Title:
Concentration and isolation of oregonin from alder bark, useful as antioxidant in cosmetic or therapeutic compositions, includes treating hot water extract with adsorber resin
Kind Code:
A1


Abstract:
Improved method for concentration and isolation of oregonin (I) from alder (Alnus) bark. Improved method for concentration and isolation of oregonin (I) from alder (Alnus) bark comprises extraction with hot water; filtration; selective separation from the cooled extract on an adsorber resin; washing with water; elution with alcohol and distillation of the solvent.



Inventors:
gleich Anmelder
Application Number:
DE10247476A
Publication Date:
04/29/2004
Filing Date:
10/11/2002
Assignee:
Lorenz, Peter, Dr. (Magdeburg, 39128, DE)
Rönnefahrt, Ines, Dr. (Großwoltersdorf, 16775, DE)
International Classes:
C07H15/04 (IPC1-7): C07H15/04



Foreign References:
GB1019271A1966-02-02
Claims:
1. Verbessertes Verfahren zur Anreicherung und Isolierung von Oregonin der Formel I
aus Erlenrinde mittels Extraktion in heißem Wasser, Filtration, selektiver Ausscheidung aus dem abgekühlten Extrakt auf Adsorberharz, Waschen mit Wasser, Elution mit Alkohol und Abdestillieren des Lösemittels.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Rinde vor der Extraktion mit heißem Wasser gemahlen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion mit heißem Wasser mehrmals wiederholt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Extraktion der Erlenrinde an Stelle von Wasser andere Lösemittel wie wäßriges Ethanol, Methanol oder Aceton verwendet, diese Lösemittel nach der Extraktion abdestilliert und den Rückstand vor Elution über das Adsorberharz in Wasser löst.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass bevorzugt ein schwach polares Adsorberharz auf Acrylat-Basis verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Adsorberharz auf Acrylat-Basis Amberlit® XAD-7 vorzüglich geeignet ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Elution vom Adsorberharz an Stelle von Ethanol auch Methanol, n- bzw. iso-Propanol eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Abscheidung des Polyphenols aus dem wäßrigen Extrakt im Festbett, in einer Chromatographie-Säule, einem Hängegefäß mit Siebboden-Einlage oder durch Rühren mit dem Adsorberharz und anschließende Filtration erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, das andere Biarylheptanoide der Formeln II und III angereichert werden,
worin R1 und R2 für H, OH oder OCH3 und R3 bzw. R4 für N, OH oder eine Zuckereinheit (z.B. D-Glucose, D-Xylose) steht.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Baum-Rinde von Erlen, besonders der Art Schwarz- und Grau-Erle (Alnus glutinosa L. und Alnus incana L.) hohe Ausbeuten liefert.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man Biarylheptanoide der Formeln 1, II und III durch Extraktion von Rinden anderer Betulaceae (wie Alnus und Betula) aber auch Pinus-Arten gewinnt.

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, das Oregonin der Formel I oder Oregonin-angereicherte Extrakte gewonnen werden, die gegenüber 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) vorzügliche Radikalfänger-Eigenschaften besitzen.

Description:

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Erlen-Polyphenolgerbstoff durch Extraktion von Erlenrinde mit heißem Wasser und Anreicherung des Hauptbestandteils Oregonin mit Hilfe eines Adsorberharzes auf Acrylester-Basis. Oregonin der Formel I ist ein Polyphenol-O-Glycosid, das sich als wertvoller phytopharmazeutischer oder kosmetischer Wirkstoff eignet.

Oregonin der Formel I wurde als wasserlöslicher Hauptbestandteil der Rinde von Oregon-Erle, Alnus oregona Nutt. aber auch vieler europäischer Erlen, z.B. Alnus glutinosa (L.), A. incana (L.) und A. cordata (Loisel.) Desf. erkannt (Karchesy, J.J. at al., J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1974, 16, 649-650, Guz, N. & Lorenz, P. et al., Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 471-474).

Aus der Literatur sind vielfältige biologische Wirkungen von Oregonin bekannt. So wirkt die Substanz der Formel I z.B. entzündungshemmend, durch Inhibierung von Cyclooxygenase-2 (COX-2) und Stickstoffoxidsynthase (i-NOS).

