Title:
Verfahren zur Gewinnung einer angereicherten Population von siRNA-exprimierenden Zellen
Kind Code:
B4


Abstract:

Verfahren zur Gewinnung von Zellen, die in der Lage sind, inhibierende RNA zu exprimieren, wobei das Verfahren umfasst:
Einführen von wenigstens einer Nukleinsäure in eine Zelle, worin die wenigstens eine Nukleinsäure in der Lage ist, ein RNAi-Molekül und einen Separationsmarker zu exprimieren, wobei der Separationsmarker und ein Zielgen des RNAi-Moleküls voneinander verschieden sind;
Exprimieren des Separationsmarkers;
Sortieren der Zelle, basierend auf der Expression des Separationsmarkers; und
Exprimieren des RNAi-Moleküls in einer Menge, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens zu inhibieren.




Inventors:
Planelles, Vicente (Salt Lake City, Utah, US)
Zimmerman, Erik S. (Salt Lake City, Utah, US)
Dehart, Jason L. (Salt Lake City, Utah, US)
Application Number:
DE112004002408
Publication Date:
04/30/2008
Filing Date:
12/10/2004
Assignee:
University of Utah Research Foundation (Salt Lake City, Utah, US)



Other References:
Human Gene Therapy 13, 2002, S. 2197-2201;
Oligonucleotides 13, 2003, S. 303-312;
Aids Research and Human Retroviruses Vol. 19, No.
8, 2003, S. 699-706;
Attorney, Agent or Firm:
Cremer & Cremer (Ulm, 89077)
Claims:
1. Verfahren zur Gewinnung von Zellen, die in der Lage sind, inhibierende RNA zu exprimieren, wobei das Verfahren umfasst:
Einführen von wenigstens einer Nukleinsäure in eine Zelle, worin die wenigstens eine Nukleinsäure in der Lage ist, ein RNAi-Molekül und einen Separationsmarker zu exprimieren, wobei der Separationsmarker und ein Zielgen des RNAi-Moleküls voneinander verschieden sind;
Exprimieren des Separationsmarkers;
Sortieren der Zelle, basierend auf der Expression des Separationsmarkers; und
Exprimieren des RNAi-Moleküls in einer Menge, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens zu inhibieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das RNAi-Molekül ein Zielgen ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem zellulären Gen, einem endogenen Gen, einem Transgen und einem viralen Gen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zelle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zelle aus Säugerursprung stammt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin Sortieren der Zelle fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin Sortieren der Zelle Magnetperlenseparation umfasst.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin Einführen der wenigstens einen Nukleinsäure in die Zelle das Einführen der wenigstens einen Nukleinsäure in weniger als 50 % der Zellen umfasst.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, worin Einführen von wenigstens einer Nukleinsäure in eine Zelle das Einführen einer Bibliothek aus RNAi-Molekülen umfasst.

9. Verfahren zur Anreicherung einer Population aus Säugerzellen mit einer inhibierenden RNA-Sequenz, wobei das Verfahren umfasst:
Bereitstellen von Säugerzellen, die ein Zielgen enthalten, worin die Zielzellen für RNA-Interferenz empfänglich sind und das Zielgen in den Zielzellen exprimiert wird;
Einführen eines RNA-Moleküls in die Säugerzellen, worin das RNA-Molekül RNA-Interferenz erzeugen kann und einen doppelsträngigen Bereich enthält mit einer ersten Region, die eine Sequenz hat, welche einer Nukleotidsequenz des Zielgens entspricht, und einer zweiten Region, die eine Sequenz hat, welche zu der ersten Region komplementär ist, worin die ersten und die zweiten Regionen aneinander hybridisieren, um ein doppelsträngiges RNA-Molekül zu bilden;
Einführen eines Separationsmarkers in die Säugerzellen, wobei der Separationsmarker und das Zielgen voneinander verschieden sind;
Exprimieren des Separationsmarkers in den Säugerzellen, worin die Expression des Separationsmarkers für die Anwesenheit des doppelsträngigen RNA-Moleküls anzeigend ist; und
Sortieren der Säugerzellen, die den Separationsmarker exprimieren, wodurch für die Säugerzellen mit der doppelsträngigen RNA-Sequenz angereichert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Säugerzellen menschlichen Ursprungs sind.

11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin die Säugerzellen primäre Zellen sind.

12. Verfahren nach Anspruch 9, worin die doppelsträngige Ribonukleinsäurestruktur wenigstens 18 Basen lang ist und worin jede der Ribonukleinsäurestränge in der Lage ist, spezifisch an einen Desoxyribonukleinsäurestrang des Zielgens über die wenigstens 18 Basen zu hybridisieren.

13. Verfahren nach Anspruch 11, weiter umfassend das Inhibieren der Expression des Zielgens um wenigstens 10 %.

14. Verfahren nach Anspruch 9, weiter umfassend das Transfizieren der Säugerzellen mit einer ersten Nukleotidsequenz, die den Separationsmarker kodiert, und einer zweiten Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, das RNA-Molekül zu produzieren.

15. Verfahren nach Anspruch 13, worin Transfizieren der Säugerzellen weniger als 40 % der Säugerzellen produziert, die den Separationsmarker exprimieren.

16. Rekombinante Nukleinsäuresequenz, umfassend wenigstens eine Nukleinsäuresequenz, worin die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, einen Separationsmarker zu exprimieren, und worin die wenigstens eine Nukleinsäuresequenz einen Promotor umfasst, der an eine Sequenz operabel gekoppelt ist, die in der Lage ist, eine Inhibitor-RNA zu produzieren, worin die Inhibitor-RNA eine Sequenz umfasst, die zu einem Zielgen komplementär ist, wobei der Separationsmarker und das Zielgen voneinander verschieden sind.

17. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 16, worin die Inhibitor-RNA eine erste Region, die zu dem Zielgen komplementär ist, und eine zweite Region, die zu der ersten Region komplementär ist, umfasst, worin die Inhibitor-RNA in der Lage ist, eine kurze Haarnadel-RNA zu bilden.

18. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 16, worin sich der Separationsmarker und die Sequenz, die in der Lage ist, die Inhibitor-RNA zu produzieren, auf demselben Nukleinsäuremolekül befinden.

19. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 18, worin die wenigstens eine Nukleinsäure ein Vektor ist.

20. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 19, worin der Vektor pHYPER umfasst.

21. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 16, worin die rekombinante Nukleinsäure in einer Säugerzelle anwesend ist.

22. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 16, worin der Separationsmarker durch einen Antikörper erkannt wird.

23. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 22, worin der Antikörper an ein Magnetreagenz gekoppelt ist.

24. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 22, worin der Antikörper an ein fluoreszierendes Molekül gekoppelt ist.

25. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 22, worin der Antikörper an ein Enzym gekoppelt ist.

26. Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 16, worin der Promotor ein DNA-abhängiger RNA-Polymerase-Promotor vom Typ III ist.

27. Rekombinante Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 16 und 19 bis 25, worin die Inhibitor-RNA eine Bibliothek aus Sequenzen umfasst, die in der Lage sind, eine kurze Haarnadel-RNA zu bilden.

28. Rekombinante Nukleinsäure, umfassend wenigstens eine Nukleinsäure mit einem Mittel zur Produktion eines Separationsmarkers und einem Mittel zur Produktion einer Ribonukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, die Translation eines Zielgens zu inhibieren, wobei der Separationsmarker und das Zielgen voneinander verschieden sind.

Description:
TECHNISCHES GEBIET

Die Erfindung bezieht sich auf Biotechnologie allgemein und genauer auf die Anreicherung von doppelsträngiger RNA-Expression.

HINTERGRUND

Die Fähigkeit, Genexpression spezifisch herunterzuregulieren, ist ein starkes Mittel der Genfunktionsanalyse in vielen Modellsystemen. Bis vor kurzem war das einzig zugängliche Verfahren der gerichteten Genherunterregulation in Säugersystemen die teure und beschwerliche Gen-Knockout-Technologie in Mäusen. Die Charakterisierung von RNA-Interferenz (RNAi) in C. elegans und in Pflanzen führte zu der Entdeckung eines ähnlichen Systems in Säugerzellen. RNAi ist das Phänomen, durch welches doppelsträngige, kleine interferierende RNA (siRNA) die verwandte mRNA zum Ziel nimmt zum Abbau durch den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) (RNA Induced Silencing Complex), wodurch folglich die Genexpression auf einem Niveau der Translation unterdrückt wird (Hannon G. J. (2002) RNA interference, Nature 418 (6894): 244-51).

