Title:
Removing biomolecules from liquid media, useful for purification, product recovery or preparation of vectors, comprises retention on hydrotalcite of controlled porosity
Kind Code:
A1


Abstract:
Removing at least one biomolecule (I) from a liquid or fluid medium using as absorption agent a double layered hydroxide (II), i.e. natural or synthetic hydrotalcite or similar compounds, where (II) is calcined before use and more than 50 % of its total pore volume, of pores between 1.7 and 300 nm, is provided by pores of diameter below 20 nm, is new. An Independent claim is also included for a composition comprising (I) and (II).



Inventors:
Jackisch, Björn-Oliver, Dr. (München, 80797, DE)
Brethauer, Simone (Zürich, CH)
Burzlaff, Arne (Hannover, 30451, DE)
Kasper, Cornelia, Dr. (Hannover, 30159, DE)
Scheper, Thomas, Prof. Dr. (Hannover, 30559, DE)
Application Number:
DE10237517A
Publication Date:
02/26/2004
Filing Date:
08/16/2002
Assignee:
Süd-Chemie AG (München, 80333, DE)



Foreign References:
6329515
WO1997048480A1
WO2002012255A1
JP2000290012A
Attorney, Agent or Firm:
PAe Splanemann Reitzner Baronetzky Westendorp (München)
Claims:
Verfahren zur Entfernung oder Gewinnung von mindestens einem Biomolekül aus einem flüssigen oder fluiden Medium mit Hilfe eines Sorptionsmittels, wobei als Sorptionsmittel ein Schichtdoppelhydroxid, ausgewählt aus der Gruppe der natürlichen und synthetischen Hydrotalcite sowie der Hydrotalcit-ähnlichen Verbindungen verwendet wird, und wobei das Schichtdoppelhydroxid vor der Verwendung calciniert wird, und mehr als 50 % des Gesamtporenvolumens der Poren zwischen 1,7 und 300 nm, durch Poren mit einem Durchmesser von weniger als 20 nm gebildet werden.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als 65 %, insbesondere mehr als 75% des Gesamtporenvolumens der Poren zwischen 1,7 und 300 nm durch Poren mit einem Durchmesser von weniger als 20 nm, insbesondere von weniger als 10 nm gebildet werden.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem verwendeten Schichtdoppelhydroxid die Fläche der Mikroporen bis 200 nm Durchmesser mindestens 50 m2/g, insbesondere mindestens 60 m2/g, besonders bevorzugt von mindestens 70 m2/g beträgt.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch, gekennzeichnet, dass der Anteil der Mikroporen bis 200 nm an der Gesamtoberfläche des Schichtdoppelhydroxids mindestens 50%, vorzugsweise mehr als 60%, insbesondere mehr als 70% beträgt.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch dass das mindestens eine Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäuren, Proteine, Polysaccharide und/oder Lipide sowie deren Bausteinen, und jeweiligen Derivaten.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Biomolekül ausgewählt ist aus Oligo- und Polymeren auf der Grundlage von Nukleotiden, Aminosäuren und Kohlenhydraten.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Biomolekül ein Molekulargewicht von mindestens 200 D, vorzugsweise 10 kD, besonders bevorzugt mindestens 100 kD, und insbesondere mindesetens 500 kD aufweist.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens ein Biomolekül, wenn es sich um ein Oligopeptid oder Protein handelt, mindestens 5 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäuren und besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren aufweist; wenn es sich um eine Oligonukleotid oder eine Nukleinsäure handelt, mindestens 10 Nukleotidbausteine, vorzugsweise mindestens 100 Nukleotidbausteine und besonders bevorzugt mindestens 1000 Nukleotidbausteine aufweist; wenn es sich um ein Oligo- oder Polysaccharid handelt, mindestens 3 Monosaccharidbausteine, vorzugsweise mindestens 30 Monosaccharidbausteine und besonders bevorzugt mindestens 100 Monosaccharidbausteine aufweist.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem flüssigen oder fluiden Medium um eine kolloidale Lösung, Suspension, Dispersion, Lösung oder Emulsion handelt.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:
a) in Kontakt bringen des flüssigen oder fluiden Mediums enthaltend mindestens ein Biomolekül wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert, mit dem Sorptionsmittel, gegebenenfalls nach zumindest teilweiser Rekonstitution der Doppelschichtstruktur des calcinierten Schichtdoppelhydroxids,
b) Ermöglichen der An- bzw. Einlagerung des mindestens einen Biomoleküls an bzw. in das Schichtdoppelhydroxid,
c) Abtrennen des an- bzw. eingelagerten Biomoleküls mit dem Schichtdoppelhydroxid,
d) gegegbenenfalls Abtrennung bzw. Desorption des mindestens einen Biomoleküls von dem Schichtdoppelhydroxid.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mittlere Teilchengröße (D50) nicht mehr als etwa 1 μm bträgt und vorzugsweise zwischen 0,3 μm und 0,8 μm liegt.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass M2+ ein oder mehrere aus der Gruppe von Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, Fe2+, Sr2+, Ba2+ und/oder Cu2+ darstellt.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass N3+ ein oder mehrere aus der Gruppe von Al3+, Mn3+, Co3+, Ni3+, Cr3+, Fe3+, Ga3+, Sc3+, B3+ und/oder dreiwertige Kationen von Seltenerdenmetallen darstellt.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass M2+ Magnesium darstellt und N3+ Aluminium darstellt.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Anion An in der nicht calcinierten Form ausgewählt ist aus Carbonat, Nitrat, Halogenid, Sulfat, Phosphat und/oder Arsenat.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Anion An in der nicht calcinierten Form Carbonat darstellt.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Schichtdoppelhydroxid ein Hydrotalcit darstellt, dessen allgemeine Summenformel zwischen [Mg2Al(OH)6](CO3)0,5 und [Mg2,5Al(OH)7](CO3)0,5 liegt und insbesondere der Summenformel [Mg2,2Al(OH)6,4]CO3)0,5 genügt.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das calcinierte Schichtdoppelhydroxid eine BET-Oberfläche von mindestens 50 m2/g, insbesondere mindestens 100 m2/g, besonders bevorzugt von mindestens 150 m2/g, aufweist.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zu entfernende bzw. zu gewinnende Biomolekül gebunden, vorzugsweise zumindest teilweise zwischen die Schichten des Schichtdoppelhydroxids eingelagert und/oder von diesem umhüllt wird.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem flüssigen oder fluiden Medium um ein wässriges Medium, vorzugsweise um ein Fermentationsmedium, einen Fermentationrückstand aus der Zellkultur, Brauchwasser, oder ein Abwasser mit mindestens einem Biomolekül wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert handelt.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt das die Biomoleküle enthaltende Schichtdoppelhydroxid entsorgt wird.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt das Biomolekül von dem Schichtdoppelhydroxid wieder desorbiert bzw. gewonnen wird, wodurch das Schichtdoppelhydroxid ggf. erneut eingesetzt werden kann.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Schichtdoppelhydroxid die nachstehende allgemeine Summenformel aufweist: [M1–x2+Nx3+(OH)2]x+[An]x/n·YH2O, wobei M2+ mindestens ein zweiwertiges Metallion und N3+ mindestens ein dreiwertiges Metallion darstellt, An– mindestens ein Anion, x eine rationale Zahl zwischen 0 und 1, und y eine positive Zahl einschließlich 0 bedeuten.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schichtdoppelhydroxid die zweiwertigen Metallionen ganz oder teilweise durch einwertige Kationen, insbesondere Lithium, ersetzt sind, und das Schichtsilicat vorzugsweise die nachstehende allgemeine Summenformel aufweist: [M1–x1+Nx3+(OH)2]b+[An]x/n·yH2O, wobei M1+ ein geeignetes einwertiges Kation, insbesondere Lithium darstellt, und N3+, An, x und y die in Anspruch 23 angegebene Bedeutung haben, und b = 2x–1.

Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Schichtdoppelhydroxid eine mittlere Teilchengröße (D50) zwischen etwa 0,3 und 1,5 μm, insbesondere zwischen 0,5 und 1,0 μm aufweist; vorzugsweise die D10-Werte der Teilchengröße zwischen etwa 0,1 und 1,0 μm, insbesondere zwischen 0,15 und 0,5 μm liegen, und vorzugsweise die D90-Werte der Teilchengröße zwischen etwa 0,5 und 4,0 μm, insbesondere zwischen 1,0 und 3,0 μm liegen.

Zusammensetzung mit einem Schichtdoppelhydroxid wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert und mindestens einem Biomolekül wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert.

Verwendung der Zusammensetzung gemäß Anspruch 26 als anorganischer Vektor zur Einbringung von Biomolekülen in Zellen, oder als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Biomolekülen, bevorzugt von Nukleinsäuren.

Verwendung eines Schichtdoppelhydroxids wie in einem der Ansprüche 1 bis 25 definiert als Sorptionsmittel zur An- bzw. Abreicherung von Biomolekülen gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 25 aus flüssigen oder fluiden Medien, insbesondere zur Entfernung von Biomolekülen aus Fermentationsmedien, Fermentationrückständen aus der Zellkultur oder Abwässern bzw. Altlasten.

Verwendung gemäß Anspruch 28 zur Senkung oder Einstellung der Viskosität des Mediums.

Verwendung gemäß Anspruch 28 oder 29 bei der Herstellung bzw. Aufreinigung von biotechnologisch hergestellten Stoffen und Wirkstoffen.

Verwendung gemäß einem der Ansprüche 28 bis 30 zur Aufreinigung von Nukleinsäuren.

Verwendung gemäß einem der Ansprüche 28 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdoppelhydroxidteilchen mit einem Bindemittel zu Teilchenaggregaten oder Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht sind.

Verwendung gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bindemittel um Alginat, Agar-Agar, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten handelt.

Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdoppelhydroxidteilchen mit einem Bindemittel zu Teilchenaggregaten oder Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht sind.

Verfahren gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bindemittel um Alginat, Agar-Agar, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten handelt.

Zusammensetzung gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdoppelhydroxidteilchen mit einem Bindemittel zu Teilchenaggregaten oder Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht sind.

Zusammensetzung gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindemittel Alginat, Agar-Agar, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten ist.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Schichtdoppelhydroxiden in Verfahren zur An- bzw. Einlagerung von Biomolekülen, insbesondere zur An- bzw. Abreicherung von Biomolekülen aus flüssigen oder fluiden Medien sowie eine Zusammensetzung mit einem Schichtdoppelhydroxid und mindestens einem Biomolekül, die insbesondere als anorganischer Vektor oder pharmazeutische Zusammensetzung zum Einbringen von Biomolekülen in Zellen verwendet werden kann.

Aus dem Stand der Technik ist die Verwendung bestimmter Schichtdoppelhydroxide als Anionenaustauscher bzw. -adsorbens bekannt.

So beschreibt beispielsweise die EP 0 206 799 81 die Verwendung von gemischten Metallhydroxiden als Anionenaustauscher, insbesondere zur Steuerung der Farbstoffmigration in einer Flüssigkeit.

Die EP 0 566 260 B1 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von Flüssigkeiten mit Hydrotalciten als Sorptionsmittel, wobei es erfindungswesentlich ist, dass das Sorptionsmittel mindestens teilweise ungetrocknet ist bzw. frisch hergestellt oder in situ bei der Behandlung eines flüssigen Mediums erzeugt wird.

Die WO 01/49869 A1 beschreibt Zusammensetzungen mit Nukleinsäuren, die in bilaminare mineralische Teilchen eingelagert sind. Bevorzugt werden Hydrotalcite zur Herstellung eines Medikaments verwendet, das zur Transfektion von Zellen mit den eingelagerten Nukleinsäuren dient.

In ähnlicher Weise beschreibt die EP 0 987 328 A2 bio-anorganische Hybridzusammensetzungen, die Biomaterialien stabil aufnehmen können. Die Hybridzusammensetzung weist dabei die Formel [Ma2+1_xN3+x(OH)2][ABion–]x/n·yH2O auf. Die Verwendung von Schichtdoppelhydroxiden als nicht-virale Vektoren zum Einbringen von DNA in Zellen ist ebenfalls in der Literaturstelle Choy et al., Angew. Chem. 2000, 112 (22), Seiten 4208–4211, beschrieben. Die Literaturstelle Lotsch et al., Solid State Sciences 3 (2001), Seiten 883–886, beschäftigt sich mit der Trennung von Nukleosid-Monophosphaten unter Verwendung der preferenziellen Anionenaustauschinterkalation in Schichtdoppelhydroxiden.

Die Interkalation von Aminosäuren und Zucker in Schichtdoppelhydroxide ist beispielsweise in Aisawa und Narita, Zeoraito (2000) 17, Seiten 101–107, beschrieben.