COX-2 und i-NOS sind dem Fachmann als proteinogene Entzündungsfaktoren bekannt (Lee, M.W. et al., Planta Med., 2000, 66, 551-553, Lee M.W. et al., Biological & Pharmaceutical Bulletin 2000, 23, 517-518.). Weiterhin zeigt Oregonin der Formel I antibakterielle Wirkungen (Saxena, G. et al., Int. J. Pharmacocnosy, 1995, 33, 33-36) und ist ein natürliches Antioxidants (Gonzales-Larado, R.F. et al., Rev. Latinoam. Quim. 1997, 25, 62-70). Aufgrund seiner Chelatisierungs-Eigenschaften, z.B. mit Metallionen farbige Komplexe zu bilden, eignet es sich auch für die Färbung von Naturfasern. Die phenolischen Hydroxylgruppen und die Hydroxyl-Gruppen des D-Xylose-Restes im Oregonin bestimmen seine hydrophilen Eigenschaften, wie beispielsweise eine gute Löslichkeit in protischen Lösungsmitteln (z.B. Alkohole, Wasser), sowie die Fähigkeit, durch semipermeable biologische Membranen zu diffundieren. Beides sind wichtige Voraussetzungen für die Verwendung in Kosmetika bzw. pharmazeutischen Formulierungen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung sollte es sein ein einfaches und billiges Verfahren aufzuzeigen, mit welchem die Hochanreicherung und Isolierung von Erlen-Polyphenolen bzw. Oregonin auch in industriellem Maßstab gelingt.

Durch Extraktion von Erlenrinde mit Wasser oder Alkoholen, wie es in der GB 1019271 beschrieben wird, gelingt die Anreicherung der Polyphenol-Bestandteile (insbesondere Oregonin) nur zu sehr geringem Prozentsatz. Andere in der Literatur beschriebene Verfahren zur Reinisolierung von Oregonin der Formel I setzen aufwendige chromatographische Reinigungen voraus, liefern nur geringe Ausbeuten und sind somit nicht für eine rentable industrielle Gewinnung der Substanz geeignet.

Die Erfindung

Die gestellte Aufgabe wurde überraschenderweise gelöst durch Selektiv-Extraktion eines Heißwasser-Auszuges von Erlenrinde mit Hilfe eines Adsorberharzes auf Acrylester-Basis (Amberlit® XAD-7, Rohm & Haas Co.). Gegenstand der Erfindung ist somit ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung des Erlen-Polyphenolgerbstoffs Oregonin durch Extraktion eines Heißwasser-Auszuges von Erlenrinde, mit Hilfe des Adsorberharzes Amberlit® XAD-7, Waschen des Harzes mit Wasser und Auswaschen der somit angereicherten Polyphenole (besonders Oregonin) mit Hilfe von Alkoholen.

Bevorzugte Ausführungsformen

Verfahren zur Herstellung von Polyphenolgerbstoff Oregonin der Formel I durch Extraktion der getrockneten und gemahlenen Rinden verschiedener europäischer bzw. nordamerikanischer Erlenarten z.B. Alnus glutinosa L., Alnus incana L., Alnus cordata (Loisel.) Desf. oder Alnus oregona Nutt. mit heißem Wasser oder wäßrigem Alkohol, wobei man vorzugsweise mit einem Verhältnis der Droge zum Lösemittel von 1 : 5 bis 1 : 10 arbeitet. Bevorzugte Temperaturen für die Durchführung der Extraktion liegen im Bereich von 50 bis 120 °C, besonders bevorzugt im Bereich des Siedepunktes des eingesetzten Lösemittels. Die Extraktion wird üblicherweise unter Rühren der Extraktionsmischung durchgeführt und bei Normaldruck. Das erfindungsmäßige Verfahren kann jedoch auch unter vermindertem oder erhöhtem Druck durchgeführt werden. Die Anwendung von erhöhtem Druck ist insbesondere dann angezeigt, wenn man die Extraktion der Erlenrinde bei einer Temperatur durchführen möchte, bei der das Lösungsmittel unter Normaldruck siedet. Geeignete Lösungsmittel für die Extraktion sind zum Beispiel: Wasser, wäßriges Ethanol, Methanol oder Aceton. Die Extraktion wird vorzugsweise zwei- bis dreimal wiederholt, wobei man jeweils von der Droge abfiltriert, abnutscht bzw. über eine Filterpresse abpreßt.