Es gibt jedoch etliche Beschränkungen, um RNAi-Technologie in Säugersystemen effektiv anzuwenden. Erstens fehlt Säugerzellen die RNA-abhängige RNA-Polymerase, die in C. elegans und in Pflanzen vorhanden ist, welche die Amplifikation und die nachhaltige Expression des interferierenden RNA-Signals erleichtert (Paddison, P. J. und G. J. Hannon (2002) RNA interference: the new somatic cell genetics?, Cancer Cell 2 (1): 17-23 (hiernach Paddison 2002); und Hannon 2002). Aufgrund dessen ist die Wirkung von transfizierter siRNA in Säugerzellen vorübergehend, was das für die Genfunktionsanalyse zugängliche Zeitfenster beschränkt. Die Entwicklung von auf polIII-Promotoren basierten Expressionsvektoren, die kurze Haarnadel-RNAs (small hairpin RNA; shRNAs), welche an doppelsträngige siRNA erinnern, exprimieren, kann verwendet werden, um siRNA-Vergänglichkeit zu überwinden (Brummelkamp et al. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells, Science 296 (5567): 550-3). Solche Vektoren sorgen für eine nachhaltige RNAi-Wirkung durch eine transiente oder stabile Transfektion des die RNAi-Wirkung erzeugenden Vektors. Dieser Ansatz ist jedoch durch die Variabilität der Transfektionseffizienz in unterschiedlichen Zellkulturbedingungen oder Zellarten beschränkt.

Zusätzlich zur Transfektion kann eine Bibliothek aus siRNA-Molekülen in die geeigneten Wirtszellen unter Verwendung eines Virusansatzes eingeführt werden. Zum Beispiel können lentivirale Vektoren verwendet werden. Die Konstruktion und Zubereitung einer Bibliothek aus viralen Vektoren erfordert jedoch eine große Investition in Zeit und Geld. Zusätzlich ist es auch möglich, dass der Virusvektor selber eine zelluläre Antwort modulieren wird, welche unerwünscht sein mag. Schließlich können viral basierte Vektoren, z. B. Retrovirus-basierte Vektoren, für die stabile Expression von siRNAs nicht in sämtlichen Zelltypen verwendet werden, dies würde die zusätzliche Zeit und Anstrengung erfordern, siRNA-kodierende Inserts zu verschiedenen Vektoren zu bewegen.

Abbas-Terki et al. (2001) Lentiviral-mediated RNA interference, Human Gene Therapy 13: 2197-2201, offenbaren lentiviral vermittelte RNAi, gerichtet gegen EGFP. Das bereitgestellte Konstrukt reduziert die EGFP-Expression, wie durch diverse Nachweisverfahren nachgewiesen wird. Die Publikationen von Anderson et al. (Anderson et al. (2003) Bispecific short hairpin siRNA constructs targeted to CD4, CXCR4, and CCR5 confer HIV-1 resistance, Oligonucleotides 13: 303-312; und Anderson et al. (2003) Potent suppression of HIV type 1 infection by a short hairpin anti-CXCR4 siRNA, AIDS Research and Human Retroviruses 19 (8): 699-706) beschreiben jeweils spezifische siRNA-Konstrukte, die gegen HIV-Zelloberflächenproteine gerichtet sind. Der Nachweis erfolgter RNAi wird mit Hilfe von gegen die zu unterdrückenden HIV-Zelloberflächenrezeptorproteine gerichteten Antikörpern durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung überwindet die genannten Beschränkungen und stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit, welche zum Beispiel signifikante Mengen von sowohl Zeit als auch Geld sparen können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt eine Technik bereit, um die Beschränkungen der Transfektionseffizienz zu überwinden, während eine wünschenswerte nachhaltige RNAi-Expression bewahrt wird. Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Zellen, die in der Lage sind, inhibitorische RNA zu exprimieren, durch Einführen von wenigstens einer Nukleinsäure in eine Zelle, worin die wenigstens eine Nukleinsäure in der Lage ist, ein RNAi-Molekül und einen Separationsmarker zu exprimieren, wobei der Separationsmarker und ein Zielgen des RNAi-Moleküls voneinander verschieden sind; Exprimieren des Separationsmarkers; Sortieren der Zelle, basierend auf der Expression des Separationsmarkers; und Exprimieren des RNAi-Moleküls in einer Menge, die ausreichend ist, die Expression des Zielgens zu inhibieren.

Die Erfindung bezieht sich auch auf das Targeting von zellulären, Fremd-, viralen und Transgenen für die RNA-Inhibition. In einer Ausführung bezieht sich die Erfindung auf die Transfektion von Säugerzellen, während eine wünschenswerte, nachhaltige RNAi-Expression bewahrt wird.

Die Erfindung bezieht sich weiter auf das Sortieren von Zellen, basierend auf der Expression eines Separationsmarkers. Beispielhafte Ausführungen schließen das Sortieren durch fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren und magnetische Zellseparation ein.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Anreichern einer Population aus Säugerzellen mit einer RNAi-Sequenz durch das Bereitstellen von eukaryotischen Zellen, z. B. Säugerzellen, die ein Zielgen enthalten, in welche ein Konstrukt, das in der Lage ist, eine RNA zu exprimieren, und ein Separationsmarker eingeführt sind, wobei der Separationsmarker und das Zielgen voneinander verschieden sind, worin die RNA eine doppelsträngige Region des Moleküls enthält mit einer ersten Region mit einer Sequenz, die einer Nukleotidsequenz des Zielgens entspricht, und einer zweiten Region mit einer Sequenz, die zu der ersten Region komplementär ist, worin die ersten und die zweiten Regionen der RNA aneinander hybridisieren, um ein doppelsträngiges RNA-Molekül zu bilden; Exprimieren des Separationsmarkers, worin Expression des Separationsmarkers anzeigend ist für die Anwesenheit des doppelsträngigen RNA-Moleküls; und Sortieren der eukaryotischen Zellen, die den Separationsmarker exprimieren, wodurch für die eukaryotischen Zellen mit der doppelsträngigen RNA-Sequenz angereichert wird.

Die Erfindung bezieht sich auch auf eine oder mehrere rekombinante Nukleinsäuren mit einem Separationsmarker und einem Promotor, der operabel an eine Nukleotidsequenz mit einer Sequenz, welche zu einem Zielgenprodukt komplementär ist, gekoppelt ist. Der Separationsmarker und das Zielgen sind dabei voneinander verschieden. In einer beispielhaften Ausführung umfasst die Nukleotidsequenz eine erste Region, die zu dem Zielgenprodukt komplementär ist, und eine zweite Region, die zu der ersten Region komplementär ist.

In einer beispielhaften Ausführung ist die rekombinante Nukleinsäure ein Vektor oder ein Expressionsvektor. Eine beispielhafte Ausführung eines Expressionsvektors ist pHYPER.

In einer anderen beispielhaften Ausführung bezieht sich die Erfindung auf eine Bibliothek aus siRNA-Sequenzen, worin die Bibliothek aus zufälligen Sequenzen oder einem verwandten Satz von Sequenzen sein kann. In einer anderen beispielhaften Ausführung bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Zubereiten und/oder Anreichern von Zellen, die mit einer Bibliothek aus verwandten siRNA-Sequenzen oder einem zufälligen Satz aus siRNA-Sequenzen transfiziert sind. In einer anderen beispielhaften Ausführung stellt die Erfindung die Fähigkeit bereit, die Population anzureichern, welche mit einer Bibliothek aus siRNA-Sequenzen transfiziert ist.

In einer anderen beispielhaften Ausführung bezieht sich die Erfindung auf eine rekombinante Nukleinsäure, umfassend eine Nukleinsäure mit einer ersten Region, einschließend eine oder mehrere unbekannte Nukleotidpositionen, einer zweiten Region, die in der Lage ist, eine Schleife zu bilden, und einer dritten Region, welche das Komplement der einen oder mehreren unbekannten Nukleotidpositionen umfasst, worin die Nukleinsäure in der Lage ist, eine Stamm-Schleifen-Struktur zu bilden.

Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine rekombinante Nukleinsäure, umfassend wenigstens eine Nukleinsäure mit einem Mittel zur Produktion eines Separationsmarkers und einem Mittel zur Produktion einer Ribonukleotidsequenz, die mit einem Zielgenprodukt komplementär ist, wobei der Separationsmarker und das Zielgen voneinander verschieden sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist eine Karte des pMACS-K/k-H1-Rad17-Plasmids, die die shRNA-Sequenz zeigt (SEQ ID Nr. 1 ist der obere Strang und SEQ ID Nr. 2 ist das Komplement zu dem unteren Strang).

2A, B und D erläutern, dass Transfektionseffizienzen von 49 % und 42 % erreicht worden sind für pMACS-K/k-H1 bzw. pMACS-K/k-H1-Rad17 im Vergleich mit HeLa-Kontrolle, wie angezeigt durch α-K/k.II-FITC-Bindung. Die 2C und E erläutern, dass Zellpopulationen auf Reinheiten von 97 % und 98 % für pMACS-K/k-H1 bzw. pMACS-K/k-H1-Rad17 angereichert worden sind.

3 zeigt, dass Rad17-Proteinspiegel wenigstens 72 Stunden nach der Transfektion signifikant in Zellen reduziert sind, die pMACS-K/k-H1-Rad17 exprimieren, im Verhältnis zu jenen, die keine RNAi (pMACS-K/k-H1) exprimieren.

