnCRU4195177p-BnMYR136085p-BnMDP142895p-BnRTI-41820103p-BnMTFL1335111p-BnGSTF1565119p-BnSRP2447124p-BnLSP1593121

Die Analyse der 5' stromaufwärts liegenden Sequenzen unter Verwendung der Genomatix Software Gems-Launcher zeigte, dass die Sequenzen Promotorelemente umfassten. Dies wurde durch das Vorhandensein einer TATA-Box bestätigt, die für die Transkription durch RNA-Polymerasen erforderlich ist, Ebenso wurden in den isolierten Fragmenten Elemente gefunden, die für Samen-Transkriptionsfaktoren (z. B. Prolamin-Box, Legumin-Box, RITA usw.) spezifisch sind.

Die folgenden Brassica napus Sequenzen stromabwärts der identifizierten, exprimierten offenen Leserahmen (ORF) wurden erhalten (Tabelle 14): Tabelle 13: Genomische 3' stromabwärts liegende Sequenzen von den Brassica napus cDNA-Sequenzen

Brassica napus Sequenzgenomische 3' Sequenz in bpSEQ ID NO:t-BnGRPL5812t-BnPEF-var14777t-BnPEF-var253810t-BnSCT2-var157315t-BnSCT2-var257617t-BnSETL-var161423t-BnSCP58771t-BnCRU451478t-BnMYR65286t-BnMDP48396t-BnRTI-4572104t-BnMTFL521112t-BnSRP865125

Beispiel 3: Produktion von Testkonstrukten für den Nachweis einer Promotoraktivität

Zum Testen der Promotorelemente wurden in einem ersten Schritt Promotor-Terminatorkassetten erzeugt. Zu diesem Zweck wurden Fusions-PCRs verwendet, in welchen über zwei PCR-Stufen Promotorelemente mit Terminatorelementen verbunden wurde. Gleichzeitig wurde eine mehrfache Klonierungsstelle zwischen den Promotor- und Terminatorelementen eingeführt. Die Primer, die unter Verwendung entsprechender nativer Brassica-Terminatoren zum Erzeugen von Kassetten verwendet wurden, sind in Tabelle 15 angeführt Tabelle 16 listet die unter Verwendung des OCS Terminators erzeugten Kassetten auf. Tabelle 15: Primerpaare, die für die Erzeugung von Promotor-mehrfache Klonierungsstelleterminierten Kassetten durch Fusion-PCR unter Verwendung nativer Brassica-Terminatorsequenzen verwendet wurdenTabelle 16: Primerpaare, die für die Erzeugung von Promotor-mehrfache Klonierungssteile-terminierten Kassetten durch Fusion-PCR unter Verwendung der OCS-Terminatorsequenz verwendet wurden

Die Promotor-Terminatorkassetten wurden in den pCR2.1 (Invitrogen) Vektor nach dem Handbuch des Herstellers geklont und anschließend sequenziert. In einem werteren Schritt wurde das Delta-6-Desaturase Gen (SEQ ID NO: 68) über die NcoI, PacI Restriktionsstellen zwischen der Promotor- und Terminatorsequenz eingeführt.

Unter Verwendung des Multisite Gateway Systems (Invitrogen) wurde eine mehrfache Klonierungsstelle (SEQ ID 57) in jeden der drei pENTR Vektoren pENTR/A pENTR/B und pENTR/C über HindIII) und KpnI Restriktionsstellen eingeführt. In die erste Position dieses MCS wurde die Promotor-Delta-6-Desaturase-Terminatorkassette über FseI und KasI geklont. Ebenso wurde das DsRed-Gen in pENTR/C zwischen dem Napin-Promotor und dem OCS-Terminator eingeführt. Durch Ausführung einer ortsspezifischen Rekombination (LR-Reaktion) wurden der erzeugte pENTR/B, pENTR/C und ein leerer pENTR/A Vektor mit dem pSUN-Destinationsvektor nach dem Multisite Gateway Handbuch der Hersteller (Invitrogen) kombiniert, um die endgültigen binären Vektoren SEQ ID: 3 pSUN-p-GRPL_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 8 pSUN-p-PEF-var1_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 11 pSUN-p-PEF-var2_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 18 pSUN-p-SCT2-var2_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 24 pSUN-p-SETL-var1_t-OCS, SEQ ID: 79 pSUN-pBnCRU4_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 87 pSUN-pBnMYR_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 93 pSUN-pBnSETL-var2_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 94 pSUN-pBnSCT2-var1_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 97 pSUN-pBnMDP_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 105 pSUN-pBnRTI-4_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 113 pSUN-pBnMTFL_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 120 pSUN-pBnGSTF_d6Des(Pir)_t-OCS, SEQ ID: 132 pSUN-pBnLSP_d6Des(Pir)_t-OCS zu erzuegen. Ebenso wurden die zwei binären Vektoren SEQ ID: 137 pSUN-pNapin_d6Des(Pir)_t-OCS und SEQ ID: 141 pSUN-pLuPXR_d6Des(Pir)_t-OCS als positive Kontrolle geklont, das heißt, von diesen zwei Vektoren ist bekannt, dass sie imstande sind, eine samenspezifischen Expression von PUFA Genen zu steuern, z. B. der Delta-6-Desaturase SEQ ID NO: 68.