In dem hier beschriebenen erfindungsmäßigen Verfahren werden anschließend mit Hilfe des Adsorberharzes Amberlite® XAD-7 alle mittelpolaren Verbindungen, insbesondere Polyphenol-Glycoside, selektiv gebunden. Hochpolare Substanzen und alle nicht wirksamen Verbindungen, wie z.B. Zucker und Salze werden in der bevorzugten Ausführungsform nach Adsorption ausgewaschen. Die Abscheidung der Erlen-Polyphenole erfolgt vorzugsweise mit Hilfe einer Festbett-Extraktion, wobei man das gewaschene Amberlit® XAD-7 in einem Büchner-Trichter mit Frittenboden vorlegt, den wäßrigen Extrakt von oben aufgibt und langsam durch das Harz durchlaufen läßt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Festbett-Extraktion mit dem XAD-Harz auch in einem Chromatographie-Rohr oder Hänge-Gefäß mit Fritten- bzw. Siebboden durchgeführt werden. Es versteht sich von selbst, dass eine Anwendung von Über- oder Unterdruck das Durchlaufen des Extraktes durch das XAD-Harz beschleunigt. Bei Beschleunigung des Prozesses können jedoch aufgrund zu geringer Verweilzeiten Verluste auftreten.

Amberlite® XAD-7, ein Homopolymer aus Trimethylolpropan-trimethacrylat, ist ein schwach polares Adsorberharz, welches aufgrund der hohen Affinität seiner Ankergruppen für schwach saure phenolische ON-Gruppen sich besonders gut für die Adsorbtion von Polyphenolen und Polyphenol-Gycosiden eignet. Das Adsorberharz ist z.B. von Rhom & Haas Co. in Form harter unlöslicher Perlen (Oberfläche: 450 m2/g; Teilchengröße: 20-50 mesh) kommerziell erhältlich. Bevorzugt verwendet man 1 Teil XAD-7 für die Adsorbtion von Polyphenol aus 10 Teilen wäßrigem Erlenextrakt.

Die Desorbtion des auf dem XAD-Harz angereicherten Erlen-Polyphenols erfolgt in dem erfindungsmäßigen Verfahren üblicherweise mit Ethanol. Aber auch andere Lösemittel z.B. Methanol, iso- und n-Propanol können dazu verwendet werden. Das Lösungsmittel kann durch Destillation unter vermindertem Druck zurückgewonnen werden, wodurch das erfindungsmäßige Verfahren sehr wirtschaftlich arbeitet. Als Rückstand wird üblicherweise Erlen-Polyphenol mit einem hohen Gehalt an Oregonin der Formel I erhalten. Der im Erlen-Polyphenol spektralphotometrisch bestimmbare Polyphenolglycosid-Gehalt beträgt gewöhnlich mindestens 70 % (ber. als Oregonin). Es ist überraschend, daß durch Anwendung von XAD-7 eine Selektivextraktion und damit eine Hochanreicherung von Oregonin in einem Schritt gelingt. Damit wird ein wesentlich höherer Oregonin-Gehalt erzielt, als bei der Durchführung einer einfachen Extraktion mit Ethanol oder Wasser und anschließendem Aufkonzentrieren durch Verdampfen des Lösemittels. Das erfindungsgemäße Verfahren ist damit wirtschaftlicher und erreicht im Vergleich zu den Verfahren des Standes der Technik höhere Raum-Zeit-Ausbeuten. Das Verfahren hat außerdem den Vorteil, dass nur unbenkliche und umweltverträgliche Lösungsmittel (z.B. Alkohole) verwendet werden. Die nach Verdampfen oder Abdestillieren im Festextrakt enthaltenen Lösungsmittel-Rückstände sind nur gering und unbedenklich. Damit eignet sich ein so gewonnenes Erlen-Polyphenol bzw. Oregonin als pharmazeutischer oder kosmetischer Wirkstoff.

Nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das XAD-Harz sehr leicht durch nachfolgendes Waschen mit Alkohol, verdünnter Natronlauge, verdünnter Salzsäure und Wasser regeneriert werden. Durch die leichte Regenierbarkeit und einfache Handhabung des verwendeten Adsorberharzes XAD-7 kann das erfindungsmäßige Verfahren auch im Technikums- bzw. industriellen Maßstab mit hoher Wirtschaftlichkeit durchgeführt werden.

Neben Oregonin der Formel I konnten mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens auch andere Biarylheptanoide der Formeln II und III angereichert werden, die als Nebenbestandteile je nach Erlen-Art in unterschiedlichen Konzentrationen vorkommen. Solche dem Oregonin ähnliche Biarylheptanoide wurden durch Vergleich ihrer Massenspektren mit Literaturspektren bekannter Verbindungen identifiziert. Damit kann das beschriebene erfindungsgemäße Verfahren auch zur Herstellung bzw. Anreicherung anderer Biarylheptanoide der Formel II und III verwendet werden,

worin R1 und R2 für N, OH oder OCHS und R3 bzw. R4 für N, OH oder eine Zuckereinheit (z.B. D-Glucose, D-Xylose) steht. Als Rohmaterial für die Isolierung der Biarylheptanoide der allgemeinen Formeln I bis III sind für das erfindungsmäßige Verfahren Baum-Rinden verschiedener Betulaceae-Arten (z.B. Alnus, Betula) aber auch Pinus-Arten geeignet (s. a. Lee, K.K. et al., J. Nat. Prod. 61, 1407-1409).

