Title:
Verfahren zur Bestimmung allergener Potenz von Produkten
Kind Code:
B4


Abstract:

Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der allergenen Potenz von Produkten mittels Granulozyten und/oder Mastzellen, nach dem Prinzip der Fluoreszenz-Ratio-Imaging-Technik, bei dem man
– Granulozyten aus Blut aufreinigt und anreichert oder aus Gewebe isoliert oder Mastzellen aus Gewebe isoliert
– die Granulozyten oder Mastzellen mit einem fluoreszierenden Calciumindikatorfarbstoff belädt
– die Granulozyten oder Mastzellen mit dem Produkt, dessen allergene Potenz bestimmt werden soll, in Kontakt bringt und die intrazelluläre Veränderung der Ca2+-Konzentration mittels der Flureszenz-Ratio-Imaging-Technik bestimmt.




Inventors:
Eckert, Ralph, Priv.-Doz. Dr.med. (66129, Saarbrücken, DE)
Application Number:
DE10235310A
Publication Date:
05/16/2012
Filing Date:
08/01/2002
Assignee:
Molecular and Clinical Drug Research, 66822 (DE)



Foreign References:
200200129552002-01-31
Other References:
Datenbank PubMed bei NCBI, Adresse www.ncbi.nlm. nih.gov, Zusammenfassung zu: ALMERS, W. & NEHER, E.: The Ca signal from fura-2 loaded mast cells depends strongly on the method of dye-loading. FEBS Lett. (1985) 192 (1) 13-8 Ärecher. am am 27.06.2005
MILLARD, P.J. u.a.: Imaging asynchronous changes in intracellular Ca2+ in individual stimulated tumor mast cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (6) 1854-8
Attorney, Agent or Firm:
WSL Patentanwälte Partnerschaftsgesellschaft, 65185, Wiesbaden, DE
Claims:
1. Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der allergenen Potenz von Produkten mittels Granulozyten und/oder Mastzellen, nach dem Prinzip der Fluoreszenz-Ratio-Imaging-Technik, bei dem man
– Granulozyten aus Blut aufreinigt und anreichert oder aus Gewebe isoliert oder Mastzellen aus Gewebe isoliert
– die Granulozyten oder Mastzellen mit einem fluoreszierenden Calciumindikatorfarbstoff belädt
– die Granulozyten oder Mastzellen mit dem Produkt, dessen allergene Potenz bestimmt werden soll, in Kontakt bringt und die intrazelluläre Veränderung der Ca2+-Konzentration mittels der Flureszenz-Ratio-Imaging-Technik bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Granulozyten um basophile Granulozyten handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufreinigung und Anreicherung mittels der Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung der Granulozyten mit Hilfe immunomagnetischer Trennung durch Markierung der Zellen mit Antikörpern und anschließender Säulenaufreinigung durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Indikatorfarbstoff um Fura-2 handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Beladung der Granulozyten mit Fura-2 in PBS, BSA und EDTA bei 37°C bei mindestens 30 Minuten, vorzugsweise mit einem Waschgang mit PBS und BSA und anschließender 20-minütiger Nachinkubation bei 37°C, vorgenommen wird.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung mittels eines geeigneten Software-Programms durchgeführt wird.

8. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Diagnose von Allergien bei atopischen Personen.

9. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Ermittlung des allergenen Potentials von Stoffen oder Produkten, insbesondere von Kosmetika, Körperpflegemitteln, Lebensmitteln, Pharmazeutika, chemischen Einzelstoffen.

Description:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung der allergenen Potenz von Produkten mittels Granulozyten und/oder Mastzellen nach dem Prinzip der Fluoreszenz-Ratio-Imaging-Technik.

Die Zahl der allergischen Erkrankungen in der Bevölkerung wächst von Jahr zu Jahr. Allergische Erkrankungen (Allergonen) gehören inzwischen zu den großen Gesundheitsproblemen der Industrienationen. Als Gründe für die Zunahme der Allergieformen werden veränderte Wohnbedingungen, verminderte Infektionsrisiken im Säuglings- und Kleinkindesalter, ein intensiverer Allergenkontakt im häuslichen Wohnbereich, veränderte Ernährungsbedingungen oder Schadstoffbelastungen der Umwelt genannt. Bis zu 25% der Bevölkerung westlicher Industrienationen gehören zur Gruppe der Allergiker.

