Title:
Neuartige photolabile Schutzgruppen für verbesserte Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotid-Arrays
Kind Code:
B4
Abstract:

Verwendung einer Verbindung mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgewählt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgewählt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgewählt wird; ...



Inventors:
Bühler, Sigrid (84478, Waldkraiburg, DE)
Ott, Markus (84559, Kraiburg, DE)
Pfleiderer, Wolfgang (78464, Konstanz, DE)
Application Number:
DE112004000265T
Publication Date:
11/13/2014
Filing Date:
02/19/2004
Assignee:
Nigu Chemie GmbH, 84478 (DE)
Other References:
Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996), 4(10): 1649-1658
Tetrahedron (1992), 48(20), 4171-4182
Tetrahedron (1997), 53(12):4247-4264
Claims:
1. Verwendung einer Verbindung mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
R9 aus der Gruppe bestehend aus H oder ausgew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgew?hlt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst,
in einem Verfahren mit lichtgesteuerter Synthese von Oligonukleotiden.

2. Verwendung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel (2): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H ist; oder
R1 H ist unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgew?hlt wird, die die photolabile Schutzgruppe oder ein Desoxyribonukleosid oder ein Ribonukleosid umfasst, die durch eine der folgenden Formeln (3) oder (4) repr?sentiert werden: wobei
R5 aus der Gruppe bestehend aus einem H, einem Oligonukleotid oder einer funktionellen Gruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist;
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist;
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgew?hlt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus eine Schutzgruppe tragen k?nnen, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; oder
Z aus der Gruppe bestehend aus einem chemisch modifizierten Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid oder einem Analogon davon ausgew?hlt wird, verwendet wird.

3. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Y eine Alkylgruppe ist, die aus der Gruppe bestehend aus Methyl oder tert-Butyl ausgew?hlt wird, und R2 H ist.

4. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R1 gleich H ist und R2 ein optional substituiertes Phenyl ist.

5. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R1 gleich H ist und R2 ein optional substituiertes Benzoyl ist.

6. Verwendung nach einem der Anspr?che 2 bis 5, wobei W gleich O ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-, Alkenyl-, Acetal- oder Silylether-Schutzgruppe ausgew?hlt wird.

7. Verwendung nach einem der Anspr?che 2 bis 5, wobei W gleich S ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-Schutzgruppe ausgew?hlt wird.

8. Verwendung nach einem der Anspr?che 2 bis 6, wobei R6 aus der Gruppe bestehend aus einem O-Methyl, O-Ethyl, O-Allyl, O-Tetrahydropyranyl, O-Methoxytetrahydropyranyl oder einem O-t-Butyldimethylsilyl ausgew?hlt wird.

9. Verwendung nach einem der Anspr?che 2 bis 8, wobei B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin oder Guanin ausgew?hlt wird und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Phenoxyacetyl, 4-tert-Butylphenoxyacetyl, 4-Isopropylphenoxyacetyl oder Dimethylformamidino ausgew?hlt wird.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei B Adenin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl oder p-Nitrophenyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird.

11. Verwendung nach Anspruch 9, wobei B Guanin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird.

12. Verwendung nach Anspruch 9, wobei B Cytosin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, t-Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird.

13. Verwendung nach einem der Anspr?che 2 bis 12, wobei R5 eine Phosphitamid oder eine intermedi?re OH-Schutz- oder eine Dimethoxytrityl- oder eine Monomethoxytrityl- oder eine Silylgruppe ist.

14. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 bis 5, wobei Z aus einer Abgangsgruppe ausgew?hlt wird.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Abgangsgruppe aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Imidazolyl oder Nitrophenoxyl ausgew?hlt wird.

16. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 bis 15, wobei die lichtgesteuerte Oligonukleotid-Synthese an einem festen Tr?ger erfolgt.

17. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 bis 16,
wobei die lichtgesteuerte Oligonukleotid-Synthese folgende Schritte umfasst:
a) Anlagern eines Nukleosids oder Nudleotids nach Formel 2 das die photolabile Schutzgruppe an seiner prim?ren Hydroxylgruppe umfasst, als ersten Baustein ?ber seine sekund?re Hydroxylgruppe an einem Tr?ger;
b) Bestrahlen des aus Schritt a) resultierenden tr?gergebundenen Nukleosids oder Nukleotids, so dass die Schutzgruppe an der prim?ren Hydroxylgruppe entfernt wird, wodurch die prim?re Hydroxylgruppe entsch?tzt wird;
c) Reagieren des aus Schritt b) resultierenden tr?gergebundenen Nukleotids in Gegenwart eines Aktivators mit einem aus Anspruch 12 ausgew?hlten zweiten Nukleotid, das eine Schutzgruppe an seiner prim?ren Hydroxylgruppe und eine funktionelle Phosphoramidit-Gruppe an seiner sekund?ren Hydroxylgruppe umfasst, um eine internukleosidische Phosphor-Verbindung zu bilden;
d) optionales Capping von unreagierten prim?ren Hydroxylgruppen mit einer inerten Alkohol-Schutzgruppe;
e) Oxidieren der internukleosidischen Phosphor-Verbindung zum nat?rlich vorkommenden f?nfwertigen Zustand;
f) Wiederholen der Schritte b) bis d), w?hrend nacheinander die Phsphoramidit-Bausteine in einer vorbestimmten Reihenfolge angebracht werden, bis der gew?nschte Oligonukleotidstrang vollst?ndig ist; und
g) Entfernen aller Nukleobase- und Phosphat-Schutzgruppen.

18. Verwendung nach einem der Anspr?che 1 bis 17,
wobei die lichtgesteuerte Oligonukleotid-Synthese folgende Schritte umfasst:
a) Anlagern eines Nukleosids oder Nudleotids nach Formel 2 das die photolabile Schutzgruppe an seiner prim?ren Hydroxylgruppe umfasst, als ersten Baustein ?ber seine sekund?re Hydroxylgruppe an einem Tr?ger;
b) Bestrahlen des aus Schritt a) resultierenden tr?gergebundenen Nukleosids oder Nukleotids, so dass die Schutzgruppe an der prim?ren Hydroxylgruppe entfernt wird, wodurch die prim?re Hydroxylgruppe entsch?tzt wird;
c) Reagieren des aus Schritt b) resultierenden tr?gergebundenen Nukleotids in Gegenwart eines Aktivators mit einem aus Anspruch 12 ausgew?hlten zweiten Nukleotid, das eine Schutzgruppe an seiner sekund?ren Hydroxylgruppe und eine funktionelle Phosphoramidit-Gruppe an seiner prim?ren Hydroxylgruppe umfasst, um eine internukleosidische Phosphor-Verbindung zu bilden;
d) optionales Capping von unreagierten sekund?ren Hydroxylgruppen mit einer inerten Alkohol-Schutzgruppe;
e) Oxidieren der internukleosidischen Phosphor-Verbindung zum nat?rlich vorkommenden f?nfwertigen Zustand;
f) Wiederholen der Schritte b) bis d), w?hrend nacheinander die Phsphoramidit-Bausteine in einer vorbestimmten Reihenfolge angebracht werden, bis der gew?nschte Oligonukleotidstrang vollst?ndig ist; und
g) Entfernen aller Nukleobase- und Phosphat-Schutzgruppen.

19. Verbindung mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
R9 aus der Gruppe bestehend aus H oder gew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgew?hlt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst.

20. Verbindung nach Anspruch 19,
mit der folgenden allgemeinen Formel (2): wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgew?hlt wird, die die photolabile Schutzgruppe oder ein Desoxyribonukleosid oder ein Ribonukleosid umfasst, die durch eine der folgenden Formeln (3) oder (4) repr?sentiert werden: wobei
R5 aus der Gruppe bestehend aus einem H, einem Oligonukleotid oder einer funktionellen Gruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist;
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist;
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgew?hlt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus eine Schutzgruppe tragen k?nnen, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; oder
Z aus der Gruppe bestehend aus einem chemisch modifizierten Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid oder einem Analogon davon ausgew?hlt wird.

21. Verbindung nach Anspruch 19 bis 20, wobei R1 gleich H ist und R2 ein optional substituiertes Phenyl ist.

22. Verbindung nach Anspruch 19 bis 20, wobei R1 gleich H ist und R2 ein optional substituiertes Benzoyl ist.

23. Verbindung nach Anspruch 20 bis 22, wobei W gleich O ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-, Alkenyl-, Acetal- oder Silylether-Schutzgruppe ausgew?hlt wird.

24. Verbindung nach Anspruch 20 bis 22, wobei W gleich S ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-Schutzgruppe ausgew?hlt wird.

25. Verbindung nach Anspruch 20 bis 24, wobei R8 aus der Gruppe bestehend aus einem O-Methyl, O-Ethyl, O-Allyl, O-Tetrahydropyranyl, O-Methoxytetrahydropyranyl oder einem O-t-Butyldimethylsilyl ausgew?hlt wird.

26. Verbindung nach Anspruch 20 bis 25, wobei B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin oder Guanin ausgew?hlt wird und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Phenoxyacetyl, 4-tert-Butylphenoxyacetyl, 4-Isopropylphenoxyacetyl oder Dimethylformamidino ausgew?hlt wird.

27. Verbindung nach Anspruch 26, wobei B Adenin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl oder p-Nitrophenyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird.

28. Verbindung nach Anspruch 26, wobei B Guanin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird.

29. Verbindung nach Anspruch 26, wobei B Cytosin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, t-Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird.

30. Verbindung nach Anspruch 20 bis 29, wobei R5 eine Phosphitamid oder eine intermedi?re OH-Schutz- oder eine Dimethoxytrityl- oder einer Monomethoxytrityl- oder eine Silylgruppe ist.

31. Verbindung nach Anspruch 19 bis 22, wobei Z aus einer Abgangsgruppe ausgew?hlt wird.

32. Verbindung nach Anspruch 31, wobei die Abgangsgruppe aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Imidazolyl oder Nitrophenoxyl ausgew?hlt wird.

33. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 19 bis 32,
wobei R9 ? H, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Alkohol der allgemeinen Formel (1), wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
R9 H ist;
als ein Reagenz verwendet wird.

34. Verfahren nach Anspruch 33,
wobei ein Alkohol der allgemeinen Formel (1), wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
R9 H ist;
mit einer eine Hydroxyl- oder Aminofunktion tragenden Verbindung zur Reaktion gebracht wird, umfassend zumindest die Schritte zum
a) Aktivieren entweder des Alkohols der Formel (1) oder der die Hydroxylfunktion tragenden Verbindung durch Umwandlung der Hydroxylfunktion in einen aktivierten Carbonatester, Thiocarbonatester oder ein Sulfonat; und
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonatesters oder Thiocarbonatesters oder Sulfonats mit der nicht aktivierten Verbindung.

35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34,
umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Alkohols mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
R9 H ist;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung, um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen; und
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonatesters oder Thiocarbonatesters mit einer Verbindung, die ein prim?res Amin, ein sekund?res Amin oder eine Hydroxylgruppe aufweist.

36. Verfahren nach Anspruch 35,
wobei der aktivierte Carbonatester oder Thiocarbonatester die allgemeine Formel (2) hat: wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einem Halogen, Imidazolyl, Nitrophenoxyl, (Thio)carbonat und (Thio)carbamat ausgew?hlt wird.

37. Verfahren nach Anspruch 33 bis 36,
zur Herstellung eines derivatisierten Nukleosids oder Nukleosid-Analogons davon, umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Alkohols mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
R9 H ist;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung, um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen;
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonat- oder Thiocarbonatesters mit einem Nukleosid, das ausgew?hlt wird aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel (5): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; und
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosind, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgew?hlt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus optional eine Schutzgruppe tragen k?nnen, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; oder mit einem nukleosidischen Derivat oder Analogon, das eine ungesch?tzte prim?re Hydroxylfunktion umfasst;
oder mit einem Nukleosid, das ausgew?hlt wird aus der Gruppe von Verbindungen mit der allgemeinen Formel (6): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; und
R7 aus einer intermedi?ren Schutzgruppe oder aus der Gruppe von nukleosidischen und nukleotidischen Derivaten einschlie?lich Analoga davon ausgew?hlt wird, die ein intermedi?r gesch?tztes prim?res Hydroxyl umfassen;
c) optionalen Entfernen der intermedi?ren Schutzgruppe und Reinigen des Produkts; und
d) optionalen Reagieren des Produkts von Schritt b) oder c) mit einem Phosphitylierungs-Reagenz, um nach der Reinigung ein Phosphoramidit zu bilden.

38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Phosphitylierungs-Reagenz Bis(diisopropylamino)-?-cyanoethoxyphosphan ist.

39. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34,
zur Herstellung eines derivatisierten Nukleosids oder Nukleosid-Analogons davon, umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Nukleosids, das ausgew?hlt wird aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel (5): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; und
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosind, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgew?hlt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus optional eine Schutzgruppe tragen k?nnen, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; oder Reagieren eines nukleosidischen Derivats oder Analogons, das eine ungesch?tzte prim?re Hydroxylfunktion umfasst;
oder Reagieren eines Nukleosids, das ausgew?hlt wird aus der Gruppe von Verbindungen mit der allgemeinen Formel (6): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Okigonukleotid-Synthese n?tzlich ist; und
R7 aus einer intermedi?ren Schutzgruppe oder aus der Gruppe von nukleosidischen und nukleotidischen Derivaten einschlie?lich Analoga davon ausgew?hlt wird, die ein intermedi?r gesch?tztes prim?res Hydroxyl umfassen; oder Reagieren eines nukleosidischen Derivats oder Analogons, das eine ungesch?tzte sekund?re Hydroxylfunktion umfasst;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen;
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonat- oder Thiocarbonatesters mit einem Alkohol der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
R9 H ist;
c) optionalen Entfernen der intermedi?ren Schutzgruppe und Reinigen des Produkts; und
d) Reagieren des Produkts von Schritt b) oder c) mit einem Phosphitylierungs-Reagenz, um nach der Reinigung ein Phosphoramidit zu bilden.

40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei das Phosphatylierungs-Reagenz Bis(diisopropylamino)-?-cyanoethxyphosphan ist.

41. Verbindung mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
R9 aus der Gruppe bestehend aus H oder gew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgew?hlt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst.

42. Verbindung nach Anspruch 41,
mit der folgenden allgemeinen Formel (2): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H ist;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgew?hlt wird, die die photolabile Schutzgruppe oder ein Desoxyribonukleosid oder ein Ribonukleosid umfasst, die durch eine der folgenden Formeln (3) oder (4) repr?sentiert werden: wobei
R5 aus der Gruppe bestehend aus einem H, einem Oligonukleotid oder einer funktionellen Gruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist;
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist;
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgew?hlt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus eine Schutzgruppe tragen k?nnen, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; oder
Z aus der Gruppe bestehend aus einem chemisch modifizierten Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid oder einem Analogon davon ausgew?hlt wird.

43. Verbindung nach Anspruch 41 oder 42, wobei Y eine Alkylgruppe ist, die aus der Gruppe bestehend aus Methyl oder tert-Butyl ausgew?hlt wird, und R2 H ist.

44. Verbindung nach Anspruch 42 bis 43, wobei W gleich O ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-, Alkenyl-, Acetal- oder Silylether-Schutzgruppe ausgew?hlt wird.

45. Verbindung nach Anspruch 42 bis 43, wobei W gleich S ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-Schutzgruppe ausgew?hlt wird.

46. Verbindung nach Anspruch 42 bis 45, wobei R6 aus der Gruppe bestehend aus einem O-Methyl, O-Ethyl, O-Allyl, O-Tetrahydropyranyl, O-Methoxytetrahydropyranyl oder einem O-t-Butyldimethylsilyl ausgew?hlt wird.

47. Verbindung nach Anspruch 42 bis 46, wobei B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin oder Guanin ausgew?hlt wird und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Phenoxyacetyl, 4-tert-Butylphenoxyacetyl, 4-Isopropylphenoxyacetyl oder Dimethylformamidino ausgew?hlt wird.

48. Verbindung nach Anspruch 47, wobei B Adenin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl oder p-Nitrophenyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird.

49. Verbindung nach Anspruch 47, wobei B Guanin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird.

50. Verbindung nach Anspruch 47, wobei B Cytosin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, t-Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird.

51. Verbindung nach Anspruch 42 bis 50, wobei R5 eine Phosphitamid oder eine intermedi?re OH-Schutz- oder eine Dimethoxytrityl- oder einer Monomethoxytrityl- oder eine Silylgruppe ist.

52. Verbindung nach Anspruch 41 bis 43, wobei Z aus einer Abgangsgruppe ausgew?hlt wird.

53. Verbindung nach Anspruch 52, wobei die Abgangsgruppe aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Imidazolyl oder Nitrophenoxyl ausgew?hlt wird.

54. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 41 bis 53, wobei R9 ? H, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Alkohol der allgemeinen Formel (1), wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
R9 H ist;
als ein Reagenz verwendet wird.

55. Verfahren nach Anspruch 54,
wobei ein Alkohol der allgemeinen Formel (1), wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
R9 H ist,
mit einer eine Hydroxyl- oder Aminofunktion tragenden Verbindung zur Reaktion gebracht wird, umfassend zumindest die Schritte zum
a) Aktivieren entweder des Alkohols der Formel (1) oder der die Hydroxylfunktion tragenden Verbindung durch Umwandlung der Hydroxylfunktion in einen aktivierten Carbonatester, Thiocarbonatester oder ein Sulfonat; und
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonatesters oder Thiocarbonatesters oder Sulfonats mit der nicht aktivierten Verbindung.

56. Verfahren nach Anspruch 55 oder 54,
umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Alkohols mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
R9 H ist;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung, um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen; und
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonatesters oder Thiocarbonatesters mit einer Verbindung, die ein prim?res Amin, ein sekund?res Amin oder eine Hydroxylgruppe aufweist.

57. Verfahren nach Anspruch 56,
wobei der aktivierte Carbonatester oder Thiocarbonatester die allgemeine Formel (2) hat: wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einem Halogen, Imidazolyl, Nitrophenoxyl, (Thio)carbonat und (Thio)carbamat ausgew?hlt wird.

58. Verfahren nach Anspruch 54 bis 57
zur Herstellung eines derivatisierten Nukleosids oder Nukleosid-Analogons davon, umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Alkohols mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
R9 H ist;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung, um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen;
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonat- oder Thiocarbonatesters mit einem Nukleosid, das ausgew?hlt wird aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel (5): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; und
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgew?hlt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus optional eine Schutzgruppe tragen k?nnen, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist;
oder mit einem nukleosidischen Derivat oder Analogon, das eine ungesch?tzte prim?re Hydroxylfunktion umfasst;
oder mit einem Nukleosid, das ausgew?hlt wird aus der Gruppe von Verbindungen mit der allgemeinen Formel (6): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; und
R7 aus einer intermedi?ren Schutzgruppe oder aus der Gruppe von nukleosidischen und nukleotidischen Derivaten einschlie?lich Analoga davon ausgew?hlt wird, die ein intermedi?r gesch?tztes prim?res Hydroxyl umfassen;
c) optionalen Entfernen der intermedi?ren Schutzgruppe und Reinigen des Produkts; und
d) optionalen Reagieren des Produkts von Schritt b) oder c) mit einem Phosphitylierungs-Reagenz, um nach der Reinigung ein Phosphoramidit zu bilden.

59. Verfahren nach Anspruch 58, wobei das Phosphatylierungs-Reagenz Bis(diisopropylamino)-?-cyanoethxyphosphan ist.

60. Verfahren nach Anspruch 54 oder 55
zur Herstellung eines derivatisierten Nukleosids oder Nukleosid-Analogons davon, umfassend die Schritte zum:
a) Reagieren eines Nukleosids, das ausgew?hlt wird aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel (5): wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; und
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgew?hlt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus optional eine Schutzgruppe tragen k?nnen, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist;
oder Reagieren eines nukleosidischen Derivats oder Analogons, das eine ungesch?tzte prim?re Hydroxylfunktion umfasst;
oder Reagieren eines Nukleosids, das ausgew?hlt wird aus der Gruppe von Verbindungen mit der allgemeinen Formel (6): wobei
R8 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; und
R7 aus einer intermedi?ren Schutzgruppe oder aus der Gruppe von nukleosidischen und nukleotidischen Derivaten einschlie?lich Analoga davon ausgew?hlt wird, die eine intermedi?r gesch?tzte prim?re Hydroxylfunktion umfassen;
oder Reagieren eines nukleosidischen Derivats oder Analogons, das eine ungesch?tzte sekund?re Hydroxylfunktion umfasst;
mit Phosgen oder einem Derivat oder Ersatzstoff davon, oder mit der jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindung, um einen aktivierten Carbonatester oder Thiocarbonatester herzustellen;
b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonat- oder Thiocarbonatesters mit einem Alkohol mit der allgemeinen Formel (1): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
R9 H ist;
c) optionalen Entfernen der intermedi?ren Schutzgruppe und Reinigen des Produkts; und
d) Reagieren des Produkts von Schritt b) oder c) mit einem Phosphitylierungs-Reagenz, um nach der Reinigung ein Phosphoramidit zu bilden.