4 erläutert ein Verfahren zum Konstruieren einer Bibliothek aus RNAi-Sequenzen in einem Plasmid der Erfindung unter Nutzung von Cre/Lox-Rekombination, um eine Bibliothek aus Sequenzen von einer Quelle zu einer anderen zu übertragen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Probleme mit der Vergänglichkeit von siRNA-vermitteltem knockdown und Transfektionseffizienz, zum Beispiel Transfektion von polIII-basierten RNAi-Expressionsvektoren, haben den Umfang von RNAi-basierten Experimenten, zum Beispiel in säugerbasierten Modellsystemen, beschränkt. Die Erfindung stellt ein Werkzeug bereit, um RNAi effizienter und effektiver zu nutzen, durch das Integrieren der RNAi-Expression mit Verfahren der Zellanreicherung. In einer beispielhaften Ausführung stellt die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren einer Population aus Zellen, zum Beispiel zu wenigstens 97 % rein, für die Expression des pMACS-k/k-H1-Rad17-Plasmids bereit (2). Ferner kann die Expression von shRNA aus diesem Plasmid die Expression eines Säugergenproduktes unterdrücken, und diese Inhibition kann für wenigstens 72 Stunden nach der Transfektion des pMACS-k/k-H1-Rad17-Plasmids aufrechterhalten werden (3). Folglich zeigt die Erfindung die erfolgreiche Anwendung von Zellseparation, zum Beispiel pMACS-k/k-H1, als ein Mittel zum Anreichern einer Population für die Anwesenheit von RNAi.

Zwei Gruppen, Paddison, P. J. et al. (2004) A Resource for Large-scale RNA-interference-based Screens in Mammals, Nature 428: 427-431, und Berns, k. et al. (2004) A Large-scale RNAi Screen in Human Cells Identifies New Components of the p53 Pathway, Nature 428: 431-437 (siehe auch Andrew Fraser (2004) RNA interference: Human Genes Hit the Big Screen, Nature 428: 375-378), nutzten einen retroviralen Vektor, um Screening im großen Maßstab, z. B. genomweit, durchzuführen. Beide Gruppen nutzten jedoch retrovirale Vektoren, und solche Vektoren haben eine Anzahl von Nachteilen, welche durch die vorliegende Erfindung überwunden worden sind.

shRNAs inhibieren Zielgene oftmals oder bewirken ihren knockdown in unterschiedlichem Ausmaß, folglich können multiple, z. B. mehr als zwei, drei oder vier shRNAs, für jedes Gen erzeugt werden. Solche multiple Abdeckung kann eine innere Kontrolle bereitstellen und/oder den Vergleich von Knockdowns mit unterschiedlichen Stärken, z. B. stark und schwach, erlauben, wodurch eine Analyse vergleichbar mit klassischen genetischen Ansätzen erlaubt wird.

RNA-Interferenz kann erzeugt werden durch eine Anzahl von unterschiedlichen RNA-Inhibitoren; wie hierin verwendet bedeuten „RNA-Inhibitor", „inhibierende RNA" und ähnliche Ausdrücke RNA-Sequenzen, die in der Lage sind, eine Wirkung zu erzeugen, auf die Bezug genommen wird als RNA-Interferenz, von welcher angenommen wird, dass sie aus der sequenzspezifischen Spaltung von mRNAs resultiert, wodurch die Translation von funktionellen Genprodukten verhindert wird, wobei inhibierende RNAs shRNA, siRNA, dsRNA und andere RNAi-Produkte einschließen.

Die Erfindung bezieht sich auf eine Population aus Zellen, welche angereichert werden können für die Produktion einer siRNA. Ein Fachmann kann zum Beispiel etliche Zielsequenzen testen oder analysieren, um die Knockdown-Wirkung zu optimieren oder die Wirkungen zu vergleichen. Zusätzlich kann ein Fachmann Knockdown-Effizienz modulieren aufgrund von solchen Faktoren wie Ziel-mRNA-Häufigkeit, Expressionsmaß, Umsatzrate und/oder durch Proteinhalbwertszeit (Elbashir et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature 411 (6836): 494-8).

Das pMACS-K/k-H1-System von RNA-Interferenz kann als ein Mittel oder ein Verfahren zum Untersuchen der Unterdrückung von Genfunktion, zum Beispiel in Säugerzellen, angewendet werden. Diese Technik kann für RNA-Interferenz in Zelllinien nützlich sein, die schwierig zu transfizieren sind. Mit einem sehr geringen Maß an Transfektion kann man eine hoch angereicherte Population von shRNA-exprimierenden Zellen isolieren. Zusätzlich erleichtert das Verfahren Experimente, die einen verlängerten Zeitraum der Gensuppression erfordern.

Das pMACS-K/k-H1-System der RNAi-Zufuhr ist eine Verbesserung der gegenwärtigen Technologie, welche die Fähigkeit erweitern kann, RNAi-basierte Experimente durchzuführen. Weiter können Zellen, die basierend auf der Expression von shRNA oder anderer RNAi separiert werden, nützlich sein für die Behandlung von Erkrankung, zum Beispiel durch Ex-vivo-Gentherapie. Die Verfahren der Erfindung können mit jeder Zelle verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf eukaryotische Zellen wie zum Beispiel Säugerzellen oder Pflanzenzellen.

In einer beispielhaften Ausführung stellt die Erfindung eine Technik bereit, um die Beschränkungen von Transfektionseffizienz zu umgehen, während die wünschenswerte nachhaltige RNAi-Expression eines polIII-Vektor-basierten Systems bewahrt wird. Durch Klonieren des polIII-H1-Promotors in ein pMACS-K/k.II-Plasmid (Miltenyi Biotch., Köln, Deutschland) für die transfizierte Zellseparation wurden Zellpopulationen, die zu 98 % für shRNA-Expression positiv sind, reproduzierbar isoliert. Unter Verwendung dieses Systems wurde ein signifikanter Knockdown einer Säugergenexpression gezeigt, bis zu 72 Stunden nach RNAi-Exprimieren der Plasmidtransfektion. Folglich erleichtert dieses System die gleichmäßigere, unterstützte und verstärkte RNA-Interferenz. Ferner ist es nun möglich, effektive RNAi-Experimente in Zelllinien durchzuführen, welche zuvor schwierig mit sowohl synthetischen siRNA, shRNA als auch doppelsträngigen Expressionsvektoren zu transfizieren waren.

Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, worin das RNAi-Inhibitionssignal für eine Population an Zellen erhöht ist und/oder das Rauschen reduziert wird. Zum Beispiel kann die Transfektion von primären Zellen oder Lymphozyten in einer Transfektionseffizienz von weniger als ungefähr 5 % resultieren. Folglich wird ohne Selektion das durch den RNAi-Knock-out gewonnene Signal wahrscheinlich durch das Rauschen von den nicht-transfizierten Zellen überlagert. Unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung kann eine Population aus Zellen transformiert oder transfiziert sein, selektiert, um für die transformierten oder transfizierten Zellen anzureichern, und die selektierten Zellen können untersucht werden. Dadurch wird der Hintergrund von den nicht-transfizierten (nicht-transformierten) Zellen entfernt. Folglich ermöglicht die Erfindung RNAi-Studien in Zellen mit einer geringen Transfektions- oder Transformationseffizienz. Zum Beispiel kann eine Transformations- oder Transfektionseffizienz von weniger als 50 %, weniger als 40 %, weniger als 30 %, weniger als 20 % oder weniger als 10 % von der Erfindung profitieren. Zum Beispiel können HeLa-Zellen eine Transfektionseffizienz von annähernd 30 % haben. Unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung kann das Rauschen aufgrund von nicht-transfizierten Zellen reduziert werden, wodurch ein Test, der weiter stromabwärts stattfindet, verbessert wird, wie zum Beispiel eine phänotypische und/oder genotypische Analyse.

Die Reduktion im Rauschen aufgrund von nicht-transfizierten Zellen ist besonders vorteilhaft, wenn eine große Anzahl von Konstrukten, wie zum Beispiel eine Bibliothek aus siRNA-Konstrukten, gescreent und/oder analysiert wird.

Sortieren oder Anreichern für transfizierte Zellen kann durchgeführt werden durch fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS) (Gross et al. (1995) Model Study Detecting Breast Cancer Cells in Peripheral Blood Mononuclear Cells at Frequencies as low as 10–7. Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Immunaffinitätszellseparationstechniken (Lebkowski et al. (1992) Rapid isolation of CD34+ cells from PB of autologous transplant Patient, Blood 80(suppl) 1: 527; und US-Patent 5,912,177), affinitätsbasierte Separationsverfahren (zum Beispiel eine Streptavidinaffinitätssäule für eine Biotinmarkierung, magnetische Mikropartikel, gekoppelt an Antikörper (Shpall et al. (1991) Bone Marrow Transplantation 7: 145) und Hochgradientenmagnetzellsortieren (high gradient magnetic cell sorting; Miltenyi et al. (1990) High Gradient Magnetic Cell Sorting with MACS, Cytometry 11: 231-239), Dielektrophorese-/Gravitations-Feld-Fluss-Fraktionierung und Zentrifugation. Ein Überblick über Zellseparationstechniken wird bereitgestellt durch Cell Separation Methods and Applications, Recktenwald et al., Hrsg. (1998). Wie durch einen Durchschnittsfachmann erkannt wird, kann Zellsortieren oder -anreicherung Separationsmarker nutzen, die durch Antikörper, photometrische Systeme oder Ähnliches, wie zum Beispiel fluoreszierende Moleküle und chemilumineszierende Marker, erkannt werden.

