Title:
Proteinbildungskomplex mit einem c-Jun-Protein, Nucleinsäure, codierend denselben und Verfahren unter Verwendung desselben
Kind Code:
B4


Abstract:

Verwendung eines Proteins der folgenden (a) oder (b):
(a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 95 bis 99, SEQ ID NOS: 1 bis 69, SEQ ID NOS: 70 bis 87, SEQ ID NOS: 88 bis 94, SEQ ID NOS: 100 bis 104, SEQ ID NOS: 105 bis 108, SEQ ID NOS: 109 bis 111, SEQ ID NOS: 112 und 113, SEQ ID NOS: 114 und 115, SEQ ID NOS: 116 und 117, SEQ ID NOS: 118 und 119, SEQ ID NOS: 120 und 121, SEQ ID NOS: 122 und 123 und SEQ ID NOS: 124 und 125,
(b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 95 bis 99, SEQ ID NOS: 1 bis 69, SEQ ID NOS: 70 bis 87, SEQ ID NOS: 88 bis 94, SEQ ID NOS: 100 bis 104, SEQ ID NOS: 105 bis 108, SEQ ID NOS: 109 bis 111, SEQ ID NOS: 112 und 113, SEQ ID NOS: 114 und 115, SEQ ID NOS: 116 und 117, SEQ ID NOS: 118 und 119, SEQ ID NOS: 120 und 121, SEQ ID NOS: 122 und 123 und SEQ ID NOS: 124 und 125 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
zur Inhibierung einer Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung ...




Inventors:
Miyamoto, Etsuko (Kanagawa, Yokohama, JP)
Horisawa, Kenichi (Kanagawa, Yokohama, JP)
Yanagawa, Hiroshi (Kanagawa, Yokohama, JP)
Application Number:
DE112004002217T
Publication Date:
04/06/2017
Filing Date:
11/19/2004
Assignee:
Tokyo University of Science Foundation (Tokyo, JP)



Other References:
Datenbank NCBI, Eintragungsnummer NP_796363.2 zu Melanoma inhibitory activity protein 3 precursor vom 01.10.2011 (nachveröffentlicht)
KANAI, Y. [u.a.]: KIF5C, a novel neuronal kinesin enriched in motor neurons. J. Neurosci. (2000) 20 (17) 6374-84
Revision History für Eintragungsnummer NP_796363.2, erste Eintragung 09.03.2003
Sequenzvergleich der Sequenz SEQ ID NO 109 mit NP_796363
Attorney, Agent or Firm:
HOFFMANN - EITLE Patent- und Rechtsanwälte PartmbB, 81925, München, DE
Claims:
1. Verwendung eines Proteins der folgenden (a) oder (b):
(a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 95 bis 99, SEQ ID NOS: 1 bis 69, SEQ ID NOS: 70 bis 87, SEQ ID NOS: 88 bis 94, SEQ ID NOS: 100 bis 104, SEQ ID NOS: 105 bis 108, SEQ ID NOS: 109 bis 111, SEQ ID NOS: 112 und 113, SEQ ID NOS: 114 und 115, SEQ ID NOS: 116 und 117, SEQ ID NOS: 118 und 119, SEQ ID NOS: 120 und 121, SEQ ID NOS: 122 und 123 und SEQ ID NOS: 124 und 125,
(b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 95 bis 99, SEQ ID NOS: 1 bis 69, SEQ ID NOS: 70 bis 87, SEQ ID NOS: 88 bis 94, SEQ ID NOS: 100 bis 104, SEQ ID NOS: 105 bis 108, SEQ ID NOS: 109 bis 111, SEQ ID NOS: 112 und 113, SEQ ID NOS: 114 und 115, SEQ ID NOS: 116 und 117, SEQ ID NOS: 118 und 119, SEQ ID NOS: 120 und 121, SEQ ID NOS: 122 und 123 und SEQ ID NOS: 124 und 125 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
zur Inhibierung einer Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt, und dem c-Jun-Protein.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Protein gemäß (a) oder (b) irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 95 bis 99, SEQ ID NOS: 1 bis 69, SEQ ID NOS: 70 bis 87, SEQ ID NOS: 88 bis 94, SEQ ID NOS: 100 bis 104, SEQ ID NOS: 105 bis 108, SEQ ID NOS: 109 bis 111, SEQ ID NOS: 112 und 113, SEQ ID NOS: 114 und 115, SEQ ID NOS: 116 und 117, SEQ ID NOS: 118 und 119, SEQ ID NOS: 120 und 121, SEQ ID NOS: 122 und 123 und SEQ ID NOS: 124 und 125 umfasst.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Protein gemäß (a) oder (b) ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
(a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 225 bis 229, SEQ ID NOS: 126 bis 199, SEQ ID NOS: 200 bis 217, SEQ ID NOS: 218 bis 224, SEQ ID NOS: 230 bis 234, SEQ ID NOS: 235 bis 238, SEQ ID NOS: 239 bis 241, SEQ ID NOS: 242 und 243, SEQ ID NOS: 244 und 245, SEQ ID NOS: 246 und 247, SEQ ID NOS: 248 und 249, SEQ ID NOS: 250 und 251, SEQ ID NOS: 252 und 253 und SEQ ID NOS: 254 und 255,
(b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 225 bis 229, SEQ ID NOS: 126 bis 199, SEQ ID NOS: 200 bis 217, SEQ ID NOS: 218 bis 224, SEQ ID NOS: 230 bis 234, SEQ ID NOS: 235 bis 238, SEQ ID NOS: 239 bis 241, SEQ ID NOS: 242 und 243, SEQ ID NOS: 244 und 245, SEQ ID NOS: 246 und 247, SEQ ID NOS: 248 und 249, SEQ ID NOS: 250 und 251, SEQ ID NOS: 252 und 253 und SEQ ID NOS: 254 und 255 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.

Description:
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die mit c-Jun in Wechselwirkung treten, Nucleinsäuren, die sie codieren und Inhibitoren, die sie verwenden, wie auch Nachweisverfahren für eine Interaktion und Screening-Verfahren.

Gegenwärtig werden genomische Nucleotidsequenzen verschiedener Organismen erhellt werden. Bei Forschungen an genomischen Sequenzen wird erwartet, dass Forschungen als Postsequenzierungsforschungen der zweiten Generation dazu in der Lage sind, die Bedeutungen der erhellten genomischen Information zu analysieren, d. h. strukturelle und funktionale Analysen von Genen und Proteinen (Nicht-Patentdokumente 1 und 2), Analysen von Protein/Protein- und Protein/Nucleinsäure-Wechselwirkungen (Nicht-Patentdokumente 3 und 4) usw. durchzuführen.

Auf der Basis von Analysen der Netzwerke von Wechselwirkungen zwischen Protein und Protein, Protein und Nucleinsäure usw. bei Postsequenzierungs-genomisch funktionalen Analysen unter Verwendung solcher Verfahren wie oben beschrieben, wird erwartet, dass Arzneimittel usw. erzeugt werden, basierend auf Entdeckungen neuer Funktionen bekannter Proteine oder wichtige biologische Enzyme, wie z. B. neue Proteine, die bis jetzt unbekannt waren.

Als Verfahren zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind die Immunpräzipitation (Nicht-Patentdokument 5), ein Pull-down-Assay, basierend auf dem GST-Fusionsprotein (Nicht-Patentdokument 6), das TAP-Verfahren (Nicht-Patentdokument 7), das Hefe-Zwei-Hybridverfahren (Nicht-Patentdokument 8) usw. bekannt. Weiterhin gibt es als Verfahren für eine umfassende Analyse der Wechselwirkungen zwischen Proteinen in Postsequenzierungs-genomischen funktionalen Analysen unter Verwendung der ”Zuordnung des Gens (Phänotyps) und Proteins (Phänotyps)”, entstanden als Werkzeug für eine evolutionäre Molekularbiologie, das in vitro-Virusverfahren (Nicht-Patentdokumente 9 und 10, Patentdokumente 1 und 2), das STABLE-Verfahren (Nicht-Patentdokument 11), das Phagendisplay-Verfahren (Nicht-Patentdokument 12), das Ribosomdisplay-Verfahren (Nicht-Patentdokument 13, Patentdokument 3), das mRNA-Peptidfusionsverfahren (mRNA-Displayverfahren, Nicht-Patentdokument 14) usw.

Weiterhin sind auch ein Oberflächenplasmon-Resonanzverfahren, Fluoreszenzresonanz-Energietransferverfahren, Fluoreszenz-Depolarisationsverfahren, evaneszentes Feld-Abbildungsverfahren, Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, Fluoreszenzabbildungsverfahren, Enzym-gebundener Immunosorbent-Assay usw. ebenfalls bekannt. Weiterhin wurden frühe Verfahren für eine Modifikation der C-terminalen Enden von Proteinen in einem Translationssystem unter Verwendung von Nucleinsäurederivaten, wie z. B. Puromycin, vorgeschlagen (Patentdokumente 4 und 5). Diese Verfahren haben Vorteile darin, dass die Funktionen der Proteine nicht so leicht beschädigt werden im Vergleich mit den konventionellen chemischen Modifikationsverfahren und dem fluoreszierenden Proteinfusionsverfahren.

Auf dem Gebiet der Life Science wurde die Sequenzanalyse des menschlichen Genoms vervollständigt und Genomforschungen stürzen sich auf funktionale Analysen von Genen im Postgenomalter. So werden innovative Arzneimittelkreationen, basierend auf einer umfassenden genomischen funktionalen Analyse usw. erwartet. Es besteht der Wunsch nach einer Technik, die eine umfassende Analyse von Genen und Proteinen ermöglicht, die bis jetzt unabhängig untersucht wurden, beispielsweise eine Technik zur Analyse verschiedener Co-Faktoren von Transkriptionskontrollfaktoren als Zielproteine in einer Arzneimittelerzeugung sofort usw. Als Transkriptionskontrollfaktoren sind die c-Fos/c-Jun-Proteine wohl bekannt.

Das c-jun-Gen wurde als menschliches Homolog isoliert, dessen Aminosäuresequenz mehr als 80% Identität oder mehr mit einem Oncogen anzeigt, v-jun, das in dem Vorgelsarkomvirus 17 vorliegt (nachher wurde bekannt, dass v-jun von dem Hühnergenom abstammt und in vielen Arten konserviert ist) (Nicht-Patentdokument 15). c-jun ist ein Transkriptionskontrollfaktor, nachgewiesen in vielen Zytomen als ein typisches ”immediate early”-Gen im Zusammenhang mit einem Proliferationsstimulus. Als bekannte Familiengene sind junB und junC bekannt. Die Erzeugung einer null-mutierten Maus durch Gentargeting und Analyse, durchgeführt von Hilbert et al., bestätigte, dass Mäuse, denen c-Jun fehlte, eine beeinträchtigte Hepatogenese zeigen, was embryonisch lethal ist. Dies legt eine essentielle Beteiligung des c-jun-Gens an der Hepatogenese nahe (Nicht-Patentdokument 16).

Es ist bekannt, dass c-Jun eine Transaktivierungsdomäne aufweist, die die Transkription kontrolliert, und zwar am N-terminalen Ende und eine bZIP-Domäne, die ein Homo/Heterodimer bildet und ein DNA-Element bindet, und zwar am C-terminalen Ende (Nicht-Patentdokument 17). Kürzlich ergab ein Screening durch das Zwei-Hybrid-Verfahren das BAF60a, eine Untereinheit des SWI/SNF-Chromatin-Remodellierungskompexes mit dem c-Fos/c-Jun-Komplex in Wechselwirkung tritt (Nicht-Patentdokument 18), und es wird langsam bekannt, dass die Genexpressionsregulation durch c-Jun ein komplizierter Mechanismus durch strukturelle Veränderungen von Chromatin ist, und nicht ein einfaches Transkriptionsmodell. Da es viele Faktoren gibt, die mit c-Jun in Wechselwirkung treten, gibt es eine hohe Möglichkeit, dass c-Jun eine wichtige Rolle als Nabe von Protein-Protein-Wechselwirkungen beim Erhalt des komplizierten Mechanismus spielt. Die Regulation von Chromatin ist ein essentieller Mechanismus, der an der Entwicklung und Differenzierung beteiligt ist und mit verschiedenen Erkrankungen einschließlich Krebs assoziiert ist. So wird eine umfassende Analyse von Faktoren, die mit c-Jun in Wechselwirkung treten, eine wichtige Auswirkung nicht nur auf grundlegende Studien, sondern auch auf die Erzeugung von Arzneimitteln haben. Eine solche eingehende 1:1-Molekülanalyse-Technik als Zwei-Hybrid-Verfahren benötigt jedoch einen enormen Zeitaufwand und ist daher nicht praktisch.

<Nicht-Patentdokument 1>

  • Saegusa A., Nature, 401, 6751 (1999)

<Nicht-Patentdokument 2>

  • R. Dalton, A. Abbott, Nature, 402, 6763 (1999)

<Nicht-Patentdokument 3>

  • Etsuko Miyamoto, Hiroshi Yanagawa, Series Genome Science of Post-sequencing 3, Proteomics, S. 136–145 (2000)

<Nicht-Patentdokument 4>

  • Etsuko Miyamoto, Hiroshi Yanagawa, PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, 46(2), S. 138–147 (2001)

<Nicht-Patentdokument 5>

  • Xiong et al., Nature, 366, 701–704 (1993)

<Nicht-Patentdokument 6>

  • Kaelin et al., Cell, 64, 521–532 (1991)

<Nicht-Patentdokument 7>

  • Guillaume Rigaut et al., Nature Biotechnology, 17, 1030 (1999)

<Nicht-Patentdokument 8>

  • S. Fields, O. Song, Nature 340, 245 (1989)

<Nicht-Patentdokument 9>

  • E. Miyamoto-Sato et al., Viva Origino, 25, 35 (1997)

<Nicht-Patentdokument 10>

  • N. Nemoto et al., FEBS Lett., 414, 405 (1997)

<Patentdokument 1>

  • Internationale Veröffentlichung WO 98/16636

<Patentdokument 2>

  • Internationale Veröffentlichung WO 02/46395

<Nicht-Patentdokument 11>

  • N. Doi, H. Yanagawa, FEBS Lett., 457, 227 (1999)

<Nicht-Patentdokument 12>

  • G. P. Smith, Science, 228, 1315 (1985)

<Nicht-Patentdokument 13>

  • L. C. Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9022–9026 (1994)

<Patentdokument 3>

  • Internationale Veröffentlichung WO 95/11922

<Nicht-Patentdokument 14>

  • R. W. Roberts und J. W. Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297 (1997)

<Patentdokument 4>

  • US-Patent Nr. 6,228,994

<Patentdokument 5>

  • Internationale Veröffentlichung WO 02/48347

<Nicht-Patentdokument 15>

  • D. Bohmann; T. J. Bos; A. Admon; T. Nishimura; P. K. Vogt; R. Tjian; Science 238, 1386–1392 (1987)

<Nicht-Patentdokument 16>

  • F. Hilberg; A. Aguzzi; N. Howells; E. F. Wagner; Nature 365, 179–181 (1993)

<Nicht-Patentdokument 17>

  • Y. Chinenov, T. K. Kerppola, Oncogene. 20, 2438–2452 (2001)

<Nicht-Patentdokument 18>

  • T. Ito, M. Yamauchi, M. Nishina, N. Yamamichi, T. Mizutani, M. Ui, M. Murakami, H. Iba, J. Biol. Chem. 276, 2852–2857 (2001)

Offenbarung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Komplexes, der mit dem c-Jun-Protein, das als Transkriptionskontrollfaktor wohl bekannt ist, als Zielprotein in Wechselwirkung tritt.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten umfassende Analysen der Transkriptionskontrollfaktorkomplexe in einer Mausgehirn-cDNA-Bibliothek mit c-Jun als Köder unter Verwendung von zwei Techniken durch, dem Cotranslations-Screening von in vitro-Virus (IVV) und dem C-terminalen Markierungsverfahren (US-Patent Nr. 6,228,994, WO 02/48347), bezeichnet als Puromycin-Technologien, die auf der Basis des vorher erwähnten in vitro-Virusverfahrens als Verfahren für eine umfassende Analyse als ein Eins-zu-Multiple-Molekül-Analyse-Verfahren untersucht wurde, das das Verfahren ersetzt, und dadurch versucht, Proteine zu analysieren, die bis jetzt unbekannt waren, Proteine, die bis jetzt bekannt waren, von jenen jedoch nicht bekannt war, dass sie einen Komplex mit dem c-Jun-Protein bildeten usw. Die Terminologie ”ein Protein, das einen Komplex bildet”, wie hier verwendet, betrifft ein Protein, das direkt oder indirekt mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Proteins, das mit c-Jun in Wechselwirkung tritt und eines Inhibitors unter Verwendung desselben, wie auch ein Verfahren zum Nachweis einer Wechselwirkung und ein Screening-Verfahren.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben neue Proteine gefunden, die mit c-Jun in Wechselwirkung treten, durch Cotranslations-Screening unter Verwendung von IVV, und haben auch festgestellt, dass bestimmte bekannte Proteine mit c-Jun in Wechselwirkung traten und vervollständigten so die vorliegende Erfindung. Die vorliegende Erfindung stellt so das folgende bereit:

  • (1) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 1 bis 69,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 1 bis 69 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von einer oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (2) Inhibitor gemäß Punkt 1, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 1 bis 69 umfasst.
  • (3) Inhibitor gemäß Punkt 2, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 126 bis 199,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 126 bis 199 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (4) Inhibitor gemäß Punkt 3, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 126 bis 199 umfasst.
  • (5) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, das folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b'):
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 1 bis 69,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 1 bis 69 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 126 bis 199,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 126 bis 199 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (6) Verfahren gemäß Punkt 5, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 1 bis 69 umfasst.
  • (7) Verfahren gemäß Punkt 5, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 126 bis 199 umfasst.
  • (8) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 5 bis 7 umfasst; und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (9) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden a) oder b) als Wirkstoff umfasst:
  • a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 70 bis 87,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 70 bis 87 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (10) Inhibitor gemäß Punkt 9, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 70 bis 87 umfasst.
  • (11) Inhibitor gemäß Punkt 9, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 200 bis 217,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 200 bis 217 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (12) Inhibitor gemäß Punkt 11, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 200 bis 217 umfasst.
  • (12) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 70 bis 87,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 70 bis 87 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von einem oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 200 bis 217,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 200 bis 217 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (14) Verfahren gemäß Punkt 13, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 70 bis 87 umfasst.
  • (15) Verfahren gemäß Punkt 13, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 200 bis 217 umfasst.
  • (16) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 13 bis 15 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (17) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 88 bis 94,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 88 bis 94 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (18) Inhibitor gemäß Punkt 17, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 88 bis 94 umfasst.
  • (19) Inhibitor gemäß Punkt 17, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 218 bis 224,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 218 bis 224 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (20) Inhibitor gemäß Punkt 19, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 218 bis 224 umfasst.
  • (21) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b'):
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 88 bis 94,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 88 bis 94 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 218 bis 224,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 218 bis 224 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (22) Verfahren gemäß Punkt 21, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 88 bis 94 umfasst.
  • (23) Verfahren gemäß Punkt 21, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 218 bis 224 umfasst.
  • (24) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 23 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (25) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 95 bis 99,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 95 bis 99 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (26) Inhibitor gemäß Punkt 25, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 95 bis 99 umfasst.
  • (27) Inhibitor gemäß Punkt 25, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 225 bis 229,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 225 bis 229 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (28) Inhibitor gemäß Punkt 27, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 225 bis 229 umfasst.
  • (29) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b'):
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 95 bis 99,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 95 bis 99 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 225 bis 229,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 225 bis 229 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (30) Verfahren gemäß Punkt 29, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 95 bis 99 umfasst.
  • (31) Verfahren gemäß Punkt 29, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 225 bis 229 umfasst.
  • (32) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 29 bis 31 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (33) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 100 bis 104,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 100 bis 104 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (34) Inhibitor gemäß Punkt 33, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 100 bis 104 umfasst.
  • (35) Inhibitor gemäß Punkt 33, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 230 bis 234,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 230 bis 234 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (36) Inhibitor gemäß Punkt 35, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 230 bis 234 umfasst.
  • (37) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b):
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 100 bis 104,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 100 bis 104 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 230 bis. 234,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 230 bis 234 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (38) Verfahren gemäß Punkt 37, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 100 bis 104 umfasst.
  • (39) Verfahren gemäß Punkt 37, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 230 bis 234 umfasst.
  • (40) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 37 bis 39 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (41) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 105 bis 108,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 105 bis 108 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (42) Inhibitor gemäß Punkt 41, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 105 bis 108 umfasst.
  • (43) Inhibitor gemäß Punkt 41, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 235 bis 238,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 235 bis 238 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (44) Inhibitor gemäß Punkt 43, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 235 bis 238 umfasst.
  • (45) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b'):
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 105 bis 108,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 105 bis 108 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 235 bis 238,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 235 bis 238 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (46) Verfahren gemäß Punkt 45, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 105 bis 108 umfasst.
  • (47) Verfahren gemäß Punkt 45, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 235 bis 238 umfasst.
  • (48) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 45 bis 47 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (49) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 109 bis 111,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 109 bis 111 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (50) Inhibitor gemäß Punkt 49, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 109 bis 111 umfasst.
  • (51) Inhibitor gemäß Punkt 49, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 239 bis 241,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 239 bis 241 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (52) Inhibitor gemäß Punkt 51, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 239 bis 241 umfasst.
  • (53) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b'):
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 109 bis 111,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 109 bis 111 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 239 bis 241,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 239 bis 241 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (54) Verfahren gemäß Punkt 53, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 109 bis 111 umfasst.
  • (55) Verfahren gemäß Punkt 53, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 239 bis 241 umfasst.
  • (56) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 53 bis 55 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (57) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 112 bis 113,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 112 oder 113 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (58) Inhibitor gemäß Punkt 57, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 112 oder 113 umfasst.
  • (59) Inhibitor gemäß Punkt 57, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 242 oder 243,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 242 bis 243 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (60) Inhibitor gemäß Punkt 59, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 242 bis 243 umfasst.
  • (61) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 112 oder 113,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 112 oder 113 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 242 oder 243,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 242 oder 243 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (62) Verfahren gemäß Punkt 61, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 112 oder 113 umfasst.
  • (63) Verfahren gemäß Punkt 61, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 242 oder 243 umfasst.
  • (64) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 61 bis 63 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (65) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 114 oder 115,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 114 oder 115 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (66) Inhibitor gemäß Punkt 65, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 114 oder 115 umfasst.
  • (67) Inhibitor gemäß Punkt 65, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b)
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 244 bis 245,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 244 bis 245 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (68) Inhibitor gemäß Punkt 67, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 244 oder 245 umfasst.
  • (69) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b'):
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 114 oder 115,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 114 oder 115 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 244 oder 245,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 244 oder 245 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (70) Verfahren gemäß Punkt 69, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 114 oder 115 umfasst.
  • (71) Verfahren gemäß Punkt 69, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 244 bis 245 umfasst.
  • (72) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 69 bis 71 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (73) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 116 oder 117,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 116 oder 117 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (74) Inhibitor gemäß Punkt 73, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 116 oder 117 umfasst.
  • (75) Inhibitor gemäß Punkt 73, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 246 oder 247,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 246 oder 247 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (76) Inhibitor gemäß Punkt 75, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 246 oder 247 umfasst.
  • (77) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 116 oder 117,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 116 oder 117 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 246 oder 247,'
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 246 oder 247 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (78) Verfahren gemäß Punkt 77, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 116 oder 117 umfasst.
  • (79) Verfahren gemäß Punkt 77, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 246 oder 247 umfasst.
  • (80) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 77 bis 79 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (81) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 118 oder 119,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 118 oder 119 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (82) Inhibitor gemäß Punkt 81, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 118 oder 119 umfasst.
  • (83) Inhibitor gemäß Punkt 81, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 248 oder 249,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 248 oder 249 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (84) Inhibitor gemäß Punkt 83, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 248 oder 249 umfasst.
  • (85) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b'):
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 118 oder 119,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 118 oder 119 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 248 oder 249,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 248 oder 249 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (86) Verfahren gemäß Punkt 85, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 118 oder 119 umfasst.
  • (87) Verfahren gemäß Punkt 61, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 248 oder 249 umfasst.
  • (88) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachwisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 85 bis 88 umfasst, und den Schritt der Selektion eine Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (89) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 120 oder 121,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 120 oder 121 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (90) Inhibitor gemäß Punkt 89, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 120 oder 121 umfasst.
  • (91) Inhibitor gemäß Punkt 89, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 250 oder 251,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 250 oder 251 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (92) Inhibitor gemäß Punkt 91, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 250 oder 251 umfasst.
  • (93) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b'):
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 120 oder 121,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 120 oder 121 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 250 oder 251,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 250 oder 251 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (94) Verfahren gemäß Punkt 93, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 120 oder 121 umfasst.
  • (95) Verfahren gemäß Punkt 93, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 250 oder 251 umfasst.
  • (96) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 93 bis 95 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (97) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 122 oder 123,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 122 oder 123 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (98) Inhibitor gemäß Punkt 97, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 122 oder 123 umfasst.
  • (99) Inhibitor gemäß Punkt 97, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 122 oder 123,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 252 oder 253 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (100) Inhibitor gemäß Punkt 99, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 252 oder 253 umfasst.
  • (101) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b'):
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 122 oder 123,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 122 oder 123 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 252 oder 253,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 252 oder 253 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (102) Verfahren gemäß Punkt 101, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 122 oder 123 umfasst.
  • (103) Verfahren gemäß Punkt 101, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 252 oder 253 umfasst.
  • (104) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 101 bis 103 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.
  • (105) Inhibitor für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein, das mit einem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt und dem c-Jun-Protein, der ein Protein der folgenden (a) oder (b) als Wirkstoff umfasst:
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 124 oder 125,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 124 oder 125 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (106) Inhibitor gemäß Punkt 105, wobei das Protein als Wirkstoff irgendeine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 124 oder 125 umfasst.
  • (107) Inhibitor gemäß Punkt 105, wobei das Protein ein Protein ist, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a) oder (b):
  • (a) eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 254 oder 255,
  • (b) eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 254 oder 255 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (108) Inhibitor gemäß Punkt 107, wobei die Nucleinsäure irgendeine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 254 oder 255 umfasst.
  • (109) Nachweisverfahren einer Wechselwirkung zwischen einem Köder und einer Beute, was folgendes umfasst: der Köder und die Beute werden miteinander kontaktiert und ein Komplex wird nachgewiesen, gebildet durch den Kontakt, wobei der Köder ein Protein der folgenden (a) oder (b) ist oder ein Protein, translatiert von einer Nucleinsäure der folgenden (a') oder (b')
  • (a) ein Protein, umfassend irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 124 oder 125,
  • (b) ein Protein, das irgendeine der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 124 oder 125 umfasst, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäureresten und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt,
  • (a') eine Nucleinsäure, umfassend irgendeine der Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOS: 254 bis 255,
  • (b') eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure hybridisiert, umfassend eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 254 oder 255 unter stringenten Bedingungen und ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt.
  • (110) Verfahren gemäß Punkt 109, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 124 oder 125 umfasst.
  • (111) Verfahren gemäß Punkt 109, wobei die Nucleinsäure eine der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 254 oder 255 umfasst.
  • (112) Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, das den Nachweisschritt einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Verfahren gemäß einem der Punkte 109 bis 111 umfasst, und den Schritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wird.

