Title:
New mutant nucleic acid encoding the human MSH3 protein, useful e.g. for diagnosis and treatment of neoplasia, also for drug discovery
Kind Code:
A1


Abstract:
Nucleic acid (I), or fragment of it, that encodes the human mismatch repair gene MSH3 protein and has a sequence that differs from the reference sequence by mutation at at least one specific position, is new. Nucleic acid (I), or fragment of it, that encodes the human mismatch repair gene MSH3 protein and has a sequence that differs from the reference sequence by mutation at at least one specific position is new. The specified positions are: (a) -382, -151, -144, -50, -39 and/or -35 in the 5'-untranslated region (UTR); (b) exon 1, -151; (c) intron 2, +40, +76 and/or -7; (d) intron 3, +59; (e) intron 4, +50; (f) intron 5, +151; (g) intron 8, +71; (h) intron 9, +61; (i) intron 12, +98; (j) intron 20, -103; (k) intron 21, -29 and/or -22; (l) intron 23, +64 and/or (m) 3'-UTR, +898. Independent claims are also included for: (1) a vector that contains (I); (2) a host cell transfected with the vector of (1); (3) diagnosing a disease (or predisposition) associated with MSH3, or for predicting progression, severity and/or survival time; (4) diagnosing MSH3-dependent resistance to chemotherapy; (5) diagnostic kit for methods (3) and (4); (6) identifying a compound for treatment or prevention of MSH3-associated diseases; and (7) use of a vector that contains the MSH3 reference sequence, or part of it, for gene therapy.



Inventors:
Plaschke, Jens, Dr. (Coswig, 01640, DE)
Krüger, Stefan, Dr. (Dresden, 01309, DE)
Schackert, Hans Konrad, Prof. Dr.med. (Dresden, 01099, DE)
Application Number:
DE10235988A
Publication Date:
03/04/2004
Filing Date:
08/06/2002
Assignee:
Technische Universität Dresden (Dresden, 01069, DE)
International Classes:



Other References:
ABUIN,A., ZHANG,H., BRADLEY,A.: Genetic analysis of mouse embryonic stem cells bearing Msh3 and Msh2 single and compound mutations. 2000. In: Mo- lecular and Cellular Biology, S.149-157
Internet-Recherche am 25.04.2003: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez ORIMO,H., NAKAJIMA,E., YAMAMOTO,M.: [u.a.]: Association between single nucleotide polymorphisms in the hMSH3 gene and sporadic colon cancer with microsatelite instabi- lity. 2000. In: J. Hum. Genet., Vol.45, S.228-230.PubMed Abstract: PMID 10944853.
Attorney, Agent or Firm:
Dr. B. Huber und Kollegen (München)
Claims:
Nukleinsäuremolekül, das die das humane MSH3 Protein kodierende Nukleinsäuresequenz umfaßt, wobei sich die Sequenz dieses Nukleinsäuremoleküls gegenüber einer Referenzsequenz durch eine Mutation an einer oder mehreren der folgenden Positionen unterscheidet:
(a) 5'UTR –382, –151, –144, –50, –39 und/oder –35;
(b) Exon 1 +151;
(c) Intron 2 +40, +76, und/oder –7;
(d) Intron 3 +59;
(e) Intron 4 +50;
(f) Intron 5 +151;
(g) Intron 8 +71;
(h) Intron 9 +61;
(i) Intron 12 +98;
(j) Intron 20 –103;
(k) Intron 21 –29 und/oder –22;
(l) Intron 23 +64; und/oder
(m) 3'UTR +898;
oder ein Fragment der das humane MSH3 Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz, das eine oder mehrere der Mutationen gemäß (a) bis (m) umfaßt.

Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei sich dessen Nukleinsäuresequenz gegenüber einer Referenzsequenz durch folgende Mutation(en) unterscheidet:
(a) 5'UTR: –382: 19 Basen (TGGCGCGTCCCGCCCAGGT) deletiert; –151: Insertion eines C; –144: T→C; –50: C→T; –39: C→T; oder –35: A→G;
(b) Exon 1 +151: 8 × 9 bp-Wiederholungseinheit SCYSCAGCK (mit S = C oder G; Y = C oder T; K = G oder T) ;
(c) Intron 2 +40: T→C; +76: C→G oder C→A; oder –7: G→A;
(d) Intron 3 +59: G→A;
(e) Intron 4 +50: G→A;
(f) Intron 5 +151: G→A;
(g) Intron 8 +71: T→C;
(h) Intron 9 +61: C→A;
(i) Intron 12 +98: A→G;
(j) Intron 20 –103: T→C;
(k) Intron 21 –29: Insertion TGAA; oder –22: T→A;
(l) Intron 23 +64: G→A; oder
(m) 3'UTR +898: G→A.

Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder Fragment davon, das eine nachweisbare Markierung trägt.

Vektor, eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend.

Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 4 transfiziert ist.

