Title:
Neuartige photolabile Schutzgruppen für verbesserte Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotid-Arrays
Kind Code:
B4
Abstract:

Verwendung einer Verbindung mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird; ...



Inventors:
Bühler, Sigrid (84478, Waldkraiburg, DE)
Ott, Markus (84559, Kraiburg, DE)
Pfleiderer, Wolfgang (78464, Konstanz, DE)
Application Number:
DE112004000265T
Publication Date:
11/13/2014
Filing Date:
02/19/2004
Assignee:
Nigu Chemie GmbH, 84478 (DE)
Other References:
Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996), 4(10): 1649-1658
Tetrahedron (1992), 48(20), 4171-4182
Tetrahedron (1997), 53(12):4247-4264
Claims:
1. Verwendung einer Verbindung mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
R9 aus der Gruppe bestehend aus H oder ausgewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgewählt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst,
in einem Verfahren mit lichtgesteuerter Synthese von Oligonukleotiden.

2. Verwendung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel (2): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H ist; oder
R1 H ist unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgewählt wird, die die photolabile Schutzgruppe oder ein Desoxyribonukleosid oder ein Ribonukleosid umfasst, die durch eine der folgenden Formeln (3) oder (4) repräsentiert werden: wobei
R5 aus der Gruppe bestehend aus einem H, einem Oligonukleotid oder einer funktionellen Gruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist;
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist;
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgewählt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus eine Schutzgruppe tragen können, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; oder
Z aus der Gruppe bestehend aus einem chemisch modifizierten Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid oder einem Analogon davon ausgewählt wird, verwendet wird.

3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Y eine Alkylgruppe ist, die aus der Gruppe bestehend aus Methyl oder tert-Butyl ausgewählt wird, und R2 H ist.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R1 gleich H ist und R2 ein optional substituiertes Phenyl ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R1 gleich H ist und R2 ein optional substituiertes Benzoyl ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei W gleich O ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-, Alkenyl-, Acetal- oder Silylether-Schutzgruppe ausgewählt wird.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei W gleich S ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-Schutzgruppe ausgewählt wird.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei R6 aus der Gruppe bestehend aus einem O-Methyl, O-Ethyl, O-Allyl, O-Tetrahydropyranyl, O-Methoxytetrahydropyranyl oder einem O-t-Butyldimethylsilyl ausgewählt wird.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin oder Guanin ausgewählt wird und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Phenoxyacetyl, 4-tert-Butylphenoxyacetyl, 4-Isopropylphenoxyacetyl oder Dimethylformamidino ausgewählt wird.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei B Adenin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl oder p-Nitrophenyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird.

11. Verwendung nach Anspruch 9, wobei B Guanin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird.

12. Verwendung nach Anspruch 9, wobei B Cytosin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, t-Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 12, wobei R5 eine Phosphitamid oder eine intermediäre OH-Schutz- oder eine Dimethoxytrityl- oder eine Monomethoxytrityl- oder eine Silylgruppe ist.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Z aus einer Abgangsgruppe ausgewählt wird.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Abgangsgruppe aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Imidazolyl oder Nitrophenoxyl ausgewählt wird.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die lichtgesteuerte Oligonukleotid-Synthese an einem festen Träger erfolgt.

17. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16,
wobei die lichtgesteuerte Oligonukleotid-Synthese folgende Schritte umfasst:
a) Anlagern eines Nukleosids oder Nudleotids nach Formel 2 das die photolabile Schutzgruppe an seiner primären Hydroxylgruppe umfasst, als ersten Baustein über seine sekundäre Hydroxylgruppe an einem Träger;
b) Bestrahlen des aus Schritt a) resultierenden trägergebundenen Nukleosids oder Nukleotids, so dass die Schutzgruppe an der primären Hydroxylgruppe entfernt wird, wodurch die primäre Hydroxylgruppe entschützt wird;
c) Reagieren des aus Schritt b) resultierenden trägergebundenen Nukleotids in Gegenwart eines Aktivators mit einem aus Anspruch 12 ausgewählten zweiten Nukleotid, das eine Schutzgruppe an seiner primären Hydroxylgruppe und eine funktionelle Phosphoramidit-Gruppe an seiner sekundären Hydroxylgruppe umfasst, um eine internukleosidische Phosphor-Verbindung zu bilden;
d) optionales Capping von unreagierten primären Hydroxylgruppen mit einer inerten Alkohol-Schutzgruppe;
e) Oxidieren der internukleosidischen Phosphor-Verbindung zum natürlich vorkommenden fünfwertigen Zustand;
f) Wiederholen der Schritte b) bis d), während nacheinander die Phsphoramidit-Bausteine in einer vorbestimmten Reihenfolge angebracht werden, bis der gewünschte Oligonukleotidstrang vollständig ist; und
g) Entfernen aller Nukleobase- und Phosphat-Schutzgruppen.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17,
wobei die lichtgesteuerte Oligonukleotid-Synthese folgende Schritte umfasst:
a) Anlagern eines Nukleosids oder Nudleotids nach Formel 2 das die photolabile Schutzgruppe an seiner primären Hydroxylgruppe umfasst, als ersten Baustein über seine sekundäre Hydroxylgruppe an einem Träger;
b) Bestrahlen des aus Schritt a) resultierenden trägergebundenen Nukleosids oder Nukleotids, so dass die Schutzgruppe an der primären Hydroxylgruppe entfernt wird, wodurch die primäre Hydroxylgruppe entschützt wird;
c) Reagieren des aus Schritt b) resultierenden trägergebundenen Nukleotids in Gegenwart eines Aktivators mit einem aus Anspruch 12 ausgewählten zweiten Nukleotid, das eine Schutzgruppe an seiner sekundären Hydroxylgruppe und eine funktionelle Phosphoramidit-Gruppe an seiner primären Hydroxylgruppe umfasst, um eine internukleosidische Phosphor-Verbindung zu bilden;
d) optionales Capping von unreagierten sekundären Hydroxylgruppen mit einer inerten Alkohol-Schutzgruppe;
e) Oxidieren der internukleosidischen Phosphor-Verbindung zum natürlich vorkommenden fünfwertigen Zustand;
f) Wiederholen der Schritte b) bis d), während nacheinander die Phsphoramidit-Bausteine in einer vorbestimmten Reihenfolge angebracht werden, bis der gewünschte Oligonukleotidstrang vollständig ist; und
g) Entfernen aller Nukleobase- und Phosphat-Schutzgruppen.

19. Verbindung mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
R9 aus der Gruppe bestehend aus H oder gewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgewählt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst.

20. Verbindung nach Anspruch 19,
mit der folgenden allgemeinen Formel (2): wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgewählt wird, die die photolabile Schutzgruppe oder ein Desoxyribonukleosid oder ein Ribonukleosid umfasst, die durch eine der folgenden Formeln (3) oder (4) repräsentiert werden: wobei
R5 aus der Gruppe bestehend aus einem H, einem Oligonukleotid oder einer funktionellen Gruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist;
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist;
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgewählt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus eine Schutzgruppe tragen können, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; oder
Z aus der Gruppe bestehend aus einem chemisch modifizierten Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid oder einem Analogon davon ausgewählt wird.

21. Verbindung nach Anspruch 19 bis 20, wobei R1 gleich H ist und R2 ein optional substituiertes Phenyl ist.

22. Verbindung nach Anspruch 19 bis 20, wobei R1 gleich H ist und R2 ein optional substituiertes Benzoyl ist.

23. Verbindung nach Anspruch 20 bis 22, wobei W gleich O ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-, Alkenyl-, Acetal- oder Silylether-Schutzgruppe ausgewählt wird.

24. Verbindung nach Anspruch 20 bis 22, wobei W gleich S ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-Schutzgruppe ausgewählt wird.

25. Verbindung nach Anspruch 20 bis 24, wobei R8 aus der Gruppe bestehend aus einem O-Methyl, O-Ethyl, O-Allyl, O-Tetrahydropyranyl, O-Methoxytetrahydropyranyl oder einem O-t-Butyldimethylsilyl ausgewählt wird.

26. Verbindung nach Anspruch 20 bis 25, wobei B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin oder Guanin ausgewählt wird und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Phenoxyacetyl, 4-tert-Butylphenoxyacetyl, 4-Isopropylphenoxyacetyl oder Dimethylformamidino ausgewählt wird.

27. Verbindung nach Anspruch 26, wobei B Adenin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl oder p-Nitrophenyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird.

28. Verbindung nach Anspruch 26, wobei B Guanin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird.

29. Verbindung nach Anspruch 26, wobei B Cytosin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, t-Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird.

30. Verbindung nach Anspruch 20 bis 29, wobei R5 eine Phosphitamid oder eine intermediäre OH-Schutz- oder eine Dimethoxytrityl- oder einer Monomethoxytrityl- oder eine Silylgruppe ist.

31. Verbindung nach Anspruch 19 bis 22, wobei Z aus einer Abgangsgruppe ausgewählt wird.

32. Verbindung nach Anspruch 31, wobei die Abgangsgruppe aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Imidazolyl oder Nitrophenoxyl ausgewählt wird.

33. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 19 bis 32,
wobei R9 ≠ H, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Alkohol der allgemeinen Formel (1), wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
R9 H ist;
als ein Reagenz verwendet wird.

34. Verfahren nach Anspruch 33,
wobei ein Alkohol der allgemeinen Formel (1), wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
R9 H ist;
mit einer eine Hydroxyl- oder Aminofunktion tragenden Verbindung zur Reaktion gebracht wird, umfassend zumindest die Schritte zum
a) Aktivieren entweder des Alkohols der Formel (1) oder der die Hydroxylfunktion tragenden Verbindung durch Umwandlung der Hydroxylfunktion in einen aktivierten Carbonatester, Thiocarbonatester oder ein Sulfonat; und
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonatesters oder Thiocarbonatesters oder Sulfonats mit der nicht aktivierten Verbindung.

35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34,
umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Alkohols mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
R9 H ist;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung, um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen; und
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonatesters oder Thiocarbonatesters mit einer Verbindung, die ein primäres Amin, ein sekundäres Amin oder eine Hydroxylgruppe aufweist.

36. Verfahren nach Anspruch 35,
wobei der aktivierte Carbonatester oder Thiocarbonatester die allgemeine Formel (2) hat: wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einem Halogen, Imidazolyl, Nitrophenoxyl, (Thio)carbonat und (Thio)carbamat ausgewählt wird.

37. Verfahren nach Anspruch 33 bis 36,
zur Herstellung eines derivatisierten Nukleosids oder Nukleosid-Analogons davon, umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Alkohols mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
R9 H ist;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung, um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen;
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonat- oder Thiocarbonatesters mit einem Nukleosid, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel (5): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; und
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosind, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgewählt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus optional eine Schutzgruppe tragen können, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; oder mit einem nukleosidischen Derivat oder Analogon, das eine ungeschützte primäre Hydroxylfunktion umfasst;
oder mit einem Nukleosid, das ausgewählt wird aus der Gruppe von Verbindungen mit der allgemeinen Formel (6): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; und
R7 aus einer intermediären Schutzgruppe oder aus der Gruppe von nukleosidischen und nukleotidischen Derivaten einschließlich Analoga davon ausgewählt wird, die ein intermediär geschätztes primäres Hydroxyl umfassen;
c) optionalen Entfernen der intermediären Schutzgruppe und Reinigen des Produkts; und
d) optionalen Reagieren des Produkts von Schritt b) oder c) mit einem Phosphitylierungs-Reagenz, um nach der Reinigung ein Phosphoramidit zu bilden.

38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Phosphitylierungs-Reagenz Bis(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphan ist.

39. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34,
zur Herstellung eines derivatisierten Nukleosids oder Nukleosid-Analogons davon, umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Nukleosids, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel (5): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; und
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosind, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgewählt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus optional eine Schutzgruppe tragen können, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; oder Reagieren eines nukleosidischen Derivats oder Analogons, das eine ungeschützte primäre Hydroxylfunktion umfasst;
oder Reagieren eines Nukleosids, das ausgewählt wird aus der Gruppe von Verbindungen mit der allgemeinen Formel (6): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Okigonukleotid-Synthese nützlich ist; und
R7 aus einer intermediären Schutzgruppe oder aus der Gruppe von nukleosidischen und nukleotidischen Derivaten einschließlich Analoga davon ausgewählt wird, die ein intermediär geschätztes primäres Hydroxyl umfassen; oder Reagieren eines nukleosidischen Derivats oder Analogons, das eine ungeschützte sekundäre Hydroxylfunktion umfasst;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen;
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonat- oder Thiocarbonatesters mit einem Alkohol der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
R9 H ist;
c) optionalen Entfernen der intermediären Schutzgruppe und Reinigen des Produkts; und
d) Reagieren des Produkts von Schritt b) oder c) mit einem Phosphitylierungs-Reagenz, um nach der Reinigung ein Phosphoramidit zu bilden.

40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei das Phosphatylierungs-Reagenz Bis(diisopropylamino)-β-cyanoethxyphosphan ist.

41. Verbindung mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
R9 aus der Gruppe bestehend aus H oder gewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgewählt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst.

42. Verbindung nach Anspruch 41,
mit der folgenden allgemeinen Formel (2): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H ist;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgewählt wird, die die photolabile Schutzgruppe oder ein Desoxyribonukleosid oder ein Ribonukleosid umfasst, die durch eine der folgenden Formeln (3) oder (4) repräsentiert werden: wobei
R5 aus der Gruppe bestehend aus einem H, einem Oligonukleotid oder einer funktionellen Gruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist;
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist;
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgewählt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus eine Schutzgruppe tragen können, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; oder
Z aus der Gruppe bestehend aus einem chemisch modifizierten Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid oder einem Analogon davon ausgewählt wird.

43. Verbindung nach Anspruch 41 oder 42, wobei Y eine Alkylgruppe ist, die aus der Gruppe bestehend aus Methyl oder tert-Butyl ausgewählt wird, und R2 H ist.

44. Verbindung nach Anspruch 42 bis 43, wobei W gleich O ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-, Alkenyl-, Acetal- oder Silylether-Schutzgruppe ausgewählt wird.

45. Verbindung nach Anspruch 42 bis 43, wobei W gleich S ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-Schutzgruppe ausgewählt wird.

46. Verbindung nach Anspruch 42 bis 45, wobei R6 aus der Gruppe bestehend aus einem O-Methyl, O-Ethyl, O-Allyl, O-Tetrahydropyranyl, O-Methoxytetrahydropyranyl oder einem O-t-Butyldimethylsilyl ausgewählt wird.

47. Verbindung nach Anspruch 42 bis 46, wobei B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin oder Guanin ausgewählt wird und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Phenoxyacetyl, 4-tert-Butylphenoxyacetyl, 4-Isopropylphenoxyacetyl oder Dimethylformamidino ausgewählt wird.

48. Verbindung nach Anspruch 47, wobei B Adenin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl oder p-Nitrophenyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird.

49. Verbindung nach Anspruch 47, wobei B Guanin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird.

50. Verbindung nach Anspruch 47, wobei B Cytosin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, t-Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird.

51. Verbindung nach Anspruch 42 bis 50, wobei R5 eine Phosphitamid oder eine intermediäre OH-Schutz- oder eine Dimethoxytrityl- oder einer Monomethoxytrityl- oder eine Silylgruppe ist.

52. Verbindung nach Anspruch 41 bis 43, wobei Z aus einer Abgangsgruppe ausgewählt wird.

53. Verbindung nach Anspruch 52, wobei die Abgangsgruppe aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Imidazolyl oder Nitrophenoxyl ausgewählt wird.

54. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 41 bis 53, wobei R9 ≠ H, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Alkohol der allgemeinen Formel (1), wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
R9 H ist;
als ein Reagenz verwendet wird.

55. Verfahren nach Anspruch 54,
wobei ein Alkohol der allgemeinen Formel (1), wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
R9 H ist,
mit einer eine Hydroxyl- oder Aminofunktion tragenden Verbindung zur Reaktion gebracht wird, umfassend zumindest die Schritte zum
a) Aktivieren entweder des Alkohols der Formel (1) oder der die Hydroxylfunktion tragenden Verbindung durch Umwandlung der Hydroxylfunktion in einen aktivierten Carbonatester, Thiocarbonatester oder ein Sulfonat; und
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonatesters oder Thiocarbonatesters oder Sulfonats mit der nicht aktivierten Verbindung.

56. Verfahren nach Anspruch 55 oder 54,
umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Alkohols mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
R9 H ist;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung, um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen; und
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonatesters oder Thiocarbonatesters mit einer Verbindung, die ein primäres Amin, ein sekundäres Amin oder eine Hydroxylgruppe aufweist.

57. Verfahren nach Anspruch 56,
wobei der aktivierte Carbonatester oder Thiocarbonatester die allgemeine Formel (2) hat: wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einem Halogen, Imidazolyl, Nitrophenoxyl, (Thio)carbonat und (Thio)carbamat ausgewählt wird.

58. Verfahren nach Anspruch 54 bis 57
zur Herstellung eines derivatisierten Nukleosids oder Nukleosid-Analogons davon, umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Alkohols mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
R9 H ist;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung, um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen;
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonat- oder Thiocarbonatesters mit einem Nukleosid, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel (5): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; und
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgewählt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus optional eine Schutzgruppe tragen können, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist;
oder mit einem nukleosidischen Derivat oder Analogon, das eine ungeschützte primäre Hydroxylfunktion umfasst;
oder mit einem Nukleosid, das ausgewählt wird aus der Gruppe von Verbindungen mit der allgemeinen Formel (6): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; und
R7 aus einer intermediären Schutzgruppe oder aus der Gruppe von nukleosidischen und nukleotidischen Derivaten einschließlich Analoga davon ausgewählt wird, die ein intermediär geschütztes primäres Hydroxyl umfassen;
c) optionalen Entfernen der intermediären Schutzgruppe und Reinigen des Produkts; und
d) optionalen Reagieren des Produkts von Schritt b) oder c) mit einem Phosphitylierungs-Reagenz, um nach der Reinigung ein Phosphoramidit zu bilden.

59. Verfahren nach Anspruch 58, wobei das Phosphatylierungs-Reagenz Bis(diisopropylamino)-β-cyanoethxyphosphan ist.

60. Verfahren nach Anspruch 54 oder 55
zur Herstellung eines derivatisierten Nukleosids oder Nukleosid-Analogons davon, umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Nukleosids, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel (5): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; und
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgewählt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus optional eine Schutzgruppe tragen können, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist;
oder Reagieren eines nukleosidischen Derivats oder Analogons, das eine ungeschützte primäre Hydroxylfunktion umfasst;
oder Reagieren eines Nukleosids, das ausgewählt wird aus der Gruppe von Verbindungen mit der allgemeinen Formel (6): wobei
R8 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; und
R7 aus einer intermediären Schutzgruppe oder aus der Gruppe von nukleosidischen und nukleotidischen Derivaten einschließlich Analoga davon ausgewählt wird, die eine intermediär geschützte primäre Hydroxylfunktion umfassen;
oder Reagieren eines nukleosidischen Derivats oder Analogons, das eine ungeschützte sekundäre Hydroxylfunktion umfasst;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung, um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen;
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonat- oder Thiocarbonatesters mit einem Alkohol mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
R9 H ist;
c) optionalen Entfernen der intermediären Schutzgruppe und Reinigen des Produkts; und
d) Reagieren des Produkts von Schritt b) oder c) mit einem Phosphitylierungs-Reagenz, um nach der Reinigung ein Phosphoramidit zu bilden.

61. Verfahren nach Anspruch 58, wobei das Phosphatylierungs-Reagenz Bis(diisopropylamino)-β-cyanoethxyphosphan ist.

62. Methode zum Entfernen einer photolabilen Schutzgruppe mit der allgemeinen Formel: wobei die Methode den Schritt des Bestrahlens einer Verbindung umfasst, die die Schutzgruppe enthält und R1, R2, R3, R4 sowie X entsprechend Anspruch 1 definiert sind.