Kurze Erklärung der Zeichnungen

[1] Diese zeigt kollektiv Informationen für Aminosäuresequenz, Gensequenz usw. des Proteins der vorliegenden Erfindung. Jeder der Zahlen in Klammern nach der DNA-Sequenzzahlen zeigt die Zahl der dadurch codierten Aminosäuresequenz an. Eine Zahl mit einer Unterzahl bedeutet, dass die DNA dieselbe Aminosäuresequenz codiert, jedoch eine unterschiedliche Nucleotidsequenz aufweist.

[2] Sie zeigt den Umriss des Cotranslations-Screening-verfahrens unter Verwendung einer IVV-statistischen Bibliothek, wobei es sich um ein Verfahren zum Nachweis der Proteine und Gene der vorliegenden Erfindung und ihrer Nucleotidsequenzen handelt. Eine IVV-statistische Bibliothek des Mausgehirns und c-Jun als Köder wurden verwendet, um ein zellfreies Cotranslations-Screening durchzuführen, und die Bibliothek wurde nach dem Screening durch RT-PCR amplifiziert und dann einem zellfreien Cotranslations-Screening wiederum mit dem Köder unterworfen. Diese Prozedur wurde dreimal wiederholt, um die Proteine und Gene der vorliegenden Erfindung und ihre Nucleotidsequenzen nachzuweisen.

[3] Sie zeigt die statistische Priming-Bibliothek von IVV, verwendet zum Nachweis der Proteine und Gene der vorliegenden Erfindung und ihrer Nucleotidsequenzen und einen Umriss des Verfahrens, um sie zu erzeugen. Unter Verwendung einer RNA-Bibliothek als Matrize und eines Zufalls-Primers, beinhaltend eine Zufallssequenz, bestehend aus neun Nucleotiden und eine spezifische Sequenz (tag2-Sequenz) in dem statistischen Priming-Verfahren wird eine Bibliothek von einzelsträngigen cDNAs (ssDNA) komplementär zu den mRNAs durch reverse Transkription synthetisiert (I). Nur RNAs werden in den Doppelsträngen der cDNA und RNA mit RNaseH abgebaut, gleichzeitig werden DNAs, komplementär zu den cDNAs mit DNA-Polymerase I synthetisiert und weiterhin wird ein Nick, der zwischen den mit DNA-Polymerase I synthetisierten DNAs existiert unter Verwendung einer DNA-Ligase zur Synthese einer doppelsträngigen (dsDNA) Bibliothek (II) modifiziert. Die synthetisierten doppelsträngigen cDNAs haben eine Phosphatgruppe am 5'-Ende, nur auf der Seite, synthetisiert mit der DNA-Polymerase I, und daher wird dieses verwendet, um einen Adaptor zu ligieren, der eine spezifische Sequenz aufweist (5'-UTR = Promotor + Enhancer), wobei eine DNA-Ligase verwendet wird, um eine ligierte dsDNA-Bibliothek (III) zu synthetisieren. Eine PCR wird unter Verwendung des Adaptors und der spezifischen Sequenz des Zufallsprimers durchgeführt, um eine cDNA-Bibliothek von Zuordnungsmolekülen herzustellen, die die Sequenzen eines Promotors und eines Enhancers am 5'-Ende und eines A-Schwanzes am 3'-Ende aufweisen (IVV cDNA-Bibliothek) (IV). Dann wird die IVV-cDNA-Bibliothek transkribiert, um eine IVV RNA-Bibliothek zu bilden (V), ein Spacer für die Herstellung von IVV wird ligiert (VI) und weiter wird dies in ein zellfreies Translationssystem oder ähnliches translatiert, um eine Bibliothek von Zuordnungsmolekülen zu bilden (VII).

[4] Sie zeigt das Ergebnis der Verifikation der Wechselwirkungen der Proteine und Gene der vorliegenden Erfindung (elektrophoretische Fotografien) und der Nucleotidsequenzen davon.

  • A: Es wurde durch das C-terminale Markierungsverfahren in einem Weizen-zellfreien Translationssystem bestätigt, dass die Proteine von SEQ ID NOS: 18 (SNAP19), 76 (KINN), 93 (Kif5a), 99 (Eef1d), 102 (Nef3), 106 (Jip-c3.1), 110 (Jip-c1), 113 (EB2), 115 (Cspg6), 117 (Mapk8ip3), 119 (Jip-c3.2), 121 (GFAP), 123 (Jip-c8) und 125 (Kif5b) (1) von den Nucleinsäuresequenzen der SEQ ID NOS: 143, 206, 223, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249 und 253 exprimiert wurden. Spuren 1 bis 14: Proteine von SEQ ID. NOS: 18 (SNAP19), 76 (KINN), 93 (Kif5a), 99 (Eef1d), 102 (Nef3), 106 (Jip-c3.1), 110 (Jip-c1), 113 (EB2), 115 (Cspg6), 117 (Mapk8ip3), 119 (Jip-c3.2), 121 (GFAP), 123 (Jip-c8) und 125 (Kif5b).
  • B: Als Verifikationsexperiment der Wechselwirkungen der erhaltenen Proteine und c-Jun wurden direkte Wechselwirkungen mit c-Jun durch Pull-down unter Verwendung C-terminal markierter Proteine mit den Aminosäuresequenzen der Proteine von SEQ ID NOS: 18 (SNAP19), 76 (KINN), 93 (Kif5a), 106 (Jip-c3.1), 110 (Jip-c1), 113 (EB2), 115 (Cspg6), 117 (Mapk8ip3), 119 (Jip-c3.2) und 123 (Jip-c8) bestätigt, basierend auf den Nucleinsäuresequenzen von SEQ ID NOS: 143, 206, 223, 236, 240, 243, 245 und 249. Gruppe 1: SEQ ID No: 18 (SNAP19), Gruppe 2: 76 (KINN), Gruppe 3: 93 (Kif5a), Gruppe 6: 106 (Jip-c3.1), Gruppe 7: 110 (Jip-c1), Gruppe 8: 113 (EB2), Gruppe 9: 115 (Cspg6), Gruppe 10: 117 (Mapk8ip3), Gruppe 11: 119 (Jip-c3.2) und Gruppe 13: 123 (Jip-c8); a und b: mit und ohne Köder-c-Jun (Spuren 1, 2 und 3: Translationsprodukt, Überstandfraktion und eluierte Fraktion).

[5] Sie zeigt das Ergebnis der Verifikation der Konzentrationsrate und indirekten Wechselwirkung der Gene der vorliegenden Erfindung. Um Konzentrationen von 14 Arten von Proteinen zu bestätigen mit den SEQ ID NOS: 18 (SNAP19), 76 (KINN), 93 (Kif5a), 99 (Eef1d), 102 (Nef3), 106 (Jip-c3.1), 110 (Jip-c1), 113 (EB2), 115 (Cspg6), 117 (Mapk8ip3), 119 (Jip-c3.2), 121 (GFAP), 123 (Jip-c8) und 125 (Kif5b) wurde eine Echtzeit-PCR unter Verwendung von Nucleinsäuresequenzen von SEQ ID NOS: 143, 206, 223, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249 und 253 durchgeführt.

[6] Sie zeigt den Umriss des primären und sekundären Screenings bei der Analyse der Wechselwirkung von IVV mit Substanzen oder Proteinen unter Verwendung der Proteine und Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung. Es ist möglich, Wechselwirkungen mit den Substanzen und Proteinen in dem primären Screening unter Verwendung der Proteine und Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung nachzuweisen und weiterhin die Details der Wechselwirkung im sekundären Screening unter Verwendung von FCCS, Mikroarrays oder ähnlichem zu analysieren. Weiterhin können die Proteine und Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung auch unabhängig für die Analyse der Wechselwirkung mit den Substanzen oder Proteinen unter Verwendung von FCCS, Mikroarray oder ähnlichem als IVV oder C-terminal markierte Proteine verwendet werden. Weiterhin ist es auch möglich, sie auf evolutionäre molekulare Manipulation unter Verwendung von IVV der Proteine oder Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung anzuwenden und sie zu verwerten, um funktionelle Proteine in dem primären Screening zu erzeugen. In einem solchen Fall ist es auch möglich, Details von Wechselwirkungen der erzeugten funktionellen Proteine mit einer Kombination aus primärem und sekundärem Screening zu analysieren.

[7] Sie zeigt Konfigurationen einer Translationsmatrize (A), wie auch eines Codierungsmoleküls (B) und eines Spacer-Moleküls (C), die Konstituenten der Matrize sind. Die Translationsmatrize besteht aus einem codierenden Bereich, abgeleitet von dem codierenden Molekül und einem Spacer-Bereich, abgeleitet von dem Spacer-Molekül. F1 und F2 repräsentieren einen fluoreszierenden Farbstoff.

[8] zeigt Konfigurationen eines Proteins, modifiziert am C-terminalen Ende (C-terminal markiertes Protein) (A), einer Translationsmatrize der vorliegenden Erfindung (B) und eines Modifikationsmittels (C).

[9] Sie zeigt den Umriss der Bildung eines Komplexes durch eine zellfreie Cotranslation.

  • A: Sowohl Köder als auch Beute werden in einem zellfreien Translationssystem translatiert, um miteinander in Wechselwirkung zu treten, um einen Komplex in dem zellfreien Translationssystem zu bilden. Die Beute kann in Einzelzahl (I) oder multipler Zahl (II) existieren und kann ein Polypeptid sein, selbst erhältlich durch Translation im zellfreien Translationssystem oder ein Zuordnungsmolekül (gebundene Substanz).
  • B: In Gegenwart des Köders wird die Beute in einem zellfreien Translationssystem translatiert, um mit dem Köder in Wechselwirkung zu treten und dadurch einen Komplex in dem zellfreien Translationssystem zu bilden. Die Beute kann in Einzahlzahl (I) oder vielfacher Zahl (II) existieren und kann ein Polypeptid sein, das selbst durch Translation in dem zellfreien Translationssystem erhältlich ist oder ein Zuordnungsmolekül (gebundene Substanz).

[10] Sie zeigt den Umriss einer Bildung eines Komplexes durch zellfreie Cotranslation unter Verwendung eines komplexierten Köders.

Sowohl der Köder als Teil, der den komplexierten Köder bildet als auch die Beute werden in dem zellfreien Translationssystem translatiert und treten in Wechselwirkung, um einen Komplex in dem zellfreien Translationssystem zu bilden. Die Beute kann in einzelner Zahl (I) oder vielfacher Zahl (II) existieren und kann ein Polypeptid sein, das selbst durch Translation in dem zellfreien Translationssystem erhältlich ist oder ein Zuordnungsmolekül (gebundene Substanz). Weiterhin ist der komplexierte Köder nicht auf die Kombination eines Polypeptids, translatiert in einem zellfreien Translationssystem und einen DNA-Köder, wie dargestellt in der Zeichnung, begrenzt und kann beispielsweise eine Kombination aus einem multiplen oder einzelnen Polypeptid sein, translatiert in einem zellfreien Translationssystem und einem multiplen oder einfachen Köder, coexistierend in dem zellfreien Translationssystem (z. B. DNA-Köder usw.) oder ähnliches.

[11] Sie zeigt den Umriss des Screening-Verfahrens für einen Komplex, basierend auf zellfreier Cotranslation.

Durch den Schritt (1) der Bildung eines Komplexes auf der Basis der zellfreien Cotranslation, wie dargestellt in den 9 und 10, können der Schritt (2) des Screening der Beute des Komplexes und der Schritt (3) der Analyse der Beute, die zellfreie Cotranslation und das Screening vollständig in vitro realisiert werden. Wenn die Beute ein Zuordnungsmolekül ist und in multipler Zahl existiert, kann das Screening wiederum von Schritt (1) wiederholt werden, durch Rekonstruktion von mRNA oder DNA, codierend die Beute durch RT-PCR oder PCR. Weiterhin kann, nach Analyse der erhaltenen Beute, neuerlich von Schritt (1) unter Verwendung der Beute als Köder das Screening wiederholt werden.

Beste Ausführungsform der Erfindung<1> Proteine der vorliegenden Erfindung

In dieser Beschreibung werden Proteine, von denen festgestellt wurde, dass sie mit c-Jun in Wechselwirkung treten, einschließlich neuer Proteine für eine einfachere Erklärung, ”Proteine der vorliegenden Erfindung” genannt.

Die erste Gruppe von Proteinen der vorliegenden Erfindung besteht aus Proteinen, deren Funktion bekannt ist, deren Funktion einer Wechselwirkung mit c-Jun jedoch neu ist. Diese Proteine sind nicht irgendwelche Proteine, von denen bis jetzt bekannt war, dass sie einen Komplex mit c-Jun bilden (Yurii Chinenovl und Tom K. Kerppola, Oncogene (2001), 20, 2438–2452). Spezifisch ist, wie dargestellt in 1, SNAP19(SNAPc5), korrespondierend zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 1 bis 69, eine der Untereinheiten des SNAP-Komplexes, der an PSE bindet, einem Promotor von snRNA, transkribiert durch polII und polIII, wodurch die Transkription reguliert wird (Henry, R. W.; Mittal, V.; Ma, B.; Kobayashi, R.; Hernandez, N., Genes Dev. 12: 2664–2672, 1998. (PubMed ID: 9732265)). Kif5c, korrespondierend zu den Aminosäuresequenzen SEQ ID NOS: 70 bis 87 ist ein Molekül der Kinesin-Superfamilie, wobei es sich um ein motorisches Protein handelt, involviert an dem Substanztransport zusammen mit Mikrotubuli. Es ist bekannt, dass es im Gehirn hoch exprimiert wird (Nagase, T.; Ishikawa, K.; Miyajima, N.; Tanaka, A.; Kotani, H.; Nomura, N.; Ohara, O. DNA Res. 5: 31–39, 1998. (PubMed ID: 9628581)). Kif5a, korrespondierend zur Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 88 bis 94 ist ein Molekül der Kinesin-Superfamilie, wobei es sich um motorisches Protein handelt, beteiligt am Substanztransport zusammen mit Mikrotubuli. Es ist bekannt, dass seine Mutation zu erblicher spastischer Paraplegie führt (Niclas, J.; Navone, F.; Hom-Booher, N.; Vale, R. D. Neuron 12: 1059–1072, 1994. (PubMed ID: 7514426)). Eef1d, korrespondierend zu Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 95 bis 99 ist als Protein bekannt, das die Elongation der Translation reguliert, und es wurde kürzlich gezeigt, dass es auch ein Produkt eines Gens ist, das mit Krebs und Tumor in Beziehung steht (Joseph, P.; Lei, Y. X.; Whong, W. Z.; Ong, T. M., J. Biol. Chem. 277: 6131–6136, 2002. (PubMed ID: 11711542)). Nef3, korrespondierend zur Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 100 bis 104, ist eines der drei Moleküle, die neuronenspezifische intermediäre Filamente bilden und ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 125 kD (Levy, E.; Liem, R. K. H.; D'Eustachio, P.; Cowan, N. J. Europ. J. Biochem. 166: 71–77, 1987. (PubMed ID: 3036526)). EB2, korrespondierend zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 112 bis 113 ist APC-Bindungsprotein EB2 (Mapre3) und ist eines der EB1-Familie, von der bekannt ist, dass sie mit APC in Wechselwirkung treten, um kooperativ die Aggregation der Mikrotubuli zu unterstützen (Su, L.-K.; Qi, Y.: Characterization of human MAPRE genes and their proteins. Genomics 71: 143–149, 2001). Cspg6, korrespondierend zur Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 114 bis 115 ist eine der Untereinheiten der Cohesinkomplexe, die eine wichtige Rolle bei der Schwester-Chromatidtrennung spielen und ist ein Protein, bestehend aus einem globulären Bereich mit einer ATPase-Aktivität und einem stäbchenförmigen Bereich (Sumara, I.; Vorlaufer, E.; Gieffers, C.; Peters, B. H.; Peters, J.-M. J. Cell Biol. 151: 749–761, 2000. (PubMed ID: 11076961)). Mapk8ip3, korrespondierend zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 116 bis 117 ist eines der Gerüstproteine, die an JNK binden, und es wird angenommen, dass es eine wichtige Rolle in der MAP-Kinasesignalkaskade spielt, vermittelt durch JNK (Dickens, M.; Davis, R. J., Molec. Cell. Biol. 20: 1030–1043, 2000. (PubMed ID: 10629060)). GFAP, korrespondierend zur Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 120 bis 121 ist eines der Bestandteile der intermediären Filamente, die in Gliazellen der Astrozytenzelllinie hoch exprimiert werden. Es hat eine spezifische Sequenz am N-terminalen Ende, und es wird angenommen, dass es eine zellspezifische Rolle spielt. Es ist ein kausales Gen für eine seltsame Erkrankung, die Alexander-Erkrankung (Bongcam-Rudloff, E.; Nister, M.; Betsholtz, C.; Wang, J.-L.; Stenman, G.; Huebner, K.; Croce, C. M.; Westermark, B., Cancer Res. 51: 1553–1560, 1991 (PubMed ID: 1847665). Kif5b, korrespondierend zur Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 124 bis 125 gehört zur Kinesinsuperfamilie, wobei es sich um ein motorisches Protein handelt, das am Substanztransport zusammen mit Mikrotubuli beteiligt ist. Es ist am Organellentransport beteiligt und eine abnormale Verteilung von Mitochondrien tritt in der KO-Maus (Tanaka, Y.; Kanai, Y.; Okada, Y.; Nonaka, S.; Takeda, S.; Harada, A.; Hirokawa, N., Cell 93: 1147–1158, 1998. PubMed ID: 9657148), Kamal, A.; Almenar-Queralt, A.; LeBlanc, J. F.; Roberts, E. A.; Goldstein, L. S. B., Nature 414: 643–648, 2001. (PubMed ID: 11740561)).

Unter diesen Proteinen sind diejenigen ohne Leucin-Zipper Nef3, EB2, GFAP und Kif5b. Diejenigen, die indirekt mit c-Jun in Wechselwirkung treten, sind Nef3 und GFAP. Alle anderen, SNAP19, Kif5c, Kif5a, Eef1d, Cspg6 und Mapk8ip3 haben den Leucin-Ziffer und bilden einen Komplex mit c-Jun.

Die zweite Gruppe der Proteine der vorliegenden Erfindung besteht aus Proteinen, deren Funktion unbekannt ist und deren Funktion einer Wechselwirkung mit c-Jun neu gefunden wurde.

Spezifisch sind dies Jip-c3.1, korrespondierend zur Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 105 bis 108, Jip-c1, korrespondend zur Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 109 bis 111, Ji-c3.2, korrespondierend zur Aminosäuresequenz SEQ ID NOS. 118 bis 119 und Jip-c8, korrespondierend zur Aminosäuresequenz SEQ ID NOS: 122 bis 123 (1). Alle diese Proteine haben den Leucin-Zipper und treten direkt in Wechselwirkung mit c-Jun.

