Title:
Untersuchungsverfahren zur Phagozytose
Kind Code:
B4


Abstract:

Verfahren zur Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
– Bereitstellen von mit Fluoreszenz markierten Partikeln, die mindestens ein pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid aufweisen,
– Inkubieren der markierten Partikel mit den Zellen,
– fluoreszenzmikroskopische, fluorimetrische und/oder fluoreszenzzytometrische Analyse der Zellen,
wobei die Fluoreszenz zumindest teilweise über mindestens 12 Stunden detektierbar ist.




Inventors:
Schneider, Marion (Ulm, 89075, DE)
Wiedenmann, Jörg (Ulm, 89077, DE)
Application Number:
DE10361243
Publication Date:
07/12/2007
Filing Date:
12/22/2003
Assignee:
Universität Ulm (Ulm, 89073, DE)



Other References:
MASELLI, A. u.a.: Kinetics of binding, uptake and
degradation of live fluorescent (DsRed) bacteria
by Dictyostelium discoideum, Microbiology (2002)
148 (Pt2) 413-20;
BAIRD, G.S. u.a.: Biochemistry, mutagenesis, and
oligomerization of DsRed, a red fluorescent
protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(2000) 97 (22) 11984-9;
Internetdokument, Adresse www.orpegen.com/HP/
Support/Manuals/phagotst.pdf zu: PHAGOTEST,
Version 7/96, operators Manual;
Attorney, Agent or Firm:
Patentanwälte Ruff, Wilhelm, Beier, Dauster & Partner (Stuttgart, 70174)
Claims:
1. Verfahren zur Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
– Bereitstellen von mit Fluoreszenz markierten Partikeln, die mindestens ein pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid aufweisen,
– Inkubieren der markierten Partikel mit den Zellen,
– fluoreszenzmikroskopische, fluorimetrische und/oder fluoreszenzzytometrische Analyse der Zellen,
wobei die Fluoreszenz zumindest teilweise über mindestens 12 Stunden detektierbar ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Säugerzellen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen myeloische Zellen, Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, Endothelzellen, dendritische Zellen und/oder Vorstufen dieser Zellen sind.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Bakterien, Cyanobakterien, Pilze, Viren und/oder eukaryontische Zellen, insbesondere Tumorzellen, und/oder Fragmente davon sind.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel infektiöse Partikel sind.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Bakterien sind, insbesondere Escherichia coli und/oder Staphylococcus spec.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Peptid das grün fluoreszierende Protein aus Aequorea victoria oder ein davon ableitbares Protein oder Peptid ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Peptid ein Protein oder Peptid mit einem Fluorophor aus mindestens drei Aminosäuren ist, wobei vorzugsweise die zweite Aminosäure Tyrosin und/oder die dritte Aminosäure Glycin ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Peptid ein fluoreszierendes Phycobiliprotein, insbesondere Phycoerythrin, ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Peptid bei saurem pH-Wert eine Abnahme der Fluoreszenz zeigt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein oder Peptid ein fluoreszierendes Protein oder Peptid ist, welches eine erhöhte Sensitivität gegenüber Proteasen und/oder reaktiven Sauerstoffspezies zeigt, wobei vorzugsweise das fluoreszierende Protein oder Peptid bei Anwesenheit von Proteasen und/oder bei Einwirkung von reaktivem Sauerstoffspezies eine Abnahme der Fluoreszenz zeigt.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens ein natürlicherweise exprimiertes pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid aufweisen.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel autofluoreszierende Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, Cyanobakterien und/oder Algen, insbesondere Dinoflagellaten, und/oder Fragmente davon sind.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens ein rekombinant exprimiertes pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid aufweisen.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Bereitstellen von mit Fluoreszenz markierten Partikeln mindestens ein fluoreszierendes Protein oder Peptid innerhalb der Partikel exprimiert wird.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Bereitstellen von mit Fluoreszenz markierten Partikeln mindestens ein fluoreszierendes Protein oder Peptid, vorzugsweise Phycoerythrin, an die Partikel gebunden wird.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Bereitstellen von mit Fluoreszenz markierten Partikeln mindestens ein fluoreszierendes Protein oder Peptid mit Peptiden und/oder Proteinen der Partikel gekoppelt, insbesondere fusioniert, wird.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens zwei pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide, insbesondere ein natürlicherweise exprimiertes und mindestens ein rekombinant exprimiertes pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid, aufweisen.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel mindestens zwei unterscheidbare Fluoreszenzen zeigen.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die unterscheidbaren Fluoreszenzen durch die intrazelluläre Aktivität der zu untersuchenden Zellen unterschiedlich beeinflusst werden.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die unterscheidbaren Fluoreszenzen unterschiedliche Stabilitäten aufweisen.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die unterscheidbaren Fluoreszenzen durch mindestens zwei Proteine und/oder Peptide bewirkt werden.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die unterscheidbaren Fluoreszenzen durch unterscheidbare fluoreszierende Zustände eines Proteins oder Peptids bewirkt werden.

24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Untersuchung der Präsentation von Fragmenten von phagozytierten Partikeln Fragmente mindestens eines fluoreszierenden Proteins oder Peptids und/oder Fragmente von mindestens einem mit einem fluoreszierenden Protein oder Peptid fusionierten Peptid und/oder Protein analysiert werden.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die präsentierten Fragmente mit Antikörpern und/oder mit zellulären Rezeptoren nachgewiesen werden.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die präsentierten Fragmente mit Fluoreszenz markiert sind.

27. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26 zum Screening und/oder zur Charakterisierung von immunstimulierenden oder immunsuppressiven Substanzen.

28. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26 zum Screening und/oder zur Charakterisierung von Substanzen, welche die Phagozytose, Prozessierung und/oder Präsentation von Bakterien, Viren und/oder Tumorzellen und/oder deren Fragmenten beeinflussen.

29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzen die Phagozytose, Prozessierung und/oder Präsentation von Bakterien, Viren und/oder Tumorzellen und/oder deren Fragmente steigern oder hemmen.

30. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Diagnose und/oder Überwachung einer Therapie von Immundefekten.

31. Reagenzien-Kit zur Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren, mindestens umfassend
– mit Fluoreszenz markierte Partikel, die mindestens ein pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid aufweisen,
wobei die Fluoreszenz zumindest teilweise über mindestens 12 Stunden detektierbar ist.

32. Reagenzien-Kit nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Partikeln um Bakterien, Cyanobakterien, Pilze, Viren und/oder eukaryontische Zellen und/oder Fragmente davon handelt.

33. Reagenzien-Kit nach einem der Ansprüche 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel mindestens zwei unterscheidbare Fluoreszenzen zeigen.

Description:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren.

Ein wichtiger Bestandteil der Immunantwort von Säugetieren sind Aufnahme, Abbau und Prozessierung von Krankheitserregern, von toten oder aberranten Körperzellen und anderen Fremdsubstanzen. Hierbei werden die als körperfremd bzw. unerwünscht erkannten Partikel durch bestimmte Zellen im Blut aufgenommen und intrazellulär abgebaut. Die zu dieser sogenannten Phagozytose befähigten Zellen umfassen im wesentlichen myeloische Zellen, Makrophagen, Granulozyten, Monozyten, Endothelzellen und dendritische Zellen sowie von diesen Zelltypen abgeleitete Vorläufer und Differenzierungsprodukte.

Voraussetzung für die Phagozytose der unerwünschten Partikel ist, dass die zur Phagozytose befähigten Zellen den Partikel binden und als „unerwünscht" erkennen. Nur dann wird der Partikel von der Zelle umschlossen und aufgenommen. Ein wichtiger Faktor für die Erkennung der Partikel ist die sogenannte Opsonisierung, bei welcher an die Oberfläche der Partikel Opsonine, d. h. z. B. Antikörper oder Komplemente, gebunden werden. Die aufgenommenen Partikel werden von den entsprechenden Zellen zu Fragmenten abgebaut und im Kontext mit Molekülen der Klasse MHC-Klasse II und in Einzelfällen auch der MHC-Klasse I als Antigene wieder an der Oberfläche präsentiert. Dieser als Prozessierung bezeichnete Abbauprozess erfolgt vor allem mittels Modifikation bzw. Abbau durch pH-abhängige Denaturierung, durch reaktive Sauerstoffspezies und/oder Proteolyse. Diese Prozessierungsreaktionen werden von Enzymen der entsprechenden Immunzellen getragen.

Nach erfolgter Erkennung, Phagozytose und Prozessierung werden die modifizierten und fragmentierten Fremdpartikel von den antigenpräsentierenden Zellen an der Zelloberfläche für darauffolgende Prozesse der Immunreaktion zugänglich gemacht.