In einer beispielhaften Ausführung werden Separationsantikörper an ein magnetisches Reagenz, wie zum Beispiel ein paramagnetisches Mikro- oder Nanopartikel (Mikropartikel oder Nanopartikel), gekoppelt. Magnetische Zellseparation ist ein Mittel/Verfahren, wodurch Zielzellen mit einem magnetischen Marker markiert werden können und dann selektiv zurückgehalten oder durch Aussetzen an ein Magnetfeld ausgeschlossen werden können. Beispiele solcher Verfahren können gefunden werden in Kantor, et al. (1998 Magnetic Cell Sorting with Colloidal Superparamagnetic Particles, in Cell Separation Methods & Applications); Gee (1998, Immunomagnetic Cell Separation Using Antibodies and Superparamagnetic Microspheres in Cell Separation Methods & Applications); und US-Patent 5,411,863. Für Hochgradientenmagnetseparation wird typischerweise eine heterogene Suspension, enthaltend selektierte, an magnetische Marker gebundene Zellen, durch eine Säule geführt, wodurch Zellen mit einem magnetischen Marker ermöglicht wird, an eine Säule oder eine paramagnetische Matrix innerhalb der Säule magnetisch anzuhaften. Der Rest der Suspension wird eluiert, wodurch die gewünschten magnetisierten Zellen an die Säule gebunden zurückbelassen werden. Wenn das Magnetfeld entfernt wird, können die gebundenen Zellen eluiert werden. Das US-Patent 4,452,773 beschreibt die Zubereitung von magnetischen Eisen-Dextran-Mikropartikeln und stellt eine Zusammenfassung bereit, welche die verschiedenen Mittel der Zubereitung von Partikeln, die für das Anheften an biologische Materialien geeignet sind, beschreibt. Eine Beschreibung von Polymerüberzügen für magnetische Partikel kann gefunden werden in DE 37 20 844 und US-Patent 5,385,707. Verfahren für die Zubereitung von superparamagnetischen Partikeln werden beschrieben im US-Patent 4,770,183. Magnetzellseparation schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf diamagnetische, paramagnetische, ferromagnetische und superparamagnetische Materialien (siehe US-Patent 5,385,707). Folglich schließt die Erfindung Magnetseparation unter Verwendung einer Reihe von magnetischen Eigenschaften ein. Das Ausmaß an Magnetisierung, welches durch ein Partikel erworben wird, ist eine Funktion des magnetischen Momentes, des Volumens des Partikels und des angelegten Magnetfeldes. Zum Beispiel ist, je höher das magnetische Moment und je kleiner das Volumen ist, desto höher die Magnetisierung.

In einer anderen beispielhaften Ausführung sind Separationsmarker oder Antikörper ein Fluorochrom oder sind daran gekoppelt. Die transfizierte oder transformierte Population aus Zellen kann dann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung sortiert werden. In noch einer anderen beispielhaften Ausführung werden die transfizierten oder transformierten Zellen durch ein Verfahren sortiert, auf das allgemein Bezug genommen wird als Panning. Zum Beispiel werden Antikörper an einen festen Untergrund gekoppelt und die transfizierte oder transformierte Population wird an die Antikörper auf dem festen Untergrund ausgesetzt. Anschließend werden ungebundene Zellen durch Waschen entfernt, während die den Separationsmarker exprimierenden Zellen, welche direkt oder indirekt durch die angehefteten Antikörper gebunden sein können, an den festen Untergrund gebunden bleiben werden. Die gebundenen Zellen können dann zu der gewünschten Zeit eluiert werden.

Separationsmarker können auf der Zelloberfläche (zum Beispiel der Plasmamembran oder Zellwand), der extrazellulären Matrix, in dem Cytoplasma, den Zellorganellen, den zellulären Organellkompartimenten oder Organellmembranen, wie zum Beispiel der Kernmembran, oder extrazellulär gebunden werden (siehe Patentanmeldung der Vereinigten Staaten 2002/0182645). Der Separationsmarker sollte jedoch vorzugsweise für die Sortiermittel oder -verfahren ohne Zerstörung der Zelle zugänglich sein. Zum Beispiel können grünes fluoreszierendes Protein (siehe US-Patent 6,319,669) oder Beta-Galactosidase (z. B. unter Verwendung von Fluoresceindigalactosid (FDG)) von einem Vektor exprimiert sein, in die Kernmembran eingebaut sein und die Zellen können durch fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS) oder Durchflusscytometrie sortiert werden (siehe Anderson et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8508-8511). In einer beispielhaften Ausführung ist der Separationsmarker jedes Molekül, das in der zu sortierenden Zellpopulation nicht exprimiert oder in geeignet niedrigen Spiegeln exprimiert wird, zum Beispiel können eines oder mehrere intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (ICANs) oder Fragmente davon verwendet werden. In noch einer anderen Ausführung kann ein rekombinantes chimäres Molekül verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Fragment eines IgG-Immunglobulins (z. B. eine schwere Kette der Maus oder ein Fragment davon) an ein Zelloberflächenprotein fusioniert sein. In einer anderen Ausführung kann das Separationsmolekül die Größe, Form oder andere Eigenschaften einer Zelle ändern. Zum Beispiel kann der Separationsmarker die Vorwärts- und/oder Seitenstreueigenschaften der Zelle ändern. Folglich schließen die Separationsmarker der Erfindung alle Mittel oder Moleküle ein, die in der Lage sind, eine das RNAi-Konstrukt tragende Zelle zu identifizieren.

Der Separationsmarker kann direkt oder indirekt wirken und kann direkt oder indirekt detektiert werden. Ein Durchschnittsfachmann wird unter Verwendung der hierin bereitgestellten Führung erkennen, dass der bestimmte verwendete Separationsmarker oder Separationsverfahren nicht für die Erfindung kritisch ist, und kann jedes geeignete Verfahren und/oder Molekül oder Fragment eines Moleküls sein, das ausreichend ist, die Zelle zu identifizieren und Abtrennung von Zellen zu ermöglichen, denen der Separationsmarker fehlt. Ein Separationsmarker kann mit einem selektierbaren Marker (zum Beispiel Antibiotikaresistenzmarkern wie zum Beispiel Puromycinresistenz und Ampicillinresistenz) kombiniert sein. Separationsmarker unterscheiden sich von Selektionsmarkern dahingehend, dass ein Separationsmarker nicht die Applikation von letalen Arzneimitteln an die Zellen erfordert. Weiter bieten Separationsmarker signifikant mehr Auswahl, als es die Verwendung von Selektionsmarkern tut. Zum Beispiel können multiple Separationsmarker verwendet werden, und Zellen können in jene sortiert werden, die sämtliche Marker oder Untersätze der Marker haben. Folglich wird signifikant mehr Flexibilität mit Separationsmarkern geboten. Zusätzlich erweckt die Anwesenheit von einem oder mehreren Selektionsmarkern) Bedenken, dass Zellen, die diese Marker enthalten (typischerweise Antibiotikaresistenzgene) die Resistenz auf Bakterien oder andere Organismen übertragen könnten, wodurch Antibiotikamedizin weniger effektiv gemacht werden würde. Im Gegensatz dazu könnte ein Separationsmarker ohne solche Bedenken verwendet werden.

Das genaue Verfahren zum Detektieren eines Separationsmarkers ist für die Praxis der Erfindung nicht kritisch, und eine Anzahl von Alternativen sind in der Technik bekannt. Zum Beispiel können Separationsantikörper direkt an detektierbare Partikel gekoppelt sein. Indirekte Kopplung kann durch etliche Verfahren bewerkstelligt werden. Die Antikörper können an ein Mitglied eines hoch affinen Bindungssystems (z. B. Biotin) gekoppelt sein, und die Partikel können an das andere Glied (z. B. Avidin) angeheftet sein. Man kann auch zweistufige Antikörper (second stage antibodies) verwenden, welche speziesspezifische Epitope der Antikörper erkennen, z. B. anti-Maus-Ig, anti-Ratten-Ig etc. Indirekte Kopplungsverfahren erlauben die Verwendung einer einzelnen magnetisch gekoppelten Einheit, z. B. Antikörper, Avidin, Magnetliposom etc., mit einer Reihe von Separationsantikörpern.

In einer Ausführung können Hapten-spezifische zweistufige Antikörper verwendet werden, die an detektierbare Partikel gekoppelt sind (z. B. magnetische Partikel oder Fluorochrome). Wie hierin verwendet, schließen „detektierbare Partikel" magnetische Reagenzien und fluoreszierende Moleküle ein. Die Hapten-spezifischen Antikörper können eine Affinität von wenigstens ungefähr 100 μM für das Hapten haben. Die Antikörper können an ein passendes Hapten konjugiert sein. Geeignete Haptene schließen Digoxin, Digoxigenin, FITC, Dinitrophenyl, Nitrophenyl etc. ein. Verfahren für die Konjugation eines Haptens oder detektierbaren Partikels an einen Antikörper sind in der Technik bekannt.