Hiernach werden die Proteine der vorliegenden Erfindung weiter erklärt.

Unter den Proteinen der vorliegenden Erfindung sind die Proteine mit irgendeiner der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 1 bis 125 Proteine, für die festgestellt wurde, dass sie mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung treten, d. h. einen Komplex bilden, wie in den unten erwähnten Beispielen beschrieben. Für Proteine wird die Existenz eines Mutanten mit derselben Funktion allgemein erwartet. Weiterhin kann durch geeignete Modifikation einer Aminosäuresequenz eines Proteins ein Mutant mit derselben Funktion erhalten werden. Daher fallen Proteine, die irgendeine der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 1 bis 125 aufweisen, einschließlich einer Deletion, Substitution oder Addition von einem oder mehreren Aminosäureresten und die mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung treten, auch in dem Umfang der Proteine der vorliegenden Erfindung. Die Bezeichnung ”einige”, wie hier verwendet, bedeutet vorzugsweise innerhalb von 5, noch bevorzugt innerhalb von 2. Weiterhin fallen auch Proteine, die eine Homologie von in der Regel 15 oder mehr, vorzugsweise 90 oder mehr, noch bevorzugter 95 oder mehr, mit irgendeiner der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOS: 1 bis 125 zeigen, und mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung treten, auch in den Umfang des Proteins der vorliegenden Erfindung.

Eine Aminosäuresequenz eines Proteins kann durch Modifikation einer Nucleotidsequenz von DNA, codierend das Protein unter Verwendung eines wohl bekannten Mittels, wie z. B. ortsgerichteter Mutagenese und Expression der DNA, deren Nucleotidsequenz modifiziert wurde, modifiziert werden. Unter solchen modifizierten Proteinen fallen diejenigen, die mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung treten, in den Umfang des Proteins der vorliegenden Erfindung. Die Wechselwirkung mit dem c-Jun-Protein kann durch ein bekanntes Verfahren zur Messung einer Wechselwirkung gemessen werden, und Beispiele beinhalten ein Verfahren zum Nachweis der Bildung eines Komplexes, wie erwähnt in den später beschriebenen Beispielen.

Die Proteine der vorliegenden Erfindung können mit einem anderen Protein fusioniert werden und so als Fusionsprotein bereitgestellt werden.

Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung sind Nucleinsäuren, die die Proteine der vorliegenden Erfindung codieren. Die Nucleinsäuren sind in der Regel RNA oder DNA. Beispiele für die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung beinhalten Nucleinsäuren mit einer der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 126 bis 255. Diese Nucleinsäuren sind Nucleinsäuren, deren Nucleotidsequenzen in den unten erwähnten Beispielen bestimmt wurden. Für ein Gen wird die Existenz eines Gens, das dasselbe Produkt codiert, jedoch eine unterschiedliche Nucleotidsequenz aufweist oder eines Gens, codierend einen Mutanten mit derselben Funktion, erwartet. Weiterhin kann durch geeignete Modifikation einer Nucleotidsequenz ein Gen, codierend dasselbe Produkt oder ein Mutant mit derselben Funktion, erhalten werden. Daher fallen auch Nucleinsäuren mit einer Nucleotidsequenz, die einer der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 126 bis 255 ähnlich ist und die Protein codieren, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt, auch in den Umfang der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung. Beispiele für solche Nucleinsäuren mit einer ähnlichen Nucleotidsequenz beinhalten Nucleinsäuren, die mit einer Nucleinsäure hybridisieren, mit einer Nucleotidsequenz, komplementär zu einer der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 126 bis 255, unter stringenten Bedingungen und Nucleinsäuren mit einer Nucleotidsequenz, die eine Homologie von in der Regel 16% oder mehr, vorzugsweise 90% oder mehr, noch bevorzugter 95% oder mehr, zu einer der Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOS: 126 bis 255 zeigen.

Die hier genannte stringente Bedingung korrespondiert beispielsweise zu einer Hybridisierung unter Verwendung von DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics) bei 42°C, gefolgt von einem Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS für 15 Minuten bei 60°C. Die Homologie der Nucleotidsequenzen wird als Rate der Zahl von Nucleotiden erhalten, die sich in Ausrichtung der Nucleotidsequenzen, die verglichen werden sollen, paaren, zu der Nucleotidzahl der Kettenlänge der Nucleotidsequenzen. Weiterhin wird eine Homologie von Aminosäurensequenzen als Rate der Zahl von Aminosäureresten erhalten, die sich bei einer Ausrichtung der Aminosäuresequenzen, die verglichen werden sollen, paaren, zu der Aminosäurezahl der Kettenlänge der Aminosäuresequenzen.

Ob eine DNA ein Protein codiert, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt, kann einfach durch Expression eines Proteins von dieser DNA bestätigt werden und durch Bestätigung, ob das exprimierte Protein mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt, wobei das vorher erwähnte Verfahren verwendet wird.

Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können durch ein konventionelles Verfahren auf der Basis der erhellten Nucleinsequenzen erhalten werden. Zum Beispiel können sie durch ein chemisches Syntheseverfahren synthetisiert werden oder durch RT-PCR unter Verwendung von in geeigneter Weise entworfener Primer von einer mRNA, hergestellt aus Zellen oder Geweben, die ein Protein exprimieren, das mit dem c-Jun-Protein in Wechselwirkung tritt, erhalten werden.

<2> Verwendung der Proteine der vorliegenden Erfindung und andere

Die Proteine und Gene der vorliegenden Erfindung können als Inhibitor verwendet werden, der die Transkriptionsfunktion blockiert, oder die Genreplikationsfunktion usw. für c-Jun bei der Gentherapie usw. unter Verwendung der neuen Funktion, erhalten durch die Nucleinsäuresequenzen (die Funktion ermöglicht in diesem Fall die Bindung mit c-Jun). Die Basis hierfür stammt von der Tatsache, dass die Gene der Proteine der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden, nachdem sie ein kompetitives Verfahren eines Screenings durchlaufen haben, das vielfach wiederholt wurde. Gene, die durch dieses Verfahren nachgewiesen wurden, zeigen eine bestimmte Zahlverteilung, und ein Gen mit einer höheren kompetitiven Kraft wird in größerer Zahl nachgewiesen werden. Dies bedeutet, dass ein Gen, dessen Klone durch dieses Verfahren in größerer Zahl nachgewiesen wurden, eine höhere kompetitive Kraft haben sollte und effektiver als Blockierungsmittel oder Inhibitor wirken sollte.

Im Hinblick auf die Verwendung der Proteine der vorliegenden Erfindung und die diese codierenden Gene, wie in in-vitro-Anwendungen, können sie beispielsweise für evolutionäre molekularbiologische Manipulation unter Verwendung eines zellfreien Proteinsynthesesystems oder eine genomische Funktionsanalyse angewandt werden, unter Verwendung der neuen Funktionen, die durch die Proteine, Gene oder Nucleinsäuresequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. In diesem Fall ist die Analyse unter Verwendung des Cotranslations-Screenings und einer Selektion der Zuordnungsmoleküle extrem effektiv. Dies liegt daran, dass das Cotranslations-Screening/Selektionsverfahren es ermöglicht, Proteine umfassend nachzuweisen, die direkt oder indirekt mit einem Köderprotein in Wechselwirkung treten. Weiterhin können sie bei der Analyse von Wechselwirkungen zwischen IVVs, IVV und C-terminal markiertem Protein usw. als ”Zielmolekül (Köderprotein)” ebenfalls verwendet werden. Beispiele für allgemeine Verfahren zur Analyse einer Wechselwirkung beinhalten beispielsweise das Mikroarrayverfahren, eine Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS/FCCS), eine Fluoreszenzabbildungsanalyse, ein Fluoreszenz-Resonanzenergietransferverfahren, ein evaneszentes-Feld-Molekularabbildungsverfahren, ein Fluoreszenzdepolarisationsverfahren, ein Oberflächenplasmonresonanzverfahren, einen enzymgebundenen Immunosorbentassay usw. Spezifische Beispiele des zellfreien Proteinsynthesesystems beinhalten Weizenkeimextrakt, Kaninchenretikulozytenlysat, Escherichia coli S30-Extrakt usw. Durch Zugabe eines Proteins, Gens oder einer Nucleinsäuresequenz als Translationsmatrize gemäß der vorliegenden Erfindung zu irgendeinem dieser zellfreien Proteinsynthesesysteme, simultane Zugabe von 1 bis 100 μM eines Modifikationsmittels im Fall einer C-terminalen Markierung und Erhalt des Systems bei 25 bis 37°C für eine bis etliche Stunden wird ein C-terminal modifiziertes Protein synthetisiert. Im Fall der Zuordnung wird nur durch Zugabe eines Proteins, eines Gens oder einer Nucleinsäuresequenz als Translationsmatrize gemäß der vorliegenden Erfindung zu dem zellfreien Proteinsynthesesystem und Erhalt des Systems bei 25 bis 37°C für ein bis etliche Stunden ein Zuordnungsmolekül synthetisiert.

Weiterhin kann im Hinblick auf in vivo-Anwendungen unter Verwendung der neuen Funktion, bereitgestellt durch die Proteine, Gene oder Nucleinsäuresequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung, beispielsweise ein Protein, modifiziert für die Abtrennung und markiert für den Nachweis (doppelt-modifiziertes Protein), synthetisiert in einem zellfreien Proteinsynthesesystem, wie es ist für einen darauf folgenden Reinigungsprozess, Nachweisprozess oder eine direkte Einführung in Zellen, verwendet werden. Spezifische Beispiele für Zellexpressionssysteme beinhalten alle Arten von Zellen von Bakterien, wie Escherichia coli, Bacillus subtilis und thermophile Bakterien, Hefe bis hin zu kultivierten Zellen von Insekten, Säugern usw., Zellen des Fadenwurms, der Taufliege (Drosophila), des Zebrafischs, der Maus usw. Durch direkte Einführung des vorher erwähnten C-terminal markierten oder zugeordneten doppelt-modifizierten Proteins in diese Zellen kann ein Objektprotein blockiert werden. Alternativ ist es auch möglich, das vorher erwähnte Gen oder die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung einzuführen und das Gen oder die Nucleinsäure wie sie ist als Antisensesequenz oder RNAi-Sequenz zur Blockierung der Expression einer Zielnucleinsäure zu verwenden, oder sie können in einer Zelle exprimiert und als Protein oder Zuordnungsmolekül verwendet werden, um ein Protein mit einer Wechselwirkungswirkung zu blockieren. Wenn ein Protein in dem C-terminalen Markierungsverfahren verwendet wird, wird durch simultanes Einführen von 1 bis 100 μm Modifikationsmittel für das C-terminale Markieren in die Zellen unter Verwendung von Elektroporation, Mikroinjektion oder ähnlichem und Erhalt der Zellen bei optimaler Wachstumstemperatur der Zellen für etliche Stunden ein modifiziertes Protein synthetisiert. Im Fall der Zuordnung wird durch Einführung einer Matrize eines Zuordnungsmoleküls mit dem vorher erwähnten Gen oder der Nucleinsäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung in Zellen und Erhalt der Zellen bei optimaler Wachstumstemperatur der Zellen für etliche Stunden ein Zuordnungsmolekül synthetisiert. Das synthetisierte doppelt-modifizierte Protein kann durch Aufbruch der Zellen gesammelt und für die darauf folgenden Reinigungsverfahren oder Nachweisverfahren verwendet werden. Weiterhin kann es wie es ist in den Zellen für den Nachweis verwendet werden.

Hiernach wird die Verwendung der Proteine der vorliegenden Erfindung und anderer weiter erklärt.

Das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren der Verwertung der Proteine der vorliegenden Erfindung als Köder beim Nachweis der Wechselwirkung zwischen Köder und Beute.

Vorzugsweise ist das Verfahren im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass Köder und Beute auf spezifische Weise für die Trennung modifiziert und für den Nachweis markiert werden, und die Beute wird durch Translation in einem zellfreien Translationssystem in Gegenwart des Köders zum Kontakt von Köder und Beute erzeugt. In dieser Beschreibung wird das Kontaktieren eines Köders und einer Beute durch Erzeugung der Beute durch Translation in einem zellfreien Translationssystem in Gegenwart des Köders auch als ”zellfreie Cotranslation” bezeichnet.

In dieser Beschreibung haben die Bezeichnungen von ”Köder” (”bait”) und ”Beute” (”prey”) die üblicherweise auf dem technischen Gebiet der Analyse der Wechselwirkung zwischen Substanzen verwendeten Bedeutungen. Das heißt, ein Protein, eine Nucleinsäure oder ähnliches als bekannte Substanz wird ”Köder” genannt und ein Protein, Nucleinsäure oder ähnliches als Substanz, die mit dem Köder in Wechselwirkung tritt, wird ”Beute” genannt. In der vorliegenden Erfindung ist die Beute vorzugsweise ein Protein.

Der hier verwendete Köder kann das Protein der vorliegenden Erfindung sein oder ein Komplex, gebildet durch willkürliche Komponenten einschließlich eines Proteins (einschließlich eines Peptids), Nucleinsäure oder Liganden, wie z. B. einem Antikörper und Hormon, Metall usw., so lange es das Protein der vorliegenden Erfindung enthält und kann eine natürliche oder künstliche Substanz sein. Der Köder ist nicht besonders begrenzt im Hinblick auf Molekulargewicht usw. Beispiele beinhalten beispielsweise im Fall eines Proteins eine funktionale Domäne, ein Gesamtlängenprotein, enthaltend eine funktionale Domäne usw. Wenn eine Beute-Bibliothek verwendet wird, ermöglicht die Verwendung der Gesamtlängenproteine einen umfassenden Nachweis.

Weiterhin wird als Beute vorzugsweise ein Protein verwendet. Die Beute ist nicht besonders im Hinblick auf Molekulargewicht usw. begrenzt.

Vorzugsweise ist das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Nachweis einer Wechselwirkung von Köder und Beute Köder und Beute auf spezifische Weise für die Trennung modifiziert und für den Nachweis markiert werden, und die zellfreie Cotranslation wird wie oben beschrieben durchgeführt. Daher kann eine bevorzugte Konfiguration des Nachweisverfahrens der vorliegenden Erfindung dieselbe sein wie für ein übliches Verfahren zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute, umfassend das Kontaktieren von Köder und Beute, und Nachweisen eines Komplexes, gebildet durch den Kontakt, außer dass Köder und Beute auf spezifische Weise für die Trennung modifiziert und für den Nachweis markiert sind, und eine zellfreie Cotranslation durchgeführt wird.

Obwohl die Modifikation für die Trennung und die Markierung für den Nachweis von Köder und Beute willkürlich durchgeführt werden, so dass sie für den Nachweis des Komplexes geeignet sind, sollten sie so durchgeführt werden, dass nicht sowohl Köder als auch Beute mit einer Markierung für den Nachweis markiert oder für die Trennung modifiziert sind. Daher wird die Beute als Fusionsprotein mit einem Protein verwendet, das als Markierung für den Nachweis verwendet werden kann, oder einem Zuordnungsmolekül, und der Köder hat korrespondierend eine Modifikation für die Trennung.

Wenn die Beute als Fusionsprotein verwendet wird, sollte der Köder eine Modifikation für die Trennung aufweisen. Wenn der Köder ein Protein ist, wird der Köder vorzugsweise in einem zellfreien Translationssystem durch Translation einer mRNA erzeugt, codierend ein Fusionsprotein, enthaltend den Köder als Fusionsprotein mit einem Protein, das als Modifikation für die Trennung in dem zellfreien Translationssystem verwendet werden kann.

Beispiele der Modifikation für die Trennung in dem Fall, in dem der Köder ein Protein ist, beinhalten die Bildung eines Fusionsproteins mit dem GST-Protein, CBP, verwendet für das TAP-Verfahren usw. (dies kann unter Verwendung einer Affinität mit Calmodulinkügelchen getrennt werden), Protein A (dies kann unter Verwendung von einer IgG-Protein A-Affinität getrennt werden) als Protein oder irgendeiner verschiedener Antikörper-tags usw. als Affinitäts-tags. Wenn der Köder selbst eine Eigenschaft aufweist, dass er als Modifikation für die Trennung verwendet werden kann, kann der Köder wie er ist als Köder mit einer Modifikation für die Trennung verwendet werden. Beispiele der Modifikation für den Nachweis der Beute beinhalten die Bildung eines Fusionsproteins mit einem fluoreszierenden Protein, wie z. B. GFP (grün-fluoreszierendes Protein).

Die Herstellung von mRNA, die ein solches Fusionsprotein wie oben erwähnt codiert und die Translation dieser mRNA in einem zellfreien Translationssystem kann auf übliche Weise durchgeführt werden. Die mRNA kann eine mRNA sein, erzeugt durch Transkription von DNA in einem zellfreien Transkriptions- und Translationssystem.

Wenn die Beute ein Zuordnungsmolekül ist, kann eine willkürliche Modifikation für die Trennung dem Köder zugefügt werden. Wenn der Köder ein Protein ist, können die vorher erwähnten Beispiele der Modifikation für die Trennung verwendet werden. Wenn zusätzlich der Köder eine Nucleinsäure, ein Arzneimittel oder ähnliches ist, beinhalten Beispiele für die Modifikation für die Trennung die Verwendung von Biotin usw., das mit Streptavidin oder Avidin in Wechselwirkung tritt. Wenn der Köder selbst eine Eigenschaft hat, dass er als Modifikation für die Trennung verwendet werden kann, kann der Köder wie er ist als Köder mit einer Modifikation für die Trennung verwendet werden.

Ein Zuordnungsmolekül bedeutet ein Molekül, das einen Phänotyp und einen Genotyp zuordnet. Das Zuordnungsmolekül ist üblicherweise ein Molekül, umfassend ein Genotypmolekül, enthaltend eine Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz, die einen Genotyp reflektiert und ein Phänotypmolekül, enthaltend ein Protein, das in Bezug zur Expression eines Phänotyps steht, die miteinander gebunden sind. Unter Verwendung einer Beute als dieses Protein kann die Beute als Zuordnungsmolekül verwendet werden. Ein solches Zuordnungsmolekül kann durch Durchführung einer Translation von mRNA, codierend eine Beute in einem zellfreien Translationssystem gebildet werden, so dass die translatierte Beute sich mit einer mRNA assoziieren sollte oder durch Durchführung von Transkription und Translation von DNA, codierend eine Beute in einem zellfreien Transkriptions- und Translationssystem, so dass die translatierte Beute sich mit der DNA assoziieren sollte. Dadurch kann man, indem man einen Köder während der Produktion existieren lässt, eine zellfreie Cotranslation erhalten. Das heißt, die zellfreie Cotranslation kann durch das folgende Schema (1) oder (2) durchgeführt werden.

  • (1) Durch Durchführung der Translation von mRNA, codierend die Beute in Gegenwart des Köders in einem zellfreien Translationssystem, so dass die translatierte Beute sich mit der mRNA assoziieren sollte, wird die Beute in dem zellfreien Translationssystem erzeugt und dadurch werden Köder und Beute miteinander kontaktiert.
  • (2) Durch Durchführung von Transkription und Translation von DNA, codierend die Beute in Gegenwart des Köders in einem zellfreien Transkriptions- und Translationssystem, so dass sich die translatierte Beute mit der DNA assoziieren sollte, wird die Beute in dem zellfreien Translationssystem erzeugt, und dadurch werden Köder und Beute miteinander kontaktiert.

Hiernach werden die Ausführungsformen von (1) und (2) wie oben erklärt.

In der Ausführungsform von (1) assoziert sich die translatierte Beute vorzugsweise mit der mRNA, da die mRNA einen Spacer-Bereich aufweist, gebunden an das 3'-Ende und einen Peptidakzeptor-Bereich, gebunden an den Spacer-Bereich, und enthaltend eine Gruppe, die an ein Peptid durch eine Transpeptidisierungsreaktion binden kann. Beispiele für das Nachweisverfahren einer Wechselwirkung unter Verwendung eines Zuordnungsmoleküls beinhalten das in vitro-Virusverfahren.

Die mRNA ist vorzugsweise eine Nucleinsäure, enthaltend einen 5'-nicht-translatierten Bereich, einschließlich eines Transkriptionspromotors und eines Translationsenhancers, einen ORF-Bereich, codierend eine Beute und bindend an das 3'-Ende des 5'-nicht-translatierten Bereichs und einen 3'-Endbereich, einschließlich einer Poly-A-Sequenz und bindend an das 3'-Ende des ORF-Bereichs. Vorzugsweise ist eine Expressionsamplifikationssequenz, enthaltend eine SNNS-(S ist G oder C)Sequenz am 5'-Ende der Poly-A-Sequenz (beispielsweise eine Sequenz, die von dem Restriktionsenzym XhoI erkennbar ist) weiter beinhaltet. Die mRNA kann eine Cap-Struktur am 5'-Ende aufweisen oder auch nicht.

Die Poly-A-Sequenz ist eine Poly-A-kontinuierliche Kette von mindestens zwei oder mehr Resten, umfassend dA und/oder rA als einzelne Art von Resten oder eine Mischung von zwei Arten, und die Poly-A-Kette besteht aus vorzugsweise drei oder mehr Resten, noch bevorzugter 6 oder mehr Resten, besonders bevorzugt 8 oder mehr Resten.

Einer der Faktoren, die die Translationseffizienz beeinflussen, ist eine Kombination des 5'-UTR, umfassend einen Transkriptionspromotor und einen Translationsenhancer und des 3'-Endbereichs, beinhaltend eine Poly-A-Sequenz. Die Wirkung der Poly-A-Sequenz des 3'-Endbereichs wird in der Regel mit einer Länge von 10 oder weniger Resten ausgeübt. Als Transkriptionspromotor von 5'-UTR können T7/T3, SP6 usw. verwendet werden, und es ist keine besondere Begrenzung auferlegt. SP6 wird bevorzugt, und es wird besonders bevorzugt, SP6 zu verwenden, insbesondere wenn eine Sequenz, enthaltend eine Omega-Sequenz oder einen Teil einer Omega-Sequenz als Translationsenhancer-Sequenz verwendet wird. Der Translationsenhancer ist vorzugsweise ein Teil der Omega-Sequenz, und als Teil der Omega-Sequenz wird eine solche bevorzugt, enthaltend einen Teil der Omega-Sequenz von TMV (029, siehe Gallie D. R., Walbot V., Nucleic Acids Res., Band 20, 4631–4638 (1992) und WO 02/48347, 3).