Eine Störung der Immunantwort kann also in der Opsonisierung, der Phagozytose, der Prozessierung und/oder in der Antigenpräsentation liegen. Entsprechende Erkrankungen, die auf solchen Defekten des Immunsystems beruhen, können sich beispielsweise durch fehlende Immunreaktion auf Pathogene oder aber auch durch eine immunologische Überreaktion äußern. Diese Defekte können sich daher z. B. als Immuninsuffizienz, Tumorbildung, Allergie oder Autoimmunerkrankung manifestieren. Diese Erkrankungen können beispielsweise durch Gendefekte, welche die Funktionsfähigkeit der beteiligten Enzyme beeinträchtigen können, oder durch eine gestörte Regulation der beteiligten Enzyme, z. B. als Folge einer Infektion, verursacht werden. Als mögliche Therapie kommt hierfür entweder eine Stimulierung des Immunsystems oder eine Suppression der Immunreaktion in Frage. Diese Therapien erfordern jedoch eine präzise Diagnose der zugrundeliegenden Anomalie(n), da jeder Eingriff in das Immunsystem sehr weitreichende Folgen hat und eine entsprechende Therapie daher so gezielt wie möglich eingreifen soll. Daher ist sowohl für die Diagnose und Erforschung derartiger Krankheiten als auch für die Suche nach therapeutisch einsetzbaren Substanzen, die beispielsweise als Immunstimulanzien wirken, eine genaue Untersuchung der in diesem Bereich der Immunantwort ablaufenden Prozesse erforderlich. Weiterhin spielt eine Untersuchung dieser Prozesse auch bei der Analyse potentiell pathogener Agenzien, wie z. B. Allergene, sowie auch für eine Überwachung und Überprüfung möglicher Auswirkungen bei einer therapeutischen Behandlung eine wichtige Rolle.

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Untersuchung der Phagozytoseleistung von Immunzellen beschrieben worden. Beispielsweise wurden Vollblut oder isolierte Granulozyten mit Mikroorganismen oder Teilchen inkubiert, die selbst mit fluoreszierenden Substanzen markiert waren. Durch anschließende Messung der aufgenommenen Fluoreszenz konnten Rückschlüsse auf die Phagozytoseaktivität gezogen werden. In der EP 0 435 226 B1 wird beispielsweise ein Verfahren beschrieben, bei welchem Säugerleukozyten im Vollblut mit fluoreszenzmarkierten Gramnegativen Bakterien inkubiert werden. Als Fluoreszenzfarbstoff wird hier FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat) eingesetzt. Eine Phagozytoseaktivität konnte hier durch einen Anstieg der Fluoreszenz in den phagozytierenden Granulozyten und Monozyten nachgewiesen werden.

In der Veröffentlichung von A. Maselli, G. Laevsky und D. A. Knecht [Microbiology 2002, 148, 413-420] wird ein Phagozytosetest für Dictyostelium discoideum beschrieben, wobei Escherichia coli Bakterien als zu phagozytierende Partikel verwendet werden, die das fluoreszierende Protein DsRed exprimieren.

Durch derartige Verfahren können Störungen diagnostiziert werden, welche die Aufnahme von als körperfremd bzw. als unerwünscht erkannten Partikeln, also die Phagozytose im eigentlichen Sinne, betreffen. Die diagnostizierbaren Störungen liegen vor allem im Bereich der unspezifischen Immunität, bei welcher Monozyten und Granulozyten unerwünschte Partikel aufnehmen und abbauen, um sie zu eliminieren. Störungen in den nachfolgenden Prozessen, also insbesondere der Prozessierung der aufgenommenen Partikel sowie der nachfolgenden Präsentation auf der Oberfläche der phagozytierenden Zellen, werden mit herkömmlichen Verfahren nicht erkannt. Insbesondere Störungen der dendritischen Zellen, die vor allem für die Antigenpräsentation als Vorraussetzung für eine Induktion der primären zytotoxischen T-Zellantwort verantwortlich sind, werden hiervon nicht erfasst.

Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem die der Phagozytose nachgeschalteten Prozesse, also insbesondere die Prozessierung und die Antigenpräsentation, untersucht werden können. Mit diesem Verfahren soll vor allem eine Diagnostizierbarkeit entsprechender Krankheiten ermöglicht werden, um dann den Defekt gegebenenfalls gezielt zu therapieren. Insbesondere sollen mit dem neuen Verfahren Störungen der dendritischen Zellfunktionen erfasst werden, die für die Generierung einer primären zytotoxischen T-Zellantwort entscheidend sind. Mit dem neuen Verfahren sollen also zunächst die zellulären Initiatoren einer spezifischen Immunantwort detektiert werden können. Hierbei handelt es sich insbesondere um Makrophagen, sowie um die verschiedenen Vertreter der dendritischen Zellreihe, wie beispielsweise lymphoide und myeloide dendritische Zellen, sowie deren im Blut zirkulierende phänotypisch definierbare Entwicklungsstadien. Diese verschiedenen Zellen sind für die Sensibilisierung und Rekrutierung von Gedächtniszellen der spezifischen Immunität verantwortlich und sind daher wichtige Zielpunkte, um eventuelle Störungen zu diagnostizieren bzw. zu therapieren.

Im weiteren soll mit dem neuen Verfahren vor allem die Fähigkeit zur Prozessierung dieser verschiedenen phagozytierenden Zellen sowie deren Fähigkeit zur Antigenpräsentation untersucht werden können bzw. sollen entsprechende Störungen detektierbar sein. Mit dem neuen Verfahren soll daher die Diagnostik von klinischen Krankheitsbildern, insbesondere von schweren Krankheitsbildern, ermöglicht werden, welche auf Defekten des molekularen „Traffickings" beruhen, wobei die Phagozytose von Fremdpartikeln, infektiösen Erregern oder Agenzien, toten oder aberranten körpereigenen Zellen, wie z. B. Tumorzellen, und die nachfolgende Prozessierung und Präsentation dieser Partikel gestört oder beeinträchtigt ist.

Im weiteren soll mit dem neuen Verfahren ein Screening und/oder eine Analyse von potentiellen therapeutisch wirksamen Substanzen, welche die Immunantwort in gewünschter Weise verändern, ermöglicht werden. Weiterhin sollen mit dem neuen Verfahren die Auswirkungen von therapeutischen Eingriffen bei Störungen der Immunantwort untersucht und analysiert werden können. Darüber hinaus soll mit dem neuen Verfahren ein Screening und/oder eine Analyse von potentiellen pathogenen oder allergenen Substanzen ermöglicht werden, welche Störungen in den erwähnten Prozessen der Immunantwort bewirken.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, wie es in Anspruch 1 beschrieben ist. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 26 dargestellt. Die Ansprüche 27 bis 30 betreffen verschiedene Verwendungen dieses Verfahrens. Die Ansprüche 31 und 33 beanspruchen einen Reagenzien-Kit, welcher zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient der Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren. Hierfür werden zunächst Partikel bereitgestellt, die durch Fluoreszenz markiert sind. Diese Partikel enthalten mindestens ein pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid. Die markierten Partikel werden mit den Zellen inkubiert, deren Aktivität untersucht werden soll. Die Analyse der Zellen erfolgt durch fluoreszenzmikroskopische, fluorimetrische und/oder fluoreszenzzytometrische Methoden. Entscheidend für dieses Verfahren ist, dass die Fluoreszenz zumindest teilweise über mindestens 12 Stunden detektierbar ist. Die zeitliche Persistenz der Fluoreszenz ist von den jeweils gewählten experimentellen Bedingungen abhängig. Beispielsweise hat die Aktivität der Zellen einen Einfluss auf die Detektierbarkeit der Fluoreszenz. Von daher stellt die Zeitangabe von 12 Stunden einen Anhaltspunkt dar, der gewissen Schwankungen unterliegen kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht also auf der Aufnahme von phagozytierbaren Partikeln, die beispielsweise einen Modellerreger repräsentieren. Diese Partikel sind durch pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide und insbesondere durch fluoreszierende Proteine markiert, so dass durch die Phagozytose dieser fluoreszierenden Partikel eine Akkumulation der Fluoreszenz im Zellinneren sichtbar und quantifizierbar wird. Im Verlauf der Prozessierung der Partikel bzw. der Modellerreger nimmt die Fluoreszenz im Zellinneren durch den zellspezifischen Abbau der pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide oder deren Inaktivierung ab. Liegt bei den zu untersuchenden Zellen beispielsweise eine Störung der Prozessierungskapazität nach erfolgter Phagozytose vor, findet im Vergleich zu geeigneten Kontrollzellen keine Abnahme der Fluoreszenz im Zellinneren statt, so dass hierdurch Rückschlüsse auf die Prozessierungsaktivität bzw. die Prozessierungskapazität gezogen werden können. Daneben kann selbstverständlich auch eine Störung der Phagozytoseaktivität festgestellt werden, bei welcher im Vergleich mit Kontrollen im Zellinneren verminderte oder fehlende Fluoreszenz beobachtet wird. Darüber hinaus kann die Fähigkeit der Zellen untersucht werden, die phagozytierten Partikel nach einer Fragmentierung auf der Oberfläche zu präsentieren, welches die Voraussetzung für die Ausbildung der spezifischen Immunität darstellt. Die für dieses Verfahren eingesetzte Fluoreszenz ist zumindest teilweise über mindestens 12 Stunden detektierbar. Das heißt, dass die verwendete Fluoreszenz nach 12 Stunden in den Zellen noch nachweisbar ist, soweit nicht zelluläre Einflüsse einen Abbau der Fluoreszenz bewirken.