61. Verfahren nach Anspruch 58, wobei das Phosphatylierungs-Reagenz Bis(diisopropylamino)-?-cyanoethxyphosphan ist.

62. Methode zum Entfernen einer photolabilen Schutzgruppe mit der allgemeinen Formel: wobei die Methode den Schritt des Bestrahlens einer Verbindung umfasst, die die Schutzgruppe enth?lt und R1, R2, R3, R4 sowie X entsprechend Anspruch 1 definiert sind.

Description:
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft photolabile Verbindungen, Reagenzien f?r deren Herstellung und Verfahren f?r deren Verwendung als photospaltbare Schutzgruppen, insbesondere bei der Synthese von High-Density-Arrays von Oligonukleotiden an einem festen Tr?ger.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Synthetische Nukleins?ure-Microarrays haben bei Analysen von Nukleins?ure-Proben aus biologischen Quellen eine erhebliche Bedeutung erlangt. Sie sind leistungsf?hige Werkzeuge, die sich entsprechend den Anforderungen der biologischen und biomedizinischen Wissenschaften f?r die Analyse komplexer Mischungen von Nukleins?uren eignen. Zu den Anwendungen von Microarrays z?hlen die Forschung, deren Ziel das Verst?ndnis der Wechselbeziehung zwischen Gensequenzen und deren Funktion ist; die Analyse des Expressionsmusters verschiedener Organismen und Gewebe, die man bei der Entdeckung von Arzneimitteln verwenden kann; die Analyse der genetischen Variation zwischen Individuen, die bei der Entwicklung individueller Arzneimittel eingesetzt wird; und die Analyse von Mutationsmustern bei spezifischen Geweben, die bei der Krebsforschung und -diagnose von Nutzen ist. Eine weitere Anwendung ist der Einsatz von Microarrays zur Sequenzierung von Nukleins?uren durch Analyse des Hybridisierungsmusters, das aus einer speziellen Nukleins?ure-Sequenz an einem Array erhalten wurde. Da man alle Analysemethoden, die auf der Nukleins?ure-Hybridisierung basieren, mit Nukleins?ure-Microarrays durchf?hren kann, ergeben sich daraus zahlreiche andere wichtige Anwendungen der Microarrays, w?hrend au?erdem st?ndig neue Anwendungen entstehen.

Bei Anwendungen von Nukleins?ure-Microarrays dienen oberfl?chengebundene Oligonukleotide der Arrays (Sonden) dazu, Probensequenzen (Targets) durch komplement?re Erkennung (Hybridisierung) parallel zu analysieren. Bedingt durch die Komplexit?t der Nukleins?ure-Sequenzinformationen in biologischen Proben und den Wert der normalerweise kleinen biologischen Proben besteht ein steigender Bedarf an Microarrays mit miniaturisierten Features, die hochparallele Analysen solcher kleinen Proben erm?glichen. Dieser Bedarf wird am besten durch die lichtgesteuerte Synthese von Microarrays f?r die parallele In-situ-Assemblierung von Oligopeptiden und Oligonukleotiden an Tr?gern erf?llt, wie es urspr?nglich beispielsweise von Fodor et al. (1991), Science 251: 767?773; Pirrung et al., US-Patent Nr. 5,143,854; und Chee et al. (1996), Science 274: 610?614, beschrieben wurde. Wegen des schnellen Fortschritts bis heute erm?glicht dieser Ansatz den Aufbau von Feature-Gr??en mit 2,1 ? 10?4 ?m2 und m?glicherweise sogar noch kleiner, wie es von Singh-Gasson et al. (1999), Nature Biotech. 17: 974?978, beschrieben wurde. Im Gegensatz dazu kann man mit Microarrays, die durch Spotting von vorgefertigten Oligonukleotiden oder cDNA-Proben auf Oberfl?chen assembliert werden, Feature-Gr??en von ca. 75 ?m2 herstellen, wie es beispielsweise bei Bowtell und Sambrook (Herausgeber) in ?DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual?, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002), besprochen wurde. Wegen der leichten und flexiblen r?umlichen Adressierung von Reaktionsstellen auf dem Tr?ger ergibt sich ein weiterer Vorteil der lichtgesteuerten Array-Assemblierung daraus, dass sie parallel und automatisiert ablaufen kann.

Damit Microarrays breitere Verwendung finden, m?ssen sie zu annehmbaren Kosten erh?ltlich sein, wobei die Kosten f?r Microarrays unter anderem von verschiedenen Faktoren abh?ngen: dem Verbrauch von Reagenzien bei ihrer Herstellung, dem Grad der Automatisierung und dem Durchsatz der in der Produktionseinrichtung hergestellten Arrays. Da Microarrays aus der lichtgesteuerten Synthese sequenziell durch viele chemische Prozesse auf die Array-Oberfl?che aufgebracht werden, sind die einzelnen Schritte zur Erh?hung des Durchsatzes unter allen Umst?nden zu optimieren.

Lichtgesteuerte Synthesen von Microarrays sind haupts?chlich auf die ?blichen, hochoptimierten Anordnungen f?r die Synthese von Oligonukleotiden an festen Tr?gern unter Nutzung der Phosphoramidit-Chemie angewiesen, wie beispielsweise von Beaucage et al. (1992), Tetrahedron 48: 2223?2311), beschrieben, dessen gesamter Inhalt hier einbezogen wird. Sie umfassen die schrittweise Anlagerung von durch eine Phosphoramidit-Gruppe aktivierten Nukleosid-Synthonen in vorbestimmter Reihenfolge an ? je nach der Richtung der Kettenverl?ngerung ? die 5'-funktionelle Gruppe oder die 3'-funktionelle Gruppe des wachsenden Strangs, der an einen Tr?ger wie beispielsweise die Oberfl?che eines DNA-Chips gebunden ist. Jeder Elongationsschritt besteht im Allgemeinen aus einem Reaktionszyklus, der Folgendes umfasst: Entsch?tzen der 5'- oder 3'-Hydroxylgruppe des wachsenden Strangs; Kettenverl?ngerung durch Zusatz eines Nukleosid-Phosphoramidits und eines Aktivators; optionales Capping von unreagierten endst?ndigen Hydroxylgruppen; und Oxidation der neu gebildeten internukleosidischen Phosphorbindung in den f?nfwertigen Zustand. Arrays, die die in 5'- zu 3'-Richtung assemblierten Oligonukleotid-Sonden umfassen, eignen sich f?r Versuche, die auf die Hybridisierung angewiesen sind, und Versuche, bei denen Enzymreaktionen wie beispielsweise Elongation oder Ligation beteiligt sind, da die 3'-Enden ihrer Oligonukleotid-Sonden frei zug?nglich sind, wie es von Beier et al. (2001), Helv. Chim. Acta 84: 2089?2095, beschrieben wurde.

Da alle Reaktionen eines Kettenverl?ngerungszyklus bis auf den Schritt des Entsch?tzens im Grunde genommen gem?? den gut ausgearbeiteten herk?mmlichen Verfahren und mit erheblichem ?berschuss an Reagenzien durchgef?hrt werden, sind sie im Wesentlichen quantitativ. Bei der lichtgesteuerten Microarray-Assemblierung von Oligonukleotiden wird der Schritt des Entfernens der s?urelabilen Standard-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe (DMT) durch photochemisches Entfernen von lichtempfindlichen Schutzgruppen ersetzt, was eine einschr?nkende Reaktion in Bezug auf die Effizienz und Dauer des Kettenverl?ngerungszyklus ist. Bei der normalerweise verwendeten [(?-Methyl-2-nitropiperonyl)oxy]carbonyl-Schutzgruppe (MeNPOC) betr?gt die Ausbeute des photochemischen Entsch?tzens am Tr?ger bei der ?trockenen? Methode (d. h. ohne L?semittel) folglich nur ungef?hr 90%, woraus eine Zykluseffizienz von unter 90% resultiert, wie von Barone et al. (2001), Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 20: 525?531, und McGall et al. (1997), J. Am. Chem. Soc. 119: 5081?5090, beschrieben wurde, deren gesamter Inhalt hier einbezogen wird. Solche Umwandlungsraten sind relativ m??ig im Vergleich zu der Standardtechnologie mit Sch?tzen durch DMT und f?hren zur Bildung von Fehlsequenzen und zu abgebrochenen Oligonukleotid-Sonden, wobei die gew?nschten Sequenzen mit voller L?nge bei einem Array mit 20-mer-Sonden nur etwa 10% des Ganzen ausmachen.

Dar?ber hinaus m?ssen die Bestrahlungszeiten beim Entfernen der MeNPOC-Gruppe im trockenen Zustand ungef?hr 1 Minute oder l?nger dauern, wenn das Entsch?tzen in Gegenwart eines L?semittels durchgef?hrt wird. Bei jedem Elongationsschritt in der Synthese eines Oligonukleotid-Arrays sind vier den Kupplungsschritten entsprechende photolytische Schritte erforderlich, die anschlie?end mit jedem der vier nukleotidischen Synthone in vordefinierten Bereichen am Tr?ger erfolgen. Die Gesamtzeit, die f?r das Entsch?tzen ben?tigt wird, bel?uft sich auf 4 ? N Minuten f?r die Assemblierung eines Arrays von N-meren. Kurze Zeiten f?r das Entsch?tzen sind also sehr wichtig, um h?here Durchsatzraten bei der Array-Assemblierung zu erzielen.

Die Photospaltung von MeNPOC-gesch?tzen Nukleosiden l?uft unter trockenen Bedingungen oder in weniger polaren L?semitteln wie beispielsweise Toluol oder Dioxan am schnellsten ab. Ferner sind, wie oben er?rtert, die sich ergebenden Ausbeuten und die entsprechende Kupplungseffizienz bestenfalls m??ig. Dagegen ben?tigt die ebenfalls h?ufig einsetzte 2-(2-Nitrophenyl)-propoxycarbonyl-Gruppe (NPPOC) Bestrahlungszeiten, die im trockenen Zustand wesentlich l?nger dauern, aber in polaren L?sungen wie beispielsweise Mischungen von Wasser mit Acetonitril oder Methanol viel k?rzer sind, wie von Giegrich et al. (1998), Nucleosides & Nucleotides 17: 1987?1996, beschrieben wurde. Bei NPPOC-Nukleosiden wurden beim Entsch?tzen weiter verbesserte Raten durch Beer et al. (2000), Nucleic Acids Res. 28: e11, mittels Bestrahlung in Acetonitril erzielt, das eine geringe Menge einer Base wie beispielsweise DBU oder NMI enthielt. Dieses Verfahren bewirkt eine um 12% h?here Zykluseffizienz als die Anwendung von MeNPOC-gesch?tzten Phosphoramiditen in der trockenen Entsch?tzungsform.

Fr?he Berichte ?ber photospaltbare Schutzgruppen in der Nukleosid- und Nukleotid-Chemie bezogen sich auf die Ether und Carbonatester der ortho-Nitrobenzyl-Gruppe einschlie?lich deren Derivaten, wie von Pillai, in Organic Photochemistry, Ed. Padwa, Marcel Dekker, New York und Basel, 1987, Vol. 9, p. 225?323, sowie Walker et al. (1988), J. Am. Chem. Soc. 110: 7170?7177, beschrieben wurde. Man kann die MeNPOC-Schutzgruppe als eine moderne Variante in dieser Kategorie ansehen.

Es wurden auch Schutzgruppen des Pyrenylmethoxycarbonyl-Typs verwendet, wie es von McGall und Rava, Internationale Patentanmeldung Nr. WO 98/39348, beschrieben wurde. Die jeweiligen Nukleosid- und Nukleotid-Derivate der vorgenannten Schutzgruppen zeigen beim Entsch?tzen unbefriedigende Raten und Ausbeuten, obwohl f?r bestimmte Anwendungen Arrays mit ausreichender Qualit?t erhalten werden. Ferner entstehen bei der Spaltung der ortho-Nitrobenzyl-Verbindungen unerw?nschte Nebenprodukte wie beispielsweise giftige Nitrosophenyl-Verbindungen.

Bessere Spaltungsraten und/oder weniger Nebenprodukte wurden bei Dimethoxybenzoin-Carbonaten ? beschrieben von Pirrung und Bradley (1995), J. Org. Chem. 60: 1116?1117 ? und sowohl bei Carbonaten des ortho-Nitrophenylethyl-Typs wie beispielsweise dem oben genannten NPPOC als auch bei Sulfonaten des ortho-Nitrophenylethyl-Typs ? beschrieben von Hasan et al. (1997), Tetrahedron 53: 4247?4264; Giegrich et al. (1998) Nucleosides & Nucleotides 17: 1987?1996; und Pfleiderer et al., US-Patente Nr. 5,763,599 und 6,153,744 ? beobachtet. Erstere photolabile Gruppe zeigt schnellere Entsch?tzungsraten, w?hrend die beiden letzteren Gruppen auch h?here Ausbeuten und Reinheiten beim Entsch?tzen liefern. Wie oben aber bereits gesagt wurde, besteht sogar bei diesen photolabilen Schutzgruppen der ?zweiten Generation? Verbesserungsbedarf in Bezug auf schnellere Entsch?tzungsraten und h?here Umwandlungsraten.

Dar?ber hinaus sind auch photolabile Carbonat-Schutzgruppen des ortho-Nitrophenylethoxycarbonyl-Typs und des 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Typs beschrieben (A. Avino et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 1996, 4(10): 1649?1658).

Zudem ist neben den beschriebenen lichtgesteuerten Verfahren zur Oligonukleotidsynthese auch die Abspaltung von Schutzgruppen mittels DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene) bekannt (R. Eritja et al., Tetrahedron 1992, 48(20): 4171?4182).

Angesichts des steigenden Bedarfs wurden Verfahren mit digitalen Lichtprozessoren entwickelt, mit denen Genchips irgendeiner Struktur innerhalb von Stunden hergestellt werden, wie beispielsweise von Singh-Gasson et al. (1999), Nature Biotech. 17: 974?978, beschrieben wurde. Der Gesamtdurchsatz solcher Instrumente bleibt gegenw?rtig allerdings auf zwei Chips pro Arbeitstag beschr?nkt, haupts?chlich wegen der jeweils betr?chtlichen Zeit, die in einer Array-Synthese beim Entsch?tzen anf?llt. Durch eine Beschleunigung der Photolysedauer w?rde demnach die Gesamtzeit des Verfahrens wesentlich verk?rzt.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht demzufolge darin, gesch?tzte Nukleosid-Derivate herzustellen, die photolabile Schutzgruppen umfassen, die keine der oben beschriebenen Nachteile aufweisen. Ein besonderes Ziel der Erfindung besteht darin, Schutzgruppen mit besseren Entsch?tzungseigenschaften bereitzustellen, die sowohl f?r die 3'-OH- als auch die 5'-OH-Funktion der Zuckerkomponente von Nukleosid-Derivaten gut geeignet ist. Ein weiteres besonderes Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung der gesch?tzten Nukleosid-Derivate der Erfindung bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung sieht daher Verbindungen mit der allgemeinen Formel (1) vor wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
R9 aus der Gruppe bestehend aus H oder ausgew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgew?hlt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst.

Die Verbindungen der Erfindung werden in der folgenden detallierten Beschreibung der Erfindung und in den Anspr?chen ausf?hrlich beschrieben.

Die vorliegende Erfindung sieht ferner ein Verfahren vor, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Alkohol der allgemeinen Formel (1) wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
R9 H ist,
als Reagenz verwendet wird.

Das Verfahren der Erfindung wird in der folgenden detallierten Beschreibung der Erfindung und in den Anspr?chen ausf?hrlich beschrieben.

Die vorliegende Erfindung sieht schlie?lich noch die Verwendung der Verbindungen der Erfindung vor, insbesondere in einem Verfahren, das einen Schritt umfasst, bei dem eine photolabile Schutzgruppe entfernt wird.

Die neuartigen Verbindungen der Erfindung zeigen verbesserte Entsch?tzungseigenschaften, die schnellere Entsch?tzungszeiten und bessere Umwandlungsraten ergeben, wobei weniger Nebenprodukte gebildet werden. Die neuartigen Verbindungen der Erfindung, die verbesserte Entsch?tzungseigenschaften aufweisen, erm?glichen eine wesentlich beschleunigte Array-Assemblierung und eine verbesserte Oligonukleotid-Qualit?t. Dar?ber hinaus sind die Schutzgruppen insbesondere an ?trockene? oder ?nasse? Entsch?tzungsbedingungen angepasst, um unabh?ngig von dem zum Entsch?tzen verwendeten Ansatz einen hohen Durchsatz und eine hochwertige Array-Herstellung erm?glichen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfasst neuartige Verbindungen, die generell durch die folgende Formel (1) repr?sentiert werden: wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
R9 aus der Gruppe bestehend aus H oder ausgew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgew?hlt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst.

Die Verbindungen der Erfindung ergeben schnellere Entsch?tzungszeiten und bessere Umwandlungsraten, wobei weniger Nebenprodukte entstehen, wenn die Verbindungen in einem Verfahren eingesetzt werden, das das Entfernen einer photolabilen Schutzgruppe umfasst.

In einer bevorzugten Ausf?hrung der Erfindung haben die Verbindungen der Erfindung die allgemeine Formel (2): wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird;
X aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird; und
Z aus der Gruppe bestehend aus einer Abgangsgruppe, einem O-Atom einer Hydroxylgruppe bzw. einem N-Atom einer Aminogruppe einer Verbindung ausgew?hlt wird, die die photolabile Schutzgruppe umfasst. Z ist vorzugsweise ein Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid, das durch eine der folgenden Formeln (3) oder (4) repr?sentiert wird: wobei
R5 aus der Gruppe bestehend aus H, einem Oligonukleotid oder einer funktionellen Gruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist;
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird oder WR8 ist, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist;
B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgew?hlt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus eine Schutzgruppe tragen k?nnen, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; oder
Z aus der Gruppe bestehend aus einem chemisch modifizierten Desoxyribonukleosid oder Ribonukleosid oder einem Analogon davon ausgew?hlt wird.

Die folgenden Varianten von Verbindungen der Formel (1) und/oder (2) der Erfindung werden bevorzugt:

  • ? eine Variante, wobei Y eine Alkylgruppe ist, die aus der Gruppe bestehend aus Methyl oder tert-Butyl ausgew?hlt wird, und R2 H ist;
  • ? eine Variante, wobei R1 H ist und R2 aus der Gruppe ausgew?hlt wird, die ein optional substituiertes Phenyl oder ein optional substituiertes Benzoyl umfasst;
  • ? eine Variante, wobei W gleich O ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-, Alkenyl-, Acetal- oder Silylether-Schutzgruppe ausgew?hlt wird;
  • ? eine Variante, wobei W gleich S ist und R8 aus der Gruppe bestehend aus einer Alkyl-Schutzgruppe ausgew?hlt wird;
  • ? eine Variante, wobei R6 aus der Gruppe bestehend aus einem O-Methyl, O-Ethyl, O-Allyl, O-Tetrahydropyranyl, O-Methoxytetrahydropyranyl oder einem O-t-Butyldimethylsilyl ausgew?hlt wird;
  • ? eine Variante, wobei B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin oder Guanin ausgew?hlt wird und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Phenoxyacetyl, 4-tert-Butylphenoxyacetyl, 4-Isopropylphenoxyacetyl oder Dimethylformamidino ausgew?hlt wird, wobei B bevorzugt Adenin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, p-Nitrophenyloxycarbonyl (p-NPEOC), Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyloxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird, wobei B weiterhin bevorzugt Cytosin ist und die Schutzgruppe aus der Gruppe bestehend aus Benzoyl, t-Isobutyroyl oder p-Nitrophenylethyl-oxycarbonyl (p-NPEOC) ausgew?hlt wird.
  • ? eine Variante, wobei R5 aus der Gruppe bestehend aus einer Phosphitamid-Gruppe, einer intermedi?ren OH-Schutzgruppe, einer Dimethoxytrityl-Gruppe, einer Monomethoxytrityl-Gruppe und einer Silylgruppe ausgew?hlt wird.

Die oben angegebenen bevorzugten Varianten k?nnen unabh?ngig voneinander kombiniert werden.

Bei einer besonders bevorzugten Ausf?hrung der Erfindung ist R4 eine Methylgruppe, sind R1 und R3 Wasserstoff, und wird R2 aus der Gruppe bestehend aus Aryl und Aroyl ausgew?hlt. Bei dieser speziellen Ausf?hrung ist noch bevorzugter X Sauerstoff und wird R2 aus einer Phenyloder Benzoyl-Komponente ausgew?hlt. Schutzgruppen mit diesem Substitutionsmuster entsprechen Gruppen wie beispielsweise den 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyloxy-carbonyl-Schutzgruppen (P-NPPOC) bzw. den 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyloxy-carbonyl-Schutzgruppen (Bz-NPPOC).