Mit der Verwendung von Schichtdoppelhydroxiden bzw. Hydrotalciten und Hydrotalcit-ähnlichen Strukturen zur Absorption bestimmter Anionen beschäftigen sich weiterhin Ulibarri et al., Applied Clay Science 18 (2001), Seiten 17–27, Parker et al., Ind. Eng. Chem. Res. 34 (1995), Seiten 1196–1202, Pavan et al., Journal of Colloid and Interface Science 229 (2000), Seiten 346–352, sowie die JP-A-63-132898.

Die gemäß Stand der Technik als Anionenadsorptionsmittel verwendeten Schichtdoppelhydroxide sind jedoch insbesondere zur stabilen und reversiblen An- bzw. Einlagerung von Biomolekülen, z.B. zur An- bzw. Abreicherung von Biomolekülen aus flüssigen oder fluiden Medien, nicht ausreichend geeignet. So besteht ein ständiger Bedarf an verbesserten Materialien auf diesem Gebiet.

Aufgabe der Erfindung war es daher, Schichtdoppelhydroxide bereitzustellen, die eine besonders effiziente An- bzw. Einlagerung von Biomolekülen, insbesondere zur An- bzw. Abreicherung von Biomolekülen aus flüssigen oder fluiden Medien, ermöglichen. Dabei sollen die Nachteile des Standes der Technik vermieden und eine besonders wirkungsvolle Interaktion zwischen dem Schichtdoppelhydroxid und den Biomolekülen je nach Art der Verwendung sichergestellt werden.

Diese Aufgabe wird mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen 2 bis 25.

Erfindungsgemäß kann dabei ein Schichtdoppelhydroxid, ausgewählt aus der Gruppe der natürlichen und der synthetischen Hydrotalcite und der Hydrotalcit-ähnlichen Verbindungen verwendet werden, wie sie beispielsweise in der Literaturstelle Catalysis today, Vol. 11 (2) vom 2. Dezember 1991, Seiten 173 bis 301, beschrieben sind ("hydrotacite-like compounds). Solche Verbindungen weisen eine Hydrotalcit-ähnliche Struktur auf.

Zur Herstellung der Hydrotalcite kann dabei grundsätzlich jedes dem Fachmann geläufige Verfahren eingesetzt werden, wie es beispielsweise in der vorstehenden Literaturstelle Catalysis today (a.a.O.) auf den Seiten 173 bis 301, insbesondere 201 bis 212, in der DE 20 61 114, den US-A-5,399,329 und 5,578,286, der DE101 19 233 oder der WO 01/12570 beschrieben ist.

Besonders bevorzugt wird dabei ein Schichtdoppelhydroxid (LDH) der allgemeinen Summenformel [M1_x2+Nx3+(OH)2]x+[An–]x/n·yH2O verwendet, wobei M2+ mindestens ein zweiwertiges Metallion und N3+ mindestens ein dreiwertiges Metallion darstellt, An– mindestens ein Anion, x eine rationale Zahl zwischen 0 und 1, n eine positive Zahl und y eine positive Zahl einschließlich 0 bedeuten.

Allgemein kann jedes für Schichtdoppelhydroxide geeignete und dem Fachmann geläufige zweiwertige Metallion oder eine Kombination aus zwei oder mehr solcher Metallionen als M2+ verwendet werden. Insbesondere stellt M2+ ein oder mehrere aus der Gruppe von Mg2+, Ca2+, Zn2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, Fe2+, Sr2+, Ba2+ und/oder Cu2+ dar.

Allgemein kann jedes für Schichtdoppelhydroxide geeignete und dem Fachmann geläufige dreiwertige Kation oder eine Kombination aus zwei oder mehr solcher Kationen als N3+ verwendet werden. Insbesondere stellt N3+ ein oder mehrere aus der Gruppe von Al3+, Mn3+, Co3+, Nl3+, Cr3+, Fe3+, Ga3+ Sc3+, B3+ und/oder dreiwertige Kationen von Seltenerdenmetallen dar.

Nach einer besonders vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform ist M2+ Magnesium und N3+ Aluminium. Es können erfindungsgemäß auch solche Doppelschichthydroxide (LDHs) verwendet werden, die auch einwertige Kationen, wie z.B. Li+, enthalten, die die zweiwertigen Kationen teilweise oder ganz ersetzen können. Somit sind auch Schichtdoppelhydroxide mit einwertigen Kationen von der vorliegenden Erfindung erfasst, insbesondere diejenigen mit der nachstehenden allgemeinen Summenformel: [M1–x1+Nx3+(OH)2]b+[An– ]x/n·YH2O, wobei M1+ ein geeignetes einwertiges Kation, insbesondere Li+ darstellt, N3+, An, x und y die vorstehend angegebene Bedeutung haben, und b = 2x–1.

Das Anion An– ist, in der nicht calcinierten Form des Schichtdoppelhydroxids, ausgewählt aus Carbonat, Nitrat, Halogenid, Sulfat, Phosphat und/oder Arsenat. Besonders bevorzugt ist das Anion An– in der nicht calcinierten Form Carbonat.

Nach einer besonders vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Schichtdoppelhydroxid ein Hydrotalcit dessen allgemeine Summenformel zwischen [Mg2Al(OH)6](CO3)0,5 und [Mg2,5Al(OH)7](CO3)0,5 liegt und insbesondere der Summenformel [Mg2,2Al(OH) 6,4](CO3)0,5 genügt. Mit diesen Hydrotalciten wurden besonders vorteilhafte Sorptionsmittel für Biomoleküle erhalten.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschend gefunden, dass eine besonders vorteilhafte An- bzw. Einlagerung des Biomoleküls erfolgt, wenn das Schichtdoppelhydroxid in calcinierter Form eingesetzt wird. Dabei wird bevorzugt die Fähigkeit der Schichtdoppelhydroxide genutzt, die durch den Prozess der Calcinierung zerstörte Brucit-ähnliche Struktur (Doppelschichtstruktur) erneut auszubilden. Geschieht dies in einer Lösung, werden die darin enthaltenen Anionen eingebaut. Diese Fähigkeit wird allgemein als "memory-effect" bezeichnet. Es wurde überraschend gefunden, dass die Verwendung von calcinierten Schichtdoppelhydroxiden zu einer besonders wirkungsvollen An- bzw. Einlagerung von Biomolekülen führt.

Die zur Calcinierung von Schichtdoppelhdroxiden verwendeten Calcinierungsbedingungen sind dem Fachmann geläufig. Allgemein kann die Calcinierung in einem Ofen bei 350 bis 650 Grad Celsius über einen Zeitraum von 0,5 bis 15 Stunden erfolgen. Bevorzugt findet die Calcinierung bei 450 bis 600 Grad Celsius über einen Zeitraum von 0,5 bis 5 Stunden statt.