Vorteilhafterweise handelt es sich bei den zu untersuchenden Zellen um Zellen, die zur Phagozytose in der Lage sind. Besonders geeignet sind Säugerzellen, insbesondere Zellen des Immunsystems. Vorteilhafterweise handelt es sich um myeloische Zellen, also Zellen, deren Vorstufen im Knochenmark generiert werden, sowie Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, Endothelzellen und dendritische Zellen. Insbesondere die dendritischen Zellen sind für das erfindungsgemäße Verfahren von besonderem Interesse, da dies äußerst potente antigenpräsentierende Zellen sind, die im wesentlichen die primäre zytotoxische T-Zellantwort induzieren und für die Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg) verantwortlich sind. Weiterhin können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren von diesen Zellen abgeleitete Differenzierungsprodukte und/oder Vorstufen bzw. Vorläufer dieser Zellen untersucht werden. Andererseits können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch andere Zellen untersucht werden, soweit sie phagozytotisch aktiv sind, beispielsweise Schleimpilze, einzellige niedere Organismen oder ähnliches.

Die Detektion der Fluoreszenz bzw. der pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide im Zuge der Analyse der Zellen kann sowohl lichtmikroskopisch als auch fluoreszenzmikroskopisch und insbesondere durch automatisierte Verfahren erfolgen. Besonders bevorzugt ist hierbei die Durchflusszytometrie oder die Fluorimetrie, insbesondere in Plattenmessgeräten.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die markierten Partikel bzw. die Modellerreger mit Zellen im Vollblut oder in isolierter Form vorteilhafterweise in einer Weise inkubiert, die einen Ablauf normaler physiologischer Vorgänge ermöglicht. Hierfür werden beispielsweise geeignete Pufferlösungen eingesetzt, welche für ein physiologisches Milieu sorgen. Während dieser Inkubation werden die markierten Partikel von den Zellen entsprechend ihrer Phagozytoseaktivität aufgenommen, so dass die Zellen nach erfolgter Phagozytose durch die Fluoreszenz der aufgenommenen Partikel markiert sind. Bereits diese Phagozytoseaktivität der zu untersuchenden Zellen kann durch entsprechende Analyse der Fluoreszenz der Zellen, beispielsweise durch Verwendung eines Fluoreszenzzytometers oder durch fluorimetrische Plattenmessgeräte, ausgewertet werden. Im weiteren Verlauf des Verfahrens bzw. der Inkubation befinden sich die phagozytierten Partikel innerhalb der zu untersuchenden Zellen und treten hier mit dem Degradationsapparat der Zellen in Kontakt. Der Abbau bzw. die Degradation oder Fragmentierung der aufgenommenen Partikel hängt von der Fusion der primären Endosomen, innerhalb welcher die phagozytierten Partikel zunächst eingeschlossen sind, mit Lysosomen in den phagozytierenden Zellen ab. Diese Lysosomen sind mit unterschiedlichen Enzymen ausgerüstet, welche unter anderem die Zerstörung bzw. Fragmentierung der phagozytierten Partikel und der Bestandteile der Partikel bewirken. Bei einem typischen Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens sind zunächst die Partikel bzw. die Modellerreger nach erfolgter Phagozytose unter dem Fluoreszenzmikroskop noch als granuläre Strukturen erkennbar. Erfolgt im weiteren Verlauf der Prozessierung ein weiterer Abbau des Partikels, so verteilt sich das Fluoreszenzsignal scheinbar gleichmäßig im Zytoplasma der phagozytierenden Zelle. Diese Analysierbarkeit des weiteren Schicksals der phagozytierten Partikel stellt einen besonderen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, da dies bei herkömmlichen Verfahren nicht möglich ist.

Das Schicksal eines Partikels nach erfolgter Phagozytose in der Zelle hängt insbesondere von der Stabilität der zu prozessierenden Bestandteile bzw. der Proteine des Partikels ab. Hierfür spielen zunächst vor allem die biochemische Beschaffenheit des Proteins und weiterhin die Enzymaktivierung in der zu untersuchenden Zelle eine Rolle. Die Kinetik des Proteinabbaus wird durch eine Denaturierung in Folge der sauren pH-Bedingungen in den Lysosomen sowie durch eine Degradation bzw. einen Abbau in Folge von Proteolyse und/oder Oxidation beeinflusst.

Obwohl die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Fluoreszenz bzw. die entsprechenden pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide, wobei es sich hierbei im wesentlichen um fluoreszierende Proteine handelt, aufgrund ihrer Tertiärstruktur im wesentlichen stabil sind, kommt es bei funktionsfähigen phagozytierenden Zellen mit der Zeit zu einem Abbau der fluoreszierenden Proteine, insbesondere durch die Wirkung von saurem pH-Wert, reaktiven Sauerstoffspezies und/oder Proteasen. Die damit verbundene Zerstörung der Tertiärstruktur der fluoreszierenden Proteine bzw. der pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide führt zu einem Verlust der Fluoreszenz. Damit kann erfindungsgemäß die Kapazität der zur Phagozytose fähigen Zellen zum Abbau von Proteinen gezeigt und quantifiziert werden. Durch die Analyse der Zellen im Durchflusszytometer oder in anderen geeigneten Messgeräten kann diese Kapazität anhand des Fluoreszenzverlustes der zu untersuchenden Zellen quantifiziert werden. Dies erfolgt bevorzugt nach einer ausreichenden Inkubationszeit, innerhalb derer die entsprechenden Phagozytose- und Prozessierungsprozesse in der Zelle abgelaufen sind. Bevorzugterweise werden diese Inkubationszeiten standardisiert. Weiterhin können vorteilhafterweise unterschiedliche Inkubationszeiten eingesetzt werden, um so Rückschlüsse auf zeitliche Verläufe der entsprechenden Prozesse ziehen zu können.

Besondere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen in der Automatisierbarkeit des Verfahrens sowie in den kostengünstigen und einfachen Bereitstellungsmöglichkeiten für die benötigten Nachweissubstanzen.

Bei den Partikeln, die von den zu untersuchenden Zellen zu phagozytieren sind, handelt es sich vorteilhafterweise um membranumhüllte Strukturen. Hierbei können die Partikel beispielsweise eine Doppelmembran aufweisen, z.B. wie bei Eukaryonten, bestimmten Viren, artifiziellen Vesikeln oder Exosomen, oder eine Einzelmembran, wie z.B. bei Prokaryonten. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Partikel Rezeptoren aufweisen, die durch eine sogenannte Opsonisierung die Phagozytose erleichtern. In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Partikel Bakterien, Cyanobakterien, Pilze und/oder eukaryontische Zellen wie beispielsweise Tumorzellen, sowie von Tumorzellen abstammende Partikel, wie beispielsweise Exosomen oder Organellen, welche durch Fluoreszenz markiert sind. Weiterhin kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch die Phagozytose, Prozessierung und/oder Präsentation von Viren mit Vorteil untersucht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden synthetische Partikel, wie beispielsweise Lipidvesikel oder auch Latexkügelchen, eingesetzt. Diese Partikel dienen vor allem als Trägersubstanzen für die pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide bzw. Antigene, deren weitere Prozessierung im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens verfolgt wird.