Description:
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft photolabile Verbindungen, Reagenzien für deren Herstellung und Verfahren für deren Verwendung als photospaltbare Schutzgruppen, insbesondere bei der Synthese von High-Density-Arrays von Oligonukleotiden an einem festen Träger.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Synthetische Nukleinsäure-Microarrays haben bei Analysen von Nukleinsäure-Proben aus biologischen Quellen eine erhebliche Bedeutung erlangt. Sie sind leistungsfähige Werkzeuge, die sich entsprechend den Anforderungen der biologischen und biomedizinischen Wissenschaften für die Analyse komplexer Mischungen von Nukleinsäuren eignen. Zu den Anwendungen von Microarrays zählen die Forschung, deren Ziel das Verständnis der Wechselbeziehung zwischen Gensequenzen und deren Funktion ist; die Analyse des Expressionsmusters verschiedener Organismen und Gewebe, die man bei der Entdeckung von Arzneimitteln verwenden kann; die Analyse der genetischen Variation zwischen Individuen, die bei der Entwicklung individueller Arzneimittel eingesetzt wird; und die Analyse von Mutationsmustern bei spezifischen Geweben, die bei der Krebsforschung und -diagnose von Nutzen ist. Eine weitere Anwendung ist der Einsatz von Microarrays zur Sequenzierung von Nukleinsäuren durch Analyse des Hybridisierungsmusters, das aus einer speziellen Nukleinsäure-Sequenz an einem Array erhalten wurde. Da man alle Analysemethoden, die auf der Nukleinsäure-Hybridisierung basieren, mit Nukleinsäure-Microarrays durchführen kann, ergeben sich daraus zahlreiche andere wichtige Anwendungen der Microarrays, während außerdem ständig neue Anwendungen entstehen.

Bei Anwendungen von Nukleinsäure-Microarrays dienen oberflächengebundene Oligonukleotide der Arrays (Sonden) dazu, Probensequenzen (Targets) durch komplementäre Erkennung (Hybridisierung) parallel zu analysieren. Bedingt durch die Komplexität der Nukleinsäure-Sequenzinformationen in biologischen Proben und den Wert der normalerweise kleinen biologischen Proben besteht ein steigender Bedarf an Microarrays mit miniaturisierten Features, die hochparallele Analysen solcher kleinen Proben ermöglichen. Dieser Bedarf wird am besten durch die lichtgesteuerte Synthese von Microarrays für die parallele In-situ-Assemblierung von Oligopeptiden und Oligonukleotiden an Trägern erfüllt, wie es ursprünglich beispielsweise von Fodor et al. (1991), Science 251: 767–773; Pirrung et al., US-Patent Nr. 5,143,854; und Chee et al. (1996), Science 274: 610–614, beschrieben wurde. Wegen des schnellen Fortschritts bis heute ermöglicht dieser Ansatz den Aufbau von Feature-Größen mit 2,1 × 10–4 μm2 und möglicherweise sogar noch kleiner, wie es von Singh-Gasson et al. (1999), Nature Biotech. 17: 974–978, beschrieben wurde. Im Gegensatz dazu kann man mit Microarrays, die durch Spotting von vorgefertigten Oligonukleotiden oder cDNA-Proben auf Oberflächen assembliert werden, Feature-Größen von ca. 75 μm2 herstellen, wie es beispielsweise bei Bowtell und Sambrook (Herausgeber) in ”DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002), besprochen wurde. Wegen der leichten und flexiblen räumlichen Adressierung von Reaktionsstellen auf dem Träger ergibt sich ein weiterer Vorteil der lichtgesteuerten Array-Assemblierung daraus, dass sie parallel und automatisiert ablaufen kann.

Damit Microarrays breitere Verwendung finden, müssen sie zu annehmbaren Kosten erhältlich sein, wobei die Kosten für Microarrays unter anderem von verschiedenen Faktoren abhängen: dem Verbrauch von Reagenzien bei ihrer Herstellung, dem Grad der Automatisierung und dem Durchsatz der in der Produktionseinrichtung hergestellten Arrays. Da Microarrays aus der lichtgesteuerten Synthese sequenziell durch viele chemische Prozesse auf die Array-Oberfläche aufgebracht werden, sind die einzelnen Schritte zur Erhöhung des Durchsatzes unter allen Umständen zu optimieren.

Lichtgesteuerte Synthesen von Microarrays sind hauptsächlich auf die üblichen, hochoptimierten Anordnungen für die Synthese von Oligonukleotiden an festen Trägern unter Nutzung der Phosphoramidit-Chemie angewiesen, wie beispielsweise von Beaucage et al. (1992), Tetrahedron 48: 2223–2311), beschrieben, dessen gesamter Inhalt hier einbezogen wird. Sie umfassen die schrittweise Anlagerung von durch eine Phosphoramidit-Gruppe aktivierten Nukleosid-Synthonen in vorbestimmter Reihenfolge an – je nach der Richtung der Kettenverlängerung – die 5'-funktionelle Gruppe oder die 3'-funktionelle Gruppe des wachsenden Strangs, der an einen Träger wie beispielsweise die Oberfläche eines DNA-Chips gebunden ist. Jeder Elongationsschritt besteht im Allgemeinen aus einem Reaktionszyklus, der Folgendes umfasst: Entschützen der 5'- oder 3'-Hydroxylgruppe des wachsenden Strangs; Kettenverlängerung durch Zusatz eines Nukleosid-Phosphoramidits und eines Aktivators; optionales Capping von unreagierten endständigen Hydroxylgruppen; und Oxidation der neu gebildeten internukleosidischen Phosphorbindung in den fünfwertigen Zustand. Arrays, die die in 5'- zu 3'-Richtung assemblierten Oligonukleotid-Sonden umfassen, eignen sich für Versuche, die auf die Hybridisierung angewiesen sind, und Versuche, bei denen Enzymreaktionen wie beispielsweise Elongation oder Ligation beteiligt sind, da die 3'-Enden ihrer Oligonukleotid-Sonden frei zugänglich sind, wie es von Beier et al. (2001), Helv. Chim. Acta 84: 2089–2095, beschrieben wurde.

Da alle Reaktionen eines Kettenverlängerungszyklus bis auf den Schritt des Entschützens im Grunde genommen gemäß den gut ausgearbeiteten herkömmlichen Verfahren und mit erheblichem Überschuss an Reagenzien durchgeführt werden, sind sie im Wesentlichen quantitativ. Bei der lichtgesteuerten Microarray-Assemblierung von Oligonukleotiden wird der Schritt des Entfernens der säurelabilen Standard-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe (DMT) durch photochemisches Entfernen von lichtempfindlichen Schutzgruppen ersetzt, was eine einschränkende Reaktion in Bezug auf die Effizienz und Dauer des Kettenverlängerungszyklus ist. Bei der normalerweise verwendeten [(α-Methyl-2-nitropiperonyl)oxy]carbonyl-Schutzgruppe (MeNPOC) beträgt die Ausbeute des photochemischen Entschützens am Träger bei der ”trockenen” Methode (d. h. ohne Lösemittel) folglich nur ungefähr 90%, woraus eine Zykluseffizienz von unter 90% resultiert, wie von Barone et al. (2001), Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 20: 525–531, und McGall et al. (1997), J. Am. Chem. Soc. 119: 5081–5090, beschrieben wurde, deren gesamter Inhalt hier einbezogen wird. Solche Umwandlungsraten sind relativ mäßig im Vergleich zu der Standardtechnologie mit Schützen durch DMT und führen zur Bildung von Fehlsequenzen und zu abgebrochenen Oligonukleotid-Sonden, wobei die gewünschten Sequenzen mit voller Länge bei einem Array mit 20-mer-Sonden nur etwa 10% des Ganzen ausmachen.

Darüber hinaus müssen die Bestrahlungszeiten beim Entfernen der MeNPOC-Gruppe im trockenen Zustand ungefähr 1 Minute oder länger dauern, wenn das Entschützen in Gegenwart eines Lösemittels durchgeführt wird. Bei jedem Elongationsschritt in der Synthese eines Oligonukleotid-Arrays sind vier den Kupplungsschritten entsprechende photolytische Schritte erforderlich, die anschließend mit jedem der vier nukleotidischen Synthone in vordefinierten Bereichen am Träger erfolgen. Die Gesamtzeit, die für das Entschützen benötigt wird, beläuft sich auf 4 × N Minuten für die Assemblierung eines Arrays von N-meren. Kurze Zeiten für das Entschützen sind also sehr wichtig, um höhere Durchsatzraten bei der Array-Assemblierung zu erzielen.

Die Photospaltung von MeNPOC-geschützen Nukleosiden läuft unter trockenen Bedingungen oder in weniger polaren Lösemitteln wie beispielsweise Toluol oder Dioxan am schnellsten ab. Ferner sind, wie oben erörtert, die sich ergebenden Ausbeuten und die entsprechende Kupplungseffizienz bestenfalls mäßig. Dagegen benötigt die ebenfalls häufig einsetzte 2-(2-Nitrophenyl)-propoxycarbonyl-Gruppe (NPPOC) Bestrahlungszeiten, die im trockenen Zustand wesentlich länger dauern, aber in polaren Lösungen wie beispielsweise Mischungen von Wasser mit Acetonitril oder Methanol viel kürzer sind, wie von Giegrich et al. (1998), Nucleosides & Nucleotides 17: 1987–1996, beschrieben wurde. Bei NPPOC-Nukleosiden wurden beim Entschützen weiter verbesserte Raten durch Beer et al. (2000), Nucleic Acids Res. 28: e11, mittels Bestrahlung in Acetonitril erzielt, das eine geringe Menge einer Base wie beispielsweise DBU oder NMI enthielt. Dieses Verfahren bewirkt eine um 12% höhere Zykluseffizienz als die Anwendung von MeNPOC-geschützten Phosphoramiditen in der trockenen Entschützungsform.

Frühe Berichte über photospaltbare Schutzgruppen in der Nukleosid- und Nukleotid-Chemie bezogen sich auf die Ether und Carbonatester der ortho-Nitrobenzyl-Gruppe einschließlich deren Derivaten, wie von Pillai, in Organic Photochemistry, Ed. Padwa, Marcel Dekker, New York und Basel, 1987, Vol. 9, p. 225–323, sowie Walker et al. (1988), J. Am. Chem. Soc. 110: 7170–7177, beschrieben wurde. Man kann die MeNPOC-Schutzgruppe als eine moderne Variante in dieser Kategorie ansehen.

Es wurden auch Schutzgruppen des Pyrenylmethoxycarbonyl-Typs verwendet, wie es von McGall und Rava, Internationale Patentanmeldung Nr. WO 98/39348, beschrieben wurde. Die jeweiligen Nukleosid- und Nukleotid-Derivate der vorgenannten Schutzgruppen zeigen beim Entschützen unbefriedigende Raten und Ausbeuten, obwohl für bestimmte Anwendungen Arrays mit ausreichender Qualität erhalten werden. Ferner entstehen bei der Spaltung der ortho-Nitrobenzyl-Verbindungen unerwünschte Nebenprodukte wie beispielsweise giftige Nitrosophenyl-Verbindungen.

Bessere Spaltungsraten und/oder weniger Nebenprodukte wurden bei Dimethoxybenzoin-Carbonaten – beschrieben von Pirrung und Bradley (1995), J. Org. Chem. 60: 1116–1117 – und sowohl bei Carbonaten des ortho-Nitrophenylethyl-Typs wie beispielsweise dem oben genannten NPPOC als auch bei Sulfonaten des ortho-Nitrophenylethyl-Typs – beschrieben von Hasan et al. (1997), Tetrahedron 53: 4247–4264; Giegrich et al. (1998) Nucleosides & Nucleotides 17: 1987–1996; und Pfleiderer et al., US-Patente Nr. 5,763,599 und 6,153,744 – beobachtet. Erstere photolabile Gruppe zeigt schnellere Entschützungsraten, während die beiden letzteren Gruppen auch höhere Ausbeuten und Reinheiten beim Entschützen liefern. Wie oben aber bereits gesagt wurde, besteht sogar bei diesen photolabilen Schutzgruppen der ”zweiten Generation” Verbesserungsbedarf in Bezug auf schnellere Entschützungsraten und höhere Umwandlungsraten.

Darüber hinaus sind auch photolabile Carbonat-Schutzgruppen des ortho-Nitrophenylethoxycarbonyl-Typs und des 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Typs beschrieben (A. Avino et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 1996, 4(10): 1649–1658).

Zudem ist neben den beschriebenen lichtgesteuerten Verfahren zur Oligonukleotidsynthese auch die Abspaltung von Schutzgruppen mittels DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene) bekannt (R. Eritja et al., Tetrahedron 1992, 48(20): 4171–4182).

Angesichts des steigenden Bedarfs wurden Verfahren mit digitalen Lichtprozessoren entwickelt, mit denen Genchips irgendeiner Struktur innerhalb von Stunden hergestellt werden, wie beispielsweise von Singh-Gasson et al. (1999), Nature Biotech. 17: 974–978, beschrieben wurde. Der Gesamtdurchsatz solcher Instrumente bleibt gegenwärtig allerdings auf zwei Chips pro Arbeitstag beschränkt, hauptsächlich wegen der jeweils beträchtlichen Zeit, die in einer Array-Synthese beim Entschützen anfällt. Durch eine Beschleunigung der Photolysedauer würde demnach die Gesamtzeit des Verfahrens wesentlich verkürzt.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht demzufolge darin, geschützte Nukleosid-Derivate herzustellen, die photolabile Schutzgruppen umfassen, die keine der oben beschriebenen Nachteile aufweisen. Ein besonderes Ziel der Erfindung besteht darin, Schutzgruppen mit besseren Entschützungseigenschaften bereitzustellen, die sowohl für die 3'-OH- als auch die 5'-OH-Funktion der Zuckerkomponente von Nukleosid-Derivaten gut geeignet ist. Ein weiteres besonderes Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung der geschützten Nukleosid-Derivate der Erfindung bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung sieht daher Verbindungen mit der allgemeinen Formel (1) vor wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
R9 aus der Gruppe bestehend aus H oder ausgewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgewählt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst.

Die Verbindungen der Erfindung werden in der folgenden detallierten Beschreibung der Erfindung und in den Ansprüchen ausführlich beschrieben.

Die vorliegende Erfindung sieht ferner ein Verfahren vor, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Alkohol der allgemeinen Formel (1) wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
R9 H ist,
als Reagenz verwendet wird.

Das Verfahren der Erfindung wird in der folgenden detallierten Beschreibung der Erfindung und in den Ansprüchen ausführlich beschrieben.

Die vorliegende Erfindung sieht schließlich noch die Verwendung der Verbindungen der Erfindung vor, insbesondere in einem Verfahren, das einen Schritt umfasst, bei dem eine photolabile Schutzgruppe entfernt wird.

Die neuartigen Verbindungen der Erfindung zeigen verbesserte Entschützungseigenschaften, die schnellere Entschützungszeiten und bessere Umwandlungsraten ergeben, wobei weniger Nebenprodukte gebildet werden. Die neuartigen Verbindungen der Erfindung, die verbesserte Entschützungseigenschaften aufweisen, ermöglichen eine wesentlich beschleunigte Array-Assemblierung und eine verbesserte Oligonukleotid-Qualität. Darüber hinaus sind die Schutzgruppen insbesondere an ”trockene” oder ”nasse” Entschützungsbedingungen angepasst, um unabhängig von dem zum Entschützen verwendeten Ansatz einen hohen Durchsatz und eine hochwertige Array-Herstellung ermöglichen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfasst neuartige Verbindungen, die generell durch die folgende Formel (1) repräsentiert werden: wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
R9 aus der Gruppe bestehend aus H oder ausgewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgewählt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst.

Die Verbindungen der Erfindung ergeben schnellere Entschützungszeiten und bessere Umwandlungsraten, wobei weniger Nebenprodukte entstehen, wenn die Verbindungen in einem Verfahren eingesetzt werden, das das Entfernen einer photolabilen Schutzgruppe umfasst.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung haben die Verbindungen der Erfindung die allgemeine Formel (2): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgewählt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst. Z ist vorzugsweise ein Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid, das durch eine der folgenden Formeln (3) oder (4) repräsentiert wird: wobei
R5 aus der Gruppe bestehend aus H, einem Oligonukleotid oder einer funktionellen Gruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist;
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird oder WR8 ist, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist;
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgewählt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus eine Schutzgruppe tragen können, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; oder
Z aus der Gruppe bestehend aus einem chemisch modifizierten Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid oder einem Analogon davon ausgewählt wird.

Die folgenden Varianten von Verbindungen der Formel (1) und/oder (2) der Erfindung werden bevorzugt:

  • – eine Variante, wobei Y eine Alkylgruppe ist, die aus der Gruppe bestehend aus Methyl oder tert-Butyl ausgewählt wird, und R2 H ist;
  • – eine Variante, wobei R1 H ist und R2 aus der Gruppe ausgewählt wird, die ein optional substituiertes Phenyl oder ein optional substituiertes Benzoyl umfasst;
  • – eine Variante, wobei W gleich O ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-, Alkenyl-, Acetal- oder Silylether-Schutzgruppe ausgewählt wird;
  • – eine Variante, wobei W gleich S ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-Schutzgruppe ausgewählt wird;
  • – eine Variante, wobei R6 aus der Gruppe bestehend aus einem O-Methyl, O-Ethyl, O-Allyl, O-Tetrahydropyranyl, O-Methoxytetrahydropyranyl oder einem O-t-Butyldimethylsilyl ausgewählt wird;
  • – eine Variante, wobei B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin oder Guanin ausgewählt wird und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Phenoxyacetyl, 4-tert-Butylphenoxyacetyl, 4-Isopropylphenoxyacetyl oder Dimethylformamidino ausgewählt wird, wobei B bevorzugt Adenin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, p-Nitrophenyloxycarbonyl (p-NPEOC), Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird, wobei B weiterhin bevorzugt Cytosin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, t-Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyl-oxycarbonyl (p-NPEOC) ausgewählt wird.
  • – eine Variante, wobei R5 aus der Gruppe bestehend aus einer Phosphitamid-Gruppe, einer intermediären OH-Schutzgruppe, einer Dimethoxytrityl-Gruppe, einer Monomethoxytrityl-Gruppe und einer Silylgruppe ausgewählt wird.

Die oben angegebenen bevorzugten Varianten können unabhängig voneinander kombiniert werden.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung ist R4 eine Methylgruppe, sind R1 und R3 Wasserstoff, und wird R2 aus der Gruppe bestehend aus Aryl und Aroyl ausgewählt. Bei dieser speziellen Ausführung ist noch bevorzugter X Sauerstoff und wird R2 aus einer Phenyloder Benzoyl-Komponente ausgewählt. Schutzgruppen mit diesem Substitutionsmuster entsprechen Gruppen wie beispielsweise den 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyloxy-carbonyl-Schutzgruppen (P-NPPOC) bzw. den 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyloxy-carbonyl-Schutzgruppen (Bz-NPPOC).

Gemäß anderen bevorzugten Ausführungen und Varianten der Erfindung ist R4 eine Methylgruppe, sind R3 und R2 Wasserstoff, und wird R1 aus einer Alkoxycarbonyl-Komponente ausgewählt. Besonders bevorzugte Ausführungen umfassen in dieser Hinsicht Verbindungen, bei denen X Sauerstoff ist und R1 eine Methoxycarbonyl- oder tert-Butoxycarbonyl-Komponente ist. Verbindungen mit diesem Substitutionsmuster entsprechen Gruppen wie beispielsweise den 2-(4-Methoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propoxy-carbonyl-Schutzgruppen (MeC-NPPOC) und den 2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propoxycarbonyl-Schutzgruppen (tBuC-NPPOC).

