Title:
Alkalische Protease
Kind Code:
B4


Abstract:

Alkalische Protease mit einer Präprosequenz, wobei die Präprosequenz eine mutierte Sequenz der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 darstellt oder eine Aminosäuresequenz mit einer mindestens 80%-igen, 87%-igen, 90%-igen, 95%-igen, 98%-igen oder höheren Homologie oder Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1, in der zwei oder mehr Aminosäurereste ausgewählt aus (a) Position 52, (b) Position 75 und (c) Position 142 von SEQ ID Nr.: 1 oder zwei oder mehr Aminosäurereste ausgewählt aus diesen Positionen entsprechenden Positionen durch die folgenden Aminosäurereste ersetzt sind:
in Position (a): Asparaginsäure oder Arginin,
in Position (b): Alanin oder Arginin, und
in Position (c): Lysin;
wobei die alkalische Protease in reifer Form die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 aufweist oder eine Aminosäuresequenz mit einer mindestens 80%-igen, 87%-igen, 90%-igen, 95%-igen, 98%-igen oder höheren Homologie oder Identität mit dieser Aminosäuresequenz.




Inventors:
Sato, Tsuyoshi (Tochigi, JP)
Takimura, Yasushi (Tochigi, JP)
Okuda, Mitsuyoshi (Tochigi, JP)
Sumitomo, Nobuyuki (Tochigi, JP)
Nomura, Masafumi (Wakayama, JP)
Kobayashi, Tohru (Tochigi, JP)
Application Number:
DE10328887A
Publication Date:
05/19/2016
Filing Date:
06/26/2003
Assignee:
Kao Corp. (Tokio/Tokyo, JP)
International Classes:



Foreign References:
63762272002-04-23
EP10299202000-08-23
WO1996034946A11996-11-07
Attorney, Agent or Firm:
VOSSIUS & PARTNER Patentanwälte Rechtsanwälte mbB, 81675, München, DE
Claims:
1. Alkalische Protease mit einer Präprosequenz, wobei die Präprosequenz eine mutierte Sequenz der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 darstellt oder eine Aminosäuresequenz mit einer mindestens 80%-igen, 87%-igen, 90%-igen, 95%-igen, 98%-igen oder höheren Homologie oder Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1, in der zwei oder mehr Aminosäurereste ausgewählt aus (a) Position 52, (b) Position 75 und (c) Position 142 von SEQ ID Nr.: 1 oder zwei oder mehr Aminosäurereste ausgewählt aus diesen Positionen entsprechenden Positionen durch die folgenden Aminosäurereste ersetzt sind:
in Position (a): Asparaginsäure oder Arginin,
in Position (b): Alanin oder Arginin, und
in Position (c): Lysin;
wobei die alkalische Protease in reifer Form die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 aufweist oder eine Aminosäuresequenz mit einer mindestens 80%-igen, 87%-igen, 90%-igen, 95%-igen, 98%-igen oder höheren Homologie oder Identität mit dieser Aminosäuresequenz.

2. Gen kodierend die in Anspruch 1 genannte alkalische Protease.

3. Rekombinanter Vektor, der das in Anspruch 2 genannte Gen trägt.

4. Transformante, die den in Anspruch 3 genannten Vektor trägt.

5. Transformante nach Anspruch 4, deren Wirt ein Mikroorganismus ist.

6. Genfragment kodierend die in Anspruch 1 genannte mutierte Präprosequenz.

7. Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 oder einer Aminosäuresequenz mit einer mindestens 80%-igen, 87%-igen, 90%-igen, 95%-igen, 98%-igen oder höheren Homologie oder Identität mit dieser Aminosäuresequenz, wobei man die Transformante nach Anspruch 5 einsetzt.

8. Putz- oder Reinigungsmittel enthaltend die alkalische Protease nach Anspruch 1, die durch das Gen von Anspruch 2 oder 6 kodierte alkalische Protease oder die nach dem Verfahren von Anspruch 7 hergestellte alkalische Protease als Reinigungsmittelzusatz.

9. Verwendung der alkalischen Protease nach Anspruch 1, der durch das Gen von Anspruch 2 oder 6 kodierten alkalischen Protease oder der nach dem Verfahren von Anspruch 7 hergestellten alkalischen Protease als Reinigungsmittel- oder Putzmittelzusatz.

Description:
Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen gekennzeichnete Protease, die geeignet ist, als Enzym in ein Reinigungsmittel inkorporiert zu werden.

Stand der Technik

Von den Proteasen werden die Reinigungsmitteln wie Waschmitteln beizumischenden alkalischen Proteasen industriell in den größten Mengen produziert. Beispiele bislang bekannter alkalischer Proteasen schließen Alcalase (eingetragene Marke: Novozymes), Savinase (eingetragene Marke: Novozymes), Maxacal {eingetragene Marke: Genencor), Blap {eingetragene Marke: Henkel) und KAP (Kao Corporation) ein.

Die Protease wird einem Waschmittel beigemischt, um so das Waschmittel mit der Fähigkeit zum Abbau von Proteinverschmutzungen auf Kleidung bereitzustellen. Tatsächliche auf der Kleidung abgelagerte Verschmutzungen sind jedoch komplexer Natur und enthalten, zusätzlich zu Proteinen, eine Vielzahl von organischen und anorganischen Bestandteilen wie Lipiden aus Talg, Dreck und Staub. Es besteht daher ein Bedarf an einem Reinigungsmittel mit ausgezeichneten Reinigungseigenschaften gegenüber derartigen komplexen Verschmutzungen.

Im Lichte der vorstehenden Ausführungen haben die hier genannten Erfinder zuvor verschiedene alkalische Proteasen mit einem Molekulargewicht von etwa 43.000 identifiziert, die auch in Gegenwart von hohen Konzentrationen von Fettsäuren eine ausreichende Casein abbauende Aktivität beibehalten. Sie weisen ferner ausgezeichnete Reinigungseigenschaften gegenüber komplexen Verschmutzungen auf, die Proteine und Talg enthalten. Die Erfinder haben bereits früher eine die alkalischen Proteasen betreffende Patentanmeldung eingereicht (WO 99/18218 A1). Diese alkalischen Proteasen unterscheiden sich von dem allgemein bekannten Subtilisin, einer aus Bakterien der Gattung Bacillus abgeleiteten Serinprotease, hinsichtlich des Molekulargewichts, der Primärstruktur und enzymatischer Eigenschaften. Sie weisen insbesondere eine sehr starke Resistenz gegenüber Oxidationsmitteln auf. Daher ist vorgeschlagen worden, dass diese alkalischen Proteasen einer neuen Subtilisin Unterfamilie zugeordnet werden (vgl. Saeki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 279 (2000), 313–319).

Allerdings kann die bei der Produktion erzielte Menge derartiger Proteasen für die Produktion im industriellen Maßstab unzureichend sein. Daher ist ein Bedarf an einer alkalischen Protease entstanden, die auf rationelle Weise in einem Kulturmedium produziert werden kann.

Zwischenzeitlich sind zum Zwecke der Herstellung großer Mengen des Zielproteins (Enzyms) Versuche unternommen worden, Wirtsbakterien (Wirtsstämme) durch Mutationszüchtung zu verbessern oder das das Enzym kodierende Gen oder das die Expression des Enzyms kontrollierende Gen zu verändern, um so die Sezernierung des Enzyms zu erhöhen. Es ist allerdings noch kein Versuch unternommen worden, die Sezernierung von Subtilisin durch Veränderung von dessen Präprosequenz zu verbessern, die eine wichtige Rolle bei der Herstellung und Faltung spielt.