Vorteilhafterweise handelt es sich bei den Partikeln um infektiöse Partikel, welche bei Immunreaktionen eine Rolle spielen. Um entsprechende Immunreaktionen zu untersuchen, können derartige infektiöse Partikel im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Andererseits kann es auch bevorzugt sein, wenn von derartigen Partikeln abgeleitete Partikel eingesetzt werden, die insbesondere für den Menschen nicht infektiös sind. Dies hat den Vorteil, dass hierdurch das erfindungsgemäße Verfahren ohne Sicherheitsrisiken durchgeführt werden kann. Um die wichtigsten infektiösen Partikel bzw. Erreger abzudecken, werden vorzugsweise folgende Modellerreger als Partikel im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt: Escherichia coli als Gram-negativer Erreger, der beispielsweise bei abdominalchirurgischen Eingriffen eine Rolle spielt, und/oder Staphylokokken als Vertreter Gram-positiver Erreger, welche insbesondere bei Pneumonien involviert sind. Andererseits können auch Viren verwendet werden, welche akute, chronische und/oder latente Infektionen auslösen können. Insbesondere für die Untersuchung von infektiösen Viren werden vorteilhafterweise rekombinante, nicht-infektiöse und/oder transformationsdefekte Organismen eingesetzt, die auf der Oberfläche beispielsweise Eigenschaften von häufigen Viren wie CMV oder EBV oder von Tumorantigenen exprimieren. Bei der Verwendung von eukaryontischen Zellen als Partikel kommen insbesondere solche Zellen in Frage, die in Säugerorganismen Tumore bilden können. Hierbei kann es sich beispielsweise auch um autologe Tumorzellen handeln, um durch das erfindungsgemäße Verfahren die Immunitätslage gegen einen Tumor zu prüfen. Neben den beispielhaft erwähnten Partikeln kommen auch jeweils Fragmente dieser Partikel für das erfindungsgemäße Verfahren in Frage.

Die Partikel bzw. die Modellerreger können sowohl im lebendigen und/oder funktionellen Zustand als auch im inaktivierten Zustand eingesetzt werden. Eine Inaktivierung kann z. B. durch Fixierung der eingesetzten Mikroorganismen erfolgen und hat den Vorteil, dass beispielsweise bei infektiösen Partikeln Sicherheitsrisiken weitgehend vermieden werden.

Für die Bereitstellung von mit Fluoreszenz markierten Partikeln können unterschiedliche pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide verwendet werden. Für den Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich grundsätzlich alle fluoreszierenden Proteine bzw. Peptide, die eine ausreichend langfristige Detektierbarkeit bzw. eine entsprechende Stabilität aufweisen. Neben natürlich vorkommenden fluoreszierenden Proteinen und Peptiden können auch solche Proteine und Peptide verwendet werden, die durch chemische und/oder molekularbiologische Methoden verändert wurden. Sowohl natürlich vorkommende als auch künstlich veränderte fluoreszierende Proteine oder Peptide können durch rekombinante Expression hergestellt und mit den zu phagozytierenden Partikeln verknüpft werden oder aber selbst innerhalb der Partikel durch rekombinante Expression exprimiert werden. Im folgenden soll unter dem Ausdruck „Protein" auch ein Peptid verstanden werden, selbst wenn dies nicht ausdrücklich erwähnt ist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid das grün fluoreszierende Protein aus Aequorea victoria oder ein davon ableitbares Protein oder Peptid eingesetzt. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise auf die deutsche Offenlegungsschrift DE 197 18 640 verwiesen, welche geeignete fluoreszierende Proteine beschreibt. Bisher wurden diese fluoreszierenden Proteine üblicherweise zum Nachweis der Lokalisation von Fusionsproteinen oder zur Messung der Genaktivität verwendet. Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide nun verwendet werden, um phagozytierbare Partikel, beispielsweise Bakterien oder andere Mikroorganismen, zu markieren. Weiterhin können mit diesen pH-sensitiven fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden auch eukaryontische Zellen, insbesondere Tumorzellen, markiert und für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden. Der besondere Vorteil bei der Verwendung dieses grün fluoreszierenden Proteins bzw. davon ableitbarer Proteine oder Peptide ist die außerordentliche Stabilität dieser Fluoreszenzfarbstoffe (Green Fluorescent Protein – Properties, Applications and Protocols. Martin Chalfie and Steven Kain (eds.). Wiley-Liss, New York, 1998). Das grün fluoreszierende Protein aus Aequorea victoria und davon ableitbare Proteine und Peptide sind daher aufgrund ihrer außerordentlichen Stabilität in besonderer Weise für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem pH-sensitiven fluoreszierenden Protein oder Peptid um ein Protein oder Peptid mit einem Fluorophor, welches aus mindestens drei Aminosäuren besteht. Hierbei handelt es sich bevorzugterweise bei der zweiten Aminosäure dieser mindestens drei Aminosäuren des Fluorophors um Tyrosin und/oder bei der dritten Aminosäure um Glycin. Die erste Position ist variabel.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das pH-sensitive fluoreszierende Protein oder Peptid ein Photosynthesepigment, z. B. Chlorophyll, oder akzessorische Photosynthesepigmente, wie beispielsweise Phycobiliproteine. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Phycoerythrin als pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem eingesetzten Fluoreszenzfarbstoff um ein pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid. Bestimmte Immundefekte gehen mit einem abnormalen pH-Milieu in den Lysosomen der phagozytierenden Zellen einher. Um solche Defekte nachweisen zu können, ist es besonders vorteilhaft, Partikel bzw. Modellerreger im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen, welche mit pH-sensitiven fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden markiert sind. Vorzugsweise zeigen solche fluoreszierenden Proteine oder Peptide bei saurem pH-Wert eine Abnahme der Fluoreszenz. Der Inhalt von Lysosomen zeigt im Normalfall einen sauren pH-Wert von etwa pH 4-5. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von pH-sensitiven fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden erfolgt daher bei normalem, sauren pH-Milieu in den Lysosomen eine unmittelbare Abnahme der Fluoreszenz nach Verschmelzung des primärem Endosoms mit den Lysosomen. Fehlt diese unmittelbare Abnahme der Fluoreszenz, kann auf ein abnormales pH-Milieu in den Lysosomen und einen entsprechenden Immundefekt geschlossen werden. Als besonders geeignetes pH-sensitives fluoreszierendes Protein kann das fluoreszierende Protein IhFP516/581 eingesetzt werden (Schmitt, F. (2003) Ein neuartiges von grün nach rot photokonvertierendes Fluoreszenzprotein aus der indopazifischen Steinkoralle Lobophyllia hemprichii, Ehrenberg, 1834 (Cnidaria, Anthozoa) Diplomarbeit, Universitätsbibliothek Ulm).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens ein natürlicherweise exprimiertes pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid auf. Besonders bevorzugt werden als Partikel autofluoreszierende Mikroorganismen eingesetzt, insbesondere Bakterien, Cyanobakterien (Blaualgen) und/oder Algen. Vorteilhaft sind hierbei insbesondere die Dinoflagellaten, vorzugsweise endosymbiontische Dinoflagellaten. Weiterhin können auch Fragmente dieser Partikel eingesetzt werden. Diese Auto- bzw. Eigenfluoreszenz der Mikroorganismen hat den Vorteil, dass diese Partikel ohne weitere Markierungsreaktionen eingesetzt werden können, da sie aus sich heraus die für das erfindungsgemäße Verfahren erforderliche Fluoreszenz aufweisen.

Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens ein rekombinant exprimiertes pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid aufweisen. Dies wird insbesondere durch eine autokatalysierte Bildung des Fluorophors in fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden ermöglicht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird hierbei mindestens ein fluoreszierendes Protein oder Peptid innerhalb der Partikel exprimiert. Es kann sich um Partikel handeln, die ein oder mehrere fluoreszierende Proteine oder Peptide natürlicherweise exprimieren oder aber auch um Partikel, bei welchen eine entsprechende Expression aufgrund von gentechnischer Manipulation erfolgt. Für eine geeignete rekombinante Expression der fluoreszierenden Proteine oder Peptide innerhalb der Partikel, insbesondere innerhalb der Modellerreger, wird die entsprechende kodierende DNA in der Weise in den Modellerreger eingebracht, dass ein Expression des Proteins oder Peptids im Organismus selbst möglich ist. Hierfür wird die entsprechende kodierende DNA beispielsweise unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors gestellt und insbesondere in Form eines geeigneten Vektors in den Organismus, der als Partikel eingesetzt wird, eingebracht. Vorzugsweise werden entsprechende Proteine oder Peptide stabil und über einen längeren Zeitraum exprimiert, so dass die Partikel ohne weitere Vorbereitung für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können. Andererseits kann es auch vorteilhaft sein, wenn die Partikel das oder die entsprechenden Proteine und/oder Peptide transient, also vorübergehend, exprimieren. In diesem Fall müssen die entsprechenden Partikel bzw. Modellerreger in der Regel vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit molekularbiologischen Methoden behandelt werden. Entsprechende Vorgehensweisen erschließen sich dem Fachmann.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden ein oder mehrere pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide an die Partikel gebunden, indem sie beispielsweise an die Oberfläche des Partikels angekoppelt werden. Hierfür können z. B. natürlich vorkommende fluoreszierende Proteine und/oder Peptide gereinigt bzw. angereichert werden, um sie sodann an die zu phagozytierenden Partikel mit herkömmlichen Methoden zu binden. Andererseits können auch rekombinant hergestellte fluoreszierende Proteine und/oder Peptide für diesen Zweck eingesetzt werden. Durch die Bindung an vergleichsweise große Partikel, die beispielsweise einen Durchmesser von 1-2 μm aufweisen, kann die Aufreinigung der fluoreszierenden Proteine und/oder Peptide und die Markierung der Partikel z. B. durch Filtrations- und/oder Zentrifugationstechniken vorteilhafterweise in einem Schritt erfolgen. Ein bevorzugtes Beispiel für eine Kopplung der fluoreszierenden Proteine oder Peptide ist eine Kopplung über Biotin-Streptavidin-Bindungen.

Besonders bevorzugt ist es, wenn fluoreszierende Proteine und/oder Peptide, insbesondere rekombinante Proteine und/oder Peptide, spezifisch an die Partikel gebunden werden. Beispielsweise erfolgt eine Bindung bzw. Immobilisierung der fluoreszierenden Proteine über metallaffine Peptidanhängsel, die insbesondere durch molekularbiologische Methoden an das fluoreszierende Protein angefügt sind. Derartige Peptidanhängsel (tags) werden üblicherweise in der Affinitätschromatographie verwendet. Ein Beispiel hierfür ist das sogenannte 6x-Histidin-Tag. Neben rekombinant hergestellten fluoreszierenden Proteinen und/oder Peptiden, die insbesondere noch weitere Funktionalitäten wie beispielsweise die genannten Peptidanhängsel tragen können, welche für eine Bindung an die Partikel bzw. eine Immobilisierung vorteilhaft sind, können auch natürlicherweise vorkommende fluoreszierende Proteine oder Peptide an entsprechende Partikel gebunden werden. Ein Beispiel hierfür ist das Phycobiliprotein Phycoerythrin.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide mit weiteren Peptiden und/oder Proteinen gekoppelt. Diese Kopplung erfolgt vorzugsweise durch eine Fusion der Peptide bzw. Proteine, so dass das pH-sensitive fluoreszierende Protein oder Peptid als Fusionsprotein exprimiert wird. Sollen beispielsweise Viren als Partikel bzw. Modellerreger verwendet werden, erfolgt deren Fluoreszenzmarkierung bevorzugterweise durch einen geeigneten Wirtsorganismus. Hierfür wird die genetische Information des Virus insoweit verändert, dass ein oder mehrere virale Proteine in Fusion mit fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden exprimiert werden. Auch die bereits erwähnte Kombination der fluoreszierenden Proteine oder Peptide mit Peptidanhängseln oder ähnlichem, welche eine Bindung der fluoreszierenden Proteine oder Peptide an die Partikel ermöglicht oder erleichtert, kann durch eine Fusion der fluoreszierenden Proteine oder Peptide mit entsprechenden Peptiden oder Proteinen erreicht werden, welche entsprechende Funktionalitäten bereits tragen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens zwei verschiedene pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide auf. Hierbei können entweder verschiedenartige Partikel jeweils unterschiedliche pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide tragen, oder aber eine Art von Partikeln weist verschiedene pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide auf. Besonders bevorzugt ist es, wenn eine Art von Partikeln, beispielsweise Bakterien, Cyanobakterien und/oder Algen, ein natürlicherweise exprimiertes pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid sowie mindestens ein rekombinant exprimiertes pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid aufweisen. Selbstverständlich werden von der Erfindung auch Partikel umfasst, die zwei oder mehr rekombinant exprimierte verschiedene pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide aufweisen.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die verschiedenen pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide insbesondere in Folge unterschiedlicher Emissionsspektren unterscheidbare Fluoreszenzen bewirken. Dies kann für verschiedene Aspekte des erfindungsgemäßen Verfahrens in vorteilhafter Weise ausgenutzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspektes reagieren die verschiedenen pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide, welche die unterscheidbaren Fluoreszenzen bewirken, unterschiedlich auf die intrazellulären Aktivitäten der zu untersuchenden Zellen. Beispielsweise wird eines dieser pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide, insbesondere eines der fluoreszierenden Proteine, schneller durch die intrazellulären Enzyme abgebaut als das andere fluoreszierende Protein. Dies kann dadurch verursacht sein, dass beispielsweise eines der fluoreszierenden Proteine bestimmte Schnittstellen für intrazelluläre Proteasen aufweist, wohingegen das andere Protein diese Schnittstellen nicht enthält. Weiterhin kann es sich beispielsweise bei einem der fluoreszierenden Proteine um ein pH-sensitives fluoreszierendes Protein handeln und bei dem anderen um ein Protein, welches von dem pH-Wert innerhalb der Zelle im wesentlichen unbeeinflusst ist. Darüber hinaus kann es sich bei einem der fluoreszierenden Proteine um ein Protein handeln, dessen Fluoreszenz bei Kontakt mit reaktiven Sauerstoffspezies schneller abnimmt als bei dem anderen Protein, dessen Fluoreszenz unter diesen Bedingungen weitgehend stabil bleibt.

Besonders bevorzugt ist es, dass die pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine oder Peptide bzw. insbesondere die fluoreszierenden Proteine, welche die unterscheidbaren Fluoreszenzen bewirken, unterschiedliche Stabilitäten aufweisen. Hierbei kann es sich beispielsweise um kompartimentspezifische Stabilitäten handeln. Die Bedingungen (z.B. pH-Wert, Proteaseaussstattung) in den verschiedenen Kompatimenten (z.B. Exosomen, Lysosomen) können sehr unterschiedlich sein. Durch die Verwendung von pH-sensitiven fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden, die jeweils auf bestimmte dieser Bedingungen reagieren, können Aussagen zu kompartimentspezifischen Abläufen gemacht werden.

Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung von verschiedenen und unterscheidbaren pH-sensitiven fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden liegt weiterhin darin, dass beispielsweise durch die Verwendung fluoreszierender Proteine mit unterschiedlicher Farbe und Stabilität die Quantifizierung der Prozessierungskapazität der zu untersuchenden Zellen verbessert werden kann. Hierbei wird durch die Verwendung zweier unterschiedlich fluoreszierender Proteine, die sich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber zellulären Abbausystemen unterscheiden, die Prozessierungskapazität phagozytierender Zellen messbar, wie sie beispielsweise durch die Proteaseaktivität der beteiligten Enzyme bewirkt wird. Das stabilere Protein dient als interner Standard zur Quantifizierung der inkorporierten Proteinmenge, wohingegen das instabilere Protein als Zeiger für beispielsweise den proteasebedingten Abbau dient. Diese Form des Tests ermöglicht zum Beispiel die Diagnose von Immundefekten, die durch eine abnormale oder fehlende Proteaseaktivität ausgelöst werden. Hierfür können beispielsweise Unterschiede zwischen natürlich vorkommenden fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden ausgenutzt werden. Darüber hinaus können fluoreszierende Proteine eingesetzt werden, bei denen solche Unterschiede künstlich, insbesondere durch molekularbiologische Methoden, erzeugt wurden. Dies geschieht beispielsweise durch eine gezielte Stabilisierung durch Entfernung von geeigneten Proteaseschnittstellen und/oder durch eine gezielte Destabilisierung durch Hinzufügung von geeigneten Proteaseschnittstellen.

Ein ähnlicher Parallelansatz kann mit einem pH-sensitiven fluoreszierenden Protein und einem andersfarbigen stabileren fluoreszierenden Protein, welches als interner Standard dient, durchgeführt werden. Hierdurch können in besonders vorteilhafter Weise Aussagen über Störungen im pH-Milieu der Lysosomen getroffen werden, wie es weiter oben schon beschrieben ist. In diesem Fall darf das Protein oder Peptid, welches als interner Standard dient, keine oder nur wenig pH-Abhängigkeit der Fluoreszenz aufweisen. Ein Beispiel für ein stabiles Protein, welches im wesentlichen pH-unabhängig ist, ist das rot fluoreszierende Protein egFP611 (Wiedenmann et al. (2002) Proc Natl Acad Sci 99:11646-11651). Als pH-sensitives fluoreszierendes Protein kann das Protein IhFP516/581 eingesetzt werden.