Immunmagnetselektion wurde verwendet, um Zellen zu selektieren, die einen Marker exprimieren, zum Beispiel einen Oberflächenmarker, und um transient transfizierte Zellen zu selektieren, enthaltend einen selektierbaren Marker kodierende(s) Plasmid(e), und nach Aufnahme und Expression des/der Plasmids/e werden die transfizierten Zellen an mit Antikörper überzogene Magnetperlen immunabsorbiert. In einer einzelnen Runde der Magnetselektion ist es möglich, die Zellpopulation um mehr als das 7fache in dem Fall von Co-Transfektion anzureichern. Siehe Aileen Constans (2000) Field of Dreams: Innovations in Magnetic Particle Technology Advance Many Fields, The Scientist 14 (13): 23; und Partington (1999) A novel method of cell separation based an dual parameter immunomagnetic cell selection, J. Immunol. Methods. 223 (2): 195-205.

Antikörper der Erfindung können enzymkonjugierte Antikörper (z. B. Meerrettichperoxidase, Phosphatase etc.), mit Hapten versehene Antikörper (z. B. Biotinkonjugate, Digoxigeninkonjugate etc.) oder einen fluorochromkonjugierten Antikörper (z. B. Phycoerythrin, FITC, Rhodamin, Texasrot, Allophycocyanin etc.) einschließen. Die Antikörper können für jedes Antigen Spezifität haben, das bei der Separation einer Subpopulation nützlich ist. Reagenzien können auch Blocking-Mittel einschließen, die unspezifische Markierung reduzieren (z. B. Fc-Rezeptor-Blocking-Reagenz, Peroxidase-Blocking-Reagenz etc.). Zum Beispiel kann ein Cocktail aus Digoxigenin-gekoppelten Antikörpern in Kombination mit an Magnetperlen gekoppelten anti-Digoxigenin-Antikörpern verwendet werden, worauf Markieren mit einem fluorochromkonjugierten Antikörper, gerichtet gegen den anti-Haptenantikörper, folgen kann.

Eine Bibliothek aus siRNA-Sequenzen schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf eine Bibliothek aus zufälligen Sequenzen oder eine Bibliothek aus verwandten Sätzen von Sequenzen. Ein verwandter Satz aus Sequenzen kann siRNA-Sequenzen umfassen, die in der Lage sind, eines oder mehrere Mitglieder einer Genfamilie oder Subfamilie zu inhibieren; Beispiele von Genfamilien und die Verfahren, Gene in eine Familie oder Subfamilie zu kategorisieren, sind in der Technik gut bekannt. Wie von einem Durchschnittsfachmann erkannt werden wird, sind Genfamilien oder Subfamilien üblich, und die Liste solcher Familien wird kontinuierlich erweitert. Als ein erläuterndes Beispiel ist von der 5-Hydroxytryptamin-(5-HT-)Rezeptorfamilie bekannt, dass sie wenigstens sieben Subfamilien hat (5-HT1-7). Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine Bibliothek aus RNAi-Sequenzen zu konstruieren, eine Zellpopulation mit der Bibliothek zu transfizieren, die Population für jene anzureichern, die mit einer RNAi-Sequenz transfiziert sind, und die angereicherte Population zu screenen. Die Fähigkeit, die transfizierte Population anzureichern, stellt Vorteile bereit, wenn Screens unter Verwendung einer Bibliothek aus Zufallssequenzen (z. B. genomweites Screening) oder einem verwandten Satz von Sequenzen (z. B. Genfamilienscreening und/oder -analyse, Gensubfamilienscreening und/oder -analyse, Screening und/oder Analysieren einer Proteinklasse) durchgeführt werden. Wie von einem Durchschnittsfachmann erkannt werden wird, kann die Fähigkeit, die Population anzureichern, signifikante Vorteile bereitstellen, wo eine große Anzahl von Konstrukten einzuführen und zu screenen und/oder zu analysieren sind.

Transfektion von siRNA ist ein kritischer Schritt in Gen-Silencing-Experimenten. Eine mit sämtlichen Transfektionstechniken einhergehende Schwierigkeit ist die Transfektionseffizienz. Zum Beispiel wird, falls ein Zellpool mit weniger als 100 % Effizienz transfiziert wird, was annähernd immer der Fall ist, jeder Test schwierig zu interpretieren werden oder wird signifikant mehr Zeit und/oder Reagenzien erfordern, was alles die Kosten erhöht. Wie durch einen Durchschnittsfachmann erkannt werden wird, veranlasst dieser Aspekt der Transfektion den Bedarf für geeignete Transfektionseffizienzkontrollen. In einer anderen beispielhaften Ausführung bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Zubereiten und/oder Anreichern von Zellen, die mit einer Bibliothek aus verwandten siRNA-Sequenzen und einem zufälligen Satz aus siRNA-Sequenzen transfiziert worden sind. Die Bibliothek aus siRNA-Sequenzen kann durch in der Technik bekannte Verfahren erzeugt werden, zum Beispiel jene, die beschrieben sind in Hutvagner et al. A Cellular Function for the RNA-interference Enzyme Dicer in the Maturation of the Let-7 SmalI Temporal RNA, Science 293 (5531): 834-838; internationale Patentveröffentlichung WO 99/64582; internationale Patentveröffentlichung WO 00/49035; internationale Patentveröffentlichung WO 96/29097; Pasquinelli et al. (2000) Conservation of the Sequence and Temporal Expression of Let-7 Heterochronic Regulatory RNA, Nature 408 (6808): 86-89; Yu Jenn-Yah et al. (2002) RNA interference by Expression of Short-Interfering RNAs and hairpin RNAs in Mammalian Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (9): 6047-6052; Raykov et al. (2002) Transient Suppression of Transgene Expression by Means of Antisense Oligonucleotides: A Method for the Production of Toxintransducing Recombinant Viruses, Gene Therapy 9 (5): 358-362; internationale Patentveröffentlichung WO 03/020931 A2 für Gert-Jan Arts et al.; und Gert-Jan Arts et al. (2003) Adenoviral Vectors Expressing siRNAs for Discovery and Validation of Gene Function, Genome Research 13 (10): 2325-2332, welche durch Bezugnahme eingeschlossen sind.

Screening und/oder Analyse einer Bibliothek aus siRNA-Molekülen wird typischerweise unter Verwendung eines viralen Ansatzes vorgenommen. Solch ein Ansatz ist jedoch nachteilig dahingehend, dass er eine große Investition in die Zeit erfordert, um die Virusstämme zu erzeugen. Dieser Ansatz legt zusätzliche Kosten sowohl in der Zeit als auch in den direkten Kosten (z. B. Ausrüstung und Materialien) auf. Zusätzlich muss Sorgfalt geübt werden, dass die Verwendung von Virus nicht eine zelluläre Antwort moduliert, die nicht wünschenswert ist. Folglich muss Sorgfalt verwendet werden beim Auswählen des geeigneten viralen Vektors, und es mag in gewissen Fällen nicht möglich sein, effektiv einen viralen Vektor zu verwenden.

Eine Zellpopulation kann in Medien kultiviert sein, die für die bestimmten Zellen geeignet sind. Um die Wiedergewinnung zu verbessern, kann Sortieren durch Verfahren wie FACS unter Verwendung von reinem Hanks-Medium oder anderen geeigneten Medien wie die Sheath-Flüssigkeit durchgeführt werden. Proben, die durch Verfahren wie FACS zu sortieren sind, können in einem reichen Medium gehalten werden, das für sie am besten geeignet ist. Hohe Serumkonzentrationen können aufgrund von Verdünnung in dem Sammelgefäß durch Sheath-Flüssigkeit anzuraten sein. Die Sammelgefäße werden typischerweise bei der optimalen Temperatur gehalten und enthalten Medium für die Bewahrung der Zelllebensfähigkeit. Zusätzlich kann das Verarbeiten der sortierten Zellen sobald als möglich nach Abschluss des Sortierens dabei helfen, die Zelllebensfähigkeit zu bewahren.

In einer anderen Ausführung können die Zellen der Erfindung mehrmals sortiert werden. Genauer können, wenn die Transformationseffizienz niedrig ist, zum Beispiel niedriger als ungefähr 10 %, oder die gewünschte Reinheit der sortierten Kultur hoch ist, zum Beispiel höher als 90 %, die Zellen zweimal oder mehrmals sortiert werden. In einer anderen Ausführung werden die Zellen unter Verwendung von zwei oder mehr Separationsmarkern in einem oder mehreren Sortierschritten separiert.

Tote Zellen können von der sortierten Population durch in der Technik bekannte Verfahren ausgeschlossen werden, zum Beispiel durch Hinzufügen (Markieren) einer geeigneten Menge Propidiumiodid (PI) oder 7-Aminoactinomycin D.