Eine weitere bevorzugte Ausführung der Erfindung umfasst Reagenzien, die durch die allgemeine Formel (1) und/oder (2) repräsentiert werden, wobei R1 bis R4 und X die oben zugeschriebenen Bedeutungen aufweisen, zur Einführung der photolabile Schutzgruppe in das Molekül, das geschützt werden soll. Z kann irgendeine geeignete Abgangsgruppe sein, die durch das nukleophile Atom einer zu schützenden funktionellen Gruppe ersetzbar ist, wie beispielsweise ein Sauerstoff einer Hydroxylgruppe oder ein Stickstoff einer Aminogruppe.

Beispiele von Abgangsgruppen (Z) umfassen – sind aber nicht darauf beschränkt – ein Halogen (F-, Cl-, Br-, I-), Imidazolyl, Nitrophenoxyl, (Thio)carbonate, (Thio)carbamate und dergleichen, vorzugsweise Chlorid, Imidazolyl oder Nitrophenoxyl. Man kann diese Reagenzien folglich in Anwendungen einsetzen, bei denen insbesondere Hydroxyl- und Aminogruppen geschützt werden müssen. Solche Anwendungen umfassen – sind aber nicht darauf beschränkt – die Oligonukleotid-Synthese an einem festen Träger.

Ebenfalls besonders bevorzugt werden Zusammensetzungen der allgemeinen Formel (1) und/oder (2), bei denen R1 bis R4 und X die oben zugeschriebenen Bedeutungen aufweisen und Z einen Baustein repräsentiert, der vorzugsweise monomer und insbesondere für die Herstellung von Oligo- und Polynukleotiden nützlich ist. Solche Bausteine umfassen – sind aber nicht darauf beschränkt – Nukleinsäuren, Nukleotide, Nukleoside und dergleichen. Bei einer bevorzugten Ausführung wird der Baustein aus einer Gruppe ausgewählt, die Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside gemäß den oben dargestellten Formeln (3) und (4) einschließlich der dazugehörigen Definitionen umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist. Bei einer anderen bevorzugten Ausführung ist der Baustein über eine Hydroxyl- oder Aminfunktion an eine photolabile Schutzgruppe gebunden. Bei den meisten Ausführungen der Erfindung sind die photolabilen Schutzgruppen an das 5'-OH oder 3'-OH eines Nukleosids angelagert. Bei einer bevorzugten Ausführung umfassen die oben durch die Formeln (3) und (4) dargestellten nukleosidischen Bausteine ferner eine aktivierende funktionelle Gruppe R5 an der 5'- oder der 3'-Stellung, wobei die funktionelle Gruppe so ausgewählt wird, dass sie die Bildung einer Bindung an eine wachsende Oligonukleotid-Kette ermöglicht Bei eine Ausführung der Erfindung ist R5 eine Phosphoramidit-Gruppe, die vorzugsweise eine β-Cyanoethoxy-Gruppe und eine an den Phosphor angelagerte Diisopropyl-Aminogruppe umfasst. Darüber hinaus können – wie dem Fachmann bekannt ist – die aktivierten Nukleosid-Bausteine, die hier auch als Nukleosid-Synthone bezeichnet werden, Carbonyl-basierte dauerhafte Schutzgruppen an ihren jeweiligen Aminofunktionen der Purin- und Pyrimidin-Komponenten tragen. Diese Gruppen werden vorzugsweise so ausgewählt, dass sie leicht mir einer Base wie beispielsweise wässrigem Ammoniak oder Ethylendiamin in Ethanol entfernt werden können. Bevorzugte Schutzgruppen für die primären Stickstoffe der Purin- und Pyrimidin-Komponenten umfassen – sind aber nicht darauf beschränkt – Benzoyl, Acetyl, DMF (Dimethylformamidyl), Isobutyryl, Pac (2-Phenoxyacetyl), Ipac (2-(4-Isopropylphenoxy)-acetyl), Tac (2-(4-tert-butylphenoxy)-acetyl) und dergleichen.

Bei noch einer anderen Ausführung der Erfindung umfassen die oben durch die Formeln (3) und (4) dargestellten nukleosidischen Bausteine ferner einen 2'-Substituenten R6, wobei R6 eine freie, geschützte oder derivatisierte Hydroxylgruppe nach der obigen Definition umfasst, und wobei ferner die schützenden oder derivatisierenden Komponenten so ausgewählt werden, dass sie für die Herstellung von Ribonukleotiden oder Derivaten davon besonders nützlich sind. Bevorzugte Schutzgruppen in dieser Hinsicht umfassen – sind aber nicht darauf beschränkt – Acetal- und Silylether-Gruppen, wobei besonders bevorzugte Schutzgruppen die Tetrahydropyranyl- und die TBDMS-Gruppe sind. Bevorzugte Derivatisierungen der 2'-Hydroxylgruppe umfassen die O-Alkylatierung und die O-Alkenylierung.

Zu den weiteren bevorzugten Ausführungen zählen Verbindungen der Formel (1) und/oder (2), die Bausteine für die Synthese von modifizierten Oligonukleotiden oder Oligonukleotid-Analoga sind, die her beide in ihrer Bedeutung unter dem Begriff ”Oligonukleotid” nach der obigen Definition zusammengefasst werden. Die Modifikationen und Analoga von Oligonukleotiden sind generell dadurch gekennzeichnet, dass sie einige strukturelle und funktionelle Merkmale mit natürlich vorkommenden Desoxyribonukleotiden und Ribonukleotiden gemeinsam haben, so dass sie beispielsweise eine spezifische Hybridisierung an einem komplementären Oligonukleotid-Strang ermöglichen. Folglich sind die Bausteine der Erfindung für die Synthese von modifizierten Oligonukleotiden oder Oligonukleotid-Analoga entsprechend modifizierte monomere Nukleoside und Nukleotide. Solche Modifikationen können die Zucker-Komponente, die Nukleobase oder die aktivierende Gruppe betreffen, je nachdem, welche Art von Modifikation bei dem beabsichtigten Oligonukleotid zu erreichen ist.

Es werden hier verschiedene Begriffe verwendet, um auf die Aspekte der vorliegenden Erfindung Bezug zu nehmen. Die folgenden Erläuterungen dienen dazu, die Beschreibung der Bestandteile der Erfindung zu erklären.

Es ist anzumerken, dass der Begriff ”ein” oder ”eine” im Zusammenhang mit einer Begriffseinheit eine oder mehrere zu dieser Einheit gehörende Dinge bezeichnet; beispielsweise bezieht sich ”ein Oligonukleotid” auf ein oder mehrere Oligonukleotide. Die Begriffe ”ein” oder ”eine”, ”ein oder mehrere” und ”mindestens ein” als solche werden hier austauschbar verwendet.

Der Begriff ”Schutzgruppe” bezieht sich auf eine geeignete chemische Komponente, die dazu verwendet wird, eine funktionelle Gruppe vor unerwünschten Reaktionen zu schützen. Eine Schutzgruppe wird an eine funktionelle Gruppe angelagert und in einem späteren Schritt entfernt, um die intakte funktionelle Gruppe freizugeben. Das Entfernen einer Schutzgruppe wird vorzugsweise unter speziellen Bedingungen durchgeführt, die keine anderen Modifikationen des die funktionelle Gruppe umfassenden Moleküls beeinträchtigen. Methoden zum Entschützen umfassen – sind aber nicht darauf beschränkt – die Anwendung von chemischen Mitteln wie beispielsweise sauren, basischen oder nukleophilen Agenzien sowie phyikalischen Mitteln wie beispielsweise Licht oder elektrischen Strom. Beispiele von in der Technik bekannten Schutzgruppen für verschiedene funktionelle Gruppen werden von Greene et al., in Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley and Sons (1991), beschrieben, dessen gesamter Inhalt hier einbezogen wird. Die Begriffe ”Schutz gruppe” und ”schützende Gruppe” werden hier austauschbar verwendet.

Der Begriff ”Aryl”, allein oder in Verbindung mit irgendeinem anderen Begriff, bezieht sich auf einen carbocyclischen aromatischen Rest, der vorzugsweise aus ab 6–14 Kohlenstoffatomen und noch bevorzugter aus ab 6–10 Kohlenstoffatomen besteht. Beispiele für Aryreste umfassen – sind aber nicht darauf beschränkt – Phenyl, Naphthyl, Indenyl, Indanyl, Azulenyl, Fluorenyl, Anthracenyl und dergleichen. Arylreste können optional mit 1 bis 3 Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die Alkyl, Alkoxy, ein Halogen, Hydroxyl, Amino, Acyl, Nitro, Cyan, Thioalkyl und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist.

Der Begriff ”Alkyl”, allein oder in Verbindung mit irgendeinem anderen Begriff, bezieht sich, im Gegensatz zu anderen Definitionen, auf eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert-Butyl und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist.

Der Begriff ”Alkoxy”, allein oder in Verbindung mit irgendeinem anderen Begriff, bezieht sich, im Gegensatz zu anderen Definitionen, auf eine -O-Alkylgruppe (wobei Alkyl gemäß der obigen Beschreibung definiert ist), die aus der Gruppe ausgewählt wird, die Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy, tert-Butoxy und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist.

Der Begriff ”Heteroaryl”, allein oder in Verbindung mit irgendeinem anderen Begriff, bezieht sich auf ein aromatisches 5- oder 6-gliedriges monocyclischen Rest, ein aromatisches 9- oder 10-gliedrigen bicyclischen Rest oder eine aromatischen 11- bis 14-gliedrigen tricyclischen Rest, vorausgesetzt, dass der monocyclische Rest oder zumindest ein Ring des bicyclischen oder tricyclischen Rest 1 oder 2 O- und/oder 5-Atome und/oder 1 bis 4 N-Atome enthält, vorausgesetzt, dass die Gesamtanzahl von Heteroatomen in jedem Ring 4 oder weniger beträgt. Die kondensierten Ringe, die die bicyclischen und tricyclischen Reste komplettieren, können nur C-Atome enthalten und gesättigt, teilweise gesättigt oder ungesättigt sein. Die N- und S-Atome können oxidiert werden, während die N-Atome quaternisiert werden können. Heteroaryl-Reste werden an irgendein verfügbares N- oder C-Atom irgendeines Rings angelagert. Heteroaryl-Reste können optional mit 1 bis 3 Substituenten substituiert werden, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die Alkyl, Alkoxy, ein Halogen, Hydroxyl, Amino, Acyl, Nitro, Cyan, Thioalkyl und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist.

Der Begriff ”Aroyl”, allein oder in Verbindung mit irgendeinem anderen Begriff, bezieht sich auf einen Carbonyl-Rest, an den eine Aryl- oder Heteroaryl-Komponente gemäß der obigen Definition gebunden ist. Beispiele für Aroyl-Reste umfassen Benzoyl, Naphthoyl, 2-Furanoyl, 3-Thiobenzoyl und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Carbonyl-Funktion der Aroyl-Reste kann optional als eine Ketal-, Dithioketal- oder Monothioketal-Gruppe derivatisiert werden, wie beispielsweise 1,3-Dioxan, 1,3-Dioxolan, 1,3-Dithian, 1,3-Dithiolan, 1-3-Oxathian, 1-3-Oxathiolan und dergleichen. Aroyl-Reste können optional mit 1 bis 3 Substituenten substituiert werden, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die Alkyl, Alkoxy, ein Halogen, Hydroxyl, Amino, Acyl, Nitro, Cyan, Thioalkyl und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist.

Der hier verwendete Begriff ”Abgangsgruppe” bezieht sich auf eine chemische Komponente oder ein Atom, die bzw. das leicht (optional gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase) durch ein Nukleophil in einer nukleophilen Substitutionsreaktion ersetzt werden kann. Beispiele für Nukleophile umfassen Amine, Alkohole und Thiole, deren jeweilige Anionen und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele für Abgangsgruppen umfassen (Thio)carbonate, (Thio)carbamate, Halide (F-, Cl-, Br-, I-), Imidazolyl, Nitrophenoxyl und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt.

Die hier verwendeten Begriffe ”Nukleosid” oder ”Nukleosid-Analogon” bedeuten entweder ein Desoxyribonukleosid oder ein Ribonukleosid oder chemische Modifikationen davon. Modifikationen der Nukleoside umfassen – sind aber nicht darauf beschränkt – Zucker-Modifikationen an der 2'-Stellung, Pyrimidin-Modifikationen an der 5-Stellung, Purin-Modifikationen an der 8-Stellung, Modifikationen bei exocyclischen Aminen von Cytosin, Substitution von 5-Brom-Uracil und dergleichen.

Der hier verwendete Begriff ”Oligonukleotid” bezieht sich auf eine Einzelstrangkette von Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden oder chemischen Modifikationen davon, wie beispielsweise Nukleotiden mit einer 2'O-4'C-Methylenbrücke in ihrem Zuckerteil, die die Nukleotid-Bestandteile von Locked-Nukleinsäuren (LNA) sind. Modifikationen umfassen – sind aber nicht darauf beschränkt – diejenigen, die andere chemische Gruppen liefern, die den einzelnen Nukleotiden oder deren entsprechenden Basen oder den Oligonukleotiden als Ganzes zusätzliche Ladung, Polarisierbarkeit, Wasserstoffbindung, elektrostatische Wechselwirkung und Funktionalität verleihen. Solche Modifikationen umfassen – sind aber nicht darauf beschränkt – modifizierte Basen wie beispielsweise Zucker-Modifikationen an der 2'-Stellung, Pyrimidin-Modifikationen an der 5-Stellung, Purin-Modifikationen an der 8-Stellung, Modifikationen bei exocyclischen Aminen von Cytosin, Substitution von 5-Brom-Uracil; Hauptketten-Modifikationen, Methylierungen, und Basen, die Teil ungewöhnlicher Basenpaaarungs-Kombinationen sind wie beispielsweise die Isobasen Isocytidin und Isoguanidin und dergleichen. Modifikationen umfassen ferner angelagerte Markierungen und Reportermoleküle wie beispielsweise fluoreszierende Farbstoffe, Biotin, Minor-Groove-Binder und dergleichen, die dem Fachmann bekannt sind. Modifikationen umfassen weiterhin modifizierte Hauptketten der Oligonukleotide wie beispielsweise Peptid-Nukleinsäuren (PNA), Phosphorothioat-DNA, Methylphosphonat-DNA und andere Modifikationen, die dem Fachmann bekannt sind und von Micklefield (2001) J., Current Medicinal Chemistry 8: 1157–1179, besprochen wurden, dessen gesamter Inhalt hier einbezogen wird. Die Oligonukleotide, auf die in dieser Erfindung Bezug genommen wird, können aus irgendwelchen Kombinationen von den oben beschriebenen Nukleotiden und deren Modifikationen bestehen und entweder einige – beispielsweise bis zu 20 – oder viele – beispielsweise 20 bis mehrere hundert oder mehr – in ihre Kette integrierte Nukleotide enthalten.

Der hier verwendete Begriff ”fester Träger” bezieht sich auf ein Material, vorzugsweise ein polymeres Material, das in dem Medium unlöslich ist, das bei allen Einheitsmethoden eingesetzt wird, die während der Synthese von Oligonukleotiden durchgeführt werden. Der feste Träger kann ausgewählt werden aus: einem anorganischen Polymer einschließlich – aber nicht darauf beschränkt – anorganischen Oxiden wie beispielsweise Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Zeolithen und Controlled-Pore-Glass (CPG); einem modifizierten anorganischen Polymer wie beispielsweise Siliciumdioxid oder CPG mit einer organischen Beschichtung wie beispielsweise Aminopropylsilan-derivatisiertes Siliciumdioxid oder CPG; oder einem organischen Polymer einschließlich – aber nicht darauf beschränkt – Polystyrol, Polyacrylamid, Polymethacrylat, Polyvinylalkohol oder anderen synthetischen Polymeren oder anderen organischen Polymeren und irgendwelchen Copolymeren, Verbundmaterialien oder Kombinationen der obigen anorganischen oder organischen Materialien. Darüber hinaus umfassen die festen Träger funktionelle Gruppen, die durch Derivatisierung eingeführt werden können oder nicht und dazu geeignet sind, an der Kupplungsreaktion einer Oligonukleotid-Synthese teilzunehmen. Die funktionellen Gruppen sind ungeschützt, wie beispielsweise freie Hydroxylgruppen, oder geschützt, wie beispielsweise DMT geschützte Hydroxylgruppen, die vor der Kupplungsreaktion entschützt werden müssen. Der feste Träger wird Zyklen der Entschützungsreaktionen, Kupplungsreaktionen mit Nukleotid-Synthonen wie beispielsweise Phosphoramidit-Synthonen und schließlich anderen chemischen Reaktionen in Schritten ausgesetzt, um Oligonukleotide zu synthetisieren, wie beispielsweise von Beaucage et al. (1992), Tetrahedron 48: 2223–2311, beschrieben wurde, dessen gesamter Inhalt hier einbezogen wird.

Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung umfasst der feste Träger mindestens eine im Wesentlichen flache Oberfläche, die am meisten bevorzugt in objektträger- oder folienartiger Form ausgebildet ist. Bei bestimmten Ausführungen kann die Oberfläche des festen Trägers physisch unterteilt sein, um beispielsweise synthetische Stellen durch Vertiefungen, Stifte, Rinnen oder andere Konstruktionselemente zu trennen. Bei anderen bevorzugten Ausführungen kann der feste Träger in Form von Kugeln, Mikrokügelchen oder anderen geometrischen Konfigurationen ausgebildet sein.

Es ist anzumerken, dass im Verlaufe dieser gesamten Anwendung verschiedene Zitierungen angegeben sind. Jede Zitierung wird hier spezifisch mit ihrem gesamten Inhalt einbezogen.

Die Verbindung der obigen Formel (1) und/oder (2) einschließlich der dazugehörigen Definitionen – wobei R9 ≠ H – kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Alkohol der allgemeinen Formel (1) wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
R9 H ist, als Reagenz verwendet wird.

Insbesondere die photolabilen geschützten nukleosidischen Bausteine sowie Derivate und Analoga davon können gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt werden, wobei Z über seine primäre oder sekundäre Hydroxylgruppe gebunden ist, wie beispielsweise durch die Formel (3) bzw. (4) veranschaulicht wird.

Die Verfahren zur Synthese des Ausgangsalkohols der obigen allgemeinen Formel (1), bei der R9 H ist, werden im Folgenden in den Beispielen 1 bis 17 detailliert erörtert.

Das Beispiel 1 beschreibt ein generelles Verfahren zur Synthese von durch die Formel (10) repräsentierten Verbindungen, das mit 3-Ethylanilin (7) beginnt (in Schema 1 dargestellt). In kurzen Worten: nach dem Schützen der Aminofunktion des Ausgangsmaterials (7) durch Acetylierung wird eine Nitrogruppe in die para-Stellung eingeführt, um das substituierte Nitrobenzol 9 zu bilden. Die entsprechenden Halogensubstituierten Derivate 10a–c werden dann über die Diazonierung und anschließende Sandmeyer-Reaktion in Ausbeuten von 46%, 80% bzw. 57% erhalten.

Schema 1

Bevorzugte Aryl-substituierte Verbindungen (11a–c) sind ausgehend von der Verbindung 10b durch eine Suzuki-Kupplungsreaktion in guten bis ausgezeichneten Ausbeuten zugänglich (dargestellt in Schema 2 und beschrieben in den Beispielen 2 bis 4).