Die häufigste Form der Allergie ist der Heuschnupfen, die allergische Form des Bronchialasthmas und die Neurodermitis, welche auch unter dem Begriff Atopie-Syndrom zusammengefasst werden. Allergie beschreibt die angeborene oder erworbene spezifische Änderung der Reaktionsfähigkeit des Immunsystems gegenüber körperfremden, eigentlich unschädlichen Substanzen, sogenannten Allergenen. Typische Allergene sind Bestandteile des Kots der Hausstaubmilbe, Tierepithelien, Pollen, verschiedene Nahrungsmittel, Schimmelpilze, Sporen und Insektengifte. Allergene in kosmetischen Produkten bzw. Arzneimitteln sind hier ebenfalls zu nennen.

Der Mechanismus der allergischen Reaktion bei atopischen Menschen ist in der Literatur ausführlich beschrieben. Dabei spielen Antikörper, sogenannte Immunoglobuline, eine große Rolle. Zunächst muss das Immunsystem auf das betreffende Allergen geprägt werden. Diese als Sensibilisierung bezeichnete Phase läuft normalerweise beim Erstkontakt mit einem Allergen ab. Die Sensibilisierung ermöglicht es dem Immunsystem durch Produktion spezifischer Antikörper bei weiteren Kontakten direkt auf das entsprechende Allergen zu reagieren. Das Allergen oder Antigen weist häufig ein Eiweißbestandteil auf und wird von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, sie geben die Information an B-Zellen weiter, die schließlich für die Produktion spezifischer, auf das Allergen passender, Antikörper (sog. Immunoglobulin Typ E, kurz IgE) verantwortlich sind. IgE sind ypsilonförmige Moleküle, die sich auf die Oberflächen von Mastzellen oder basophilen Granulozyten setzen. Sie besitzen eine hohe Affinität zu diesen Zellen.

Bei erneutem Allergenkontakt heftet sich ein Allergen an zwei Antikörper, was zur Freisetzung verschiedener Mediatoren führt. Diesen Vorgang bezeichnet man als Degranulation. Mediatoren sind beispielsweise Histamine, Leukotriene, Prostalglandine, die die eigentliche allergische Reaktion verursachen. Die Entzündungseffekte von Histamin erklären sich aus ihren pharmakologischen Eigenschaften, die über H1-Rezeptoren auf Blutgefässe, glatte Muskulatur und die Oberfläche von Schleimhäuten einwirken. Dadurch läuft eine Reaktionskaskade ab, die die typischen Symptome wie Kontraktion der Muskulatur der Atemwege, bis hin zu einem Asthmaanfall, Erweiterung der Blutgefässe und somit auch Rötung und Schwellung, Absonderung von Schleim, Juckreiz und Schmerz, verursacht.

Zur Diagnose von Allergien ermittelt man die im Blut vorhandenen spezifischen und unspezifischen IgE- und IgG-Antikörper. IgG-Antikörper lösen nach neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen ebenfalls allergische Reaktionen aus. Zur Bestimmung von spezifischen oder unspezifischen Antikörpern werden sowohl In vivo-Testmethoden, als auch In vitro-Testmethoden angewandt. Zu den In vivo-Testmethoden zählen insbesondere Hautteste, Kontaktekzemen und Provokationsteste. Bei dem Hauttest (sog. Prick-Test) wird ein gelöstes Allergen in die Haut mittels einer kurz geschliffenen Nadel appliziert. Bei einer allergischen Reaktion werden an dieser Stelle Quaddeln oder Rötungen sichtbar. Bei Kontaktekzemen werden Allergene über Pflaster auf die Haut gebracht; die Überempfindlichkeit ist durch Papeln oder Knötchen gekennzeichnet. Bei dem Provokationstest wird das fragliche Allergen auf die Schleimhaut der Nase oder der Atemwege appliziert. Eine genaue Beobachtung der Reaktion ist hier besonders wichtig.