Das inhibitorische RNA-Molekül der Erfindung kann jede Länge haben, die für einen bestimmten Zweck geeignet und wünschenswert ist. Zum Beispiel ist siRNA typischerweise ungefähr 18 bis ungefähr 26 Nukleotide lang, wobei die Länge typischerweise gemessen wird durch die Länge der Sequenz, die mit der Zielsequenz komplementär ist (z. B. die mRNA) (zum Beispiel siehe McCaffrey et al. (2003) Inhibition of Hepatitis B Virus in Mice by RNA Interference, Nat. Biotechnol. 21 (6): 639-644). Doppelsträngige RNA kann von ungefähr 18 bis zu tausenden von Nukleotiden lang sein. Doppelsträngige RNA wird typischerweise entweder in vitro oder in vivo durch eine RNase, wie zum Beispiel die RNase III, auf die Bezug genommen wird als „Dicer", gespalten, um siRNAs zu erzeugen (zum Beispiel siehe US-Patent 6,506,559). Längere doppelsträngige RNA-Moleküle können jedoch eine dsRNA-aktivierte Proteinkinase-(PKR-)Antwort in einer Zelle auslösen. PKR phosphoryliert EIF-2α, welches eine generalisierte Inhibition der Translation induziert. Zusätzlich kann dsRNA das 2'5'-Oligoadenylatpolymerase/RNase-L-System aktivieren, um IκB zu unterdrücken, was zu Zelltod im Wege von Apoptose führt. Ein Durchschnittsfachmann kann Verfahren verwenden, die in der Technik bekannt sind, um solch eine zelluläre Antwort zu verhindern oder zu umgehen (z. B. unter Verwendung von Zellen, denen eine PKR-Antwort fehlt).

Eine shRNA kann eine Schleifensequenz von zwischen ungefähr 4 bis ungefähr 26 Nukleotiden einschließen. Die Schleifensequenz braucht nur ausreichend lang zu sein, um dem Molekül zu erlauben, auf sich selbst zurückzufalten, um die doppelsträngige „Stamm"-Struktur zu produzieren (eine intramolekulare Hybridisierung).

Die doppelsträngige RNAi kann einen oder mehrere Stränge aus polymerisiertem Ribonukleotid umfassen. Die doppelsträngige Struktur kann durch einen oder mehrere mit sich selbst komplementäre oder komplementäre RNA-Stränge gebildet sein.

RNA, die eine Nukleotidsequenz enthält, die mit einem Teil des Zielgens identisch ist, wird typischerweise für die Inhibition bevorzugt. Die Erfindung hat jedoch den Vorteil, dass sie in der Lage ist, Sequenzvariationen zu tolerieren, die aufgrund von genetischer Mutation, Stammpolymorphismus oder Evolutionsdivergenz erwartet werden könnten. Deshalb sind Insertionen, Deletionen und Mutationen im Verhältnis zu der Zielsequenz ebenfalls für die Inhibition effektiv. Die Duplexregion der RNA kann funktionell als eine Nukleotidsequenz definiert sein, die in der Lage ist, mit einem Teil des Zielgentranskriptes zu hybridisieren. Folglich kann eine Nukleotidsequenz von einem Teil des Zielgens ausgewählt sein, um inhibitorische RNA zu erzeugen. RNAi ist wirksam beim Produzieren von Inhibition von Genexpression und kann verwendet werden, um viele unterschiedliche Typen von Zielgenen zu inhibieren (US-Patent 6,506,559). Wie hierin beschrieben, braucht die RNAi-Sequenz nicht zu 100 % mit dem Zielgen identisch sein, um Inhibition zu produzieren (Jackson et al. (2003) Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi, Nat. Biotechnol. 21 (6): 635-637). Zum Beispiel können Sequenzunterschiede an dem 3'-Ende des siRNA-Sinnstrangs (5'-Ende des Gegensinnstrangs) im Verhältnis mit dem Zielgen immer noch eine effektive RNA-Inhibition erlauben.

Nukleinsäurehybridisierung wird durch solche Bedingungen wie Salzkonzentration, Temperatur oder organische Lösungsmittel zusätzlich zu der Rasenzusammensetzung, der Länge der komplementären Stränge und der Anzahl von Nukleotidbasenfehlpaarungen zwischen den hybridisierenden Nukleinsäuren beeinflusst werden, wie von Fachleuten leicht erkannt werden wird. Stringente Temperaturbedingungen werden allgemein Temperaturen von mehr als 30 °C, typischerweise mehr als 37 °C und bevorzugt mehr als 45 °C einschließen. Stringente Salzbedingungen werden gewöhnlich niedriger sein als 1000 mM, typischerweise niedriger als 500 mM und bevorzugt niedriger als 200 mM. Die Kombination an Parametern ist jedoch viel wichtiger als das Maß jedes einzelnen Parameters. Die Stringenzbedinungen sind abhängig von der Länge der Nukleinsäure und der Basenzusammensetzung der Nukleinsäure und können durch in der Technik wohlbekannte Techniken bestimmt werden. Zum Beispiel Ausubel, 1992; Wetmur und Davidson, 1968.

Folglich, wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen", dass Hybridisierung nur geschehen wird, falls es wenigstens 80 %, vorzugsweise wenigstens 90 %, bevorzugter 95 % und am bevorzugtesten wenigstens 97 % Identität zwischen den Sequenzen gibt. Solche Hybridisierungstechniken sind Fachleuten wohlbekannt. Stringente Hybridisierungsbedinungen sind wie oben definiert oder alternativ Bedingungen unter Übernacht-Inkubation bei 42 °C in einer Lösung, umfassend: 50 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (ph 7,6), 5 × Denhardts-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, abgescherte Lachssperma-DNA, gefolgt von Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei ungefähr 65 °C.

Verfahren zum Anheften einer Nukleinsäure an eine Membran oder einen Untergrund sind in der Technik wohlbekannt. Zum Beispiel können Verfahren und repräsentative Membranen und Untergründe gefunden werden in Ausubel et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc., 2004). Zusätzlich sind Screeningtests, Verfahren zur Zubereitung der Bibliothek und andere solche Verfahren und damit im Zusammenhang stehende Materialien in der Technik bekannt und können gefunden werden in Ausubel et al. Verfahren und Materialien im Zusammenhang mit Immunologie, einschließlich Antikörper und ihre Verwendung, können gefunden werden in Bierer et al. CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, Inc., 2004) und Harlow und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1988); Verfahren und Materialien im Zusammenhang mit Cytometrie können gefunden werden in Robinson et al. CURRENT PROTOCOLS IN CYTOMETRY (John Wiley & Sons, Inc., 2004).

Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Zielgen" ein Gen oder eine Nukleinsäuresequenz, die von einer Zelle oder einem Virus abgeleitet worden ist (wie zum Beispiel ein endogenes Gen oder eine Sequenz), ein Fremdgen oder -sequenz (wie zum Beispiel ein Gen, Allel oder eine Sequenz, die nicht typischerweise in dem Genom vorhanden ist), ein Transgen oder eine transgene Sequenz (wie zum Beispiel ein in die Zelle eingeführtes Genkonstrukt oder Sequenz, entweder integriert oder extrachromosomal) oder ein Gen oder eine Sequenz von einem Pathogen, welche in der Lage ist, einen Organismus, aus welchem die Zelle abgeleitet worden ist, zu infizieren. Ein Zielgen kann mehr als eine Nukleinsäuresequenz einschließen, zum Beispiel kann ein Zielgen ein oder mehrere Mitglied(er) einer Genfamilie oder -subfamilie einschließen, zum Beispiel kann ein Zielgen ein oder mehrere Mitglied(er) einer zuvor unidentifizierten Genfamilie sein. Ähnlich kann ein Zielgen Nukleinsäuresequenzen einschließen, wie zum Beispiel Pseudogene, Isoformen und/oder Splicevarianten.

Inhibition von Genexpression bezieht sich auf die beobachtbare Abnahme in dem Spiegel des Proteins und/oder RNA-Produkts (Genprodukt) aus einem Zielgen. Gerichtete Inhibition bezieht sich auf die Fähigkeit, das Zielgen zu inhibieren, ohne Effekte auf andere Gene der Zelle zu manifestieren. Inhibition kann durch in der Technik wohlbekannte Verfahren gemessen werden. Zum Beispiel kann RNAi-Inhibition in einer Zelllinie oder einem gesamten Organismus untersucht werden durch die Verwendung eines Reporters oder eines anderen testbaren Markers (z. B. ein Arzneimittelresistenzgen). Solche Reportergene oder Tests sind in der Technik wohlbekannt.

In Abhängigkeit von dem Test erlaubt eine Quantifikation der Menge an Genexpression, einen Grad von Inhibition zu bestimmen. Quantifikation von Genexpression in einer Zelle kann Inhibition von Ziel-mRNA oder Translation von Zielprotein zeigen. Zum Beispiel kann eine Genprodukt-mRNA mit einer Hybridisierungssonde detektiert werden oder translatiertes Polypeptid kann mit einem gegen die Polypeptidsequenz erzeugten Antikörper detektiert werden.