Beschreibung

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen; also eine alkalische Protease mit einer Präprosequenz, wobei die Präprosequenz eine mutierte Sequenz der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1 darstellt oder eine Aminosäuresequenz mit einer mindestens 80%-igen, 87%-igen, 90%-igen, 95%-igen, 98%-igen oder höheren Homologie oder Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1, in der zwei oder mehr Aminosäurereste ausgewählt aus (a) Position 52, (b) Position 75 und (c) Position 142 von SEQ ID Nr.: 1 oder zwei oder mehr Aminosäurereste ausgewählt aus diesen Positionen entsprechenden Positionen durch die folgenden Aminosäurereste ersetzt sind:
in Position (a): Asparaginsäure oder Arginin,
in Position (b): Alanin oder Arginin, und
in Position (c); Lysin;
wobei die alkalische Protease in reifer Form die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 aufweist oder eine Aminosäuresequenz mit einer mindestens 80%-igen, 87%-igen, 90%-igen, 95%-igen, 98%-igen oder höheren Homologie oder Identität mit dieser Aminosäuresequenz. Die Erfindung betrifft ferner ein Strukturgen kodierend die alkalische Protease, einen Vektor, der das Strukturgen trägt und eine Transformante, die den genannten Vektor trägt.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Genfragment, das die vorstehend genannte mutierte Präprosequenz kodiert.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 oder einer Aminosäuresequenz mit einer mindestens 80%-igen, 87%-igen, 90%-igen, 95%-igen, 98%-igen oder höheren Homologie oder Identität mit dieser Aminosäuresequenz, wobei man die vorstehend genannte Transformante einsetzt.

Die Erfindung betrifft auch ein Putz- oder Reinigungsmittel enthaltend die erfindungsgemäße alkalische Protease, die durch das erfindungsgemäße Gen kodierte alkalische Protease oder die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte alkalische Protease als Reinigungsmittelzusatz oder Putzmittelzusatz.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen alkalischen Protease, der durch das erfindungsgemäße Gen kodierten alkalischen Protease oder der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten alkalischen Protease als Reinigungsmittel- oder Putzmittelzusatz.

Vorzugsweise ist das Putz- oder Reinigungsmittel ein Waschmittel, ein Bleichmittel, ein Mittel zur Reinigung fester Oberflächen, ein Reinigungsmittel für Abflussrohre, ein Gebissreiniger oder ein Reinigungsmittel zur Sterilisierung medizinischer Apparate.

Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff „Reinigungsmittelzusatz” oder „Putzmittelzusatz” einen Zusatz eines Putzmittels oder Reinigungsmittels. Die erfindungsgemäße Protease wird vorzugsweise als Trockengranulat oder solubilisiertes Protein zu dem Reinigungsmittel oder Putzmittel zugegeben. Vorzugsweise ist die Endkonzentration der Protease im Bereich von 0,1% bis 5% (Gew-%).

Kurze Beschreibung der Figuren

1 zeigt in einer Gegenüberstellung einer Präprosequenz bestehend aus der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr.: 1 und Präprosequenzen, die aus Aminosäuresequenzen mit einer Homologie von 80% oder höher zu dieser Aminosäuresequenz bestehen.

Die 2a und 2b zeigen in einer Gegenüberstellung eine Protease mit der SEQ ID Nr.: 2 und Proteasen, die Aminosäuresequenzen mit einer Homologie von 80% oder höher zu dieser Aminosäuresequenz aufweisen.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die hier genannten Erfinder haben ein neues Enzym untersucht, das die vorstehend aufgeführten Eigenschaften der alkalischen Protease beibehält und wirtschaftlich in einem Kulturmedium herstellbar ist. Sie haben gefunden, dass die Produktivität der alkalischen Protease erhöht werden kann, wenn ein Aminosäurerest in einer bestimmten Position der Präprosequenz der alkalischen Protease durch einen bestimmten Aminosäurerest ersetzt wird.

Die Präprosequenz der erfindungsgemäßen alkalischen Protease (die als ”mutierte Präprosequenz” bezeichnet werden kann) ist eine veränderte (oder mutierte) Sequenz der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 80% oder höher mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1, wobei zwei oder mehr Aminosäurereste ausgewählt aus Position 52 (auch als Position (a) bezeichnet), Position 75 (auch als Position (b) bezeichnet) und Position 142 (auch als Position (c) bezeichnet) von SEQ ID Nr.: 1 oder zwei oder mehr Aminosäurereste ausgewählt aus diesen Positionen entsprechenden Positionen durch die folgenden Aminosäurereste ersetzt sind:
in Position (a): Asparaginsäure oder Arginin,
in Position (b): Alanin oder Arginin, und
in Position (c): Lysin;

Erfindungsgemäß kann die Präprosequenz eine natürlicherweise mutierte Sequenz oder eine künstlich mutierte Sequenz sein.

Die Präprosequenz ist bezüglich der Sezernierung und Faltung der alkalischen Protease ein wichtiger Bereich. Die Präsequenz ist eine Signalsequenz und wird durch eine Signalpeptidase gespalten, wenn das Vorläufermolekül der alkalischen Protease durch die Zellmembran geschleust wird. Es ist mittlerweile bekannt, dass die Prosequenz als intramolekulares Chaperonmolekül agiert und eine wichtige Region für die richtige dreidimensionale Struktur der alkalischen Protease ist, bevor und nachdem diese die Zellmembran passiert. Die Prosequenz wird schlussendlich durch reife alkalische Protease gespalten und in kleine Peptide abgebaut. Ein durch Transkription und Translation des strukturellen, alkalische Protease kodierenden Gens erhaltenes Produkt ist in der Zelle in Form eines Vorläufermoleküls der alkalischen Protease vorhanden, das eine Präprosequenz aufweist. Dementsprechend betrifft die erfindungsgemäße alkalische Protease mit einer Präprosequenz ein Vorläufermolekül einer alkalischen Protease.

Beispiele der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1, d. h. einer nicht mutierten Präprosequenz, schließen die Präprosequenz von KP43 (aus Bacillus Sp. KSM-KP43 (FERM BP-6532), WO 99/18218 A1) ein.

Unter den Aminosäuresequenzen mit einer Homologie von 80% oder höher zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1 sind diejenigen bevorzugt, die eine Homologie von 87% oder höher aufweisen, stärker bevorzugt diejenigen mit einer Homologie von 90% oder höher, noch stärker bevorzugt diejenigen mit einer Homologie von 95% oder höher, und am stärksten bevorzugt diejenigen mit einer Homologie von 98% oder höher. Aminosäuresequenzen mit einer Homologie von 80% oder höher in Bezug auf die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1 sind vorzugsweise Präprosequenzen einer alkalischen Protease, die aus einer Aminosäuresequenz besteht, die eine Homologie von 80% oder höher zur nachstehend beschriebenen Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr.: 2 aufweist. Besondere Beispiele einer derartigen Aminosäuresequenz schließen die Präprosequenz der Protease KP9860 (GenBank Hinterlegungsnummer AB046403) (aus Bacillus Sp. KSM-KP9860 (FERM BP-6534), WO 99/18218 A1) und die Präprosequenz der Protease 9865 (GenBank Hinterlegungsnummer AB084155 (aus Bacillus Sp. KSM-9865 (FERM P-18566), japanische Patentanmeldung mit der Nummer 2002-2653) ein. Die Homologien der Präprosequenzen der Proteasen KP9860 und 9865 zur Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1 sind 86,8% bzw. 97,6% (1). Die Homologie oder Identität zwischen Aminosäuresequenzen wird durch Programme wie „GENETYX WIN maximum matching” oder „search homology” (Produkte von Software Development Co., Ltd.) berechnet.

„Aminosäurereste in Positionen, die diesen Positionen entsprechen” können durch Vergleich von Aminosäuresequenzen von alkalischen Proteasen vermittels eines bekannten Algorithmus wie des Lipman-Person Verfahrens identifiziert werden, wodurch den konservierten Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz jeder alkalischen Protease eine maximale Homologie zugeteilt wird. Wenn die Aminosäuresequenzen der Präprosequenzen mit einem derartigen Verfahren ausgerichtet werden, können die Positionen der homologen Aminosäurereste in jeder Präprosequenz bestimmt werden und zwar unabhängig von Insertionen oder Deletionen von (einem) Aminosäurerest(en) in den Aminosauresequenzen. Es ist denkbar, dass sich die homologen Aminosäurereste in den selben Positionen der drei-dimensionalen Strukturen der Präprosequenzen befinden. Daher sind die alkalischen Proteasen mit den Präprosequenzen hinsichtlich der die Spezifität bestimmenden Funktionen als analog anzusehen.