Nach einer vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das calcinierte Schichtdoppelhydroxid in trockener Form mit dem das bzw. die Biomolekül (e) enthaltenden flüssigen oder fluiden Medium in Kontakt gebracht, so dass vorzugsweise während der Rekonstituierung der Doppelschichtstruktur die in dem flüssigen bzw. fluiden Medium enthaltenen Biomoleküle an das Schichtdoppelhydroxid gebunden bzw. darin eingelagert und/oder davon umhüllt werden. Ohne auf diesen theoretischen Mechanismus beschränkt zu sein, wird vermutet, dass während der Rekonstituierung der Doppelschichtstruktur neben einer Interkalation in die Schichtzwischenräume auch eine Adsorption der negativ geladenen Biomoleküle an der positiv geladenen Oberfläche des regenerierten Schichtdoppelhydroxids und eine (teilweise) Umhüllung der Biomoleküle stattfindet. Die neu entstehende Doppelschichtstruktur wird dabei durch die Anwesenheit der polyanionischen Biomoleküle in der gewünschten Weise, d.h. zu Gunsten einer schonenden und wirkungsvollen An- bzw. Einlagerung, beeinflusst.

Nach einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das calcinierte Schichtdoppelhydroxid jedoch auch vor der Kontaktierang mit dem das bzw. die Biomolekül (e) enthaltenden flüssigen oder fluiden Medium zumindest teilweise "rekonstituiert" werden, beispielsweise durch Suspendieren des trockenen calcinierten Materials in wasserhaltigen oder wässrigen Medien. Es ist jedoch auch eine Rekonstituierung über die Luftfeuchtigkeit und Kohlendioxid in der Luft denkbar. Es wurde überaschenderweise gefunden, dass auch vor der Verwendung als Sorptionsmittel rekonstituierte Schichtdoppelhydroxide eine vorteilhaftere An- bzw. Einlagerung von Biomolekülen zeigen, als nicht calcinierte Schichtdoppelhydroxide. Es wird vermutet, dass dies auf die mit der Rekonstituierung der calcinierten Schichtdoppelhydroxide verbundenen Einflüsse auf die Struktur der einzelnen Schichtdoppelhydroxidteilchen zurück zu führen ist.

Zusammenfassend wurde gefunden, dass es bei der Verwendung von calcinierten Doppelschichthydroxiden als Sorptionsmittel, gegebenenfalls nach zumindest teilweiser Rekonstituierung der Doppelschichtstruktur, zu einer besonders schonenden und gleichzeitig effizienten An- bzw. Einlagerung von Biomolekülen an bzw. in das Schichtdoppelhydroxid kommt, wobei auch von einer zumindest teilweisen Umhüllung der Biomoleküle durch das (rekonstituierte) Doppelschichthydroxid ausgegangen wird.

Besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß ein Schichtdoppelhydroxid verwendet, das vor der Calcinierung in der Carbonatform vorlag, da hierdurch der "memory-effect" begünstigt wird.

Erfindungsgemäß wurde weiterhin gefunden, dass eine besonders effiziente und zugleich schonende An- bzw. Einlagerung von Biomolekülen erzielt wird, wenn bei dem in calcinierter Form eingesetzten Schichtdoppelhydroxid mehr als 50 % des Gesamtporenvolumens der Poren zwischen 1,7 und 300 nm, durch Poren mit einem Durchmesser von weniger als 20 nm gebildet werden. Diese Werte werden wie nachstehend angegeben bestimmt.

Es wird vermutet, ohne dass die Erfindung hierauf beschränkt wäre, dass bei Einhaltung dieser Porenvolumenverteilung die Rekonstiuierung der Doppelschichtstruktur im Hinblick auf die parallel verlaufende oder anschließende An- und Einlagerung der Biomoleküle in dem flüssigem bzw. fluidem Medium begünstigt wird. Diese Vermutung wird dadurch bestätigt, dass bei deutlich geringerem Anteil der Poren mit einem Durchmesser von weniger als 20 nm bzw. einem entsprechend höheren Anteil der größeren Meso- und Makroporen, in die auch (größere) Biomoleküle eingelagert werden könnten, die vorteilhafte An- bzw. Einlagerung der Biomoleküle bei gleicher Größe der Doppelschichthydroxidteilchen zumindest teilweise verloren zu gehen scheint.

Als besonders günstig hat sich erwiesen, wenn mehr als 75% des Gesamtporenvolumens der Poren zwischen 1,7 und 300 nm durch Poren mit einem Durchmesser von weniger als 20 nm, insbesondere von weniger als 10 nm gebildet werden.

Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform beträgt bei dem verwendeten calcinierten Schichtdoppelhydroxid die Fläche der Mikroporen (bis 200 nm Durchmesser) mindestens 50 m2/g, insbesondere mindestens 60 m2/g, besonders bevorzugt von mindestens 70 m2/g. Es wird angenommen, ohne dass die Erfindung auf diesen theoretischen Mechanismus beschränkt ist, dass sich die Biomoleküle besonders bevorzugt im Bereich der Mikroporen aufhalten. LDH-Oberflächen in den vorstehenden Größenordnungen werden auf struktureller Ebene durch eine stark variable Oberflächen-Topologie in den Mikroporen bedingt. Dadurch erhöht sich auch die statistische Wahrscheinlichkeit, dass das Biomolekül im Bereich der Mikroporen besonders stark mit dem Schichtdoppelhydroxid in Wechselwirkung tritt.

Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform beträgt der Anteil der Mikroporen bis 200 nm an der Gesamtoberfläche des Schichtdoppelhydroxids mindestens 50%, vorzugsweise mehr als 60%, insbesondere mehr als 70%. Eine mögliche Erklärung, warum mit solchen Schichtdoppelhydroxiden besonders gute Ergebnisse erzielt wurden, liefert die vorstehende Modellvorstellung, da die Wahrscheinlichkeit der Wechselwirkung zwischen Biomolekülen und den Mikroporen direkt mit deren Anteil an der Gesamtoberfläche korreliert ist.

Es wurde gefunden, dass sich insbesondere größere bzw. langkettige Biomoleküle erfindungsgemäß besonders schonend und effizient an- bzw. einlagern oder umhüllen ("verpacken") lassen. Es wird angenommen, dass bei der parallel zur Rekonstituierung des Doppelschichthydroxid verlaufenden oder daran anschließenden An- und Einlagerung bzw. Umhüllung der Biomoleküle in dem flüssigem bzw. fluidem Medium eine besonders gute "Verpackung" der Biomoleküle erfolgt, so dass diese besser gegen die die bei der weiteren Verarbeitung des die Biomoleküle enthaltenen flüssigen bzw. fluiden Mediums unvermeidlich auftretenden Scherkräfte und mögliche Exposition von Molekülteilbereichen gegenüber enzymatischen Spaltungen besser geschützt sind.