Verfahren zur Diagnose einer mit MSH3 in Zusammenhang stehenden Erkrankung oder einer Prädisposition dafür oder zur Prädikation des Verlaufs, des Schweregrads und/oder der Überlebensdauer bei einer solchen Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure enthaltende Probe von einer zu untersuchenden Person gewonnen wird und mindestens an einer Position gemäß Anspruch 1 oder 2 genotypisiert und mit einer Referenzsequenz verglichen wird, wobei das Vorliegen einer oder mehrerer Veränderungen gemäß Anspruch 1 oder 2 ein Anzeichen für eine Erkrankung oder eine Prädisposition dafür ist oder eine Prädikation des Verlaufs, des Schweregrads und/oder der Überlebensdauer bei einer solchen Erkrankung erlaubt.

Verfahren nach Anspruch 6, wobei mindestens die möglichen Mutationen gemäß Anspruch 1(a) und 1(b) oder 2(a) und 2(b) genotypisiert und mit einer Referenzsequenz verglichen werden.

Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Erkrankung eine maligne Erkrankung ist.

Verfahren nach Anspruch 8, wobei die maligne Erkrankung eine Neoplasie, ein kolorektales Karzinom, ein Endometriumkarzinom, ein Ovarialkarzinom oder eine Leukämie ist.

Verfahren zur Diagnose einer MSH3-bedingten Chemotherapie-Resistenz, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure enthaltende Probe von einer zu untersuchenden Person gewonnen wird und mindestens an einer Position gemäß Anspruch 1 oder 2 genotypisiert und mit einer Referenzsequenz verglichen wird, wobei das Vorliegen einer oder mehrerer Veränderungen gemäß Anspruch 1 oder 2 ein Anzeichen für eine Chemotherapie-Resistenz ist.

Diagnostischer Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 6 bis 10, der ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält oder mindestens einen Primer oder Primersatz, wobei die Primer einen mutierten Bereich gemäß der Definition in Anspruch 1(a) bis 1(m) 5' und/oder 3' flankieren.

Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die zur Therapie oder Prävention einer mit MSH3 assoziierten Erkrankung geeignet ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Inkontaktbringen einer zu untersuchenden Verbindung mit einem von einem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 kodierten MSH3-Protein oder einer diese Nukleinsäure exprimierenden Zelle; und
(b) Bestimmen der Wirkung dieser Verbindung auf die Aktivität des MSH3-Protreins, wobei eine Steigerung oder Wiederherstellung der Aktivität ein Anzeichen dafür ist, dass die Verbindung therapeutisch von Nutzen ist.

Verwendung eines Vektors, der die MSH3-Referenzsequenz oder einen Teil davon enthält zur Gentherapie.

Arzneimittel, einen Vektor gemäß der Definition nach Anspruch 13, die in diesen Vektor inserierte Nukleinsäure oder eine gemäß dem Verfahren nach Anspruch 12 identifizierte Verbindung enthaltend.

Verwendung einer in Anspruch 14 definierten Verbindung zur Behandlung einer mit MSH3 in Zusammenhang stehenden Erkrankung.

Description:

Die Erfindung betrifft neue Sequenzvarianten des menschlichen Mismatch-Repair-Gens MSH3 (OMIM *600887, GenBank J04810, D61397-D61419, U61981) und ihre Verwendung zur Diagnose eines Spektrums von Erkrankungen, vorzugsweise von malignen Erkrankungen, insbesondere zur Feststellung von Neoplasie-Prädispositionen sowie zur Therapeutika-Entwicklung auf der Basis pharmakogenetischer Prinzipien.

Das hereditäre nichtpolyposis-assoziierte kolorektale Karzinom Syndrom (HNPCC) ist eine autosomal-dominant vererbte Tumorprädisposition mit hoher Penetranz. Neben dem kolorektalen Karzinom haben betroffene Personen ein erhöhtes Risiko für das Auftreten von Endometrium-, Urothel-, Magen-, Ovarial- und hepatobiliären Karzinomen. Als Resultat eines defekten DNR-Reparatur-Mechanismus zeigen entsprechende Tumoren Veränderungen in der Anzahl der Wiederholungen einfacher Sequenzen (Grundzahl: 1–6 Nukleotide), genannt Mikrosatelliten-Instabilitäten (MSI). Weiterhin sind ca. 10–15% der sporadischen kolorektalen Tumoren Mikrosatelliten-instabil. Mutationen in den Mismatch-Repair-Genen hMSH2, hMLH1, hMSH6 und hPMS2 konnten als HNPCC assoziierte Keimbahnveränderungen identifiziert werden, wobei hMSH2- und hMLH1-Mutationen mit zusammen ca. 70% die Mehrzahl der genetischen HNPCC-Prädispositionen darstellen.

Darüber hinaus konnten somatische Mutationen in einem weiteren Mismatch-Repair-Gen, hMSH3, in instabilen Tumorzelllinien und Tumoren identifiziert werden. Biochemische Analysen an menschlichen und Hefe-Substraten ergaben, dass sowohl das hMSH6-Protein wie auch das hMSH3-Protein jeweils heterodimere Proteinkomplexe mit dem hMSH2-Protein bilden. Die Stabilität der hMSH6- und hMSH3-Proteine hängt von der hMSH2-Expression ab.