Gem?? anderen bevorzugten Ausf?hrungen und Varianten der Erfindung ist R4 eine Methylgruppe, sind R3 und R2 Wasserstoff, und wird R1 aus einer Alkoxycarbonyl-Komponente ausgew?hlt. Besonders bevorzugte Ausf?hrungen umfassen in dieser Hinsicht Verbindungen, bei denen X Sauerstoff ist und R1 eine Methoxycarbonyl- oder tert-Butoxycarbonyl-Komponente ist. Verbindungen mit diesem Substitutionsmuster entsprechen Gruppen wie beispielsweise den 2-(4-Methoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propoxy-carbonyl-Schutzgruppen (MeC-NPPOC) und den 2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propoxycarbonyl-Schutzgruppen (tBuC-NPPOC).

Eine weitere bevorzugte Ausf?hrung der Erfindung umfasst Reagenzien, die durch die allgemeine Formel (1) und/oder (2) repr?sentiert werden, wobei R1 bis R4 und X die oben zugeschriebenen Bedeutungen aufweisen, zur Einf?hrung der photolabile Schutzgruppe in das Molek?l, das gesch?tzt werden soll. Z kann irgendeine geeignete Abgangsgruppe sein, die durch das nukleophile Atom einer zu sch?tzenden funktionellen Gruppe ersetzbar ist, wie beispielsweise ein Sauerstoff einer Hydroxylgruppe oder ein Stickstoff einer Aminogruppe.

Beispiele von Abgangsgruppen (Z) umfassen ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? ein Halogen (F-, Cl-, Br-, I-), Imidazolyl, Nitrophenoxyl, (Thio)carbonate, (Thio)carbamate und dergleichen, vorzugsweise Chlorid, Imidazolyl oder Nitrophenoxyl. Man kann diese Reagenzien folglich in Anwendungen einsetzen, bei denen insbesondere Hydroxyl- und Aminogruppen gesch?tzt werden m?ssen. Solche Anwendungen umfassen ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? die Oligonukleotid-Synthese an einem festen Tr?ger.

Ebenfalls besonders bevorzugt werden Zusammensetzungen der allgemeinen Formel (1) und/oder (2), bei denen R1 bis R4 und X die oben zugeschriebenen Bedeutungen aufweisen und Z einen Baustein repr?sentiert, der vorzugsweise monomer und insbesondere f?r die Herstellung von Oligo- und Polynukleotiden n?tzlich ist. Solche Bausteine umfassen ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? Nukleins?uren, Nukleotide, Nukleoside und dergleichen. Bei einer bevorzugten Ausf?hrung wird der Baustein aus einer Gruppe ausgew?hlt, die Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside gem?? den oben dargestellten Formeln (3) und (4) einschlie?lich der dazugeh?rigen Definitionen umfasst, aber nicht darauf beschr?nkt ist. Bei einer anderen bevorzugten Ausf?hrung ist der Baustein ?ber eine Hydroxyl- oder Aminfunktion an eine photolabile Schutzgruppe gebunden. Bei den meisten Ausf?hrungen der Erfindung sind die photolabilen Schutzgruppen an das 5'-OH oder 3'-OH eines Nukleosids angelagert. Bei einer bevorzugten Ausf?hrung umfassen die oben durch die Formeln (3) und (4) dargestellten nukleosidischen Bausteine ferner eine aktivierende funktionelle Gruppe R5 an der 5'- oder der 3'-Stellung, wobei die funktionelle Gruppe so ausgew?hlt wird, dass sie die Bildung einer Bindung an eine wachsende Oligonukleotid-Kette erm?glicht Bei eine Ausf?hrung der Erfindung ist R5 eine Phosphoramidit-Gruppe, die vorzugsweise eine ?-Cyanoethoxy-Gruppe und eine an den Phosphor angelagerte Diisopropyl-Aminogruppe umfasst. Dar?ber hinaus k?nnen ? wie dem Fachmann bekannt ist ? die aktivierten Nukleosid-Bausteine, die hier auch als Nukleosid-Synthone bezeichnet werden, Carbonyl-basierte dauerhafte Schutzgruppen an ihren jeweiligen Aminofunktionen der Purin- und Pyrimidin-Komponenten tragen. Diese Gruppen werden vorzugsweise so ausgew?hlt, dass sie leicht mir einer Base wie beispielsweise w?ssrigem Ammoniak oder Ethylendiamin in Ethanol entfernt werden k?nnen. Bevorzugte Schutzgruppen f?r die prim?ren Stickstoffe der Purin- und Pyrimidin-Komponenten umfassen ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? Benzoyl, Acetyl, DMF (Dimethylformamidyl), Isobutyryl, Pac (2-Phenoxyacetyl), Ipac (2-(4-Isopropylphenoxy)-acetyl), Tac (2-(4-tert-butylphenoxy)-acetyl) und dergleichen.

Bei noch einer anderen Ausf?hrung der Erfindung umfassen die oben durch die Formeln (3) und (4) dargestellten nukleosidischen Bausteine ferner einen 2'-Substituenten R6, wobei R6 eine freie, gesch?tzte oder derivatisierte Hydroxylgruppe nach der obigen Definition umfasst, und wobei ferner die sch?tzenden oder derivatisierenden Komponenten so ausgew?hlt werden, dass sie f?r die Herstellung von Ribonukleotiden oder Derivaten davon besonders n?tzlich sind. Bevorzugte Schutzgruppen in dieser Hinsicht umfassen ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? Acetal- und Silylether-Gruppen, wobei besonders bevorzugte Schutzgruppen die Tetrahydropyranyl- und die TBDMS-Gruppe sind. Bevorzugte Derivatisierungen der 2'-Hydroxylgruppe umfassen die O-Alkylatierung und die O-Alkenylierung.

Zu den weiteren bevorzugten Ausf?hrungen z?hlen Verbindungen der Formel (1) und/oder (2), die Bausteine f?r die Synthese von modifizierten Oligonukleotiden oder Oligonukleotid-Analoga sind, die her beide in ihrer Bedeutung unter dem Begriff ?Oligonukleotid? nach der obigen Definition zusammengefasst werden. Die Modifikationen und Analoga von Oligonukleotiden sind generell dadurch gekennzeichnet, dass sie einige strukturelle und funktionelle Merkmale mit nat?rlich vorkommenden Desoxyribonukleotiden und Ribonukleotiden gemeinsam haben, so dass sie beispielsweise eine spezifische Hybridisierung an einem komplement?ren Oligonukleotid-Strang erm?glichen. Folglich sind die Bausteine der Erfindung f?r die Synthese von modifizierten Oligonukleotiden oder Oligonukleotid-Analoga entsprechend modifizierte monomere Nukleoside und Nukleotide. Solche Modifikationen k?nnen die Zucker-Komponente, die Nukleobase oder die aktivierende Gruppe betreffen, je nachdem, welche Art von Modifikation bei dem beabsichtigten Oligonukleotid zu erreichen ist.

Es werden hier verschiedene Begriffe verwendet, um auf die Aspekte der vorliegenden Erfindung Bezug zu nehmen. Die folgenden Erl?uterungen dienen dazu, die Beschreibung der Bestandteile der Erfindung zu erkl?ren.

Es ist anzumerken, dass der Begriff ?ein? oder ?eine? im Zusammenhang mit einer Begriffseinheit eine oder mehrere zu dieser Einheit geh?rende Dinge bezeichnet; beispielsweise bezieht sich ?ein Oligonukleotid? auf ein oder mehrere Oligonukleotide. Die Begriffe ?ein? oder ?eine?, ?ein oder mehrere? und ?mindestens ein? als solche werden hier austauschbar verwendet.

Der Begriff ?Schutzgruppe? bezieht sich auf eine geeignete chemische Komponente, die dazu verwendet wird, eine funktionelle Gruppe vor unerw?nschten Reaktionen zu sch?tzen. Eine Schutzgruppe wird an eine funktionelle Gruppe angelagert und in einem sp?teren Schritt entfernt, um die intakte funktionelle Gruppe freizugeben. Das Entfernen einer Schutzgruppe wird vorzugsweise unter speziellen Bedingungen durchgef?hrt, die keine anderen Modifikationen des die funktionelle Gruppe umfassenden Molek?ls beeintr?chtigen. Methoden zum Entsch?tzen umfassen ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? die Anwendung von chemischen Mitteln wie beispielsweise sauren, basischen oder nukleophilen Agenzien sowie phyikalischen Mitteln wie beispielsweise Licht oder elektrischen Strom. Beispiele von in der Technik bekannten Schutzgruppen f?r verschiedene funktionelle Gruppen werden von Greene et al., in Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley and Sons (1991), beschrieben, dessen gesamter Inhalt hier einbezogen wird. Die Begriffe ?Schutz gruppe? und ?sch?tzende Gruppe? werden hier austauschbar verwendet.

Der Begriff ?Aryl?, allein oder in Verbindung mit irgendeinem anderen Begriff, bezieht sich auf einen carbocyclischen aromatischen Rest, der vorzugsweise aus ab 6?14 Kohlenstoffatomen und noch bevorzugter aus ab 6?10 Kohlenstoffatomen besteht. Beispiele f?r Aryreste umfassen ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? Phenyl, Naphthyl, Indenyl, Indanyl, Azulenyl, Fluorenyl, Anthracenyl und dergleichen. Arylreste k?nnen optional mit 1 bis 3 Substituenten substituiert sein, die aus der Gruppe ausgew?hlt werden, die Alkyl, Alkoxy, ein Halogen, Hydroxyl, Amino, Acyl, Nitro, Cyan, Thioalkyl und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschr?nkt ist.

Der Begriff ?Alkyl?, allein oder in Verbindung mit irgendeinem anderen Begriff, bezieht sich, im Gegensatz zu anderen Definitionen, auf eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, die aus der Gruppe ausgew?hlt wird, die Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert-Butyl und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschr?nkt ist.

Der Begriff ?Alkoxy?, allein oder in Verbindung mit irgendeinem anderen Begriff, bezieht sich, im Gegensatz zu anderen Definitionen, auf eine -O-Alkylgruppe (wobei Alkyl gem?? der obigen Beschreibung definiert ist), die aus der Gruppe ausgew?hlt wird, die Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy, tert-Butoxy und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschr?nkt ist.

Der Begriff ?Heteroaryl?, allein oder in Verbindung mit irgendeinem anderen Begriff, bezieht sich auf ein aromatisches 5- oder 6-gliedriges monocyclischen Rest, ein aromatisches 9- oder 10-gliedrigen bicyclischen Rest oder eine aromatischen 11- bis 14-gliedrigen tricyclischen Rest, vorausgesetzt, dass der monocyclische Rest oder zumindest ein Ring des bicyclischen oder tricyclischen Rest 1 oder 2 O- und/oder 5-Atome und/oder 1 bis 4 N-Atome enth?lt, vorausgesetzt, dass die Gesamtanzahl von Heteroatomen in jedem Ring 4 oder weniger betr?gt. Die kondensierten Ringe, die die bicyclischen und tricyclischen Reste komplettieren, k?nnen nur C-Atome enthalten und ges?ttigt, teilweise ges?ttigt oder unges?ttigt sein. Die N- und S-Atome k?nnen oxidiert werden, w?hrend die N-Atome quaternisiert werden k?nnen. Heteroaryl-Reste werden an irgendein verf?gbares N- oder C-Atom irgendeines Rings angelagert. Heteroaryl-Reste k?nnen optional mit 1 bis 3 Substituenten substituiert werden, die aus der Gruppe ausgew?hlt werden, die Alkyl, Alkoxy, ein Halogen, Hydroxyl, Amino, Acyl, Nitro, Cyan, Thioalkyl und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschr?nkt ist.

Der Begriff ?Aroyl?, allein oder in Verbindung mit irgendeinem anderen Begriff, bezieht sich auf einen Carbonyl-Rest, an den eine Aryl- oder Heteroaryl-Komponente gem?? der obigen Definition gebunden ist. Beispiele f?r Aroyl-Reste umfassen Benzoyl, Naphthoyl, 2-Furanoyl, 3-Thiobenzoyl und dergleichen, sind aber nicht darauf beschr?nkt. Die Carbonyl-Funktion der Aroyl-Reste kann optional als eine Ketal-, Dithioketal- oder Monothioketal-Gruppe derivatisiert werden, wie beispielsweise 1,3-Dioxan, 1,3-Dioxolan, 1,3-Dithian, 1,3-Dithiolan, 1-3-Oxathian, 1-3-Oxathiolan und dergleichen. Aroyl-Reste k?nnen optional mit 1 bis 3 Substituenten substituiert werden, die aus der Gruppe ausgew?hlt werden, die Alkyl, Alkoxy, ein Halogen, Hydroxyl, Amino, Acyl, Nitro, Cyan, Thioalkyl und dergleichen umfasst, aber nicht darauf beschr?nkt ist.

Der hier verwendete Begriff ?Abgangsgruppe? bezieht sich auf eine chemische Komponente oder ein Atom, die bzw. das leicht (optional gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase) durch ein Nukleophil in einer nukleophilen Substitutionsreaktion ersetzt werden kann. Beispiele f?r Nukleophile umfassen Amine, Alkohole und Thiole, deren jeweilige Anionen und dergleichen, sind aber nicht darauf beschr?nkt. Beispiele f?r Abgangsgruppen umfassen (Thio)carbonate, (Thio)carbamate, Halide (F-, Cl-, Br-, I-), Imidazolyl, Nitrophenoxyl und dergleichen, sind aber nicht darauf beschr?nkt.

Die hier verwendeten Begriffe ?Nukleosid? oder ?Nukleosid-Analogon? bedeuten entweder ein Desoxyribonukleosid oder ein Ribonukleosid oder chemische Modifikationen davon. Modifikationen der Nukleoside umfassen ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? Zucker-Modifikationen an der 2'-Stellung, Pyrimidin-Modifikationen an der 5-Stellung, Purin-Modifikationen an der 8-Stellung, Modifikationen bei exocyclischen Aminen von Cytosin, Substitution von 5-Brom-Uracil und dergleichen.

Der hier verwendete Begriff ?Oligonukleotid? bezieht sich auf eine Einzelstrangkette von Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden oder chemischen Modifikationen davon, wie beispielsweise Nukleotiden mit einer 2'O-4'C-Methylenbr?cke in ihrem Zuckerteil, die die Nukleotid-Bestandteile von Locked-Nukleins?uren (LNA) sind. Modifikationen umfassen ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? diejenigen, die andere chemische Gruppen liefern, die den einzelnen Nukleotiden oder deren entsprechenden Basen oder den Oligonukleotiden als Ganzes zus?tzliche Ladung, Polarisierbarkeit, Wasserstoffbindung, elektrostatische Wechselwirkung und Funktionalit?t verleihen. Solche Modifikationen umfassen ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? modifizierte Basen wie beispielsweise Zucker-Modifikationen an der 2'-Stellung, Pyrimidin-Modifikationen an der 5-Stellung, Purin-Modifikationen an der 8-Stellung, Modifikationen bei exocyclischen Aminen von Cytosin, Substitution von 5-Brom-Uracil; Hauptketten-Modifikationen, Methylierungen, und Basen, die Teil ungew?hnlicher Basenpaaarungs-Kombinationen sind wie beispielsweise die Isobasen Isocytidin und Isoguanidin und dergleichen. Modifikationen umfassen ferner angelagerte Markierungen und Reportermolek?le wie beispielsweise fluoreszierende Farbstoffe, Biotin, Minor-Groove-Binder und dergleichen, die dem Fachmann bekannt sind. Modifikationen umfassen weiterhin modifizierte Hauptketten der Oligonukleotide wie beispielsweise Peptid-Nukleins?uren (PNA), Phosphorothioat-DNA, Methylphosphonat-DNA und andere Modifikationen, die dem Fachmann bekannt sind und von Micklefield (2001) J., Current Medicinal Chemistry 8: 1157?1179, besprochen wurden, dessen gesamter Inhalt hier einbezogen wird. Die Oligonukleotide, auf die in dieser Erfindung Bezug genommen wird, k?nnen aus irgendwelchen Kombinationen von den oben beschriebenen Nukleotiden und deren Modifikationen bestehen und entweder einige ? beispielsweise bis zu 20 ? oder viele ? beispielsweise 20 bis mehrere hundert oder mehr ? in ihre Kette integrierte Nukleotide enthalten.

Der hier verwendete Begriff ?fester Tr?ger? bezieht sich auf ein Material, vorzugsweise ein polymeres Material, das in dem Medium unl?slich ist, das bei allen Einheitsmethoden eingesetzt wird, die w?hrend der Synthese von Oligonukleotiden durchgef?hrt werden. Der feste Tr?ger kann ausgew?hlt werden aus: einem anorganischen Polymer einschlie?lich ? aber nicht darauf beschr?nkt ? anorganischen Oxiden wie beispielsweise Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Zeolithen und Controlled-Pore-Glass (CPG); einem modifizierten anorganischen Polymer wie beispielsweise Siliciumdioxid oder CPG mit einer organischen Beschichtung wie beispielsweise Aminopropylsilan-derivatisiertes Siliciumdioxid oder CPG; oder einem organischen Polymer einschlie?lich ? aber nicht darauf beschr?nkt ? Polystyrol, Polyacrylamid, Polymethacrylat, Polyvinylalkohol oder anderen synthetischen Polymeren oder anderen organischen Polymeren und irgendwelchen Copolymeren, Verbundmaterialien oder Kombinationen der obigen anorganischen oder organischen Materialien. Dar?ber hinaus umfassen die festen Tr?ger funktionelle Gruppen, die durch Derivatisierung eingef?hrt werden k?nnen oder nicht und dazu geeignet sind, an der Kupplungsreaktion einer Oligonukleotid-Synthese teilzunehmen. Die funktionellen Gruppen sind ungesch?tzt, wie beispielsweise freie Hydroxylgruppen, oder gesch?tzt, wie beispielsweise DMT gesch?tzte Hydroxylgruppen, die vor der Kupplungsreaktion entsch?tzt werden m?ssen. Der feste Tr?ger wird Zyklen der Entsch?tzungsreaktionen, Kupplungsreaktionen mit Nukleotid-Synthonen wie beispielsweise Phosphoramidit-Synthonen und schlie?lich anderen chemischen Reaktionen in Schritten ausgesetzt, um Oligonukleotide zu synthetisieren, wie beispielsweise von Beaucage et al. (1992), Tetrahedron 48: 2223?2311, beschrieben wurde, dessen gesamter Inhalt hier einbezogen wird.

Bei einer bevorzugten Ausf?hrung der Erfindung umfasst der feste Tr?ger mindestens eine im Wesentlichen flache Oberfl?che, die am meisten bevorzugt in objekttr?ger- oder folienartiger Form ausgebildet ist. Bei bestimmten Ausf?hrungen kann die Oberfl?che des festen Tr?gers physisch unterteilt sein, um beispielsweise synthetische Stellen durch Vertiefungen, Stifte, Rinnen oder andere Konstruktionselemente zu trennen. Bei anderen bevorzugten Ausf?hrungen kann der feste Tr?ger in Form von Kugeln, Mikrok?gelchen oder anderen geometrischen Konfigurationen ausgebildet sein.

Es ist anzumerken, dass im Verlaufe dieser gesamten Anwendung verschiedene Zitierungen angegeben sind. Jede Zitierung wird hier spezifisch mit ihrem gesamten Inhalt einbezogen.

Die Verbindung der obigen Formel (1) und/oder (2) einschlie?lich der dazugeh?rigen Definitionen ? wobei R9 ? H ? kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Alkohol der allgemeinen Formel (1) wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
R9 H ist, als Reagenz verwendet wird.

Insbesondere die photolabilen gesch?tzten nukleosidischen Bausteine sowie Derivate und Analoga davon k?nnen gem?? dem Verfahren der Erfindung hergestellt werden, wobei Z ?ber seine prim?re oder sekund?re Hydroxylgruppe gebunden ist, wie beispielsweise durch die Formel (3) bzw. (4) veranschaulicht wird.

Die Verfahren zur Synthese des Ausgangsalkohols der obigen allgemeinen Formel (1), bei der R9 H ist, werden im Folgenden in den Beispielen 1 bis 17 detailliert er?rtert.

Das Beispiel 1 beschreibt ein generelles Verfahren zur Synthese von durch die Formel (10) repr?sentierten Verbindungen, das mit 3-Ethylanilin (7) beginnt (in Schema 1 dargestellt). In kurzen Worten: nach dem Sch?tzen der Aminofunktion des Ausgangsmaterials (7) durch Acetylierung wird eine Nitrogruppe in die para-Stellung eingef?hrt, um das substituierte Nitrobenzol 9 zu bilden. Die entsprechenden Halogensubstituierten Derivate 10a?c werden dann ?ber die Diazonierung und anschlie?ende Sandmeyer-Reaktion in Ausbeuten von 46%, 80% bzw. 57% erhalten.

Schema 1

Bevorzugte Aryl-substituierte Verbindungen (11a?c) sind ausgehend von der Verbindung 10b durch eine Suzuki-Kupplungsreaktion in guten bis ausgezeichneten Ausbeuten zug?nglich (dargestellt in Schema 2 und beschrieben in den Beispielen 2 bis 4).