Wie in 1 dargestellt, in der Aminosäuresequenzen vermittels des vorgenannten Verfahrens ausgerichtet sind, sind die Aminosäurereste in (a) Position 52, (b) Position 75 und (c) Position 142 von SEQ ID Nr.: 1 Lysin, Glutamin und Glutaminsäure. Die Aminosäurereste in den Positionen (a) bis (c) entsprechenden Positionen können mit dem vorgenannten Verfahren ermittelt werden. In der Präprosequenz der Protease KP9860 oder der Protease 9865 beispielsweise sind die Aminosäurereste in (a) Position 52, (b) Position 75 und (c) Position 142 Lysin, Glutamin bzw. Glutaminsäure.

In der mutierten Präprosequenz der erfindungsgemäßen alkalischen Protease ist der Aminosäurerest in (a) Position 52 von SEQ ID Nr.: 1 oder einer dieser Position entsprechenden Position vorzugsweise durch Asparaginsäure oder Arginin ersetzt, besonders bevorzugt durch Arginin. Der Aminosäurerest in (b) Position 75 oder einer dieser Position entsprechenden Position ist vorzugsweise durch Alanin oder Arginin ersetzt, besonders bevorzugt durch Arginin. Der Aminosäurerest in (c) Position 142 oder einer dieser Position entsprechenden Position ist besonders bevorzugt durch Lysin ersetzt.

In der mutierten Präprosequenz der erfindungsgemäßen alkalischen Protease kann der Austausch von Aminosäureresten in zwei oder mehr Positionen, ausgewählt aus den Positionen (a) bis (c) erfolgen, solange die Eigenschaften des so erhaltenen Enzyms nicht abweichen. Spezifische Beispiele von Kombinationen von Austauschen von Aminosäureresten in zwei oder mehr Positionen schließen Lys52(Asp/Arg) + Gln 75 (Ala/Arg), Lys52 (Asp/Arg) + Glu142Lys, Lys52(Asp/Arg) + Glu142Lys und Gln75 (Ala/Arg) + Lys52(Asp/Arg) + Glu142Lys ein. Bevorzugte Kombinationen sind Lys52Arg + Gln75Arg, Lys52Asp + Gln75Ala und Lys52Asp + Glu142Lys. Die Kombination Lys52Arg + Glu142Lys ist besonders bevorzugt. Aminosäuren werden mit drei Buchstaben bezeichnet; das Symbol „+” bezeichnet den Fall, in dem eine zusätzliche Substitution durchgeführt wurde. Das Symbol „/” bezeichnet den Fall, wo eine der rechten oder linken beiden Aminosäuren für die Substitution eingesetzt werden kann.

Die erfindungsgemäße alkalische Protease weist die vorgenannte mutierte Präprosequenz auf, und die reife alkalische Protease besitzt die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 80% oder mehr im Vergleich zu dieser Aminosäuresequenz.

Was die Aminosäuresequenzen mit einer Homologie von 80% oder mehr im Vergleich zur Aminosäuresequenz.vgon SEQ ID Nr. 2 angeht, so sind diejenigen bevorzugt, die eine Homologie von 87% oder höher aufweisen, stärker bevorzugt diejenigen mit einer Homologie von 90% oder höher, noch stärker bevorzugt diejenigen mit einer Homologie von 95% oder höher, und am stärksten bevorzugt diejenigen mit einer Homologie von 98% oder höher. Eine derartige alkalische Protease kann eine Wildtyp alkalische Protease oder eine Variante sein.

Vorzugsweise zeigt die alkalische Protease eine Resistenz gegen Oxidationsmittel und weist ein Molekulargewicht von 43.000 +/– 2.000 auf, bestimmt durch Natriumdodecylsutfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Vorzugsweise weist die alkalische Protease die folgenden Eigenschaften auf: Aktivität in einem alkalischen Bereich bei einem pH-Wert von 8 oder höher, Resistenz gegen Oxidationsmittel, die enzymatische Aktivität wird nicht in Gegenwart hoher Konzentrationen an Fettsäuren gehemmt, hohe Gelatine-abbauende Aktivität, mindestens 80%-ige Restaktivität nach Behandlung bei 50°C und einem pH-Wert von 10 für 10 Minuten, Inhibition durch Diisopropyl-fluorphosphat (DFP) und Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und Molekulargewicht von 43.000 +/– 2.000, bestimmt durch SDS-PAGE.

Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „die alkalische Protease weist Resistenz gegenüber Oxidationsmitteln auf” den Fall, bei dem die alkalische Protease nach Stehen lassen für 20 Minuten bei 30°C in einem Wasserstoffperoxid (50 mM) und Calciumchlorid (5 mM) enhaltenden 20 mM Britton-Robinson Puffer (pH 10) eine mindestens 50%-ige Restaktivität beibehält.

So lange die alkalische Protease die vorgenannten Eigenschaften beibehält, kann sie eine Wildtyp-, variante oder künstlich mutierte alkalische Protease sein.

Beispiele der alkalischen Protease mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 (reife alkalische Protease) schließen KP43 (abgeleitet aus Bacillus Sp. KSM-KP43 (FERM BP-6532), WO 99/18218 A1) ein. Beispiele der alkalische Protease mit einer Aminosäuresequenz, die eine Homologie von 80% oder höher mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 aufweisen, schließen die Protease KP9860 (GenBank Hinterlegungsnummer AB046403) (aus Bacillus Sp. KSM-KP9860 (FERM BP-6534), WO 99/18218 A1), die Protease 9865 (GenBank Hinterlegungsnummer AB084155) (aus Bacillus Sp. KSM-9865 (FERM P-1592) japanische Patentanmeldung mit der Nummer 2002-002653), die Protease E-1 (GenBank Hinterlegungsnummer AB046402) (aus Bacillus Nr. D-6 (FERM P-1592), japanische offengelegte Patentanmeldung („kokai”) mit der Nummer 49-71191), die Protease Ya (GenBank Hinterlegungsnummer A6046404) (aus Bacillus Sp. Y (FERM BP-1029), japanische offengelegte Patentanmeldung („kokai”) mit der Nummer 61-280268), die Protease SD521 (GenBank Hinterlegungsnummer AB046405) (aus Bacillus SD521 (FERM P-11162), japanische offengelegte Patentanmeldung („kokai”) mit der Nummer 3-191781), die Protease A-1 (GenBank Hinterlegungsnummer AB046406) (aus NCIB12289, WO 88/01293 A1), die Protease A-2 (aus NCIB12513, WO 98/56927 A2) ein, ferner eine Mutante, die durch Substitution in Position 46 der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 durch Leucin erhalten wird, ferner eine Mutante, die durch Substitution in Position 57 durch Alanin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 103 durch Arginin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 107 durch Lysin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 124 durch Lysin oder Alanin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 136 durch Alanin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 193 durch Alanin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 195 durch Asparagin, Glutaminsäure, Arginin, Prolin, Threonin, Valin, Histidin, Serin, Lysin,. Glutamin, Methionin, Cystein, Alanin, Asparaginsäure, Tryptophan, Glycin oder Phenylalanin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 247 durch Threonin oder Arginin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 257 durch Valin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 342 durch Alanin erhalten wird, eine Doppelmutante, die durch Substitution in den Positionen 66 und 264 durch Asparaginsäure bzw. Serin erhalten wird (japanische Patentanmeldung mit der Nummer 2000-355166 (japanische offengelegte Patentanmeldung („kokai”) mit der Nummer 2002-218989)), eine Mutante, die durch Substitution in Position 84 der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 durch Arginin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 104 durch Prolin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 256 durch Alanin oder Serin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 369 durch Asparagin erhalten wird (japanische offengelegte Patentanmeldung („kokai”) mit der Nummer 2002-306176), eine Mutante, die durch Substitution in Position 251 der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 durch Asparagin, Threonin, Isoleucin, Valin, Leucin oder Glutamin erhalten wird, eine Mutante, die durch Substitution in Position 256 durch Serin, Glutamin, Asparagin, Valin oder Alanin erhalten wird (japanische Patentanmeldung mit der Nummer 2001-329472), sowie eine alkalische Protease mit einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 80% oder höher, vorzugsweise 87% oder höher, stärker bevorzugt 90% oder höher, noch stärker bevorzugt 95% oder höher mit den Aminosäuresequenzen der vorstehend genannten Proteasen. Die 2a und 2b zeigen in einer Gegenüberstellung die Aminosäuresequenzen einiger der vorstehend genannten alkalischen Proteasen.