Diese beiden Proteinkomplexe erfüllen spezifische Funktionen innerhalb des Mismatch-Repair-Systems der Zelle bei der Erkennung von DNA-Fehlpaarungen. In vitro erkennt und bindet der mutSα-Proteinkomplex (bestehend aus dem hMSH2- und hMSH6-Protein) Basen-Fehlpaarungen und Insertion/Deletion-Loops (IDLs) von einem oder zwei Basen. Der mutSβ-Proteinkomplex (bestehend aus dem hMSH2- und hMSH3-Protein) unterstützt effizient die Reparatur von Insertions/Deletions-Heterologien von 2 bis 8 Basen, ist schwach aktiv bei Ein-Basen-IDLs und hat keine messbare Aktivität bei Basen-Fehlpaarungen. Die beiden Proteinkomplexe sind also zumindest teilweise redundant, sie überlappen sich in ihren Funktionen jedoch nicht vollständig. Weiterhin konnte bei Endometriumkarzinom-Zelllinien eine Bedeutung des hMSH2/hMSH3-Heterodimers für die genomische Stabilität nachgewiesen werden, was auf eine zweite Funktion dieses Komplexes hindeutet.

An Knock-out-Mäusen konnte gezeigt werden, dass eine Msh2-Defizienz die Aktivität beider Proteinkomplexe zunichte macht, woraus eine starke Krebsdisposition erwächst. Bei Msh6-Defizienz beschleunigt ein zusätzlicher Msh3-Verlust die Tumorigenese intestinaler Tumoren und erreicht Werte vergleichbar mit Msh2-defizienten Mäusen. Der Funktionsverlust von Msh6 oder Msh3 bedingt jedoch nur einen partiellen Mismatch-Repair-Defekt. Eine Msh3-Defizient allein (bei intaktem Msh2 und Msh6) führt bei Mäusen zu einer späteren und verringerten Entstehung gastrointestinaler Tumoren, verglichen zu Msh2- oder Msh6-defizienten Mäusen.

Das hMSH3-Gen wurde 1989 als erstes humanes Mismatch-Repair-Gen kloniert. Es liegt auf dem langen Arm von Chromosom 5 (5g11.2-g13.2) in unmittelbarer Nachbarschaft des Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gens. Beide Gene werden gemeinsam mittels eines bidirektionalen Promotors in geringer Intensität in allen bisher untersuchten Geweben exprimiert. Das hMSH3-Gen besteht aus 24 Exons und erstreckt sich über eine genomische Region von ca. 230 kb. Die kodierende Region beträgt 3387 bp, was einem Protein von 1128 Aminosäuren entspricht. Die einzelnen Exons, bzw. die kodierenden Regionen von Exon 1 und 24 haben eine Länge zwischen 65 und 221 bp.

Bisher wurden keine pathogenen Keimbahnmutationen im hMSH3-Gen beschrieben, jedoch zeigte sich bei einer von 19 untersuchten Familien eine Kopplung der Erkrankung mit dem hMSH3-Locus. Für den Wildtyp einer Missense-Variante konnte eine, verglichen zu Normalkontrollen, signifikant erhöhte Allelfrequenz bei Patienten mit sporadischen Mikrosatelliten-instabilen Kolonkarzinomen gefunden werden. Weiterhin wurde eine 27 bp Deletion in Exon 1 beschrieben, wobei der resultierende Verlust von neun Aminosäuren jedoch zumindest keine hochpenetrante funktionelle Konsequenz zu haben scheint und als Polymorphismus interpretiert wurde. Diese 27 bp Deletion besteht in der Deletion von drei von sechs Wiederholungen eines Imperfekten Repeats [Konsens-Sequenz: (G/C)C(C/T)(G/C)CAGCG], welches 151 Nukleotide nach dem ATG-Startcodon beginnt. Für eine japanische Population wurde gezeigt, das für dieses Repeat Allele mit drei bis sieben Wiederholungen auftreten. Damit ist die Kenntnis von Sequenzvarianten des MSH3-Gens, die mit den vorstehenden Erkrankungen bzw. Dispositionen in Zusammenhang stehen und somit als diagnostische Marker von Nutzen sein könnten, noch sehr begrenzt.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, weitere Marker zur Diagnose von mit MSH3 bzw. dessen abnormaler Expression/Aktivität in Zusammenhang stehenden Erkrankungen bzw. einer entsprechenden Prädisposition dafür zur Verfügung zu stellen.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Sequenzvarianten (Polymorphismen und Mutationen) und resultierende Haplotypen in der DNA-Sequenz des humanen MSH3-Mismatch-Repair-Gens konnten ermittelt und deren Korrelationen mit Krankheitsprädispositionen und -dispositionen festgestellt werden, d.h. in der genomischen MSH3-Sequenz konnten zahlreiche Varianten gefunden werden. Es handelt sich dabei um Varianten an den folgenden genomischen Bereichen: 5'UTR –382, 5'UTR –151, 5'UTR –144, 5'UTR –50, 5'UTR –39, 5'UTR –35, Exon1 151, Intron 2 +40, Intron 2 +76, Intron 2 –7, Intron 3 +59, Intron 4 +50, Intron 5 +151, Intron 8 +71, Intron 9 +61, Intron 12 +98, Intron 20 –103, Intron 21 –29, Intron 21 –22, Intron 23 +64 und 3'UTR +898. Es wurde ferner gefunden, dass diese genetischen Varianten teilweise mit der Prädisposition für verschiedene Krankheiten, z. B. kolorektales Karzinom, korrelieren. Ausgehend von diesen Korrelationen erscheint eine Entwicklung von Verfahren zur Diagnose dieser Krankheitsprädispositionen und -dispositionen, sowie zur Prädiktion von Schweregrad, Verlauf und Überlebenszeit entsprechender Erkrankungen möglich und außerdem ein System (a) zur Prädiktion der individuellen Ansprechbarkeit von Neoplasien auf verschiedene Chemo-Therapeutika und (b) zur Entwicklung individuell spezifischer Chemo-Therapeutika. Außerdem erlauben die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Befunde die Entwicklung von Testsystemen zur Erforschung pathophysiologischer Zusammenhänge und Entwicklung oben genannter Therapeutika. Zusammenfassend kann für jeden hMSH3-Genotyp ein individuelles Risiko an einer bestimmten Krankheit zu erkranken, vorhergesagt werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