In einer beispielhaften Ausführung ist die Nukleinsäure der Erfindung ein Vektor. Die Vektoren der Erfindung können eine oder mehrere Nukleinsäuren sein (zum Beispiel Nukleinsäuren, die in der Lage sind zur homologen Rekombination oder zu Cre/Lox-vermittelter Rekombination). Die Sequenz von Interesse kann transient, konditional oder konstitutiv exprimiert sein. Weiter können chromosomal integrierte Vektoren eine stabil transformierte oder transfizierte Zelllinie produzieren. Vektoren für die Bildung solcher stabiler Zelllinien schließen ein, ohne Beschränkung, jene, die beschrieben sind im US-Patent 6,025,192 und in der PCT-Veröffentlichung WO 98/12339.

Promotoren können in einer Nukleinsäure oder einem Vektor der Erfindung als ein Mittel eingebaut sein, die Transkription zu starten. Geeignete Promotoren schließen jede Nukleotidsequenz ein, die in der Lage ist, die Transkription unter geeigneten Bedingungen zu starten. Geeignete Promotoren schließen ohne Beschränkung ein pol-III-Promotoren; pol-II-Promotoren (siehe Paddison et al (2002) Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1443), wie zum Beispiel der Gal4-Promotor, let858, SERCA, UL6, myo-2 oder myo-3, Gal4p-Bindungsstellen und/oder Pho5; pol-I-Promotoren; virale Promotoren wie zum Beispiel T7, T3 und SP6, Adenoviruspromotoren, der Immediate Early Promotor von Cytomegalovirus und der starke Operator und/oder Promotorregionen des Phagen λ; Hefepaarungsfaktorpromotoren (a oder α), jene, die offenbart sind im US-Patent 6,537,786, der Polyhedron- oder p10-Promotor des Baculovirussystems und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen kontrollieren, und jede Kombination davon. Ein Durchschnittsfachmann kann jeden bekannten oder entdeckten Promotor in Kombination mit der Erfindung verwenden. Promotoren können zum Beispiel minimal, induzierbar, konstitutiv, gewebespezifisch, rheostatisch, stressansprechend oder Kombinationen davon sein.

Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die erhöhte Transkriptionsspiegel aus DNA, an welche sie operabel gekoppelt sind, in Antwort auf gewisse Änderungen der zellulären Bedingungen, zum Beispiel die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nährstoffes oder eine Änderung in der Temperatur, in Gang bringen. Induzierbare Promotoren (tet, Hormonrezeptoren usw.) können zum Beispiel verwendet werden, um Gen-Silencinganalysen zu erleichtern, indem die temporäre Unterdrückung von normalerweise letalen Knock-outs (z. B. „essentielle Gene") erlaubt wird, und um dabei zu helfen, die aufeinanderfolgenden oder temporären Beschränkungen gewisser zellulärer Phänomene zu zergliedern. Weiterhin können induzierbare Vektoren verwendet werden, zum Beispiel um die Expression der Sequenz von Interesse zu einer wünschenswerten Zeit zu induzieren. Zum Beispiel kann sich die Sequenz von Interesse unter der Kontrolle eines Promotors befinden, der abgeleitet ist von einem Gen, das in Antwort auf Infektion durch einen Schädling oder ein Virus heraufreguliert ist (zum Beispiel Transkriptionsfaktor vom Myb-Typ, ein spätes, bei der Embryogenese häufiges Protein, ein wurzelspezifisches Gen (z. B. TobR67), D-Ribulose-5-Phosphat-3-Epimerase oder eine 20S-Proteasom-α-Untereinheit), wodurch Expression der dsRNA in Antwort auf die Infektion induziert wird. Induzierbare Promotoren sind Durchschnittsfachleuten bekannt.

Die das Zielgen aufweisende Zelle kann aus jedem Organismus gewonnen werden. Solche Organismen schließen eine Pflanze, ein Tier, ein Protozoon, Bakterien, Virus oder Pilz ein. Die Pflanze kann eine Monokotyledone, Dikotyledone oder Gymnosperme sein; das Tier kann ein Vertebrat oder Invertebrat sein. Pilze schließen Organismen sowohl in den Schimmel- als auch in den Hefemorphologien ein. In einer beispielhaften Ausführung bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung des Verfahrens für die Studie von Säugerzellen, wie zum Beispiel primäre Zellen und Lymphozyten.

Es sind etliche Verfahren für die Zelltransfektion und -transformation zugänglich. Zum Beispiel können Zellen durch Verfahren transfiziert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Calciumphosphat, DEAE-Dextran, kationische Polymere, kationische Dendrimere, virale Verfahren, Partikelkanone, hydrodynamische und kationische Lipide. Das Verfahren zur Transfektion oder Transformation ist für die Erfindung nicht kritisch und kann in geeigneter Weise von einem Durchschnittsfachmann gewählt werden. Für Beispiele der Transfektions- und Transformationsverfahren und -materialien siehe Bonifacino et al. CURRENT PROTOCOLS IN CYTOMETRY (John Wiley & Sons), Inc., 2004).

BEISPIEL I

Ein Plasmid, pHYPER, wurde durch Inserieren des pol-III-H1-Promotors in eine 5'-EcoRI-Stelle und 3'-BglII-Stelle von pMACS-K/k.II (Miltenyi Biotech.) konstruiert.

Es wurde eine auf das 5'UTR der Rad17-mRNA gerichtete shRNA-Sequenz gestaltet (Zou, et al. (2002) Regulation of ATR substrate selection by Rad17-dependent loading of Rad9 complexes onto chromatin, Genes Dev. 16 (2): 198-208). Diese RNAi-Zielsequenz wurde in die Haarnadelsequenz, die von dem H1-Promotor exprimiert werden soll, eingebaut (1). Der H1-Promotor wurde in pMACS-K/k.II kloniert, so dass shRNA in transfizierten Zellen exprimiert werden könnte. Als nächstes wurde eine Oligonukleotidduplex, die für eine RNA-Haarnadelsequenz, gerichtet auf die 5'-untranslatierte Region der Rad17-mRNA, kodiert (Zou, Cortez et al. (2002)) stromabwärts des H1-Promotors unter Verwendung von 5'-BglII- und 3'-HindIII-Stellen inseriert (1).

Zellkultur und Transfektion: HeLa-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PSG, bei 37 °C, 5 % CO2 kultiviert. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von 10 μg DNA/10 Zellen bei ∞Ω, 975 mF, 310 V, transfiziert. Zellen wurden in frischen Medien für 24 Stunden nach der Transfektion rekultiviert.

Magnetsortierung und Durchflusscytometrie: Zellen wurden unter Verwendung von 2 mM EDTA in PBS 24 Stunden nach der Transfektion abgelöst. Diese Zellen wurden dann mit α-K/k.II-konjugierten Magnetperlen bei einer Konzentration von 10 μl Perlen/107 Zellen für 15 Minuten inkubiert und wurden mit MACS-Puffer (1 × PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) gewaschen. Annähernd 105 Zellen wurden genommen und mit α-K/k.II-FITC-Antikörper bei einer Konzentration von 1:200 in FACS-Puffer (1 × PBS, 2 % fötales Rinderserum, 0,5 mM EDTA) für 10 Minuten inkubiert, mit FACS-Puffer gewaschen, mit 2 % Paraformaldehyd in PBS fixiert und im Hinblick auf Transfektionseffizienz durch Ein-Farb-Durchflusscytometrie analysiert. Der Rest der an Magnetperlen gebundenen Zellen wurde durch Verwendung des doppelt positiven Selektionsprogramms auf einem AutoMACS-Magnetzellsortiergerät (Miltenyi Biotech.) sortiert. Die für die Expression des Separationsmarkers positiven Zellen wurden in Kultur zurückgegeben, und es wurde ihnen ermöglicht, sich für 24 Stunden zu erholen. Annähernd 105 der positiven Zellen wurden mit α-K/k.II-FITC-Antikörper inkubiert, wie oben für die Durchflusscytometrieanalyse der Sortiereffizienz beschrieben.

HeLa-Zellen wurden mit pMACS-K/k-H1-Rad17 und pMACS-K/k-H1 durch Elektroporation transfiziert. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen abgelöst, mit α-K/k.II-Magnetperlen inkubiert und durch AutoMACS sortiert. Fraktionen der Zellpopulationen vor und nach dem Sortieren wurden mit α-K/k.II-FITC-Antikörper für die Analyse der Transfektion und AutoMACS-Sortiereffizienzen mittels Durchflusscytometrie inkubiert. Ein-Farb-Durchflusscytometrie zeigte, dass Ausgangstransfektionseffizienzen von 49 % und 42 % für pMACS-K/k-H1 bzw. pMACS-K/k-H1-Rad17 erzielt worden sind, wenn sie mit einer scheintransfizierten Kontrolle verglichen werden (1). Analyse der positiv sortierten Zellpopulation zeigte die höchste Reinheit unserer positiv selektierten Zellpopulation. Die Population nach dem Sortieren an mit pMACS-K/k-H1 transfizierten Zellen war 97 % rein für K/k.II-Expression (2). 98 % der positiv sortierten Population an pMACS-K/k-H1-Rad17-transfizierten Zellen exprimierte K/k.II und wahrscheinlich shRNA, gerichtet auf Rad17-mRNA (2).

