Title:
Verfahren zur Bestimmung der Umwelttoxizität
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Toxizität einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellen einer Testpopulation umfassend eine Vielzahl von Testorganismen oder Testzellen, die zur Aufnahme magnetischer Partikel fähig sind; In Kontakt bringen der Testpopulation mit einer Probe, deren Toxizität bestimmt werden soll; In Kontakt bringen der Testpopulation mit einer Vielzahl von Magnetpartikeln während oder nach dem in Kontakt bringen der Testpopulation mit der Probe und magnetische Isolierung der Testorganismen oder der Testzellen der Testpopulation, welche Magnetpartikel aufgenommen haben. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.




Inventors:
gleich Anmelder
Application Number:
DE102017114331
Publication Date:
12/28/2017
Filing Date:
06/28/2017
Assignee:
Pauli, Viktoria, Dr., 14513 (DE)
International Classes:



Other References:
http://www.vp-scientific.com/Magnetic_Bead_Separation_Extractor.php
http://ibidi.com/xtproducts/en/ibidi-Labware/Channel-Slides/m-Slide-VI-0.4)
Attorney, Agent or Firm:
Schulz Junghans Patentanwälte PartGmbB, 10963, Berlin, DE
Claims:
1. Verfahren zur Bestimmung der Toxizität einer Probe, umfassend die Schritte:
– Bereitstellen einer Testpopulation umfassend eine Vielzahl von Testorganismen oder Testzellen, die zur Aufnahme von Magnetpartikeln fähig sind,
– In Kontakt bringen der Testpopulation mit einer Probe, deren Toxizität bestimmt werden soll,
– In Kontakt bringen der Testpopulation mit einer Vielzahl von Magnetpartikeln während oder nach dem in Kontakt bringen der Testpopulation mit der Probe, und
– Magnetische Isolierung der Testorganismen oder der Testzellen der Testpopulation, welche Magnetpartikel aufgenommen haben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge der magnetisch isolierten Testorganismen oder Testzellen indirekt proportional zur Toxizität der Probe ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine chemische Verbindung oder eine Umweltprobe ist oder eine chemische Verbindung oder eine Umweltprobe umfasst.

4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, zusätzlich umfassend die Schritte:
– In Kontakt bringen der Testpopulation mit einer Referenzprobe, wobei die Toxizität der Referenzprobe bekannt ist,
– In Kontakt bringen der Testpopulation mit einer Vielzahl von Magnetpartikeln während oder nach dem in Kontakt bringen der Testpopulation mit der Referenzprobe,
– Magnetische Isolierung der Testorganismen oder der Testzellen der Testpopulation, welche Magnetpartikel aufgenommen haben, und
– Vergleich der Menge der magnetisch isolierten Testorganismen oder Testzellen der Testpopulation, die mit der Probe in Kontakt gebracht wurde, mit der Menge der magnetisch isolierten Testorganismen oder Testzellen der Testpopulation, die in Kontakt mit der Referenzprobe gebracht wurde.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vielzahl von Magnetpartikeln durch eine durchschnittliche Partikelgröße im Bereich von 100 nm bis 100 µm charakterisiert ist.

6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnetpartikel ein paramagnetisches Material, insbesondere α-Fe2O3, ein ferromagnetisches Material, insbesondere Eisen, Nickel, Cobalt, AlNiCo oder γ-Fe2O3, oder ein ferrimagnetisches Material umfassen oder daraus bestehen, insbesondere ein ferrimagnetisches Eisenoxid wie Magnetit oder Maghemit, oder ein Ferrit wie Mangan-Zink-Ferrit, Nickel-Zink-Ferrit oder Kobaltferrit.

7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnetpartikel eine Beschichtung aufweisen, wobei die Beschichtung vorzugsweise eine hydrophile Verbindung umfasst oder daraus besteht, insbesondere ein Polysaccharid, ein hydrophiler Polyester wie etwa Polymilchsäure, oder ein Silikat.

8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Testzellen Hämozyten sind, insbesondere Hämozyten aus einem Lebewesen der Gruppe der Tunicata, der Mollusca oder der Chordate, insbesondere der Gruppe der Vertebraten, vorzugsweise der Gruppe der Fische oder der Säugetiere.

9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Testorganismus ein einzelliger Organismus ist, insbesondere ein einzelliger Organismus ausgewählt aus der Gruppe umfassend Flagellaten, Amöben und Ciliaten, oder ein mehrzelliger Organismus, insbesondere ein mehrzelliger Organismus ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nematoda, Rotifera und Crustacea, vorzugsweise aus der Gruppe der Daphnia.