In einem vergleichbaren Parallelansatz werden fluoreszierende Proteine oder Peptide verwendet, welche sich sowohl insbesondere in der Farbigkeit der Fluoreszenz als auch hinsichtlich der Stabilität gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies unterscheiden. Hierdurch können in besonders vorteilhafter Weise Aussagen über die Beteiligung reaktiver Sauerstoffspezies an Abbauprozessen getroffen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei welchem die Partikel mindestens zwei unterscheidbare Fluoreszenzen aufweisen, werden diese Fluoreszenzen durch mindestens zwei verschiedene pH-sensitive fluoreszierende Proteine oder Peptide bewirkt. Andererseits kann es auch sehr vorteilhaft sein, wenn die unterscheidbaren Fluoreszenzen durch mindestens zwei unterscheidbare fluoreszierende Zustände eines Proteins bewirkt werden. Diese verschiedenen fluoreszierenden Zustände eines Proteins unterschieden sich vorzugsweise hinsichtlich ihrer Stabilität. Ein Beispiel hierfür ist das fluoreszierende Protein IhFP516/681 aus Lobophyllia hemprichii. Dieses Protein kann durch Bestrahlung mit kurzwelligem Licht gezielt und irreversibel von einer grün fluoreszierenden in eine rot fluoreszierende Form überführt werden. Der Grad der Photokonversion und damit das Mengenverhältnis zwischen grün und rot fluoreszierender Form ist beispielsweise durch die Intensität und Dauer der Bestrahlung steuerbar und kann auch innerhalb eines Partikels, insbesondere innerhalb eines Modellerregers, durchgeführt werden. Beide Zustände sind pH-sensitiv. Die rot fluoreszierende Form zeigt eine geringere Widerstandsfähigkeit gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies. Wird sowohl die Grün- als auch die Rotfluoreszenz quantifiziert, beispielsweise in einem Fluoreszenzzytometer, kann aus deren Verhältnis die Abbaukapazität und damit die Prozessierungsaktivität der zu untersuchenden Zellen berechnet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Präsentation von Fragmenten der phagozytierten Partikel durch die zu untersuchenden Zellen untersucht. Diese Untersuchung der sogenannten Antigenpräsentation erfolgt entweder zusätzlich zur Analyse der Prozessierungskapazität bzw. der Prozessierungsaktivität der Zellen oder wird davon unabhängig durchgeführt. Zur Untersuchung der Antigenpräsentation werden Fragmente der fluoreszierenden Proteine oder Peptide und/oder Fragmente der mit diesen Proteinen oder Peptiden fusionierten Peptide und/oder Proteine analysiert, welche auf der Oberfläche der zu untersuchenden Zellen im Zuge der Antigenpräsentation erscheinen. Die prozessierten Bestandteile bzw. Fragmente werden als Peptide einer relativ konstanten Länge von bestimmten Immunzellen, insbesondere von dendritischen Zellen, an deren Oberfläche präsentiert. Das Verständnis dieser Zusammenhänge ist vor allen Dingen im Zusammenhang mit Überlegungen zu Vakzinierungsstrategien diskutiert worden (Hung and Wu (2003) Curr Opin Mol Ther 5 (1): 20-4). Die Antigenpräsentation ist die Voraussetzung für den Ablauf der weitergehenden Immunreaktionen eines Säugerorganismus. Das erfindungsgemäße Verfahren ist in ganz besonders vorteilhafter Weise dazu geeignet, diese Vorgänge und insbesondere die Kapazität der phagozytierenden Zellen, Antigene zu präsentieren, zu untersuchen. Durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten fluoreszierenden Proteine oder Peptide werden definierte Antigene in die phagozytierenden Zellen eingebracht.

Da diese Proteine oder Peptide im Säugerorganismus in der Regel natürlicherweise nicht vorkommen, können daraus abgeleitete Antigene mit großer Sicherheit nachgewiesen werden.

Bevorzugterweise werden hierfür die präsentierten Fragmente mit Antikörpern nachgewiesen, die Fragmente der fluoreszierenden Proteine oder Peptide erkennen. Hierfür kommen grundsätzlich polyklonale und monoklonale Antikörper in Frage. Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper, da diese eine besonders große Spezifität für die zu erkennenden Antigene zeigen. In einer besonders vorteilhaften Ausführungs form werden diese Antikörper markiert, wodurch der Nachweis der Bindung der Antikörper an die jeweiligen Antigene erleichtert werden kann. Beispielsweise können hierfür die Antikörper mit unterscheidbaren Fluoreszenzfarbstoffen markiert sein. Es können auch andere Methoden zum Nachweis der Antikörper eingesetzt werden. Mit Vorteil können die Antikörper durch geeignete zweite Antikörper, die z. B. eine nachweisbare enzymatische Funktion tragen, detektiert werden. Einzelheiten hierzu erschließen sich dem Fachmann.

Weiterhin können die präsentierten Fragmente auch mit zellulären Rezeptoren nachgewiesen werden. Als zelluläre Rezeptoren sind vor allem solche Rezeptoren bevorzugt, die als physiologische Strukturen das jeweilige präsentierte Fragment erkennen und binden. Diese Rezeptoren können als sehr spezifische und wirksame Werkzeuge zum Nachweis und zur Detektion der Antigenpräsentation eingesetzt werden.

In dem Fall, dass die fluoreszierenden Proteine bzw. fluoreszierenden Peptide mit anderen Peptiden oder Proteinen fusioniert sind, können Fragmente dieser Fusionspartner mit geeigneten Antikörpern nachgewiesen werden. Weiterhin können auch andere spezifische Antigene, die sich aus Bestandteilen der Partikel, insbesondere der Modellerreger, herleiten, mit geeigneten Antikörpern nachgewiesen werden. Diese Antigene, wie z. B. Tumorantigene, können natürlicherweise oder durch künstliche Veränderung in den Partikeln bzw. Modellerregern vorkommen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei welchem die Antigenpräsentationskapazität der Zellen untersucht wird, sind die fluoreszierenden Proteine oder Peptide oder die mit diesen fusionierten Peptide oder Proteine in der Weise mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, dass sie auch nach der Prozessierung ihre Fluoreszenz beibehalten. Dies bewirkt, dass das prozessierte Frag ment, welches an der Oberfläche der Zellen präsentiert wird, selbst weiterhin fluoresziert und somit direkt an der Zelloberfläche detektiert werden kann. Unter Fluoreszenzfarbstoff ist hierbei die fluoreszierende Komponente eines Proteins oder Peptids zu verstehen, welches dem jeweiligen Protein oder Peptid die fluoreszierenden Eigenschaften verleiht. Die Detektion dieser Fluoreszenzen an der Oberfläche kann mit üblichen Methoden erfolgen, insbesondere mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie und/oder der Durchflusszytometrie. Daneben kann die spezifische Lokalisation an der Zelloberfläche beispielsweise nach Zugabe von geeigneten zellimpermeablen Quenching-Substanzen geprüft werden.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass dieses Verfahren sowohl mit isolierten phagozytierenden Zellen als auch mit Vollblut oder im kompletten Knochenmark durchgeführt werden kann. Bei der Vollblutanwendung ist es im allgemeinen vorteilhaft, vor der Fluoreszenzmessung die nicht-phagozytierenden Zellen, insbesondere Erythrozyten, zu entfernen. Dies kann durch physikalische Metho den und/oder beispielsweise durch Lyse erfolgen. Die Lyse kann mit Hilfe einer nicht-isotonischen Lösung, also einer hypotonen Lösung, vorgenommen werden, wobei die Bedingungen vorteilhafterweise so gewählt werden, dass vor allem die Erythrozyten und nicht die phagozytierenden Zellen zerstört werden. Dies kann beispielsweise durch geeignete Puf fer- und/oder Temperaturbedingungen erreicht werden.