Western-Blotting: Zellen wurden 24 und 48 Stunden nach AutoMACS-Sortieren geerntet und wurden in Laemmlis-Puffer mit einer Konzentration von 106 Zellen/200 μl resuspendiert. Proben wurden gekocht und elektrophoretisch auf einem 10 % SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Protein wurde auf PVDF-Membran (Amersham) unter Verwendung eines halbtrockenen (semi-dry) Transfersystems (Bio-Rad) übertragen. Blots wurden in 5 % entrahmter Milch in TPBS für eine Stunde geblockt. Primärer α-Rad17-Antikörper (Santa Cruz) wurde bei 1:500 verwendet. Sekundärer Ziegen-α-Kaninchen-IgG, konjugiert an Meerrettichperoxidase (Santa Cruz) wurde bei 1:1000 angewendet. Blots wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenz-Kits (Amersham) entwickelt.

Um zu bestätigen, dass die mRNA-Translationsunterdrückung anzeigend ist für erfolgreiche RNA-Interferenz, wurden zelluläre Spiegel an Rad17-Protein quantifiziert. Zellen aus den pMACS-K/k-H1- und pMACS-K/k-H1-Rad17-positiven Populationen wurden 48 und 72 Stunden nach der Transfektion für Western-Blotting geerntet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das Rad17-spezifische shRNAs exprimierende pMACS-K/k-H1-Rad17-Plasmid signifikant zelluläre Rad17-Proteinspiegel bis zu 72 Stunden nach Plasmidtransfektion reduzierte (3). Wichtig ist, dass Rad17-Spiegel im Verhältnis zu der pMACS-K/k-H1-transfizierten Kontrolle reduziert waren, was zeigt, dass Rad17-Knockdown der shRNA-Expression zuzuschreiben war (3).

BEISPIEL II

Ein Plasmid, das verstärktes grünes fluoreszierendes Protein (EGFP) oder eine Variante davon exprimiert, wird konstruiert, worin die Expression von EGFP durch einen von der Wirtszelle erkannten konstitutiven Promotor angetrieben wird. Zusätzlich wird ein Tetracyclin-induzierbares Promotorsystem (tet-System) operabel an eine Sequenz der invertierten Wiederholung (shRNA) mit Stammsequenzen, die zu einer von dem Gen von Interesse abgeleiteten mRNA-Sequenz komplementär sind, zum Beispiel hoxb13, gekoppelt.

Zum Beispiel werden eine Sequenz des Gens von Interesse (z. B. hoxb13; ccaggagctc cctgaaaccc (SEQ ID Nr. 3)), eine Schleifensequenz (z. B. eine sechs bis neun Nukleotide lange Schleifensequenz), das Komplement der Sequenz von dem Gen von Interesse (z. B. gggtttcagg gagctcctgg (SEQ ID Nr. 4)) und ein Transkriptionsterminator operabel an den tet-Promotor gekoppelt. Folglich ist der tet-Promotor operabel gekoppelt, um eine induzierbare Expression der kleinen Haarnadel-RNA von hoxb13 bereitzustellen. Folglich wird eine shRNA durch das tet-System kodiert.

Der tet-Promotor ist in der Technik wohlbekannt. Das Tetracyclin-abhängige Regulationssystem (tet-System) ist auf der Wechselwirkung zwischen dem Tetracyclin-Transaktivator (tTA), bestehend aus der prokaryotischen TetR, fusioniert an die Aktivatordomäne des VP16-Proteins von Herpes-simplex-Virus, und dem Tetracyclin-Response-Element (TRE), bestehend aus sieben Kopien der prokaryotischen Tetracyclin-Operatorstelle (tetO), fusioniert an einen minimalen CMV-Promotor. In der Anwesenheit von Tetracylin (tet) verliert tTA seine Fähigkeit, das TRE zu binden und die Expression wird abgeschaltet.

Das tet-System-shRNA und EGFP-Expressionssystem werden in primäre neuronale Zellen transfiziert. Die Zellen werden in der Anwesenheit von tet kultiviert, wobei Wiedergewinnung und Expression des Selektionsmarkers erlaubt werden, aber die Expression der shRNA verhindert wird, und die Zellen werden dann durch Durchflusscytometrie abgetrennt. Die sortierten, EGFP-exprimierenden Zellen werden dann für die Wirkung der siRNA untersucht, zum Beispiel durch Kultur in der Abwesenheit von tet, um zu bestimmen, ob hoxb13 als ein Inhibitor der neuronalen Zellproliferation wirken könnte. Die sortierten Zellen können in zwei Pools aufgeteilt werden, jene, die EGFP exprimieren, und jenen, denen EGFP fehlt, und können verglichen werden, worin die Zellen, denen EGFP fehlt, als eine Kontrolle dienen können. In einer anderen Ausführung können EGFP-exprimierende Zellen, jedoch ohne die shRNA, als eine Kontrolle verwendet werden.

BEISPIEL III

Eine invertierte Wiederholung, operabel an einen RNA-Polymerase-III-(polIII-)-Promotor des kleinen U6-Kern-RNA-Gens (U6) gekoppelt, wird konstruiert. Die U6-gelenkte invertierte Wiederholung und ein Selektionsmarker (z. B. das ABC-Transportergen MDR 1) werden in eine Nukleinsäuresequenz kloniert. Die Nukleinsäuresequenz wird in vitro verpackt unter Verwendung von vier rekombinanten SV40-Proteinen (VP1, VP2, VP3 und agno) oder von nur VP1 alleine (Kimchi-Sarfaty et al. (2003) High Cloning Capacity of In Vitro Packaged SV40 Vectors with No SV40 Virus Sequences, Hum. Gene Ther. 14 (2): 167-177). Das in vitro verpackte SV40 wird in Wirtszellen infiziert.

Für den Transporter spezifische Antikörper werden verwendet, um Zelloberflächenexpression zu detektieren, und Zellen, die den Transporter exprimieren, werden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortieranalyse (FACS) sortiert. Sortierte Zellen, die den Selektionsmarker exprimieren, werden für die Wirkung von Gen-Silencing durch die invertierte Wiederholungssequenz untersucht.

BEISPIEL IV

Eine Bibliothek aus siRNA-produzierenden Plasmiden wird unter Verwendung von Lox/cre-vermittelter Rekombination geschaffen. Zum Beispiel wird eine Bibliothek aus shRNA-Sequenzen, wie zum Beispiel jene von Paddison et al. (2004), auf ein Plasmid der Erfindung übertragen, um die Zelltypbeschränkung, die von einem retroviralen Konstrukt auferlegt wird, zu überwinden. 4 erläutert ein Verfahren zum Transferieren einer Bibliothek aus shRNA-Sequenzen, wie zum Beispiel jene von Paddison et al. (2004), auf ein Plasmid der vorliegenden Erfindung.

Die Bibliothek aus shRNA-Sequenzen wird in 5 × 108 Zellen transformiert und sortiert unter Verwendung eines AutoMACS-Magnetzellsortierers (Miltenyi Biotech.), wie hierin beschrieben. Die für die Expression des Separationsmarkers positiven Zellen werden in Kultur zurückgegeben, und es wird ihnen erlaubt, sich für 24 Stunden zu erholen. Die positiven Zellen werden dann für eine gewünschte Aktivität gescreent.

Alternativ kann ein Separationsmarker in den retroviralen Vektor eingeführt werden, zum Beispiel der retrovirale Vektor von Paddison et al. (2004), wodurch die Abtrennung von infizierten von nicht-infizierten Zellen erlaubt wird. Solch ein Verfahren kann die Verwendung einer niedrigeren Multiplizität der Infektion erlauben und/oder unerwünschten Hintergrund reduzieren.

Sämtliche hierin zitierten Bezugnahmen, einschließlich Publikationen, Patenten und Patentanmeldungen, werden hierdurch durch Bezugnahme zu demselben Ausmaß eingeschlossen, als ob jede Bezugnahme einzeln und spezifisch als durch Bezugnahme eingeschlossen angezeigt wäre und als ob sie in ihrer Gesamtheit hierin dargelegt wären.

Während diese Erfindung in gewissen Ausführungen beschrieben worden ist, kann die vorliegende Erfindung weiter innerhalb des Geistes und Umfangs dieser Offenbarung modifiziert sein. Von dieser Anmeldung ist deshalb beabsichtigt, dass sie alle Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung unter Verwendung ihrer allgemeinen Prinzipien abdeckt. Weiter wird von dieser Anmeldung beabsichtigt, dass sie solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung abdeckt, wie sie innerhalb der bekannten oder üblichen Praxis in der Technik aufkommen, auf welche sich diese Erfindung bezieht, und welche innerhalb die Grenzen der beigefügten Ansprüche fallen. SEQUENZPROTOKOLL