Weiterhin wird für die Translationseffizienz eine Kombination der XhoI-Sequenz und einer Poly-A-Sequenz im 3'-Endbereich bevorzugt. Weiterhin wird eine Kombination des stromabwärts gelegenen Bereichs des ORF-Bereiches, d. h. des stromaufwärts gelegenen Bereiches der XhoI-Sequenz mit einem Affinitäts-tag und einer Poly-A-Sequenz bevorzugt. Die Affinitäts-tag-Sequenz kann jede Sequenz zur Verwendung als Mittel sein, das ein Protein nachweisen kann, wie z. B. eine Antigen-Antikörper-Reaktion, und es ist keine Begrenzung auferlegt. Das Affinitäts-tag ist vorzugsweise die Flag-tag-Sequenz oder His-tag-Sequenz, wobei es sich um ein tag für die Affinitätstrennanalyse handelt, basierend auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Im Hinblick auf die Wirkung der Poly-A-Sequenz erhöht ein Affinitäts-tag, wie z. B. das Flag-tag, angehaftet an die XhoI-Sequenz und weiter angehaftet an die Poly-A-Sequenz, die Translationseffizient. Im Hinblick auf das His-tag zeigt selbst ein His-tag mit einer Konfiguration, das keine XhoI-Sequenz enthält, auch eine ausreichende Translationseffizienz und ist so effektiv.

Eine solche Konfiguration, die für die Verbesserung der Translationseffizienz effektiv ist, ist auch für die Zuordnungseffizienz effektiv.

Wenn SP6 + 029 und Flag + XhoI + An (n = 8) oder His + An (n = 8), beispielsweise als 5'-UTR bzw. 3'-Endbereich verwendet werden, würden der 5'-UTR und 3'-Endbereich Längen von ungefähr 49 bp bzw. ungefähr 38 oder 26 bp aufweisen und würden so eine Länge haben, so dass sie in Primer für die PCR als Adaptorbereich eingebaut werden können. Daher kann ein Codierungsbereich mit einem solchen 5'-UTR und 3'-Endbereich einfach durch PCR von irgendeinem Vektor, Plasmid und einer cDNA-Bibliothek erzeugt werden. In dem codierenden Bereich kann die Translation jenseits des ORF-Bereichs auftreten. Das heißt, es könnte kein Stopp-Codon am Ende des ORF-Bereichs geben.

Der Peptidakzeptorbereich ist nicht besonders begrenzt, so lange er an das C-terminale Ende eines Peptids binden kann. Zum Beispiel kann Puromycin und 3'-N-Aminoacylpuromycinaminonucleosid (PANS-Aminosäuren) einschließlich PANS-Aminosäuren, korrespondierend zu allen Aminosäuren, wie z. B. PANS-Gly, worin der Aminosäureteil Glycin ist, PANS-Val, worin der Aminosäureteil Valin ist und PANS-Ala, worin der Aminosäureteil Alanin ist, verwendet werden. Weiterhin können auch 3'-N-Aminocycladenosinaminonucleoside (AANS-Aminosäuren), worin ein 3'-Aminoacyladenosin und eine Aminosäure über eine Amidbindung als chemische Bindung gebunden sind, gebildet als Ergebnis einer Dehydratisierungskondensation der Aminogruppe des 3'-Aminoacyladenosins und der Carboxylgruppe der Aminosäure, korrespondierend zu allen Aminosäuren, beispielsweise AANS-Gly, worin der Aminosäureteil Glycin ist, AANS-Val, worin der Aminosäureteil Valin ist, AANS-Ala, worin der Aminosäureteil Alanin ist, usw. verwendet werden. Weiterhin können auch Nucleoside und Nucleoside, gebunden an eine Aminosäure über eine Esterbindung, verwendet werden.

Zusätzlich kann jede Substanz, gebildet mit einem Bindungsschema, das chemisch ein Nucleosid binden kann oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, ähnlich der eines Nucleosids, und eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, ähnlich einer Aminosäure verwendet werden.

Der Peptidakzeptorbereich umfasst vorzugsweise Puromycin oder ein Derivat davon, oder Puromycin oder ein Derivat davon und ein oder zwei Reste von Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden. Die in diesem Fall verwendete Bezeichnung ”Derivat” bedeutet ein Derivat, das an das C-terminale Ende des Peptids in einem Proteintranslationssystem binden kann. Das Puromycinderivat ist nicht auf diejenigen mit der gesamten Puromycinstruktur begrenzt und beinhaltet diejenigen, die eine Puromycinstruktur aufweisen, wobei ein Teil davon eliminiert ist. Spezifische Beispiele der Puromycinderivate beinhalten PANS-Aminosäuren, AANS-Aminosäuren usw.

Obwohl der Peptidakzeptorbereich eine Struktur aufweisen kann, bestehend nur aus Puromycin, hat er vorzugsweise eine Nucleotidsequenz, umfassend DNA und/oder RNA von ein oder mehr Resten am 5'-Ende. Als solche Sequenz ist dC-Puromycin, rC-Puromycin usw., noch bevorzugter eine CCA-Sequenz, umfassend dCdC-Puromycin, rCrC-Puromycin, rCdC-Puromycin, dCrC-Puromycin oder ähnliches und Imitieren des 3'-Endes der Aminoacyl-tRNA (Philipps, G. R., Nature 223, 374–377 (1969)) geeignet. Im Hinblick auf die Nucleotidart ist die Präferenz höher in der Reihenfolge von C > (U oder T) > G > A.

Der Spacer-Bereich ist vorzugsweise ein PEG-Bereich, enthaltend Polyethylenglykol als Hauptkomponente. Der Spacer-Bereich enthält üblicherweise zusätzlich zu dem PEG-Bereich einen Donorbereich, der an das 3'-Ende einer Nucleinsäure binden kann.

Der Donorbereich, der an das 3'-Ende einer Nucleinsäure binden kann, besteht üblicherweise aus ein oder mehr Nucleotiden. Die Zahl der Nucleotide liegt üblicherweise bei 1 bis 15, vorzugsweise 1 bis 2. Die Nucleotide können ein Ribonucleotid oder ein Desoxyribonucleotid sein. Der Donorbereich kann eine Modifikationssubstanz aufweisen.

Die Sequenz des 5'-Ende des Donorbereichs beeinflusst die Ligationseffizienz mit dem Codierungsbereich, codierend die Beute. Um die Ligation des Codierungsbereichs und des Spacer-Bereichs zu erreichen, ist es nötig, mindestens ein oder mehr Reste zu beinhalten, und mindestens einen Rest von dC (Deoxycytidylsäure) oder zwei Reste von dCdC (Dideoxycytidylsäure) wird für einen Akzeptor mit einer Poly-A-Sequenz bevorzugt. Im Hinblick auf die Art des Nucleotids geht die Präferenz in der Reihenfolge von C > (U oder T) > G > A höher.

Der PEG-Bereich enthält Polyethylenglykol als Hauptbestandteil. Der Ausdruck ”enthält Polyethylenglykol als Hauptbestandteil”, wie hier verwendet, bedeutet, dass die Gesamtzahl der Nucleotide, enthalten in dem PEG-Bereich, 20 oder weniger beträgt oder dass das durchschnittliche Molekulargewicht des Polyethylenglykols 400 oder mehr beträgt. Dies bedeutet vorzugsweise, dass die Gesamtzahl der Nucleotide 10 oder weniger oder das durchschnittliche Molekulargewicht des Polyethylenglykols 1000 oder mehr beträgt.

Das durchschnittliche Molekulargewicht von Polyethylenglykol im PEG-Bereich liegt üblicherweise bei 400 bis 30.000, vorzugsweise 1.000 bis 10.000, noch bevorzugter 2.000 bis 8.000. Wenn das Molekulargewicht von Polyethylenglkyol niedriger ist als ungefähr 400, kann eine Nachbehandlung für die Zuordnungstranslation für die Zuordnungstranslation eines Genotypmoleküls, enthaltend den Spacer-Bereich, nötig sein (Liu, R., Barrick, E., Szostak, J. W., Roberts, R. W., Methods in Enzymology, Band 318, 268–293 (2000)). Wenn jedoch PEG mit einem Molekulargewicht von 1.000 oder mehr, vorzugsweise 2.000 oder mehr, verwendet wird, kann eine hoch effiziente Zuordnung nur durch Zuordnungstranslation erhalten werden, und daher wird die Nachbehandlung für die Translation unnötig. Wenn weiterhin das Molekulargewicht des Polyethylenglykols ansteigt, neigt die Stabilität des Genotypmoleküls zu einer Erhöhung und insbesondere wird die Stabilität sehr günstig, wenn das Molekulargewicht 1.000 oder mehr beträgt. Wenn das Molekulargewicht 400 oder weniger beträgt, unterscheiden sich die Eigenschaften nicht so sehr von denjenigen eines DNA-Spacers, und dies wird instabiler.

Durch einen Spacer-Bereich, enthaltend Polyethylenglykol als Hauptbestandteil, wird es möglich, ein Zuordnungsmolekül nicht nur in einem zellfreien Translationssystem von Kaninchenretikulozyten, sondern auch in einem zellfreien Translationssystem von Weizenkeimen zu bilden, wobei die Stabilität des Genotypmoleküls in beiden Translationssystemen deutlich verbessert ist, und es wird unnötig, irgendeine Behandlung nach der Translation durchzuführen.

In der Ausführungsform (2) wird es bevorzugt, dass die DNA ein Fusionsprotein eines Proteins und Streptavidin oder Avidin codiert, die DNA mit Biotin markiert wird und eine translatierte Beute sich mit der DNA assoziiert, da die Transkription und Translation in einem Zustand durchgeführt wird, dass ein DNA-Molekül in einem Kompartiment der Emulsion enthalten ist. Beispiele für ein Nachweisverfahren einer Wechselwirkung unter Verwendung eines Zuordnungsmoleküls beinhalten das STABLE-Verfahren.

Die Emulsion ist üblicherweise eine W/O-Typ-Emulsion, gebildet durch Vermischung von zwei Arten von Tensiden, Mineralöl und einer Reaktionsmischung eines zellfreien Transkriptions- und Translationssystems. Um eine W/O-Typ-Emulsion zu bilden, ist es üblicherweise nötig, dass die Tenside einen HLB(hydrophile/lipophile Balance)-Wert von 3,5 bis 6 aufweisen. Der HLB-Wert von zwei gemischten Arten von Tensiden wird aus den HLB-Werten der individuellen Tenside. unter Verwendung einer einfachen Gleichung berechnet. Wenn z. B. Span 85 (HLB 1,8) und Tween 80 (HLB = 15,0) in Volumina von 40,2 bzw. 9,8 μl gemischt werden, hat die Mischung einen HLB-Wert von 4,4. Das Verhältnis der Tenside und des Mineralöls beträgt üblicherweise 1:18 (Volumenverhältnis). Weiterhin liegt das Verhältnis der Reaktionsmischung bei 1 bis 50% (Volumenverhältnis) in Bezug auf die Gesamtemulsion und liegt in der Regel bei 5%. Die Emulsion kann durch Zugabe der Reaktionsmischung als etliche getrennte Teile zu einer Mischung der Tenside und Mineralöl bei niedriger Temperatur unter Rühren und Vermischen gebildet werden. Die Reaktionen der Transkription und Translation können durch Anheben der Temperatur der Emulsion begonnen werden.

Die Präparation von DNA, codierend eine Beute, und die Transkription und Translation einer solchen DNA in einem zellfreien Transkriptions- und Translationssystem kann auf übliche Weise durchgeführt werden.

Wie oben beschrieben, kann durch Markieren des Köders und der Beute für den Nachweis und Modifikation für die Trennung in bestimmten Schemata ein Komplex, gebildet durch zellfreie Cotranslation spezifisch nachgewiesen werden.

Im Hinblick auf die zellfreie Cotranslation eines Köders und einer Beute kann das zellfreie Translationssystem (einschließlich des zellfreien Transkriptions- und Translationssystems), worin die zellfreie Cotranslation durchgeführt wird, jedes System von E. coli, Kaninchenretikulozyten, Weizenkeimen usw. sein. Obwohl die Bildung von Zuordnungsmolekülen, bei E. coli in den in vitro-Virusverfahren ziemlich instabil ist, wurde bestätigt, dass sie in einem System von Kaninchenretikulozyten stabil ist (Nemoto N., Miyamoto-Sato E. und Yanagawa H., FEBS Lett. 414, 405 (1997); Roberts R. W., Szostak J. W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297 (1997)), und es wurde weiter bestätigt, dass sie noch stabiler in einem System von Weizenkeimen ist (Japanisches offengelegtes Patent Nr. 2002-176987). Für das STABLE-Verfahren kann das System jedes der Systeme von E. coli, Kaninchenreticulozyten, Weizenkeimen usw. sein.

Die Bedingungen für die Translation und Transkription in den zellfreien Cotranslationssystemen werden in geeigneter Weise, abhängig von dem zu verwenden zellfreien Translationssystem, gewählt.

Die Matrizen für Köder und Beute, zugefügt zum zellfreien Translationssystem, können entweder RNA oder DNA sein, so lange das zellfreie Translationssystem eine zellfreie Transkription und Translation ist, die auch eine Transkription auslöst.

Hiernach wird ein Beispiel für eine Translationsmatrize erklärt, die für die Verwendung als Köder bevorzugt wird.

Als in dem Cotranslations-Screening dieser Ausführungsform verwendeter Köder wird eine Translationsmatrize verwendet, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen codierenden Bereich umfasst, mit einer Information für die Translation in ein Protein und einen PEG-Spacer-Bereich, wie dargestellt in 7. Der codierende Bereich hat eine Information für die Translation zu einem Protein und kann irgendeine Sequenz sein. Er ist jedoch vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass er einen Akzeptor (A-Sequenz) in einem 3'-Endbereich des codierenden Bereichs aufweist oder einen Akzeptor (A-Sequenz) in einem 3'-Endbereich des codierenden Bereichs und eine Translationsamplifikationssequenz (X-Sequenz) 5'-stromaufwärts von der A-Sequenz. Er enthält eine kurze Poly-A-Sequenz als A-Sequenz des codierenden Bereichs. Die kurze Poly-A-Sequenz ist üblicherweise eine Sequenz, umfassend 2 bis 10 Nucleotide von A. Sie ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz aufweist, die eine (C oder G)NN(C oder G)-Sequenz aufweist, beispielsweise eine XhoI-Sequenz als X-Sequenz. Der PEG-Spacer-Bereich hat einen PEG-Bereich, enthaltend Polyethylenglykol als Hauptbestandteil, einen Donorbereich für die Ligation mit dem codierenden Bereich und einen CCA-Bereich am 3'-Ende. Obwohl der PEG-Spacer-Bereich nur aus dem Donorbereich oder CCA-Bereich bestehen kann, wird es bevorzugt, dass er eine Konfiguration aufweist, umfassend. den PEG-Bereich, enthaltend Polyethylenglykol als Hauptbestandteil. Der CCA-Bereich ist dadurch gekennzeichnet, dass er nicht eine Funktion der Bindung durch eine Transpeptidierungsreaktion an ein Protein, translatiert von der Translationsmatrize, aufweist. Der PEG-Bereich ist durch ein Molekulargewicht des Polyethylenglykols von 500 oder mehr gekennzeichnet. Weiterhin ist er dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine Funktions-verleihende Einheit (F) im Donorbereich und/oder im CCA-Bereich enthält. Er ist dadurch gekennzeichnet, dass die Funktions-verleihende Einheit (F1) und/oder (F2)) die Translationsmatrize immobilisiert oder mit Fluoreszenz markiert und/oder ein Protein, translatiert von der Translationsmatrize. Als Immobilisierungssustanz werden Biotin usw. in die Betrachtung einbezogen und als fluoreszierende Substanz Fluorescein, Cy5, Rhodamin-Grün (RhG) usw. Die vorliegende Erfindung betrifft diesen codierenden Bereich, die Translationsmatrize und Bibliotheken davon, wie auch ein Protein, translatiert auf einem Ribosom und eine Bibliothek davon.

Die Translationsmatrize eines Köders (7, A) umfasst einen codierenden Bereich, abgeleitet von einem codierenden Molekül (7, B) und einen PEG-Spacer-Bereich, abgeleitet von einem PEG-Spacer-Molekül (7, C). In dieser Ausführungsform kann ein PEG-Spacer-Bereich an den codierenden Bereich zur Verbesserung der Stabilität ligiert werden und so kann die Translationseffizienz verbessert werden, im wesentlichen unabhängig von der Sequenz des codierenden Bereiches. Es ist jedoch weiter möglich, die Translationseffizienz, abhängig von der Konfiguration des codierenden Bereichs, oder der Art des PEG-Spacer-Bereichs zu verbessern. Details hierfür werden unten beschrieben.

Der codierende Bereich dieser Ausführungsform (7, B) umfasst einen 5'-Endbereich, einen ORF-Bereich und einen 3'-Endbereich und kann eine Cap-Struktur am 5'-Ende aufweisen oder auch nicht. Weiterhin ist die Sequenz des codierenden Bereichs nicht besonders begrenzt und seine Verwendung kann als in einen Vektor oder ein Plasmid eingebaut betrachtet werden. Der 3'-Endbereich des codierenden Bereichs beinhaltet einen mit einer Poly-A x 8-Sequenz als A-Sequenz oder einen mit der XhoI-Sequenz oder einer Sequenz von SNNS (S ist G oder C) als Sequenz von 4 oder mehr Nucleotiden als X-Sequenz und XA als Kombination der A- und X-Sequenz. Eine Konfiguration, wobei eine Flag-tag-Sequenz als Affinitäts-tag-Sequenz stromaufwärts von der A-Sequenz, X-Sequenz oder XA-Sequenz beinhaltet ist, wird auch betrachtet. Die hier verwendete Affinitäts-tag-Sequenz kann eine Sequenz zur Verwendung irgendeines Mittels sein, das den Nachweis oder die Reinigung eines Proteins ermöglicht, beispielsweise diejenigen unter Verwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion, wie z. B. ein HA-tag und Protein A von IgG (z-Domäne), His-tag usw. Im Hinblick auf Faktoren, die die Translationseffizienz beeinflussen, ist die Kombination der XA-Sequenz wichtig. Die ersten vier Nucleotide der X-Sequenz sind wichtig und eine mit einer Sequenz von SNNS wird bevorzugt. Weiterhin umfasst der 5'-Endbereich einen Transkriptionspromotor und einen Translationsenhancer. Als Transkriptionspromotor kann T7/T3, SP6 usw. verwendet werden, und es wird keine besondere Begrenzung auferlegt. Für ein zellfreies Translationssystem von Weizen wird jedoch eine Sequenz, enthaltend eine Omega-Sequenz oder einen Teil der Omega-Sequenz vorzugsweise als Translationsenhancer-Sequenz verwendet, und SP6 wird vorzugsweise als Promotor verwendet. Der Teil der Omega-Sequenz ist ein solcher, der einen Teil der Omega-Sequenz von TMV enthält (029, siehe Gallie D. R., Walbot V., Nucleic Acids Res., Band 20, 4631–4638 (1992) und WO 02/48347, 3). Der ORF-Bereich des codierenden Bereichs kann irgendeine Sequenz sein, umfassend DNA und/oder RNA. Er kann eine Gensequenz, Exonsequenz, Intronsequenz, statistische Sequenz oder irgendeine natürliche oder künstliche Sequenz sein, und die Sequenz ist nicht begrenzt.

Das PEG-Spacer-Molekül dieser Ausführungsform (8, C) umfasst einen CCA-Bereich, einen PEG-Bereich und einen Donorbereich. Der minimale essentielle Bestandteil ist der Donorbereich. Im Hinblick auf Faktoren, die die Translationseffizienz beeinflussen, wird eines, das nicht nur den Donorbereich, sondern auch den PEG-Bereich aufweist, bevorzugt, und es hat vorzugsweise Puromycin, das keine Fähigkeit zur Bindung an eine Aminosäure aufweist. Das Molekulargewicht des Polyethylenglykols im PEG-Bereich liegt bei 400 bis 30.000, vorzugsweise 1.000 bis 10.000, noch bevorzugter 2.000 bis 6.000. Weiterhin kann der CCA-Bereich eine Konfiguration, einschließlich Puromycin, oder eine Konfiguration ohne Puromycin aufweisen. Als Puromycin können Puromycin und 3'-Aminoacylpuromycinaminonucleoside (PANS-Aminosäuren), einschließlich PANS-Aminosäuren, korrespondierend zu allen Aminosäuren, wie z. B. PANS-Gly, worin der Aminosäureteil Glycin ist, PANS-Val, worin der Aminosäureteil Valin ist und PANS-Ala, worin der Aminosäureteil Alanin ist, verwendet werden. Weiterhin können auch 3'-N-Aminoacyladenosinaminonucleoside (AANS-Aminosäuren), worin ein 3'Aminoacyladenosin und eine Aminosäure über eine Amidbindung als chemische Bindung gebunden sind, gebildet als Ergebniseiner Dehydratisierungskondensation der Aminogruppe des 3'-Aminoacyladenosins und der Carboxylgruppe der Aminosäure, korrespondierend zu allen Aminosäuren, beispielsweise AANS-Gly, worin der Aminosäureteil Glycin ist, AANS-Val, worin der Aminosäureteil Valin ist, AANS-Ala, worin der Aminosäureteil Alanin ist usw., verwendet werden. Weiterhin können auch Nucleoside und Nucleoside, gebunden an eine Aminosäure, über eine Esterbindung verwendet werden. Zusätzlich können alle Substanzen, gebildet mit einem Bindungsschema, das chemisch ein Nucleosid binden kann oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, ähnlich zu der eines Nucleosid, oder eine Aminosäure oder eine Substanz mit einer chemischen Struktur, die einer Aminosäure ähnlich ist, verwendet werden. Für diese Translationsmatrize werden alle Substanzen, korrespondierend zu den vorher erwähnten Puromycinderivaten, deren Aminogruppe die Fähigkeit zur Bindung an eine Aminosäure fehlt, und ein CCA-Bereich, dem Puromycin fehlt, mit in die Betrachtung einbezogen. Durch Einbau von Puromycin, das nicht an ein Protein auf einem Ribosom binden kann, kann jedoch die Translationseffizienz weiter verbessert werden. Obwohl der Grund hierfür nicht sicher ist, kann es möglich sein, dass Puromycin, das nicht an ein Protein binden kann, ein Ribosom stimuliert, um den Turnover zu verbessern. Eine Nucleotidsequenz, umfassend DNA und/oder RNA von ein oder mehr Resten ist vorzugsweise auf dem 5'-Ende des CCA-Bereichs (CCA) enthalten. Im Hinblick auf die Nucleotidart liegt die Präferenz in der Reihenfolge von C > (U oder T) > G > A. Als solche Sequenz ist dC-Puromycin, rC-Puromycin usw., noch bevorzugter eine CCA-Sequenz, umfassend dCdC-Puromycin, rCrC-Puromycin, rCdC-Puromycin, dCrC-Puromycin oder ähnliches und Imitieren des 3'-Endes von Aminoacyl-tRNA (Philipps, G. R., Nature 223, 374–377 (1969)) geeignet. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Puromycine zu einer Bindung mit einer Aminosäure auf bestimmte Weise unfähig gemacht.