Schema 2

Das Einführen eines Alkyloxycarbonyl-Substituenten in das 2-Ethyl-nitrophenyl-Gerüst wurde ausgehend von 4-Ethylbenzoesäure (12) erreicht (in Schema 3 zusammengefasst). Nach Schema 3 liefert eine Nitrierungsreaktion mit anschließender Veresterung der Carboxylgruppe die gewünschten Verbindungen, wie in den Beispielen 5 und 6 für die Methyl- und tert-Butylester 11d bzw. e beschrieben ist, die die bevorzugten Bausteine sind.

Schema 3

Die Aryl-substituierte Verbindung (11f), die ein Vorläufer der Bz-NPPOC-Schutzgruppe ist, wurde gemäß Schema 4 synthetisiert und wird in den Beispielen 7 und 8 beschrieben. Nach Schema 4 führt die Kondensation von Benzylcyanid (14) mit 2-Nitroethylbenzol (15) in Gegenwart von Kaliumhydroxid zur Bildung von Oxim (16), das dann durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid in einer kochenden Kaliumhydroxid-Lösung in einer Methanol-Wasser-Mischung in das Nitroderivat (11f) umgewandelt wird.

Schema 4

Derivate von 11f, bei denen der Benzoyl-Ring mit verschiedenen Komponenten ersetzt wird, sind ebenfalls mit den in den Beispielen 7 und 8 beschriebenen Methoden zugänglich. Die jeweils substituierten Derivate von 11f sind zugänglich, indem man das Ausgangsmaterial 14 durch das entsprechende Ring-substituierte Benzylcyanid wie in den Syntheseprotokollen der Beispiele 7 bzw. 8 ersetzt.

Die Beispiele 9 bis 14 beschreiben die Aldol-Kondensationsreaktionen zwischen den 2-Ethyl-nitrophenyl-Derivaten 11a–e und Formaldehyd, um die entsprechenden 2-substituierten Propanole der Formel (4) zu gewinnen. Die Ausbeuten dieser Reaktionen, die in Schema 5 dargestellt sind, lagen im Bereich von 38% bis 94%. Unter diesen Reaktionsbedingungen erbrachte die jeweilige Umwandlung des Benzoyl-Derivats 11f wegen der Anfälligkeit der Carbonylgruppe gegen unerwünschte Nebenreaktionen nur 24% des entsprechenden Alkohols 4f.

Schema 5

Schema 6 veranschaulicht einen alternativen Syntheseweg zur Umwandlung des Benzoyl-Derivats 11f in den entsprechenden Alkohol 4f (in den Beispielen 15 bis 17 beschrieben). Nach Schema 6 wird die Carbonylgruppe der Verbindung 11f als 1,3-Dioxan geschützt, um die Verbindung 17 zu bilden, die dann über eine Aldol-Kondensation mit Triton B als Base in die Verbindung 18 umgewandelt wird. Die Carbonylgruppe der Verbindung 18 wird anschließend entschützt, um die Verbindung 4f in einer Gesamtausbeute von 82% zu erhalten.

Schema 6

Alkohole (4a–4f) dienen als bevorzugte Vorläufer für die photolabilen Schutzgruppen der vorliegenden Erfindung. Derivate der Alkohole (4a–4f) liegen ebenfalls im Umfang der Erfindung. Beispielsweise kann man Derivate des Alkohols 4f bei denen der von Benzylcyanid abgeleitete Benzylring mit verschiedenen Komponenten substituiert wird, unter Einsatz der in den Beispielen 7 und 8 beschriebenen Chemie erhalten, indem das Ausgangsmaterial 14 durch die oben genannten in geeigneter Weise substituierten Benzylcyanide ersetzt wird. Weitere bevorzugte Vorläufer für die Schutzgruppen der vorliegenden Erfindung sind die Ketal-, Dithioketal- oder Monothioketal-Derivate des Alkohols 4f und verwandte Aroyl-substituierte Alkohole, wobei die Verbindung 18 in Schema 6 ein Beispiel dafür ist.

Die photolabile Schutzgruppe kann in die primäre oder die sekundäre Hydroxylgruppe eines Nukleosids, Nukleotids oder Analogons davon (diese Begriffe werden nachstehend zusammen als Nukleosid bezeichnet) eingeführt werden. Wie unten detailliert erörtert wird, erfordert das Einführen einer Schutzgruppe der Erfindung in eine sekundäre Hydroxylgruppe eines Nukleosids die zwischenzeitliche Blockierung der primären Hydroxylgruppe des Nukleosids durch eine orthogonale Schutzgruppe. Im Gegensatz dazu kann man das Einführen einer Schutzgruppe der Erfindung in die primäre Hydroxylgruppe eines Nukleosids im Allgemeinen in Gegenwart einer nicht blockierten sekundären Hydroxylgruppe durchführen. Das Einführen der Schutzgruppe in eine primäre oder sekundäre Hydroxylgruppe eines Nukleosids wird vorzugsweise dadurch realisiert, dass vor der Reaktion entweder das Nukleosid oder der Alkohol (1) in das aktivierte Carbonat, Thiocarbonat oder Sulfonat umgewandelt wird. Wie dem Fachmann bekannt ist, ist bei beiden Methoden die Verwendung einer Hilfsbase wie beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin, Dimethylaminopyridin (DMAP) oder dergleichen von Nutzen, um den Ersatz der Abgangsgruppe während der Bildung des (Thio)kohlensäure-Diesters oder des Sulfonsäureesters zu erleichtern.

Demzufolge wird bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ein Alkohol der allgemeinen Formel (1), wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
R9 H ist,
mit einer eine Hydroxyl- oder Aminofunktion tragenden Verbindung zur Reaktion gebracht, umfassend zumindest die Schritte zum

  • a) Aktivieren entweder des Alkohols der Formel (1) oder der die Hydroxylfunktion tragenden Verbindung durch Umwandlung der Hydroxylfunktion in einen aktivierten Carbonatester, Thiocarbonatester oder ein Sulfonat;
  • b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonatesters oder Thiocarbonatesters oder Sulfonats mit der nicht aktivierten Verbindung.

Besonders bevorzugte Varianten des Verfahrens der Erfindung sind die Folgenden: Eine erste Variante umfasst eine Methode zur Derivatisierung der primären Hydroxylgruppe eines Nukleosids, Nukleotids oder Analogons davon mit einer photospaltbaren Schutzgruppe, wobei die Methode folgende Schritte umfasst:

  • a. Umwandeln der Hydroxylgruppe eines Alkohols, der die folgende allgemeine Formel (1) hat: wobei
    R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
    R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
    R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
    R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
    R9 H ist,
    in ein aktiviertes Carbonat, Thiocarbonat oder Sulfonat;
  • b1. Reagieren des aktivierten Carbonats, Thiocarbonats oder Sulfonats mit einer Verbindung, die ein primäres Amin, sekundäres Amin oder eine Hydroxylgruppe hat, beispielsweise die primäre Hydroxylgruppe eines Nukleosids, Nukleotids oder Analogons davon.

Wie oben gesagt wurde, ist bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung R4 eine Methylgruppe, sind R1 und R3 Wasserstoff, und wird R2 aus der Gruppe bestehend aus Aryl und Aroyl ausgewählt. Gemäß anderen bevorzugten Ausführungen der Erfindung ist R4 eine Methylgruppe, sind R3 und R2 Wasserstoff und wird R1 aus einer Alkoxycarbonyl-Komponente ausgewählt.

Die Umwandlung des aktivierten Carbonats oder Thiocarbonats kann durch Reagieren des Alkohols (1) mit Phosgen oder Derivaten oder Ersatzstoffen davon oder mit den jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindungen vorzugsweise in einem unpolaren organischen Lösemittel bei oder unter 25°C erreicht werden. Phosgen-Derivate umfassen vorzugsweise – sind aber nicht darauf beschränkt – Diphosgen (Trichormethylchlorformat) oder Triphosgen (Bistrichlormethylchlorformat), während bevorzugte Ersatzstoffe für Phosgen CDI (Carbonyldiimidazol), Bisnitrophenylcarbonat, Nitrophenoxycarbonylchlorid, Pentafluorphenoxychlorformat und dergleichen sind. Die erforderliche Reaktionszeit und die Reaktionstemperaturen hängen von der Beschaffenheit der Ersatzstoffe ab und variieren von 0,5 bis 6 Stunden und –20°C bis 25°C.

Die resultierenden aktivierten Carbonate bzw. Thiocarbonate, die durch die obige Formel (1) und/oder (2) dargestellt sind – wobei Z eine Abgangsgruppe ist und alle anderen dazugehörigen Definitionen inbegriffen sind –, repräsentieren die vorgenannten Reagenzien zum Einführen der Schutzgruppe der Erfindung. Falls Z eine Abgangsgruppe ist, wird Z vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus einem Halogen, Imidazolyl, Nitrophenoxyl, (Thio)carbonat und (Thio)carbamat ausgewählt. Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen wird in Beispiel 18 beschrieben. Diese Verbindungen werden normalerweise in Ausbeuten und Reinheiten von über 90% erhalten und können generell ohne weitere Reinigung verwendet werden, wie bei der Umwandlung der Alkohole 4a, 4d bzw. 4e und in den Beispielen 19, 20 bzw. 21 gezeigt wird. Der entsprechende Chlorcarbonatester des Alkohols 4f wurde in quantitativer Ausbeute hergestellt, wobei ein leicht modifiziertes Verfahren eingesetzt wurde (in Beispiel 22 beschrieben). Nach dem einfachen Entfernen des Lösemittels und überschüssigen Phosgens durch Vakuumverdampfung kann man die Reaktionsmischung direkt im nächsten Schritt verwenden.

Im zweiten Schritt (b1) lässt man das Produkt des Schrittes (a), das normalerweise in rohem Zustand vorliegt, dann mit einem Nukleosid reagieren. Bei einer bevorzugten Ausführung wird das Nukleosid aus der Gruppe von Verbindungen ausgewählt, die die folgende allgemeine Formel haben: wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgewählt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgewählt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgewählt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist; und B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgewählt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus eine Schutzgruppe tragen können, die bei der Oligonukleotid-Synthese nützlich ist.

Ein allgemeines Verfahren zum Einführen einer photolabilen Schutzgruppe der Erfindung in eine primäre Hydroxylgruppe eines Nukleosids ist in Beispiel 23 vorgesehen. Die Reaktion wird vorzugsweise in einer Lösemittelmischung, die aus Dichlormethan und einem polaren organischen Lösemittel besteht, optional in Gegenwart einer Base bei Temperaturen zwischen –50°C und 25°C durchgeführt. Das polare organische Lösemittel wird aus der Gruppe ausgewählt, die DMF oder Pyridin umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist. Wird Pyridin als polares organisches Lösemittel verwendet, ist keine zusätzliche Base notwendig. Falls Dichlormethan/DMF-Lösemittelmischungen eingesetzt werden, wird eine Base, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die Pyridin, Triethylamin oder Ethyldiisopropylamin umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist, zugegeben, um die während der Reaktion freigesetzten Protonen abzufangen.

Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die in Pyridin oder der DMF/Base aufgelöste nukleosidische Verbindung geladen und eine Lösung des aktivierten Carbonats, wie beispielsweise Chlorkohlensäureester in Dichlormethan, tropfenweise bei der jeweiligen Reaktionstemperatur zugegeben. Das Molverhältnis zwischen nukleosidischer Verbindung und aktiviertem Carbonat kann stöchiometrisch auf ungefähr 1:1 eingestellt werden. Dennoch kann man – insbesondere dann, wenn die Reaktion bei tiefen Reaktionstemperaturen (ca. –50°C) abläuft –, vorzugsweeise einen geringen bis mäßigen molaren Überschuss des aktivierten Carbonats verwenden, der beispielsweise 1,1 bis 1.5 äquivalente Mengen in Bezug auf das Nukleosid beträgt. Falls andererseits die oberste Priorität darin besteht, die Bildung der diacylierten Nebenprodukte zu unterdrücken, gibt man vorzugsweise nur etwa 0,5 äquivalente Mengen des aktivierten Carbonats zu, insbesondere wenn höhere Reaktionstemperaturen von ungefähr 0°C oder höher zum Einsatz kommen.

Nach Vollendung der Reaktion (ungefähr 0,5 bis 6 Stunden) sowie den Standard-Bearbeitungsmethoden und der Reinigung erhält man die entsprechenden Nukleosid-Derivate in guten Ausbeuten und hoher Reinheit, wie für die Synthesen des 5'-P-NPPOC-geschützten 2'-Desoxythymidins (20) und N6-tert-Butylphenoxyacetyl-2'-desoxyadenosins (21) sowie des 5'-tBuC-NPPOC-geschützten 2'-Desoxythymidins (25) gezeigt wird (in den Beispielen 24, 25 bzw. 26 beschrieben). Das Bz-NPPOC-geschützte N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin (29) und N4-Acetat-2'-desoxycytidin (30) wurden über leicht modifizierte Synthesewege synthestisiert, die in den Beispielen 27 und 28 beschrieben sind.

Wenn in Schritt b1) eine eine Aminogruppe tragende Verbindung verwendet wird, wird Z aus der Gruppe bestehend aus einem Halogen, Imidazolyl, Nitrophenoxyl, (Thio)carbonat und (Thio)carbamat ausgewählt.

Eine zweite Variante des Verfahrens der Erfindung umfasst eine Methode zur Derivatisierung einer sekundären Hydroxylgruppe eines Nukleosids mit einer photospaltbaren Schutzgruppe, wobei die Methode folgende Schritte umfasst:

  • a. Umwandeln der Hydroxylgruppe eines Alkohols, der die folgende allgemeine Formel (1) hat: wobei
    R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
    R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
    R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird;
    R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird; und
    R9 = H,
    in ein aktiviertes Carbonat, Thiocarbonat oder Sulfonat;
  • b2. Reagieren des aktivierten Carbonats, Thiocarbonats oder Sulfonats mit der sekundären Hydroxylgruppe eines Nukleosids oder Nukleosid-Analogons, bei dem die primäre Hydroxylgruppe geschützt ist; undc. Entfernen der Schutzgruppe aus der primären Hydroxylgruppe.

Der erste Schritt (a) dieser Methode ist mit dem ersten Schritt der oben beschriebenen Methode identisch, was den Schutz einer primären Hydroxylgruppe betrifft.

Im zweiten Schritt (b2) dieser Methode lässt man das Produkt des Schrittes (a), das normalerweise in rohem Zustand vorliegt, dann wie oben beschrieben mit einer sekundären Hydroxylgruppe eines Nukleosids reagieren, bei dem das primäre Hydroxyl geschützt wurde. Bei einer bevorzugten Ausführung wird das Nukleosid oder Nukleosid-Analogon aus der Gruppe von Verbindungen ausgewählt, die die folgende allgemeine Formel haben: wobei
R6 wie oben definiert ist und R7 eine intermediäre Alkohol-Schutzgruppe ist. Bei einer bevorzugten Ausführung wird R7 aus einer DMT-Schutzgruppe oder einer Silylether-Schutzgruppe wie beispielsweise tert-Butyldimethylsilyl (TBDMS) oder aus der Gruppe nukleosidischer und nukleotidischer Derivate und Analoga davon ausgewählt, die demgemäß eine intermediär geschützte primäre Hydroxylfunktion umfasst. Die im Anschluss an den Schritt (b2) erhaltene rohe nukleosidische Verbindung, die die photolabile Schutzgruppe der Erfindung – vorzugsweise als Carbonat oder Thiocarbonat – und die intermediäre Schutzgruppe enthält, wird optional durch in der Technik bekannte Verfahren gereinigt.

Im dritten Schritt (c) dieser Methode wird die intermediäre Schutzgruppe entfernt, wodurch die primäre Hydroxylfunktion freigesetzt wird. Das Entfernen dieser Schutzgruppe wird unter Einsatz von Standardmethoden erreicht, die von der zu entfernenden intermediären Schutzgruppe abhängen, beispielsweise durch Behandlung mit verdünnter Säure im Falle der DMT-Gruppe oder mit Fluorid (F-) im Falle von Silylgruppen. Das Produkt wird dann nach den Methoden isoliert und gereinigt, die oben für den Schritt (b1) beschrieben wurden.

Bei einer dritten Variante des Verfahrens der Erfindung wird die zu schützende Hydroxylgruppe des Nukleosids vorzugsweise in ein aktiviertes Carbonat, Thiocarbonat oder Sulfonat umgewandelt und anschließend die Reaktion mit Alkohol (1) durchgeführt. Gemäß dieser Ausführung wird im ersten Schritt ein Nukleosid der Formel (5) oder (6), einschließlich der oben beschriebenen dazugehörigen Definitionen, oder ein nukleosidisches Derivat oder Analogon davon, das eine mit der Schutzgruppe auszustattende primäre oder sekundäre Hydroxylfunktion umfasst, vorzugsweise in eine aktiviertes Carbonat, Thiocarbonat oder Sulfonat umgewandelt (wie oben beschrieben). Die aktivierte Verbindung wird danach im zweiten Schritt mit einem Alkohol der Formel (1) behandelt, um die gewünschte photolabil-geschützte Verbindung zu erhalten, deren primäre Hydroxylgruppe anschließend gemäß dem vorgenannten Schritt (c) entblockiert wird, sofern eine intermediäre Schutzgruppe verwendet wird. Die entsprechenden synthetischen Methoden und dafür geeigneten Reaktionsbedingungen können leicht von einem Fachmann aus den in den vorgenannten Schritten (a), (b1), (b2) und (c) aufgeführten Methoden und Bedingungen hergeleitet werden.

Diese Ausführung der Erfindung wird im Beispiel 29 veranschaulicht, das eine Methode zum Einführen der P-NPPOC-Gruppe in das 3'-Ende von 2'-Desoxythymindin beschreibt. Kurz gesagt: das aktivierte Carbonat 3'-(4-Nitrophenoxycarbonyl)-2'-desoxythymidin wird mit in der Technik bekannten Methoden synthetisiert, indem man 4-Nitrophenoxycarbonylchlorid mit 5'-DMT-geschütztem 2'-Desoxythymidin reagieren lässt und anschließend die DMT-Gruppe entfernt. Das aktivierte Carbonat wird dann in Gegenwart von Dimethylaminopyridin (DMAP) mit dem entsprechenden Alkohol zur Reaktion gebracht, um die derivatisierte Produktverbindung (27) zu bilden. Diese unkomplizierte Synthese lieferte das beabsichtigte Produkt in guter Ausbeute.

Das Nukleosid oder Nukleosid-Analogon, das wie hier beschrieben mit einer photolabilen Schutzgruppe entweder an seiner primären oder sekundären Hydroxylgruppe derivatisiert wurde, kann mit in der Technik bekannten Methoden weiter in das entsprechende Phosphoramidit umgewandelt werden, wobei ein geeignetes Phosphitylierungs-Reagenz verwendet wird. Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung des jeweiligen Phosphoramidits ist in Beispiel 30 vorgesehen. Demnach ist nach der Synthese des Phosphoramidits ein Synthon zugänglich, das für die lichtgesteuerte Synthese von Oligonukleotiden nützlich ist. Die Beispiele 31 bis 36 beschreiben solche Reaktionen, bei denen das Phosphitylierungs-Reagenz Bis(diisopropylamino-β-cyanoethoxyphosphan in Gegenwart von Tetrazol oder DCI als Aktivator eingesetzt wird, um die Phosporamidite von 5'- und 3'-P-NPPOC-geschütztem dT, 5'-tBuC-NPPOC-dT, 5'-P-NPPOC-dA(tac), 5'-Bz-NPPOC-dA(bz) und 5'-Bz-NPPOC-dC(ac) zu bilden. Alle diese sechs Verbindungen umfassen die an den Phosphor angelagerte bevorzugte β-Cyanoethoxy-Gruppe und Diisopropyl-Aminogruppe.