Weiterhin ist es sowohl bei isolierten Zellen als auch bei Vollblut bzw. Knochenmark vorteilhaft, dass die phagozytierenden Zellen vor der Fluoreszenzmessung fixiert werden. Die Fixierung erfolgt in der Lösung und gewährleistet, dass die phagozytotischen und die nachfolgenden Vorgänge in den Zellen gestoppt oder zumindest beeinträchtigt bzw. verlangsamt werden. Eine solche Fixierung bzw. Arretierung kann insbesondere durch Zugabe von Formaldehyd, beispielsweise etwa 1 % Paraformaldehyd, erreicht werden. Durch eine Arretierung der Zellen mit nachfolgender Fluoreszenzanalyse können zeitgenaue Aussagen zu den Abläufen in der Zelle gemacht werden, die mit der Phagozytose in Zusammenhang stehen.

In besonders vorteilhafter Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Klärung der Frage genutzt werden, welche Zellen des Vollblutes (z.B. Makrophagen, dendritische Zellen, andere myeloische Zellen, Endothelzellen) oder des Knochenmarks in Bezug auf die Phagozytose und die nachgeschalteten Prozesse aktiv sind. Hierfür erfolgt die Inkubation des Vollbluts, des Knochenmarks oder bestimmter isolierter Zellen mit den fluoreszenzmarkierten Partikeln in Gegenwart von lineagespezifischen Antikörpern, die die jeweiligen Zelltypen erkennen. Vorzugsweise werden hierfür wegen ihrer besonderen Spezifität monoklonale Antikörper eingesetzt. Diese Antikörper sind ebenfalls fluoreszenzmarkiert, wobei sich die Fluoreszenz vorteilhafterweise von derjenigen Fluoreszenz unterscheidet, mit welcher die Partikel markiert sind. Durch nachfolgende Lokalisation beider Fluoreszenzen können Rückschlüsse auf die phagozytotische, Prozessierungs- und/oder Antigenpräsentationsfunktion bestimmter Zelltypen gezogen werden.

Besondere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die große Sensitivität des Nachweises der Fluoreszenzmarkierung, die kostengünstige Herstellung, Lagerung und Versand der zu verwendenden Partikel bzw. der Modellerreger und die automatisierbare Quantifizierung, die beispielsweise mit Hilfe der Durchflusszytometrie und/oder mit geeigneten Plattenmessgeräten durchgeführt werden kann. Dies ermöglicht vor allem die Auswertung großer Probenmengen. Neben dem Einsatz in der Diagnostik kann das erfindungsgemäße Verfahren daher auch mit großem Vorteil bei der Wirkstoffsuche und -evaluation eingesetzt werden.

Die Erfindung umfaßt daher auch die Verwendung eines Verfahrens gemäß der obigen Beschreibung zum Screening und/oder zur Charakterisierung von immunstimulierenden oder immunsuppressiven Substanzen. Hierbei kann beispielsweise die Effizienz und/oder der Wirkmechanismus von Immunstimulanzien und Immunsuppressiva in vivo als auch in vitro untersucht werden. Hierzu können die phagozytierenden Zellen mit potentiellen immunstimulierenden oder immunsuppressiven Substanzen versetzt werden. Die Auswirkung auf die Phagozytoseaktivität und die Prozessierungsaktivität und/oder die Antigenpräsentationskapazität wird vorteilhafterweise jeweils im Vergleich mit Kontrollzellen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert. Im Fall einer immunstimulierenden Substanz kann also beispielsweise eine Erhöhung der Phagozytoseaktivität, eine Erhöhung der Prozessierungsaktivität und/oder eine Verstärkung der Antigenpräsentation nachgewiesen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher in besonderer Weise dafür geeignet, therapeutisch wirksame Substanzen zu finden und zu evaluieren, welche z. B. die Phagozytose und Prozessierung von Bakterien, Viren und/oder Tumorzellen bzw. deren Fragmenten stimulieren.

Zum anderen kann beispielsweise im Hinblick auf Autoimmunerkrankungen oder auf Allergien das erfindungsgemäße Verfahren zur Findung und Evaluation von therapeutisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, welche Überreaktionen der Immunantwort dämpfen oder verhindern. Ein Beispiel für eine Überreaktion ist eine verstärkte Antigen präsentation. Die Automatisierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dabei von besonderem Vorteil, da dies den Einsatz im Hochdurchsatzverfahren ermöglicht.

Da das Immunsystem von Menschen und anderen Säugetieren in vieler Hinsicht vergleichbar ist, kann das erfindungsgemäße Verfahren sowohl mit Zellen humanen Ursprungs als auch mit Zellen aus anderen Tieren, insbesondere aus anderen Säugetieren, durchgeführt werden. Dies ist vor allem für das Screening und/oder die Charakterisierung von immunstimulierenden oder immunsuppressiven Substanzen vorteilhaft, da entsprechende Substanzen in einem Tiermodell durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch bei Nicht-Säugerorganismen bzw. deren Zellen eingesetzt werden, soweit diese Zellen in der Lage sind, Phagozytose, Prozessierung und/oder Präsentation von Fragmenten bzw. Antigenen durchzuführen.

In besonders vorteilhafter Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose von Immundefekten verwendet werden, die angeboren oder erworben sein können. Wie eingangs erwähnt, können sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachweisbaren Defekte beispielsweise als Immuninsuffizienzen, Tumorbildung, Allergien oder Autoimmunerkrankungen manifestieren. Diese Immundefekte können beispielsweise durch Funktionsdefekte definierbarer antigenpräsentierender Zellen verursacht sein. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft für die Erfassung genetischer Defekte des intrazellulären Traffickings geeignet. Kongenitale Immundefekte können sich z. B. als Griscelli-Syndrom (mutiertes Rab27a, Bahadoran et al. (2003) J Biol Chem 278 (13): 11386-92), als Herrmann Pudlack-Syndrom (mutiertes vsp33, Chiang et al. (2003) J Biol Chem 278 (22): 20332-7) oder als Chediak Higashi-Syndrom (mutiertes Lyst, Huizing et al. (2001) Thromb Haemost 86 (1): 233-45) äußern. Beispielsweise bei diesen Syndromen kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren eine sofortige Diagnose für das Bestehen eines derartigen Defektes getroffen werden. Für die Auswertung ist eine Standardisierung durch Untersuchung gesunder Kontrollen und/oder die Austetung von gesunden Eltern oder Geschwistern vorteilhaft. Weiterhin ist beispielsweise auch die Diagnose von chronischen Virusinfektionen mit besonderem Vorteil möglich. Chronische Virusinfektionen scheinen ebenfalls defekte Phagozytoseleistungen sowie Defekte in den nachfolgenden Prozessen, insbesondere bei Makrophagen und dendritischen Zellen, hervorzurufen. Auch können genetische Rezeptormutationen des HIV zu Veränderungen in der Immunantwort führen. Patienten mit chronischen Virusinfektionen und daraus resultierenden Immundefekten oder Autoimmunphänomenen können daher mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht und die Defekte rasch diagnostiziert werden.

Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren mit großem Vorteil zur Überwachung einer Therapie von Immundefekten geeignet. Hierfür kommen insbesondere die Immundefekte in Frage, die bereits oben erwähnt wurden. Allgemein lassen sich sowohl angeborene als auch erworbene Immundefekte mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens sowohl diagnostizieren als auch in der Therapie überwachen. Eine Therapie, die beispielsweise eine verminderte Immunantwort stimulieren soll oder eine überreagierende Immunantwort dämpfen soll, kann mit Hilfe oder eine überreagierende Immunantwort dämpfen soll, kann mit Hilfe des Verfahrens in ihrer Wirkung kontrolliert werden. Hierfür werden vorteilhafterweise in einem in-vitro-Testverfahren Blutzellen von Patienten und/oder Probanden eingesetzt, welche sich einer immunmodulatorischen Therapie unterzogen haben. Der Therapieeffekt wird anhand der Phagozytoseaktivität und der Prozessierungsaktivität und/oder der Präsentationsaktivität mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens in oben beschriebener Weise überprüft. Von besonderem Interesse sind hierbei vor allem phagozytierende dendritische Zellen sowie Makrophagen.

Die Erfindung umfasst schließlich einen Reagenzien-Kit zur Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren. Dieser Kit umfasst mindestens mit Fluoreszenz markierte Partikel, wobei es sich hier insbesondere um entsprechend markierte Bakterien, Cyanobakterien, Pilze, Viren und/oder eukaryontische Zellen bzw. Fragmente dieser verschiedenen Partikel handelt. Diese Partikel sind dadurch charakterisiert, dass sie mindestens ein pH-sensitives fluoreszierendes Protein oder Peptid aufweisen. Dieses pH-sensitive fluoreszierende Protein oder Peptid bewirkt eine insbesondere zytoplasmatische Fluoreszenz, die mindestens über 12 Stunden detektierbar ist. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Partikel mindestens zwei unterscheidbare Fluoreszenzen aufweisen bzw. zeigen. Weiterhin enthält der Reagenzien-Kit vorteilhafterweise geeignete übliche Puffer. Bezüglich weiterer Merkmale dieser mit Fluoreszenz markierten Partikel bzw. des Reagenzien-Kits wird auf die obige Beschreibung verwiesen.