1: Partielle Nukleotidabfolge der Referenz-Nukleinsäuresequenz von hMSH3 mit eingezeichneten neuen Sequenzvarianten Die partiell dargestellte Referenzsequenz ist die von Watanabe et al., Genomics 31(3) (1996), 311–318 publizierte hMSH3-Mismatch-Repair-Gen-Sequenz (GenBank-Zugangsnummer: J04810 und D61397-D61419). Die Positionen der Sequenzänderungen beziehen sich auf die Positionen der Referenzsequenz. Basen des kodierenden Bereichs (der Exons) und der 5'- und der 3'nichttranslatierten Regionen (UTR) sind mit Großbuchstaben dargestellt. Basen der Introns sind mit Kleinbuchstaben dargestellt. Kursiv geschriebene Basen kennzeichnen das Translations-Start-Codon in Exon 1 und das Translations-Stop-Codon in Exon 24. Zahlen vor den Zeilen mit Großbuchstaben geben die Position der ersten Base in der jeweiligen Zeile an, wobei die erste Base (A) des Translations-Start-Codons in Exon 1 Position 1 ist. Die Positionsangaben der Sequenzvarianten im kodierenden Bereich beziehen sich ebenfalls auf den Translations-Start. Fettgedruckte Basen der Referenzsequenz kennzeichnen Basen, die durch die dargestellten Sequenzvarianten ausgetauscht oder deletiert werden. Die Positionen für Sequenzvarianten in Introns (IVS) werden ermittelt, indem ab der ersten Base eines Introns mit +1, bzw. ab der letzten Base eines Introns mit –1 gezählt wird. Insertionen erfolgten vor der mit Pfeil gekennzeichneten Base, so dass in der veränderten Sequenz diese Position durch die erste Base der Insertion eingenommen wird. Es sind nur die Bereiche des MSH3-Gens dargestellt, in denen neue Sequenzvarianten identifiziert wurden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Nukleinsäuremolekül, das die das humane MSH3 Protein kodierende Nukleinsäuresequenz umfaßt, wobei sich die Sequenz dieses Nukleinsäuremoleküls gegenüber einer Referenzsequenz durch eine Mutation an einer oder mehreren der folgenden Positionen unterscheidet: (a) 5'UTR –382, –151, -144, –50, –39 und/oder – 35; (b) Exon 1 +151; (c) Intron 2 +40, +76, und/oder –7; (d) Intron 3 +59; (e) Intron 4 +50; (f) Intron 5 +151; (g) Intron 8 +71; (h) Intron 9 +61; (i) Intron 12 +98; (j) Intron 20 – 103; (k) Intron 21 –29 und/oder –22; (1) Intron 23 +64; oder (m) 3'UTR +898; oder ein Fragment der das humane MSH3 Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz, das eine oder mehrere der Mutationen gemäß (a) bis (m) umfaßt.

Der hier verwendete Ausdruck „Referenzsequenz" bezieht sich auf die in Watanabe et al., Genomics 31(3) (1996), 311–318, beschriebene Nukleinsäuresequenz (GenBank-Zugangsnummer: J04810 und D61397-61419). Bezüglich der Bezeichnung der Positionen wird auf die Legende zu 1 verwiesen.