Diese Tests können für Patienten stark belastend sein, da die Gefahr eines anaphylaktischen Schocks stets besteht und nicht zu unterschätzen ist.

Unter den Laboratoriumsuntersuchungen hat sich der Nachweis spezifischer IgE-Antikörper im Serum weltweit als diagnostisches Verfahren durchgesetzt, die sogenannte In vitro-Testmethode. Dabei werden zur Diagnose von Allergien einmal die Bestimmung der Gesamtkonzentration an IgE im Blut und zum anderen eine Bestimmung von allergenspezifischen IgE-Antikörpern durchgeführt. Diese Methoden basieren häufig auf dem Prinzip des Immunoassays. Der Nachteil dieser bekannten Nachweisverfahren liegt darin, dass das Allergen, das für die Durchführung der Verfahren notwendig ist, modifiziert wird. Die Qualität handelsüblicher Allergenextrakte schwankt außerordentlich, so dass die Testergebnisse nicht immer zufrieden stellend sind.

Die US 2002/0012955 A1 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Degranulationsaktivität von basophilen Granulozyten in einer Vollblut-Probe sowie die Bereitstellung eines Reagenzienkits hierfür. Dabei wird die Probe zuerst mit einem Antigen gemischt, um die Degranulation auszulösen. Anschließend wird die Probe mit einem ersten bindenden Molekül und mit einem zweiten bindenden Molekül gemischt und inkubiert. Die ersten und zweiten bindenden Moleküle besitzen unterschiedliche Markergruppen, die gleichzeitig nachgewiesen und als Maß für die Degranulationsaktivität verwendet werden können.

Aus Millard, P. J. et al.,: ”Imaging asynchronous changes in intracellular Ca2+ in individual stimulated tumor mast cells”, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1988) 85(6) 1854–8, geht hervor, dass bei basophilen Leukämiezellen von Ratten (RBL), eine Mastzellenlinie, Änderungen des Gehalts von intrazellulär gelöstem Calcium mit der Sekretion von Mediatoren für unmittelbare Überempfindlichkeit verbunden sind. Dabei wurde zur Bestimmung von Calcium in einzelnen RBL-Zellen digitales Fluoreszenz-Ratio-Imaging von Fura-2 verwendet, wobei auch die auftretenden Änderungen von Calcium als Reaktion auf die Verbrückung von IgE-Rezeptoren auf der Zelloberfläche oder auf die Zugabe von dem Ca2+-Ionophor Ionomycin studiert wurde.

Almers, W. und Nehrer, E. ”The Ca signal from fura-2 loaded mast cells depends strongly on the method of dye-loading”, FEBS Lett. (1985) 192 (1) 13–8 betrifft die Messung der Calciumkonzentration in Zellen mit Hilfe des fluoreszierenden Calciumindikatorfarbstoffs Fura-2.

Allergiepotentiale von Produkten wie Lebensmittel, Kosmetika, Arzneimittel zu bestimmen, ist sehr aufwendig. Es werden Tierversuche durchgeführt oder menschliche Gewebe zur Überprüfung genommen. Diese aufwendigen Versuche, bedingt durch gesetzliche Auflagen bei Tierversuchen, kosten nicht nur Zeit und Geld, sondern führen häufig auch zu Konflikten mit Tierschützern.

Es ist daher wünschenswert, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem es möglich ist, einerseits Allergiepotentiale von einzelnen Stoffen und von beliebigen Produkten schnell, effizient und ohne Tierversuche zu bestimmen und andererseits allergieauslösende Allergene beim atopischen Personen ohne Hauttests, Provokationstests o. ä. zuverlässig zu ermitteln.

Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung, ausgehend von einem Verfahren der eingangs genannten Art vor, dass man Granulozyten aus Blut aufreinigt und anreichert oder aus Gewebe isoliert oder Mastzellen aus Gewebe isoliert, die Granulozyten oder Mastzellen mit einem fluoreszierenden Calciumindikatorfarbstoff belädt und die Granulozyten oder Mastzellen mit dem Produkt, dessen allergene Potenz bestimmt werden soll, in Kontakt bringt und die intrazelluläre Veränderung der Ca2+-Konzentration mittels der Fluoreszenz-Ratio-Imaging-Technik bestimmt.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Kenntnis der Ca2+-Konzentration-Erhöhung bei der Degranulation der Zelle. Aufgrund des erneuten Allergenkontakts heftet sich ein Allergen an zwei Antikörper. Durch diese Verbrückung werden Calciumkanäle in der Zellmembran geöffnet, so dass extrazelluläre Calcium-Ionen einströmen können. Dadurch ändert sich die Durchlässigkeit der Zellmembranen und es kommt zur Freisetzung von Mediatoren (Degranulation). Durch Erhöhung der Calcium-Ionen in der Zelle wird die Erregbarkeit der Zelle vermindert. Dieser physiologische Effekt ist bekannt.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Konzentration intrazellulärer Calcium-Ionen bestimmt, die indirekt die allergene Potenz bestimmter Produkte wiedergibt. Durch die Aufreinigung und Isolierung der Granulozyten aus Blut, insbesondere aus Blut von Patienten mit bekannter allergener Disposition, wird gewährleistet, dass nur diese mit Mediatoren enthaltenen Zellen gemessen werden. Störfaktoren können somit mehr oder weniger eliminiert werden. Mittels der Fluoreszenz-Ratio-Imaging-Technik kann die intrazelluläre Veränderung der Calcium-Ionen in zeitlicher und zweidimensionaler Auflösung dargestellt werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die allergene Potenz von neuen Produkten rasch und zuverlässig bestimmt werden. Produkte sind Kosmetika, Körperpflegemittel, Pharmazeutika, Chemische Stoffe, Lebensmittel u. a., die den Körper innerlich oder äußerlich berühren. Das Verfahren ist auch zur Diagnose von Allergien bei atopischen Personen geeignet.

Zweckmäßigerweise handelt es sich bei den Granulozyten um basophile Granulozyten, da diese sich im Blut befinden und sich für die Aufreinigung und Isolierung als besonders geeignet und effektiv erwiesen haben. Mastzellen können ebenfalls zur Anwendung kommen. Diese befinden sich zumeist in Geweben, so dass die Isolierung und Reinigung aufwendiger ist, ohne jedoch grundsätzliche Schwierigkeiten zu bereiten.

Es hat sich herausgestellt, dass mittels der Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation die Aufreinigung und Anreicherung der Granulozyten äußerst einfach und effizient möglich ist. Durch ihre spezifische Dichte sammeln sich die basophilen Granulozyten zwischen dem Serum- und dem Ficoll-Layer an, so dass diese Zell-Bande geerntet werden kann.

Die Granulozyten werden mittels der immunomagnetischen Trennung durch Markierung der Zellen mit Antikörpern und anschließender Säulenaufreinigung abgetrennt. Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, den ”Basophil Isolation Kit” von Miltenyi Biotech zu verwenden.

Es ist zweckmäßig, die gewonnene basophilen Granulozyten auf ihre Vitalität zu testen. Hierbei wird die Zellsuspension mit Trypan-Blau versetzt. Diese werden nur von toten Zellen aufgrund ihrer Membrandurchlässigkeit aufgenommen.

Bevorzugt wird als Calcium-Indikatorfarbstoff Fura-2 verwandt. Fura-2 ist ein sehr selektiver Indikator für Calcium-Ionen. Er permeiert in veresterter Form die Zellmembran, wobei in der Zelle die Estergruppe hydrolytisch abgespalten wird. Verbindet er sich mit Calcium-Ionen, beginnt er zu fluoreszieren. Die Fluoreszenz ändert sich sowohl mit der Wellenlänge des Anregungslichts als auch mit der Ca2+-Konzentration.

Die Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration mit Fura-2 ist in der Literatur ausführlich beschrieben, so dass hier nur eine grobe Darstellung der Messungen wiedergegeben wird. Durch alternierende Anregungen mit Licht einer Wellenlänge von 340 und 380 nm werden die Fluoreszenzintensitäten gemessen und daraus Fluoreszenzbilder digitalisiert. Pixel für Pixel wird das Verhältnis 340/380 nm errechnet und das Bild zusammengesetzt. Dieses Verhältnis ist ein Maß für die Calciumkonzentration und somit auch ein Maß für allergene Potenz.