Um lichtspaltbare Schutzgruppen und die entsprechenden Entschützungsverfahren für die lichtgesteuerte Oligonukleotid-Array-Synthese bewerten zu können, müssen die Zykluseffizienz und die Rate der photolytischen Freisetzung von 5'/3'-Schutzgruppen ermittelt werden. Der Rate der photolytischen Entschützung von entsprechend geschützten Nukleosiden in einer Lösung oder im trockenen Zustand kann zur Beurteilung dieser Parameter herangezogen werden.

Es wurden Photolyseraten in Lösung bei einigen der bevorzugten Schutzgruppen der Erfindung im Vergleich zur bekannten NPPOC-Gruppe gemessen (in Beispiel 37 beschrieben), indem Lösungen der geschützten Nukleoside bei 365 nm mit einer Hg-Lampe bestrahlt wurden. Die durch Licht bewirkte Entschützung wurde bei verschiedenen Zeitintervallen durch HPLC überwacht. Die entsprechenden Halbwertszeiten der Photospaltungs-Reaktionen, die in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt sind, werden unten detailliert erörtert. Die nach der Photolyse von 5'-tBuC-NPPOC-dT (25) bei 0 Sek., 60 Sek. und 600 Sek. erhaltenen HPLC-Chromatogramme sind zur Veranschaulichung in 1 dargestellt.

Die Tabelle 1 zeigt die Halbwertszeiten verschiedener 5'-geschützter Desoxythymidine in wässrigen methanolischen Lösungen im Vergleich zur Halbwertszeit von 5'-NPPOC-geschütztem Desoxythymidin (26). Die Tabelle 1 zeigt, dass die 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl-Gruppe (P-NPPOC) unter diesen Bedingungen mit einer Halbwertszeit von 17 Sekunden am schnellsten entfernt wird, was einer 3,2-fachen Zunahme der Photolyserate im Vergleich zur ursprünglichen NPPOC-Gruppe entspricht (aus Eintrag 1 bis 7 ersichtlich). Die Alkoxycarbonyl-substituierten Schutzgruppen der Verbindungen 24 und 25 (Einträge 5 und 6) wurden unter denselben Bedingungen dagegen wesentlich langsamer abgespalten: 77 bzw. 75 Sekunden. Die Einträge 1 bis 4 belegen ferner, dass die Photolyserate bei der P-NPPOC-Gruppe praktisch nicht von der jeweils verwendeten Nukleobase abhängt. Alle untersuchten P-NPPOC-geschützten Nukleoside, das dT-Derivat und die basengeschützten dC(tac)-, dA(tac)- und dG(tac)-Derivate zeigten fast identische t1/2-Werte von 17 bis 19 Sekunden. Bei einer zweiten Versuchsreihe wurden die Photolyseraten dieser vier in wässrigem Acetontril gelösten Nukleoside bestimmt; dabei ergaben sich etwas geringere t1/2-Werte, was wiederum zeigt, dass keine Abhängigkeit von der Nukleobase vorliegt (in Tabelle 2 dargestellt). Eine weitere Analogie zu den Versuchen in wässriger methanolischer Lösung ist der 3,9-fach höhere t1/2-Wert für das NPPOC-geschützte Desoxythymidin im Vergleich zum P-NPPOC-Schutz, was aus den Einträgen 1 und 5 der Tabelle 2 hervorgeht.

Die Tabelle 3 zeigt die t1/2-Werte von Nukleosiden, die mit der Bz-NPPOC-Schutzgruppe und substituierten Derivaten davon derivatisiert wurden, die wie in Beispiel 37 beschrieben gemessen wurden. Diese Daten wurden in derselben Weise wie die in den Tabellen 1 und 2 zusammengestellten Daten erfasst, außer dass Lösungen von Methanol oder Acetonitril mit 5% Wassergehalt und eine bessere optische Fokussierung verwendet wurden. Die letztere Modifikation sorgt für eine beträchtliche Abnahme der t1/2-Werte, was durch einen t1/2-Wert von lediglich 5 Sekunden für 5'-NPPOC-dT verdeutlicht wird, der weniger als ein Zehntel des zuvor gemessenen Werts (in Tabelle 1 aufgeführt) beträgt. Aus dem Eintrag 1 von Tabelle 3 geht hervor, dass der t1/2-Wert von 5'-Bz-NPPOC-dT (28) weniger als halb so groß wie beim entsprechenden NPPOC-Derivat (26) ist. Unter diesen Bedingungen haben die 5'-Bz-NPPOC-geschützten dA(bz) (29) und dC(ac) (30) auch t1/2-Werte im Bereich von ungefähr 2 Sekunden (Einträge 2 und 3) in wässrigem Methanol und in wässrigem Acetonitril. Man kann also im Falle der P-NPPOC-Gruppe davon ausgehen, dass die t1/2-Werte der Bz-NPPOC-Schutzgruppe größtenteils auch von der jeweils benutzten Nukleobase unabhängig sind. Die Tabelle 3 enthält die t1/2-Werte der 5'-Bz-NPPOC geschützten dT-Verbindungen 31, 32 und 33, bei denen die Benzoyl-Komponente der Schutzgruppe mit einem Fluorid an den Stellungen 2, 3 bzw. 4 derivatisiert wurde. Auch bei diesen Verbindungen wurden t1/2-Werte von etwa 2 Sekunden bei beiden Lösemittelsystemen beobachtet, was aus den Einträgen 4 bis 6 hervorgeht.

Im Zusammenhang mit der photolithographischen Herstellung von Microarrays mit der vorgenannten α-Methyl-6-nitropiperonyloxycarbonyl-Gruppe (MeNPOC) wurde die trockene Entschützung von Barone et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 20: 525–531 (2001), und McGall et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 5081–5090 (1997), als vorteilhaft beschrieben, insbesondere in Bezug auf die Automatisierungsmöglichkeiten und Entschützungsraten. Entsprechende Versuche wurden unter trockenen Entschützungsbedingungen mit Nukleosiden durchgeführt, die photolabile Schutzgruppen der Erfindung trugen (in Beispiel 38 beschrieben). Kurz gesagt: die jeweiligen Nukleoside wurden bei 365 nm in trockenem Zustand auf einer Polystyrol-Oberfläche bestrahlt, wobei die zeitabhängige Entschützung des Ausgangsmaterials und die Bildung des Produkts durch HPLC quantifiziert wurden. Die Ergebnisse sind in den 2 und 3 dargestellt. 2 zeigt, dass beide 3'-P-NPPOC- und 5'-NPPOC-geschützten Desoxythymidine (27) und (26) wesentlich schneller entschützt wurden als das 5'-MeNPOC-geschützte Desoxythymidin und 5'-MeC-NPPOC-Desoxythymidin (24) – ein Beispiel für Alkoxycarbonyl-substitutierte Schutzgruppen der Erfindung. 5'-MeCNPPOC-Desoxythymidin (24) lieferte jedoch wesentlich höhere Ausbeuten von Desoxythymidin gegenüber allen anderen photosensitiv-geschützten Desoxythymidinen, die in dieser Versuchsreihe untersucht wurden (in 3 dargestellt). Die Alkoxycarbonyl-substituierten Schutzgruppen der Erfindung, die durch das in der Verbindung (24) enthaltene Methoxy-Derivat und das in der Verbindung (25) enthaltene tert-Butoxy-Derivat beispielhaft vertreten sind, haben also ähnliche Photolyseraten, aber höhere Umwandlungsraten als die MeNPOC-Gruppe, die bis jetzt als die Gruppe mit der besten Gesamtleistung bei der Photolyse im trockenen Zustand galt.

Bei einer separaten Versuchsreihe, bei der die in Beispiel 38 beschriebene Methode einschließlich der vorgenannten verbesserten optischen Fokussierung zum Einsatz kam, wurden die Halbwertszeiten für das photolytische Entfernen der Bz-NPPOC-Schutzgruppe und einiger ihrer fluorierten Derivate bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die Tabelle 4 (Einträge 1 bis 6) zeigt, dass alle diese Verbindungen mit Ausnahme des (4-Fluor-Bz)-NPPOC-geschützten Desoxythymidins (33) t1/2-Werte von 6,0 Sekunden aufweisen. Dieser Wert ist etwa dreimal höher als die t1/2-Werte der jeweiligen nassen Entschützungen (in Tabelle 3 zusammengestellt), aber weniger als halb so groß wie der t1/2-Wert, der bei 5'-NPPOC-dT (26) gemessen wurde (Tabelle 4, Eintrag 7). Betrachtet man also die für 2 zusammengefassten Ergebnisse, zeigen die Bz-NPPOC-Schutzgruppe und deren fluorierte Derivate ähnliche oder meist kürzere Photolyseraten als alle anderen hier beschriebenen photolabilen Schutzgruppen. In Bezug auf die Abspaltung sind die Ausbeute und die Effizienz dieser Schutzgruppen sogar noch konkurrenzfähiger, wie unten gezeigt wird.

Die Verbindungen gemäß der Formel (1) und/oder (2) können in einem Verfahren verwendet werden, das einen Schritt zum Entfernen einer photolabilen Schutzgruppe umfasst, d. h. ein Verfahren mit lichtgesteuerter Synthese von Oligonukleotiden.

Bei einer bevorzugten Ausführung werden Verbindungen gemäß der Formel (1) und/oder (2) bei einer verbesserten Methode zur Herstellung von Oligonukleotiden an einem Träger eingesetzt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass eine schrittweise Elongation entweder in der 3'-zu-5'-Richtung unter Einsatz nukleotidischer Bausteine, die photospaltbare Schutzgruppen an ihrem 5'-Ende aufweisen, oder in der 5'-zu-3'-Richtung unter Einsatz solcher Bausteine erfolgt, die entsprechend 3'-geschützt sind. Der letztere Fall wird unten in Klammern weiter beschrieben. Die Methode umfasst die folgenden Schritte:

  • 1. Anlagern eines ersten Nukleotids an einen Träger über seine 3'(5')-Hydroxylgruppe, wobei seine 5'(3')-Stellung mit einer photospaltbaren Schutzgruppe der Erfindung derivatisiert wird;
  • 2. Bestrahlen des aus Schritt 1 resultierenden trägergebundenen Nukleotids, um die photospaltbare Schutzgruppe zu entfernen, wodurch die 5'(3')Hydroxylgruppe entschützt wird;
  • 3. Inkontaktbringen des in Schritt 2 erhaltenen trägergebundenen Nukleotids in Gegenwart eines Aktivators mit einem zweiten Nukleotid, das eine 5'(3')-Schutzgruppe der Erfindung und eine funktionelle 3'(5')-Phosphoramidit-Gruppe umfasst, die mit der 5'(3')-Hydroxylgruppe des trägergebundenen Nukleotids unter Bildung einer internukleosidischen Phosphor-Verbindung reagiert;
  • 4. optionales Capping von unreagierten 5'(3')-Hydroxylgruppen mit einer inerten Schutzgruppe, um eine weitere Kupplung zu verhindern;
  • 5. Oxidieren der neu gebildeten internukleosidischen Phosphor-Verbindung zum natürlich vorkommenden fünfwertigen Zustand;
  • 6. optionales Wiederholen der Schritte 2 bis 5, während nacheinander die Nukleosidmonomere in einer vorbestimmten Reihenfolge angebracht werden, bis der gewünschte Oligonukleotidstrang vollständig ist; und
  • 7. Entfernen aller Nukleobasen- und Phosphat-Schutzgruppen. Außer dem Schritt, bei dem die photolabile Schutzgruppe der Erfindung entfernt wird, laufen alle anderen Schritte analog zu bekannten Methoden der Festphasensynthese von Oligonukleotiden ab und sind dem Fachmann bekannt.

Die allgemeine Methode der Erfindung zur Herstellung von Oligonukleotiden umfasst die Herstellung von Array-Assemblierungen von Oligonukleotiden und insbesondere von Microarrays, die für auf Hybridisierung basierende parallele Durchmusterungen von Genomen nützlich sind. Solche Microarrays können insbesondere durch Anwendung von photolithographischen Methoden hergestellt werden, wie sie beispielsweise von Fodor et al. (1991), Science 251: 767–773 (1991), beschrieben sind, oder nach der Methode gebildet werden, die auf den von Singh-Gasson et al. (1999), Nature Biotech. 17: 974–978, und Nuwaysir et al. (2002), Genome Research 12: 1749–1755, beschriebenen ”Maskless Array Synthesizer” (MAS) angewiesen sind.

In den unten beschriebenen Versuchen wurde ein MAS eingesetzt, um die vorteilhaften Eigenschaften der neuartigen photolabilen Schutzgruppen der Erfindung und insbesondere die gesteigerten Spaltungsraten sowie die verbesserte Zykluseffizienz bei der Herstellung von Oligonukleotid-Microarrays zu zeigen. Wie von Sengh-Gasson et al. (1999), Nature Biotech. 17: 974–978, im Detail beschrieben wurde, erzeugt der MAS ein UV-Bild der virtuellen Maske auf der Oberfläche des Glassubstrats, das als fester Träger dient, an dem ein Array von Oligonukleotiden assembliert wird. Bevor das Glassubstrat in der Fließzellen-Reaktionskammer des MAS befestigt wird, die mit einem Standard-DNA-Synthesizer verbunden ist, wird es kovalent mit einem Silan-Reagenz modifiziert (in Beispiel 39 beschrieben), um Hydroxylethyl-Grupen zu bilden, mit denen die Sondensynthesen beginnen können.

Auf silanisierten Glasträgern wurden für jede diese Gruppen separate Arrays gefertigt (in Beispiel 40 beschrieben), um am Chip die Entschützung der photolabilen Schutzgruppen der Erfindung in Gegenwart eines Lösemittels im Vergleich zu den etablierten NPPOC- und MeNPOC-Schutzgruppen zu untersuchen. Zusammengefasst gesagt: während des ersten Synthesezyklus wurden 5'-geschützte Desoxythymidin-3'-Phosphoramidite an die Glasträger gekuppelt und anschließend verschiedene Bereiche auf jedem Glasträger mit unterschiedlichen Bestrahlungsdosen beleuchtet. Das fluoreszierende Cy3-Phosphoramidit wurde dann im nächsten Zyklus an die Arrays angelagert, wodurch man ein relatives Maß für die 5'-Hydroxylgruppen erhielt, die photolytisch freigesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in der 4 dargestellt, die belegt, dass wesentlich weniger Energie für die P-NPPOC-Gruppe benötigt wird, um die maximale Freisetzung im Vergleich zu der MeNPOC- und der NPPOC-Gruppe zu erreichen; dies entspricht einer Reduzierung der Entschützungszeit um einen Faktor von > 2 bzw. > 3. Analog zu der Beschreibung von Wöll et al., Poster-Darstellung auf der EuroBiochips 2002, wurde die P-NPPOC-Gruppe sogar noch schneller entfernt, als der Photosensibilisator Thioxanthon im Entschützungs-Lösemittel vorhanden war (auch in 4 ersichtlich).

Ähnliche Versuche auf dem Substrat in Bezug auf die trockene Entschützung wurden gemäß der Beschreibung von Beispiel 41 durchgeführt, um die positiven Ergebnisse zu überprüfen, die für die Alkoxycarbonyl-Derivate der lichtempfindlichen Schutzgruppen der Erfindung erhalten wurden. Im Gegensatz zu den vorgenannten Versuchen auf MAS-Basis wurden alle Lösemittel vor dem Entschützungsschritt entfernt und der Array mit einem durch die Fließzelle laufenden Argonstrom getrocknet. Die Ergebnisse in 5 zeigen, dass die tBuC-NPPOC-Gruppe wesentlich schneller und die MeC-NPPOC-Gruppe etwas schneller als die MeNPOC-Gruppe entfernt wurden.

Schließlich wurde das 5'-Bz-NPPOC-geschützte Desoxythymidin-Phosphoramidit verwendet, um Arrays von dT12-Oligonukleotiden zu bilden (in Beispiel 42 beschrieben), wobei die in Beispiel 41 beschriebene trockene Entschützungsmethode zum Einsatz kam. Analog zu einer von McGall et al. (1997), J. Am. Chem. Soc. 119: 5081–5090, beschriebenen Methode wurde nach dem Photolyseschritt die Ausbeute bei jedem Zyklus der Oligonukleotid-Synthese durch Derivatisierung einer jeweiligen Untergruppe von Features an dem Array mit Cy3-Phosphoramidit bestimmt. Die Zyklusausbeuten wurden nach Beendigung der Synthese aus den Fluoreszenzemissionen der jeweiligen Untergruppen abgeleitet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 aufgeführt, die belegt, dass die Assemblierung von dT12 mit Bz-NPPOC-Schutz sogar unter allgemeinen, nicht optimierten Entschützungsbedingungen bei deutlich kürzeren Expositionszeiten mit identischen oder höheren durchschnittlichen Zyklusausbeuten erreicht wurde als bei den entsprechenden NPPOC- und MeNPOC-Schutzschemen.

Zum Abschluss bleibt festzustellen, dass für die lichtgesteuerte Herstellung von Oligonukleotid-Arrays die bessere Leistung der photolabilen Schutzgruppen der Erfindung dargelegt wird. In Bezug auf die Array-Fertigung, die Entschützungsschritte mit Bestrahlung eines an der Trägeroberfläche vorhandenen Lösemittels umfasst, übertrifft der P-NPPOC-Schutz deutlich den häufig verwendeten NPPOC-Schutz hinsichtlich der Entschützungszeiten und hinsichtlich der Qualität der assemblierten Oligonukleotide. In Bezug auf die Array-Fertigung, die eine Entschützung mit Bestrahlung der trockenen Trägeroberfläche umfasst, sind der MeC-NPPOC-, tBuC-NPPOC- und insbesondere der Bz-NPPOC-Schutz bei den vorgenannten Kriterien dem MeNPOC-Schutz überlegen. Ferner sind die Reagenzien zum Einführen der Bz-NPPOC-Schutzgruppe durch vergleichsweise umkomplizierte Synthesewege mit hohen Ausbeuten leicht zugänglich.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erklärung und Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sollen in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken.