Schema 2

Das Einf?hren eines Alkyloxycarbonyl-Substituenten in das 2-Ethyl-nitrophenyl-Ger?st wurde ausgehend von 4-Ethylbenzoes?ure (12) erreicht (in Schema 3 zusammengefasst). Nach Schema 3 liefert eine Nitrierungsreaktion mit anschlie?ender Veresterung der Carboxylgruppe die gew?nschten Verbindungen, wie in den Beispielen 5 und 6 f?r die Methyl- und tert-Butylester 11d bzw. e beschrieben ist, die die bevorzugten Bausteine sind.

Schema 3

Die Aryl-substituierte Verbindung (11f), die ein Vorl?ufer der Bz-NPPOC-Schutzgruppe ist, wurde gem?? Schema 4 synthetisiert und wird in den Beispielen 7 und 8 beschrieben. Nach Schema 4 f?hrt die Kondensation von Benzylcyanid (14) mit 2-Nitroethylbenzol (15) in Gegenwart von Kaliumhydroxid zur Bildung von Oxim (16), das dann durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid in einer kochenden Kaliumhydroxid-L?sung in einer Methanol-Wasser-Mischung in das Nitroderivat (11f) umgewandelt wird.

Schema 4

Derivate von 11f, bei denen der Benzoyl-Ring mit verschiedenen Komponenten ersetzt wird, sind ebenfalls mit den in den Beispielen 7 und 8 beschriebenen Methoden zug?nglich. Die jeweils substituierten Derivate von 11f sind zug?nglich, indem man das Ausgangsmaterial 14 durch das entsprechende Ring-substituierte Benzylcyanid wie in den Syntheseprotokollen der Beispiele 7 bzw. 8 ersetzt.

Die Beispiele 9 bis 14 beschreiben die Aldol-Kondensationsreaktionen zwischen den 2-Ethyl-nitrophenyl-Derivaten 11a?e und Formaldehyd, um die entsprechenden 2-substituierten Propanole der Formel (4) zu gewinnen. Die Ausbeuten dieser Reaktionen, die in Schema 5 dargestellt sind, lagen im Bereich von 38% bis 94%. Unter diesen Reaktionsbedingungen erbrachte die jeweilige Umwandlung des Benzoyl-Derivats 11f wegen der Anf?lligkeit der Carbonylgruppe gegen unerw?nschte Nebenreaktionen nur 24% des entsprechenden Alkohols 4f.

Schema 5

Schema 6 veranschaulicht einen alternativen Syntheseweg zur Umwandlung des Benzoyl-Derivats 11f in den entsprechenden Alkohol 4f (in den Beispielen 15 bis 17 beschrieben). Nach Schema 6 wird die Carbonylgruppe der Verbindung 11f als 1,3-Dioxan gesch?tzt, um die Verbindung 17 zu bilden, die dann ?ber eine Aldol-Kondensation mit Triton B als Base in die Verbindung 18 umgewandelt wird. Die Carbonylgruppe der Verbindung 18 wird anschlie?end entsch?tzt, um die Verbindung 4f in einer Gesamtausbeute von 82% zu erhalten.

Schema 6

Alkohole (4a?4f) dienen als bevorzugte Vorl?ufer f?r die photolabilen Schutzgruppen der vorliegenden Erfindung. Derivate der Alkohole (4a?4f) liegen ebenfalls im Umfang der Erfindung. Beispielsweise kann man Derivate des Alkohols 4f bei denen der von Benzylcyanid abgeleitete Benzylring mit verschiedenen Komponenten substituiert wird, unter Einsatz der in den Beispielen 7 und 8 beschriebenen Chemie erhalten, indem das Ausgangsmaterial 14 durch die oben genannten in geeigneter Weise substituierten Benzylcyanide ersetzt wird. Weitere bevorzugte Vorl?ufer f?r die Schutzgruppen der vorliegenden Erfindung sind die Ketal-, Dithioketal- oder Monothioketal-Derivate des Alkohols 4f und verwandte Aroyl-substituierte Alkohole, wobei die Verbindung 18 in Schema 6 ein Beispiel daf?r ist.

Die photolabile Schutzgruppe kann in die prim?re oder die sekund?re Hydroxylgruppe eines Nukleosids, Nukleotids oder Analogons davon (diese Begriffe werden nachstehend zusammen als Nukleosid bezeichnet) eingef?hrt werden. Wie unten detailliert er?rtert wird, erfordert das Einf?hren einer Schutzgruppe der Erfindung in eine sekund?re Hydroxylgruppe eines Nukleosids die zwischenzeitliche Blockierung der prim?ren Hydroxylgruppe des Nukleosids durch eine orthogonale Schutzgruppe. Im Gegensatz dazu kann man das Einf?hren einer Schutzgruppe der Erfindung in die prim?re Hydroxylgruppe eines Nukleosids im Allgemeinen in Gegenwart einer nicht blockierten sekund?ren Hydroxylgruppe durchf?hren. Das Einf?hren der Schutzgruppe in eine prim?re oder sekund?re Hydroxylgruppe eines Nukleosids wird vorzugsweise dadurch realisiert, dass vor der Reaktion entweder das Nukleosid oder der Alkohol (1) in das aktivierte Carbonat, Thiocarbonat oder Sulfonat umgewandelt wird. Wie dem Fachmann bekannt ist, ist bei beiden Methoden die Verwendung einer Hilfsbase wie beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin, Dimethylaminopyridin (DMAP) oder dergleichen von Nutzen, um den Ersatz der Abgangsgruppe w?hrend der Bildung des (Thio)kohlens?ure-Diesters oder des Sulfons?ureesters zu erleichtern.

Demzufolge wird bei einer bevorzugten Ausf?hrung der Erfindung ein Alkohol der allgemeinen Formel (1), wobei
R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet; oder
R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
R9 H ist,
mit einer eine Hydroxyl- oder Aminofunktion tragenden Verbindung zur Reaktion gebracht, umfassend zumindest die Schritte zum

  • a) Aktivieren entweder des Alkohols der Formel (1) oder der die Hydroxylfunktion tragenden Verbindung durch Umwandlung der Hydroxylfunktion in einen aktivierten Carbonatester, Thiocarbonatester oder ein Sulfonat;
  • b) Reagieren des in Schritt a) gebildeten aktivierten Carbonatesters oder Thiocarbonatesters oder Sulfonats mit der nicht aktivierten Verbindung.

Besonders bevorzugte Varianten des Verfahrens der Erfindung sind die Folgenden: Eine erste Variante umfasst eine Methode zur Derivatisierung der prim?ren Hydroxylgruppe eines Nukleosids, Nukleotids oder Analogons davon mit einer photospaltbaren Schutzgruppe, wobei die Methode folgende Schritte umfasst:

  • a. Umwandeln der Hydroxylgruppe eines Alkohols, der die folgende allgemeine Formel (1) hat: wobei
    R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet; oder
    R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
    R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
    R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
    R9 H ist,
    in ein aktiviertes Carbonat, Thiocarbonat oder Sulfonat;
  • b1. Reagieren des aktivierten Carbonats, Thiocarbonats oder Sulfonats mit einer Verbindung, die ein prim?res Amin, sekund?res Amin oder eine Hydroxylgruppe hat, beispielsweise die prim?re Hydroxylgruppe eines Nukleosids, Nukleotids oder Analogons davon.

Wie oben gesagt wurde, ist bei einer bevorzugten Ausf?hrung der Erfindung R4 eine Methylgruppe, sind R1 und R3 Wasserstoff, und wird R2 aus der Gruppe bestehend aus Aryl und Aroyl ausgew?hlt. Gem?? anderen bevorzugten Ausf?hrungen der Erfindung ist R4 eine Methylgruppe, sind R3 und R2 Wasserstoff und wird R1 aus einer Alkoxycarbonyl-Komponente ausgew?hlt.

Die Umwandlung des aktivierten Carbonats oder Thiocarbonats kann durch Reagieren des Alkohols (1) mit Phosgen oder Derivaten oder Ersatzstoffen davon oder mit den jeweiligen Thiocarbonyl-Verbindungen vorzugsweise in einem unpolaren organischen L?semittel bei oder unter 25?C erreicht werden. Phosgen-Derivate umfassen vorzugsweise ? sind aber nicht darauf beschr?nkt ? Diphosgen (Trichormethylchlorformat) oder Triphosgen (Bistrichlormethylchlorformat), w?hrend bevorzugte Ersatzstoffe f?r Phosgen CDI (Carbonyldiimidazol), Bisnitrophenylcarbonat, Nitrophenoxycarbonylchlorid, Pentafluorphenoxychlorformat und dergleichen sind. Die erforderliche Reaktionszeit und die Reaktionstemperaturen h?ngen von der Beschaffenheit der Ersatzstoffe ab und variieren von 0,5 bis 6 Stunden und ?20?C bis 25?C.

Die resultierenden aktivierten Carbonate bzw. Thiocarbonate, die durch die obige Formel (1) und/oder (2) dargestellt sind ? wobei Z eine Abgangsgruppe ist und alle anderen dazugeh?rigen Definitionen inbegriffen sind ?, repr?sentieren die vorgenannten Reagenzien zum Einf?hren der Schutzgruppe der Erfindung. Falls Z eine Abgangsgruppe ist, wird Z vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus einem Halogen, Imidazolyl, Nitrophenoxyl, (Thio)carbonat und (Thio)carbamat ausgew?hlt. Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen wird in Beispiel 18 beschrieben. Diese Verbindungen werden normalerweise in Ausbeuten und Reinheiten von ?ber 90% erhalten und k?nnen generell ohne weitere Reinigung verwendet werden, wie bei der Umwandlung der Alkohole 4a, 4d bzw. 4e und in den Beispielen 19, 20 bzw. 21 gezeigt wird. Der entsprechende Chlorcarbonatester des Alkohols 4f wurde in quantitativer Ausbeute hergestellt, wobei ein leicht modifiziertes Verfahren eingesetzt wurde (in Beispiel 22 beschrieben). Nach dem einfachen Entfernen des L?semittels und ?bersch?ssigen Phosgens durch Vakuumverdampfung kann man die Reaktionsmischung direkt im n?chsten Schritt verwenden.

Im zweiten Schritt (b1) l?sst man das Produkt des Schrittes (a), das normalerweise in rohem Zustand vorliegt, dann mit einem Nukleosid reagieren. Bei einer bevorzugten Ausf?hrung wird das Nukleosid aus der Gruppe von Verbindungen ausgew?hlt, die die folgende allgemeine Formel haben: wobei
R6 aus der Gruppe bestehend aus H, OH oder einer optional substituierten Alkoxyl- bzw. Alkenoxylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen oder WR8 ausgew?hlt wird, wobei W aus Sauerstoff oder Schwefel ausgew?hlt wird und R8 aus einer Schutzgruppe ausgew?hlt wird, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist; und B aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil oder chemischen Modifikationen davon ausgew?hlt wird, und wobei im Falle von Adenosin, Cytosin und Guanin die Aminofunktionen am Heterocyclus eine Schutzgruppe tragen k?nnen, die bei der Oligonukleotid-Synthese n?tzlich ist.

Ein allgemeines Verfahren zum Einf?hren einer photolabilen Schutzgruppe der Erfindung in eine prim?re Hydroxylgruppe eines Nukleosids ist in Beispiel 23 vorgesehen. Die Reaktion wird vorzugsweise in einer L?semittelmischung, die aus Dichlormethan und einem polaren organischen L?semittel besteht, optional in Gegenwart einer Base bei Temperaturen zwischen ?50?C und 25?C durchgef?hrt. Das polare organische L?semittel wird aus der Gruppe ausgew?hlt, die DMF oder Pyridin umfasst, aber nicht darauf beschr?nkt ist. Wird Pyridin als polares organisches L?semittel verwendet, ist keine zus?tzliche Base notwendig. Falls Dichlormethan/DMF-L?semittelmischungen eingesetzt werden, wird eine Base, die aus der Gruppe ausgew?hlt wird, die Pyridin, Triethylamin oder Ethyldiisopropylamin umfasst, aber nicht darauf beschr?nkt ist, zugegeben, um die w?hrend der Reaktion freigesetzten Protonen abzufangen.

Bei einer bevorzugten Ausf?hrung der Erfindung wird die in Pyridin oder der DMF/Base aufgel?ste nukleosidische Verbindung geladen und eine L?sung des aktivierten Carbonats, wie beispielsweise Chlorkohlens?ureester in Dichlormethan, tropfenweise bei der jeweiligen Reaktionstemperatur zugegeben. Das Molverh?ltnis zwischen nukleosidischer Verbindung und aktiviertem Carbonat kann st?chiometrisch auf ungef?hr 1:1 eingestellt werden. Dennoch kann man ? insbesondere dann, wenn die Reaktion bei tiefen Reaktionstemperaturen (ca. ?50?C) abl?uft ?, vorzugsweeise einen geringen bis m??igen molaren ?berschuss des aktivierten Carbonats verwenden, der beispielsweise 1,1 bis 1.5 ?quivalente Mengen in Bezug auf das Nukleosid betr?gt. Falls andererseits die oberste Priorit?t darin besteht, die Bildung der diacylierten Nebenprodukte zu unterdr?cken, gibt man vorzugsweise nur etwa 0,5 ?quivalente Mengen des aktivierten Carbonats zu, insbesondere wenn h?here Reaktionstemperaturen von ungef?hr 0?C oder h?her zum Einsatz kommen.

Nach Vollendung der Reaktion (ungef?hr 0,5 bis 6 Stunden) sowie den Standard-Bearbeitungsmethoden und der Reinigung erh?lt man die entsprechenden Nukleosid-Derivate in guten Ausbeuten und hoher Reinheit, wie f?r die Synthesen des 5'-P-NPPOC-gesch?tzten 2'-Desoxythymidins (20) und N6-tert-Butylphenoxyacetyl-2'-desoxyadenosins (21) sowie des 5'-tBuC-NPPOC-gesch?tzten 2'-Desoxythymidins (25) gezeigt wird (in den Beispielen 24, 25 bzw. 26 beschrieben). Das Bz-NPPOC-gesch?tzte N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin (29) und N4-Acetat-2'-desoxycytidin (30) wurden ?ber leicht modifizierte Synthesewege synthestisiert, die in den Beispielen 27 und 28 beschrieben sind.

Wenn in Schritt b1) eine eine Aminogruppe tragende Verbindung verwendet wird, wird Z aus der Gruppe bestehend aus einem Halogen, Imidazolyl, Nitrophenoxyl, (Thio)carbonat und (Thio)carbamat ausgew?hlt.

Eine zweite Variante des Verfahrens der Erfindung umfasst eine Methode zur Derivatisierung einer sekund?ren Hydroxylgruppe eines Nukleosids mit einer photospaltbaren Schutzgruppe, wobei die Methode folgende Schritte umfasst:

  • a. Umwandeln der Hydroxylgruppe eines Alkohols, der die folgende allgemeine Formel (1) hat: wobei
    R1 COOY ist, wobei Y aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen unter der Bedingung ausgew?hlt wird, dass R2 H bedeutet; oder
    R1 H bedeutet unter der Bedingung, dass R2 aus der Gruppe bestehend aus einer optional substituierten Arylgruppe oder einer optional substituierten Aroylgruppe ausgew?hlt wird;
    R3 aus der Gruppe bestehend aus H oder NO2 ausgew?hlt wird;
    R4 aus der Gruppe bestehend aus H, OCH3 oder einer optional substituierten Alkylgruppe mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen ausgew?hlt wird; und
    R9 = H,
    in ein aktiviertes Carbonat, Thiocarbonat oder Sulfonat;
  • b2. Reagieren des aktivierten Carbonats, Thiocarbonats oder Sulfonats mit der sekund?ren Hydroxylgruppe eines Nukleosids oder Nukleosid-Analogons, bei dem die prim?re Hydroxylgruppe gesch?tzt ist; undc. Entfernen der Schutzgruppe aus der prim?ren Hydroxylgruppe.

Der erste Schritt (a) dieser Methode ist mit dem ersten Schritt der oben beschriebenen Methode identisch, was den Schutz einer prim?ren Hydroxylgruppe betrifft.

Im zweiten Schritt (b2) dieser Methode l?sst man das Produkt des Schrittes (a), das normalerweise in rohem Zustand vorliegt, dann wie oben beschrieben mit einer sekund?ren Hydroxylgruppe eines Nukleosids reagieren, bei dem das prim?re Hydroxyl gesch?tzt wurde. Bei einer bevorzugten Ausf?hrung wird das Nukleosid oder Nukleosid-Analogon aus der Gruppe von Verbindungen ausgew?hlt, die die folgende allgemeine Formel haben: wobei
R6 wie oben definiert ist und R7 eine intermedi?re Alkohol-Schutzgruppe ist. Bei einer bevorzugten Ausf?hrung wird R7 aus einer DMT-Schutzgruppe oder einer Silylether-Schutzgruppe wie beispielsweise tert-Butyldimethylsilyl (TBDMS) oder aus der Gruppe nukleosidischer und nukleotidischer Derivate und Analoga davon ausgew?hlt, die demgem?? eine intermedi?r gesch?tzte prim?re Hydroxylfunktion umfasst. Die im Anschluss an den Schritt (b2) erhaltene rohe nukleosidische Verbindung, die die photolabile Schutzgruppe der Erfindung ? vorzugsweise als Carbonat oder Thiocarbonat ? und die intermedi?re Schutzgruppe enth?lt, wird optional durch in der Technik bekannte Verfahren gereinigt.

Im dritten Schritt (c) dieser Methode wird die intermedi?re Schutzgruppe entfernt, wodurch die prim?re Hydroxylfunktion freigesetzt wird. Das Entfernen dieser Schutzgruppe wird unter Einsatz von Standardmethoden erreicht, die von der zu entfernenden intermedi?ren Schutzgruppe abh?ngen, beispielsweise durch Behandlung mit verd?nnter S?ure im Falle der DMT-Gruppe oder mit Fluorid (F-) im Falle von Silylgruppen. Das Produkt wird dann nach den Methoden isoliert und gereinigt, die oben f?r den Schritt (b1) beschrieben wurden.

Bei einer dritten Variante des Verfahrens der Erfindung wird die zu sch?tzende Hydroxylgruppe des Nukleosids vorzugsweise in ein aktiviertes Carbonat, Thiocarbonat oder Sulfonat umgewandelt und anschlie?end die Reaktion mit Alkohol (1) durchgef?hrt. Gem?? dieser Ausf?hrung wird im ersten Schritt ein Nukleosid der Formel (5) oder (6), einschlie?lich der oben beschriebenen dazugeh?rigen Definitionen, oder ein nukleosidisches Derivat oder Analogon davon, das eine mit der Schutzgruppe auszustattende prim?re oder sekund?re Hydroxylfunktion umfasst, vorzugsweise in eine aktiviertes Carbonat, Thiocarbonat oder Sulfonat umgewandelt (wie oben beschrieben). Die aktivierte Verbindung wird danach im zweiten Schritt mit einem Alkohol der Formel (1) behandelt, um die gew?nschte photolabil-gesch?tzte Verbindung zu erhalten, deren prim?re Hydroxylgruppe anschlie?end gem?? dem vorgenannten Schritt (c) entblockiert wird, sofern eine intermedi?re Schutzgruppe verwendet wird. Die entsprechenden synthetischen Methoden und daf?r geeigneten Reaktionsbedingungen k?nnen leicht von einem Fachmann aus den in den vorgenannten Schritten (a), (b1), (b2) und (c) aufgef?hrten Methoden und Bedingungen hergeleitet werden.

Diese Ausf?hrung der Erfindung wird im Beispiel 29 veranschaulicht, das eine Methode zum Einf?hren der P-NPPOC-Gruppe in das 3'-Ende von 2'-Desoxythymindin beschreibt. Kurz gesagt: das aktivierte Carbonat 3'-(4-Nitrophenoxycarbonyl)-2'-desoxythymidin wird mit in der Technik bekannten Methoden synthetisiert, indem man 4-Nitrophenoxycarbonylchlorid mit 5'-DMT-gesch?tztem 2'-Desoxythymidin reagieren l?sst und anschlie?end die DMT-Gruppe entfernt. Das aktivierte Carbonat wird dann in Gegenwart von Dimethylaminopyridin (DMAP) mit dem entsprechenden Alkohol zur Reaktion gebracht, um die derivatisierte Produktverbindung (27) zu bilden. Diese unkomplizierte Synthese lieferte das beabsichtigte Produkt in guter Ausbeute.

Das Nukleosid oder Nukleosid-Analogon, das wie hier beschrieben mit einer photolabilen Schutzgruppe entweder an seiner prim?ren oder sekund?ren Hydroxylgruppe derivatisiert wurde, kann mit in der Technik bekannten Methoden weiter in das entsprechende Phosphoramidit umgewandelt werden, wobei ein geeignetes Phosphitylierungs-Reagenz verwendet wird. Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung des jeweiligen Phosphoramidits ist in Beispiel 30 vorgesehen. Demnach ist nach der Synthese des Phosphoramidits ein Synthon zug?nglich, das f?r die lichtgesteuerte Synthese von Oligonukleotiden n?tzlich ist. Die Beispiele 31 bis 36 beschreiben solche Reaktionen, bei denen das Phosphitylierungs-Reagenz Bis(diisopropylamino-?-cyanoethoxyphosphan in Gegenwart von Tetrazol oder DCI als Aktivator eingesetzt wird, um die Phosporamidite von 5'- und 3'-P-NPPOC-gesch?tztem dT, 5'-tBuC-NPPOC-dT, 5'-P-NPPOC-dA(tac), 5'-Bz-NPPOC-dA(bz) und 5'-Bz-NPPOC-dC(ac) zu bilden. Alle diese sechs Verbindungen umfassen die an den Phosphor angelagerte bevorzugte ?-Cyanoethoxy-Gruppe und Diisopropyl-Aminogruppe.