Nach einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt die mittlere Teilchengröße (D50) der LDHs zwischen etwa 0,3 und 1,5 μm, insbesondere zwischen 0,5 und 1,0 μm. Die D10-Werte der Teilchengröße liegen bevorzugt zwischen etwa 0,1 und 1,0 μm, insbesondere zwischen 0,15 und 0,5 μm. Die D90-Werte der Teilchengröße liegen bevorzugt zwischen etwa 0,5 und 4,0 μm, insbesondere zwischen 1,0 und 3,0 μm. Bei Einhaltung dieser Teilchengrößen zusammen mit der vorstehenden Porosimetrie ergeben sich überraschend besonders vorteilhafte Bindungseigenschaften für Biomoleküle, insbesondere größere Biomoleküle.

Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist das calcinierte Schichtdoppelhydroxid eine BET-Oberfläche (bestimmt nach DIN 66131) von mindestens 50 m2/g, insbesondere mindestens 100 m2/g, besonders bevorzugt von mindestens 150 m2/g, auf. Durch die hohe Oberfläche wird offenbar die Rekonstitution bzw. die vorteilhafte An- und Einlagerung der Biomoleküle begünstigt.

Unter Biomolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Molekül verstanden, das als Bausteine Nukleotide bzw. Nukleoside (Nukleobasen), Aminosäuren, Monosaccharide und/oder Fettsäuren aufweist. Zu dieser Gruppe zählen somit die Mono-, Oligo- und Polymere aus diesen Bausteinen, insbesondere die Oligonukleotide und Nukleinsäuren, Oligopeptide und Proteine, Oligo- und Polysaccharide und/oder die Lipide sowie deren vorstehende Bausteine und jeweiligen Derivate. Unter Derivaten werden dabei alle chemischen Modifikationen der vorstehenden Moleküle verstanden, die weiterhin als Polyanionen an Schichtdoppelhydroxide gebunden werden können. In der Regel wird es sich hierbei um Modifikationen oder Derivatisierungen der funktionellen (Seiten)-Gruppen eines oder mehrerer Bausteine der Biomoleküle handeln. Jedoch sind im Rahmen der Erfindung auch Derivate erfasst, bei denen das "Rückgrat" des Biomoleküls modifiziert ist, wie beispielsweise bei den peptidischen Nukleinsäuren (PNA).

Nach einer vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei den Biomolekülen um DNA- oder RNA-Moleküle in doppelsträngiger oder einsträngiger Form mit einem oder mehreren Nukleotidbausteinen; Aminosäuren bzw. Oligopeptide und Proteine sowie mono-, oligo- oder polymere Kohlehydrate und Lipide, einschließlich von Glycoproteinen und Glycolipiden, solange diese als (Poly-)Anionen an Schichtdoppelhydroxide an- bzw. eingelagert werden können.

Wie vorstehend erwähnt, lassen sich mit Hilfe der vorliegenden Erfindung Biomoleküle besonders schonend an bzw. in die Schichtdoppelhydroxide an- bzw. einlagern. Dieser erfindungsgemäße Vorteil kommt natürlich insbesondere bei größeren bzw. längerkettigen Biomolekülen, wie längerkettigen Oligonukleotiden und Nukleinsäuren oder Oligopeptiden und Proteinen oder langkettigen Sacchariden zur Geltung.

Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung der vorstehend definierten Schichtdoppelhydroxide zur Entfernung bzw. Gewinnung von Biomolekülen aus flüssigen oder fluiden Medien, die mindestens ein größeres oder langkettiges Biomolekül wie nachstehend definiert enthalten. Vorzugsweise weist das größere bzw. langkettige Biomolekül, wenn es sich um ein Oligopeptid oder Protein handelt, mindestens 5 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäuren und besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren auf; wenn es sich um eine Oligonukleotid oder eine Nukleinsäure handelt, mindestens 10 Nukleotidbausteine, vorzugsweise mindestens 100 Nukleotidbausteine und besonders bevorzugt mindestens 1000 Nukleotidbausteine auf; wenn es sich um ein Oligo- oder Polysaccharid handelt, mindestens 3 Monosaccharidbausteine, vorzugsweise mindestens 30 Monosaccharidbausteine und besonders bevorzugt mindestens 100 Monosaccharidbausteine auf.

Nach einem besonders vorteilhaften erfindungsgemäßen Aspekt enthält die vorstehende Zusammensetzung somit mindestens ein Biomolekül mit einem Molekulargewicht von mindestens 200 D, insbesondere 10 kD, besonders bevorzugt mindestens 100 kD. Der Größe des Biomoleküls sind dabei im Rahmen der Erfindung nach oben keine Grenzen gesetzt, so dass auch sehr große Biomoleküle mit mehr als 500 kD oder mehr als 1 MD besonders vorteilhaft an- bzw. eingelagert werden können.

In Bezug auf Aminosäuren ist das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Verwendung der calcinierten Schichtdoppelhydroxide insbesondere für flüssige oder fluide Medien geeignet, die Peptide bzw. Proteine mit mindestens 5 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäuren und besonders bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren aufweisen.

In Bezug auf Nukleinsäuren ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft bei flüssigen bzw. fluiden Medien, die Oligonukleotide bzw. Nukleinsäuren mit mindestens 10 Basen(paaren), vorzugsweise mit mindestens 100 Basen(paaren), insbesondere mindestens 1000 Basen (paaren) enthalten.

In Bezug auf Kohlenhydrate ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft bei flüssigen bzw. fluiden Medien, die Oligonukleotide bzw. Nukleinsäuren mit mindestens 3 Monosaccharideinheiten, vorzugsweise mit mindestens 30 Monosaccharideinheiten und insbesondere mindestens 100 Monosaccharideinheiten enthalten.

Unter flüssigen oder fluiden Medien werden dabei alle Medien verstanden, die ein In-Kontakt-Bringen und somit eine An- bzw. Einlagerung der Biomoleküle in das Schichtdoppelhydroxid ermöglichen. Insbesondere handelt es sich in der Praxis hierbei um wässrige bzw. wasserhaltige Medien in Form einer Lösung, Suspension, Dispersion, kolloidalen Lösung oder Emulsion.