Die Beladung der Granulozyten mit Fura-2 wird in einer Pufferlösung, vorzugsweise PBS, in Bovine Serumalbumin (BSA) und EDTA bei 37°C für mindestens 30 Minuten durchgeführt. Eine Nachinkubation nach einem Waschgang wird vorzugsweise vorgenommen.

Eine andersartige Aufreinigung, Anreicherung, Isolierung und/oder Beladung der Granulozyten mit fluoreszierendem Calciumindikatorfarbstoff sind ohne weiteres möglich.

Mit geeignetem Software-Programm kann die Bildverarbeitung durchgeführt werden.

Nachstehend wird beispielhaft die Aufreinigung, Anreicherung, Isolierung und Beladung der Granulozyten mit Fura-2 schematisch beschrieben.

Aufreinigung basophiler Granulozyten mittels Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation und anschliessender negativer Selektion

Die Abkürzungen „mM” und „μM” stehen im Folgenden für die Einheiten „mmol/l” bzw. „μmol/l”.

1. Schritt: PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cells)-Isolierung über Ficoll-Dichtezentrifugation

  • – 6,6 ml frisches Blut (höchstens 2 h nach Entnahme) 1:3 verdünnen mit 1*PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA
  • – jeweils 10 ml verdünntes Blut vorsichtig auf je 3 ml Ficoll schichten
  • – zentrifugieren bei 400*g, 30 min, 20°C mit herunterregulierter Beschleunigungs- und Bremsleistung → zwischen Ficoll- und Serum-Layer sollte eine scharfe Zell-Bande zu sehen sein
  • – Ernten der Zell-Bande (PBMC)
  • – 3* waschen mit je 13 ml 1*PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA (1* zentrifugieren bei 300*g, 10 min, 4°C; 2* zentrifugieren bei 200*g, 10 min, 4°C); Zellen resuspendieren in 500 μl 1*PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA
  • – Zellen auszählen: Gesamtzellzahl ~1,5*10<7> Zellen
  • – Basophilen-Anreicherung (ausgezählt mittels Alcian Blue): ~2–3% Basophile unter den Leukozyten

2. Schritt: Negative Selektion der basophilen Granulozyten mit Hilfe des ”Basophil Isolation Kit” von Miltenyi Biotech

  • – PBMC abzentrifugieren (500*g, 10 min, 4°C) und in entsprechendem Volumen 1*PBS ± 0,5% BSA ± 2 mM EDTA resuspendieren
  • – Inkubation mit Blocking Reagent und Hapten-Antibody-Cocktail gegen Kontaminanten für 10 min bei 6–8°C
  • – Bindung der MACS Anti-Hapten Micro Beads für 15 min bei 6–8°C
  • – Suspension auf vorpreparierte LS-Säule geben
  • – Durchlauf ernten → Basophile
  • – Säule 4* spülen mit je 3 ml 1*PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA und Durchlauf ernten → Basophile
  • – Aufgereingte Basophile abzuzentrifugieren und in 500 μl Puffer resuspendieren
  • – Alcian Blue-Färbung: → 70–80% Basophile unter den Leukozyten
  • – Vitalitätstest mittel Trypan Blue: > 95%

Beladung mit Fura 2AM

  • – Beladung der Basophilen mit 2 μM Fura 2AM für 30 min bei 37°C in 1*PBS + 0,5% BSA + 0,32 mM EDTA
  • – 3* waschen mit 1*PBS + 0,5% BSA (jeweils 10 min, 200*g, 4°C)
  • – eventuell 20 min nachinkubieren bei 37°C

Anschließend werden die mit Fura-2 beladenen Granulozyten mittels der Fluoreszenz-Ratio-Imaging-Technik gemessen. Dabei werden die Zellen in Millisekunde-Abständen mit Hilfe eines Mikromanipulators mit Stimulantien behandelt. Die Anregung des intrazellulären Fluoreszenzfarbstoffes erfolgt über einen Monochromator, der die Wellenlänge in Millisekunden verändern kann, so dass mehrere Ratiomessungen in sehr kurzer Zeitabfolge möglich sind.