Um lichtspaltbare Schutzgruppen und die entsprechenden Entsch?tzungsverfahren f?r die lichtgesteuerte Oligonukleotid-Array-Synthese bewerten zu k?nnen, m?ssen die Zykluseffizienz und die Rate der photolytischen Freisetzung von 5'/3'-Schutzgruppen ermittelt werden. Der Rate der photolytischen Entsch?tzung von entsprechend gesch?tzten Nukleosiden in einer L?sung oder im trockenen Zustand kann zur Beurteilung dieser Parameter herangezogen werden.

Es wurden Photolyseraten in L?sung bei einigen der bevorzugten Schutzgruppen der Erfindung im Vergleich zur bekannten NPPOC-Gruppe gemessen (in Beispiel 37 beschrieben), indem L?sungen der gesch?tzten Nukleoside bei 365 nm mit einer Hg-Lampe bestrahlt wurden. Die durch Licht bewirkte Entsch?tzung wurde bei verschiedenen Zeitintervallen durch HPLC ?berwacht. Die entsprechenden Halbwertszeiten der Photospaltungs-Reaktionen, die in den Tabellen 1 und 2 aufgef?hrt sind, werden unten detailliert er?rtert. Die nach der Photolyse von 5'-tBuC-NPPOC-dT (25) bei 0 Sek., 60 Sek. und 600 Sek. erhaltenen HPLC-Chromatogramme sind zur Veranschaulichung in 1 dargestellt.

Die Tabelle 1 zeigt die Halbwertszeiten verschiedener 5'-gesch?tzter Desoxythymidine in w?ssrigen methanolischen L?sungen im Vergleich zur Halbwertszeit von 5'-NPPOC-gesch?tztem Desoxythymidin (26). Die Tabelle 1 zeigt, dass die 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl-Gruppe (P-NPPOC) unter diesen Bedingungen mit einer Halbwertszeit von 17 Sekunden am schnellsten entfernt wird, was einer 3,2-fachen Zunahme der Photolyserate im Vergleich zur urspr?nglichen NPPOC-Gruppe entspricht (aus Eintrag 1 bis 7 ersichtlich). Die Alkoxycarbonyl-substituierten Schutzgruppen der Verbindungen 24 und 25 (Eintr?ge 5 und 6) wurden unter denselben Bedingungen dagegen wesentlich langsamer abgespalten: 77 bzw. 75 Sekunden. Die Eintr?ge 1 bis 4 belegen ferner, dass die Photolyserate bei der P-NPPOC-Gruppe praktisch nicht von der jeweils verwendeten Nukleobase abh?ngt. Alle untersuchten P-NPPOC-gesch?tzten Nukleoside, das dT-Derivat und die basengesch?tzten dC(tac)-, dA(tac)- und dG(tac)-Derivate zeigten fast identische t1/2-Werte von 17 bis 19 Sekunden. Bei einer zweiten Versuchsreihe wurden die Photolyseraten dieser vier in w?ssrigem Acetontril gel?sten Nukleoside bestimmt; dabei ergaben sich etwas geringere t1/2-Werte, was wiederum zeigt, dass keine Abh?ngigkeit von der Nukleobase vorliegt (in Tabelle 2 dargestellt). Eine weitere Analogie zu den Versuchen in w?ssriger methanolischer L?sung ist der 3,9-fach h?here t1/2-Wert f?r das NPPOC-gesch?tzte Desoxythymidin im Vergleich zum P-NPPOC-Schutz, was aus den Eintr?gen 1 und 5 der Tabelle 2 hervorgeht.

Die Tabelle 3 zeigt die t1/2-Werte von Nukleosiden, die mit der Bz-NPPOC-Schutzgruppe und substituierten Derivaten davon derivatisiert wurden, die wie in Beispiel 37 beschrieben gemessen wurden. Diese Daten wurden in derselben Weise wie die in den Tabellen 1 und 2 zusammengestellten Daten erfasst, au?er dass L?sungen von Methanol oder Acetonitril mit 5% Wassergehalt und eine bessere optische Fokussierung verwendet wurden. Die letztere Modifikation sorgt f?r eine betr?chtliche Abnahme der t1/2-Werte, was durch einen t1/2-Wert von lediglich 5 Sekunden f?r 5'-NPPOC-dT verdeutlicht wird, der weniger als ein Zehntel des zuvor gemessenen Werts (in Tabelle 1 aufgef?hrt) betr?gt. Aus dem Eintrag 1 von Tabelle 3 geht hervor, dass der t1/2-Wert von 5'-Bz-NPPOC-dT (28) weniger als halb so gro? wie beim entsprechenden NPPOC-Derivat (26) ist. Unter diesen Bedingungen haben die 5'-Bz-NPPOC-gesch?tzten dA(bz) (29) und dC(ac) (30) auch t1/2-Werte im Bereich von ungef?hr 2 Sekunden (Eintr?ge 2 und 3) in w?ssrigem Methanol und in w?ssrigem Acetonitril. Man kann also im Falle der P-NPPOC-Gruppe davon ausgehen, dass die t1/2-Werte der Bz-NPPOC-Schutzgruppe gr??tenteils auch von der jeweils benutzten Nukleobase unabh?ngig sind. Die Tabelle 3 enth?lt die t1/2-Werte der 5'-Bz-NPPOC gesch?tzten dT-Verbindungen 31, 32 und 33, bei denen die Benzoyl-Komponente der Schutzgruppe mit einem Fluorid an den Stellungen 2, 3 bzw. 4 derivatisiert wurde. Auch bei diesen Verbindungen wurden t1/2-Werte von etwa 2 Sekunden bei beiden L?semittelsystemen beobachtet, was aus den Eintr?gen 4 bis 6 hervorgeht.

Im Zusammenhang mit der photolithographischen Herstellung von Microarrays mit der vorgenannten ?-Methyl-6-nitropiperonyloxycarbonyl-Gruppe (MeNPOC) wurde die trockene Entsch?tzung von Barone et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 20: 525?531 (2001), und McGall et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 5081?5090 (1997), als vorteilhaft beschrieben, insbesondere in Bezug auf die Automatisierungsm?glichkeiten und Entsch?tzungsraten. Entsprechende Versuche wurden unter trockenen Entsch?tzungsbedingungen mit Nukleosiden durchgef?hrt, die photolabile Schutzgruppen der Erfindung trugen (in Beispiel 38 beschrieben). Kurz gesagt: die jeweiligen Nukleoside wurden bei 365 nm in trockenem Zustand auf einer Polystyrol-Oberfl?che bestrahlt, wobei die zeitabh?ngige Entsch?tzung des Ausgangsmaterials und die Bildung des Produkts durch HPLC quantifiziert wurden. Die Ergebnisse sind in den 2 und 3 dargestellt. 2 zeigt, dass beide 3'-P-NPPOC- und 5'-NPPOC-gesch?tzten Desoxythymidine (27) und (26) wesentlich schneller entsch?tzt wurden als das 5'-MeNPOC-gesch?tzte Desoxythymidin und 5'-MeC-NPPOC-Desoxythymidin (24) ? ein Beispiel f?r Alkoxycarbonyl-substitutierte Schutzgruppen der Erfindung. 5'-MeCNPPOC-Desoxythymidin (24) lieferte jedoch wesentlich h?here Ausbeuten von Desoxythymidin gegen?ber allen anderen photosensitiv-gesch?tzten Desoxythymidinen, die in dieser Versuchsreihe untersucht wurden (in 3 dargestellt). Die Alkoxycarbonyl-substituierten Schutzgruppen der Erfindung, die durch das in der Verbindung (24) enthaltene Methoxy-Derivat und das in der Verbindung (25) enthaltene tert-Butoxy-Derivat beispielhaft vertreten sind, haben also ?hnliche Photolyseraten, aber h?here Umwandlungsraten als die MeNPOC-Gruppe, die bis jetzt als die Gruppe mit der besten Gesamtleistung bei der Photolyse im trockenen Zustand galt.

Bei einer separaten Versuchsreihe, bei der die in Beispiel 38 beschriebene Methode einschlie?lich der vorgenannten verbesserten optischen Fokussierung zum Einsatz kam, wurden die Halbwertszeiten f?r das photolytische Entfernen der Bz-NPPOC-Schutzgruppe und einiger ihrer fluorierten Derivate bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgef?hrt. Die Tabelle 4 (Eintr?ge 1 bis 6) zeigt, dass alle diese Verbindungen mit Ausnahme des (4-Fluor-Bz)-NPPOC-gesch?tzten Desoxythymidins (33) t1/2-Werte von 6,0 Sekunden aufweisen. Dieser Wert ist etwa dreimal h?her als die t1/2-Werte der jeweiligen nassen Entsch?tzungen (in Tabelle 3 zusammengestellt), aber weniger als halb so gro? wie der t1/2-Wert, der bei 5'-NPPOC-dT (26) gemessen wurde (Tabelle 4, Eintrag 7). Betrachtet man also die f?r 2 zusammengefassten Ergebnisse, zeigen die Bz-NPPOC-Schutzgruppe und deren fluorierte Derivate ?hnliche oder meist k?rzere Photolyseraten als alle anderen hier beschriebenen photolabilen Schutzgruppen. In Bezug auf die Abspaltung sind die Ausbeute und die Effizienz dieser Schutzgruppen sogar noch konkurrenzf?higer, wie unten gezeigt wird.

Die Verbindungen gem?? der Formel (1) und/oder (2) k?nnen in einem Verfahren verwendet werden, das einen Schritt zum Entfernen einer photolabilen Schutzgruppe umfasst, d. h. ein Verfahren mit lichtgesteuerter Synthese von Oligonukleotiden.

Bei einer bevorzugten Ausf?hrung werden Verbindungen gem?? der Formel (1) und/oder (2) bei einer verbesserten Methode zur Herstellung von Oligonukleotiden an einem Tr?ger eingesetzt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass eine schrittweise Elongation entweder in der 3'-zu-5'-Richtung unter Einsatz nukleotidischer Bausteine, die photospaltbare Schutzgruppen an ihrem 5'-Ende aufweisen, oder in der 5'-zu-3'-Richtung unter Einsatz solcher Bausteine erfolgt, die entsprechend 3'-gesch?tzt sind. Der letztere Fall wird unten in Klammern weiter beschrieben. Die Methode umfasst die folgenden Schritte:

  • 1. Anlagern eines ersten Nukleotids an einen Tr?ger ?ber seine 3'(5')-Hydroxylgruppe, wobei seine 5'(3')-Stellung mit einer photospaltbaren Schutzgruppe der Erfindung derivatisiert wird;
  • 2. Bestrahlen des aus Schritt 1 resultierenden tr?gergebundenen Nukleotids, um die photospaltbare Schutzgruppe zu entfernen, wodurch die 5'(3')Hydroxylgruppe entsch?tzt wird;
  • 3. Inkontaktbringen des in Schritt 2 erhaltenen tr?gergebundenen Nukleotids in Gegenwart eines Aktivators mit einem zweiten Nukleotid, das eine 5'(3')-Schutzgruppe der Erfindung und eine funktionelle 3'(5')-Phosphoramidit-Gruppe umfasst, die mit der 5'(3')-Hydroxylgruppe des tr?gergebundenen Nukleotids unter Bildung einer internukleosidischen Phosphor-Verbindung reagiert;
  • 4. optionales Capping von unreagierten 5'(3')-Hydroxylgruppen mit einer inerten Schutzgruppe, um eine weitere Kupplung zu verhindern;
  • 5. Oxidieren der neu gebildeten internukleosidischen Phosphor-Verbindung zum nat?rlich vorkommenden f?nfwertigen Zustand;
  • 6. optionales Wiederholen der Schritte 2 bis 5, w?hrend nacheinander die Nukleosidmonomere in einer vorbestimmten Reihenfolge angebracht werden, bis der gew?nschte Oligonukleotidstrang vollst?ndig ist; und
  • 7. Entfernen aller Nukleobasen- und Phosphat-Schutzgruppen. Au?er dem Schritt, bei dem die photolabile Schutzgruppe der Erfindung entfernt wird, laufen alle anderen Schritte analog zu bekannten Methoden der Festphasensynthese von Oligonukleotiden ab und sind dem Fachmann bekannt.

Die allgemeine Methode der Erfindung zur Herstellung von Oligonukleotiden umfasst die Herstellung von Array-Assemblierungen von Oligonukleotiden und insbesondere von Microarrays, die f?r auf Hybridisierung basierende parallele Durchmusterungen von Genomen n?tzlich sind. Solche Microarrays k?nnen insbesondere durch Anwendung von photolithographischen Methoden hergestellt werden, wie sie beispielsweise von Fodor et al. (1991), Science 251: 767?773 (1991), beschrieben sind, oder nach der Methode gebildet werden, die auf den von Singh-Gasson et al. (1999), Nature Biotech. 17: 974?978, und Nuwaysir et al. (2002), Genome Research 12: 1749?1755, beschriebenen ?Maskless Array Synthesizer? (MAS) angewiesen sind.

In den unten beschriebenen Versuchen wurde ein MAS eingesetzt, um die vorteilhaften Eigenschaften der neuartigen photolabilen Schutzgruppen der Erfindung und insbesondere die gesteigerten Spaltungsraten sowie die verbesserte Zykluseffizienz bei der Herstellung von Oligonukleotid-Microarrays zu zeigen. Wie von Sengh-Gasson et al. (1999), Nature Biotech. 17: 974?978, im Detail beschrieben wurde, erzeugt der MAS ein UV-Bild der virtuellen Maske auf der Oberfl?che des Glassubstrats, das als fester Tr?ger dient, an dem ein Array von Oligonukleotiden assembliert wird. Bevor das Glassubstrat in der Flie?zellen-Reaktionskammer des MAS befestigt wird, die mit einem Standard-DNA-Synthesizer verbunden ist, wird es kovalent mit einem Silan-Reagenz modifiziert (in Beispiel 39 beschrieben), um Hydroxylethyl-Grupen zu bilden, mit denen die Sondensynthesen beginnen k?nnen.

Auf silanisierten Glastr?gern wurden f?r jede diese Gruppen separate Arrays gefertigt (in Beispiel 40 beschrieben), um am Chip die Entsch?tzung der photolabilen Schutzgruppen der Erfindung in Gegenwart eines L?semittels im Vergleich zu den etablierten NPPOC- und MeNPOC-Schutzgruppen zu untersuchen. Zusammengefasst gesagt: w?hrend des ersten Synthesezyklus wurden 5'-gesch?tzte Desoxythymidin-3'-Phosphoramidite an die Glastr?ger gekuppelt und anschlie?end verschiedene Bereiche auf jedem Glastr?ger mit unterschiedlichen Bestrahlungsdosen beleuchtet. Das fluoreszierende Cy3-Phosphoramidit wurde dann im n?chsten Zyklus an die Arrays angelagert, wodurch man ein relatives Ma? f?r die 5'-Hydroxylgruppen erhielt, die photolytisch freigesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in der 4 dargestellt, die belegt, dass wesentlich weniger Energie f?r die P-NPPOC-Gruppe ben?tigt wird, um die maximale Freisetzung im Vergleich zu der MeNPOC- und der NPPOC-Gruppe zu erreichen; dies entspricht einer Reduzierung der Entsch?tzungszeit um einen Faktor von > 2 bzw. > 3. Analog zu der Beschreibung von W?ll et al., Poster-Darstellung auf der EuroBiochips 2002, wurde die P-NPPOC-Gruppe sogar noch schneller entfernt, als der Photosensibilisator Thioxanthon im Entsch?tzungs-L?semittel vorhanden war (auch in 4 ersichtlich).

?hnliche Versuche auf dem Substrat in Bezug auf die trockene Entsch?tzung wurden gem?? der Beschreibung von Beispiel 41 durchgef?hrt, um die positiven Ergebnisse zu ?berpr?fen, die f?r die Alkoxycarbonyl-Derivate der lichtempfindlichen Schutzgruppen der Erfindung erhalten wurden. Im Gegensatz zu den vorgenannten Versuchen auf MAS-Basis wurden alle L?semittel vor dem Entsch?tzungsschritt entfernt und der Array mit einem durch die Flie?zelle laufenden Argonstrom getrocknet. Die Ergebnisse in 5 zeigen, dass die tBuC-NPPOC-Gruppe wesentlich schneller und die MeC-NPPOC-Gruppe etwas schneller als die MeNPOC-Gruppe entfernt wurden.

Schlie?lich wurde das 5'-Bz-NPPOC-gesch?tzte Desoxythymidin-Phosphoramidit verwendet, um Arrays von dT12-Oligonukleotiden zu bilden (in Beispiel 42 beschrieben), wobei die in Beispiel 41 beschriebene trockene Entsch?tzungsmethode zum Einsatz kam. Analog zu einer von McGall et al. (1997), J. Am. Chem. Soc. 119: 5081?5090, beschriebenen Methode wurde nach dem Photolyseschritt die Ausbeute bei jedem Zyklus der Oligonukleotid-Synthese durch Derivatisierung einer jeweiligen Untergruppe von Features an dem Array mit Cy3-Phosphoramidit bestimmt. Die Zyklusausbeuten wurden nach Beendigung der Synthese aus den Fluoreszenzemissionen der jeweiligen Untergruppen abgeleitet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 aufgef?hrt, die belegt, dass die Assemblierung von dT12 mit Bz-NPPOC-Schutz sogar unter allgemeinen, nicht optimierten Entsch?tzungsbedingungen bei deutlich k?rzeren Expositionszeiten mit identischen oder h?heren durchschnittlichen Zyklusausbeuten erreicht wurde als bei den entsprechenden NPPOC- und MeNPOC-Schutzschemen.

Zum Abschluss bleibt festzustellen, dass f?r die lichtgesteuerte Herstellung von Oligonukleotid-Arrays die bessere Leistung der photolabilen Schutzgruppen der Erfindung dargelegt wird. In Bezug auf die Array-Fertigung, die Entsch?tzungsschritte mit Bestrahlung eines an der Tr?geroberfl?che vorhandenen L?semittels umfasst, ?bertrifft der P-NPPOC-Schutz deutlich den h?ufig verwendeten NPPOC-Schutz hinsichtlich der Entsch?tzungszeiten und hinsichtlich der Qualit?t der assemblierten Oligonukleotide. In Bezug auf die Array-Fertigung, die eine Entsch?tzung mit Bestrahlung der trockenen Tr?geroberfl?che umfasst, sind der MeC-NPPOC-, tBuC-NPPOC- und insbesondere der Bz-NPPOC-Schutz bei den vorgenannten Kriterien dem MeNPOC-Schutz ?berlegen. Ferner sind die Reagenzien zum Einf?hren der Bz-NPPOC-Schutzgruppe durch vergleichsweise umkomplizierte Synthesewege mit hohen Ausbeuten leicht zug?nglich.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erkl?rung und Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sollen in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschr?nken.