Die Klonierung des Gens der erfindungsgemäßen alkalische Protease kann durch Shotgun-Klonierung, PCR oder ähnliche Verfahren bewerkstelligt werden. Das derart klonierte Gen kann einer Mutagenese unterworfen werden. Ein Beispiel der Basensequenz des so erhaltenen Gens ist in SEQ ID Nr.: 3 dargestellt. Das die Präprosequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder eine Präprosequenz mit einer Homologie von 80% oder höher zu dieser Präprosequenz kodierende Gen kann durch PCR oder ähnliche Verfahren kloniert werden.

Die Mutagenese des die Präprosequenz kodierenden Gens kann durch zufallsbestimmte Mutagenese oder stellenspezifische Mutagenese, einer gängigen Technik, bewerkstelligt werden. Genauer kann die Mutagenese des Gens beispielsweise unter Verwendung des „Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km” Kits (Takara) durchgeführt werden.

Nachfolgend wird das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Protease unter Verwendung des so erhaltenen mutierten Präprogens beschrieben. Wenn das die Präprosequenz der alkalischen Protease kodierende Gen – die Basensequenz des Gens ist in SEQ ID Nr.: 3 dargestellt – mutiert wird, wird das so erhaltene mutierte Gen eingesetzt, wie es ist. Wenn unterdessen das das reife Enzym kodierende Gen mit einer Aminosäuresequenz mit einer Homologie von 80% oder höher zur Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 an den stromabwärts liegenden Bereich der mutierten Praprosequenz ligiert wird, kann ein Strukturgen durch Bereitstellen einer geeigneten Restriktionsspaltstelle durch stellenspezifische Mutagenese oder durch Einsatz rekombinanter PCR oder ähnlicher Verfahren hergestellt werden. Nachfolgend wird das mutierte Gen in einen Plasmidvektor eingeführt und ein Wirtsbakterium, welches den Vektor verlässlich amplifizieren und beibehalten kann, damit transformiert.

In einer anderen Ausführungsform wird das mutierte Gen in die chromosomale DNA eines Wirtsbakteriums eingeführt, das das Gen in stabiler Weise tragen kann. Beispiele von Wirtsbakterien, die diese Voraussetzungen erfüllen, schließen zur Gattung Bacillus gehörende Bakterien, Escherichia coli, Schimmelpilze, Hefen und Actinomyceten ein. Das Wirtsbakterium mit dem mutierten Gen wird in einem Kulturmedium nach üblichen Verfahren inokuliert und gezüchtet, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und weitere essentielle Nährzusatze enthält.

Die in den Wirtszellen exprimierte alkalische Protease mit der erfindungsgemäßen Präprosequenz wie so wirksam von den Transformanten produziert.

Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff „wirksam produziert” den Fall, dass eine mutierte alkalische Protease unter denselben Bedingungen hergestellt wird, wie sie für die Produktion der nicht mutierten alkalischen Protease eingesetzt werden (z. B. Inokulation in einem Kulturmedium, das Polypepton S (8% (Gew./Vol.)). Hefeextrakt (0,3%), Maltose (10%) Magnesiumsulfat-Heptahydrat (0,04%), Kaliumdihydrogenphosphat (0,2%), Natriumcarbonat-Anhydrat (1,5%) und Tetracyclin (30 ppm) und Schütteln der Kultur für 3 Tage bei 30°C), die Aktivität und Menge des Proteins im Kulturüberstand gemessen wird und die Aktivität oder Menge der Protease sich bei einem bestimmten Wert oder einem höheren Wert bewegt. Beispielsweise bezeichnet der Begriff „wirksam produziert” den Fall, dass die Aktivität oder Menge des Proteins im Vergleich mit der parentalen alkalischen Protease um mindestend 5% erhöht ist, vorzugsweise um mindestens 10% und stärker bevorzugt um mindestens 15%. Wenn die Variation beispielsweise in der spezifischen Aktivität der so erhaltenen alkalischen Protease nicht bestätigt wird, kann entweder die Aktivität oder die Menge der Protease gemessen werden.

Die Präprosequenz wird von der alkalischen Protease abgespalten und aus den Wirtszellen wird ein reifes Enzym sezemiert. Das reife Enzym kann unter Verwendung üblicher Verfahren zum Gewinnen und Aufreinigen von Enzymen gesammelt und aufgereinigt werden. Die Kulturbrühe kann beispielsweise zentrifugiert oder filtriert werden, wodurch die Wirtszellen abgetrennt werden, und das gewünschte Enzym wird mit einem üblichen Aufreinigungsverfahren aus dem Kulturüberstand erhalten. Die so erhaltene Enzymlösung kann ohne weitere Behandlung eingesetzt werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Enzymlösung zusätzlich einer Aufreinigung, Kristallisierung, Pulverisierung oder Granulatbildung unter Einsatz üblicher Verfahren unterzogen werden.

Die so erhaltene alkalische Protease weist eine Resistenz gegenüber Oxidationsmitteln auf, behält eine Casein-abbauende Aktivität auch in Gegenwart hoher Fettsäure-Konzentrationen bei und zeigt eine hohe Gelatine-abbauende Aktivität. Darüber hinaus weist die alkalische Protease vorzugsweise ein Molekulargewicht von 43.000 +/– 2.000, bestimmt durch SDS-PAGE auf und vorteilhafterweise eine Aktivität im alkalischen Bereich. Daher kann die alkalische Protease beispielsweise in Waschmitteln, Bleichmitteln, Reinigungsmitteln zur Säuberung harter Oberflächen, Reinigungsmitteln für Abflussrohre, in Gebissreinigern sowie in Reinigungsmitteln für die Sterilisierung medizinischer Apparate eingesetzt werden.

BeispieleBeispiel 1

Ein DNA-Fragment von etwa 2,0 kB (enthaltend ein Terminationskodon) des Strukturgens für die alkalische Protease (SEQ ID Nr.: 3), abgeleitet aus dem Bacillus Sp. Stamm KSM-KP43, wurde einer Zufallsmutagenese unterworfen. Zunächst wurde eine PCR unter Verwendung des BcaBEST Sequenzierungsprimers RV-M (Takara) und des BcaBEST Sequenzierungsprimers M13-47 (Takara) durchgeführt, die die vorstehend genannte und in die Multiklonierungsstelle von pKF18k (Takara) eingefügte DNA von etwa 2,0 kB amplifizieren können. Die Reaktion wurde unter Verwendung der Matrizen-DNA (30 ng), jedem Primer (20 pMol), von jedem dNTP (20 nMol), geeigneter Mengen an Mangansulfat und Dimethylsulfoxid, Takara Taq Reaktionspuffer (10 μL) und Taq Polymerase (2,5 Einheiten) (Gesamtmenge dieser Substanzen: 100 μL) durchgeführt. Die PCR wurde über 30 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus 94°C × 1 Minute, 55°C × zwei Minuten und 72°C × drei Minuten einschloss und das so erhaltene PCR Produkt wurde 10 Minuten bei 72°C gehalten. Das PCR Produkt wurde unter Verwendung eines „High Pure” PCR Produkt Reinigungskits (Roche) gereinigt und mit sterilem Wasser (100 μL) eluiert. Das so erhaltene DNA-Fragment von etwa 2,0 kB wurde mit BamHI und XbaI (Roche) gespalten und dann mit pKF18k gemischt, das mit diesen Enzymen behandelt worden war, worauf sich eine Ligation unter Verwendung eines DNA-Ligationskits Ver. 2 (Takara) anschloss. Mit dem so erhaltenen Reaktionsgemisch wurden Escherichia coli HB101 Zellen transformiert und auf einem Kanamycin (100 μg/mL) enthaltenden LB-Agarmedium wachsen gelassen. Die so erhaltene Transformante wurde in einem Kanamycin (100 μg/mL) enthaltenden LB-Medium inokuliert und dann in eine Schüttelkultur bei 30°C überführt. Die Aktivität des so erhaltenen Kulturüberstandes wurde mit einem synthetischen Substrat (Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA, Peptide Institute) gemessen. Es wurde eine Kulturbrühe mit einer Aktivität ausgewählt, die höher als die der parentalen alkalischen Protease war. Eine PCR wurde unter denselben Bedingungen wie vorstehend beschrieben durchgeführt und zwar unter Verwendung einer kleinen Menge des Stammes, des BcaBEST Sequenzierungsprimers RV-M (Takara) und des BcaBEST Sequenzierungsprimers M13-47, um mutierte Gene zu amplifizieren. Die so amplifizierten Genfragmente wurden gereinigt und die Nukleotidsequenz von jedem der Fragmente wurde unter Verwendung eines DNA-Sequenzierers (Modell 377, Applied Biosystems) unter Einsatz eines geeigneten Primers und eines „Big Dye” DNA Sequenzierkits (Applied Biosystems) bestimmt.