Der hier verwendete Ausdruck „Fragment" bezieht sich auf Teilstücke der das MSH3 Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz, die aber noch die entsprechende Mutation (oder mehrere) umfassen, wobei die Mutation bevorzugt in einem mittleren Bereich des Fragments liegt. Diese Fragmente sind z.B. als Sonden in diagnostischen Assays (gegebenenfalls in Kombination mit den entsprechenden, die Sequenz der Referenzsequenz enthaltenen Oligonukleotiden) von Nutzen und weisen eine Länge von mindestens 11 Basen, vorzugsweise von mindestens 15 Basen, mehr bevorzugt von mindestens 25 und am meisten bevorzugt von mindestens 50 Basen auf, die zu der MSH3-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen identisch bzw. komplementär sind.

Der hier verwendete Ausdruck „Mutation" bezieht sich auf alle Arten von Mutationen, unabhängig davon, ob diese zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz des MSH3 Proteins führen. Diese Mutationen umfassen den Austausch, die Insertion oder die Deletion von Base(n). Bezüglich einer Insertion beziehen sich die Positionsangaben 5' zu der angegebenen Position.

In einer bevorzugten Ausführungsform unterscheidet sich die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls gegenüber der Referenzsequenz durch folgende Mutation(en): (a) 5'UTR: –382: 19 Basen (TGGCGCGTCCCGCCCAGGT) deletiert; –151: Insertion eines C; –144: T→C; –50: C→T; –39: C→T; oder –35: A→G; (b) Exon 1 +151: 8 × 9 bp-Wiederholungseinheit SCYSCAGCK (mit S = C oder G; Y = C oder T; K = G oder T; eine analoge Schreibweise ist: (C/G)C(C/T)(C/G)CAGC(G/T)); (c) Intron 2 +40: T→C; +76: CTG, oder C→A; oder –7: G→A; (d) Intron 3 +59: G→A; (e) Intron 4 +50: G→A; (f) Intron 5 +151: G→A; (g) Intron 8 +71: T→C; (h) Intron 9 +61: C→A; (i) Intron 12 +98: A→G; (j) Intron 20 –103: T→C; (k) Intron 21 –29: Insertion TGAA; oder –22: T→A; (1) Intron 23 +64: G→A; oder (m) 3'UTR +898: G→A.

In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform trägt das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Fragment davon eine nachweisbare Markierung, vorzugsweise ist diese Markierung ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder Enzym-Cofaktor.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Vektor, der eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthält. Geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt. Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Vektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und gegebenenfalls geeignete Reportergene zum Studium der Promotoraktivität enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989), beschrieben sind.

Dieser Vektor gestattet z.B. Untersuchungen zur Aktivität des veränderten MSH3 Proteins in einer humanen Zellinie oder die Suche nach Verbindungen, die die Aktivität des Proteins in gewünschter Weise beeinflussen und somit das Screenen nach therapeutischen Wirkstoffen erlauben. Verfahren zur Isolierung bzw. Synthese solcher Wirkstoffe sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise können möglicherweise nützliche Verbindungen in Extrakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial gescreent werden. Solche Extrakte können beispielsweise aus Pilzen, Actinomyceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien stammen. Solche Verbindungen können auch synthetisch hergestellt werden. Die Herstellung und das simultane Screenen von großen Banken aus synthetischen Molekülen kann mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159–2164 und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145–167. Die Methodik der kombinatorischen Chemie kann dazu verwendet werden, eine riesige Anzahl von Verbindungen zu erzeugen, die hinsichtlich spezifischer Verbindungen, die geeignete Bindungsaffinitäten, z.B. zu dem MSH3 Protein besitzen, sehr schnell gescreent werden können und Spezifitäten gegen ein beliebiges Ziel, wie die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, können genutzt werden (siehe für eine allgemeine Hintergrundinformation Gold, J. of Biol. Chem. 270 (1995), 13581–13584). Nützliche Verbindungen können auch mittels des "Rational drug design" erhalten werden, das einen integrierten Satz an Methoden beinhaltet, zu denen die Strukturanalyse von Zielmolekülen, synthetische Chemie und fortgeschrittene Computerverfahren zählen. Bei der Verwendung zum Entwurf von Modulatoren der MSH3-Proteinaktivität besteht das Ziel von "rational drug design" in einem Verständnis der dreidimensionalen Gestalt und der Chemie eines Moleküls. "Rational drug design" wird unterstützt von Daten, die durch Röntgenstrukturanalyse oder NMR gewonnen wurden; siehe dazu beispielsweise Coldren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 6635–6640.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die zur Therapie oder Prävention einer mit MSH3 assoziierten Erkrankung geeignet ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

  • (a) Inkontaktbringen einer zu untersuchenden Verbindung mit einem von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodierten MSH3-Protein oder einer diese Nukleinsäure exprimierenden Zelle; und
  • (b) Bestimmen der Wirkung dieser Verbindung auf die Aktivität des MSH3-Protreins, wobei eine Steigerung oder Wiederherstellung der Aktivität ein Anzeichen dafür ist, dass die Verbindung therapeutisch von Nutzen ist.