BEISPIELEBeispiel 1. Herstellung von 3-Ethyl-4-nitro-Halogenbenzolen (10) (Schema 1)

  • a) 3-Ethylacetylaminobenzol (8). Die Verbindung (8) wurde nach einer modifizierten Methode hergestellt, die urspr?nglich von Wieland et al. (1938), Liebigs Ann., 536: 89, beschrieben wurde, deren gesamter Inhalt hier eingezogen wird. Nach Schema 1 wurde 3-Ethylanilin (7) (25 mL, 27 g, 0,22 mol) zu Essigs?ureanhydrid (100 mL) in einem Eisbad gegeben und die Reaktionsmischung 10 Minuten bei K?hlung und weitere 20 Minuten ohne K?hlung ger?hrt. Die Verdampfung und anschlie?ende Destillation (110?114?C/0,05 mbar) ergab eine Ausbeute von 32,1 g (89%) der Verbindung (8) in Form von hellgelben Kristallen. mp 30?32?C. Rf = 0,42 (Hexane/EtOAc 1:1). 1H NMR: (250 MHz, CDCl3) ? 7,60 (s, 1H, NH), 7,34?7,16 (m, 3H, 3 ? arom. H), 2,59 (q, 2H, CH2), 2,14 (s, 1H, C(O)CH3), 1,18 (t, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 206 (3,41); 242 (3,10); 280 (1,76).
  • b) 4-Amino-2-ethylnitrobenzol (9). Die Verbindung 9 wurde mit einer modifizierten Methode hergestellt, die von Wieland et al. (1938), Liebigs Ann., 536: 89, beschrieben wurde, deren gesamter Inhalt hier eingezogen wird. Spezifisch wurde 3-Ethylacetylaminobenzol (8) (39 g, 0,24 mol) tropfenweise konzentrierter Schwefels?ure (100 mL) bei mechanischem R?hren und Eisk?hlung in einer solchen Rate zugegeben, dass die Temperatur nicht ?ber 25?C anstieg. Nach Abk?hlung auf ?15?C wurde 30 Minuten lang tropfenweise konzentrierte Salpeters?ure (9,8 mL, 15 g, 0,24 mol) bei Eisk?hlung in einer solchen Rate zugegeben, dass die Temperatur nicht ?ber ?15?C anstieg. Nach 90 Minuten wurde die Reaktionsmischung auf Eis gegossen und mit Diethylether (3 ? 300 mL) ausgesch?ttelt. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit Wasser gewaschen und mit festem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Nach Trocknung und Verdampfung in vacuo wurde das erhaltene tiefrote ?l (51 g) mit konzentrierter HCl (175 mL) 2,5 Stunden bei R?ckfluss erhitzt. Nach Abk?hlung wurde der Niederschlag abfiltriert, in 1 N NaOH (400 mL) dispergiert und mit Diethylether (3 ? 250 mL) ausgesch?ttelt. Die kombinierten organischen Phasen wurden getrocknet, verdampft und durch Kieselgel-S?ulenchromatographie (Hexane/EtOAc 8:1 und 4:1) weiter gereinigt. Das Produkt, die Verbindung (9), wurde in einer Ausbeute von 56% (22,1 g) in Form von gelblichen Kristallen erhalten. mp 84?85?C. Rf = 0,27 (Kieselgel, Hexane/EtOAc 7:3). 1H NMR: (250 MHz, CDCl3) ? 7,96 (m, 1H, H(6)), 6,47 (m, 2H, H(5), H(3)), 4,23 (s, 2H, NH2), 2,93 (q, 2H, CH2), 1,24 (t, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 203 (4,21), 231 (3,82), [245 (3,69)], [372 (4,09)].
  • c) 3-Ethyl-4-nitrobrombenzol (10b). Einer auf 60?C vorerhitzten Mischung aus HBr (48%, 95 mL) und Wasser (155 mL) wurde 4-Amino-2-ethylnitrobenzol (9) (16,6 g, 0,1 mol) zugegeben und die Mischung schnell in einem Eisbad abgek?hlt. Bei einer Temperatur unter 5?C wurde Natriumnitrit (7,59 g, 0,11 mol) in Wasser (20 mL) tropfenweise zugegeben; nach 10 Minuten wurde eine Spatelspitze Harnstoff zugegeben und die Reaktionsmischung 5 weitere Minuten unter Eisk?hlung ger?hrt. Der Niederschlag wurde durch Saugen filtriert und einer Mischung aus Kupfersulfat-Pentahydrat (15 g, 60 mmol) und Kupferpulver (6 g, 94 mmol) in HBr (48%, 63 mL) und Wasser (37 mL) zugesetzt; danach wurde die Mischung 70 Minuten auf 80?C erhitzt. Nach Abk?hlen wurde die Mischung mit Ethylacetat (4 ? 150 mL) extrahiert; die kombinierten organischen Extrakte wurden mit 1 N NaOH (200 mL) und Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft. Die Destillation ergab 18,53 g (80%) 3-Ethyl-4-nitrobrombenzol (10b) als gelbes ?l. bp 75?83?C/0,007 mbar. Rf = 0,76 (Hexane/EtOAc 4:1). 1H NMR ? (250 MHz, CDCl3): 7,76 (d, 1H, H(6)), 7,50 (d, 1H, H(3)), 7,45 (dd, 1H, H(5)), 2,89 (q, 2H, CH2), 1,27 (t, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 203 (4,19), [217 (3,98)], 267 (3,91), [320 (3,21)]. Elementaranalyse f?r C8H8BrNO2 (230,07 g/mol): berechnet: C 41,77, H 3,50, N 6,09; gefunden: C 41,71, H 3,59, N 6,08.
  • d) 3-Ethyl-4-nitrochlorbenzol (10a). Die Verbindung 10a wurde nach der oben beschriebenen Methode mit einer Ausbeute von 46% als gelbes ?l gewonnen, wobei statt dessen konzentrierte HCl und Kupfer(I)-chlorid verwendet wurden. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 7,85 (m, 1H, H(6)), 7,34 (m, 1H, H(3)), 7,29 (dd, 1H, H(5)), 2,90 (q, 2H, CH2), 1,24 (t, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 206 (4,09), [216 (3,91]), 263 (3,79)], [334 (2,84)]. Elementaranalyse f?r C8H8ClNO2 (185,61): berechnet: C 51,77, H 4,34, N 7,55; gefunden: C 51,65, H 4,34, N 7,63.
  • e) 3-Ethyl-4-nitroiodbenzol (10c). Die Verbindung 10c wurde nach der oben beschriebenen Methode mit einer Ausbeute von 57% als rotes ?l gewonnen, wobei statt dessen verd?nnte H2SO4 und Natriumiodid verwendet wurden. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 7,72 (m, 1H, H(3)), 7,66 (dd, 1H, H(5)), 7,58 (d, 1H, H(6)), 2,85 (q, 2H, CH2), 1,25 (t, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 203 (4,22), [220 (3,88]), 281 (3,87)], [328 (3,22)]. Elementaranalyse f?r C8H8INO2 (277,06): berechnet: C 34,68, H 2,91, N 5,06; gefunden: C 34,84, H 2,92, N 4,90.

Beispiel 2. Herstellung von 3-Ethyl-4-nitrobiphenyl (11a) (Schema 2)

Einer L?sung von 3-Ethyl-4-nitro-brombenzol (10b) (6,9 g, 26 mmol) in Toluol (40 mL) wurden Ethanol (10,5 mL), eine w?ssrige L?sung von Natriumhydrogencarbonat (2 M, 16 mL), Benzolborons?ure (3,82 g, 31 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0) (400 mg, 0,35 mmol) zugegeben und die Mischung bei R?ckfluss 5 Stunden erhitzt. Nach Abk?hlung wurde eine ges?ttigte w?ssrige NaCl-L?sung (30 mL) zugesetzt und die Mischung mit Ethylacetat (2 ? 25 mL) extrahiert; die kombinierten organischen Extrakte wurden getrocknet und verdampft. Nach Kieselgel-S?ulenchromatographie (Hexane und Hexane/EtOAc 9:1), wurde die Verbindung 11a mit einer Ausbeute von 92% (5,43 g) in Form von gelben Kristallen gewonnen. mp 54?56?C. Rf = 0,67 (Hexane/EA 9:1). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 7,99 (d, 1H, arom. H), 7,61 und 7,38 (m, 7H, 7 arom. H), 2,99 (q, 2H, CH2), 1,33 (t, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 205 (4,52), [225 (4,05)], 291 (4,04). Elementaranalyse f?r C14H13NO2 (227,26): berechnet: C 73,99, H 5,75, N 6,16; gefunden: C 73,84, H 5,68, N 5,81.

Beispiel 3. Herstellung von 3-Ethyl-4-nitro-4'-methoxybiohenyl (11b) (Schema 2)

3-Ethyl-4-nitro-4'-methoxybiphenyl (11b) wurde wie in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wobei 4-Methoxybenzolborons?ure als Reagenz verwendet wurde. Nach der Reinigung wurde die Verbindung 11b mit einer Ausbeute von 93% in Form von gelben Kristallen erhalten. mp 94?95?C. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 7,97 (d, 1H, 1 arom. H), 7,51 (m, 4H, 4 arom. H), 6,70 (dd, 2H, 2 arom. H) 3,85 (s, 3H, OMe), 2,99 (q, 2H, CH2), 1,32 (t, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 204 (4,52), 232 (4,13), 320 (4,07)]. Elementaranalyse f?r C15H15NO3 (257,29): berechnet: C 70,02, H 5,88, N 5,44; gefunden: C 70,00, H 5,97, N 5,14.

Beispiel 4. Herstellung von 2-(3-Ethyl-4-nitrophenyl)naphthalen (11c) (Schema 2)

2-(3-Ethyl-4-nitrophenyl)naphthalen (11c) wurde wie in Beispiel 2 beschrieben synthetisiert, wobei 2-Naphthylborons?ure als Reagenz verwendet wurde. Die Verbindung 11c wurde mit einer Ausbeute von 93% in Form von gelben Kristallen gewonnen. mp 110? 111?C. 1H-NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,03 (m, 2H, 2 arom. H), 7,90 (m, 3H, 3 arom. H), 7,66 (m, 3H, 3 arom. H), 7,52 (m, 2H, 2 arom. H), 3,03 (q, 2H, CH2), 1,36 (t, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 212 (4,61), 233 (4,59), [271 (4,15)], 310 (4,14), [339 (3,96)]. Elementaranalyse f?r C18H15NO2 (277,32): berechnet: C 77,96, H 5,45, N 5,05; gefunden: C 77,79, H 5,25, N 4,76.

Beispiel 5. Herstellung von 4-Ethyl-3-nitrobenzoes?uremethylester (11d) (Schema 3)

  • a) 4-Ethyl-3-nitrobenzoes?ure (13) (Schema 3) wurde aus 4-Ethylbenzoes?ure (12) nach einer von Fahim et al. (1952), J. Chem. Soc. 4519?4521, beschriebenen Methode hergestellt, deren gesamter Inhalt hier einbezogen wird. Das Produkt wurde als farbloser Feststoff in einer Ausbeute von 95% erhalten. mp 157?159?C. Rf = 0,11 (Hexane/EA 1:1). 1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) ? 8,33 (d, 1H, arom. H(2)), 8,12 (dd, 1H, arom. H(6)), 7,65 (d, 1H, arom. H(5)), 2,86 (q, 2H, CH2CH3), 1,20 (t, 3H, CH2CH3).
  • b) 4-Ethyl-3-nitrobenzoes?uremethylester (11d). Einer L?sung von 4-Ethyl-3-nitrobenzoes?ure (13) (9,76 g, 50 mmol) in 40 mL trockenem Methanol wurde konz. H2SO4 (1,5 mL) zugesetzt und die Mischung danach bei R?ckfluss 3 Stunden erhitzt. Nach Abk?hlung auf Raumtemperatur wurde die Mischung in CH2Cl2 (50 mL) suspendiert und mit einer ges?ttigten L?sung von NaHCO3 (50 mL) extrahiert. Die w?ssrige Phase wurde zweimal mit CH2Cl2 (50 mL) reextrahiert; danach wurden die kombinierten organischen Extrakte ?ber Na2SO4 getrocknet und verdampft. Das Rohprodukt (10,24 g, 49 mmol, 98%) wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Rf = 0,59 (Hexane/EA 9:1). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,48 (d, 1H, arom. H(2)), 8,15 (dd, 1H, arom. H(6)), 7,44 (d, 1H, arom. H(5)), 3,93 (s, 3H, COOCH3), 2,93 (q, 2H, CH2CH3), 1,28 (t, 3H, CH2CH3).

Beispiel 6. Herstellung von 4-Ethyl-3-nitrobenzoes?ure-tert-butylester (11e) (Schema 3)

Eine L?sung von 4-Ethyl-3-nitrobenzoes?ure (13) (9,76 g, 50 mmol), N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (11,35 g, 55 mmol), tert-Butanol (4,8 g, 65 mmol) und 4-Pyrrolidinopyridin (740 mg, 5 mmol) in trockenem CH2Cl2 (150 mL) wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur ger?hrt, filtriert; dann wurde das Filtrat zur Trocknung eingedampft. Das Rohmaterial (15,09 g) wurde auf Kieselgel (20 g) absorbiert und dann durch Flash-Chromatographie gereinigt (120 g Kieselgel, S?ule: 5 ? 14 cm, L?semittel: Hexan/ETOAC, mit folgendem Stufengradient: 600 mL Hexan, 600 mL 20:1 (v/v), 330 mL 10:1 (v/v) und 270 mL 8:1 (v/v)). Die Verbindung 11e (10,67 g, 42 mmol, 89% Ausbeute) wurde als hellgelbes ?l erhalten. Rf = 0,59 (Hexan/EtOAc 9:1). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,38 (d, 1H, arom. H(2)), 8,07 (dd, 1H, arom. H(6)), 7,39 (d, 1H, arom. H(5)), 2,90 (q, 2H, CH2CH3), 1,56 (s, 9H, 3 ? CH3 COOtBu), 1,21 (t, 3H, CH2CH3).

Beispiel 7. Herstellung von 4-?-Cyanobenzyliden-6-ethyl-2,5-cyclohexadien-1-one-oxim (16) (Schema 4)

Einer L?sung von Kaliumhydroxid (240 g, 4,28 mol) in Methanol (1000 mL) wurden Phenylacetonitril (14) (120 mL, 121,8 g, 1,04 mol) und 1-Ethyl-2-nitrobenzol (15) (120 mL, 134,5 g, 0,89 mol) zugegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden bei 50?60?C ger?hrt, in einem Eisbad abgek?hlt und mit Wasser (1600 mL) verd?nnt. Eine L?sung von Essigs?ure (440 mL) in Wasser (400 mL) wurde dann tropfenweise der eisgek?hlten Reaktionsmischung zugesetzt. Die resultierende Suspension wurde ?ber Nacht in einem Eisbad ger?hrt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mehrere Tage an der Luft getrocknet und mit Hexan gewaschen, um 200 g (0,80 mol, 90%) der Verbindung 16 als gelbes Pulver zu erhalten.

Beispiel 8. Herstellung von 3-Ethyl-4-nitro-benzophenon (11f)

Eine Mischung aus dem Oxim 16 (200 g, 0,80 mol), Kaliumhydroxid (188 g, 3,36 mol), Methanol (190 mL) und Wasser (1900 mL) wurde auf 70?90?C erhitzt. Bei kr?ftigem R?hren wurde der hei?en Reaktionsmischung ca. 6?8 Stunden lang tropfenweise eine w?ssrige L?sung von Wasserstoffperoxid (35%, 1400 mL) zugegeben. Die Mischung wurde dann ?ber Nacht unter R?ckfluss erhitzt, auf Raumtemperatur abgek?hlt und der ?lige Niederschlag absetzen gelassen. Die w?ssrige Phase wurde abgetrennt und mit Ethylacetat (1000 mL) extrahiert. Die erhaltene organische Phase und der ?lige Niederschlag wurden kombiniert, mit etwas Toluol verd?nnt und in vacuo konzentriert. Der R?ckstand wurde in CH2Cl2 gel?st, ?ber Kieselgel (380 g) filtriert, in vacuo verdampft, aus Methanol kristallisiert und luftgetrocknet, um 58,5 g (0,23 mol, 29%) der Verbindung 11f als gelbe Kristalle zu erhalten.

Beispiel 9. Allgemeines Protokoll f?r die Herstellung von 2-(5-Aryl-2-nitrophenyl)propanol-Derivaten (Schema 5)

Das jeweilige Ethylbenzol-Derivat (11) (5 mmol) wurde mit Paraformaldehyd (5 mmol) in trockenem DMSO (10 mL) und Kalium-tert-butoxid (0,05?0,5 mmol) in tert-Butanol (3 mL) behandelt. Nach 15 Minuten R?hren bei Raumtemperatur und 2 Stunden Erhitzen bei 80?C wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgek?hlt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit konz. HCl neutralisiert, mit einer ges?ttigten w?ssrigen L?sung von NaCl (25 mL) verd?nnt und mit Ethylacetat (3 ? 20 mL) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden dann getrocknet und verdampft. Die Kieselgel-S?ulenchromatographie lieferte das gew?nschte Produkt.

Beispiel 10. Herstellung von 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)propanol (4a)

Die Verbindung 4a wurde nach der in Beispiel 9 beschriebenen allgemeinen Methode hergestellt, wobei ausgehend von 3-Ethyl-4-nitrobiphenyl (11a) die Verbindung 4a als gelbes ?l in einer Ausbeute von 68% gewonnen wurde. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 7,85 (d, 1 arom. H), 7,65 (d, 1 arom. H), 7,59?7,38 (m, 6 arom. H), 3,83 (m, 2H, CH2), 3,62 (m, 1H, CH), 1,73 (br. s, 1H, OH), 1,37 (d, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 204 (4,53), [231 (4,03)], 281 (3,94)], 336 (3,70). Elementaranalyse f?r C14H13NO2 (227,26): berechnet: C 70,02, H 5,88, N 5,44; gefunden: C 69,67, H 5,73, N 5,30.

Beispiel 11. Herstellung von 2-[5-(4-Methoxyphenyl)-2-nitrophenyl]propanol (4b)

Die Verbindung 4b wurde nach der in Beispiel 9 beschriebenen allgemeinen Methode hergestellt, wobei ausgehend von 3-Ethyl-4-nitro-4'-methoxybiphenyl (11b) die Verbindung 4b in einer Ausbeute von 57% als gelbe Kristalle erhalten wurde. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 7,84 (d, 1 arom. H), 7,53 (dm, 4 arom. H), 6,99 (dd, 2 arom. H), 3,83 (m, 5H, OMe und ?-CH2), 3,66 (m, 1H, ?-CH), 1,60 (br. s, 1H, OH), 1,36 (d, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 204 (4,56), 232 (4,13), 305 (4,01). Elementaranalyse f?r C16H17NO4 (287,31): berechnet: C 66,89, H 5,96, N 4,88; gefunden: C 66,78, H 5,83, N 4,77.

Beispiel 12. Herstellung von 2-[5-(2-Naphthyl)-2-nitrophenyl]propanol (4c)

Die Verbindung 4c wurde nach der in Beispiel 9 beschriebenen allgemeinen Methode hergestellt, wobei ausgehend von 2-(3-Ethyl-4-nitrophenyl)naphthalen (11c) die Verbindung 4c in einer Ausbeute von 69% als gelbe Kristalle gewonnen wurde. mp 118?119?C. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,04 (s, 1 arom. H), 7,91 (m, 3 arom. H), 7,78 (d, 1 arom. H), 7,68 (m, 2 arom. H), 7,52 (m, 2 arom. H), 3,88 (m, 2H, ?-CH2), 3,67 (m, 1H, ?-CH); 1,78 (br. s, 1H, OH); 1,41 (d, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 212 (4,61), 235 (4,57), [274 (4,14)], [303 (4,09)], [340 (3,85)]. Elementaranalyse f?r C19H17NO3 (307,35): berechnet: C 74,25, H 5,58, N 4,56; gefunden: C 74,22, H 5,47, N 4,35.

Beispiel 13. Herstellung von 2-(4-Methoxycarbonyl-2-nitrophenyl)propanol (4d)

Einer Suspension von 4-Ethyl-3-nitrobenzoes?uremethylester (11d) (10 g, 48 mmol) und Paraformaldehyd (1,8 g, 60 mmol) in DMSO (10 mL) wurde portionsweise Kalium-tert-butoxid (1,46 g, 12 mmol) zugegeben; dabei wechselte die Farbe der Reaktionsmischung von gelb nach violett. Nach 2,5 Stunden R?hren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung direkt auf das Kieselgelbett einer Chromatographies?ule (100 g Kieselgel, 3,5 ? 14 cm) aufgebracht und mit Hexan/Ethylacetat (EA) (3:1, v/v) verd?nnt. Das leicht gelbliche Produkt (4d) wurde in einer Ausbeute von 38% (4,42 g, 18 mmol) gewonnen. Rf = 0,24 (Hexane/EtOAc 7:3). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,36 (d, 1H, arom. H(3)), 8,18 (dd, 1H, arom. H(5)), 7,58 (d, 1H, arom. H(6)), 3,93 (s, 3H, COOCH3), 3,78 (m, 2H, ?-CH2), 3,54 (Sextett, 1H, ?-CH), 1,69 (d, 3H, CH3).

Beispiel 14. Herstellung, von 2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)propanol (4e)

Einer Suspension von 4-Ethyl-3-nitrobenzoes?ure-tert-butylester (11e) (10 g, 40 mmol) und Paraformaldehyd (1,8 g, 60 mmol) in DMSO (10 mL) wurde portionsweise Kalium-tert-butoxid (590 mg, 5,8 mmol) zugegeben; dabei wechselte die Farbe der Reaktionsmischung von gelb nach violett. Nach 1 Stunde R?hren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in CH2Cl2 suspendiert, auf Kieselgel (15 g) in vacuo absorbiert und durch Flash-Chromatographie gereinigt (100 g Kieselgel, S?ule: 3,5 ? 14 cm, L?semittel: Hexan/EA 3:1). Das Produkt wurde als gelbes ?l in einer Ausbeute von 94% (10,57 g, 38 mmol) erhalten. Rf = 0,34 (Hexan/EtOAc 3:1). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,27 (d, 1H, arom. H(3)), 7,58 (dd, 1H, arom. H(5)), 7,53 (d, 1H, arom. H(6)), 3,76 (m, 2H, ?-CH2), 3,50 (Sextett, 1H, ?-CH), 1,81 (t, 1H, OH), 1,57 (s, 9H, 3 ? CH3 COOtBu), 1,31 (d, 3H, CH3).