Im Ergebnis wurde gefunden, dass eine Mutante mit einer erhöhten Proteaseaktivität durch Expression von jedem der mutierten Gene produziert wurde, in dem Lysin in Position 52, Glutamin in Position 75 und Glutaminsäure in Position 142 der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 1 durch Arginin, Arginin bzw. Lysin ersetzt worden war. Die Proteaseaktivität der Mutante war um 2 bis 10% erhöht. Nachfolgend wurde das Strukturgen für die alkalische Protease mutiert, um die Auswirkungen der Substitution der Aminosäuren in den oben genannten mutierten Positionen durch andere Aminosäuren zu bestätigen. Für die Mutagenese wurden die Aminosäuren in den Positionen 52, 75 und 142 unter Verwendung eines ortsgerichteten Mutagenese System „Mutan-Super Express Km” Kits (Takara) durch willkürlich gewählte Aminosäuren ersetzt. Eine PCR wurde durchgeführt unter Einsatz eines Matrizen Plasmids (des Plasmids, welches durch Einführen des Strukturgens für die Protease in die BamHI und XbaI Spaltstellen von pKF18k erhalten worden war) (30 ng), eines mit dem Kit erhältlichen Selektionsprimers, den Primem Nr. 3 bis 5 (SEQ ID Nrn.: 4 bis 6) (jeweils 20 pMol) und Takara LA Taq. Die Reaktion wurde über 30 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus 94°C × 1 Minute, 55°C ×× zwei Minuten und 72°C × drei Minuten einschloss. Das so erhaltene PCR Produkt wurde aufgereinigt. Zusätzlich wurde eine PCR unter Einsatz des gereinigten Fragments als Primer, von Matrizenplasmid (30 ng) und LA Taq durchgeführt. Die Reaktion wurde über 30 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus 94°C × 1 Minute, 55°C × zwei Minuten und 72°C × vier Minuten einschloss. Das so erhaltene PCR Produkt wurde gereinigt und ligiert. Mit dem PCR Produkt wurden Zellen des Escherichia coli Stammes MV1184 transformiert. Aus dem transformierten Stamm wurde Plasmid DNA extrahiert und Escherichia coli HB101 Zellen wurden mit der Plasmid DNA transformiert. Die Transformante wurde in einem Kanamycin (100 μg/mL) enthaltenden LB-Medium inokuliert und dann in eine Schüttelkultur bei 30°C überführt. Die Aktivität des so erhaltenen Kulturüberstandes wurde mit einem synthetischen Substrat gemessen. Es wurde eine Kulturbrühe mit einer Aktivität ausgewählt, die höher als die der parentalen alkalischen Protease war. Eine PCR wurde unter Verwendung des Stammes als Matrize durchgeführt, um mutierte Gene zu amplifizieren. Die so amplifizierten Gene wurden gereinigt. Nach der Aufreinigung wurde die Nukleotidsequenz von jedem der Gene bestimmt. Im Ergebnis wurde gefunden, dass die Aktivität der Mutante, in der Lysin in Position 52 durch Asparaginsäure ersetzt war und die Aktivität der Mutante, in der Glutamin in Position 75 durch Alanin ersetzt war, im Vergleich zur parentalen alkalischen Protease um 5% bzw. 10% erhöht war. Eine Mutante, bei der die Aminosäure in Position 142 durch eine andere Aminosäure als Lysin ersetzt war, zeigte keine erhöhte Proteaseaktivität. Des weiteren wurden die Auswirkungen von Kombinationen der vorgenannten mutierten Positionen auf die Erhöhung der Proteaseaktivität untersucht. Ein BamHI-XhoI Fragment, in dem die Aminosäure in Position 52 mutiert war, ein XhoI-AatII Fragment, in dem die Aminosäure in Position 142 mutiert war sowie ein AatII-XbaI Fragment, welches das ein reifes Enzym kodierende Gen enthielt, wurden präpariert. Diese Fragmente wurden mit pKF18k gemischt, das mit BamHI und XbaI behandelt worden war und eine Ligation durchgeführt. Escherichia coli HB101 Zellen wurden mit der so erhaltenen Plasmid DNA transformiert und eine Doppelmutante mit der Mutation Lys52Arg und der Mutation Glu142Lys wurde in Kultur produziert. Im Ergebnis wurde gefunden, dass die Aktivität der Lys52Arg + Glu142Lys Mutante um 10% höher war als die der Lys52Arg Mutante.

Beispiel 2

Wenn die KP43 Protease als parentale alkalische Protease eingesetzt wurde, hatte jede der wie vorstehend erhaltenen mutierten Präprosequenzen in der erhaltenen Mutante eine erhöhte Aktivität. Weitere Untersuchungen wurden zur Bestätigung der Wirkung der erfindungsgemäßen Praprosequenz auf die mutierte alkalische Protease hinsichtlich einer erhöhten Sezemierung und einer spezifischen Aktivität durchgeführt (die durch die nachfolgenden Substitutionen der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 erhaltene alkalische Protease KP43H: Phe46Leu/Thr65Pro/Tyr195Gly/Val273Ile/Thr359Ser/Asp369Asn/Ser387Ala).

Das jede der mutierten Präprosequenzen kodierende Genfragment wurde mit BamHI und AatII aus pKF18k ausgeschnitten und mit einer Ligase mit dem KP43H kodierenden Gen verknüpft, das mit AatII und XbaI aus pKF18k ausgeschnitten worden war (die AatII Spaltstelle wurde durch ortsspezifische Substitution eines Nukleotids ohne Veränderung der durch das Gen kodierten Aminosäure neu eingeführt).

Escherichia coli HB101 Zellen wurden mit den so erhaltenen Plasmiden transformiert. Nach der Extraktion wurde jedes Plasmid mit BamHI und XbaI gespalten. Die so erhaltenen Fragmente wurden in pHA64 eingeführt, das zuvor mit diesen Enzymen behandelt worden war. Der Bacillus Sp. Stamm KSM-KP43 wurde durch Elektoporation unter Verwendung von SSH-10 (Shimadzu Corporation) und einer Genpulser Küvette (BioRad) transformiert. Die Einführung des Proteasegens wurde ermittelt auf der Basis der Erzeugung von Flecken durch die Transformanten auf einem Magermilch enthaltenden alkalischen Agarmedium (Magermilch (Difco) (1% (Gew./Vol.), Bactotrypton (Difco) (1%), Hefeextrakt (Difco) (0,5%), Natriumchlorid (0,5%), Agar (1,5%), Natriumkarbonat-Anhydrat (0,05%) und Tetracyclin (15 ppm)), wobei die Flecken den Abbau von Magermilch wiederspiegeln. Es wurden Transformanten ausgewählt, die Plasmide trugen, in denen das Proteasegen in pHA64 eingefügt war. Diese Stämme wurden dem nachstehend beschriebenen Züchtungsverfahren unterworfen.