BEISPIELEBeispiel 1. Herstellung von 3-Ethyl-4-nitro-Halogenbenzolen (10) (Schema 1)

  • a) 3-Ethylacetylaminobenzol (8). Die Verbindung (8) wurde nach einer modifizierten Methode hergestellt, die ursprünglich von Wieland et al. (1938), Liebigs Ann., 536: 89, beschrieben wurde, deren gesamter Inhalt hier eingezogen wird. Nach Schema 1 wurde 3-Ethylanilin (7) (25 mL, 27 g, 0,22 mol) zu Essigsäureanhydrid (100 mL) in einem Eisbad gegeben und die Reaktionsmischung 10 Minuten bei Kühlung und weitere 20 Minuten ohne Kühlung gerührt. Die Verdampfung und anschließende Destillation (110–114°C/0,05 mbar) ergab eine Ausbeute von 32,1 g (89%) der Verbindung (8) in Form von hellgelben Kristallen. mp 30–32°C. Rf = 0,42 (Hexane/EtOAc 1:1). 1H NMR: (250 MHz, CDCl3) δ 7,60 (s, 1H, NH), 7,34–7,16 (m, 3H, 3 × arom. H), 2,59 (q, 2H, CH2), 2,14 (s, 1H, C(O)CH3), 1,18 (t, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 206 (3,41); 242 (3,10); 280 (1,76).
  • b) 4-Amino-2-ethylnitrobenzol (9). Die Verbindung 9 wurde mit einer modifizierten Methode hergestellt, die von Wieland et al. (1938), Liebigs Ann., 536: 89, beschrieben wurde, deren gesamter Inhalt hier eingezogen wird. Spezifisch wurde 3-Ethylacetylaminobenzol (8) (39 g, 0,24 mol) tropfenweise konzentrierter Schwefelsäure (100 mL) bei mechanischem Rühren und Eiskühlung in einer solchen Rate zugegeben, dass die Temperatur nicht über 25°C anstieg. Nach Abkühlung auf –15°C wurde 30 Minuten lang tropfenweise konzentrierte Salpetersäure (9,8 mL, 15 g, 0,24 mol) bei Eiskühlung in einer solchen Rate zugegeben, dass die Temperatur nicht über –15°C anstieg. Nach 90 Minuten wurde die Reaktionsmischung auf Eis gegossen und mit Diethylether (3 × 300 mL) ausgeschüttelt. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit Wasser gewaschen und mit festem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Nach Trocknung und Verdampfung in vacuo wurde das erhaltene tiefrote Öl (51 g) mit konzentrierter HCl (175 mL) 2,5 Stunden bei Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlung wurde der Niederschlag abfiltriert, in 1 N NaOH (400 mL) dispergiert und mit Diethylether (3 × 250 mL) ausgeschüttelt. Die kombinierten organischen Phasen wurden getrocknet, verdampft und durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Hexane/EtOAc 8:1 und 4:1) weiter gereinigt. Das Produkt, die Verbindung (9), wurde in einer Ausbeute von 56% (22,1 g) in Form von gelblichen Kristallen erhalten. mp 84–85°C. Rf = 0,27 (Kieselgel, Hexane/EtOAc 7:3). 1H NMR: (250 MHz, CDCl3) δ 7,96 (m, 1H, H(6)), 6,47 (m, 2H, H(5), H(3)), 4,23 (s, 2H, NH2), 2,93 (q, 2H, CH2), 1,24 (t, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 203 (4,21), 231 (3,82), [245 (3,69)], [372 (4,09)].
  • c) 3-Ethyl-4-nitrobrombenzol (10b). Einer auf 60°C vorerhitzten Mischung aus HBr (48%, 95 mL) und Wasser (155 mL) wurde 4-Amino-2-ethylnitrobenzol (9) (16,6 g, 0,1 mol) zugegeben und die Mischung schnell in einem Eisbad abgekühlt. Bei einer Temperatur unter 5°C wurde Natriumnitrit (7,59 g, 0,11 mol) in Wasser (20 mL) tropfenweise zugegeben; nach 10 Minuten wurde eine Spatelspitze Harnstoff zugegeben und die Reaktionsmischung 5 weitere Minuten unter Eiskühlung gerührt. Der Niederschlag wurde durch Saugen filtriert und einer Mischung aus Kupfersulfat-Pentahydrat (15 g, 60 mmol) und Kupferpulver (6 g, 94 mmol) in HBr (48%, 63 mL) und Wasser (37 mL) zugesetzt; danach wurde die Mischung 70 Minuten auf 80°C erhitzt. Nach Abkühlen wurde die Mischung mit Ethylacetat (4 × 150 mL) extrahiert; die kombinierten organischen Extrakte wurden mit 1 N NaOH (200 mL) und Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft. Die Destillation ergab 18,53 g (80%) 3-Ethyl-4-nitrobrombenzol (10b) als gelbes Öl. bp 75–83°C/0,007 mbar. Rf = 0,76 (Hexane/EtOAc 4:1). 1H NMR δ (250 MHz, CDCl3): 7,76 (d, 1H, H(6)), 7,50 (d, 1H, H(3)), 7,45 (dd, 1H, H(5)), 2,89 (q, 2H, CH2), 1,27 (t, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 203 (4,19), [217 (3,98)], 267 (3,91), [320 (3,21)]. Elementaranalyse für C8H8BrNO2 (230,07 g/mol): berechnet: C 41,77, H 3,50, N 6,09; gefunden: C 41,71, H 3,59, N 6,08.
  • d) 3-Ethyl-4-nitrochlorbenzol (10a). Die Verbindung 10a wurde nach der oben beschriebenen Methode mit einer Ausbeute von 46% als gelbes Öl gewonnen, wobei statt dessen konzentrierte HCl und Kupfer(I)-chlorid verwendet wurden. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,85 (m, 1H, H(6)), 7,34 (m, 1H, H(3)), 7,29 (dd, 1H, H(5)), 2,90 (q, 2H, CH2), 1,24 (t, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 206 (4,09), [216 (3,91]), 263 (3,79)], [334 (2,84)]. Elementaranalyse für C8H8ClNO2 (185,61): berechnet: C 51,77, H 4,34, N 7,55; gefunden: C 51,65, H 4,34, N 7,63.
  • e) 3-Ethyl-4-nitroiodbenzol (10c). Die Verbindung 10c wurde nach der oben beschriebenen Methode mit einer Ausbeute von 57% als rotes Öl gewonnen, wobei statt dessen verdünnte H2SO4 und Natriumiodid verwendet wurden. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,72 (m, 1H, H(3)), 7,66 (dd, 1H, H(5)), 7,58 (d, 1H, H(6)), 2,85 (q, 2H, CH2), 1,25 (t, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 203 (4,22), [220 (3,88]), 281 (3,87)], [328 (3,22)]. Elementaranalyse für C8H8INO2 (277,06): berechnet: C 34,68, H 2,91, N 5,06; gefunden: C 34,84, H 2,92, N 4,90.

Beispiel 2. Herstellung von 3-Ethyl-4-nitrobiphenyl (11a) (Schema 2)

Einer Lösung von 3-Ethyl-4-nitro-brombenzol (10b) (6,9 g, 26 mmol) in Toluol (40 mL) wurden Ethanol (10,5 mL), eine wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat (2 M, 16 mL), Benzolboronsäure (3,82 g, 31 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (400 mg, 0,35 mmol) zugegeben und die Mischung bei Rückfluss 5 Stunden erhitzt. Nach Abkühlung wurde eine gesättigte wässrige NaCl-Lösung (30 mL) zugesetzt und die Mischung mit Ethylacetat (2 × 25 mL) extrahiert; die kombinierten organischen Extrakte wurden getrocknet und verdampft. Nach Kieselgel-Säulenchromatographie (Hexane und Hexane/EtOAc 9:1), wurde die Verbindung 11a mit einer Ausbeute von 92% (5,43 g) in Form von gelben Kristallen gewonnen. mp 54–56°C. Rf = 0,67 (Hexane/EA 9:1). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,99 (d, 1H, arom. H), 7,61 und 7,38 (m, 7H, 7 arom. H), 2,99 (q, 2H, CH2), 1,33 (t, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 205 (4,52), [225 (4,05)], 291 (4,04). Elementaranalyse für C14H13NO2 (227,26): berechnet: C 73,99, H 5,75, N 6,16; gefunden: C 73,84, H 5,68, N 5,81.

Beispiel 3. Herstellung von 3-Ethyl-4-nitro-4'-methoxybiohenyl (11b) (Schema 2)

3-Ethyl-4-nitro-4'-methoxybiphenyl (11b) wurde wie in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wobei 4-Methoxybenzolboronsäure als Reagenz verwendet wurde. Nach der Reinigung wurde die Verbindung 11b mit einer Ausbeute von 93% in Form von gelben Kristallen erhalten. mp 94–95°C. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,97 (d, 1H, 1 arom. H), 7,51 (m, 4H, 4 arom. H), 6,70 (dd, 2H, 2 arom. H) 3,85 (s, 3H, OMe), 2,99 (q, 2H, CH2), 1,32 (t, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 204 (4,52), 232 (4,13), 320 (4,07)]. Elementaranalyse für C15H15NO3 (257,29): berechnet: C 70,02, H 5,88, N 5,44; gefunden: C 70,00, H 5,97, N 5,14.

Beispiel 4. Herstellung von 2-(3-Ethyl-4-nitrophenyl)naphthalen (11c) (Schema 2)

2-(3-Ethyl-4-nitrophenyl)naphthalen (11c) wurde wie in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wobei 2-Naphthylboronsäure als Reagenz verwendet wurde. Die Verbindung 11c wurde mit einer Ausbeute von 93% in Form von gelben Kristallen gewonnen. mp 110– 111°C. 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,03 (m, 2H, 2 arom. H), 7,90 (m, 3H, 3 arom. H), 7,66 (m, 3H, 3 arom. H), 7,52 (m, 2H, 2 arom. H), 3,03 (q, 2H, CH2), 1,36 (t, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 212 (4,61), 233 (4,59), [271 (4,15)], 310 (4,14), [339 (3,96)]. Elementaranalyse für C18H15NO2 (277,32): berechnet: C 77,96, H 5,45, N 5,05; gefunden: C 77,79, H 5,25, N 4,76.

Beispiel 5. Herstellung von 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäuremethylester (11d) (Schema 3)

  • a) 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäure (13) (Schema 3) wurde aus 4-Ethylbenzoesäure (12) nach einer von Fahim et al. (1952), J. Chem. Soc. 4519–4521, beschriebenen Methode hergestellt, deren gesamter Inhalt hier einbezogen wird. Das Produkt wurde als farbloser Feststoff in einer Ausbeute von 95% erhalten. mp 157–159°C. Rf = 0,11 (Hexane/EA 1:1). 1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 8,33 (d, 1H, arom. H(2)), 8,12 (dd, 1H, arom. H(6)), 7,65 (d, 1H, arom. H(5)), 2,86 (q, 2H, CH2CH3), 1,20 (t, 3H, CH2CH3).
  • b) 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäuremethylester (11d). Einer Lösung von 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäure (13) (9,76 g, 50 mmol) in 40 mL trockenem Methanol wurde konz. H2SO4 (1,5 mL) zugesetzt und die Mischung danach bei Rückfluss 3 Stunden erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die Mischung in CH2Cl2 (50 mL) suspendiert und mit einer gesättigten Lösung von NaHCO3 (50 mL) extrahiert. Die wässrige Phase wurde zweimal mit CH2Cl2 (50 mL) reextrahiert; danach wurden die kombinierten organischen Extrakte über Na2SO4 getrocknet und verdampft. Das Rohprodukt (10,24 g, 49 mmol, 98%) wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Rf = 0,59 (Hexane/EA 9:1). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,48 (d, 1H, arom. H(2)), 8,15 (dd, 1H, arom. H(6)), 7,44 (d, 1H, arom. H(5)), 3,93 (s, 3H, COOCH3), 2,93 (q, 2H, CH2CH3), 1,28 (t, 3H, CH2CH3).

Beispiel 6. Herstellung von 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäure-tert-butylester (11e) (Schema 3)

Eine Lösung von 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäure (13) (9,76 g, 50 mmol), N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (11,35 g, 55 mmol), tert-Butanol (4,8 g, 65 mmol) und 4-Pyrrolidinopyridin (740 mg, 5 mmol) in trockenem CH2Cl2 (150 mL) wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, filtriert; dann wurde das Filtrat zur Trocknung eingedampft. Das Rohmaterial (15,09 g) wurde auf Kieselgel (20 g) absorbiert und dann durch Flash-Chromatographie gereinigt (120 g Kieselgel, Säule: 5 × 14 cm, Lösemittel: Hexan/ETOAC, mit folgendem Stufengradient: 600 mL Hexan, 600 mL 20:1 (v/v), 330 mL 10:1 (v/v) und 270 mL 8:1 (v/v)). Die Verbindung 11e (10,67 g, 42 mmol, 89% Ausbeute) wurde als hellgelbes Öl erhalten. Rf = 0,59 (Hexan/EtOAc 9:1). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,38 (d, 1H, arom. H(2)), 8,07 (dd, 1H, arom. H(6)), 7,39 (d, 1H, arom. H(5)), 2,90 (q, 2H, CH2CH3), 1,56 (s, 9H, 3 × CH3 COOtBu), 1,21 (t, 3H, CH2CH3).

Beispiel 7. Herstellung von 4-α-Cyanobenzyliden-6-ethyl-2,5-cyclohexadien-1-one-oxim (16) (Schema 4)

Einer Lösung von Kaliumhydroxid (240 g, 4,28 mol) in Methanol (1000 mL) wurden Phenylacetonitril (14) (120 mL, 121,8 g, 1,04 mol) und 1-Ethyl-2-nitrobenzol (15) (120 mL, 134,5 g, 0,89 mol) zugegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden bei 50–60°C gerührt, in einem Eisbad abgekühlt und mit Wasser (1600 mL) verdünnt. Eine Lösung von Essigsäure (440 mL) in Wasser (400 mL) wurde dann tropfenweise der eisgekühlten Reaktionsmischung zugesetzt. Die resultierende Suspension wurde über Nacht in einem Eisbad gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mehrere Tage an der Luft getrocknet und mit Hexan gewaschen, um 200 g (0,80 mol, 90%) der Verbindung 16 als gelbes Pulver zu erhalten.

Beispiel 8. Herstellung von 3-Ethyl-4-nitro-benzophenon (11f)

Eine Mischung aus dem Oxim 16 (200 g, 0,80 mol), Kaliumhydroxid (188 g, 3,36 mol), Methanol (190 mL) und Wasser (1900 mL) wurde auf 70–90°C erhitzt. Bei kräftigem Rühren wurde der heißen Reaktionsmischung ca. 6–8 Stunden lang tropfenweise eine wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid (35%, 1400 mL) zugegeben. Die Mischung wurde dann über Nacht unter Rückfluss erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt und der ölige Niederschlag absetzen gelassen. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und mit Ethylacetat (1000 mL) extrahiert. Die erhaltene organische Phase und der ölige Niederschlag wurden kombiniert, mit etwas Toluol verdünnt und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde in CH2Cl2 gelöst, über Kieselgel (380 g) filtriert, in vacuo verdampft, aus Methanol kristallisiert und luftgetrocknet, um 58,5 g (0,23 mol, 29%) der Verbindung 11f als gelbe Kristalle zu erhalten.

Beispiel 9. Allgemeines Protokoll für die Herstellung von 2-(5-Aryl-2-nitrophenyl)propanol-Derivaten (Schema 5)

Das jeweilige Ethylbenzol-Derivat (11) (5 mmol) wurde mit Paraformaldehyd (5 mmol) in trockenem DMSO (10 mL) und Kalium-tert-butoxid (0,05–0,5 mmol) in tert-Butanol (3 mL) behandelt. Nach 15 Minuten Rühren bei Raumtemperatur und 2 Stunden Erhitzen bei 80°C wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit konz. HCl neutralisiert, mit einer gesättigten wässrigen Lösung von NaCl (25 mL) verdünnt und mit Ethylacetat (3 × 20 mL) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden dann getrocknet und verdampft. Die Kieselgel-Säulenchromatographie lieferte das gewünschte Produkt.

Beispiel 10. Herstellung von 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)propanol (4a)

Die Verbindung 4a wurde nach der in Beispiel 9 beschriebenen allgemeinen Methode hergestellt, wobei ausgehend von 3-Ethyl-4-nitrobiphenyl (11a) die Verbindung 4a als gelbes Öl in einer Ausbeute von 68% gewonnen wurde. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,85 (d, 1 arom. H), 7,65 (d, 1 arom. H), 7,59–7,38 (m, 6 arom. H), 3,83 (m, 2H, CH2), 3,62 (m, 1H, CH), 1,73 (br. s, 1H, OH), 1,37 (d, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 204 (4,53), [231 (4,03)], 281 (3,94)], 336 (3,70). Elementaranalyse für C14H13NO2 (227,26): berechnet: C 70,02, H 5,88, N 5,44; gefunden: C 69,67, H 5,73, N 5,30.

Beispiel 11. Herstellung von 2-[5-(4-Methoxyphenyl)-2-nitrophenyl]propanol (4b)

Die Verbindung 4b wurde nach der in Beispiel 9 beschriebenen allgemeinen Methode hergestellt, wobei ausgehend von 3-Ethyl-4-nitro-4'-methoxybiphenyl (11b) die Verbindung 4b in einer Ausbeute von 57% als gelbe Kristalle erhalten wurde. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,84 (d, 1 arom. H), 7,53 (dm, 4 arom. H), 6,99 (dd, 2 arom. H), 3,83 (m, 5H, OMe und α-CH2), 3,66 (m, 1H, β-CH), 1,60 (br. s, 1H, OH), 1,36 (d, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 204 (4,56), 232 (4,13), 305 (4,01). Elementaranalyse für C16H17NO4 (287,31): berechnet: C 66,89, H 5,96, N 4,88; gefunden: C 66,78, H 5,83, N 4,77.

Beispiel 12. Herstellung von 2-[5-(2-Naphthyl)-2-nitrophenyl]propanol (4c)

Die Verbindung 4c wurde nach der in Beispiel 9 beschriebenen allgemeinen Methode hergestellt, wobei ausgehend von 2-(3-Ethyl-4-nitrophenyl)naphthalen (11c) die Verbindung 4c in einer Ausbeute von 69% als gelbe Kristalle gewonnen wurde. mp 118–119°C. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,04 (s, 1 arom. H), 7,91 (m, 3 arom. H), 7,78 (d, 1 arom. H), 7,68 (m, 2 arom. H), 7,52 (m, 2 arom. H), 3,88 (m, 2H, α-CH2), 3,67 (m, 1H, β-CH); 1,78 (br. s, 1H, OH); 1,41 (d, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 212 (4,61), 235 (4,57), [274 (4,14)], [303 (4,09)], [340 (3,85)]. Elementaranalyse für C19H17NO3 (307,35): berechnet: C 74,25, H 5,58, N 4,56; gefunden: C 74,22, H 5,47, N 4,35.

Beispiel 13. Herstellung von 2-(4-Methoxycarbonyl-2-nitrophenyl)propanol (4d)

Einer Suspension von 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäuremethylester (11d) (10 g, 48 mmol) und Paraformaldehyd (1,8 g, 60 mmol) in DMSO (10 mL) wurde portionsweise Kalium-tert-butoxid (1,46 g, 12 mmol) zugegeben; dabei wechselte die Farbe der Reaktionsmischung von gelb nach violett. Nach 2,5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung direkt auf das Kieselgelbett einer Chromatographiesäule (100 g Kieselgel, 3,5 × 14 cm) aufgebracht und mit Hexan/Ethylacetat (EA) (3:1, v/v) verdünnt. Das leicht gelbliche Produkt (4d) wurde in einer Ausbeute von 38% (4,42 g, 18 mmol) gewonnen. Rf = 0,24 (Hexane/EtOAc 7:3). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,36 (d, 1H, arom. H(3)), 8,18 (dd, 1H, arom. H(5)), 7,58 (d, 1H, arom. H(6)), 3,93 (s, 3H, COOCH3), 3,78 (m, 2H, α-CH2), 3,54 (Sextett, 1H, β-CH), 1,69 (d, 3H, CH3).

Beispiel 14. Herstellung, von 2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)propanol (4e)

Einer Suspension von 4-Ethyl-3-nitrobenzoesäure-tert-butylester (11e) (10 g, 40 mmol) und Paraformaldehyd (1,8 g, 60 mmol) in DMSO (10 mL) wurde portionsweise Kalium-tert-butoxid (590 mg, 5,8 mmol) zugegeben; dabei wechselte die Farbe der Reaktionsmischung von gelb nach violett. Nach 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in CH2Cl2 suspendiert, auf Kieselgel (15 g) in vacuo absorbiert und durch Flash-Chromatographie gereinigt (100 g Kieselgel, Säule: 3,5 × 14 cm, Lösemittel: Hexan/EA 3:1). Das Produkt wurde als gelbes Öl in einer Ausbeute von 94% (10,57 g, 38 mmol) erhalten. Rf = 0,34 (Hexan/EtOAc 3:1). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,27 (d, 1H, arom. H(3)), 7,58 (dd, 1H, arom. H(5)), 7,53 (d, 1H, arom. H(6)), 3,76 (m, 2H, α-CH2), 3,50 (Sextett, 1H, β-CH), 1,81 (t, 1H, OH), 1,57 (s, 9H, 3 × CH3 COOtBu), 1,31 (d, 3H, CH3).