10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Testorganismus aus der Gruppe ausgewählt ist, die Tetrahymena spec., Paramedium spec, Euplotes spec., Colpoda spec., Blepharisma spec., Dictyostelium spec., Amoeba spec., Hartmanella spec. Acanthamoeba spec., Euglena spec., Ochromonas spec., Oikomonas spec., Bodo spec, Mytilus spec., Crassostrea spec., Ciona spec., Brachydanio rerio, Pimephales promelas, Cyprinus carpio, Oryzias latipes, Poecilia reticulate, Lepomis macrochirus, Oncorhynchus mykiss, Brachionus spec., Caenorhabditis elegans, Daphnia spp., Ceriodaphnia spec., Thamnocephalus spp., Bosmina spec., Notodromas spec., Artemia spec., Moina spec., Gammarus spec. und Hyallela spec. umfasst.

11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umweltprobe einem Wasserspeicher, einem Oberflächengewässer, einem Abwasser, einem Belebtschlamm, einem Sickerwasser, einem Boden- oder Sedimenteluat, oder einer wässrigen Phase einer Emulsion entnommen wurde.

12. Testkit zur Bestimmung der Toxizität einer Probe, umfassend
– eine Vielzahl von Magnetpartikeln, insbesondere eine Vielzahl von Magnetpartikeln mit den Merkmalen gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, und
– eine Testpopulation umfassend eine Vielzahl von Testorganismen oder Testzellen, die zur Aufnahme der magnetischen Partikel befähigt sind, insbesondere eine Testpopulation mit den Merkmalen gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10.

13. Testkit nach Anspruch 12, zusätzlich aufweisend eine erste Referenzprobe, wobei die erste Referenzprobe keine toxische Verbindung aufweist.

14. Testkit nach Anspruch 12 oder 13, zusätzlich aufweisend eine zweite Referenzlösung, wobei die zweite Referenzlösung eine bekannte toxische Verbindung in einer definierten Konzentration umfasst.

15. Testkit nach einem der Ansprüche 12 bis 14, zusätzlich aufweisend einen Magnetseparator.

16. Testkit nach einem der Ansprüche 12 bis 15, zusätzlich aufweisen ein Probengefäß, das zur Aufnahme der Testpopulation ausgebildet ist, wobei insbesondere das Probengefäß als ein Teströhrchen, ein PCR-Gefäß, eine Streifenplatte, eine Mikrotiterplatte, eine Zählkammer oder eine Multiwellplatte ausgebildet ist.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Testkit zur Bestimmung der Toxizität einer Probe.

Hintergrund

Zur Festlegung von Qualitätsanforderungen für schadstoffbelastete Gewässer und Böden sowie zur Risikoanalyse von Umweltchemikalien werden in der Regel sogenannte „ökotoxikologische Standardtests“ herangezogen. Die zunehmende Anzahl von Chemikalien, die weltweit produziert werden und in die Umwelt gelangen, erfordert allerdings zunehmend einfachere und besonders schnelle Biotests für Screening-Zwecke, mit denen erste Aussagen zu Umweltbelastungen getroffen werden können. Die überwiegende Zahl solcher Schnelltests nutzt Bakterien als Testorganismen und basiert auf metabolischen Parametern wie der Respiration und dem ATP-Gehalt oder zieht enzymatische Hemmungen zur Messung schädlicher Wirkungen heran.

Für eukaryotische und besonders mehrzellige tierische Organismen existieren dagegen nur wenige Schnelltests. Um auch hier schnelle Messungen vornehmen zu können, wurden physiologische oder Verhaltensänderungen als schnelle Indikatoren von toxischem Stress vorgeschlagen. Solche Änderungen auf suborganismischer Ebene würden als erster Angriffspunkt toxische Wechselwirkungen widerspiegeln, in deren Folge dann für den Gesamtorganismus Schädigungen sichtbar werden, die sich in einer Abnahme der Wachstums- und Vermehrungsfähigkeit oder der Vitalität ausdrücken. So konnte in einigen Arbeiten gezeigt werden, dass die Fähigkeit zur Aufnahme von Nahrungs- oder nahrungsähnlichen Partikeln ein derartiger toxikologischer Schnellindikator ist, der bereits frühzeitig längerfristige Schädigungen des Wachstums und der Vermehrungs- und Lebensfähigkeit von Organismen anzeigen kann. Solche Tests sind in der Literatur zum Beispiel für mehrzellige Organismen wie Flohkrebse (Cerodaphnia), Feenkrebse (Thamonocepahlus platyurus), Rotifera (Brachionus caciflorus und B. plicatilis) sowie einzellige Wimpertierchen wie z.B. Paramecium, Euplotes und Tetrahymena beschrieben.