Die Isolierung einzelner Kolonien und Ringbildung wurden für jede der Transformanten bestätigt und der Stamm wurde in ein Saatkulturmedium (5 mL) (Polypepton S (Nihon Pharmaceuticals Co., Ltd.) (6% (Gew./Vol.), Hefeextrakt (0,1%), Maltose (1%) Magnesiumsulfat-Heptahydrat (0,02%) Kaliumdihydrogenphosphat (0,1%), Natriumkarbonat-Anhydrat (0,3%) und Tetracyclin (30 ppm)) in einem Teströhrchen inokuliert, gefolgt von einer Präkultur bei 30°C und 320 UpM über Nacht. Die so erhaltene Saatkulturbrühe (1 Vol.-%) wurde in ein Kulturmedium (20 mL) (Polypepton S (8% (Gew./Vol.)), Hefeextrakt (0,3%), Maltose (10%) Magnesiumsulfat-Heptahydrat (0,04%) Kaliumdihydrogenphosphat (0,2%), Natriumkarbonat-Anhydrat (1,5%) und Tetracyclin (30 ppm)) in einer Sakaguchi-Flasche (Kapazität: 500 ml) inokuliert, gefolgt von einer Züchtung bei 30°C und 121 UpM für drei Tage. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert und die Proteaseaktivität des erhaltenen Kulturüberstandes wurde gemessen. Die Proteaseaktivität wurde mit dem Caseinverfahren gemessen und die Menge an erhaltenem Protein mit einem Protein Testkit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ermittelt. Im Ergebnis wurde gefunden, dass die Aktivität der alkalischen Protease KP43H mit der mutierten Präprosequenz im Vergleich zu der Kontrolle (ein durch Züchtung einer das Gen für die KP43H alkalische Protease tragenden Transformante unter den vorstehend genannten Bedingungen erzeugtes Produkt) um 5 bis 25% erhöht war (Tabelle 1). Von den wie vorstehend beschrieben ausgewählten Transformanten wurden Plasmide gesammelt und die Basensequenz von jedem der Plasmide wurde bestimmt. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass die Transformanten gezielte Mutanten waren.

Es wurde gefunden, dass die unter Verwendung der vorstehend genannten mutierten Präprosequenz erzeugte alkalische Protease in der Transformante in vermehrter Menge produziert wurde. Zusätzlich wurde ermittelt, dass die alkalische Protease die Eigenschaften der parentalen alkalischen Protease aufweist, insbesondere Resistenz gegenüber Oxidationsmittel, eine hohe Gelatine abbauende Aktivität, eine Casein abbauende Aktivität, die nicht durch hohe Konzentrationen von Fettsäuren inhibiert werden, ein Molekulargewicht von 43.000 +/– 2.000, ermittelt durch SDS-PAGE sowie Aktivität im alkalischen Bereich.

[Proteasetest- synthetisches Substrat Verfahren]

Ein synthetisches Substrat (Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA: AAPL) wurde eingesetzt, um die enzymatische Aktivität zu messen. In eine Testplatte mit 96 Vertiefungen (Iwaki) wurde ein Lösung enthaltend 100 mM Boratpuffer (pH 10,5) (48,5 μL) und 100 mM AAPL (1,5 μL) gegeben und darüber hinaus eine in geeigneter Weise verdünnte Enzymlösung or Kulturbrühe (50 μL). Hierdurch wurde die Reaktion bei 30°C für 15 Minuten unter Verwendung eines iMES Reader MS (LABSYSTEMS) initiiert. Die Absorption des freigesetzten p-Nitroanilins wurde bei 414 nm gemessen. Eine Einheit an enzymatischer Aktivität wurde definiert als die Menge an Enzym, die für die Erhöhung der Absorption um 0,001 pro Minute unter den vorstehend angegebenen Reaktionsbedingungen benötigt wird.

[Proteasetest-Caseinverfahren]

Ein Casein (1% (Gew./Vol.) enthaltender 50 mM Boratpuffer (pH 10,5) (1,0 mL) wurde 5 Minuten bei 30°C gehalten. Nachfolgend wurde eine Enzymlösung (0,1 mL) zum Puffer gegeben und so die Durchführung der Reaktion für 15 Minuten ermöglicht. Eine Lösung zu Beendigung der Reaktion (0,11 M Trichloressigsäure – 0,22 M Natriumacetat – 0,33 M Essigsäure) (2,0 mL) wurde zu dem so erhaltenen Reaktionsgemisch gegeben und das Gemische wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nachfolgend wurde das erhaltene Gemisch gefiltert und die Menge an Säure-löslichem Protein im Filtrat wurde mit einem modifizierten Lowry-Test gemessen. Genauer wurde eine alkalische Kupferlösung (1% Kalium-Natriumtartrat:1% Kupfersulfat-pentahydrat:2% Natriumkarbonat – 0,1 N Natriumhydroxid = 1:1:100) (2,5 mL) zum Filtrat gegeben (0,5 mL) und das so erhaltene Gemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nachfolgend wurde dem Gemisch eine Phenollösung (erhalten durch zweifache Verdünnung eines Phenolreagens (Kanto Kagaku) in destilliertem Wasser) (0,25 mL) zugesetzt und das so erhaltene Gemisch wurde 30 Minuten bei 30°C inkubiert. Nachfolgend wurde die Absorption des Gemisches bei 660 nm gemessen. Eine Einheit an Proteaseaktivität (1 PE) wurde definiert als die Menge an Enzym, die für die Freisetzung von Säure-löslichen Protein Abbauprodukten pro Minute unter den vorstehend beschriebenen Reaktionsbedingungen erforderlich ist, die 1 mMol Tyrosin entsprechen. Tabelle 1

MutanteRelative Aktivität (%)KP43H (Kontrolle)100Lys52Asp105Lys52Arg119Gln75Ala110Gln75Arg110Glu142Lys107Lys52Arg/Glu142Lys125

Beispiel 3(1) Herstellung eines Reinigungsmittels

In einen Mischtank (1 m3), der mit einem Rührpaddel versehen war, wurde Wasser (465 kg) gegeben. Nachdem die Temperatur des Wassers 55°C erreicht hatte, wurde dem Wasser eine 40%-ige (Gew./Vol.) wässrige Lösung an Natriumpolyacrylat (135 kg) zugegeben. Nachdem das so erhaltene Gemisch 15 Minuten gerührt worden war, wurde diesem Natriumkarbonat (120 kg), Natriumsulfat (60 kg), Natriumsulfit (9 kg) und ein Fluoreszenzfarbstoff (3 kg) zugegeben. Nachdem das so erhaltene Gemisch weitere 15 Minuten gerührt worden war, wurde ihm Zeolith (300 kg) zugesetzt, es wurde für weitere 30 Minuten gerührt und so eine homogene Aufschlämmung erhalten (Wassergehalt der Aufschlämmung: 50 Masse-%). Die Aufschlämmung wurde durch eine Druckspraydüse, die in der Nähe der Spitze eines Sprühtrocknungsturmes angebracht war gesprüht, wodurch ein granulärer Grundstoff erhalten wurde (ein Gas hoher Temperatur wurde bei 225°C durch den unteren Teil des Sprühtrocknungsturmes eingeführt und bei 105°C von der Spitze des Turmes ausgestoßen).

Nachfolgend wurde der so erhaltene granuläre Grundstoff (100 Gewichtsteile) in einen Lodige Mixer (Matsuzaka Giken Co., Ltd, Kapazität: 20 L, mit einer Ummantelung versehen) gefüttert. Während der granuläre Grundstoff mit der Hauptwelle gerührt wurde (150 UpM), wurde ein Gemisch aus nicht-ionischem Grenzflächen-aktivem Mittel (20 Gewichtsteile), linearem Natriumalkyl(C10-C13)benzolsulfonat (22 Gewichtsteile), einem Natriumsalz einer Fettsäure (C14-C18) (4 Gewichtsteile), Polyethylenglykol (2 Gewichtsteile) und Wasser (4 Gewichtsteile) über einen Zeitraum von 3 Minuten zum Mixer gegeben. Nachfolgend wurde das so erhaltene Gemisch fünf Minuten lang gerührt. Außerdem wurden kristallines Natriumsilikat (20 Gewichtsteile) und Zeolith (10 Gewichtsteile) zum Mixer gegeben, wodurch eine Beschichtung der Oberfläche durchgeführt wurde und eine Reinigungsmittelbasis erhalten wurde.