Beispiel 15. Herstellung von 2-(3-Ethyl-4-nitrophenvl)-2-phenyl-1.3-dioxan (17)

Eine Suspension von 3-Ethyl-4-nitro-benzophenon (11f) (20,0 g, 78,4 mmol), 1,3-Propandiol (7,15 g, 94,0 mmol), p-Toluensulfonsäure-Monohydrat (50 mg) in Toluol (300 mL) wurde unter Rückfluss erhitzt, wobei 24 Stunden lang ein Dean-Stark-Wasserabscheider verwendet wurde. Der Dean-Stark-Wasserabscheider wurde dann durch einen mit einem Molekularsieb gefüllten Soxhlet-Extraktor ersetzt und die Mischung weitere 48 Stunden unter Rückfluss erhitzt, um eine vollständige Umwandlung zu erreichen. Die Reaktionsmischung wurde anschließend auf Umgebungstemperatur abgekühlt, mit einer gesättigten wässrigen Lösung von NaHCO3 gewaschen und in vacuo konzentriert, bis die Kristallisation begann. Die Suspension wurde 0,5 Stunden in einem Eisbad gekühlt; danach wurde das kristalline Produkt filtriert, mit einer kleinen Menge Hexan gewaschen und luftgetrocknet, um 22,48 g (72 mmol, 91,5%) der Verbindung 17 in Form von gelben Kristallen zu erhalten.

Beispiel 16. Herstellung von 2-(3-(2-Hydroxy-1-methylethyl)-4-nitrophenyl)-2-phenyl-1,3-dioxan (18)

Eine Suspension von 2-(3-Ethyl-4-nitrophenyl)-2-phenyl-1,3-dioxan (17) (20,0 g, 63,8 mmol), Paraformaldehyd (6,5 g, 72,6 mmol) und einer methanolischen Lösung von Triton B (35%, 17 mL) in DMSO (100 mL) wurde 2 Stunden bei 85°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt, mit CH2Cl2 (200 mL) verdünnt, mit Wasser (2 × 200 mL) gewaschen, partiell in vacuo konzentriert (zur azeotropen Trocknung) und über Kieselgel (35 g) filtriert. Das Filtrat wurde dann in vacuo verdampft, um 24,15 g (ca. 70,3 mmol, 110%) des Rohprodukts als gelbes Öl zu erhalten.

Beispiel 17. Herstellung von 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4f)

Einer Lösung von 2-(3-(2-Hydroxy-1-methylethyl)-4-nitrophenyl)-2-phenyl-1,3-dioxan (18) (23,6 g; ca. 69 mmol) in Ethanol (350 mL) wurde Wasser (70 mL) bei kräftigem Rühren zugegeben. Dann wurde konzentrierte Salzsäure (ca. 12 N wässrige Lösung, 35 mL) tropfenweise zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei Umgebungstemperatur 4 Stunden gerührt, mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat gewaschen. Die organische Phase wurde der Reihe nach mit einer wässrigen gesättigten Lösung von NaHCO3 und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend in vacuo konzentriert und mit Kristallen des Produkts 4f geimpft, um einen gelben Feststoff zu erhalten. Schließlich wurde der pulverige Feststoff mit Hexan gewaschen und luftgetrocknet, woraus eine Ausbeute von 17,83 g (62,5 mmol, 91%) eines gelben Pulvers resultierte. 1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 7,91–7,52 (m, 8H, arom.), 4,75 (br. s., 1H, OH), 3,53 (d, 2H, α-CH2), 3,23 (Sextett, 1H, β-CH), 1,24 (d, 3H, γ-CH3).

Beispiel 18. Allgemeines Protokoll für die Herstellung von 2-(2-Nitrophenyl)-1-propyloxycarbonylchlorid-Derivaten von Verbindungen (4a bis 4e)

Einer Lösung von Trichlormethylchlorformat (2,37 g, 1,4 mL, 12 mmol, 1,2 äquivalente Mengen) in trockenem Tetrahydrofuran (10 mL), die auf 0°C vorgekühlt war, wurde 5 Minuten lang eine Lösung des jeweiligen 2-(2-Nitrophenyl)-1-propanol-Derivats (10 mmol) und von Triethylamin (1 g, 10 mmol) in Tetrahydrofuran (10 mL) bei fortlaufender Kühlung zugegeben. Nach 1 Stunde Rühren in einem Eisbad wurde die Reaktionsmischung filtriert; der Filterkuchen wurde mit etwas Tetrahydrofuran gewaschen, und die kombinierten organischen Phasen wurden in vacuo verdampft.

Beispiel 19. Herstellung von 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19a)

Herstellung nach der in Beispiel 18 beschriebenen allgemeinen Methode; ausgehend von 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4a) wurde ein dunkelgelbes Öl (3,08 g, 96%) erhalten, das nach 2 Stunden Trocknen bei 0,1 mbar ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde. Rf = 0,91(CH2Cl2). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,93 (d, 1 arom. H), 7,62–7,40 (m, 7 arom. H), 4,54 (d, 2H, CH2), 3,90 (Sextett, 1H, CH), 1,45 (d, 3H, CH3).

Beispiel 20. Herstellung von 2-(4-Methoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propyloxycarbonylchlorid (19d)

Herstellung nach der in Beispiel 18 beschriebenen allgemeinen Methode; ausgehend von 2-(4-tert-Methoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4d) (1,85 g, 7,7 mmol) wurde das Produkt in einer Ausbeute von 93% (2,16 g, 7,02 mmol) als gelbes Öl erhalten, das ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde. Rf = 0,80 (CH2Cl2). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,45 (d, 1H, arom. H(3)), 8,22 (dd, 1H, arom. H(5)), 7,55 (d, 1H, arom. H(6)), 4,48 (dd, 2H, α-CH2), 3,95 (s, 3H, COOCH3), 3,82 (Sextett, 1H, β-CH), 1,41 (d, 3H, CH3).

Beispiel 21. Herstellung von 2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19e)

Herstellung ausgehend von 2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4e) (7,05 g, 25 mmol) nach der in Beispiel 18 beschriebenen allgemeinen Methode; das Produkt, die Verbindung 19e, wurde in einer Ausbeute von 97% (8,37 g, 24 mmol) als gelbes Öl erhalten, das ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde. Rf = 0,86 (CH2Cl2). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,36 (d, 1H, arom. H(3)), 8,16 (dd, 1H, arom. H(5)), 7,52 (d, 1H, arom. H(6)), 4,48 (m, 2H, α-CH2), 3,76 (Sextett, 1H, β-CH), 1,59 (s, 9H, 3 × CH3 COOtBu), 1,39 (m, 3H, CH3).

Alle anderen oben beschriebenen substituierten Propanole können in der gleichen Weise behandelt werden, um die jeweiligen Chlorcarbonate in ausgezeichneter Ausbeute und ausreichender Reinheit zu gewinnen.

Beispiel 22. Herstellung von 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19f)

Einer auf 0°C vorgekühlten Lösung von Trichlormethylchlorformat (15,83 g, 80 mmol, 0,8 äquivalente Mengen) in trockenem Tetrahydrofuran (150 mL) wurde ca. 2 Stunden lang eine Lösung von 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4f) (28,53 g, 100 mmol) und Triethylamin (10,12 g, 100 mmol) in Tetrahydrofuran (250 mL) bei fortlaufender Kühlung zugesetzt. Nach 1 Stunde Rühren bei Umgebungstemperatur wurde die resultierende Suspension filtriert; der Filterkuchen wurde mit etwas Tetrahydrofuran gewaschen, und die kombinierten organischen Phasen wurden in vacuo konzentriert, um die Verbindung 19f als gelbes Öl zu erhalten.

Alle anderen oben beschriebenen substituierten Propanole können in der gleichen Weise behandelt werden, um die jeweiligen Chlorcarbonate in ausgezeichneter Ausbeute und ausreichender Reinheit zu gewinnen.

Beispiel 23. Allgemeines Protokoll für das Einführen der photolabilen Schutzgruppen an der 5'-Stellung von 2'-Desoxynukleosiden

Das jeweilige 2'-Desoxynukleosid (1 mmol) wurde durch Koverdampfung mit abs. Pyridin (3 × 3 mL) getrocknet, in abs. Pyridin (3 mL) gelöst und auf –50°C abgekühlt. Das jeweilige Chlorcarbonat (1,35 äquivalente Mengen für 2'-Desoxythymidin, 2'-Desoxyadenosin und 2'-Desoxyguanosin, oder 1,5 äquivalente Mengen für 2'-Desoxycytidin) in abs. CH2Cl2 (3 mL) wurde 10 Minuten lang tropfenweise zugesetzt. Nach 5 Stunden Rühren bei –50°C bis –30°C wurde die Reaktionsmischung mit Wasser (10 mL) behandelt und die wässrige Phase mit CH2Cl2 (3 × 10 mL) extrahiert. Die kombinierte organische Phase wurde getrocknet, mit Toluol (3 × 10 mL) koverdampft und durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (CH2Cl2/MeOH 100:1, 100:2, 100:3, 100:3,5 und 100:4). Die Produkte wurden als amorphe Feststoffe in mäßiger bis guter Ausbeute gewonnen.

Beispiel 24. Herstellung von 5'-O-[2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin (20) (Tabelle 1)

Die Verbindung 20 wurde nach der in Beispiel 23 beschriebenen allgemeinen Methode mit 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19a) hergestellt, um ein gelbliches Pulver in einer Ausbeute von 78% zu erhalten. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,91 (br. s, NH), 7,86 (d, 1 arom. H), 7,61–7,38 (m, 7 arom. H), 7,28 (s, 1H, H-C(6)), 6,30 (t, 1H, HC(1')), 4,52–4,21 (m, 5H, CH2, H-C(5'), H-C(3')), 4,09 (m, 1H, H-C(4')), 3,89 (m, 1H, CH), 3,65 (br. s, 1H, HO-(3')), 2,32 (m, 1H, H-C(2')), 2,10 (m, 1H, H-C(2')), 1,76 (d, 3H, CH3-(thy)), 1,41 (d, 3H, CH3). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 203 (4,69), 263 (4,25)], [295 (3,95)]; 335 (3,80). Elementaranalyse für C26H27N3O9 × 0,5 H2O (534,52): berechnet: C 58,42, H 5,28, N 7,86; gefunden: C 58,82, H 5,26, N 7,58.

Beispiel 25. Herstellung von N6-tert-Butylphenoxyacetyl-5'-O-[2-(5-phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxyadenosin (21) (Tabelle 1)

Die Verbindung 21 wurde nach der in Beispiel 23 beschriebenen allgemeinen Methode mit 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19a) hergestellt, um ein gelbliches Pulver in einer Ausbeute von 80% zu erhalten. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 9,47 (br. d, 1H, NH), 8,74 und 8,19 (2d, 2H, H-C(2), H-C(8)), 7,85 (m, 1 arom. H), 7,61 (d, 1 arom. H), 7,52 (m, 2 arom. H), 7,43–7,30 (m, 4H, 2 arom. H (Schutzgr.), 2 arom. H (Tac)), 6,94 (d, 2 arom. H (Tac)), 6,49 (t, 1H, H-C(1')), 4,80 (s, 2H, CH2 (Tac)), 4,67 (m, 1H, H-C(3')), 4,41–4,19 (m, 5H, 2 × CH, H-C(5'), H-C(4')), 3,89 (m, 1H, CH (Schutzgr.)), 3,11 (br. s, 1H, HO-(3')), 2,80 (m, 1H, H-C(2)). 2,54 (m, 1H, H-C(2')), 1,41 (d, 3H, CH3)), 1,27 (s, 9H, CH3 (tert-butyl)). Elementaranalyse für C38H40N6O8 × 1,5H2O (734,78): berechnet: C 62,03, H 5,89, N 11,42; gefunden: C 62,27, H 5,70, N 11,39.

Beispiel 26. Herstellung von 5'-O-[2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin (25) (Tabelle 1)

Die Verbindung 20 wurde mit der in Beispiel 17 beschriebenen allgemeinen Methode ausgehend von 2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19e) hergestellt, um ein farbloses Pulver in einer Ausbeute von 72% zu erhalten. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,89 (s, 1H, NH), 8,29 (s, 1H, arom. H(3) 4tBuOOCNPPOC), 8,14 (m, 1H, arom. H(5) 4tBuOOCNPPOC), 7,51 (m, 1H, arom. H(6) 4tBuOOCNPPOC), 7,27 (2 × s, 1H, H-C(6)), 6,29 (m, 1H, H-C(1')), 4,45–4,08 (m, 6H, αCH2 4tBuOOCNPPOC, 2 × H-C(5'), H-C(3'), H-C(4')), 3,78 (Sextett, 1H, β-CH 4tBuOOCNPPOC), 2,87 (t, 1H, OH-C(3')), 2,34 (m, 1H, H-C(2')), 2,16 (m, 1H, H-C(2')), 1,85 + 1,79 (2 × s, 3H, CH3 thy), 1,58 (s, 9H, 3 × CH3 COOtBu), 1,36 (m, 3H, γ-CH3 4tBuOOCNPPOC).

Beispiel 27. Herstellung von N6-Benzoyl-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxyadenosin (29)

N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin (23,63 g, 67 mmol) wurde durch Koverdampfung mit abs. Pyridin (3 × 100 mL) getrocknet, in Pyridin (400 mL) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Eine Lösung von 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19f) (35 mmol, hergestellt aus 10,00 g Alkohol 4f) in abs. CH2Cl2 (100 mL) wurde 2,5 Stunden lang tropfenweise zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Umgebungstemperatur wurde die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert, in CH2Cl2 gelöst und mit Wasser (2 × 200 mL) gewaschen. Überschüssiges N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin fiel als kristalliner Feststoff aus der wässrigen Phase aus und wurde durch Filtrieren zurückgewonnen. Die organische Phase wurde mit Toluol (100 mL) verdünnt, in vacuo konzentriert und durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (315 g Kieselgel, Säulendurchmesser 5,5 cm, Gradient: CH2Cl2 zu CH2Cl2/Methanol 100:5), um 13,20 g (19,8 mmol, 57%) des Produkts 29 als leicht gelblichen Schaum zu erhalten. 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6): δ 11,02 und 11,01 (2s, 2H, NH), 8,67 (s, 1H, H-C(2)), 8,51 und 8,50 (2s, 2H, H-C(8)), 8,00–7,48 (m, 13H, arom.), 6,46 (m, 1H, H-C(1')), 5,47 (d, 1H, HO-C(3')), 4,46 (m, 1H, H-C(3')), 4,28 (m, 4H, 2 × CH2), 4,03 (m, 1H, H-C(4)), 3,50 (m, β-CH), 2,86 (m, 1H, H-C(2'')), 2,40 (m, 1H, H-C(2')), 1,28 (d, 3H, γ-CH3).

Beispiel 28. Herstellung von N4-Acetat-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propvl-oxyoxycarbonyl]-2'-desoxycytidin (30)

N4-Acetat-2'-desoxycytidin (17,87 g, 66 mmol) wurde durch Koverdampfung mit abs. Pyridin (3 × 70 mL) getrocknet, in Pyridin (200 mL) gelöst und auf 0°C abgekühlt. Eine Lösung von 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19f) (35 mmol, hergestellt aus 10,00 g Alkohol 41) in abs. CH2Cl2 (100 mL) wurde 2,5 Stunden lang tropfenweise zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Umgebungstemperatur wurde die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert, in CH2Cl2 gelöst und mit Wasser (2 × 200 mL) gewaschen. Die organische Phase wurde mit Toluol (100 mL) verdünnt, in vacuo konzentriert und durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (320 g Kieselgel, Säulendurchmesser 5,5 cm, Gradient: CH2Cl2 zu CH2Cl2/Methanol 100:5), um 10,58 g (18,2 mmol, 52%) des Produkts 30 als farblosen Schaum zu erhalten. 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 10,72 (s, 1H, NH), 7,96–7,50 (m, 9H, H-C(6) und arom.), 7,10 (d, 1H, H-C(5)), 7,09 (d, 1H, H-C(5)), 6,08 (m, 1H, H-C(1')), 5,37 (d, 1H, HO-C(3')), 4,32–4,22 (m, 4H, 2 × CH2), 4,15 (m, 1H, H-C(3')), 3,97 (m, 1H, H-C(4')), 3,54 (m, 1H, β-CH), 2,27 (m, H-C(2'')), 2,08 (s, 1H, NHAc), 2,05 (m, 1H, H-C(2')), 1,31 (d, 3H, γ-CH3).

Alle anderen oben beschriebenen Chlorcarbonate können in analoger Weise in die jeweiligen 5'- oder 3'-geschützten Nukleoside mit ausgezeichneter Ausbeute und ausreichender Reinheit umgewandelt werden.

Beispiel 29. Herstellung von 3'-O-[2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin (28)

Eine Lösung von 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4a) (324,4 mg) und DMAP (36,1 mg) in Acetonitril (1 mL) wurde einer Lösung von 3'-(4-Nitrophenyl-oxycarbonyl)-2'-desoxythymidin (102,7 mg, erhalten durch Reagieren von 4-Nitrophenyl-oxycarbonylchlorid mit 5'-Dimethoxytrityl-geschütztem (DMT) 2'-Desoxythymidin und anschließendes Entfernen der DMT-Schutzgruppe unter leicht sauren Bedingungen analog zu in der Technik bekannten Protokollen) in Acetonitril (1 mL) zugesetzt. Die Mischung wurde 20 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Na2HPO4/KH2PO4-Puffer (5 mL) gelöscht; die Mischung wurde dann mit Dichlormethan (3 × 10 mL) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet und in vacuo konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (8 g Kieselgel, 16 × 1 cm, Gradient: Dichlormethan zu Dichlormethan:Methanol 25:1). Das Produkt wurde in einer Ausbeute von 62,7% (82,9 mg) als leicht bräunlicher Schaum erhalten. Rf = 0,20 (CH2Cl2/MeOH 20:1). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,61 (s, 1H, NH); 7,88 (d, 1H, arom. H Schutzgruppe); 7,62–7,37 (m, 8H, 7 × arom. H Schutzgruppe, H-C (6)); 6,08 (m, 1H, H-C(1')); 5,25 (m, 1H, H-C(3')); 4,36 (m, 2H, α-CH2); 4,08 (m, 1H, H-C(4')); 3,87 (m, 3H, 2 × H-C(5'); β-CH Schutzgruppe); 2,54–2,15 (m, 3H, 2 × H-C(2'); OH-C(5')); 1,89 (s, 3H, CH3 Thy); 1,42 (d, 3H, CH3 Schutzgruppe). UV (λmax [nm] (log ε); MeOH): 203 (4,64); 263 (4,22); [293 (3,92)]; 341 (3,78).

Beispiel 30. Allgemeines Protokoll für die Herstellung von 5'-O-photolabil-geschützten 3'-O-(β-Cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidityl-2'-desoxynukleosiden

Das 5'-photolabil-geschützte 2'-Desoxynukleosid (2 mmol) wurde unter Argon in einer Mischung aus abs. CH2Cl2 (8 mL) und abs. Acetonitril (2 mL) suspendiert. Dann wurden Tetrazol (140 mg, 2 mmol) und Bis(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphan (1,2 g, 4 mmol) zugesetzt. Nach 2,5 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde CH2Cl2 (40 mL) zugegeben und die resultierende Mischung mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat (40 mL) gewaschen. Die kombinierte organische Phase wurde getrocknet und durch Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt (EtOAc/NEt3, 99:1 (v/v)). Die Produkte wurde in guten Ausbeuten als amorphe Feststoffe erhalten.