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und den Beispielen in Verbindung mit den Figuren. Hierbei können die verschiedenen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.

In den Figuren ist gezeigt:

1 Fluoreszenzaktivität nach Phagozytose durch intakte, aus Vollblut angereicherte und isolierte dendritische Zellen;

2 Fluoreszenzaktivität nach Phagozytose durch Leukozyten im Vollblutansatz.

Beispiele1. Untersuchung der Phagozytose und Prozessierung an isolierten dendritischen Zellen

Phagozytierende Zellen aus Blut eines gesunden Spenders werden angereichert und isoliert und mit rekombinanten, fluoreszierenden Bakterien (Escherichia coli) inkubiert. Als Fluoreszenzmarkierung werden fluoreszierender Proteine, welche homolog zu dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) aus Aequorea victoria sind, eingesetzt.

Zur Isolierung der phagozytierenden Zellen werden 10 ml Vollblut mit 50 IU Na-Heparin/ml versetzt. Das Blut wird mit 10 ml PBS verdünnt und auf Ficoll (Dichte 1,077 g/l) überschichtet. Die mononukleären Zellen werden bei 840 × g für 20 min abzentrifugiert und zweimal in Hank's BSS gewaschen. Die mononukleären Zellen werden bei einer Zellkonzentration von 2 – 4 × 105/ml in Zellkultur gebracht (RPMI 1640, 25 mmol/L Hepes, Antibiotika, L-Glutamin, 10 % FCS, endotoxinfrei). Nach 10 Tagen werden die schwimmenden Zellen grob abgenommen. Die verbleibenden schwach adhärenten Zellen werden für weitere 14 Tage in frischem Medium kultiviert. Nach weiteren 14 bis 28 Tagen lassen sich aus diesen Kulturen gut angereicherte phagozytierende dendritische Zellen entnehmen, die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden.

Als zu phagozytierenden Partikel werden Bakterien (E. coli) eingesetzt, die fluoreszierende Proteine (GFP) exprimieren. Hierzu wurden die Bakterien mit Plasmiden (pQE32, Qiagen) transformiert; welche die kodierenden Sequenzen für die fluoreszierenden GFP-ähnlichen Proteine IhFP516/581 (Schmitt, 2003) und egFP611 (Wiedenmann et al., 2002) tragen. Das fluoreszierende Protein IhFP516/581 zeigt nach Expression eine grüne Fluoreszenz mit einem Emissionsmaximum bei 516 nm. Die maximale Anregbarkeit liegt bei 506 nm. Nach Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) wird das Emissionsmaximum nach 581 nm verschoben. Gleichzeitig verschiebt sich das Anregungsmaximum nach 571 nm. Um diese rot fluoreszierende Form des Proteins hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit zu testen, wurde die Bakterienlösung für 30 min mit UV-Licht (366 nm) bestrahlt. Diese nun rot fluoreszierenden Bakterien wurden parallel zu Bakterien eingesetzt, welche das Protein in der grün fluores zierenden Ausgangsform beinhalten. Das rot fluoreszierende Protein egFP611 besitzt ein Emissionsmaximum bei 611 nm und wird am stärksten bei 559 nm angeregt. Die Detektion der grünen bzw. roten Fluoreszenzen erfolgt unter Verwendung entsprechend geeigneter Anregungs- und Emissionsfilter.

1 × 105 dendritische Zellen/ml werden mit 1 × 107 fluoreszierenden Bakterien/ml inkubiert. Die Stadien der Phagozytose, insbesondere von der Aufnahme in primäre Endosomen bis zur Freisetzung des Fluoreszenzfarbstoffes in das Zytoplasma der dendritischen Zellen, welche sich mit dem Phagozytoseakt in antigenpräsentierende dendritische Zellen differenzieren, lassen sich in der Folge mikroskopisch und/oder durchflusszytometrisch verfolgen. Die Phagozytoseaktivität einzelner dendritischer Zellen kann in einem Zeitraum zwischen 6 und 12 Stunden liegen. Bis zum Entlassen des Fluoreszenzfarbstoffes in das Zytoplasma können 12 bis 48 h vergehen. Die ablaufenden Vorgänge können durch Messung und Lokalisierung der Fluoreszenz analysiert werden.

1 zeigt die Phagozytoseleistung, die anhand der Fluoreszenzaktivität nach 24 Stunden gemessen wird (graues Histogramm b). Als Kontrolle werden phagozytierende Zellen ohne Bakterien entsprechend inkubiert und gemessen (schwarzes Histogramm a). Die x-Achse der durch flusszytometrischen Messung (FACScalibur, BD-Europe, Heidelberg) zeichnet die Grün-Fluoreszenz im logarithmischen Maßstab auf. Die y-Achse gibt die Menge der gemessenen Zellen an (Counts).

2. Untersuchung der Phagozytose und Prozessierung im Vollblut oder Kno chenmark

In einem weiteren Versuch wird Vollblut mit rekombinanten, fluoreszierenden E. coli inkubiert und die Fluoreszenz der nukleären Zellen untersucht.

0,1 ml heparinisiertes Vollblut (50 IU Na-Heparin/ml) werden mit 1-5 μl fluoreszierenden Bakterien (1 × 109/ml) (siehe oben) inkubiert. Die Inkubationszeit richtet sich nach der Fragestellung des Versuchsprotokolls. Zur Untersuchung der Prozessierungsaktivität kann beispielsweise die Inkubation beendet werden, wenn die Entlassung des Fluoreszenzfarbstoffes in das Zytoplasma erwartet wird, beispielsweise nach 12 bis 48 h. Die Inkubation kann auch früher beendet werden, insbesondere wenn die Fluoreszenzfarbstoffe der phagozytierten Partikel aufgrund von spezifischen Bedingungen, beispielsweise in bestimmten Endosomen, ihre Fluoreszenz verlieren.

Zur Beendigung der Inkubation und vor der Messung der Fluoreszenz werden die Erythrozyten durch physikalische Methoden oder durch Lyse entfernt. Zur Lyse der Erythrozyten werden 2 ml hypotone Ammoniumchloridlösung in Natriumphosphatpuffer (0,05 mol/l, pH 7,4) mit 1 % Pa- raformaldehyd und 0,1 % Tween 20 zu 0,1 ml Blut gegeben. Die Inkubation erfolgt auf Eis, bis die Erythrozyten lysiert sind. Die Zellsuspension, bestehend aus intakten, fixierten weißen Blutzellen und Membranresten der Erythrozyten, wird zweimal mit PBS gewaschen und anschließend im Durchflusszytometer gemessen. Ein entsprechender Ansatz kann mit Knochenmark durchgeführt werden. Der Vorteil des Einsatzes von Vollblut oder von Knochenmark besteht insbesondere darin, dass alle vorhandenen weißen Zellen simultan untersucht und differentiell ausgewertet werden können.

Aus 2 geht hervor, dass Zellen, die ohne E. coli inkubiert werden, eine schwache Eigenfluoreszenz (schwarzes Histogramm a) zeigen. Die mit E. coli inkubierten Blutzellen zeigen drei Populationen (graues Histogramm b): i) nicht fluoreszierende Zellen, die nicht phagozytiert haben und unter der schwarzen Negativkurve liegen, ii) schwach fluoreszierende Zellen, welche wenig E. coli phagozytiert haben (Fluoreszenz zwischen Kanal 80 und etwa 700), und iii) eine stark fluoreszierende Population, welche mehr phagozytiert hat und einen Peak zwischen den Fluoreszenzintensitätskanälen 1.000 und 10.000 einnimmt.

Diese beiden Versuchsansätze zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren sowohl mit isolierten Zellen als auch mit Vollblut durchgeführt werden kann. Die Fluoreszenz geht nicht verloren, wenn die nichtphagozytierenden Erythrozyten lysiert und die phagozytierenden Zellen gleichzeitig fixiert werden. Das System ermöglicht es den Experimentator, die Vorgänge an jedem beliebigen Zeitpunkt zu stoppen und zu untersuchen, ob die Fluoreszenz in den primären oder sekundären Endosomen, den Lysosomen oder im Zytoplasma vorhanden ist. Hierdurch können aufschlussreiche Aussagen zu den Abläufen nach erfolgter Phagozytose gemacht werden.