Der PEG-Spacer-Bereich dieser Ausführungsform kann eine Konfiguration aufweisen, enthaltend eine Modifikationssubstanz (F1 und/oder F2). Mit dieser Eigenschaft kann er als tag für das Sammeln, eine Wiederverwendung durch Reinigung oder Immobilisierung der Translationsmatrize verwendet werden. Diejenigen, die mindestens einen Rest des Nucleotids von DNA und/oder RNA umfassen, inkorporiert mit einem von verschiedenen Trenntags, wie z. B. eine fluoreszierende Substanz, wie Biotin und His-tags, können möglich sein. Weiterhin, wenn SP6 + O29 und Flag + XhoI + An (n = 8) als 5'-Endbereich bzw. 3'-Endbereich des Codierungsbereichs verwendet werden, betragen beispielsweise die Längen des 5'-Endbereichs und des 3'-Endbereichs ungefähr 60 bp bzw. ungefähr 40 bp, und so haben sie eine solche Länge, dass sie zu Primern für PCR als Adaptorbereich entworfen werden können. Dies stellt einen neuen Vorteil bereit. Das heißt, es ist möglich, einfach einen codierenden Bereich mit einem 5'- und 3'-Endbereich herzustellen, gemäß dieser Ausführungsform durch PCR von einem Vektor, Plasmid und einer cDNA-Bibliothek und durch Ligation des PEG-Spacer-Bereichs anstelle eines 3'-UTRs an diesen Codierungsbereich, kann eine Translationsmatrize mit hoher Translationseffizienz erhalten werden.

Die Ligation des PEG-Spacer-Moleküls und des codierenden Moleküls gemäß dieser Ausführungsform kann durch irgendein Verfahren erreicht werden, wie z. B. übliche Verfahren unter Verwendung von DNA-Ligase oder denjenigen, die auf einer Fotoreaktion basieren, und das Verfahren ist nicht besonders begrenzt. Bei der Ligation unter Verwendung einer RNA-Ligase ist als Faktor im codierenden Bereich, der die Ligationseffizienz beeinflusst, die A-Sequenz des 3'-Endbereiches wichtig. Es ist eine Poly-A-kontinuierliche Kette, bestehend aus mindestens 2, vorzugsweise 3 oder mehr, noch bevorzugter 6 bis 8 einer einzelnen Art oder von Mischarten von Resten, gewählt aus dA und/oder rA. Die DNA- und/oder RNA-Sequenz des 5'-Endes des Donorbereiches des PEG-Spacer-Bereiches beeinflusst die Ligationseffizienz. Um den codierenden Bereich und PEG-Spacer-Bereich mit einer RNA-Ligase zu ligieren, ist es notwendig, dass diese mindestens ein oder mehr Reste enthält und für einen Akzeptor mit einer Poly-A-Sequenz wird mindestens ein Rest von dC (Deoxycytidylsäure) oder zwei Reste von dCdC (Dideoxycytidylsäure) bevorzugt. Im Hinblick auf die Art des Nucleotids liegt die Präferenz in der Reihenfolge von C > (U oder T) > G > A. Weiterhin wird bevorzugt, Polyethylenglykol desselben Molekulargewichts wie in der PEG-Region während der Ligationsreaktion zuzufügen.

Hiernach wird ein Beispiel einer Translationsmatrize, die vorzugsweise als Beute verwendet wird, erklärt.

Als Beute bei dem Cotranslations-Screening gemäß dieser Ausführungsform wird ein Protein, dessen C-terminales Ende mit einer Translationsmatrize modifiziert ist, wie dargestellt in 9 (d. h. das Zuordnungsmolekül) verwendet. Die Translationsmatrize umfasst einen codierenden Bereich mit einer Information für die Translation in ein Protein und einen PEG-Spacer-Bereich. Der Codierungsbereich hat eine A-Sequenz am 3'-Ende, und die A-Sequenz umfasst eine kurze Poly-A-Sequenz. Der PEG-Spacer-Bereich ist dadurch gekennzeichnet, dass das Polyethylenglykol im PEG-Bereich, enthaltend Polyethylenglykol als Hauptkomponente, ein Molekulargewicht von 400 oder mehr aufweist, und der Donorbereich und/oder der CCA-Bereich enthält mindestens eine Modifikationssubstanz (F1 und/oder F2). Weiterhin ist der CCA-Bereich dadurch gekennzeichnet, dass er eine Funktion der Bindung durch Transpeptidierung an ein Protein, translatiert von der Translationsmatrize, aufweist, und der CCA-Bereich hat typischerweise Puromycin. Weiterhin ist er dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikationssubstanz (F1 und/oder F2) die Translationsmatrize immobilisiert oder mit Fluoreszenz markiert und/oder ein Protein, translatiert von der Translationsmatrize. Als Immobilisierungssubstanz werden Biotin usw. betrachtet und als fluoreszierende Substanz Fluorescein, Cy5, Rhodamin-Grün (RhG) usw. Die vorliegende Erfindung betrifft diesen Codierungsbereich, die Translationsmatrize und die Bibliotheken davon, wie auch ein Protein, synthetisiert durch Translation auf einem Ribosom (d. h. Zuordnungsmolekül) und eine Bibliothek solcher Proteine (d. h. Zuordnungsmoleküle).

Die Beute ist ein Protein, synthetisiert durch Translation unter Verwendung der Translationsmatrize, deren C-terminales Ende mit der Translationsmatrize modifiziert wurde (8, A, Zuordnungsmolekül) und Eigenschaften in der Translationsmatrize aufweist (8, B) und die Konfiguration eines Proteins, dessen C-terminales Ende mit PEG modifiziert ist (8, C). Dies wird im Detail unten beschrieben.

Der PEG-Spacer-Bereich der Translationsmatrize (8, B) ist derselbe wie der der vorher erwähnten Translationsmatrize, die für die Verwendung als Köder bevorzugt wird, außer dass er dadurch gekennzeichnet ist, dass das Puromycin an eine Aminosäure binden kann. Weiterhin ist der codierende Bereich auch derselbe wie der der vorher erwähnten Translationsmatrize, die für die Verwendung als Köder bevorzugt wird. Jedoch im Hinblick auf die für die Zuordnung geeignete Konfiguration ist es insbesondere wichtig, eine A-Sequenz als 3'-Endbereich zu verwenden, und dies erhöht deutlich die Zuordnungseffizienz der gesamten Proteine und vermindert deutlich die Menge von freien Proteinen. Auch in diesem Fall sind, wenn SP6 + O29 und Flag + XhoI + An (n = 8) als 5'-Endbereich bzw. 3'-Endbereich des codierenden Bereiches verwendet werden, die Längen des 5'-Endbereiches und des 3'-Endbereiches beispielsweise ungefähr 60 bp bzw. 40 bp, und so haben sie eine solche Länge, dass sie als Primer für die PCR als Adaptorregion entworfen werden können. Dies ermöglicht es einfach, einen codierenden Bereich mit einem 5'- und 3'-Endbereich gemäß dieser Ausführungsform durch PCR von irgendeinem Vektor, Plasmid und einer cDNA-Bibliothek herzustellen und durch Ligation des PEG-Spacer-Bereiches, kann eine Translationsmatrize mit hoher Zuordnungseffizienz erhalten werden.

Wenn der codierende Bereich des Proteins, dessen C-terminales Ende mit PEG gemäß dieser Ausführungsform modifiziert ist (8, C), nicht bei dem Nachweis einer Wechselwirkung von Proteinen verwendet wird, d. h. wenn das Protein beispielsweise für FCCS-Messungen, Fluoreszenzablesungen, Proteinchips usw. verwendet wird, kann es absichtlich mit einer RNase oder ähnlichem gespalten werden. Durch die Spaltung können Schwierigkeiten des Nachweises der Wechselwirkungen zwischen Proteinen aufgrund einer Inhibition durch den codierenden Bereich eliminiert werden. Weiterhin ist es auch möglich, ein solch einfaches Zuordnungsmolekül auf einer Platte, einem Kügelchen oder einem Glasträger zu immobilisieren.

Die zellfreie Cotranslation wird unter Bezugnahme auf 9 erklärt. Wie in 9 dargestellt, wird eine Beute in vitro in Gegenwart eines Köders translatiert. Wie in 9, A und B, dargestellt, gibt es einen Fall, worin der Köder ein Protein ist, und er wird simultan mit der Beute in einem zellfreien Translationssystem translatiert und einen Fall, worin der Köder ein Nucleinsäure, Hormon oder ähnliches ist, und er wird einem zellfreien Translationssystem zugefügt. Wie in 9 dargestellt, ist die Beute zu einem Fusionsprotein oder Zuordnungsmolekül gemacht worden.

Der Komplex kann durch Bindung eines Köders und einer Beute (I) oder durch Bindung einer anderen Beute an eine Beute, bindend an einen Köder (II), gebildet werden.

Da das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung eine in vitro-Bildung des Komplexes ermöglicht, können Wechselwirkungen zwischen Proteinen, Nucleinsäure und Protein usw. konsistent in vitro nachgewiesen werden.

Wenn der Köder ein Protein ist, beinhalten Beispiele für den Köder ein Protein, bestehend nur aus einer funktionellen Domäne für eine Wechselwirkung mit einem Zielprotein, ein Protein einschließlich einer funktionellen Domäne, ein Gesamtlängenprotein usw. Wenn ein Gesamtlängenprotein verwendet wird, wird erwartet, dass es multiple funktionelle Domänen aufweist, und es wird daher in günstiger Weise möglich, umfassende. Beute nachzuweisen. Das Gesamtlängenprotein kann ein einzelnes Protein mit einer gesamten Länge sein oder eine Anordnung von zwei oder mehr Ködern, aus denen ein Protein mit gesamter Länge rekonstruiert werden kann.

Der Köder kann ein Komplex, wie dargestellt in 10, sein und dieser wird als ”komplexierter Köder” bezeichnet. Durch Verwendung eines solchen Komplexes kann eine nichtspezifische Adsorption weiter reduziert werden, und es wird möglich, umfassender Beute nachzuweisen mit derselben Wirkung wie der des Gesamtlängenproteins.

Wie oben beschrieben, sind als Komplex, der für die zellfreie Cotranslation betrachtet wird, ein Komplex eines einzelnen Köders und einer einzelnen Beute, ein Komplex eines komplexierten Köders und einer Beute, ein Komplex eines Köders und multipler Beute und ein Komplex eines komplexierten Köders und multipler Beute möglich. Daher beinhaltet eine nachweisbare Wechselwirkung durch das Nachweisverfahren der gegenwärtigen Erfindung nicht nur eine direkte Wechselwirkung zwischen Köder und Beute, sondern auch eine indirekte Wechselwirkung zur Bildung eines Komplexes.

Es wird angenommen, dass der besonders wichtige Faktor bei der zellfreien Cotranslation gemäß der vorliegenden Erfindung derjenige ist, dass ein Protein in einem nativen Zustand und in einem undenaturierten Zustand direkt nach der Translation gefaltet wird, und ein Köder und eine Beute, ein Köder und eine andere Beute oder eine Beute und eine andere Beute, die miteinander in Wechselwirkung treten sollen, sollten in dem zellfreien Translationssystem coexistieren, so dass sie direkt miteinander interagieren können. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, dass ein besseres Ergebnis durch eine Cotranslation erhalten werden könnte, im Vergleich zu einer separaten Translation, gefolgt von einer Coexistenz durch Vermischen. Das heißt, es wird angenommen, dass dies darauf zurückzuführen ist, dass ein Protein, translatiert in vitro in einem nativen Faltungszustand ein Protein, eine Nucleinsäure oder ähnliches treffen kann und daher eine direkte Bildung eines Komplexes durch eine Wechselwirkung möglich wird.

Die konventionellen Nachweisverfahren einer Wechselwirkung benötigen eine Expression in E. coli und eine Reinigung eines Köders in großer Menge. Wenn beispielsweise eine Wechselwirkung eines Köders und einer Beute in einer Zelle durch das TAP-Verfahren oder ähnliches exprimiert wird, wird mindestens ein Monat einer Präparation benötigt. Weiterhin haben mRNA-Displayverfahren unter Verwendung des Pull-down-Verfahrens, basierend auf einem GST-Fusionsprotein Probleme, dass dies mindestens 2 oder 3 Wochen dauert, und zwar aufgrund der großen Menge der Expression in E. coli und der Reinigung des Köders, eine Substanz, die in E. coli nicht exprimiert werden kann, kann nicht als Köder verwendet werden usw., und dies benötigt weiterhin die Zugabe eines Köders in einer Menge des 50- bis 100-Fachen der Menge der Beute, um eine Wechselwirkung mit dem Köder auszulösen. Bei der zellfreien Cotranslation ist die Zugabe von nur ungefähr der gleichen Gewichtsmenge von mRNA- oder DNA-Matrize zu einem zellfreien Translationssystem ausreichend, und es wird vollständig unnötig, den Köder in den Zellen zu exprimieren. So kann die Arbeitszeit deutlich verkürzt werden. Weiterhin kann mit einem komplexierten Köder oder einem Gesamtlängenprotein eine Wechselwirkung eines Köders und einer Beute weiter verbessert werden und spezifisch gemacht werden, und so kann ein Nachweis nicht-spezifischer Bindungen vermieden werden. Weiterhin kann durch Verwendung eines komplexierten Köders, einer größeren Anzahl von Beute, die mit einem zweiten Köder in Wechselwirkung treten, in umfassender Weise analysiert werden.

Obwohl bis jetzt kein System existierte, das eine Komplexbildung durch Wechselwirkung und ein Screening konsistent in vitro realisierte, kann, indem eine Translation und ein Screening durchgeführt wurden, einschließlich denjenigen für einen Köder, und zwar vollständig in vitro, gemäß dem Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben, ein System, das umfassend Wechselwirkungen zwischen Proteinen oder zwischen einem Protein und einer Nucleinsäure nachweisen kann, wobei nicht-spezifische Nachweise vermieden werden, konstruiert werden. Daher stellt die vorliegende Erfindung auch ein Screening-Verfahren unter Verwendung des Nachweisverfahrens der vorliegenden Erfindung bereit.

Das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung ist durch die Bildung von Komplexen durch Wechselwirkungen eines Köders und Beute während einer zellfreien Cotranslation gekennzeichnet und durch Analyse einer Beute, die mit dem Köder in Wechselwirkung tritt, durch Screening der Komplexe. Daher kann das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung dasselbe sein wie ein übliches Screening-Verfahren für eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, umfassend den Nachweisschritt des Nachweises einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute, und den Selektionsschritt der Selektion einer Beute, für die eine Wechselwirkung nachgewiesen wurde, außer dass das Verfahren den Nachweisschritt des Nachweises einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute durch das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung umfasst.

Das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst weiterhin den Präparationsschritt der Herstellung einer Beute, die im Selektionsschritt selektiert wurde, und es wird bevorzugt, den Nachweisschritt, den Selektionsschritt und den Präparationsschritt durch Verwendung der hergestellten Beute anstelle des Köders, der im Nachweisschritt verwendet wurde oder zusammen mit diesem, zu wiederholen. In dieser Ausführungsform wird das Verfahren beispielsweise durch 1) einen Schritt einer zellfreien Cotranslation in einem zellfreien Translationssystem, worin Köder und Beute eine Wechselwirkung auslösen, 2) einen Screeningschritt zum Nachweis einer Beute-Wechselwirkung mit dem Köder, 3) einen Schritt der Überprüfung und Analyse der Beute und 4) den Schritt der Wiederholung der Schritte von 1) durch Verwendung der in 3) überprüften und analysierten Beute gebildet, wie dargestellt in 11. Die Schritte 1) und 2), korrespondierend zu dem Nachweis- und Selektionsschritt und der Schritt 3) korrespondiert zum Präparationsschritt. Das heißt, der Schritt des Kontaktierens eines Köders mit der Beute im Nachweisschritt korrespondiert zu dem Schritt der zellfreien Cotranslation und die Schritte des Nachweises und der Selektion eines Komplexes im Nachweisschritt korrespondieren zum Screening-Schritt.

Bei dem Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die im Selektionsschritt selektierte Beute wiederum im Nachweisschritt verwendet werden.

Bei dem Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die zellfreie Cotranslation mit einem Köder und einer Beute-Bibliothek durchgeführt werden, wobei es sich um eine Gruppe von multipler Beute handelt, so dass zwei oder mehr Beute in dem Screening-Schritt nachgewiesen werden können.

Wie in 9 dargestellt, können ein komplexierter Köder und eine Beute coexistieren, und ein Komplex des komplexierten Köders und der Beute können durch eine Wechselwirkung gebildet werden. Durch Verwendung einer Beute-Bibliothek in dieser zellfreien Cotranslation, so dass multiple Arten von Beute der Beute-Bibliothek mit dem Köder coexistieren sollten und multiplexe Komplexe der Beute mit dem Köder durch Wechselwirkungen gebildet werden sollten, können multiple Arten von Beute, die mit dem Köder in Wechselwirkung treten, simultan und umfassend durch das Screening nachgewiesen werden. Wenn weiterhin ein Gesamtlängenprotein als Köder verwendet wird, wird es möglich, umfassend eine größere Zahl von Beute nachzuweisen, da ein Gesamtlängenprotein allgemein multiple funktionale Domänen für die Wechselwirkungen enthält.

Wie weiterhin in 10 dargestellt, können durch Bildung multipler Komplexe von Beute, die mit einem komplexierten Köder in Wechselwirkung treten, multiple Beute, die mit dem komplexierten Köder in Wechselwirkung treten, nachgewiesen werden, und der zweite Köder dient als Verstärker der Wechselwirkung eines Köders und einer Beute, um eine spezifischere Wechselwirkung zu realisieren, was es ermöglicht, einen nicht-spezifischen Nachweis bei dem umfassenden Nachweis zu vermeiden. Bei evolutionären molekular-biologischen Manipulationstechniken, wie z. B. dem in vitro-Virusverfahren und in dem STABLE-Verfahren, ist die Beute ein Zuordnungsmolekül (Fusion). Bei der Bildung von Komplexen unter Verwendung einer Beute-Bibliothek oder multipler Arten von Beute kann die Beute direkt mit dem Köder in Wechselwirkung treten oder auch nicht.

Wenn der durch das Screening von Komplexen erhaltene Komplex ein Zuordnungsmolekül ist, kann eine Beute, die den Komplex bildet, durch RT-PCR oder PCR nachgewiesen, und das Screening kann wiederum unter Verwendung des PCR-Produkts als Beute (Rekonstruktion der Beute) oder unter Verwendung einer Beute, analysiert aus dem PCR-Produkt, als neuer folgender Köder, wie dargestellt in 11, durchgeführt werden. Das Verfahren zur Durchführung des wiederholten Screenings unter Verwendung des PCR-Produkts oder der Durchführung des Screenings unter Verwendung einer Beute, analysiert aus dem PCR-Produkt, als neuer folgender Köder, kann nur in den evolutionären molekular-biologischen Manipulationstechniken, wie z. B. dem in vitro-Virusverfahren und dem STABLE-Verfahren, durchgeführt werden und kann nicht in einem Verfahren der direkten Analyse eines Proteins, wie z. B. einem Pull-down-Verfahren und TAP-Verfahren, durchgeführt werden.

Wenn ein Zuordnungsmolekül verwendet wird, kann die Gensequenz einer proteinartigen Beute nach dem Screening durch RT-PCR oder PCR bekannt werden. Wie in den 9 und 10 dargestellt, ist die proteinartige Beute, wie oben erwähnt, eine Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung tritt, eine Beute, die mit der Beute oder ähnlichen in Wechselwirkung tritt und alle multiplen Arten von Beute, die mit einem Köder in Wechselwirkung treten, können umfassend analysiert werden. Wenn weiterhin ein wiederholtes Screening einer Beute nötig ist, wird eine DNA-Matrize, die ein Produkt der RT-PCR oder PCR ist, transkribiert und dieselben Zyklen werden wiederholt. Wenn weiterhin eine Beute durch RT-PCR oder PCR und die folgende Sequenz bestimmt wird, wird es möglich, diese proteinartige Beute als Köder zu verwenden. Wenn zwei oder mehr Arten von Beute, die mit dem ersten Köder in Wechselwirkung treten, angetroffen werden, wird es möglich, einen komplexierten Köder zu bilden, und so wird es möglich, eine weitere größere Anzahl von Beute nachzuweisen.

Wenn die zellfreie Cotranslation verwendet wird, wird es möglich, eine Wechselwirkung zwischen Proteinen konsistent in vitro selbst im Pull-down-Verfahren oder dem TAP-Verfahren nachzuweisen. Das Zuordnungsmolekül wird jedoch in dem TAP-Verfahren nicht gebildet, und daher müssen Proteine direkt bei der Analyse von Beute analysiert werden. Wenn das Pull-down-Verfahren oder das TAP-Verfahren als Screening-Verfahren in dem in vitro-Virusverfahren oder dem STABLE-Verfahren verwendet werden, wird dann ein Zuordnungsmolekül gebildet, und daher kann eine Gensequenz einer Beute, die zu einer Wechselwirkung führt, einfach durch RT-PCR oder PCR bei der Analyse der Beute nachgewiesen werden. Wenn weiterhin die zellfreie Cotranslation verwendet wird, wird es möglich, Wechselwirkungen zwischen Proteinen konsistent in vitro in dem in vitro-Virusverfahren oder dem STABLE-Verfahren nachzuweisen. Weiterhin, wenn die Zahl der Beute extrem groß ist, kann der Bereich der Kandidaten-Beute durch ein wiederholtes Screening, durchgeführt durch Wiederholung der Zyklen, eingeengt werden. Weiterhin kann die analysierte Beute als Köder in der nächsten Analyse verwendet werden, und wenn die Zahl der Beute ansteigt, schreitet das Komplexieren des Köders voran, was zu einem Nachweis weiterer Beute führt. Wie oben beschrieben, kann die Verwendung einer Beute als Köder in dem darauf folgenden Zyklus einfach nur in dem in vitro-Virusverfahren, dem STABLE-Verfahren usw. realisiert werden, die ein Zuordnungsmolekül verwenden. Das mRNA-Display-Verfahren und ähnliches benötigen jedoch eine Synthese in E. coli und eine Reinigung einer großen Menge eines GST-Fusionsproteins als neuen Köder und so benötigt die Herstellung des Köders Zeit, was das Verfahren schwierig macht. Wenn die zellfreie Cotranslation verwendet wird, sind solche Verfahren unnötig, und die Zyklen können einfach wiederholt werden.

Bei dem Screening von Komplexen nach der zellfreien Cotranslation wird es bevorzugt, dass Beute umfassend ohne Aufbruch der Komplexe, erzeugt durch die zellfreie Cotranslation, einem Screening unterworfen werden können. Für diesen Zweck kann eine Vorrichtung für das Immobilisieren dem Köder mit einem Affinitäts-tag oder ähnlichem verliehen werden, um eine Beute nachzuweisen, die mit dem Köder in Wechselwirkung tritt. Jede solche Vorrichtung für die Immobilisierung kann verwendet werden. Beispiele beinhalten beispielsweise ein Verfahren zur Durchführung eines zweistufigen Screenings unter Verwendung einer IgG-Protein-A-Affinität oder Calmodulin-Kügelchen, wie bei dem konventionellen TAP-Verfahren, und ein Verfahren zur Durchführung eines ein- oder zweistufigen Screenings unter Verwendung einer Streptavidin- oder Avidin/Biotin-Affinität, GST-tag, Flag-tag, T7-tag, His-tag oder ähnlichen, wie bei dem Pull-down-Verfahren.