Beispiel 15. Herstellung von 2-(3-Ethyl-4-nitrophenvl)-2-phenyl-1.3-dioxan (17)

Eine Suspension von 3-Ethyl-4-nitro-benzophenon (11f) (20,0 g, 78,4 mmol), 1,3-Propandiol (7,15 g, 94,0 mmol), p-Toluensulfons?ure-Monohydrat (50 mg) in Toluol (300 mL) wurde unter R?ckfluss erhitzt, wobei 24 Stunden lang ein Dean-Stark-Wasserabscheider verwendet wurde. Der Dean-Stark-Wasserabscheider wurde dann durch einen mit einem Molekularsieb gef?llten Soxhlet-Extraktor ersetzt und die Mischung weitere 48 Stunden unter R?ckfluss erhitzt, um eine vollst?ndige Umwandlung zu erreichen. Die Reaktionsmischung wurde anschlie?end auf Umgebungstemperatur abgek?hlt, mit einer ges?ttigten w?ssrigen L?sung von NaHCO3 gewaschen und in vacuo konzentriert, bis die Kristallisation begann. Die Suspension wurde 0,5 Stunden in einem Eisbad gek?hlt; danach wurde das kristalline Produkt filtriert, mit einer kleinen Menge Hexan gewaschen und luftgetrocknet, um 22,48 g (72 mmol, 91,5%) der Verbindung 17 in Form von gelben Kristallen zu erhalten.

Beispiel 16. Herstellung von 2-(3-(2-Hydroxy-1-methylethyl)-4-nitrophenyl)-2-phenyl-1,3-dioxan (18)

Eine Suspension von 2-(3-Ethyl-4-nitrophenyl)-2-phenyl-1,3-dioxan (17) (20,0 g, 63,8 mmol), Paraformaldehyd (6,5 g, 72,6 mmol) und einer methanolischen L?sung von Triton B (35%, 17 mL) in DMSO (100 mL) wurde 2 Stunden bei 85?C ger?hrt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf Umgebungstemperatur abgek?hlt, mit CH2Cl2 (200 mL) verd?nnt, mit Wasser (2 ? 200 mL) gewaschen, partiell in vacuo konzentriert (zur azeotropen Trocknung) und ?ber Kieselgel (35 g) filtriert. Das Filtrat wurde dann in vacuo verdampft, um 24,15 g (ca. 70,3 mmol, 110%) des Rohprodukts als gelbes ?l zu erhalten.

Beispiel 17. Herstellung von 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4f)

Einer L?sung von 2-(3-(2-Hydroxy-1-methylethyl)-4-nitrophenyl)-2-phenyl-1,3-dioxan (18) (23,6 g; ca. 69 mmol) in Ethanol (350 mL) wurde Wasser (70 mL) bei kr?ftigem R?hren zugegeben. Dann wurde konzentrierte Salzs?ure (ca. 12 N w?ssrige L?sung, 35 mL) tropfenweise zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei Umgebungstemperatur 4 Stunden ger?hrt, mit Wasser verd?nnt und mit Ethylacetat gewaschen. Die organische Phase wurde der Reihe nach mit einer w?ssrigen ges?ttigten L?sung von NaHCO3 und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde anschlie?end in vacuo konzentriert und mit Kristallen des Produkts 4f geimpft, um einen gelben Feststoff zu erhalten. Schlie?lich wurde der pulverige Feststoff mit Hexan gewaschen und luftgetrocknet, woraus eine Ausbeute von 17,83 g (62,5 mmol, 91%) eines gelben Pulvers resultierte. 1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) ? 7,91?7,52 (m, 8H, arom.), 4,75 (br. s., 1H, OH), 3,53 (d, 2H, ?-CH2), 3,23 (Sextett, 1H, ?-CH), 1,24 (d, 3H, ?-CH3).

Beispiel 18. Allgemeines Protokoll f?r die Herstellung von 2-(2-Nitrophenyl)-1-propyloxycarbonylchlorid-Derivaten von Verbindungen (4a bis 4e)

Einer L?sung von Trichlormethylchlorformat (2,37 g, 1,4 mL, 12 mmol, 1,2 ?quivalente Mengen) in trockenem Tetrahydrofuran (10 mL), die auf 0?C vorgek?hlt war, wurde 5 Minuten lang eine L?sung des jeweiligen 2-(2-Nitrophenyl)-1-propanol-Derivats (10 mmol) und von Triethylamin (1 g, 10 mmol) in Tetrahydrofuran (10 mL) bei fortlaufender K?hlung zugegeben. Nach 1 Stunde R?hren in einem Eisbad wurde die Reaktionsmischung filtriert; der Filterkuchen wurde mit etwas Tetrahydrofuran gewaschen, und die kombinierten organischen Phasen wurden in vacuo verdampft.

Beispiel 19. Herstellung von 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19a)

Herstellung nach der in Beispiel 18 beschriebenen allgemeinen Methode; ausgehend von 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4a) wurde ein dunkelgelbes ?l (3,08 g, 96%) erhalten, das nach 2 Stunden Trocknen bei 0,1 mbar ohne weitere Reinigung im n?chsten Schritt verwendet wurde. Rf = 0,91(CH2Cl2). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 7,93 (d, 1 arom. H), 7,62?7,40 (m, 7 arom. H), 4,54 (d, 2H, CH2), 3,90 (Sextett, 1H, CH), 1,45 (d, 3H, CH3).

Beispiel 20. Herstellung von 2-(4-Methoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propyloxycarbonylchlorid (19d)

Herstellung nach der in Beispiel 18 beschriebenen allgemeinen Methode; ausgehend von 2-(4-tert-Methoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4d) (1,85 g, 7,7 mmol) wurde das Produkt in einer Ausbeute von 93% (2,16 g, 7,02 mmol) als gelbes ?l erhalten, das ohne weitere Reinigung im n?chsten Schritt verwendet wurde. Rf = 0,80 (CH2Cl2). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,45 (d, 1H, arom. H(3)), 8,22 (dd, 1H, arom. H(5)), 7,55 (d, 1H, arom. H(6)), 4,48 (dd, 2H, ?-CH2), 3,95 (s, 3H, COOCH3), 3,82 (Sextett, 1H, ?-CH), 1,41 (d, 3H, CH3).

Beispiel 21. Herstellung von 2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19e)

Herstellung ausgehend von 2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4e) (7,05 g, 25 mmol) nach der in Beispiel 18 beschriebenen allgemeinen Methode; das Produkt, die Verbindung 19e, wurde in einer Ausbeute von 97% (8,37 g, 24 mmol) als gelbes ?l erhalten, das ohne weitere Reinigung im n?chsten Schritt verwendet wurde. Rf = 0,86 (CH2Cl2). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,36 (d, 1H, arom. H(3)), 8,16 (dd, 1H, arom. H(5)), 7,52 (d, 1H, arom. H(6)), 4,48 (m, 2H, ?-CH2), 3,76 (Sextett, 1H, ?-CH), 1,59 (s, 9H, 3 ? CH3 COOtBu), 1,39 (m, 3H, CH3).

Alle anderen oben beschriebenen substituierten Propanole k?nnen in der gleichen Weise behandelt werden, um die jeweiligen Chlorcarbonate in ausgezeichneter Ausbeute und ausreichender Reinheit zu gewinnen.

Beispiel 22. Herstellung von 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19f)

Einer auf 0?C vorgek?hlten L?sung von Trichlormethylchlorformat (15,83 g, 80 mmol, 0,8 ?quivalente Mengen) in trockenem Tetrahydrofuran (150 mL) wurde ca. 2 Stunden lang eine L?sung von 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4f) (28,53 g, 100 mmol) und Triethylamin (10,12 g, 100 mmol) in Tetrahydrofuran (250 mL) bei fortlaufender K?hlung zugesetzt. Nach 1 Stunde R?hren bei Umgebungstemperatur wurde die resultierende Suspension filtriert; der Filterkuchen wurde mit etwas Tetrahydrofuran gewaschen, und die kombinierten organischen Phasen wurden in vacuo konzentriert, um die Verbindung 19f als gelbes ?l zu erhalten.

Alle anderen oben beschriebenen substituierten Propanole k?nnen in der gleichen Weise behandelt werden, um die jeweiligen Chlorcarbonate in ausgezeichneter Ausbeute und ausreichender Reinheit zu gewinnen.

Beispiel 23. Allgemeines Protokoll f?r das Einf?hren der photolabilen Schutzgruppen an der 5'-Stellung von 2'-Desoxynukleosiden

Das jeweilige 2'-Desoxynukleosid (1 mmol) wurde durch Koverdampfung mit abs. Pyridin (3 ? 3 mL) getrocknet, in abs. Pyridin (3 mL) gel?st und auf ?50?C abgek?hlt. Das jeweilige Chlorcarbonat (1,35 ?quivalente Mengen f?r 2'-Desoxythymidin, 2'-Desoxyadenosin und 2'-Desoxyguanosin, oder 1,5 ?quivalente Mengen f?r 2'-Desoxycytidin) in abs. CH2Cl2 (3 mL) wurde 10 Minuten lang tropfenweise zugesetzt. Nach 5 Stunden R?hren bei ?50?C bis ?30?C wurde die Reaktionsmischung mit Wasser (10 mL) behandelt und die w?ssrige Phase mit CH2Cl2 (3 ? 10 mL) extrahiert. Die kombinierte organische Phase wurde getrocknet, mit Toluol (3 ? 10 mL) koverdampft und durch Kieselgel-S?ulenchromatographie gereinigt (CH2Cl2/MeOH 100:1, 100:2, 100:3, 100:3,5 und 100:4). Die Produkte wurden als amorphe Feststoffe in m??iger bis guter Ausbeute gewonnen.

Beispiel 24. Herstellung von 5'-O-[2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin (20) (Tabelle 1)

Die Verbindung 20 wurde nach der in Beispiel 23 beschriebenen allgemeinen Methode mit 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19a) hergestellt, um ein gelbliches Pulver in einer Ausbeute von 78% zu erhalten. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,91 (br. s, NH), 7,86 (d, 1 arom. H), 7,61?7,38 (m, 7 arom. H), 7,28 (s, 1H, H-C(6)), 6,30 (t, 1H, HC(1')), 4,52?4,21 (m, 5H, CH2, H-C(5'), H-C(3')), 4,09 (m, 1H, H-C(4')), 3,89 (m, 1H, CH), 3,65 (br. s, 1H, HO-(3')), 2,32 (m, 1H, H-C(2')), 2,10 (m, 1H, H-C(2')), 1,76 (d, 3H, CH3-(thy)), 1,41 (d, 3H, CH3). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 203 (4,69), 263 (4,25)], [295 (3,95)]; 335 (3,80). Elementaranalyse f?r C26H27N3O9 ? 0,5 H2O (534,52): berechnet: C 58,42, H 5,28, N 7,86; gefunden: C 58,82, H 5,26, N 7,58.

Beispiel 25. Herstellung von N6-tert-Butylphenoxyacetyl-5'-O-[2-(5-phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxyadenosin (21) (Tabelle 1)

Die Verbindung 21 wurde nach der in Beispiel 23 beschriebenen allgemeinen Methode mit 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19a) hergestellt, um ein gelbliches Pulver in einer Ausbeute von 80% zu erhalten. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 9,47 (br. d, 1H, NH), 8,74 und 8,19 (2d, 2H, H-C(2), H-C(8)), 7,85 (m, 1 arom. H), 7,61 (d, 1 arom. H), 7,52 (m, 2 arom. H), 7,43?7,30 (m, 4H, 2 arom. H (Schutzgr.), 2 arom. H (Tac)), 6,94 (d, 2 arom. H (Tac)), 6,49 (t, 1H, H-C(1')), 4,80 (s, 2H, CH2 (Tac)), 4,67 (m, 1H, H-C(3')), 4,41?4,19 (m, 5H, 2 ? CH, H-C(5'), H-C(4')), 3,89 (m, 1H, CH (Schutzgr.)), 3,11 (br. s, 1H, HO-(3')), 2,80 (m, 1H, H-C(2)). 2,54 (m, 1H, H-C(2')), 1,41 (d, 3H, CH3)), 1,27 (s, 9H, CH3 (tert-butyl)). Elementaranalyse f?r C38H40N6O8 ? 1,5H2O (734,78): berechnet: C 62,03, H 5,89, N 11,42; gefunden: C 62,27, H 5,70, N 11,39.

Beispiel 26. Herstellung von 5'-O-[2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin (25) (Tabelle 1)

Die Verbindung 20 wurde mit der in Beispiel 17 beschriebenen allgemeinen Methode ausgehend von 2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19e) hergestellt, um ein farbloses Pulver in einer Ausbeute von 72% zu erhalten. 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,89 (s, 1H, NH), 8,29 (s, 1H, arom. H(3) 4tBuOOCNPPOC), 8,14 (m, 1H, arom. H(5) 4tBuOOCNPPOC), 7,51 (m, 1H, arom. H(6) 4tBuOOCNPPOC), 7,27 (2 ? s, 1H, H-C(6)), 6,29 (m, 1H, H-C(1')), 4,45?4,08 (m, 6H, ?CH2 4tBuOOCNPPOC, 2 ? H-C(5'), H-C(3'), H-C(4')), 3,78 (Sextett, 1H, ?-CH 4tBuOOCNPPOC), 2,87 (t, 1H, OH-C(3')), 2,34 (m, 1H, H-C(2')), 2,16 (m, 1H, H-C(2')), 1,85 + 1,79 (2 ? s, 3H, CH3 thy), 1,58 (s, 9H, 3 ? CH3 COOtBu), 1,36 (m, 3H, ?-CH3 4tBuOOCNPPOC).

Beispiel 27. Herstellung von N6-Benzoyl-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxyadenosin (29)

N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin (23,63 g, 67 mmol) wurde durch Koverdampfung mit abs. Pyridin (3 ? 100 mL) getrocknet, in Pyridin (400 mL) gel?st und auf 0?C abgek?hlt. Eine L?sung von 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19f) (35 mmol, hergestellt aus 10,00 g Alkohol 4f) in abs. CH2Cl2 (100 mL) wurde 2,5 Stunden lang tropfenweise zugegeben. Nach R?hren ?ber Nacht bei Umgebungstemperatur wurde die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert, in CH2Cl2 gel?st und mit Wasser (2 ? 200 mL) gewaschen. ?bersch?ssiges N6-Benzoyl-2'-desoxyadenosin fiel als kristalliner Feststoff aus der w?ssrigen Phase aus und wurde durch Filtrieren zur?ckgewonnen. Die organische Phase wurde mit Toluol (100 mL) verd?nnt, in vacuo konzentriert und durch Kieselgel-S?ulenchromatographie gereinigt (315 g Kieselgel, S?ulendurchmesser 5,5 cm, Gradient: CH2Cl2 zu CH2Cl2/Methanol 100:5), um 13,20 g (19,8 mmol, 57%) des Produkts 29 als leicht gelblichen Schaum zu erhalten. 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6): ? 11,02 und 11,01 (2s, 2H, NH), 8,67 (s, 1H, H-C(2)), 8,51 und 8,50 (2s, 2H, H-C(8)), 8,00?7,48 (m, 13H, arom.), 6,46 (m, 1H, H-C(1')), 5,47 (d, 1H, HO-C(3')), 4,46 (m, 1H, H-C(3')), 4,28 (m, 4H, 2 ? CH2), 4,03 (m, 1H, H-C(4)), 3,50 (m, ?-CH), 2,86 (m, 1H, H-C(2'')), 2,40 (m, 1H, H-C(2')), 1,28 (d, 3H, ?-CH3).

Beispiel 28. Herstellung von N4-Acetat-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propvl-oxyoxycarbonyl]-2'-desoxycytidin (30)

N4-Acetat-2'-desoxycytidin (17,87 g, 66 mmol) wurde durch Koverdampfung mit abs. Pyridin (3 ? 70 mL) getrocknet, in Pyridin (200 mL) gel?st und auf 0?C abgek?hlt. Eine L?sung von 2-(5-Benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonylchlorid (19f) (35 mmol, hergestellt aus 10,00 g Alkohol 41) in abs. CH2Cl2 (100 mL) wurde 2,5 Stunden lang tropfenweise zugegeben. Nach R?hren ?ber Nacht bei Umgebungstemperatur wurde die Reaktionsmischung in vacuo konzentriert, in CH2Cl2 gel?st und mit Wasser (2 ? 200 mL) gewaschen. Die organische Phase wurde mit Toluol (100 mL) verd?nnt, in vacuo konzentriert und durch Kieselgel-S?ulenchromatographie gereinigt (320 g Kieselgel, S?ulendurchmesser 5,5 cm, Gradient: CH2Cl2 zu CH2Cl2/Methanol 100:5), um 10,58 g (18,2 mmol, 52%) des Produkts 30 als farblosen Schaum zu erhalten. 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) ? 10,72 (s, 1H, NH), 7,96?7,50 (m, 9H, H-C(6) und arom.), 7,10 (d, 1H, H-C(5)), 7,09 (d, 1H, H-C(5)), 6,08 (m, 1H, H-C(1')), 5,37 (d, 1H, HO-C(3')), 4,32?4,22 (m, 4H, 2 ? CH2), 4,15 (m, 1H, H-C(3')), 3,97 (m, 1H, H-C(4')), 3,54 (m, 1H, ?-CH), 2,27 (m, H-C(2'')), 2,08 (s, 1H, NHAc), 2,05 (m, 1H, H-C(2')), 1,31 (d, 3H, ?-CH3).

Alle anderen oben beschriebenen Chlorcarbonate k?nnen in analoger Weise in die jeweiligen 5'- oder 3'-gesch?tzten Nukleoside mit ausgezeichneter Ausbeute und ausreichender Reinheit umgewandelt werden.

Beispiel 29. Herstellung von 3'-O-[2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin (28)

Eine L?sung von 2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propanol (4a) (324,4 mg) und DMAP (36,1 mg) in Acetonitril (1 mL) wurde einer L?sung von 3'-(4-Nitrophenyl-oxycarbonyl)-2'-desoxythymidin (102,7 mg, erhalten durch Reagieren von 4-Nitrophenyl-oxycarbonylchlorid mit 5'-Dimethoxytrityl-gesch?tztem (DMT) 2'-Desoxythymidin und anschlie?endes Entfernen der DMT-Schutzgruppe unter leicht sauren Bedingungen analog zu in der Technik bekannten Protokollen) in Acetonitril (1 mL) zugesetzt. Die Mischung wurde 20 Minuten bei Umgebungstemperatur ger?hrt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Na2HPO4/KH2PO4-Puffer (5 mL) gel?scht; die Mischung wurde dann mit Dichlormethan (3 ? 10 mL) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden ?ber Na2SO4 getrocknet und in vacuo konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Kieselgel-S?ulenchromatographie gereinigt (8 g Kieselgel, 16 ? 1 cm, Gradient: Dichlormethan zu Dichlormethan:Methanol 25:1). Das Produkt wurde in einer Ausbeute von 62,7% (82,9 mg) als leicht br?unlicher Schaum erhalten. Rf = 0,20 (CH2Cl2/MeOH 20:1). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,61 (s, 1H, NH); 7,88 (d, 1H, arom. H Schutzgruppe); 7,62?7,37 (m, 8H, 7 ? arom. H Schutzgruppe, H-C (6)); 6,08 (m, 1H, H-C(1')); 5,25 (m, 1H, H-C(3')); 4,36 (m, 2H, ?-CH2); 4,08 (m, 1H, H-C(4')); 3,87 (m, 3H, 2 ? H-C(5'); ?-CH Schutzgruppe); 2,54?2,15 (m, 3H, 2 ? H-C(2'); OH-C(5')); 1,89 (s, 3H, CH3 Thy); 1,42 (d, 3H, CH3 Schutzgruppe). UV (?max [nm] (log ?); MeOH): 203 (4,64); 263 (4,22); [293 (3,92)]; 341 (3,78).

Beispiel 30. Allgemeines Protokoll f?r die Herstellung von 5'-O-photolabil-gesch?tzten 3'-O-(?-Cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidityl-2'-desoxynukleosiden

Das 5'-photolabil-gesch?tzte 2'-Desoxynukleosid (2 mmol) wurde unter Argon in einer Mischung aus abs. CH2Cl2 (8 mL) und abs. Acetonitril (2 mL) suspendiert. Dann wurden Tetrazol (140 mg, 2 mmol) und Bis(diisopropylamino)-?-cyanoethoxyphosphan (1,2 g, 4 mmol) zugesetzt. Nach 2,5 Stunden R?hren bei Raumtemperatur wurde CH2Cl2 (40 mL) zugegeben und die resultierende Mischung mit einer ges?ttigten w?ssrigen L?sung von Natriumhydrogencarbonat (40 mL) gewaschen. Die kombinierte organische Phase wurde getrocknet und durch Kieselgel-S?ulenchromatographie gereinigt (EtOAc/NEt3, 99:1 (v/v)). Die Produkte wurde in guten Ausbeuten als amorphe Feststoffe erhalten.