Geeignete Assays zur Bestimmung der biologischen Aktivität von MSH3 sind dem Fachmann bekannt und z.B. auch in Acharya et al., 1996, PNAS 93:13629–13634 beschrieben.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zum Studium der Expression von Reportergenen unter Kontrolle der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auch, Störungen bzw. Krankheiten, die mit MSH3 in Zusammenhang stehen, d.h., mit dessen gestörter Expression bzw. einer (gegenüber der Normalsituation veränderten) Aktivität des kodierten Proteins, auf genetischer Ebene zu untersuchen. Mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. davon abgeleiteten Sonden oder Primern kann in Säugern, insbesondere dem Menschen, z.B. festgestellt werden, ob die DNA-Sequenz die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Mutationen aufweist.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose einer mit MSH3 in Zusammenhang stehenden Erkrankung oder einer Prädisposition dafür oder zur Prädikation des Verlaufs, des Schweregrads und/oder der Überlebensdauer bei einer solchen Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure enthaltende Probe von einer zu untersuchenden Person gewonnen und mindestens an einer Position gemäß Anspruch 1 oder 2 genotypisiert und mit einer Referenzsequenz verglichen wird, wobei das Vorliegen einer oder mehrerer Veränderungen gemäß Anspruch 1 oder 2 ein Anzeichen für eine Erkrankung oder eine Prädisposition dafür ist oder eine Prädikation des Verlaufs, des Schweregrads und/oder der Überlebensdauer bei einer solchen Erkrankung erlaubt.

Der Fachmann kennt Verfahren zur Probenentnahme, wobei geeignete Proben z.B Blut, Normal- oder Tumorgewebe sowie Speichel sind. Nukleinsäure des Patienten kann dabei ohne vorherige Reinigung oder in gereinigter Form – je nach verwendetem Analyseverfahren – genotypisiert werden. Die Genotypisierung kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen, z.8. durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für die Detektion von Punktmutationen oder Insertionen/Deletionen geeignet sind. Dazu gehören PCR-gestützte Genotypisierungsverfahren wie z. B. allelspezifische PCR, andere Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden (z.B. „dot blotting" oder „Oligonucleotide Ligation Assays" (OLA), Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen und „Single Nucleotide Polymorphism" (SNP)-Analyse mittels „Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry" (MALDI), sowie die Chip-Technologie in all ihren technologischen Ausführungen. Die Insertions- und Deletionsvarianten können des weiteren auch durch Fragmentlängenbestimmung auf Agarose- oder Polyacrylamid-Gelen oder anderen geeigneten Separationsmedien bestimmt werden. Vorzugsweise sind die Primer für die PCR Oligonukleotide, die einen Nukleinsäure-Bereich umfassen, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (gemäß der Definition in Sambrook, supra) mit mindestens 11, vorzugsweise mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotiden der MSH3-Sequenz hybridisieren und den Bereich mit der fraglichen Mutation 5' und 3' flankieren. Die Primer können auch eine Markierung tragen, z.B. ein Radioisotop, fluoreszierende Verbindung, Enzym oder Enzym-Cofaktor.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren dadurch gekennzeichnet, dass es die Diagnose einer malignen Erkrankung, vorzugsweise eine Neoplasie, ein kolorektales Karzinom, ein Ovarialkarzinom oder eine Leukämie bzw. Prädisposition dafür etc., betrifft. So kann mit dem erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren beispielsweise eine Prädisposition für das Entstehen von kolorektalen Adenomen und deren Weiterentwicklung zum kolorektalen Karzinom untersucht werden. Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren eignet sich schließlich auch für den Nachweis von Krankheitsprädispositionen in Populationen als auch Familien.

Die Diagnose von Mismatch-Reparatur(MMR)-Defizienz bei Tumoren aufgrund von Mutationen in den entsprechenden Genen ist auch deshalb von Bedeutung, da entsprechende Tumoren Resistenzen gegen verschiedene Chemo-Therapeutika (Cisplatin, Alkylanzien), vermutlich aufgrund der hohen Mutationsraten, entwickeln. In Hefe konnte gezeigt werden, dass die Inaktivierung von MSH3, analog zur Inaktivierung von MLH1, MSH2 und MSH6, eine gesteigerte Resistenz gegen Cisplatin, Carboplatin und Doxorubicin hervorruft. Daraus können sich unmittelbare Konsequenzen für die Therapie von Patienten ergeben, deren Tumoren auf Basis einer hMSH3-Defizienz entstanden sind.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose einer MSH3-bedingten Chemotherapie-Resistenz, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure enthaltende Probe von einer zu untersuchenden Person gewonnen wird und mindestens an einer Position gemäß Anspruch 1 oder 2 genotypisiert und mit einer Referenzsequenz verglichen wird, wobei das Vorliegen einer oder mehrerer Veränderungen gemäß Anspruch 1 oder 2 ein Anzeichen für eine Chemotherapie-Resistenz, vorzugsweise gegenüber Cysplatin, Carboplatin oder Doxorubicin ist. Die Diagnose einer solchen Resistenz erlaubt die Durchführung entsprechend angepaßter therapeutischer Maßnahmen.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens, der ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder ein Fragment davon gemäß vorstehender Definiton enthält oder mindestens einen Primer oder Primersatz gemäß der vorstehenden Definition. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können das Nukleinsäuremolekül oder das Fragment davon bzw. der (die) Primer immobilisiert sein.