Beispiele für die Beute-Bibliothek beinhalten eine cDNA-Bibliothek (Zufallsprimingbibliothek, dT-Primingbibliothek), statistische Bibliothek, Peptidbibliothek, Hormonbibliothek, Antikörperbibliothek, Ligandenbibliothek, pharmazeutische Verbindungsbibliothek usw., und jede Art einer Bibliothek kann verwendet werden. Wenn z. B. eine Zufallspriming-cDNA-Bibliothek als Beute-Bibliothek verwendet wird, kann, obwohl eine Volllängenbeute für diese Bibliothek nicht erwartet werden kann, eine Beute, enthaltend ein funktionale Domäne, erwartet werden. Wenn eine solche Bibliothek insbesondere für ein Screening unter Verwendung von Kombinationen mit einem komplexierten Köder oder einem Gesamtlängenprotein verwendet wird, wird dies für einen umfassenden Nachweis von Beute effektiv.

Beispiele für die Zufallsprimingbibliothek beinhalten cDNAs, erhalten durch Zufallspriming und eingebaut in multiple Klonierungsstellen (MCS) von Vektoren mit einem 5'-nicht-translatierten Bereich (UTR), enthaltend den Promotor der RNA-Polymerase von SP6 (SP6) als Transkriptionspromotor und einen Teil der TMV-Omega-Sequenz (O29) des Tabakmosaikvirus als Translationsenhancer auf der 5'-Endseite der MCS, und enthalten eine Sequenz für das Flag-tag, das ein tag für die Affinitätstrennanalyse ist, basierend auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion als Affinitäts-tag-Sequenz an der 3'-Seite des MCS, so dass das Flag-tag dem C-terminalen Ende eines Proteins zugefügt werden sollte, exprimiert von einer Insertsequenz, eingebaut in die MCS.

Das vorher erwähnte Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung beinhaltet den Schritt des Kontaktierens eines Köders und einer Beute zur Bildung eines Komplexes. Daher wird ein Verfahren zur Bildung des Komplexes aus Köder und Beute, die mit dem Köder in Wechselwirkung tritt, gemäß diesem Schritt bereitgestellt.

Das Bildungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist durch die Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung als Köder bei der Bildung eines Komplexes aus Köder und Beute gekennzeichnet, wobei es sich um ein Protein handelt, das mit dem Köder in Wechselwirkung tritt und vorzugsweise durch weitere Markierung von Köder und Beute für den Nachweis und Modifikation für die Trennung in bestimmten Schemata, um eine zellfreie Cotranslation durchzuführen. Daher kann eine bevorzugte Konfiguration des Bildungsverfahrens der vorliegenden Erfindung dieselbe sein wie die eines üblichen Verfahrens zur Bildung eines Komplexes aus Köder und Beute, umfassend das Kontaktieren von Köder und Beute, die mit dem Köder in Wechselwirkung tritt, außer dass der Köder oder die Beute für den Nachweis markiert und für die Trennung in bestimmten Schemata modifiziert sind und die zellfreie Cotranslation durchgeführt wird. Die Markierung für den Nachweis und die Modifikation für die Trennung von Köder und Beute in bestimmten Schemata wie auch die zellfreie Cotranslation können dieselben sein wie diejenigen, die für das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung erklärt wurden.

Bei dem Bildungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann nicht nur ein Komplex aus Köder und Beute, für die eine Wechselwirkung bekannt ist, sondern auch ein Komplex, umfassend Elemente, für die eine Wechselwirkung unbekannt ist, durch Durchführung der Schritte des Kontaktierens vom Köder mit Beute, die mit dem Köder in Wechselwirkung tritt, durch Kontaktieren eines Köders mit einer Beute-Bibliothek, bestehend aus multiplen Arten von Beute, gebildet werden.

Andere Verfahren zur Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung beinhalten die folgenden:
ein Analyseverfahren für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein und einer Substanz, das durch eine Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzabbildungsanalyse, Fluoreszenzresonanzenergietransfer, evaneszentes Feldmolekularbildungsverfahren, Fluoreszenzdepolarisationsverfahren, Oberflächenplasmonresonanzverfahren oder einen Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay unter Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird,
ein Nachweisverfahren für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein und einer Substanz, das das Protein der vorliegenden Erfindung verwendet und die Wechselwirkung durch Amplifikation einer Nucleotidsequenz eines codierenden Bereichs, gebunden an das C-terminale Ende des Proteins der vorliegenden Erfindung nachweist,
ein Nachweisverfahren für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein und einer Substanz, das das Protein der vorliegenden Erfindung und das zellfreie Cotranslationsverfahren oder das zellfreie Cotranslations-Screeningverfahren verwendet,
ein Nachweisverfahren für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein und einer Substanz, das das Protein der vorliegenden Erfindung verwendet und das Protein mit einer Fluoreszenz markiert und/oder es immobilisiert,
ein Analyseverfahren für eine Wechselwirkung eines Proteins oder einer Substanz in vitro unter Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung,
ein Analyseverfahren für eine Wechselwirkung eines Proteins oder einer Substanz, das das Protein der vorliegenden Erfindung und das Cotranslationsverfahren in vitro verwendet,
ein Analyseverfahren für eine Wechselwirkung eines Proteins oder einer Substanz in vivo unter Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung, und
die vorstehenden Verfahren zur Analyse einer Wechselwirkung, wobei eine Nucleinsäure, codierend das Protein der vorliegenden Erfindung, verwendet wird.

Weiterhin werden auch die folgenden erwähnt:
ein Analyseverfahren für eine Wechselwirkung zwischen einem Protein und einem Zielmolekül, wobei ein C-terminal modifiziertes Protein, umfassend das Protein und ein Modifikationsmittel, das an das C-terminale Ende des Proteins bindet, verwendet wird. Die Analyse der Wechselwirkung kann durch eine Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, ein Fluoreszenzabbildungsanalyseverfahren, ein Fluoreszenzresonanzenergietransferverfahren, ein evaneszentes Feldmolekularabbildungsverfahren, ein Fluoreszenzdepolarisationsverfahren, ein Oberflächenplasmonresonanzverfahren oder einen Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay durchgeführt werden. Das C-terminal modifizierte Protein kann immobilisiert sein. Das C-terminal modifizierte Protein kann einem Array zugefügt werden, auf dem das Zielmolekül immobilisiert ist, und dann kann das C-terminal modifizierte Protein, das spezifisch an das Zielmolekül bindet, nachgewiesen werden.

Bei dem Analyseverfahren dieser Ausführungsform wird die Wechselwirkung in der Regel durch Kontaktieren des modifizierten Proteins der vorliegenden Erfindung wie oben erhalten und des Zielmoleküls in einer geeigneten Kombination, die abhängig von der Art der Modifikationssubstanz oder dem Reaktionssystem gewählt wird, und durch Messung der Veränderung des Signals, das durch die Wechselwirkung zwischen dem modifizierten Protein und dem Zielmolekül erzeugt wird, unter den Signalen, die durch das modifizierte Protein oder das Zielmolekül erzeugt werden, analysiert. Die Analyse der Wechselwirkung wird beispielsweise durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, ein Fluoreszenzabbildungsanalyseverfahren, ein Fluoreszenzresonanzenergietransferverfahren, ein evaneszentes Feldmolekularabbildungsverfahren, ein Fluoreszenzdepolarisationsverfahren, ein Oberflächenplasmonresonanzverfahren oder einen Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay durchgeführt werden. Die Details dieser Verfahren werden unten erklärt.

Das ”Zielmolekül” bedeutet ein Molekül, das mit dem modifizierten Protein der vorliegenden Erfindung in Wechselwirkung tritt, und es kann spezifisch ein Protein, eine Nucleinsäure, eine Zuckerkette, eine niedermolekulare Verbindung oder ähnliches, vorzugsweise ein Protein oder eine DNA, sein.

Das Protein ist nicht besonders begrenzt, so lange es die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit dem modifizierten Protein der vorliegenden Erfindung aufweist, und es kann ein Gesamtlängenprotein oder ein Teilpeptid sein, enthaltend eine aktive Stelle für die Bindung. Weiterhin kann es ein Protein sein, dessen Aminosäuresequenz oder Funktion bekannt oder unbekannt ist. Es kann eine synthetisierte Peptidkette, ein Protein, gereinigt aus einem Organismus, ein Protein, erhalten durch Translation von einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines geeigneten Translationssystems und einer Reinigung oder ähnlichem sein, und es kann als Zielmolekül verwendet werden. Die synthetisierte Peptidkette kann ein Glycoprotein sein, bestehend aus einer synthetisierten Peptidkette, mit einer angehafteten Zuckerkette. Unter diesen ist ein gereinigtes Protein, dessen Aminosäuresequenz bekannt ist oder ein Protein, erhalten durch Translation von einer cDNA-Bibliothek und durch Reinigung unter Verwendung geeigneter Verfahren, vorzugsweise zu verwenden.

Die Nucleinsäure ist nicht besonders begrenzt, so lange sie die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit dem modifizierten Protein der vorliegenden Erfindung aufweist, und es werden entweder DNA oder RNA verwendet. Weiterhin kann es sich um eine Nucleinsäure handeln, deren Nucleotidsequenz oder Funktion bekannt oder unbekannt ist. Vorzugsweise kann eine Nucleinsäure, deren Funktion als Nucleinsäure mit einer Fähigkeit zur Bindung an ein Protein oder eine Nucleotidsequenz bekannt ist oder eine Nucleinsäure, erhalten durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym oder ähnlichem, und durch Isolation aus einer genomischen Bibliothek oder ähnlichem, verwendet werden.

Die Zuckerkette ist nicht besonders begrenzt, so lange sie die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit dem modifizierten Protein der vorliegenden Erfindung aufweist, und es kann sich um eine Zuckerkette handeln, deren Saccharidsequenz oder Funktion bekannt oder unbekannt ist. Vorzugsweise wird eine bereits isolierte und analysierte Zuckerkette, deren Saccharidsequenz oder Funktion bekannt ist, verwendet.

Die niedermolekulare Verbindung ist nicht besonders begrenzt, so lange sie die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit dem modifizierten Protein der vorliegenden Erfindung aufweist. Eine Verbindung, deren Funktion unbekannt ist, oder eine Verbindung, deren Fähigkeit zur Bindung an ein Protein bereits bekannt ist, kann ebenfalls verwendet werden.

Die ”Wechselwirkung”, die durch diese Zielmoleküle mit dem modifizierten Protein der vorliegenden Erfindung ausgelöst wird, bedeutet in der Regel eine Wirkung, ausgelöst durch eine intermolekulare Kraft, erzeugt durch mindestens eine kovalente Bindung, hydrophobe Bindung, Wasserstoffbrückenbindung, van-der-Waals-Bindung oder eine Bindung, ausgelöst durch elektrostatische Kräfte zwischen einem Protein und einem Zielmolekül. Diese Bezeichnung sollte jedoch in ihrem breitesten Sinn konstruiert werden und sollte nicht auf irgendeine Weise als begrenzend angewandt werden. Die kovalente Bindung beinhaltet eine Koordinatenbindung und eine Dipolbindung. Die durch elektrostatische Kräfte ausgelöste Bindung beinhaltet neben der elektrostatischen Bindung die elektrische Abstoßung. Weiterhin sind eine Bindungsreaktion, eine synthetische Reaktion und eine Abbaureaktion, ausgelöst als Ergebnis der vorher erwähnten Wirkung ebenfalls in der Wechselwirkung beinhaltet.

Spezifische Beispiele für die Wechselwirkung beinhalten eine Assoziation und Dissoziation eines Antigens und eines Antikörpers, Assoziation und Dissoziation von Proteinrezeptor und einem Liganden, Assoziation und Dissoziation eines Adhäsionsmoleküls und eines Partnermoleküls, Assoziation und Dissoziation von Enzym und Substrat, Assoziation und Dissoziation einer Nucleinsäure und einem daran bindenden Protein, Assoziation und Dissoziation von Proteinen in einem Informationsübertragungssystem, Assoziation und Dissoziation eines Glycoproteins und eines Proteins und Assoziation und Dissoziation einer Zuckerkette und eines Proteins.

Das zu verwendende Zielmolekül kann mit einer Modifikationssubstanz modifiziert und abhängig von den Ausführungsformen verwendet werden. Die Modifikationssubstanz wird in der Regel gewählt aus einer nicht-radioaktiven Modifikationssubstanz, wie z. B. fluoreszierenden Substanzen. Die fluoreszierenden Substanzen können irgendwelche von verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen sein, beispielsweise vom Fluoresceintyp, Rhodamintyp, Cy3, Cy5, vom Eosintyp, vom NBD-Typ usw., die eine freie funktionelle Gruppe aufweisen (z. B. Carboxyl-, Hydroxyl-, Aminogruppe usw.) und an die vorher erwähnte Zielsubstanz, wie z. B. Proteine und Nucleinsäure binden können. Zusätzlich können andere Verbindungen, wie z. B. Farbstoffe, verwendet werden, und Art und Größe der Verbindungen sind nicht kritisch, so lange sie die Modifikation ermöglichen.

Unter diesen Modifikationssubstanzen wird eine Substanz, die für ein Messverfahren oder ein Analyseverfahren der Veränderung eines Signals, erzeugt aufgrund einer Wechselwirkung zwischen dem Zielmolekül und dem modifizierten Protein der vorliegenden Erfindung, geeignet ist, verwendet. Die vorher erwähnte Modifikationssubstanz kann an das Zielmolekül durch ein geeignetes per se bekanntes Verfahren gebunden werden. Wenn das Zielmolekül ein Protein ist, kann spezifisch ein Verfahren zur Modifikation des C-terminalen Endes, wie beschrieben in WO 02/48347 oder ähnliches, verwendet werden. Wenn das Zielmolekül weiterhin eine Nucleinsäure ist, kann diese einfach durch ein Verfahren einer PCR unter Verwendung eines Oligo-DNA-Primers, gebunden an eine Modifikationssubstanz im vorhinein über eine kovalente Bindung oder ähnliches modifiziert werden.

Weiterhin kann das modifizierte Protein der vorliegenden Erfindung oder das für die vorliegende Erfindung verwendete Zielmolekül an eine feste Phase gebunden sein (d. h. immobilisiert), abhängig von der Ausführungsform. Als Bindungsverfahren an eine feste Phase gibt es ein Verfahren der Bindung über die Modifikationssubstanz und ein Verfahren zur Bindung über einen anderen Bereich.

Die bei der Bindung über die Modifikationssubstanz verwendete Modifikationssubstanz ist üblicherweise ein Molekül, das spezifisch an ein bestimmtes Polypeptid bindet (hiernach auch bezeichnet als ”Ligand”) und ein bestimmtes Polypeptid, das an den Liganden bindet (hiernach auch bezeichnet als ”Adaptorprotein”), ist an die feste Phase gebunden. Das Adaptorprotein beinhaltet auch Bindungsproteine, Rezeptorproteine, die Rezeptoren bilden, Antikörper usw.

Beispiele für Kombinationen von Adaptorprotein und Liganden beinhalten irgendeines verschiedener Rezeptorproteine und einen Liganden hierfür, beispielsweise ein Biotin- oder Iminobiotinbindungsprotein, wie z. B. Avidin und Streptavidin und Biotin oder Iminobiotin, Maltosebindungsprotein und Maltose, G-Protein und Guaninnucleotid, Polyhistidinpeptid und Metallion, wie z. B. Nickel- oder Kobaltionen, Glutathion-S-Transferase und Glutathion, DNA-Bindungsprotein und DNA, Antikörper- und Antigenmoleküle (Epitop), Calmodulin und Calmodulinbindungspeptid, ATP-Bindungsprotein und ATP, Östradiolrezeptorprotein und Östradiol usw.

Unter diesen sind bevorzugte Kombinationen für das Adaptorprotein und den Liganden Biotin- oder Iminobiotinbindungsprotein, wie z. B. Avidin und Streptavidin und Biotin oder Iminobiotin, Maltosebindungsprotein und Maltose, Polyhistidinpeptid und Metallion, wie z. B. Nickel- und Kobaltionen, Glutathion-S-Transferase und Glutathion, Antikörper- und Antigenmoleküle (Epitop) usw., und eine Kombination aus Streptavidin und Biotin oder Iminobiotin wird besonders bevorzugt. Diese Bindungsproteine sind per se bekannt, und DNAs, die diese Proteine codieren, wurden bereits kloniert.

Das Adaptorprotein kann an eine Festphasenoberfläche durch ein per se bekanntes Verfahren gebunden werden. Es können beispielsweise spezifisch ein Verfahren unter Verwendung von Gerbsäure, Formalin, Glutaraldehyd, Brenztraubensäurealdehyd, Bis-diazotisiertem Benzizon, Toluol-2,4-diisocyanat, einer Aminogruppe, Carboxylgruppe, die in eine aktive Estergruppe umgewandelt werden kann, Hydroxyl- oder Aminogruppe, die in eine Phosphoramiditgruppe umgewandelt werden kann, oder ähnliches verwendet werden.

Wenn die Bindung über einen anderen Bereich als die Modifikationssubstanz erreicht wird, kann ein bekanntes Verfahren verwendet werden, das üblicherweise für die Bindung eines Proteins, einer Nucleinsäure, einer Zuckerkette oder einer niedermolekularen Verbindung an eine Festphase verwendet wird. Spezifisch können beispielsweise ein Verfahren unter Verwendung von Gerbsäure, Formalin, Glutaraldehyd, Brenztraubensäurealdehyd, Bis-diazotisiertem Benzizon, Toluol-2,4-diisocyanat, einer Aminogruppe, Carboxylgruppe, die in eine aktive Estergruppe umgewandelt werden kann, Hydroxyl- oder Aminogruppe, die in eine Phosphoramiditgruppe umgewandelt werden kann, oder ähnliches verwendet werden.

Die Festphase kann eine solche sein, die üblicherweise zur Immobilisierung eines Proteins, einer Nucleinsäure oder ähnlichen verwendet wird, und Material und Form hierfür sind nicht besonders begrenzt. Beispielsweise können Glasplatten, Nitrocellulosemembranen, Nylonmembranen, Polyvinylidenfluoridmembranen, Mikroplatten, hergestellt aus Kunststoff usw. verwendet werden.

Die ”Messung” ist ein Mittel zum Sammeln von Veränderungen von Signalen, die für die Analyse verwendet werden und sollte nicht auf irgendeine begrenzende Weise konstruiert werden. Als verwendetes Messverfahren kann irgendeines der Verfahren, die eine intermolekulare Wechselwirkung nachweisen können, verwendet werden, einschließlich einer Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, eines Fluoreszenzresonanzenergietransferverfahrens, eines evaneszenten Feldmolekularabbildungsverfahrens, eines Fluoreszenzdepolarisationsverfahrens, eines Fluoreszenzabbildungsanalyseverfahrens, eines Oberflächenplasmonresonanzverfahrens oder eines Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assays usw.

Das Messverfahren beinhaltet ein Verfahren, umfassend die Zugabe des modifizierten Proteins der vorliegenden Erfindung zu einem Array, auf dem ein Zielmolekül immobilisiert ist und Nachweis des modifizierten Proteins der vorliegenden Erfindung, das spezifisch an das Zielmolekül bindet. Der Array, auf dem das Zielmolekül immobilisiert ist, bedeutet eine feste Phase, auf der das Zielmolekül in einer Anordnung, die die Identifizierung ermöglicht, immobilisiert ist. Das Nachweisverfahren des modifizierten Proteins der vorliegenden Erfindung, spezifisch an das Zielmolekül bindend, ist nicht besonders begrenzt, so lange das Verfahren den Nachweis des modifizierten Proteins der vorliegenden Erfindung, spezifisch bindend das Zielmolekül, ermöglicht. Es wird jedoch üblicherweise beispielsweise ein Verfahren zur Entfernung des modifizierten Proteins der vorliegenden Erfindung, das nicht das Zielmolekül bindet, durch Waschen von dem Array, zu dem das modifizierte Protein der vorliegenden Erfindung zugefügt wurde und Nachweis des verbliebenen modifizierten Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet.

Hiernach werden Beispiele für das Messverfahren erklärt.

(1) Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS, Eigen, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91, 5740–5747 (1994)) ist ein Verfahren zur Messung von Flussrate, Diffusionskoeffizienten, Volumenschrumpfung oder ähnlichem von Teilchen unter einem konfokalen Lasermikroskop oder ähnlichem. Bei der vorliegenden Erfindung können interagierende Moleküle durch Messung der Veränderung von translationaler Brownscher Bewegung von einem ursprünglich modifizierten Molekül der vorliegenden Erfindung (C-terminal modifiziertes Protein), ausgelöst durch eine Wechselwirkung zwischen dem modifizierten Protein und einem Zielmolekül, gemessen werden.

Spezifisch wird die Fluoreszenz, emittiert von Probenteilchen in einem Partialvolumen einer Probenlösung aufgrund Anregung der Probenteilchen durch ein anregendes Licht gemessen, um ein Photonenverhältnis zu erhalten. Dieser Wert verändert sich mit der Zahl der Teilchen, die in einem Raumvolumen existieren und während einer bestimmten Zeitspanne beobachtet werden. Die vorher erwähnten verschiedenen Parameter können aus der Veränderung der Signale unter Verwendung einer Autokorrelationsfunktion berechnet werden. Apparate zur Durchführung von FCS werden auch von Carl Zeiss usw. vertrieben, und die Analyse kann unter Verwendung dieser Apparate auch in der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.

Wenn eine Protein-Zielmolekül-Wechselwirkung gemessen oder analysiert wird, wobei dieses Verfahren verwendet wird, ist es nötig, sowohl das C-terminal modifizierte Protein als auch das Zielmolekül als Lösung bereitzustellen (Flüssigphasenverfahren). Das Zielmolekül muss nicht markiert sein. Weiterhin ist ein Molekül mit einem Molekulargewicht, das deutlich geringer als dasjenige des C-terminal modifizierten Proteins, dessen Wechselwirkung untersucht werden sollte, für dieses Verfahren nicht geeignet, da ein solches Molekül die Brownsche Bewegung des C-terminal modifizierten Proteins nicht beeinflusst.