Oregonin der Formel I und Biarylheptanoide der Formel II und III können beispielsweise als Antioxidantien, Zellproliferations-Beschleuniger (z.B. JP 10237087) oder allgemein als kosmetische und pharmazeutische Wirkstoffe verwendet werden. Von besonderem Interesse ist dabei der Schutz des Zellgewebes vor oxidativem und nitrosativem Stress, der z.B. durch Bildung von reaktiven Molekülspezies (Radikale) initiiert wird. Oxidativer bzw. nitrosativer Stress ist eine Sammelbezeichnung für die Belastung der lebenden Zelle durch Anreicherung giftiger oxidierender oder nitrierender Verbindungen (reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies: N2O2, O2·, NO, ONOO, HO·, Singulett-Sauerstoff und Hydroperoxid-Anionen). Letztere können im Zellgewebe z.B. Lipide oder Proteine zerstören. Der oxidative / nitrosative Stress kann durch Umwelteinflüsse wie Strahlungs-Einwirkung, Xenobiotika, Schwermetall-Ionen oder Ischämie / Reperfusion (zeitweise Unterbrechung der Blutzufuhr eines Organs) induziert werden und spielt nachweislich eine Rolle z.B. bei der Hautalterung, sowie bei der Entstehung einer Reihe akuter und chronischer Erkrankungen (z.B. Entzündungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Schlaganfall und Krebs).

Die Entstehung von nitrosativen Stress wird insbesondere durch die Bildung des Radikals Stickstoffmonoxid (NO) und seiner Folgeprodukte ausgelöst. In Macrophagen oder auch Mikroglia-Zellen, also Körperzellen die der Immunabwehr dienen, wird bei Entzündungsprozessen das Enzym iNOS (induzierbare Stickoxidsynthase) expremiert, welches aus der Aminosäure L-Arginin das Radikal Stickoxid (NO) unter Bildung von L-Citrullin erzeugt. Obgleich die anti-oxidativen und die Radikalfänger-Wirkung von Erlenextrakt in der Literatur beschrieben sind (Gonzales-Larado, R.F. et al., Rev. Latinoam. Quim. 1997, 25, 62-70), wurde unseres Wissens nach bisher kein direkter experimenteller Nachweis der Radikalfänger-Wirkung von Oregonin der Formel I aufgezeigt. Überraschenderweise zeigte sich, dass das durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnene Oregonin der Formel I eine sehr starke Radikalfänger(Scavenger)-Wirkung besitzt, was von uns an der Reaktion der Verbindung mit dem stabilen Radikal DPPH (2,2-Diphenylpikryl-1-hydrazyl) als Modellsubstanz nachgewiesen werden konnte. Die Scavenger-Eigenschaften des Oregonins übersteigen sogar die der Ascorbinsäure (Vitamin C) und von Trolox® ((±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karbonsäure), einem wasserlöslichen Vitamin E-Analogon. Damit ist das durch die Erfindung gewonnene Erlen-Polyphenol bzw. Oregonin der Formel I als Radikalfänger für die verschiedensten Anwendungen geignet.

Beispiel 1:

790 g getrocknete und gemahlene Erlenrinde (vorzugsweise von Schwarzerle, Alnus glutinosa L. oder Grauerle, Alnus incana L.) werden zusammen mit 4.5 Ltr. Leitungswasser 30 min. unter ständigem Umrühren zum Sieden erwärmt. Anschließend läßt man 30 min. abkühlen und filtriert die Droge über ein Filtertuch. Man wiederholt die Extraktion noch zweimal in analoger Weise mit je 4.0 Ltr. Wasser. Die vereinigten wäßrigen Extrakte läßt man über Nacht stehen und filtriert über einen Faltenfilter. Den wäßrigen Extrakt eluiert man anschließend langsam über 1 kg Amberlite XAD-7 (Fluka), welches zuvor mit 8 Ltr. Wasser gewaschen wurde. Die Elution kann z.B. in einer Chromatographie-Säule oder in einem Büchner-Trichter mit Frittenboden erfolgen. Anschließend wäscht man das XAD-Harz 4x mit je 5.0 Ltr. Wasser und danach 4x mit je 1.0 Ltr. 96%igem Ethanol. Der ethanolische Extrakt wird am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck zur sirupösen Konsistenz eingeengt. Ausbeute: 109 g rotbrauner Extrakt (13.8 % ber. auf eingesetzte Drogenmenge). Polyphenol-Gehalt: 72% ber. als Oregonin im naturfeuchten Produkt (spektralphot. in MeOH, λ max. = 283 nm, log ε = 3.75). Die Charakterisierung des Oregonins erfolgte durch dünnschichtchromatographische Untersuchung mit Hilfe einer Vergleichssubstanz (Rf = 0,54; DC-System: CHCl3 MeOH : H20 = 10 : 5 : 1; Detektion mittels Anisaldehyd / Schwefelsäure-Reagenz). Die 1H- und 13C-NMR-Daten des Oregonins entsprachen der Literatur (Ohta, Shinji et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1984, 8, 1635-1642). Die Regeneration des XAD-Harzes erfolgt durch Spülen mit Ethanol, anschließend mit 0.1 proz. NaOH (wt/vol), 0.1 proz. HCl (wt/vol) und Wasser, bis die ablaufende Spülflüssigkeit pH-neutral ist.

Beispiel 2:

1.0 kg gemahlene Erlenrinde (Alnus glutinosa L.) wird mit 5.0 Ltr. Ethanol / Wasser 90 / 10 (voI/voI) 2 h gerührt und weitere 36 h stehengelassen. Anschließend filtriert man die Droge ab und engt das Filtrat am Rotationsverdampfer bis zur sirupösen Konsistenz ein. Der so erhaltene rotbraune Sirup wird dann in 2.0 Ltr. warmem Wasser gelöst, ca. 30 min. gerührt und über eine Filternutsche filtriert. Das Filtrat gibt man nachfolgend, wie im Beispiel 1 beschrieben, über XAD-Harz, wäscht mit Wasser und eluiert das Polyphenol mit Ethanol. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels erhält man 105 g rotbraunen sirupösen Extrakt (10.5% ber. auf Drogenmenge). Polyphenol-Gehalt: 82 % ber. als Oregonin im naturfeuchten Produkt (spectralphot.). Gehaltsbestimmung Rein-Oregonin (HPLC-MS): 52,5 (ber. a. Naturfeuchte). MS (ESI, negativer Modus) f. Oregonin MW 478. Die Verbindung der Formel III, worin R1 = R2 = OH, R3 = N und R4 = D-Glucose (MW = 494) und die Verbindung der Formel III, worin R1 = R2 = OH, R3 = H und R4 = D-Xylose (MW = 464) wurden als Nebenverbindungen identifiziert.

Beispiel 3:

Analog Beispiel 1 wird Erlenrinde mit Wasser heiß extrahiert. Der so gewonnene Auszug wird filtriert, das Filtrat mit dem XAD-Harz versetzt und für ca. 1 h gerührt. Anschließend wird das Harz abgenutscht und wie im Beispiel 1 mit Wasser gewaschen und danach das Polyphenol mit Alkohol eluiert.

Beispiel 4 – Prüfung der durch die Erfindung hergestellten Substanz auf ihre Radikalfängerwirkung

Die Reaktion von Oregonin mit dem stabilen Radikal DPPH (2,2-Diphenylpikryl-1-hydrazyl) zeigt in methanolischer Lösung (0.1 mM) nach 30 min. Inkubation bei 37°C einen deutlich stärkeren Effekt im Vergleich zu klassischen Radikalfängern, wie z.B. Ascorbinsäure und Trolox, bei gleichen verwendeten Konzentrationen, s. 1. (ICSp-Werte f. Oregonin = 5.97μM, f. Vitamin C = 18.0 μM, f. Trolox 17.8 μM). Die Stammlösungen von Oregonin in DMSO (2.5, 5.0, 10 und 25 mM) wurden jeweils mit der DPPH-Lösung (MeOH) 1 : 1000 zum Erreichen der entsprechenden Zielkonzentration verdünnt und inkubiert. Die Extinktion von DPPH wurde spektralphotometrisch gemessen (λmax. = 516 nm). Die Daten repräsentieren die Mittelwerte (± SEM) aus 3 Messungen (n = 3). DMSO (1 μl / ml) zeigte selbst keinen Einfluß auf DPPH.