Typische Beispiele sind industrielle oder nicht-industrielle Abwässer, Prozessbrauchwässer, Fermentationsrückstände bzw. – medien, Biomoleküle enthaltende Medien aus der medizinischen oder biologischen Forschung, mit Biomolekülen kontaminierte, flüssige oder fluide Altlasten und dergleichen.

Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst: a) in-Kontakt-Bringen des flüssigen oder fluiden Mediums, enthaltend mindestens ein Biomolekül wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert, mit dem Sorptionsmittel, gegebenenfalls nach zumindest teilweiser Rekonstitution der Doppelschichtstruktur des calcinierten Schichtdoppelhydroxids; b) Ermöglichen der An- bzw. Einlagerung des mindestens einen Biomoleküls an bzw. in das Schichtdoppelhydroxid; c) Abtrennen des an- bzw. eingelagerten Biomoleküls mit dem Schichtdoppelhydroxid; d) gegebenenfalls Abtrennung bzw. Desorption des mindestens einen Biomoleküls von dem Schichtdoppelhydroxid.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur An- bzw. Einlagerung von Biomolekülen an bzw. in Schichtdoppelhydroxide kann sowohl zur Anreicherung (d.h. Erhöhung der Konzentration des/der gewünschten Biomoleküle) als auch Abreicherung (d.h. Verringerung der Konzentration des/der gewünschten Biomoleküle) genutzt werden.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren auf eine Entfernung oder Entsorgung von Biomolekülen abzielt, kann in einem weiteren Schritt das die Biomoleküle enthaltende Schichtdoppelhydroxid entsorgt werden. Die Entsorgung kann dabei beispielsweise durch thermische Behandlung zur Entfernung des die Biomoleküle enthaltenden Schichtdoppelhydroxids erfolgen, wobei nach der thermischen Desintegration der Biomoleküle das Schichtdoppelhydroxid besonders vorteilhaft entsorgt werden kann.

So ist es nach einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt möglich, Biomoleküle gezielt aus Medien zu entfernen. Dies spielt beispielsweise bei der Abwasseraufbereitung eine große Rolle, da hier in den meisten Staaten strenge gesetzliche Vorschriften zur Entfernung von Biomolekülen aus Abwässern bestehen.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann auch die Abreicherung bzw. Entfernung von Biomolekülen aus Kulturmedien durchgeführt werden. So kann es beispielsweise in Bioreaktoren aufgrund der im Medium enthaltenen hohen Konzentration an Biomolekülen, insbesondere hochmolekularen Nukleinsäuren, zu einem unerwünschten Anstieg der Viskosität kommen. Hier kann über das erfindungsgemäße Verfahren eine effiziente und biologisch verträgliche Entfernung der störenden Biomoleküle aus dem Kulturmedium erfolgen. Durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Sortionsmittels zu dem Kulturmedium kann die Viskosität auch auf ein gewünschtes Maß eingestellt werden.

Genauso ist es in vielen Fällen erwünscht, die Konzentration an Biomolekülen in einem Medium zu erhöhen bzw. diese Biomoleküle möglichst in reiner Form zu gewinnen. Beispielsweise fällt die Gewinnung bzw. Aufreinigung gewünschter Proteine, Kohlenhydrate oder Nukleinsäuren aus Lösungen zu den Standardprozeduren in der biologischen und medizinischen Forschung. Dabei kann erfindungsgemäß in einem weiteren Schritt das Biomolekül von dem Schichtdoppelhydroxid wieder desorbiert bzw. gewonnen werden, wodurch das Schichtdoppelhydroxid ggf. erneut eingesetzt werden kann.

Nach einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt können die Schichtdoppelhydroxidteilchen über ein geeignetes Bindemittel zu größeren Agglomeraten, Granulaten bzw. Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht werden. Die Form und Größe solcher übergeordneter Strukturen, die die primären Schichtdoppelhydroxidteilchen enthalten, richtet sich nach der jeweils gewünschten Anwendung. Es können somit alle dem Fachmann geläufigen und im Einzelfall geeigneten Formen und Größen eingesetzt werden. Beispielsweise können in vielen Fällen Agglomerate mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm, insbesondere mehr a1s 50 μm bevorzugt sein. Bei einer Schüttang für Chromatographiesäulen und dergleichen kann dabei eine Kugelform der Agglomerate vorteilhaft sein. Ein möglicher Träger ist beispielsweise Calciumcarbonat.

Auch kann jedes dem Fachmann geläufige Bindemittel verwendet werden, solange die An- bzw. Einlagerung der Biomoleküle in bzw. an die Schichtdoppelhydroxidteilchen nicht zu stark beeinträchtigt wird bzw. die für die jeweilige Anwendung zu erfordernde Stabilität der Teilchenagglomerate bzw. Formkörper gewährleistet ist. Beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, können als Bindemittel verwendet werden: Agar-Agar, Alginate, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung mit einem Schichtdoppelhydroxid wie vorstehend definiert und mindestens einem Biomolekül wie vorstehend definiert.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als anorganische Vektoren zum Einbringen von Biomolekülen in Zellen oder als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Biomolekülen, bevorzugt von Nukleinsäuren. So wurde überraschenderweise gefunden, dass die schonende und wirkungsvolle An- bzw. Einlagerung der Biomoleküle in bzw. an die Schichtdoppelhydroxide, die durch in-Kontakt-Bringen des die Biomoleküle enthaltenen flüssigen oder fluiden Mediums mit dem calcinierten bzw. (teilweise) rekonstituierten Schichtdoppelhydroxid erhalten werden kann, auch zu einer besonders effizienten Einschleusung dieser Biomoleküle in prokaryontische oder eukaryontische Zellen dienen kann. Offenbar lassen sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, in besonders vorteilhafter Weise zur Einschleusung in Zellen verpacken. Der prinzipielle Mechanismus einer solchen Einschleusung von DNA-LDH-Nanohybriden ist beispielsweise in der Literaturstelle Choy et al., Angew. Chem. 2000, 112 (22), Seiten 4207–4211, sowie in der EP 0 987 328 A2 beschrieben, auf die diesbezüglich verwiesen wird und die hiermit durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen werden. Die Verwendung als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Biomolekülen, bevorzugt von Nukleinsäuren, ist als solche in der WO 01/49869 beschrieben, auf die diesbezüglich verwiesen und die hiermit durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen wird.

Die vorliegend angegebenen BET-Oberflächen wurden nach DIN 66131 bestimmt.