Unter die Definition der erfindungsgemäßen Wirtszellen fallen auch Kulturen von z.B. neoplastischen Zellen, die die erfindungsgemäßen individuellen hMSH3-Genvarianten oder unterschiedliche Kombinationen davon aufweisen können als in vitro-Testmodelle für die Entwicklung individuell spezifischer Therapeutika (z.B. Chemotherapeutika, die nicht zu einer Resistenz der neoplastischen Zellen führen) dienen. Für diesen Zweck können aber auch in vivo-Testmodelle (vorzugsweise nicht-menschliche transgene Tiere) verwendet werden, die die erfindungsgemäßen individuellen hMSH3-Genvarianten oder unterschiedliche Kombinationen davon tragen. Als individuelle Testmodelle erlauben sie in vitro (= ex vivo) z.B. eine Vorhersage zum individuellen Funktionszustand von Chemotherapeutika bei der Behandlung von Neoplasien, deren Entstehung durch die Defizienz des hMSH3-Mismatch-Repair-gens vermittelt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Vektors, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die sich von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz dadurch unterscheidet, dass sie keine Austausche enthält, sondern in dem verwendeten Bereich der MSH3-Referenzsequenz oder einem Teil davon entspricht, zur Gentherapie.

Vorzugsweise werden diese Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise DNA-Sequenzen, in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, und in die Zellen eingeschleust. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder Adenovirus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, das einen vorstehend beschriebenen Vektor bzw. eine MSH3-Referenzsequenz oder ein Fragment davon oder eine gemäß dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren identifizierte Verbindung enthält. Dieses Arzneimittel enthält gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung des Arzneimittels kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, der Art und dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc..

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1Allgemeine Verfahren

Für die Erhebung des gesamten polymorphen Spektrums des hMSH3-Mismatch-Repair-Gens wurden die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die DNA-Sequenzierung nach Sanger verwendet. Hierzu wurde die gesamte kodierende Sequenz inklusive der flankierenden Intronbereiche und Teile der 5'- und 3'-nichttranslatierten Regionen in 22 Fragmente unterteilt und mittels PCR amplifiziert. Die hierfür erstellten und genutzten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die PCR wurde in 25 μl Reaktionsvolumen mit 30–50 ng genomischer DNA, 1,7 mM MgCl, 200 nM jedes der vier Dinukleotide, 200 nM jeder der beiden Primer, 1 Unit Taq-Polymerase (Ampli-Taq von PE Applied Biosystems, Deutschland, Weiterstadt) und 10% des zur Taq-Polymerase mitgelieferten 10 × PCR-Puffers durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren 5 min 94°C gefolgt von 35 Zyklen mit 1 min 94°C, 1 min 58 °C und 2 min 72°C und abschließend 7 min 72°C. Das erste Fragment, welches Exon 1 enthält, wurde abweichend zu den oben genannten Bedingungen mit einer Denaturations-Temperatur von 96°C und einer Annealing-Temperatur von 60°C amplifiziert, wobei als DNA-Polymerase und PCR-Puffer der Expand High Fidelity Kit (Roche Diagnostics, Deutschland, Mannheim) genutzt wurde.

Die fertigen Reaktionen wurden auf Agarosegelen (1 % Agarose, 1 × TAE-Puffer) im elektrischen Feld aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Anschließend wurden die amplifizierten Fragmente unter UV-Licht aus den Agarose-Gelen ausgeschnitten und mit sterilem, deionisiertem Wasser durch Inkubieren für 3 h bei 75°C oder für 10 h bei 30 °C oder durch Filterzentrifugation für 2 min bei 800 G eluiert.

Die so gewonnenen Eluate wurden mittels des Thermo SequenaseTM Fluorescent Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Deutschland, Freiburg) und Primer, die auch zur Fragmentamplifikation genutzt wurden, sowie weitere, fragmentinterne Primer (wie in Tabelle 1 aufgeführt) sequenziert. Für jede zu generierende Sequenz wurden vier Reaktionen durchgeführt, welche 5 μl Eluat, 1 μl eines 1 mM Sequenzier-Primers und 2 μl Sequenzierreagent-Mix (Thermo Sequenase, dNTPs und jeweils ddATPs, ddCTPs, ddGTPs oder ddTTPs) in einem Gesamtvolumen von 8 μl enthielten. Die Reaktionsbedingungen waren 2 min 94°C, gefolgt von 20 Zyklen 30 sec 94°C und 30 sec 60°C und abschließend 2 min 72°C. Alle für die Sequenzierung genutzten Primer waren Cy5-Farbstoff markiert, was die Detektion der Produkte der Sequenzierreaktionen auf „Automated Laser Fluorescent (ALF) express"-Sequenzierautomaten (Amersham Pharmacia Biotech, Deutschland, Freiburg) ermöglichte. Entsprechend erfolgte die Bestimmung der Sequenzen mittels ALFexpress Sequenzierautomaten. Die Elektrophorese wurde mit Standardplatten mit 0,3 mm starken Long RangerTM- (FMC BioProducts, Rockland, Maine, USA) oder Polyacrylamid (PAA)-Gelen (6,5 % Long Ranger oder PAA, 7 M Urea, 1 × TBE-Puffer) bei 950 V, 38 mA und 42 W für 10 Stunden durchgeführt. Sämtliche PCR- und Sequenzierungsreaktionen wurden mittels GeneAmp® PCR Systemen 9700 (PE Applied Biosystems, Deutschland, Weiterstadt) durchgeführt.