Häufig werden bei Biotests, die auf einer Inhibition der Partikelaufnahme basieren, statt vollständiger Organismen auch Zellen eingesetzt, die aus Organismen isoliert wurden und die neben dem allgemeinen Toxizitätsnachweis besonders zur Untersuchung immunmodulierender Wirkungen von Schadstoffen herangezogen werden. Hierbei handelt es sich in erster Linie um Zellen des Blutes bzw. der Hämolymphe. In der Literatur finden sich entsprechende Tests beispielweise mit Hämozyten von Manteltieren (z.B. Seescheiden), von Weichtieren (Miesmuscheln, Austern) sowie von Fischen.

Neben Einzelspezies werden auch Mischpopulationen zur Erfassung der Partikelaufnahmefähigkeit in Tests eingesetzt. So sieht beispielsweise ein aktueller OECD-Testrichtlinienentwurf zur Erfassung des Gefährdungspotentials von toxischen Abwässern vor, die in Belebtschlamm vorkommenden, Partikel aufnehmenden Organismen in ihrer Gesamtheit toxikologisch zu erfassen. Ziel ist der Schutz der Reinigungsleistung von Kläranlagen und hier speziell der Fähigkeit eines Teils der Belebtschlammfauna, bakterielle Partikel aus dem Abwasser durch aktive Aufnahme zu entfernen.

Die Partikel, die für Aufnahmemessungen eingesetzt werden, bewegen sich im Mikrometerbereich und reichen von kleinen Farbstoffteilchen bis hin zu speziell hergestellten und eingefärbten bzw. mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten sog. „Microbeads“. In einigen Fällen werden auch ganze Zellen oder auch nur Bestandteile von Zellen verwendet, die teilweise vorher eingefärbt wurden.

Um eine Schädigung zu erfassen, werden im Allgemeinen die zur Partikelaufnahme fähigen Testorganismen der potentiell toxischen Probelösung ausgesetzt; bereits während oder nach einem bestimmten Zeitraum der Exposition mit der Probelösung werden den Organismen Partikel zur Aufnahme über meist mehrere Minuten angeboten. Anschließend wird häufig die Aufnahme gestoppt, indem die Testorganismen betäubt oder abgetötet werden. Für eine statistisch repräsentative Anzahl von Testorganismen wird dann im Mikroskop überprüft, ob eine Partikelaufnahme stattgefunden hat. Dies geschieht in einigen Fällen nur qualitativ nach dem Alles-oder-Nichts-Prinzip, d.h. es wird nur mit bzw. ohne Partikel unterschieden. In vielen Fällen erfolgt jedoch eine genauere Quantifizierung aufgenommener Partikel, etwa indem partikelhaltige Vakuolen direkt unter dem Mikroskop ausgezählt werden oder der Partikelgehalt mit Hilfe digitaler Bildanalysesysteme bestimmt wird. In wieder anderen Fällen werden indirekte Methoden wie die Spektrometrie, die Luminometrie oder die Durchflusszytometrie eingesetzt, um auf die Anzahl aufgenommener Partikel rückschließen zu können. Liegt ein gestörtes Aufnahmeverhalten vor, lässt dies auf das Vorliegen einer toxischen Substanz schließen. Die Stärke der Toxizität bzw. des Schädigungspotentials der Probelösung wird dann aus der Anzahl partikelhaltiger Organismen bzw. aufgenommener Partikel im Vergleich zu einer Kontrolle bestimmt.

Die vorgenannten Tests sind, soweit ausschließlich partikelhaltige von nichtpartikelhaltigen Organismen unterschieden werden, nur qualitativ; eine Abstufung im Hinblick auf die Intensität der Schädigung des einzelnen Organismus ist nicht erfassbar. Dem Experimentator bleibt somit subjektiv überlassen, welche Organismen genug Partikel aufgenommen haben, um gegenüber einer Kontrollprobe als ungeschädigt angesehen zu werden, und welche Organismen nur so wenige Partikel aufgenommen haben, dass sie als geschädigt eingestuft werden. Um diese Ungenauigkeit zu umgehen, wird in einigen Arbeiten besonders für einzellige Testorganismen vorgeschlagen, die aufgenommenen Partikel unter dem Mikroskop direkt auszuzählen oder zumindest die mit Partikeln gefüllten Vakuolen im Zellinneren zahlenmäßig zu erfassen. Obwohl sich hierdurch ein präziseres Bild der Intensität der Schädigung auf Einzelorganismus-Ebene gewinnen lässt, steigt mit dieser Technik die zur Auswertung erforderliche Arbeits- und Zeitintensität erheblich. Um wiederum dieser aufwändigen Auswertung durch Zählen von Partikeln oder suborganismischen Strukturen unter dem Mikroskop zu entgehen, wurden digitale Bildanalysesysteme eingesetzt. Diese lassen nicht nur eine Quantifizierung der Partikelgehalte in jedem Testorganismus zu, sondern erlauben zugleich auch eine schnelle Auswertung. Nachteilig bei diesen digitalen Bildanalysesystemen sind allerdings die mit dieser Technik verbundenen hohen Kosten, was einer verbreiteten Anwendung entgegensteht.