Die Reinigungsmittelbasis (99 Masse-%) wurde mit dem erfindungsgemäßen Proteasegranulat (0,5 Masse-%) und einem Duftstoff (0,5 Masse-%) gemischt, wodurch das Endprodukt granuläres Reinigungsmittel A erhalten wurde.

(2) Eingesetzte Rohmaterialien

  • Nicht-ionisches Grenzflächen-aktives Mittel: Emulgen 108KM (durchschnittliche Molzahl an zugegebenem Ethylenoxid: 8,5 (Kao Corporation))
  • Wässrige Lösung an Natriumpolyacrylat: durchschnittliches Molekulargewicht: 10.000 (hergestellt nach dem in Beispielen der japanischen Patentveröffentlichung („kokoku”) Nr. 2-24283 beschriebenen Verfahren)
  • Natriumkarbonat: dichte Asche (Central Glass Co., Ltd.)
  • Zeolith: Zeolith 4A (durchschnittliche Teilchengröße: 3,5 μm, (Tosoh Corporation))
  • Polyethylenglycol: K-PEG 6000 (durchschnittliches Molekulargewicht: 8.500 (Kao Corporation))
  • Kristallines Natriumsilikat: Pulver SKS-6 (Hoechst Tokuyama Co., Ltd.)
  • Proteasegranulat gemäß erfindungsgemäßen Ausführungsformen: Granulat (6 PE/g), hergestellt aus jeder der gereinigten Proben der erfindungsgemäßen Ausführungsformen der alkalische Protease, die in Tabelle 1 dargestellt sind. Hierbei wurde das Verfahren von Beispiel 1 der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) mit der Nummer 62-257990 eingesetzt.
  • Fluoreszenzfarbstoff: Tinopal CBS-X (Ciba-Geigy Corp.)

Beispiel 4(1) Herstellung eines Reinigungsmittels

Die Aufschlämmung (Feststoffgehalt: 50 Masse-%) wurde mit heißer Luft bei 250°C sprühgetrocknet, wodurch ein granulärer Grundstoff erhalten wurde, der Natriumpolyacrylat (durchschnittliche Molekulargewichtsmasse: 10.000) (7 Masse-%), Natriumkarbonat (26 Masse-%), Natriumsulfat (20 Masse-%), Natriumchlorid (6 Masse-%), Fuoreszenzfarbstoff (0,5 Masse-%), Zeolith (40 Masse-%) und Wasser (0,5 Masse-%) enthielt.

Nachfolgend wurde der so erhaltene granuläre Grundstoff (100 Gewichtsteile) in einen Lodige Mixer (Matsuzaka Giken Co., Ltd, Kapazität: 20 L, mit einer Ummantelung versehen) gefüttert. Während der granuläre Grundstoff mit der Hauptwelle gerührt wurde (150 UpM), wurde ein Gemisch aus nicht-ionischem Grenzflächen-aktivem Mittel (20 Gewichtsteile), linearem Natriumalkyl(C10-C13)benzolsulfonat (22 Gewichtsteile), einem Natriumsalz einer Fettsäure (C14-C18) (4 Gewichtsteile), Polyethylenglykol (2 Gewichtsteile) und Wasser (4 Gewichtsteile) über einen Zeitraum von 3 Minuten zum Mixer gegeben. Nachfolgend wurde das so erhaltene Gemisch fünf Minuten lang gerührt. Außerdem wurden kristallines Natriumsilikat (20 Gewichtsteile) und Zeolith (10 Gewichtsteile) zum Mixer gegeben, wodurch eine Beschichtung der Oberfläche durchgeführt wurde und eine Reinigungsmittelbasis erhalten wurde.

Die Reinigungsmittelbasis (95 Masse-%) wurde mit Bleichstoffgranulat (2,8 Masse-%) Bleichaktivatorgranulat (1,2 Masse-%) Proteasegranulat von erfindungsgemäßen Ausführungsformen (0,5 Masse-%) und einem Duftstoff (0,5 Masse-%) gemischt, wodurch das Endprodukt granuläres Detergens B erhalten wurde.

(2) Eingesetzte Rohmaterialien

  • Nicht-ionisches Grenzflächen-aktives Mittel: Emulgen 108KM (durchschnittliche Molzahl an zugegebenem Ethylenoxid: 8,5 (Kao Corporation))
  • Wässrige Lösung an Natriumpolyacrylat: durchschnittliches Molekulargewicht: 10.000 (hergestellt nach dem in Beispielen der japanischen Patentveröffentlichung („kokoku”) Nr. 2-24283 beschriebenen Verfahren)
  • Natriumkarbonat: dichte Asche (Central Glass Co., Ltd.)
  • Zeolith: Zeolith 4A (durchschnittliche Teilchengröße: 3,5 um, (Tosoh Corporation))
  • Polyethylenglycol: K-PEG 6000 (durchschnittliches Molekulargewicht: 8.500 (Kao Corporation))
  • Kristallines Natriumsilikat: SKS-6 (Hoechst Tokuyama Co., Ltd.)
  • Proteasegranulat gemäß erfindungsgemäßen Ausführungsformen: Granulat (6 PE/g), hergestellt aus jeder der gereinigten Proben der erfindungsgemäßen Ausführungsformen der alkalische Protease, die in Tabelle 1 dargestellt sind. Hierbei wurde das Verfahren von Beispiel 1 der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) mit der Nummer 62-257990 eingesetzt.
  • Fluoreszenzfarbstoff: Tinopal CBS-X (Ciba-Geigy Corp.)
  • Bleichstoffgranulat: ein Natriumkarbonat-Wasserstoffperoxid Additionsprodukt (hergestellt in gleicher Weise wie in Paragraph [0019] der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) mit der Nummer 2000-256699 für ein Bleichstoffgranulat beschrieben)
  • Bleichaktivatorgranulat: Natriumlauroyloxybenzolsulfonat Granulat (hergestellt in gleicher Weise wie in Paragraph [0018] der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) mit der Nummer 2000-256699 für ein Bleichaktivatorgranulat beschrieben).

Beispiel 5

Flüssigreinigungsmittel-Zusammensetzungen (Reinigungsmittel C und D), wie in Tabelle 2 dargestellt, wurden hergestellt. Tabelle 2

BestandteileReinigungsmittel C (Masse-%)Reinigungsmittel D (Masse-%)Nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel1)25,0-Nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel2)5,0-Nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel3)10,0-Nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel4)-9,0Nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel5)-9,0Nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel6)-2,5anionisches grenzflächenaktives Mittel7)1,0-Silikon8)-0,8Carbonsäure-basiertes Polymer9)2,0-Polymer10)-0,8Zitronensäure0,2-Calciumchlorid0,05-Monoethanolamin4,0-Triethylenglykolphenylether3,0-Propylenglycol3,0-Ethanol2,02,0Natriumsulfit0,2-Protease11)0,51,0Duftstoff Wasser0,5 Ausgleich0,5 AusgleichGesamt100100Verwendung Konzentration bei20 g/30 L40 g/30 LReinigungsmittels pH-Wert des flüssigen10,57,3
1) Polyoxyethylen (durchschnittliche Molzahl/Zahl der Mol an zugesetzten EO: 7) Alkylether mit einer Alkylgruppe, abgeleitet aus einem sekundären C12-C14 Alkohol (Softanol 70, Nippon Shokubai Co., Ltd.)
2) Polyoxyethylen (durchschnittliche Molzahl/Zahl der Mol an zugesetzten EO: 12) Alkylether mit einer Alkylgruppe, abgeleitet aus einem sekundären C12-C14 Alkohol (Softanol 120, Nippon Shokubai Co., Ltd.)
3) Produkt, erhalten durch nachfolgende Zugabe von EO (durchschnittliche Molzahl/Zahl der Mol: 5), PO (durchschnittliche Molzahl: 2), und EO (durchschnittliche Molzahl: 3) zu einem linearen C10-C14 primären Alkohol.
4) Polyoxyethylenlaurylether (durchschnittliche Molzahl an zugesetztem EO: 8)
5) Polyoxyethylenlaurylether (durchschnittliche Molzahl an zugesetztem EO: 11,5)
6) Eng verteilter Polyoxyethylenalkyl(sek-C12/C13)-ether
7) Lineares Natriumalkyl(C10-C14)-benzolsulfonat
8) Amid/Ether-modifiziertes Silikonpolymer (BY16-906, Dow Coming Toray Silicone Co., Ltd.)
9) Phenoxypolyethylenglykol-Acrylsäure-Maleinsäure Kopolymer, synthetisiert gemäß dem in den Zeilen 6 bis 13 von Seite 11 der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) Nr. 10-60476 beschriebenen Verfahren (Massenmittel des Molekulargewichts: 10.000; Feststoffgehalt: 51,2%)
10) Natriumsalz einer Penten/Maleinsäure (molares Verhältnis: 50/50) Kopolymers (Massenmittel des Molekulargewichts: 7.000)
11) Jede der aufgereinigten Proben von in Tabelle 1 gezeigten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen alkalischen Protease (15 PE/g)