Jedoch kann eine Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) unter Verwendung von zwei Arten von fluoreszierenden Farbstoffen sogar eine Wechselwirkung zwischen Proteinen mit Molekulargewichten in einem ähnlichen Größenbereich nachweisen, wobei Nachweis durch FCS unter Verwendung von einer Art von fluoreszierendem Farbstoff schwierig ist. Obwohl das Fluoreszenzresonanzenergietransfer(FRET)-Verfahren als weiteres Verfahren der Verwendung von zwei Arten von fluoreszierenden Farbstoffen bekannt ist, müssen sich zwei Arten von fluoreszierenden Farbstoffen aneinander auf eine Entfernung innerhalb von 40 bis 50 Å annähern, um FRET auszulösen, und es gibt bei diesem Verfahren das Risiko, dass ein FRET, abhängig von der Größe der Proteine, Stellungen, an die die fluoreszierenden Farbstoffe angehaftet sind oder ähnliches, nicht beobachtet werden kann, selbst wenn eine Wechselwirkung auftritt. Da der Nachweis der Kreuzkorrelation andererseits nicht von der Entfernung zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen im FCCS-Verfahren abhängt, leidet dieses an diesem Problem nicht. Weiterhin hat das FCCS-Verfahren im Vergleich mit dem Fluoreszenzdepolarisationsverfahren als weiterem Nachweissystem die Vorteile einer geringeren Menge der benötigten Probe, einer kürzeren Nachweiszeit, einer leichteren Automatisierung für HTS usw. Da das FCCS-Verfahren weiterhin eine extrem grundlegende Information, wie z. B. über Größe und Zahl der mit Fluoreszenz/markierten Moleküle bereitstellt, kann es für allgemeine Zwecke, wie das Oberflächenplasmonresonanzverfahren verwendet werden. Der Unterschied zwischen beiden liegt darin, dass bei dem Oberflächenplasmonresonanzverfahren eine Wechselwirkung in einen Zustand nachgewiesen wird, in dem die Proteine immobilisiert sind, während das FCCS-Verfahren die Beobachtung einer Wechselwirkung in Lösung ermöglicht, was näher am natürlichen Zustand ist. Bei dem FCCS-Verfahren müssen die Proteine, obwohl sie nicht immobilisiert sein müssen, stattdessen mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sein. Es wurde jedoch durch die vorliegende Erfindung möglich, dieses Problem zu überwinden.

Weiterhin ermöglicht das FCCS-Verfahren die Untersuchung einer Protein-Protein-Wechselwirkung oder einer Protein-Nucleinsäure-Wechselwirkung in einem Lösungszustand, was nahe an der intrazellulären Umgebung ist und ermöglicht eine günstige Berechnung der Dissoziationskonstante (Bindungskonstante) durch eine Messung.

Das Verfahren, um ein Zielmolekül mit dem C-terminal modifizierten Protein bei diesem Verfahren zu kontaktieren, kann irgendein Verfahren sein, das einen Kontakt in einem ausreichenden Ausmaß so ermöglicht, dass diese miteinander interagieren können. Dies wird jedoch vorzugsweise durch ein Verfahren der Einführung einer Lösung, die das C-terminal modifizierte Protein, in einem Puffer, der üblicherweise für biochemische Zwecke oder ähnliches verwendet wird, in geeigneter Konzentration in eine Vertiefung für eine Messung in einem kommerziell erhältlichen FCS-Apparat und weiterhin Einführung einer Lösung, die das Zielmolekül löst, in demselben Puffer bei geeigneter Konzentration in diese Vertiefung erreicht.

Bei diesem Verfahren wird beispielsweise als Verfahren zur Durchführung multipler Analysen ein Verfahren der Einführung multipler Arten unterschiedlicher C-terminal modifizierter Proteine in Vertiefungen für die Messungen in dem vorher erwähnten FCS-Apparat verwendet, und weiter durch Einführung einer Lösung eines bestimmten Zielmoleküls in die Vertiefungen oder Einführung eines bestimmten C-terminal modifizierten Proteins in Vertiefungen und weiterhin Einführung von Lösungen multipler Arten unterschiedlicher Zielmoleküle in die Vertiefungen.

(2) Fluoreszenzabbildungsanalyseverfahren

Das Fluoreszenzabbildungsanalyseverfahren ist ein Verfahren, bei dem ein modifizierendes Molekül mit einem immobilisierten Molekül kontaktiert wird und die Fluoreszenz, emittiert von dem immobilisierten modifizierenden Molekül, verblieben auf dem immobilisierten Molekül aufgrund einer Wechselwirkung zwischen beiden Molekülen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Fluoreszenzabbildungsanalysators gemessen oder analysiert wird.

Wenn eine Protein-Zielmolekül-Wechselwirkung unter Verwendung dieses Verfahrens gemessen oder analysiert wird, muss entweder das C-terminal modifizierte Protein oder das Zielmolekül durch das vorstehende Verfahren immobilisiert werden. Wenn ein immobilisiertes Zielmolekül verwendet wird, kann entweder ein modifiziertes oder nicht-modifiziertes Zielmolekül verwendet werden. Wenn es weiterhin ohne Immobilisierung verwendet wird, muss es durch die vorher erwähnte Modifikationssubstanz modifiziert werden. Es kann entweder ein C-terminal modifiziertes Protein, immobilisiert am modifizierten Bereich oder ein C-terminal modifiziertes Protein, immobilisiert an einem anderen Bereich als dem modifizierten Bereich, verwendet werden.

Als Substrat, um ein C-terminal modifiziertes Protein oder Zielmolekül (Festphase) zu immobilisieren, können Glasplatten, Nitrocellulosemembranen, Nylonmembranen, Mikroplatten, hergestellt aus Kunststoff usw. verwendet werden, die üblicherweise für das Immobilisieren eines Proteins, einer Nucleinsäure oder ähnlichen verwendet werden.

Weiterhin können solche Substrate wie die oben erwähnten, deren Oberflächen mit verschiedenen funktionalen Gruppen gebunden sind (Aminogruppe, Carboxylgruppe, Thiolgruppe, Hydroxylgruppe etc.) oder verschiedenen Liganden (Biotin, Iminobiotin, Metallionen, wie Nickel- oder Kobaltion, Glutathion, Sacchariden, Nucleotiden, DNA, RNA, Antikörper, Calmodulin, Rezeptor-Protein, etc.) ebenfalls verwendet werden.

Das Verfahren, um ein modifiziertes Zielmolekül oder ein C-terminal modifiziertes Protein bei diesem Verfahren mit einem immobilisierten Molekül zu kontaktieren, kann irgendein Verfahren sein, das einen Kontakt in einem ausreichenden Ausmaß ermöglicht, so dass beide Moleküle miteinander interagieren können. Dies wird jedoch vorzugsweise durch ein Verfahren erreicht, indem eine Lösung hergestellt wird, die das modifizierte Zielmolekül oder das C-terminal modifizierte Protein in einem Puffer löst, der üblicherweise für biochemische Zwecke verwendet wird, und zwar bei geeigneter Konzentration und indem die Lösung mit der Festphasenoberfläche kontaktiert wird.

Nachdem die beiden Moleküle miteinander in Kontakt gebracht wurden, wird vorzugsweise ein Abwaschschritt von exzessiv existierendem modifizierten Zielmolekül oder C-terminal modifiziertem Protein mit demselben Puffer oder ähnliches durchgeführt, und das Fluoreszenzsignal, emittiert von der Modifikationssubstanz des Zielmoleküls oder des C-terminal modifizierten Proteins, das auf der festen Phase verblieben ist, oder eine Mischsignal von einer Fluoreszenz, emittiert von dem immobilisierten modifizierten Molekül und Fluoreszenz, emittiert von dem modifizierten Molekül, das auf der Festphase verblieben ist, können unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Abbildungsanalysators gemessen oder analysiert werden, um das Molekül zu identifizieren, das mit dem immobilisierten Molekül in Wechselwirkung tritt.

Bei diesem Verfahren wird als Verfahren zur simultanen Durchführung multipler Analysen beispielsweise ein Verfahren verwendet, wobei multiple Arten von C-terminal modifizierten Proteinen oder modifizierten oder nicht-modifizierten Zielmolekülen auf der vorher erwähnten Festphasenoberfläche mit Positionsadresse immobilisiert werden, ein Verfahren, wobei multiple Arten nicht-immobilisierter C-terminal modifizierter Proteine oder modifizierter Zielmoleküle mit einer Art eines C-terminal modifizierten Proteins oder einem modifizierten oder nicht-modifizierten Zielmolekül in Kontakt gebracht werden, oder ähnliche. Wenn multiple Arten C-termial modifizierter Proteine oder modifizierter Zielmoleküle miteinander in Kontakt gebracht werden, können die auf der Festphase verbliebenen Moleküle durch Dissoziation unter Verwendung einer Differenz der Pufferkonzentration oder von ähnlichen erhalten und durch ein bekanntes Verfahren analysiert werden, um sie zu identifizieren.

(3) Fluoreszenzresonanzenergietransferverfahren

Als ein anderes Nachweisverfahren für eine intermolekulare Wechselwirkung unter Verwendung von zwei Arten fluoreszierender Farbstoffe ist das Fluoreszenzresonanzenergietransfer(FRET)-Verfahren wohl bekannt. FRET bedeutet ein Phänomen, das, wenn ein Fluoreszenzspektrum von einem von zwei Arten fluoreszierender Farbstoffe (Energiedonor) und ein Absorptionsspektrum des anderen (Energierezeptor) sich überlappen, und die Entfernung zwischen zwei der fluoreszierenden Farbstoffe ausreichend klein ist, es wahrscheinlicher wird, dass die Anregungsenergie des Donors den Rezeptor anregt, bevor der Donor Fluoreszenz emittiert. Daher werden zwei Arten von Proteinen, deren Wechselwirkung nachgewiesen werden soll, mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert, die als Donor bzw. Rezeptor wirken, und der Donor wird angeregt. Wenn die beiden Arten von Proteinen nicht miteinander in Wechselwirkung treten, wird kein FRET ausgelöst, da die Entfernung zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen groß ist, und so wird ein Fluoreszenzspektrum des Donors beobachtet. Wenn jedoch die beiden Arten der Proteine miteinander in Wechselwirkung treten und daher die Entfernung zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen kleiner wird, wird ein Fluoreszenzspektrum des Rezeptors aufgrund von FRET beobachtet. Daher kann Gegenwart oder Abwesenheit von Wechselwirkungen zwischen den Proteinen auf der Basis des Unterschieds der Wellenlängen der Fluoreszenzspektren bestimmt werden. Im Hinblick auf die fluoreszierenden Farbstoffe wird häufig eine Kombination als Fluorescein als Donor und Rhodamin als Rezeptor verwendet. Weiterhin wurde kürzlich versucht, FRET in einer Zelle zu beobachten, um eine Wechselwirkung unter Verwendung eines mutierten grün-fluoreszierenden Proteins (GFP), das Fluoreszenz unterschiedlicher Wellenlänge emittiert, nachzuweisen. Als Nachteil dieses Verfahrens wird es erwähnt, dass, da zwei Arten von fluoreszierenden Farbstoffen sich auf eine Distanz innerhalb von 40 bis 50 annähern müssen, um einen FRET auszulösen, es das Risiko gibt, dass ein FRET, abhängig von den Größen der Proteine, den Stellungen, an denen die fluoreszierenden Farbstoffe angehaftet sind oder ähnlichem, selbst dann nicht beobachtet werden kann, wenn eine Wechselwirkung auftritt.

(4) Evaneszentes Feldmolekularabbildungsverfahren

Das evaneszente Feldmolekularabbildungsverfahren ist ein Verfahren, das von Funatsu, T., et al., Nature 374, 555–559 (1995) und ähnlichen beschrieben wurde, und es handelt sich um ein Verfahren, wobei ein zweites Molekül als Lösung mit einem Molekül kontaktiert wird, das auf einem transparenten Material, wie z. B. Glas, immobilisiert ist, Bestrahlung mit Laserlicht oder ähnlichem aus der Lichtquelle in einem solchen Winkel, dass ein evaneszentes Feld erzeugt werden sollte, und Messung oder Analyse des erzeugten evaneszenten Lichts unter Verwendung eines Detektors. Diese Arbeitsschritte können unter Verwendung eines per se bekannten evaneszenten Feldfluoreszenzmikroskops durchgeführt werden.

Wenn eine Protein-Zielmolekül-Wechselwirkung unter Verwendung dieses Verfahrens gemessen oder analysiert wird, muss eins von dem C-terminal modifizierten Protein oder dem Zielmolekül durch das vorher erwähnte Verfahren immobilisiert werden. Wenn ein immobilisiertes Zielmolekül verwendet wird, muss dieses nicht modifiziert sein. Wenn dies jedoch ohne Immobilisierung verwendet wird, muss es mit der vorher erwähnten Modifikationssubstanz modifiziert werden.

Als Substrat, um das C-terminal modifizierte Protein oder Zielmolekül zu immobilisieren, wird vorzugsweise ein Substrat, hergestellt aus einem Material, wie Glas oder ähnlichem, verwendet, und Quarzglas wird vorzugsweise verwendet. Weiterhin wird ein Substrat, dessen Oberfläche durch Ultraschall gereinigt wurde, bevorzugt, um eine Streuung von Laserlicht oder ähnlichem zu verhindern.

Das Verfahren, um ein nicht-immobilisiertes C-terminal modifiziertes Protein oder Zielmolekül mit einem immobilisierten Molekül bei diesem Verfahren zu kontaktieren, kann irgendein Verfahren sein, das den Kontakt in einem ausreichenden Ausmaß ermöglicht, so dass die beiden Moleküle miteinander interagieren können. Ein Verfahren zur Herstellung einer Lösung, die das nicht-immobilisierte C-terminal modifizierte Protein oder modifizierte Zielmolekül in einem Puffer löst, der üblicherweise für biochemische Zwecke verwendet wird, und zwar bei geeigneter Konzentration und tröpfchenweise Zugabe der Lösung zu der Festphasenoberfläche, wird bevorzugt.

Nachdem die beiden Moleküle miteinander kontaktiert wurden, kann die erzeugte Fluoreszenz durch die Anregung durch die evaneszente Feldbeleuchtung unter Verwendung eines Detektors, wie z. B. einer CCD-Kamera, gemessen werden, um das Molekül zu identifizieren, das mit dem immobilisierten Molekül in Wechselwirkung tritt.

Bei diesem Verfahren wird als Verfahren der Simultan-Durchführung multipler Analysen beispielsweise ein Verfahren verwendet, wobei multiple Arten C-terminal modifizierter Proteine oder modifizierter Zielmoleküle auf dem vorher erwähnten Substrat mit Positionsadressen immobilisiert werden oder ähnliches.

(5) Fluoreszenzdepolarisationsverfahren

Das Fluoreszenzpolarisationsverfahren (Perran, J., et al., J. Phys. Rad., 1, 390–401 (1926)) ist ein. Verfahren, wobei die Tatsache verwertet wird, dass ein fluoreszierendes Molekül, angeregt mit einem polarisierten fluoreszierenden Licht, eine Fluoreszenz auf derselben Polarisationsebene während des angeregten Zustands emittiert, während es den stationären Zustand aufrechterhält, während die emittierte Fluoreszenz eine andere Ebene aufweist als die des angeregten Lichts, wenn das angeregte Molekül eine Brownsche Rotationsbewegung oder ähnliches während des angeregten Zustands durchläuft. Die Bewegung des Moleküls wird durch dessen Größe beeinflusst und wenn das fluoreszierende Molekül ein Makromolekül ist, zeigt das Molekül während des angeregten Zustands kaum eine Bewegung, und das emittierte Licht wird als polarisiertes Licht aufrechterhalten. In dem Fall eines niedermolekularen fluoreszierenden Moleküls wird jedoch, da dies eine hohe Bewegungsgeschwindigkeit zeigt, das emittierte Licht depolarisiert. Wenn daher die Intensität der von einem fluoreszierenden Molekül emittierten Fluoreszenz, angeregt durch ein Ebenen-polarisiertes Licht, entlang der ursprünglichen Ebene gemessen wird, wie auch einer dazu senkrechten Ebene, können Informationen im Hinblick auf die Beweglichkeit und den existierenden Zustand des Moleküls von einem Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten für beide Ebenen erhalten werden. Gemäß diesem Verfahren kann das Verhalten eines Zielmoleküls, das mit einem Fluoreszenz-modifizierten Molekül in Wechselwirkung tritt, ohne Beeinflussung durch Kontaminanten, falls überhaupt, nachgewiesen werden. Dies liegt daran, dass eine Verlagerung des Polarisationsgrads nur dann gemessen wird, wenn das Fluoreszenz-modifizierte Molekül und das Zielmolekül miteinander in Wechselwirkung treten.

Als Apparate zur Durchführung dieses Verfahrens werden BECON (erzeugt von Panyera) usw. vertrieben, und dieses Verfahren kann unter Verwendung dieser Apparate durchgeführt werden.

Wenn eine Protein-Zielmolekül-Wechselwirkung unter Verwendung dieses Verfahrens gemessen oder analysiert wird, ist es notwendig, sowohl C-terminal modifizierten Proteine als auch das Zielmolekül als Lösungen bereitzustellen. Das Zielmolekül muss nicht modifiziert sein. Weiterhin ist ein Molekül, das ein extrem viel geringeres Molekulargewicht aufweist als das C-terminal modifizierte Protein, dessen Wechselwirkung untersucht werden soll, für dieses Verfahren nicht geeignet, da das Molekül die Brownsche Bewegung des C-terminal modifizierten Proteins nicht beeinflusst.

Das Verfahren, um ein Zielmolekül mit dem C-terminal modifizierten Protein bei diesem Verfahren zu kontaktieren, kann irgendein Verfahren, das den Kontakt in ausreichendem Ausmaß ermöglicht, so dass sie miteinander in Wechselwirkung treten können. Dies sollte jedoch vorzugsweise durch ein Verfahren erreicht werden, wobei eine Lösung, die das C-terminal modifizierte Protein in einem Puffer löst, der üblicherweise für biochemische Zwecke verwendet wird, in geeigneter Konzentration in eine Vertiefung zur Messung in einem kommerziell erhältlichen Fluoreszenzdepolarisationsapparat eingeführt wird und weiterhin durch Einführung einer Lösung, die das Zielmolekül in demselben Puffer bei geeigneter Konzentration löst, in die Vertiefung.

Es wird erwartet, dass die Spezifität der Wechselwirkung zwischen dem C-terminal modifizierten Protein und den Zielmolekülen, die in diesem Verfahren gemessen werden soll, nicht notwendiger Weise so hoch ist wie diejenige einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Um daher eine optimale Kombination zu identifizieren, ist es effektiv, dass der Grad der Wechselwirkung numerisch definiert werden sollte. Als Index, der den Grad der Wechselwirkung repräsentiert, kann beispielsweise ein Wert einer minimalen Zielsubstanzkonzentration, der den maximalen Fluoreszenzpolarisationsgrad für ein C-terminal modifiziertes Protein einer fixierten Konzentration bereitstellt oder ähnliches verwendet werden.

Bei diesem Verfahren wird als Verfahren der Simultan-Durchführung multipler Analysen beispielsweise ein Verfahren der Einführung multipler Arten unterschiedlicher C-terminal modifizierter Proteine in Vertiefungen für die Messung in dem vorher erwähnten Fluoreszenzdepolarisationsapparat verwendet und weiter durch Einführung einer Lösung eines bestimmten Zielmoleküls in die Vertiefungen oder Einführung eines bestimmten C-terminal modifizierten Proteins in Vertiefungen und weiterhin Einführung von Lösungen multipler Arten von unterschiedlichen Zielmolekülen in die Vertiefungen.

(6) Oberflächenplasmonresonanzverfahren

Das Oberflächenpalsmonresonanzverfahren ist ein Verfahren zur Messung von Oberflächenplasmon, angeregt durch ein Molekül, das an einer Metall/Flüssigkeits-Grenzfläche interagiert, als Veränderung der Intensität von reflektiertem Licht (Cullen, D. C., et al., Biosensors, 3(4), 211–225 (1987–88)). Wenn eine Protein-Zielmolekül-Wechselwirkung durch dieses Verfahren gemessen oder analysiert wird, muss das C-terminal modifizierte Protein durch das vorher erwähnte Verfahren immobilisiert werden, jedoch muss das Zielmolekül nicht modifiziert werden.

Als Substrat, um das C-terminal modifizierte Protein zu immobilisieren, wird ein transparentes Substrat, hergestellt aus Glas oder ähnlichem, auf dem ein dünner Film eines Metalls, wie Gold, Silber oder Platin, gebildet wurde, verwendet. Das transparente Substrat kann irgendeines von denjenigen sein, die üblicherweise für Oberflächenplasmonresonanzapparate verwendet werden. Es besteht allgemein aus Glas als Substrat, bestehend aus einem gegenüber einem Laserlicht transparenten Material, und ein solches Substrat mit einer Dicke von ungefähr 0,1 bis 5 mm wird. üblicherweise verwendet. Weiterhin liegt die Dicke des dünnen Metallfilms geeigneter Weise bei ungefähr 100 bis 2000. Solche, die als Immobilisierungssubstrate für Oberflächenplasmonresonanzapparate vertrieben werden, können ebenfalls verwendet werden. Das C-terminal modifizierte Protein kann auf dem Substrat durch das oben beschriebene Verfahren immobilisiert werden.

Das Verfahren, um ein Zielmolekül bei diesem Verfahren in Kontakt mit dem C-terminal modifizierten Protein zu bringen, kann irgendein Verfahren sein, das den Kontakt in einem ausreichenden Ausmaß ermöglicht, so dass beide Moleküle miteinander in Wechselwirkung treten können. Ein Verfahren, wobei das immobilisierte C-terminal modifizierte Protein mit einer Lösung kontaktiert wird, die das Zielmolekül in einem Puffer löst, der üblicherweise für biochemische Zwecke verwendet wird, und zwar in geeigneter Konzentration, wird jedoch vorzugsweise verwendet.

Diese Schritte können auch unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Oberflächenplasmonresonanzapparats, beispielsweise BIAcore 2000 (erzeugt von Pharmacia Biosensor) durchgeführt werden. Nachdem die beiden Moleküle miteinander kontaktiert wurden, kann die Veränderung mit der Zeit der relativen Intensität von jedem reflektierten Licht unter Verwendung eines Oberflächenplasmonresonanzapparats, der per se bekannt ist, gemessen werden, um eine Wechselwirkung des immobilisierten C-terminal modifizierten Proteins und des Zielmoleküls zu analysieren oder zu messen.

Bei diesem Verfahren wird als Verfahren, um simultane multiple Analysen durchzuführen, beispielsweise ein Verfahren verwendet, wobei multiple Arten von C-terminal modifizierten Proteinen auf einem Substrat, das für den Oberflächenplasmonresonanzapparat verwendet wird, mit Positionierungsadressen immobilisiert werden, ein Verfahren, wobei multiple Arten von Zielmolekülen mit einer Art von immobilisiertem C-terminal modifiziertem Protein kontaktiert werden oder ähnlichem.

(7) Enzym-gebundener Immunosorbentassay

Der Enzym-gebundene Immunosorbentassay (ELISA, Crowther, J. R., Methods in Molecular Biology, 42 (1995)) ist ein Verfahren, wobei eine Lösung, enthaltend einen Antikörper, mit einem Antigen, immobilisiert auf einer Festphase, kontaktiert und der Antikörper, der auf dem immobilisierten Antigen aufgrund der Wechselwirkung zwischen den beiden Molekülen (Antigen-Antikörper-Reaktion) verblieben ist, auf der Basis von Fluoreszenz, emittiert von einem Modifikationsmolekül (IgG usw.), das spezifisch an den Antikörper bindet oder eines Signals, emittiert von einem Farbstoff, gebildet von dem Modifikationsmolekül, als Substrat unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Detektors (ELISA-Ablesevorrichtung) gemessen oder analysiert wird.