Tabelle 1: Primer für die Amplifikation und Sequenzierung des hMSH3-Mismatch-Repair-Gens

aPrimer mit einem 'y' in der Bezeichnung sind Cy5 Farbstoffmarkiert und wurden für die Sequenzierung eingesetzt.

Beispiel 2: In Patienten mit vererbten oder sporadischen Neoplasien neu identifizierte MSH3-Varianten

Es wurde die genomische DNA-Sequenz des menschlichen MSH3-Gens (Teile der 5'- und 3'-nichttranslatierten Region, sowie alle 24 kodierenden Exons und deren flankierende Intronbereiche) in Patienten mit vererbten oder sporadischen Neoplasien und nicht betroffenen Kontrollpersonen mittels der DNA-Sequenzierung nach Sanger (nach erfolgter Amplifikation der entsprechenden Gen-Abschnitte mittels Polymerasekettenreaktion und spezifischen Primern) untersucht, und zunächst eine Reihe von genetischen Varianten identifiziert, wobei die Untersuchungsanzahl 40 DNAs betrug. In den untersuchten Gen-Abschnitten wurden insgesamt 21 neue Varianten entdeckt (siehe Tabelle 2).

Als Referenzsequenz für die Varianten, deren Positionen und Konsequenzen für die Aminosäurekodierung dienten die genomische und die mRNA Gen-Sequenz von hMSH3 (GenBank Accession Nr.: U61981 sowie GenBank Accessions J04810 und D61397-D61419). Die Positionsangaben für die Sequenzvarianten in den Exons beziehen sich auf die erste Base des Translations-Start-Codons (Position 1). Die Positionsangaben für die Sequerizvarianten in den Introns (Intron 1 liegt zwischen Exon 1 und 2 u.s.w.) beziehen sich entweder auf die erste Base des jeweiligen Introns nach dem vorhergehenden Exon (Position +1), oder auf die letzte Base des jeweiligen Introns vor dem nächsten Exon (Position –1). Für Insertionen und Deletionen ist jeweils die in Leserichtung letzte Möglichkeit einer Mutation, die zur gefundenen Sequenz führt, angegeben.

Tabelle 2: Neu identifizierte Sequenzvarianten im Mismatch-Repair-Gen hMSH3

Diese Varianten sind in 1 in Bezug auf die Basenabfolge der Referenzsequenzen (GenBank J04810, D61397-D61419, U61981) des hMSH3-Gens übersichtlich dargestellt.

Korrelationen mit Erkrankungen, Prädispositionen bzw. klinisch relevanten Phänotypen:

Einen spezifischen Einfluß auf das Risiko an einem Karzinom zu erkranken, konnte z.B. für die variable Region beginnend an Position 151 (Exon 1) und für die C → T Transition an Position –39 der 5'UTR nachgewiesen werden. Die Insertion/Deletion führt bei der Translation zu einer variablen Anzahl der Aminosäuren Alanin und Prolin. In Tumorzellen von Patienten ist das zweite Allel des hMSH3-Gens oft durch eine weitere, somatische Mutation (meist Verlust des gesamten Alleles) inaktiviert, so dass diese Zellen ohne vollständiges hMSH3-Genprodukt bleiben. Analog treten die hier beschriebenen Sequenzvarianten in der 5'UTR bei bestimmten Gruppen von Patienten mit nach molekulargenetischen Merkmalen subklassifizierten kolorektalen Karzinomen häufiger auf, als in der Normalbevölkerung. Damit ergibt sich für diese Varianten ein weiterer hier identifizierter Risikofaktor.

Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß die Sequenzvariante an Position 151 von Exon 1 mit 8 Wiederholungen des Imperfekten 9 bp Repeats seltener bei Patienten mit kolorektalen Tumoren (1–2% in > 60 Patienten) als in der Normalbevölkerung (4–5% in > 150 Individuen) auftritt. Für die 5'UTR Position –39 ist das T-Allel mit dem Auftreten von kolorektalen Karzinomen assoziiert. Ähnliche Assoziationen liegen für die weiteren Sequenzvarianten bzw. Haplotypen vor. Somit läßt sich ein individuelles Risiko an einer Krankheit (z.B. kolorektalem Karzinom) zu erkranken für jede Sequenz- bzw. Haplotypenvariante der hier beschriebenen Polymorphismen mit oder ohne Berücksichtung weiterer, bereits bekannter, Polymorphismen bestimmen.