Die angegebenen (mittleren) Porendurchmesser, -volumina und -flächen wurden unter Verwendung eines vollautomatischen Stickstoff-Adsorptionsmessgerätes (ASAP 2000, Firma Micrometrics) nach dem Standardprogramm des Herstellers (BET, BJH, t-plot und DFT) bestimmt. Die prozentualen Angaben zum Anteil bestimmter Porengrößen beziehen sich auf das Gesamtporenvolumen an Poren zwischen 1,7 und 300 nm Durchmesser (BJH Adsorption Pore Distribution Report).

Die Erfindung wird nun anhand der nachstehenden nich-- beschränkenden Beispiele näher erläutert.

Es wurden die nachstehenden Hydrotalcite als Ausgangsmaterialien verwendet, wobei die Herstellung entsprechender Schichtdoppelhydroxide auch nach dem Fachmann geläufigen Verfahren (siehe oben) leicht möglich ist. Die Einstellung der Porosimetrie und der Oberflächen der Schichtdoppelhydroxide kann dabei insbesondere durch routinemäßige Versuche zur hydrothermalen Nachbehandlung und zur Calcinierung leicht erfolgen.

  • 1. HT-Granulat, erhältlich unter dem Handelsnamen CERATOFIX®NA (HT-Granulat) von der Firma Süd-Chemie AG, ist ein Mg/Al-Hydrotalcit. Die Calcinierung erfolgte 4 h im Muffelofen bei 600°C, wobei über konzentrierter Schwefelsäure im Exsikkator abgekühlt wurde. Etwa 81% (76%) des Gesamtporenvolumens der Poren zwischen 1,7 und 300 nm wurden beim calcinierten Material durch Poren mit einem Durchmesser von weniger als 20 nm (10 nm) gebildet. Die Mikroporenfläche lag bei etwa 79 m2/g.
  • 2. HT-16, erhältlich unter dem Handelsnamen CERATOFIX NA (HT-16) von der Firma Süd-Chemie AG, ist ein nicht-calcinierter Mg/Al-Hydrotalcit in der Nitratform.

Die calcinierten Hydrotalcite wurden entweder direkt zu dem die Biomoleküle enthaltenden flüssigen Medium gegeben, oder zuvor in Wasser suspendiert, um die Hydroxidform zu erzeugen.

Zur vergleichsweisen Aktivierung von HT-Granulat mit Säure wurden zu 0,1 g des Hydrotalcits in Form einer 10%igen Suspension in destilliertem Wasser 28,6 μl 99,8%ige Essigsäure gegeben, gründlich gemischt und anschließend 10 min mit 2500 UpM zentrifugiert. Der Rückstand wurde zum Entfernen der Säurereste in 5 ml Tris-Puffer (10 mM Tris/HCl, pH 8,0) suspendiert und erneut zentrifugiert.

Als weiterer Vergleich wurde Hydrotalcit HT-16 von der Nitratform in die Chloridform überführt, indem 0,1 g des trockenen Materials in 5 ml Pufferlösung (10mM Tris/HCl, 1M NaCl, pH 8,0) gewaschen, abzentrifugiert, zur Entfernung von verbliebenem NaCl in 5 ml Tris-Puffer (10mM Tris/HCl, 1M NaCl, pH 8,0) gewaschen und erneut abzentrifugiert wurden (siehe Tab. 2 und II; HT-16, gewaschen).

1. Bestimmung der DNA-Bindungskapazität

Es werden jeweils 0,1 g der vorstehenden Hydrotalcitproben zu 5 ml DNA-Lösung (Heringssperma-DNA-Natriumsalz bzw -Säure, Firma Sigma, Schnelldorf) bekannter Konzentration (2,5 mg/ml) hinzugegeben und solange gemischt, bis eine gleichmäßige Suspension entsteht. Die Probe wird anschließend 1 h bzw. 16 h mit 250 UpM bei Raumtemperatur geschüttelt. Es wird 15 min bei 2500 UpM zentrifugiert (der Rückstand wird nachstehend bei den Elutionsversuchen verwendet) und der Überstand sterilfiltriert. Enthält der verwendete Puffer kein EDTA, so werden 10 μl 0,5 M EDTA-Lösung hinzugegeben, um die Proben vor DNase-Kontamination zu schützen. Die DNA-Konzentration des Überstandes wird photometrisch anhand der UV-Absorption bei 260 nm bestimmt (Sambrook et al., "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", Band III, Seite C1, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2nd Edition (1989). Aus der Konzentrationsdifferenz wird die Bindungskapazität be- rechnet.

Es wurden für die eingangs beschriebenen Hydrotalcitproben die statischen Bindungskapazitäten sowohl für die DNA-Säure als auch für das DNA-Salz (siehe oben) bestimmt.

Als Puffer zur Herstellung der DNA-Lösungen wurden sowohl ein Tris-Puffer (10mM Tris/HCl, pH 8) als auch ein TE-Puffer (10mM Tris/HCl, 1mM EDTA, pH 8) verwendet. Die ermittelten Kapazitäten waren für beide Puffersysteme identisch.

Die Kapazitäten sind immer auf das Gewicht des eingesetzten Materials bezogen. Bei der Aktivierung mit Säure ist das Gewicht der unaktivierten, trockenen Form angegeben.

Alle Versuche wurden dreimal durchgeführt, als Ergebnis ist der Mittelwert der drei Messungen in den nachstehenden Tabellen I und II angegeben.

Tabelle I: Bindungskapazitäten verschiedener Hydrotalcite und der Vergleichssysteme für DNA-Säure
Tabelle II: Bindungskapazität verschiedener Hydrotalcite und der Vergleichssysteme für DNA-Salz

Es zeigt sich, dass bei Einsatz des erfindungsgemäß verwendeten calcinierten Hydrotalcits die Bindungskapazitäten für DNA sowohl in der Säureform als auch der Salzform erheblich höher liegen als dies bei nicht aktivierten oder säureaktivierten Hydrotalciten sowie bei Hydrotalcit in der Nitratform bzw. in der Chloridform der Fall ist.

Auch ein vergleichsweise eingesetzter calcinierter Hydrotalcit, bei dem aufgrund einer anderen hydrothermalen Nachbehandlung bei der Herstellung gegenüber calciniertem HT-Granulat nur ca. 42% des Gesamtporenvolumens der Poren zwischen 1,7 und 300 nm, durch Poren mit einem Durchmesser von weniger als 20 nm gebildet wurden (zum Vergleich: calciniertes HT-Granulat: mehr als 50%), zeigt eine erheblich geringere Bindungskapazitäten für DNA.