Beispiel 6

Während von den in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführten Komponenten Natriumperkarbonat- und Natriumkarbonat (dichte Asche) unter Rühren gemischt wurden, wurde eine 40%-ige wässrige Lösung an Natriumpolyacrylat, linearem Natriumalkylbenzolsulfonat oder einem nicht ionischem grenzflächenaktiven Mittel und Natriumlauroyloxybenzolsulfonat zu dem Gemisch gegeben. Nachfolgend wurde zu dem so erhaltenen Gemisch Proteasegranulat gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform zugegeben, hergestellt nach dem in Beispiel 1 der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) Nr. 62-257990 beschriebenen Verfahren.

Das so erhaltene Gemisch wurde gerührt, wodurch insgesamt ein gleichförmiges Gemisch und damit ein Bleichmittel erhalten wurde. Tabelle 3

BestandteileBleichmittel E (Masse-%)Bleichmittel F (Masse-%)Natriumperkarbonat1)72,072,0Natriumkarbonat (dichte Asche)20,020,0Anionisches Grenzflächen aktives Mittel2)2,0-Nicht ionisches Grenzflächen aktives Mittel3)-2,0Natriumpolyacrylat4)1,01,0Natriumlauroyloxybenzolsulfonat4,04,0Protease5)1,01,0
1) Partikelgroße: 500 bis 700 μm
2) Lineares Natriumalkyl(C12-C14)-benzolsulfonat
3) Polyoxyethylenalkylether (Anzahl an Kohlenstoffatomen der Alkylgruppe: 12 bis 14, durchschnittliche Molzahl/Zahl der Mol an zugesetzten EO: 12)
4) Durchschnittliches Molekulargewicht: 8.000
5) Granulat (6 PE/g), hergestellt aus jeder der gereinigten Proben einer in Tabelle 1 gezeigten erfindungsgemäßen Ausführungsform der alkalischen Protease nach dem in Beispiel 1 der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) Nr. 62-257990 beschriebenen Verfahren.

Beispiel 7

Es wurden die in der nachfolgend beschriebenen Tabelle 4 dargestellten Reinigungsmittelzusammensetzungen für einen automatischen Geschirrspüler (Reinigungsmittel G und H) hergestellt. Tabelle 4

BestandteileReinigungsmittel G (Masse-%)Reinigungsmittel H (Masse-%)Pluronic L-611)-4,0Softanol EP-70852)4,0-Trinatriumcitrat-30,0Natriumtripolyphosphat30,0-Natriumperkarbonat20,020,0Natriumkarbonat20,020,0Amorphes Silikat3)10,010,0AA-MA4)4,04,0Natriumsulfat10010,0α-Amylase5)1,01,0Protease6)1,01,0
1) ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen Koploymer (durchschnittliches Molekulargewicht: 2.000)
2) Produkt, erhalten durch Zugabe von einem C12-C14 sek-Alkohol zu Ethylenoxid (7 Mol) und Propylenoxid (8,5 Mol)
3) JIS Nr. 2 Natriumsilikat
4) Acrylsäure-Maleinsäure Kopolymer
5) Duramyl 60TTM (Novozymes)
6) Granulat (6 PE/g), hergestellt aus jeder der gereinigten Proben einer in Tabelle 1 gezeigten erfindungsgemäßen Ausführungsform der alkalischen Protease nach dem in Beispiel 1 der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) Nr. 62-257990 beschriebenen Verfahren.

Beispiel 8

Eine Reinigungsmittelzusammensetzung für harte Oberflächen (Reinigungsmittel J) wurde aus Bestandteilen hergestellt, die in der nachfolgenden Tabelle 5 dargestellt sind. Tabelle 5

BestandteileReinigungsmittel J (Masse-%)Anionisches Grenzflächen-aktives Mittel1)15,0Nicht-ionisches Grenzflächen-aktives Mittel2)5,0Nicht-ionisches Grenzflächen-aktives Mittel3)5,0Amphoteres Grenzflächen-aktives Mittel4)7,5Amphoteres Grenzflächen-aktives Mittel5)4,0Zitronensäure1,0Polypropylenglykol6)2,0Ethanol5,0Protease7)1,0Duftstoff, Wasser, etc./Mittel zum Angleichen des pH-Werts54,5Gesamt100,0
1) Natriumpolyoxyethylen(EOP [durchschnittliche Zahl der zugegebenen Mol an EO Gruppen] = 4)-alkyl(C12)-ethersulfat
2) Polyoxyethylen(EOP = 8)-alkyl(C12)-ether
3) Alkyl(C12)-polyglucosid (Kondensationsgrad: 1,3)
4) Mono-langkettiges tertiäres Alkyl(C12)-dimethylaminoxid
5) Alkyl(C12)-hydroxydimethylsulfobetain
6) Molekulargewicht: 10.000
7) Jede der aufgereinigten Proben einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen alkalischen Protease wie in Tabelle 1 gezeigt (15 PE/mL)

Beispiel 9

Granuläre Reinigungsmittel, wie in der nachfolgenden Tabelle 6 gezeigt, wurden unter Verwendung des vorstehend genannten Reinigungsmittel A (sh. Beispiel 3) hergestellt. Tabelle 6

Bestandteile (Masse-%)Reinigungsmittel KReinigungsmittel LReinigungsmittel MReinigungsmittel NReinigungsmittel basis von Beispiel 398,498,398,597,2Duftstoff0,50,50,50,5Protease1)0,50,50,50,5Übliche Protease2)0,60,6Cellulase3)0,70,7Lipase4)0,50,5
1) Granulat (6 PE/g), hergestellt aus jeder der gereinigten Proben einer in Tabelle 1 gezeigten erfindungsgemäßen Ausführungsform der alkalischen Protease nach dem in Beispiel 1 der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) Nr. 62-257990 beschriebenen Verfahren.
2) Protease K-16, beschrieben in der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) Nr. 5-25492, deren Aktivität auf 5 PE/g reguliert wurde und zwar gemäß dem in Beispiel 1 der offengelegten japanischen Patentanmeldung („kokai”) Nr. 62-257990 beschriebenen Verfahren.
3) KAC-500 (Kao Corporation)
4) Lipolase 100TTM (Novozymes)

Gewerbliche Anwendbarkeit

Erfindungsgemäß kann eine alkalische Protease mit erhöhter Produktion hergestellt werden. insbesondere kann eine alkalische Protease wirtschaftlich hergestellt werden, die eine Aktivität auch in Gegenwart einer Fettsäure in hoher Konzentration aufweist und die darüber hinaus ausgezeichnete Reinigungseigenschaften gegenüber komplexen Verschmutzungen zeigt, die Proteine und Talg enthalten. SEQUENZPROTOKOLL

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.