Die erhaltenen Vektoren wurden anschließend für die Produktion transgener Pflanzen verwendet. Die Promotoraktivität in den transgenen Pflanzensamen wurde auf der Basis der Expression von Delta-6-Desaturase und einer beobachteten Modifizierung in dem Lipidmuster der Samen gemessen, wie in Beispiel 5 beschrieben.

Beispiel 4: Produktion von transgenen Pflanzena) Erzeugung von transgenen Rapspflanzen (geändertes Protokoll nach Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8: 238–242)

Für die Erzeugung transgener Rapspflanzen wurden die binären Vektoren in Agrobacterium turnefaciens C58C1:pGV2260 transformiert (Deblaere et al., 1984, Nucl. Acids Res. 13: 4777–4788). Für die Transformation von Rapspflanzen (cv. Kumily) wurde eine 1:50 Verdünnung einer Übernacht-Kultur positiver transformierter Acrobacteria-Kolonien, gezüchtet in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant, 15, 473), ergänzt durch 3% Saccharose (3MS-Medium), verwendet. Blattstiele oder Hypocotyledone sterialer Rapspflanzen wurden in einer Petri-Schale mit einer 1:50 acrobacteriellen Verdünnung 5–10 Minuten inkubiert. Darauf folgte eine dreitägige Co-Inkubation im Dunkeln bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8% Bacto-Agar. Nach drei Tagen wurde die Kultur wöchentlich 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit auf MS-Medium ausgesetzt, das 500 mg/l Claforan (Cefotaxim-Natrium), 100 nM Imazetapyr, 20 mikroM Benzylaminopurin (BAP) und 1,6 g/l Glucose enthielt. Wachsende Sprossen wurden auf MS-Medium übertragen, das 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar enthielt. Selbst nach drei Wochen wurde keine Wurzelbildung beobachtet, ein Wachstumshormon, 2-Indolbutylsäure, wurde dem Medium zur Verstärkung der Wurzelbildung zugegeben.

Regenerierte Sprossen wurden auf 2MS-Medium mit Imazetapyr und Claforan erhalten und zum Sprießen ins Glashaus gebracht. Nach der Blüte wurden die reifen Samen geerntet und auf Expression des Desaturase Gens durch Lipidanalyse analysiert, wie in Qui et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561–31566, beschrieben ist.

b) Produktion transgener Flachspflanzen

Die Produktion transgener Flachspflanzen kann gemäß dem Verfahren von Bell et al., 1999, In Vitro Cell, Dev. Biol. Plant 35(6): 456–465 unter Verwendung von Partikelbombardement ausgeführt werden. Acrobacterielle Transformation könnte nach Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282–285, ausgeführt werden.

Beispiel 5: Lipidextraktion

Lipide können wie in der Standardliteratur beschrieben extrahiert werden, einschließlich Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S, 89–90 und S. 443–613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) ”Applications of HPLC in Biochemistry” in: Laboratory Techniques in Biochemistry und Molecular Biology, Bd, 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd, 3, Kapitel III: ”Product recovery and purification”, S, 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P. A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley und Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley und Sons; Shaeiwitz, J. A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in Biotechnologie, Noyes Publications.

Als Alternative wird eine Extraktion ausgeführt wie in Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935–12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152: 141–145 beschrieben. Quantitative und qualitative Analysen von Lipiden oder Fettsäuren sind beschrieben in Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Schottland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids, A Practical Guide-Ayr, Schottland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); ”Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952)–16 (1977) u. d. T.: Progress in the Chemistry of Fats und Other Lipids CODEN.

Basierend auf den analysierten Lipiden kann die Expression der Desaturase bestimmt werden, da das Lipidmuster erfolgreich transformierter Pflanzensamen sich von dem Muster von Kontrollpflanzensamen unterscheidet. Die samenspezifische Expression einer Delta-6-Desaturase würde zur Bildung von 18: 3n-6 (GLA) und/oder 18: 4n-3 (SDA) führen, abhängig davon, ob die Delta-6-Desaturase 18: 2n-6 (LA) und/oder 18: 3n-3 (ALA) als Substrat verwendet. Überraschenderweise waren nicht nur die zwei Kontrollpromotoren Napin und LuPXR, die in den Vektoren SEQ ID: 137 pSUN-pNapin_d6Des(Pir)_t-OCS und SEQ ID: 141 pSUN-pLuPXR_d6Des(Pir)_t-OCS aufgenommen waren, imstande, eine samenspezfische Expression der Delta-6-Desaturase zu steuern, wie durch die Bildung von GLA angezeigt ist, sondern auch die Promotoren der vorliegenden Erfindung (2). Interessanterweise beeinflussten die Promotoren das Verhältnis der Omega-3 Fettsäure SDA zu der Omega-6 Fettsäure GLA.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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