Beispiel 31. Herstellung von 5'-O-[2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin-3'-O-(β-cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Das Phosphoramidit wurde nach der in Beispiel 30 beschriebenen allgemeinen Methode hergestellt, um ein gelbliches Pulver in einer Ausbeute von 85% zu erhalten. Rf = 0,83 und 0,79 (EtOAc, Diastereomere). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 7,98 (br. s, NH), 7,87 (d, 1 arom. H), 7,61 (s, 1 arom. H), 7,57 (m, 3 arom. H), 7,45 (m, 3 arom. H), 7,26 (m, 1H, H-C(6)), 6,29 (t, 1H, HC(1')), 4,52–4,16 (m, 6H, 2 × α-CH, H-C(5'), H-C(3'), H-C(4')), 3,89–3,50 (m, 5H, O-CH2CH2CN, β-CH, 2 × CH (isopropyl)), 2,61 (m, 2H, CH2CN), 2,40 (m, 1H, H-C(2')), 2,13 (m, 1H, H-C(2')), 1,80–1,72 (m, 3H, CH3-thy)), 1,41 (d, 3H, CH3), 1,15 (m, 12H, 4 × CH3 (isopropyl)).

Beispiel 32. Herstellung von N6-tert-Butylphenyloxyacetyl-5'-O-[2-(5-phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxyadenosin-3'-O-(β-cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Das Phosphoramidit wurde nach der in Beispiel 30 beschriebenen allgemeinen Methode hergestellt, um ein gelbliches Pulver in einer Ausbeute von 80% zu gewinnen. Rf = 0,77 und 0,67 (EtOAc, Diastereomere). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 9,38 (s(br.), 1H, NH), 8,76 und 8,18 (2d, 2H, H-C(2), H-C(8)), 7,87 (dd, 1H, arom. H), 7,53 (m, 3H, 1 arom. H, 2 arom. H (Tac)), 7,40 (m, 3 × arom. H), 7,32 (m, 2 × arom. H), 6,95 (m, 2 × arom. H (Tac)), 6,47 (m, 1H, H-C(1')), 4,79 (s, 2H, CH2(Tac)), 4,68 (m, 1H, H-C(3')), 4,33 (m, 5H, 2 × α-CH, 2 × H-C(5'), H-C(4')), 3,89–3,52 (m, 5H, O-CH2CH2, β-CH, 2 × CH (isopropyl)), 2,84 (m, 1H, H-C(2')), 2,63 (m, 3H, CH2CN, H-C(2')), 1,42 (d, 3H, CH3), 1,27 (s, 9H, 3 × CH3 (tert-butyl)), 1,15 (m, 12H, 4 × CH3 (isopropyl)). 31P-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 146,70, 146,65 und 146,56 (3 × s, Diastereomere).

Beispiel 33. Herstellung von 5'-O-[2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin-3'-O-(β-cyanoethyl, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Herstellung nach der in Beispiel 30 beschriebenen allgemeinen Methode; erhalten wurde ein farbloses Pulver in einer Ausbeute von 86%. Rf = 0,83 und 0,77 (EtOAc/Hexan 9:1, Diastereomere). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) δ 8,29 (s, 1H, arom. H 4tBuOOCNPPOC), 8,14 (m, 2H, arom. H 4tBuOOCNPPOC, NH), 7,51 (d, 1H, arom. H 4tBuOOCNPPOC), 7,27 (dd, 1H, H-C(6)), 6,30 (m, 1H, H-C(1')), 4,50–4,17 (m, 6H, H-C(3'), 2 × H-C(5'), 2 × α-CH 4tBuOOCNPPOC, H-C(4')), 3,84–3,52 (m, 5H, α-CH2 CE, β-CH 4tBuOOCNPPOC, 2 × CH iPr), 2,61 (m, 2H, β-CH2 CE), 2,43 (m, 1H, H-C(2')), 2,15 (m, 1H, H-C(2')), 1,85, 1,80, 1,79 + 1,78 (4 × s, 3H, CH3 thy), 1,58 (s, 9H, 3 × CH3 COOtBu), 1,36 (dd, 3H, β-CH34tBuOOCNPPOC), 1,18, 1,17, 1,15 u. 1,14 (4 × s, 12H, 4 × CH3 iPr). 31P-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 148,66, 148,53 + 148,44.

Beispiel 34. Herstellung von 3'-O-[2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin-5'-O-(β-cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Bis(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphan (121 mg) wurde einer Lösung von 3'-O-[2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin (140 mg) und DCI (16 mg) in Dichlormethan (3 mL) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt, anschließend mit Dichlormethan (30 mL) verdünnt und mit einer gesättigten wässrigen Lösung von NaHCO3 (15 mL) gewaschen. Die organische Phase wurde getrennt, über Na2SO4 getrocknet und in vacuo konzentriert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (2 mL) gelöst und in n-Hexan (50 mL) gegossen, um das Produkt auszufällen. Der Niederschlag wurde getrennt, in einer kleinen Menge Dichlormethan gelöst und durch Chromatographie gereinigt (5,5 g Kieselgel, 12 × 0,8 cm, Gradient: n-Hexan/Aceton 4:1 zu 1:1). Das Produkt wurde in einer Ausbeute von 51,6% (100 mg) als farbloser Schaum erhalten. Rf = 0,32 (Hexan/Aceton 7:5). 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11,37 (s, 1H, NH); 7,95–7,43 (m, 9H, arom. H + H-C(6)); 6,13–6,05 (m, 1H, H-C(1')); 5,10–5,04 (m, 1H, H-C(3')); 4,43–4,41 (m, 2H, H-C(5')); 4,12–4,05 (m, 1H, H-C(4')); 3,78–3,29 (m, 9H, 3 × O-CH2, H-C-CH3, β-CH isopropyl); 2,77–2,72 (m, 2H, CNCH2); 2,27 (m, 2H, H-C(2')); 1,77 (s, 1H, CH3-Thy); 1,35 (d, 3H, CH3); 1,14–1,04 (m, 12H, CH3 isopropyl). 31P-NMR (400 MHz, DMSO): δ 151,66.

Beispiel 35. Herstellung von N6-Benzoyl-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxyadenosin-3'-O-(β-cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Bis(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphan (8,50 g, 28 mmol) wurde einer Lösung von N6-Benzoyl-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxyadenosin (12,50 g, 19 mmol) und DCI (1,11 g, 9 mmol) in Dichlormethan (130 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, dann mit Hexan (120 mL) verdünnt und durch ein Kieselgelbett in einer Säule (42 g Kieselgel, Durchmesser 3 cm) filtriert. Die Säule wurde mit einem Gradienten von Hexan/Ethylacetat (1:1, v/v) zu Ethylacetat eluiert. Die Produktfraktionen wurden in vacuo auf ein Volumen von ca. 200 mL konzentriert und dann langsam bei kräftigem Rühren in Hexan (1,5 L) gegossen, um das Produkt auszufällen. Der Niederschlag wurde getrennt, in einer kleinen Menge Ethylacetat gelöst und ein zweites Mal in der gleichen Weise ausgefällt. Der Niederschlag wurde wieder getrennt, in Dichlormethan gelöst und in vacuo konzentriert, um das Produkt in einer Ausbeute von 88% (14,45 g) als farblosen Schaum zu erhalten. 31P-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 148,88, 148,78.

Beispiel 36. Herstellung von N4-Acetyl-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxyoxycarbonyl]-2'-desoxycytidin-3'-O-(β-cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Bis(diisopropylamino)-β-cyanoethoxyphosphan (7,69 g, 26 mmol) wurde einer Lösung von N4-Acetyl-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxycytidin (9,89 g, 17 mmol) und DCI (1,00 g, 9 mmol) in Dichlormethan (100 mL) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, dann mit Hexan (120 mL) verdünnt und durch ein Kieselgelbett in einer Säule (43 g Kieselgel, Durchmesser 3 cm) filtriert. Die Säule wurde mit einem Gradienten von Hexan/Ethylacetat (1:1, v/v) zu Ethylacetat eluiert. Die Produktfraktionen wurden in vacuo auf ein Volumen von ca. 100 mL konzentriert und dann langsam bei kräftigem Rühren in Hexan (1,5 L) gegossen, um das Produkt auszufällen. Der Niederschlag wurde getrennt, in einer kleinen Menge Ethylacetat gelöst und ein zweites Mal in der gleichen Weise ausgefällt. Der Niederschlag wurde wieder getrennt, in Dichlormethan gelöst und in vacuo konzentriert, um das Produkt in einer Ausbeute von 88% (11,69 g) als farblosen Schaum zu erhalten. 31P-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 149,00.

Beispiel 37. Untersuchungen der Entschützung in Lösung

Die in Lösung zu photolysierenden Verbindungen wurden entweder in 1:1- (v/v) oder 95:5-Mischungen (v/v) von Methanol/Wasser bzw. Acetonitril/Wasser bei Konzentrationen von 0,1 bis 0,3 mM gelöst. Wegen ihrer geringeren Löslichkeit wurden alle Guanosin-Derivate in 3:2- (v/v) statt 1:1-Mischungen (v/v) von Methanol oder Acetonitril in Wasser gelöst. Die Lösungen wurden in einer Quarzküvette mit 10 mm Weglänge von einer Superhochdruck-Quecksilberlampe (Osram Sylvania Inc., Danvers, MA, USA) als Lichtquelle (200 W) mit Lichtbündelung bestrahlt, die mit einem Polarisationsfilter, einem UV-Filter (für ein schmales Spektralband bei der gewünschten Wellenlänge von 365 nm) und einem elektronischen Verschluss ausgestattet war, um genaue Belichtungszeiten zu gewährleisten. Die Lösungen wurden während der Messungen auf 17°C eingestellt und mit einem Magnetrührer gemischt. Bei jeder Beleuchtungsdauer wurde ein aliquoter Teil von 3 mL verwendet und danach durch Umkehrphasen-HPLC (20 bis 100% CH3CN für 30 Minuten, photometrische Erfassung bei 260 nm) analysiert. Die primären Photolyse-Produkte wurden durch Koinjektion authentischer Standards identifiziert; nach der Photolyse wurde das Verschwinden des Ausgangsmaterials überwacht, und die Halbwertszeiten wurden mittels linearer Regressionsanalyse durch Aufzeichnen der Flächenwerte der Peaks im Vergleich zur Zeit berechnet. Die Ergebnisse für einige Nukleoside, die verschiedene photolabile Schutzgruppen tragen, sind in den Tabellen 1, 2 und 3 dargestellt.

Beispiel 38. Untersuchungen der Entschützung in trockenem Zustand

Die in trockenem Zustand zu photolysierenden Verbindungen wurden zuerst in einem geeigneten Lösemittel gelöst, um 1-mM-Lösungen zu erhalten. 5 μL jeder Lösung wurden auf eine Polystyrol-Oberfläche aufpipettiert; das Lösemittel wurde dann entfernt. Die getrockneten Verbindungen wurden direkt bestrahlt, wobei die Einrichtung wie die in Beispiel 37 beschriebene eingestellt war, allerdings mit einer 100-W-Hochdruck-Quecksilberlampe (Osram Sylvania Inc., Danvers, MA, USA) und ohne Polarisationsfilter. Die Proben jeder Verbindung wurden über verschiedene Zeiträume beleuchtet, und die resultierenden Mengen des Edukts und der entblockierten Nukleoside wurden durch HPLC bestimmt (wie in Beispiel 37 beschrieben). Die Ergebnisse mehrerer verschiedenartig geschützter Desoxythymidine sind in 2, die die Rate der photolytischen Zersetzung der geschützten Desoxythymidine zeigt, und in 3 dargestellt, die die Bildungsrate der Desoxythymidine zeigt.

Beispiel 39. Silanisierung, von Glasträgern

Erie-Gold-Seal-Mikroskop-Objekträger (Fisher, Hanover Park, IL, USA), die in den ungeradzahligen Schlitzen eines Objektträgergestells aus Edelstahl angeordnet waren, wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer wässrigen Natriumhydroxid-Lösung (10%, w/v) inkubiert. Die Glasträger wurden dann in zwei Schalen voll entsalzten Wassers gespült (2,5 Minuten in jedem Bad) und danach in eine wässrige Bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan-Lösung (2%, v/v) (United Chemical Technologies, Bristol, PA, USA) gebracht, 1 Stunde geschüttelt, nach dem Silanbeschichten 5 Minuten in 95%-igem Ethanol gespült, dann sofort in Ether eingetaucht und an der Luft getrocknet. Sobald die Objektträger ganz trocken waren, wurden sie 15 Minuten bei 100°C thermisch behandelt und unmittelbar danach in trockener Atmosphäre bei –20°C gelagert.

Beispiel 40. On-Chip-Untersuchungen der Entschützung in Lösung

Maßgeschneiderte Arrays dienten dazu, die Entschützungsraten bei den Schutzgruppen der Erfindung im Vergleich mit denen der dem Stand der Technik entsprechenden photolabilen Schutzgruppen MeNPOC und NPPOC zu untersuchen, und zwar mit und ohne Zusatz eines Sensibilisators zum bestrahlten Lösemittel. Die Arrays wurden wie in Beispiel 40 beschrieben mit einem einzigen Zyklus der DNA-Synthese für den silanisierten Glasträger hergestellt; dann wurden definierte Bereiche mit verschiedenen Bestrahlungsdosen beleuchtet. Cy3-Amidit (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) wurde an den Array gekuppelt, um ein relatives Maß freier Hydroxylgruppen zu erhalten. Der Array wurde anschließend entfernt und 2 Stunden in einer Entschützungslösung – Ethylendiamin/Ethanol (1:1, v/v) – platziert. Die Arrays wurden dann an einem Axon 4000B (Axon Instruments, Union City, CA, USA) gescannt.

Beispiel 41. On-Chip-Untersuchungen der Entschützung in trockenem Zustand

Diese Versuche wurden wie in Beispiel 41 beschrieben durchgeführt, außer dass vor der Bestrahlung während des Entschützungsschritts alles Lösemittel aus der Fließzelle entfernt und der Träger mit einem Argonstrom getrocknet wurde.

Beispiel 42. Array-Synthese

Standard-DNA-Synthese-Reagenzien (Glen Research, Sterling, VA, USA, und Proligo, Boulder, CO, USA) wurden an Expedite-DANN-Synthesizern (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) verwendet. Die NPPOC-geschützten Phosphoramidite 5'-NPPOC-desoxyadenosin-[N6-Tab]-β-cyanoethoxy-phosphoramidit, 5'-NPPOC-desoxycytidin-[N4-isobutyryl]-β-cyanoethocy-phosphoramidit, 5'-NPPOC-desoxyguanosin-[N2-Ipac]-β-cyanoethoxy-phosphoramidit und 5'-NPPOC-desoxythymidin-β-cyanoethoxyphosphoramidit stammten von Proligo, während die die Schutzgruppen der Erfindung umfassenden Phosphoramidite wie oben beschrieben synthetisiert wurden. Das MAS-Gerät (NimbleGen Systems, Madison, WI, USA) wurde über eine den Träger enthaltende Fließzelle mit dem Expedite-Gerät verbunden, um die maßgeschneiderten Arrays herzustellen. Die Arrays wurden mit JazzSuite-Software (NimbleGen Systems) entworfen. Nachdem die Synthese am MAS vollendet war, wurden die basengeschützten Gruppen 2 Stunden in einer Lösung von Ethylendiamin/Ethanol (1:1 v/v; Aldrich) entfernt. Die Arrays wurden mit Wasser gespült, getrocknet und bis zu ihrer Verwendung trocken gelagert. Tabelle 1. Photolyse-Halbwertszeiten von 5'-NPPOC-geschützten Desoxynukleosiden im Vergleich zur bekannten NPPOC-Gruppe, gemessen in wässrigen methanolischen Lösungen (in Beispiel 37 beschrieben).Tabelle 2. Photolyse-Halbwertszeiten von 5'-NPPOC-geschützten Desoxynuldeosiden im Vergleich zur bekannten NPPOC-Gruppe, gemessen in wässrigen Acetonitril-Lösungen (in Beispiel 37 beschrieben).Tabelle 3. Photolyse-Halbwertszeiten von 5'-Bz-NPPOC-geschützten Desoxynukleosiden im Vergleich zur jeweiligen Halbwertszeit von NPPOC-dT (26), gemessen in wässrigen Methanol- bzw. Acetonitril-Lösungen (in Beispiel 37 beschrieben).

EintragVerbindungLösemittelt1/2 (Sekunden)15'-Bz-NPPOC-dT (28)Methanol mit 5% H2O1,9Acetonitril mit 5% H2O1,825'-Bz-NPPOC-dA(bz) (29)Methanol mit 5% H2O2,4Acetonitril mit 5% H2O1,935'-Bz-NPPOC-dC(ac) (30)Methanol mit 5% H2O1,8Acetonitril mit 5% H2O1,545'-(2-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (31)Methanol mit 5% H2O1,9Acetonitril mit 5% H2O1,755'-(3-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (32)Methanol mit 5% H2O1,6Acetonitril mit 5% H2O1,965'-(4-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (33)Methanol mit 5% H2O1,6Acetonitril mit 5% H2O2,075'-NPPOC-dT (26)Methanol mit 5% H2O5,0
Tabelle 4. Photolyse-Halbwertszeiten von 5'-Bz-NPPOC-geschützten Desoxynuldeosiden im Vergleich zur jeweiligen Halbwertszeit von NPPOC-dT (26), gemessen unter trockenen Bedingungen (in Beispiel 38 beschrieben).EintragVerbindungt1/2 (Sekunden)15'-Bz-NPPOC-dT (28)6,025'-Bz-NPPOC-dA(bz) (29)6,035'-Bz-NPPOC-dC(ac) (30)6,045'-(2-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (31)6,055'-(3-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (32)6,065'-(4-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (33)7,875'-NPPOC-dT (26)14,0
Tabelle 5. Mittlere Zyklusausbeuten bei trägergebundenen dT12-Arrays, die wie in Beispiel 40 beschrieben anhand des Protokolls für trockene Entschützung (in Beispiel 42 beschrieben) hergestellt wurden.5'-SchutzgruppeBestrahlungszeit (Sekunden)Mittlere Zyklusausbeute (%)Bz-NPPOC18863590NPPOC6581MeNPOC5886

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Es zeigen:

1A–C: HPLC-Chromatogramme, die die Photolyse von 5'-tBuC-NPPOC-desoxythymidin (25) in Methanol/Wasser (1:1, v/v) bei Bestrahlung bei 365 nm (in Beispiel 37 beschrieben) nach 0 Sekunden (1A), 60 Sekunden (1B) und 600 Sekunden (1C) analysieren;

2: die Zeitabhängigkeit der photolytischen Zersetzung von Desoxythymidinen, die durch photosensitive Schutzgruppen der Erfindung bzw. des Stands der Technik geschützt sind, von der Bestrahlung bei 365 nm unter trockenen Bedingungen, wobei wie in Beispiel 38 beschrieben gemessen wurde;

3: die Zeitabhängigkeit der photolytischen Freisetzung von Desoxythymidin bei den photosensitiv-geschützten Desoxythymidinen der Erfindung bzw. des Stands der Technik von der Bestrahlung bei 365 nm unter trockenen Bedingungen, womit ein weiterer Aspekt des gleichen Versuchs berücksichtigt wird, der in 2 analysiert und nach Beispiel 38 durchgeführt wurde;

4: die Abhängigkeit der photolytischen Freisetzung von Desoxythymidin in Lösung bei trägergebundenen Desoxythymidinen, die durch photosensitive Schutzgruppen der Erfindung bzw. des Stands der Technik geschützt sind, von der Bestrahlungsenergie, die linear mit der Bestrahlungszeit in Bezug steht, wobei wie in Beispiel 40 beschrieben gemessen wurde; und

5: die Abhängigkeit der photolytischen Freisetzung von Desoxythymidin unter trockenen Bedingungen bei trägergebundenen Desoxythymidinen, die durch photosensitive Schutzgruppen der Erfindung bzw. des Stands der Technik geschützt sind, von der Bestrahlungsenergie, die linear mit der Bestrahlungszeit in Bezug steht, wobei wie in Beispiel 41 beschrieben gemessen wurde.