Beispiel 31. Herstellung von 5'-O-[2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin-3'-O-(?-cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Das Phosphoramidit wurde nach der in Beispiel 30 beschriebenen allgemeinen Methode hergestellt, um ein gelbliches Pulver in einer Ausbeute von 85% zu erhalten. Rf = 0,83 und 0,79 (EtOAc, Diastereomere). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 7,98 (br. s, NH), 7,87 (d, 1 arom. H), 7,61 (s, 1 arom. H), 7,57 (m, 3 arom. H), 7,45 (m, 3 arom. H), 7,26 (m, 1H, H-C(6)), 6,29 (t, 1H, HC(1')), 4,52?4,16 (m, 6H, 2 ? ?-CH, H-C(5'), H-C(3'), H-C(4')), 3,89?3,50 (m, 5H, O-CH2CH2CN, ?-CH, 2 ? CH (isopropyl)), 2,61 (m, 2H, CH2CN), 2,40 (m, 1H, H-C(2')), 2,13 (m, 1H, H-C(2')), 1,80?1,72 (m, 3H, CH3-thy)), 1,41 (d, 3H, CH3), 1,15 (m, 12H, 4 ? CH3 (isopropyl)).

Beispiel 32. Herstellung von N6-tert-Butylphenyloxyacetyl-5'-O-[2-(5-phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxyadenosin-3'-O-(?-cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Das Phosphoramidit wurde nach der in Beispiel 30 beschriebenen allgemeinen Methode hergestellt, um ein gelbliches Pulver in einer Ausbeute von 80% zu gewinnen. Rf = 0,77 und 0,67 (EtOAc, Diastereomere). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 9,38 (s(br.), 1H, NH), 8,76 und 8,18 (2d, 2H, H-C(2), H-C(8)), 7,87 (dd, 1H, arom. H), 7,53 (m, 3H, 1 arom. H, 2 arom. H (Tac)), 7,40 (m, 3 ? arom. H), 7,32 (m, 2 ? arom. H), 6,95 (m, 2 ? arom. H (Tac)), 6,47 (m, 1H, H-C(1')), 4,79 (s, 2H, CH2(Tac)), 4,68 (m, 1H, H-C(3')), 4,33 (m, 5H, 2 ? ?-CH, 2 ? H-C(5'), H-C(4')), 3,89?3,52 (m, 5H, O-CH2CH2, ?-CH, 2 ? CH (isopropyl)), 2,84 (m, 1H, H-C(2')), 2,63 (m, 3H, CH2CN, H-C(2')), 1,42 (d, 3H, CH3), 1,27 (s, 9H, 3 ? CH3 (tert-butyl)), 1,15 (m, 12H, 4 ? CH3 (isopropyl)). 31P-NMR (400 MHz, CDCl3) ? 146,70, 146,65 und 146,56 (3 ? s, Diastereomere).

Beispiel 33. Herstellung von 5'-O-[2-(4-tert-Butoxycarbonyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin-3'-O-(?-cyanoethyl, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Herstellung nach der in Beispiel 30 beschriebenen allgemeinen Methode; erhalten wurde ein farbloses Pulver in einer Ausbeute von 86%. Rf = 0,83 und 0,77 (EtOAc/Hexan 9:1, Diastereomere). 1H NMR (250 MHz, CDCl3) ? 8,29 (s, 1H, arom. H 4tBuOOCNPPOC), 8,14 (m, 2H, arom. H 4tBuOOCNPPOC, NH), 7,51 (d, 1H, arom. H 4tBuOOCNPPOC), 7,27 (dd, 1H, H-C(6)), 6,30 (m, 1H, H-C(1')), 4,50?4,17 (m, 6H, H-C(3'), 2 ? H-C(5'), 2 ? ?-CH 4tBuOOCNPPOC, H-C(4')), 3,84?3,52 (m, 5H, ?-CH2 CE, ?-CH 4tBuOOCNPPOC, 2 ? CH iPr), 2,61 (m, 2H, ?-CH2 CE), 2,43 (m, 1H, H-C(2')), 2,15 (m, 1H, H-C(2')), 1,85, 1,80, 1,79 + 1,78 (4 ? s, 3H, CH3 thy), 1,58 (s, 9H, 3 ? CH3 COOtBu), 1,36 (dd, 3H, ?-CH34tBuOOCNPPOC), 1,18, 1,17, 1,15 u. 1,14 (4 ? s, 12H, 4 ? CH3 iPr). 31P-NMR (400 MHz, DMSO-d6) ? 148,66, 148,53 + 148,44.

Beispiel 34. Herstellung von 3'-O-[2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin-5'-O-(?-cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Bis(diisopropylamino)-?-cyanoethoxyphosphan (121 mg) wurde einer L?sung von 3'-O-[2-(5-Phenyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxythymidin (140 mg) und DCI (16 mg) in Dichlormethan (3 mL) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei Umgebungstemperatur ger?hrt, anschlie?end mit Dichlormethan (30 mL) verd?nnt und mit einer ges?ttigten w?ssrigen L?sung von NaHCO3 (15 mL) gewaschen. Die organische Phase wurde getrennt, ?ber Na2SO4 getrocknet und in vacuo konzentriert. Der R?ckstand wurde in Dichlormethan (2 mL) gel?st und in n-Hexan (50 mL) gegossen, um das Produkt auszuf?llen. Der Niederschlag wurde getrennt, in einer kleinen Menge Dichlormethan gel?st und durch Chromatographie gereinigt (5,5 g Kieselgel, 12 ? 0,8 cm, Gradient: n-Hexan/Aceton 4:1 zu 1:1). Das Produkt wurde in einer Ausbeute von 51,6% (100 mg) als farbloser Schaum erhalten. Rf = 0,32 (Hexan/Aceton 7:5). 1H NMR (400 MHz, DMSO) ? 11,37 (s, 1H, NH); 7,95?7,43 (m, 9H, arom. H + H-C(6)); 6,13?6,05 (m, 1H, H-C(1')); 5,10?5,04 (m, 1H, H-C(3')); 4,43?4,41 (m, 2H, H-C(5')); 4,12?4,05 (m, 1H, H-C(4')); 3,78?3,29 (m, 9H, 3 ? O-CH2, H-C-CH3, ?-CH isopropyl); 2,77?2,72 (m, 2H, CNCH2); 2,27 (m, 2H, H-C(2')); 1,77 (s, 1H, CH3-Thy); 1,35 (d, 3H, CH3); 1,14?1,04 (m, 12H, CH3 isopropyl). 31P-NMR (400 MHz, DMSO): ? 151,66.

Beispiel 35. Herstellung von N6-Benzoyl-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxyadenosin-3'-O-(?-cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Bis(diisopropylamino)-?-cyanoethoxyphosphan (8,50 g, 28 mmol) wurde einer L?sung von N6-Benzoyl-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxyadenosin (12,50 g, 19 mmol) und DCI (1,11 g, 9 mmol) in Dichlormethan (130 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden bei Umgebungstemperatur ger?hrt, dann mit Hexan (120 mL) verd?nnt und durch ein Kieselgelbett in einer S?ule (42 g Kieselgel, Durchmesser 3 cm) filtriert. Die S?ule wurde mit einem Gradienten von Hexan/Ethylacetat (1:1, v/v) zu Ethylacetat eluiert. Die Produktfraktionen wurden in vacuo auf ein Volumen von ca. 200 mL konzentriert und dann langsam bei kr?ftigem R?hren in Hexan (1,5 L) gegossen, um das Produkt auszuf?llen. Der Niederschlag wurde getrennt, in einer kleinen Menge Ethylacetat gel?st und ein zweites Mal in der gleichen Weise ausgef?llt. Der Niederschlag wurde wieder getrennt, in Dichlormethan gel?st und in vacuo konzentriert, um das Produkt in einer Ausbeute von 88% (14,45 g) als farblosen Schaum zu erhalten. 31P-NMR (400 MHz, DMSO-d6) ? 148,88, 148,78.

Beispiel 36. Herstellung von N4-Acetyl-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxyoxycarbonyl]-2'-desoxycytidin-3'-O-(?-cyanoethoxy, N,N-diisopropyl)phosphoramidit

Bis(diisopropylamino)-?-cyanoethoxyphosphan (7,69 g, 26 mmol) wurde einer L?sung von N4-Acetyl-5'-O-[2-(5-benzoyl-2-nitrophenyl)-1-propyl-oxycarbonyl]-2'-desoxycytidin (9,89 g, 17 mmol) und DCI (1,00 g, 9 mmol) in Dichlormethan (100 mL) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden bei Umgebungstemperatur ger?hrt, dann mit Hexan (120 mL) verd?nnt und durch ein Kieselgelbett in einer S?ule (43 g Kieselgel, Durchmesser 3 cm) filtriert. Die S?ule wurde mit einem Gradienten von Hexan/Ethylacetat (1:1, v/v) zu Ethylacetat eluiert. Die Produktfraktionen wurden in vacuo auf ein Volumen von ca. 100 mL konzentriert und dann langsam bei kr?ftigem R?hren in Hexan (1,5 L) gegossen, um das Produkt auszuf?llen. Der Niederschlag wurde getrennt, in einer kleinen Menge Ethylacetat gel?st und ein zweites Mal in der gleichen Weise ausgef?llt. Der Niederschlag wurde wieder getrennt, in Dichlormethan gel?st und in vacuo konzentriert, um das Produkt in einer Ausbeute von 88% (11,69 g) als farblosen Schaum zu erhalten. 31P-NMR (400 MHz, DMSO-d6) ? 149,00.

Beispiel 37. Untersuchungen der Entsch?tzung in L?sung

Die in L?sung zu photolysierenden Verbindungen wurden entweder in 1:1- (v/v) oder 95:5-Mischungen (v/v) von Methanol/Wasser bzw. Acetonitril/Wasser bei Konzentrationen von 0,1 bis 0,3 mM gel?st. Wegen ihrer geringeren L?slichkeit wurden alle Guanosin-Derivate in 3:2- (v/v) statt 1:1-Mischungen (v/v) von Methanol oder Acetonitril in Wasser gel?st. Die L?sungen wurden in einer Quarzk?vette mit 10 mm Wegl?nge von einer Superhochdruck-Quecksilberlampe (Osram Sylvania Inc., Danvers, MA, USA) als Lichtquelle (200 W) mit Lichtb?ndelung bestrahlt, die mit einem Polarisationsfilter, einem UV-Filter (f?r ein schmales Spektralband bei der gew?nschten Wellenl?nge von 365 nm) und einem elektronischen Verschluss ausgestattet war, um genaue Belichtungszeiten zu gew?hrleisten. Die L?sungen wurden w?hrend der Messungen auf 17?C eingestellt und mit einem Magnetr?hrer gemischt. Bei jeder Beleuchtungsdauer wurde ein aliquoter Teil von 3 mL verwendet und danach durch Umkehrphasen-HPLC (20 bis 100% CH3CN f?r 30 Minuten, photometrische Erfassung bei 260 nm) analysiert. Die prim?ren Photolyse-Produkte wurden durch Koinjektion authentischer Standards identifiziert; nach der Photolyse wurde das Verschwinden des Ausgangsmaterials ?berwacht, und die Halbwertszeiten wurden mittels linearer Regressionsanalyse durch Aufzeichnen der Fl?chenwerte der Peaks im Vergleich zur Zeit berechnet. Die Ergebnisse f?r einige Nukleoside, die verschiedene photolabile Schutzgruppen tragen, sind in den Tabellen 1, 2 und 3 dargestellt.

Beispiel 38. Untersuchungen der Entsch?tzung in trockenem Zustand

Die in trockenem Zustand zu photolysierenden Verbindungen wurden zuerst in einem geeigneten L?semittel gel?st, um 1-mM-L?sungen zu erhalten. 5 ?L jeder L?sung wurden auf eine Polystyrol-Oberfl?che aufpipettiert; das L?semittel wurde dann entfernt. Die getrockneten Verbindungen wurden direkt bestrahlt, wobei die Einrichtung wie die in Beispiel 37 beschriebene eingestellt war, allerdings mit einer 100-W-Hochdruck-Quecksilberlampe (Osram Sylvania Inc., Danvers, MA, USA) und ohne Polarisationsfilter. Die Proben jeder Verbindung wurden ?ber verschiedene Zeitr?ume beleuchtet, und die resultierenden Mengen des Edukts und der entblockierten Nukleoside wurden durch HPLC bestimmt (wie in Beispiel 37 beschrieben). Die Ergebnisse mehrerer verschiedenartig gesch?tzter Desoxythymidine sind in 2, die die Rate der photolytischen Zersetzung der gesch?tzten Desoxythymidine zeigt, und in 3 dargestellt, die die Bildungsrate der Desoxythymidine zeigt.

Beispiel 39. Silanisierung, von Glastr?gern

Erie-Gold-Seal-Mikroskop-Objektr?ger (Fisher, Hanover Park, IL, USA), die in den ungeradzahligen Schlitzen eines Objekttr?gergestells aus Edelstahl angeordnet waren, wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer w?ssrigen Natriumhydroxid-L?sung (10%, w/v) inkubiert. Die Glastr?ger wurden dann in zwei Schalen voll entsalzten Wassers gesp?lt (2,5 Minuten in jedem Bad) und danach in eine w?ssrige Bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan-L?sung (2%, v/v) (United Chemical Technologies, Bristol, PA, USA) gebracht, 1 Stunde gesch?ttelt, nach dem Silanbeschichten 5 Minuten in 95%-igem Ethanol gesp?lt, dann sofort in Ether eingetaucht und an der Luft getrocknet. Sobald die Objekttr?ger ganz trocken waren, wurden sie 15 Minuten bei 100?C thermisch behandelt und unmittelbar danach in trockener Atmosph?re bei ?20?C gelagert.

Beispiel 40. On-Chip-Untersuchungen der Entsch?tzung in L?sung

Ma?geschneiderte Arrays dienten dazu, die Entsch?tzungsraten bei den Schutzgruppen der Erfindung im Vergleich mit denen der dem Stand der Technik entsprechenden photolabilen Schutzgruppen MeNPOC und NPPOC zu untersuchen, und zwar mit und ohne Zusatz eines Sensibilisators zum bestrahlten L?semittel. Die Arrays wurden wie in Beispiel 40 beschrieben mit einem einzigen Zyklus der DNA-Synthese f?r den silanisierten Glastr?ger hergestellt; dann wurden definierte Bereiche mit verschiedenen Bestrahlungsdosen beleuchtet. Cy3-Amidit (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) wurde an den Array gekuppelt, um ein relatives Ma? freier Hydroxylgruppen zu erhalten. Der Array wurde anschlie?end entfernt und 2 Stunden in einer Entsch?tzungsl?sung ? Ethylendiamin/Ethanol (1:1, v/v) ? platziert. Die Arrays wurden dann an einem Axon 4000B (Axon Instruments, Union City, CA, USA) gescannt.

Beispiel 41. On-Chip-Untersuchungen der Entsch?tzung in trockenem Zustand

Diese Versuche wurden wie in Beispiel 41 beschrieben durchgef?hrt, au?er dass vor der Bestrahlung w?hrend des Entsch?tzungsschritts alles L?semittel aus der Flie?zelle entfernt und der Tr?ger mit einem Argonstrom getrocknet wurde.

Beispiel 42. Array-Synthese

Standard-DNA-Synthese-Reagenzien (Glen Research, Sterling, VA, USA, und Proligo, Boulder, CO, USA) wurden an Expedite-DANN-Synthesizern (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) verwendet. Die NPPOC-gesch?tzten Phosphoramidite 5'-NPPOC-desoxyadenosin-[N6-Tab]-?-cyanoethoxy-phosphoramidit, 5'-NPPOC-desoxycytidin-[N4-isobutyryl]-?-cyanoethocy-phosphoramidit, 5'-NPPOC-desoxyguanosin-[N2-Ipac]-?-cyanoethoxy-phosphoramidit und 5'-NPPOC-desoxythymidin-?-cyanoethoxyphosphoramidit stammten von Proligo, w?hrend die die Schutzgruppen der Erfindung umfassenden Phosphoramidite wie oben beschrieben synthetisiert wurden. Das MAS-Ger?t (NimbleGen Systems, Madison, WI, USA) wurde ?ber eine den Tr?ger enthaltende Flie?zelle mit dem Expedite-Ger?t verbunden, um die ma?geschneiderten Arrays herzustellen. Die Arrays wurden mit JazzSuite-Software (NimbleGen Systems) entworfen. Nachdem die Synthese am MAS vollendet war, wurden die basengesch?tzten Gruppen 2 Stunden in einer L?sung von Ethylendiamin/Ethanol (1:1 v/v; Aldrich) entfernt. Die Arrays wurden mit Wasser gesp?lt, getrocknet und bis zu ihrer Verwendung trocken gelagert. Tabelle 1. Photolyse-Halbwertszeiten von 5'-NPPOC-gesch?tzten Desoxynukleosiden im Vergleich zur bekannten NPPOC-Gruppe, gemessen in w?ssrigen methanolischen L?sungen (in Beispiel 37 beschrieben).Tabelle 2. Photolyse-Halbwertszeiten von 5'-NPPOC-gesch?tzten Desoxynuldeosiden im Vergleich zur bekannten NPPOC-Gruppe, gemessen in w?ssrigen Acetonitril-L?sungen (in Beispiel 37 beschrieben).Tabelle 3. Photolyse-Halbwertszeiten von 5'-Bz-NPPOC-gesch?tzten Desoxynukleosiden im Vergleich zur jeweiligen Halbwertszeit von NPPOC-dT (26), gemessen in w?ssrigen Methanol- bzw. Acetonitril-L?sungen (in Beispiel 37 beschrieben).

EintragVerbindungL?semittelt1/2 (Sekunden)15'-Bz-NPPOC-dT (28)Methanol mit 5% H2O1,9Acetonitril mit 5% H2O1,825'-Bz-NPPOC-dA(bz) (29)Methanol mit 5% H2O2,4Acetonitril mit 5% H2O1,935'-Bz-NPPOC-dC(ac) (30)Methanol mit 5% H2O1,8Acetonitril mit 5% H2O1,545'-(2-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (31)Methanol mit 5% H2O1,9Acetonitril mit 5% H2O1,755'-(3-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (32)Methanol mit 5% H2O1,6Acetonitril mit 5% H2O1,965'-(4-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (33)Methanol mit 5% H2O1,6Acetonitril mit 5% H2O2,075'-NPPOC-dT (26)Methanol mit 5% H2O5,0
Tabelle 4. Photolyse-Halbwertszeiten von 5'-Bz-NPPOC-gesch?tzten Desoxynuldeosiden im Vergleich zur jeweiligen Halbwertszeit von NPPOC-dT (26), gemessen unter trockenen Bedingungen (in Beispiel 38 beschrieben).EintragVerbindungt1/2 (Sekunden)15'-Bz-NPPOC-dT (28)6,025'-Bz-NPPOC-dA(bz) (29)6,035'-Bz-NPPOC-dC(ac) (30)6,045'-(2-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (31)6,055'-(3-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (32)6,065'-(4-Fluor-Bz)-NPPOC-dT (33)7,875'-NPPOC-dT (26)14,0
Tabelle 5. Mittlere Zyklusausbeuten bei tr?gergebundenen dT12-Arrays, die wie in Beispiel 40 beschrieben anhand des Protokolls f?r trockene Entsch?tzung (in Beispiel 42 beschrieben) hergestellt wurden.5'-SchutzgruppeBestrahlungszeit (Sekunden)Mittlere Zyklusausbeute (%)Bz-NPPOC18863590NPPOC6581MeNPOC5886

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Es zeigen:

1A?C: HPLC-Chromatogramme, die die Photolyse von 5'-tBuC-NPPOC-desoxythymidin (25) in Methanol/Wasser (1:1, v/v) bei Bestrahlung bei 365 nm (in Beispiel 37 beschrieben) nach 0 Sekunden (1A), 60 Sekunden (1B) und 600 Sekunden (1C) analysieren;

2: die Zeitabh?ngigkeit der photolytischen Zersetzung von Desoxythymidinen, die durch photosensitive Schutzgruppen der Erfindung bzw. des Stands der Technik gesch?tzt sind, von der Bestrahlung bei 365 nm unter trockenen Bedingungen, wobei wie in Beispiel 38 beschrieben gemessen wurde;

3: die Zeitabh?ngigkeit der photolytischen Freisetzung von Desoxythymidin bei den photosensitiv-gesch?tzten Desoxythymidinen der Erfindung bzw. des Stands der Technik von der Bestrahlung bei 365 nm unter trockenen Bedingungen, womit ein weiterer Aspekt des gleichen Versuchs ber?cksichtigt wird, der in 2 analysiert und nach Beispiel 38 durchgef?hrt wurde;

4: die Abh?ngigkeit der photolytischen Freisetzung von Desoxythymidin in L?sung bei tr?gergebundenen Desoxythymidinen, die durch photosensitive Schutzgruppen der Erfindung bzw. des Stands der Technik gesch?tzt sind, von der Bestrahlungsenergie, die linear mit der Bestrahlungszeit in Bezug steht, wobei wie in Beispiel 40 beschrieben gemessen wurde; und

5: die Abh?ngigkeit der photolytischen Freisetzung von Desoxythymidin unter trockenen Bedingungen bei tr?gergebundenen Desoxythymidinen, die durch photosensitive Schutzgruppen der Erfindung bzw. des Stands der Technik gesch?tzt sind, von der Bestrahlungsenergie, die linear mit der Bestrahlungszeit in Bezug steht, wobei wie in Beispiel 41 beschrieben gemessen wurde.