Wenn eine Protein-Zielmolekül-Wechselwirkung unter Verwendung dieses Verfahrens gemessen oder analysiert wird, muss das C-terminal modifizierte Protein, das als Antigen dient, durch das vorher erwähnte Verfahren immobilisiert werden. Weiterhin muss das Zielmolekül, das als Antikörper dient, mit der vorher erwähnten Modifikationsubstanz modifiziert werden.

Als Substrat zum Immobilisieren des C-terminal modifizierten Proteins, das als Antigen dient, können Mikrotiterplatten, hergestellt aus Kunststoff, die üblicherweise für ELISA verwendet werden usw., ebenfalls verwendet werden.

Das Verfahren, um das modifizierte Zielmolekül, das als Antikörper dient, mit einem immobilisierten Molekül in diesem Verfahren zu kontaktieren, kann jedes Verfahren sein, das den Kontakt in einem ausreichenden Ausmaß ermöglicht, so dass beide Moleküle miteinander interagieren können. Ein Verfahren zur Herstellung einer Lösung, die das modifizierte Zielmolekül in einem Puffer löst, der üblicherweise für biochemische Zwecke verwendet wird, und zwar in geeigneter Konzentration und Einführung der Lösung in eine Mikrotiterplatte wird jedoch bevorzugt.

Nachdem beide Moleküle miteinander kontaktiert wurden, wird vorzugsweise ein Schritt durchgeführt, wobei exzessiv existierendes modifiziertes Molekül, das nicht an das immobilisierte Molekül gebunden ist, abgewaschen wird, und Fluoreszenz, emittiert von dem modifizierten Molekül, das auf der Festphase verblieb, kann unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen ELISA-Ablesevorrichtung oder ähnlichem gemessen oder analysiert werden, um das Molekül zu identifizieren, das mit dem immobilisierten Antigenmolekül in Wechselwirkung tritt.

Bei diesem Verfahren wird als Verfahren, um simultan multiple Analysen durchzuführen, beispielsweise ein Verfahren verwendet, wobei multiple Arten von unterschiedlichen modifizierten Zielmolekülen in jeder Vertiefung der vorher erwähnten Mikrotiterplatte immobilisiert werden.

Weiterhin kann das Protein der vorliegenden Erfindung auch für die Identifizierung eines Moleküls verwendet werden, das eine Wechselwirkung auslöst.

Wenn eine Primärstruktur eines Zielmoleküls, für das eine Wechselwirkung mit einem C-terminal modifizierten Protein auf der Basis der Messung gemäß einem der oben beschriebenen Verfahren erkannt wurde, unbekannt ist, kann die Primärstruktur durch ein geeignetes Verfahren, das per se bekannt ist, analysiert werden. Wenn das Zielmolekül, für das eine Wechselwirkung erkannt wurde, insbesondere ein Protein ist, kann seine Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Aminosäureanalysators usw. zur Identifikation der Primärstruktur analysiert werden. Wenn das Zielmolekül eine Nucleinsäure ist, kann die Nucleotidsequenz weiterhin durch ein Nucleotidsequenz-Bestimmungsverfahren unter Verwendung eines automatischen DNA-Sequenzierers oder ähnlichem bestimmt werden.

Weiterhin kann das Protein der vorliegenden Erfindung auch für eine Analyse einer Wechselwirkung mit einer Proteinbibliothek verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Gen oder eine Nucleinsäuresequenz bereit, codierend ein neues Protein, das einen Komplex mit dem c-Jun-Protein bilden kann, erhalten durch Durchführung einer Cotranslationsselektion/Screening von IVV unter Verwendung des c-Jun-Proteins als Köder und einer Mausgehirn-cDNA-Bibliothek als Beute, und Verfahren zur Verwendung derselben. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verwendung eines Gens oder einer Nucleinsäuresequenz, codierend ein bekanntes Protein, von dem nicht bekannt war, dass es einen Komplex mit dem c-Jun-Protein bildet, bereit.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht nicht nur das Screening bekannter Gensequenzen und bekannter Nucleinsäuresequenzen, sondern kann auch ein neues Protein bereitstellen, das eine neue Aminosäuresequenz aufweist, gebildet durch eine unerwartete Leserahmen-Verlagerung, ein neues Protein mit einer Nucleinsäuresequenz, für das nur die Nucleinsäuresequenz, auf der Basis der Genominformation veröffentlicht wurde oder ein neues Protein mit einer vollständig neuen Nucleinsäuresequenz, weiterhin ein Protein, das einen Komplex durch eine unerwartete indirekte Wechselwirkung zusätzlich zu einer direkten Wechselwirkung bildet, ein Gen oder eine Nucleinsäuresequenz, die das Protein codieren, und Verfahren für die Verwendung derselben.

Hiernach werden die Aminosäuresequenzen der Proteine der vorliegenden Erfindung und die Sequenzen der Nucleinsäuren, die sie codieren, spezifisch beschrieben. Die folgenden Beispiele sollten jedoch nur als Hilfe für ein genaueres Verständnis der vorliegenden Erfindung konstruiert werden, und der Umfang der vorliegenden Erfindung ist auf keine Weise durch die folgenden Beispiele begrenzt.

Beispiel 1

Eine Cotranslationsselektion/Screening von IVV wurde unter Verwendung des c-Jun-Proteins als Köder und einer Mausgehirn-cDNA-Bibliothek als Beute (2) durchgeführt und im Ergebnis wurden Gene oder Nucleinsäuresequenzen, die neue Proteine codieren, die einen Komplex mit dem c-Jun-Protein bilden können, erhalten.

Das Herstellungsverfahren für den Köder, das c-Jun-Protein, war das folgende: Eine DNA-Matrize wurde aus einem pCMV-cJun(502–957)CBPzz-Vektor (SEQ ID NO: 256) durch PCR (Primer 5'SP6(O29)T7 (SEQ ID NO: 257) und 3'FosCBPzz (SEQ ID NO: 258), und dem PCR-Programm CYCB1 (siehe Tabelle 1)), wobei TakaRa Ex Taq (Takara Shuzo) verwendet wird, hergestellt. Die DNA-Matrize wurde transkribiert (37°C, 2 Stunden), wobei RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems (Promega) verwendet wurde, um eine mRNA-Matrize des Köder c-Jun-Proteins herzustellen. Eine Köder-DNA, die man coexistieren ließ, wurde durch PCR (Primer 5'-DNA (SEQ ID NO: 260) und 3'-DNA (SEQ ID NO: 161)) unter Verwendung von DNA-Fos/Jun (SEQ ID NO: 259), enthaltend die Fos/Jun-Bindungssequenz als Matrize gemäß dem PCR-Programm V-2 (siehe Tabelle 1)) hergestellt.

Das Herstellungsverfahren für die Mausgehirn-cDNA-Bibliothek als Beute war das folgende. Eine IVV-Zufallsbibliothek wurde wie in 3 dargestellt hergestellt. Als RNA-Bibliothek wurde eine kommerziell erhältliche Mausgehirn (PolyA+)-RNA-Bibliothek (erhalten durch Reinigung einer Gewebe-extrahierten RNA-Bibliothek in einer Oligo-dT-Säule, Clontech) erworben. Im Hinblick auf das Design eines Adaptors wurde dieser so entworfen, dass eine 5'-UTR-Sequenz, geeignet für die Erzeugung eines Zuordnungsmoleküls (Promotor SP6 + Enhancer O29 oder O') zu der Bibliothek als Sequenz, benötigt für die IVV-Bildung, zugefügt wurde. Für die Mausgehirn-(PolyA+)-RNA-Bibliothek wurde ein Adaptor mit dem Enhancer O29 verwendet. Die Hauptkette (SEQ ID NO: 262 oder 263) und die Subkette (gaattcgc) des Adaptors für den Enhancer 029 wurden jeweils in dem TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) bei einer Konzentration von 100 μM gelöst, und 10 μl von jeder der Lösungen der Hauptkette und Subkette wurden so vermischt, dass Haupt- und Subkette in äquimolaren Mengen vermischt waren. Die Mischung wurde für 2 Minuten auf 90°C und für 5 Minuten auf 70°C erwärmt, auf einem Wasserbad von 60°C abgesetzt und dann langsam von 60°C auf Raumtemperatur abgekühlt, indem die Wärmevorrichtung des Bads abgestellt wurde. Die Mischung wurde in 5 μl-Aliquots verteilt und bei –20°C gelagert. Dann wurde die Mausgehirn(PolyA+)-RNA-Bibliothek in einzelsträngige DNAs (3, I) revers transkribiert. 0,5 μg der Mausgehirn(PolyA+)-RNA-Bibliothek (1,4 pmol/0,5 μg), 2 pmol 3'-Zufallsprimer (SEQ ID NO: 264) und DEPC-Wasser wurden zugefügt, um ein Volumen von 12,0 μl zu erhalten, und die Mischung wurde 10 Minuten auf 70°C erwärmt und 1 Minute auf Eis abgekühlt. Eine reverse Transkriptionsreaktion wurde für 1 Stunde bei 45°C durchgeführt, wobei diese Mischung und SuperScriptII RT (SuperScript doppelsträngiges cDNA-Synthesekit, Invitrogen) verwendet wurden. Dann wurde die gesamte Menge der durch reverse Transkriptionsreaktion synthetisierten einzelsträngigen DNAs für eine Reaktion mit einer E. coli-DNA-Ligase, E. coli Polymerase I und E. coli RNase H (SuperScript doppelsträngiger cDNA-Synthesekit, Invitrogen) bei 16°C für 2 Stunden verwendet, und das Produkt wurde mit T4-DNA-Polymerase für 5 Minuten bei 16°C mit glatten Enden versehen, um doppelsträngige DNA zu synthetisieren (3, II). Dann wurde der vorher hergestellte Adaptor ligiert, indem man sich der Tatsache bediente, dass die 5'-Enden der doppelsträngigen DNAs phosphoryliert waren (3, III). Die synthetisierte doppelsträngige DNA-Bibliothek wurde einer Ethanolausfällung unterworfen und in 4 μl DEPC-Wasser gelöst. 100 μM des hergestellten Adaptors in einem Volumen von 1,0 μl und 50 μl Ligation High (TOYOBO) wurden hinzugefügt, über Nacht bei 16°C umgesetzt, gereinigt (DNA-Reinigungskit, QIAGEN) und dann auf ein Volumen von 50 μl eingestellt. Danach wurde eine PCR (EX Taq Hot Start Version, TaKaRa) durchgeführt (3, IV). Aus 50 μl der ligierten doppelsträngigen DNA-Bibliothek wurden 2 μl als Matrize zusammen mit einem 5'-PCR-Primer (SEQ ID NO: 260) mit einer spezifischen Sequenz, benötigt für IVV (O29) und einem 3'-PCR-Primer (SEQ ID NO: 261) zur Herstellung einer IVV-cDNA-Bibliothek verwendet. Im Hinblick auf die PCR-Bedingungen betrug das Gesamtvolumen 100 μl, und 20 Zyklen der Reaktionen (wobei jeder Zyklus aus Reaktionen bei 94°C für 30 Sekunden, bei 60°C für 30 Sekunden und bei 72°C für 90 Sekunden besteht, und die endgültige Verlängerungsreaktion für 180 Sekunden bei 72°C durchgeführt wurde) wurden durchgeführt.

Eine Cotranslation (26°C, 60 Minuten) der mRNA-Matrize des Köder-c-Jun-Proteins, der Mausgehirn-cDNA-Bibliothek als Beute, und der Köder-DNA, die man coexistieren ließ, wurde in einem zellfreien Translationssystem von Weizen (Weizenkeimextrakt, Promega) in einem Volumen von 50 μl durchgeführt. Zu 50 μl der Probe wurden 50 μl IgG-Bindungspuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% NP40) zugefügt, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu erhalten (Cotranslationsprobe). Dann wurde IgG-Agarose (Sigma) zweimal mit dem IgG-Bindungspuffer gewaschen, und die Cotranslationsprobe (100 μl) wurde hinzugefügt und die Mischung durch Rotation bei 4°C für 2 Stunden gerührt. IgG-Agarose wurde dreimal mit dem Bindungspuffer und einmal mit einem TEV-Spaltungspuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1 NP40, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT) gewaschen, und die Köder/Beute-Komplexbindung an IgG-Agarose wurde mit TEV-Protease (GIBCO-BRL, 16°C, 2 Stunden) gespalten. Unter Verwendung von 1 μl der gesammelten 100 μl Lösung als Matrize wurde eine RT-PCR (One Step RT-PCR kit (QIAGEN), Primer: SEQ ID NOS: 265 und 266, Programm: RT-QH3090 (siehe Tabelle 1)) in einem Volumen von 50 μl durchgeführt. Nachdem diese Prozedur (Schritt 1 in 2) 5 Runden wiederholt war, wurde die Bibliothek kloniert und sequenziert, um die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen der in 1 dargestellten Gene zu erhalten. Die DNA-Sequenz SEQ ID NOS., korrespondierend zu den Aminosäure-SEQ ID NOS: 1 bis 69 sind in der Liste 1 unten dargestellt. Dieselben Ergebnisse wurden für sowohl die unter Verwendung der Sequenz der SEQ ID NO: 262 als Hauptkette des Adaptors für den Enhancer O29 hergestellte Bibliothek als auch die Bibliothek, hergestellt unter Verwendung der Sequenz von SEQ ID NO: 263, erhalten.

<Liste 1>

  • 126(1), 127(2), 128(3), 129(4), 130(5), 131(6), 132(7), 133(8), 134(9), 135(10), 136(11), 137(12), 138(13), 139(14), 140(15), 141(16), 142(17), 143(18), 144(19), 145(20), 146(21-1), 147(21-2), 148(22), 149(23), 150(24), 151(25), 152(26), 153(27), 154(28), 155(29), 156(30), 157(31), 158(32), 159(33), 160(34-1), 161(34-2), 162(35), 163(36), 164(37), 165(38), 166(39), 167(40), 168(41), 169(42), 170(43-1), 171(43-2), 172(44), 173(45), 174(46), 175(47), 176(48), 177(49), 178(50), 179(51), 180(52), 181(53), 182(54), 183(55), 184(56), 185(57), 186(58), 187(59), 188(60), 189(61-1), 190(61-2), 191(62), 192(63), 193(64-1), 194(64-2), 195(65), 196(66), 197(67), 198(68), 199(69)

Alle diese Proteine sind Proteine, von denen erstmalig durch die vorliegende Erfindung aufgezeigt wurde, dass sie einen Komplex mit c-Jun bildeten.

Als Verifikationsexperiment der Wechselwirkungen der erhaltenen Proteine und c-Fos, wurde eine Expression der Proteine von SEQ ID NOS: 18 (SNAP19), 76 (KINN), 93 (Kif5a), 99 (Eef1d), 102 (Nef3), 106 (Jip-c3.1), 110 (Jip-c1), 113 (EB2), 115 (Cspg6), 117 (Mapk8ip3), 119 (Jip-c3.2), 121 (GFAP), 123 (Jip-c8) und 125 (Kif5b) (1) in einem zellfreien Translationssystem experimentell unter Verwendung der DNA-Sequenzen von SEQ ID NOS: 143, 206, 223, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249 und 253 gemäß den Beschreibungen WO 02/46395, Beispiel 1, (2) Herstellung des codierenden Moleküls und (3) Translation des codierenden Moleküls bestätigt, d. h. es wurde durch das C-terminale Markierungsverfahren bestätigt, dass die Proteine in einem zellfreien Translationssystem aus Weizen exprimiert wurden (4, A). Weiterhin wurden die C-terminal markierten Proteine, für die eine Expression bestätigt wurde, als Beute-Protein verwendet, um Wechselwirkungen davon mit dem Köder c-Jun durch Pull-down zu bestätigen. Im Hinblick auf das Herstellungsverfahren für das Beute-Protein wurde spezifisch ein PCR-Klonierungskit (QIAGEN) verwendet, um eine Sequenz, kloniert in den pDrive-Vektor (SEQ ID NO: 267, QIAGEN) aus Zellen zu extrahieren, und eine DNA-Matrize wurde durch PCR (Primer 5'F3 (SEQ ID NO: 268) and 3'R3 (SEQ ID NO: 269), PCR-Programm: ISHI1562 (siehe Tabelle 1), 100 μl Skala) unter Verwendung von TakaRa Ex Taq (Takara Shuzo) hergestellt. Die DNA-Matrize wurde transkribiert (37°C, 2 Stunden, 50 μl Skala), wobei RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems (Promega) verwendet, wurde, um eine mRNA-Matrize des Beute-Proteins herzustellen.

Das Herstellungsverfahren für das Köder-c-Jun-Protein ist dasselbe wie dasjenige, das für das Screening verwendet wurde.

Die zellfreie Translation der Beute-Matrize (10 μl Skala) wurde für 1 Stunde unter Verwendung des C-terminalen Markierungsverfahrens durchgeführt, um ein Beute-Protein in einem C-terminal markierten Zustand herzustellen. Gleichzeitig wurde die Translationsreaktion der Köder-c-Jun-Matrize für 1 Stunde durch zellfreie Translation (50 μl Skala) durchgeführt, um das Köderprotein zu erzeugen. Nach der Translation wurden die beiden und der Bindungspuffer vermischt (Beute: 8 μl, Köder: 10 μl, IgG-Bindungspuffer: 82 μl) und mit 50 μl IgG-Agarosekügelchen 2 Stunden inkubiert, und die Kügelchen wurden gewaschen, dann mit 20 μl eines Puffers, enthaltend SDS versetzt, bei 100°C 5 Minuten gekocht und eluiert. Diese Probe wurde durch 17,5% SDS-PAGE entwickelt, und das FITC-Fluorochrom wurde durch einen Fluoreszenzabbilder beobachtet (4, B). Zusätzlich wurde auch eine Reaktion ohne Zugabe des Köder c-Jun-Proteins als Kontrolle durchgeführt.

Als Ergebnis konnte bestätigt werden, dass die Proteine der SEQ ID NOS: 18 (SNAP19), 76 (KINN), 93 ((Kif5a), 99 (Eef1d), 102((Nef3), 106 (Jip-c3.1), 110 (Jip-c1), 113 (EB2), 115 (Cspg6), 117 (Mapk8ip3), 119 (Jip-c3.2) and 123 (Jip-c8) direkt mit c-Jun in Wechselwirkung treten.

Weiterhin wurde die Konzentration von Genen, die direkt oder indirekt mit c-Jun in Wechselwirkung treten durch Echtzeit-PCR unter Verwendung der Nucleinsäuresequenzen von SEQ ID NOS: 143, 206, 223, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249, 253 und 255 (5) bestätigt. Da SEQ ID NOS: 251 (GFAP) und 255 (Kif5b) auch ähnliche wie andere Gene einer direkten Wechselwirkung konzentriert waren, konnte bestätigt werden, dass es eine indirekte Wechselwirkung mit c-Jun gab.

Im Hinblick auf das spezifische Verfahren der Echtzeit-PCR wurden Primer (SEQ ID NOS: 270 bis 297) für 14 Arten von Genen (SEQ ID NOS: 143, 206, 223, 229, 232, 236, 240, 243, 245, 247, 249, 253 und 255) entworfen, so dass die Amplifikation in Bereichen von Sequenzen, erhalten durch das Screening, erreicht werden sollte. Für die Herstellung von Kalibrierungskurven wurde ein Gen, umfassend ein DNA-Fragment einer positiven Kontrolle, eingebaut in den pDrive-Vektor durch PCR amplifiziert (5'M13_F Primer (SEQ ID NO: 298) und 3'M13_R Primer (SEQ ID NO: 299) wurden verwendet, und das PCR-Programm Lightcycler von Tabelle 1 wurde verwendet), was so kontrolliert wurde, dass 1E03, 1E05, 1E07 oder 1E09 Klone/Reaktion erhalten werden sollten. Die Messung wurde so kontrolliert, dass jede Bibliotheks-DNA vor dem Screening, Bibliotheks-DNA in jedem Screening-Zyklus und eine Leerproben-Bibliothek-DNA, der der Köder c-Jun nicht zugefügt worden war, in einer Menge von 5 ng/Reaktion vorliegen sollte. Die PCR-Messreaktion wurde in einer Skala von 20 μl gemäß den in Tabelle 1 dargestellten Programmen durchgeführt, wobei ein LightCycler Instrument oder LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (beide von Roche Diagnostics erzeugt) verwendet wurden.

Weiterhin können die Proteine und Gene oder Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden ERfindung als Inhibitor zur Blockierung der Transkription, Genduplikation usw. verwendet werden, als Funktionen von c-Jun durch Verwendung der neuen Funktion davon (in diesem Fall Funktion der Ermöglichung der Bindung mit c-Jun). Die Basis des Obigen liegt in der Tatsache, dass die Gene, nachgewiesen durch das IVV-Verfahren, durch ein kompetitives Verfahren nachgewiesen wurden, gebildet durch ein Screening, das viele Male wiederholt wurde. Daher zeigen die durch das IVV-Verfahren nachgewiesenen Gene eine bestimmte Zahlverteilung, und ein Gen mit einer stärkeren kompetitiven Kraft sollte in größerr Zahl nachgewiesen werden. Dies legt nahe, dass eine größe Zahl von Klonen zu einer stärkeren kompetitiven Kraft korrespondiert, und so wirkt ein solches Gen effektiver als Blockierungsmittel oder Inhibitor. Bei der in diesem Beispiel durchgeführten IVV-Selektion wurden drei (/132) von c-Fos, wohl bekannt als Beute, eins (/132) von c-Jun, eins (/132) of ATF4 und fünf (/132) von Jpp2 für den Köder c-Jun nachgewiesen. So legt die Zahl von Klonen (1), nachgewiesen in der Selektion, nahe, dass SNAP19, KINN usw. eine sehr viel stärkere Kompetitionskraft aufweisen im Vergleich zu bekannten Proteinen; Kif5a, Eef1d, Nef3, Jip-c3.1, Jip-c1 usw. ausreichend mit c-Fos kompetitieren können; und EB2, Cspg6, Mapk8ip3, Jip-c3.2, Jip-c8 usw. ausreichend mit c-Jun oder ATF4 kompetitieren können, und dass so die Proteine als Inhibitor für die Blockierung von Funktionen der Transkription eines Komplexes, Genduplikation usw. durch Wechselwirkung von c-Jun und einem bekannten Protein verwendet werden können. Tabelle 1: PCR-Programme X: Anhaftungstemperatur bei 62 bis 51°C, abhängig von den Tm-Werten der Primer.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Da Proteine, die mit c-Jun in Wechselwirkung treten, bereitgestellt wurden, wird es möglich, Proteine bereitzustellen, die nicht nur durch direkte Wechselwirkung, sondern auch durch unerwartete indirekte Wechselwirkung einen Komplex mit c-Jun bilden, und Nucleinsäuren, codierend diese Proteine, wie auch Verfahren, um sie zu verwenden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.