2. Elution der gebundenen DNA:

Vor der Elution wird der jeweilige Rückstand (siehe Punkt 1. oben) mit 5 ml Tris-Puffer (10mM Tris/HCl, pH 8) gewaschen, dann wird das angegebene Volumen des nachstehenden Elutionspuffers hinzugefügt und 16 h mit 250 UpM geschüttelt. Es wird 15 min mit 2500 UpM zentrifugiert und der Überstand sterilfiltriert. Die DNA-Konzentration der Elutionsfraktion wird photometrisch bestimmt und die Wiederfindungsrate berechnet.

Zur Elution der DNA von dem Schichtdoppelhydroxid wurde der folgende Puffer eingesetzt: 0,5 M Na3PO4, pH 7,3 mit Na3PO4 eingestellt (Elutionspuffer). Mit diesem Puffer konnte bei einem relativen Elutionsvolumen von 500ml/g der überwiegende Teil der DNA von dem erfindungsgemäß eingesetzten LDH eluiert und im Überstand photometrisch nachgewiesen werden.

Somit ist eine reversible Bindung der DNA an den Hydrotalcit gewährleistet und eine Gewinnung des gewünschten Biomoleküls in Reinform möglich. Das abgetrennte Schichtdoppelhydroxid kann, gegebenenfalls nach erneuter Calcinierung, erneut eingesetzt werden.

3. Bindung von Proteinen am Beispiel von BSA

Als Modellprotein wurde BSA (Fraktion V, Firma Sigma, Schnelldorf) verwendet.

Es wurden jeweils 0,1 g der eingangs angegebenen Hydrotalcitproben zu 5 ml BSA-Lösung in TE-Puffer (c = 2 mg·ml1) gegeben und für 16 h mit 250 UpM geschüttelt. Nach dem Abzentrifugieren für 10 min mit 2500 UpM wurde die Proteinkonzentration im Überstand photometrisch durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt. Auch dieser Versuch wurde dreimal durchgeführt.

Auch hier zeigte sich, dass bei Einsatz der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten calcinierten Hydrotalcite die Bindungskapazitäten für Protein erheblich höher liegen als dies bei nicht aktivierten oder säureaktivierten Hydrotalciten sowie bei Hydrotalcit in der Nitratform bzw. der Chloridform der Fall ist.

4. Transfektion von NIH-3T3-Zellen mit Hydrotalcit als anorganischem Vektora) Zellkultivierung:

Für die Transfektionsexperimente wird die Zellinie NIH-3T3 verwendet. Hierbei handelt es sich um adhärent wachsende Mausembryo-Fibroblasten. Die Verdoppelungszeit beträgt ca. 20 h. Die Zellen werden in dem Standardmedium DMEM (mit 4,5 g·l–1 Glukose) mit 10% NCS kultiviert. Die Kultivierung erfolgt in einem Brutschrank bei 37°C unter humidizierter 5%iger CO2-Atmosphäre.

Zum Ansetzen der Stammkultur wird die aufgetaute Zellsuspension in eine Monolayerflasche (25 cm2) mit 10 ml Medium gegeben. Eine direkte Zellzahlbestimmung ist bei adhärent wachsenden Zellen nicht möglich, eine Kontrolle der Wachstumsrate erfolgt über den Bedeckungsgrad des Kulturgefäßes. Bei ca. 90%iger Konfluenz – i.d.R. nach 3–4 Tagen – wird die Kultur umgesetzt, um das Überwachsen der Zellen (Fokibildung) zu vermeiden. Dazu wird das Medium abdekantiert, Trypsin-Lösung hinzugegeben und 10 min im Brutschrank inkubiert. Die abgelöste Zellsuspension wird mit ca. 15 ml serumhaltigen Medium vermischt, um das Trypsin zu blockieren. Die abzentrifugierten Zellen werden in frischem Medium resuspendiert und in einer Verdünnung von 1:10 neu ausgesät.

b) Transfektion:

Als anorganischer Vektor für die Transfektion von NIH-3T3-Zellen wurden die eingangs angegebenen Hydrotalcitproben vor der Transfektion mit dem Plasmid pQBI25-fC1 (Firma Qbiogene, Heidelberg) "beladen". Dafür wurden 10 mg der jeweiligen Hydrotalcitprobe eingewogen und zum Sterilisieren mit Ethanol gewaschen. Anschließend wurden 2 ml steriles, destilliertes Wasser hinzugegeben, kurz gevortext und 3 rein bei 5000 UpM zentrifugiert. Zu dem Rückstand wurde 1,5 ml sterile Plasmid-DNA der Konzentration 1,45 ml·ml–1 gegeben und 16 h bei Raumtemperatur mit 250 UpM geschüttelt.

Das DNA-Hydrotalcit-Hybrid wurde in 10 ml destilliertem, sterilen Wasser suspendiert. Die Transfektion mit Hydrotalcit als Vektor wurde jeweils mit zwei verschiedenen Konzentrationen von DNA-Hydrotalcit-Hybrid durchgeführt. Die NIH-3T3-Zellen wurden 24 h vor der Transfektion mit einer Dichte von 1–2·105 Zellen·cm–2 in 6-Loch-Platten ausgesät und im Brutschrank bei 37°C unter humidifizierter 5%-iger CO2-Atmosphärέ inkubiert. Die angegebenen Mengen beziehen sich jeweils auf ein Loch der 6-Loch-Platte. Die Analyse erfolgte 48 h nach Beginn der Transfektion mit dem Fluoreszenzmikroskop. Transfizierte Zellen erkennt man an der GFP-Produktion, bei Anregung mit 474 nm leuchten sie bei Betrachtung im Fluroreszenzmikroskop grün.

Variante 1:

Direkt vor dem Versuch wurde das Medium abgenommen und 1,5 ml neues Medium hinzugegeben. 25 bzw. 100 μl der DNA-Hydrotalcit-Suspension wurden hinzugefügt und es wurde 3 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das Medium gewechselt und weitere 45 h inkubiert.

Variante 2:

Direkt vor dem Versuch wurde das Medium abgenommen und 1,5 ml neues Medium hinzugegeben. 25 bzw. 100 μl der Suspension wurden hinzugegeben und es wurde 24 h inkubiert. Anschließend wurde das Medium gewechselt und weitere 24 h inkubiert.

Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Hybrids mit dem (rekonstituierten) calcinierten Hydrotalcit konnten im Vergleich zu den Hybrid-Zusammensetzungen mit den nicht aktivierten oder säureaktivierten Hydrotalciten sowie dem Hydrotalcit (HT-16) in der Nitratform bzw. Choridform erheblich mehr erfolgreich transfizierte Zellen anhand der Fluoreszenz nachgewiesen werden, so dass sich die erfindungsgemäßen DNA-Hydrotalcit-Hybride als anorganische Vektoren eignen.