Ohne aufwändige mikroskopische Zählung kommen auch Techniken aus, die eine indirekte Bestimmung der aufgenommenen Partikelzahl vorsehen. So werden etwa spektroskopische Verfahren angewandt, um anhand des Farbstoffgehalts der aufgenommenen Partikel Rückschlüsse auf die Partikelzahl zu schließen, was aber mit weiteren Arbeitsschritten zur Extraktion der Farbstoffe verbunden ist und meist kostspielige technische Ausstattung voraussetzt. In einem anderen spektroskopischen Verfahren wird die Partikelaufnahme bestimmt, indem die nicht von den Testorganismen aufgenommenen bakteriellen Partikel anhand der optischen Dichte des Kulturmediums/der Testlösung/Umgebungslösung erfasst werden. Allerdings ist die Partikelabnahme in der Umgebungslösung im Vergleich zur Aufkonzentrierung in den Testorganismen vergleichsweise gering, weshalb dieser methodische Ansatz lange Testzeiträume erfordert. In weiteren Verfahren wird die Fluoreszenz fluoreszenzmarkierter Partikel durchflusszytometrisch bestimmt. Andere Verfahren messen über die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, die im Zusammenhang mit der Partikelaufnahme im Zellinneren gebildet werden, die Intensität der Partikelaufnahme (z.B. anhand der Luminol-Chemolumineszenz. Neben dem generellen Nachteil, dass indirekte Nachweisverfahren besonders durch Artefakte beeinträchtigt werden können, sind ähnlich den direkten Methoden auch mit den meisten indirekten Verfahren aufgrund des technischen Aufwandes meist hohe Kosten verbunden.

Als ein weiterer Nachteil der bekannten Methoden ist anzusehen, dass in der überwiegenden Zahl der Fälle die Bestimmung der Partikelaufnahme mit dem ethisch bedenklichen Abtöten der Testorganismen verbunden ist.

Hiervon ausgehend liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, zuverlässiges und kostengünstiges Verfahren zur Bestimmung, insbesondere zur Quantifizierung, der Toxizität von chemischen Verbindungen oder Umweltproben zur Verfügung zu stellen.

Beschreibung der Erfindung

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und ein Testkit mit den Merkmalen des Anspruchs 12 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den zugehörigen Unteransprüchen angegeben und werden nachfolgend beschrieben.

Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Toxizität einer Probe zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte:

  • – Bereitstellen einer Testpopulation umfassend eine Vielzahl von Testorganismen oder Testzellen, die zur Aufnahme von Magnetpartikeln fähig sind,
  • – In Kontakt bringen der Testpopulation mit einer Probe, deren Toxizität bestimmt werden soll,
  • – In Kontakt bringen der Testpopulation mit einer Vielzahl von Magnetpartikeln während oder nach dem in Kontakt bringen der Testpopulation mit der Probe, und
  • – Magnetische Isolierung der Testorganismen oder Testzellen der Testpopulation, welche Magnetpartikel aufgenommen haben.

Der Biotoxizitätstest der vorliegenden Erfindung beruht insbesondere auf der Aufnahme von Magnetpartikeln durch lebende Organismen oder Zellen. Die Anzahl der pro Versuchsansatz eingesetzten Organismen kann stark variieren und hängt vom jeweiligen Testorganismus ab. Bei einzelligen Organismen oder isolierten Zellen können dies mehrere Tausend sein, während im Falle von Vielzellern wie beispielweise Daphnien in der Regel nur einige wenige Organismen pro Versuchsansatz eingesetzt werden.

Hierbei ist insbesondere die Menge der isolierten Testorganismen oder Testzellen indirekt bzw. umgekehrt proportional zur Toxizität der Probe.

Insbesondere werden solche Testorganismen oder Testzellen der Testpopulation magnetisch isoliert, beispielsweise unter Verwendung eines Permanentmagneten, die Magnetpartikel in einer hinreichenden Menge aufgenommen haben. Die hinreichende Menge ist dabei abhängig vom Material und der Größe der Magnetpartikel, der Stärke des Permanentmagneten oder der Größe der Testorganismen oder Testzellen. Hierbei versteht der Fachmann, dass beispielsweise größere Testorganismen (d.h. gekennzeichnet durch ein größeres Volumen und Gewicht) entsprechend größere und/oder mehr Magnetpartikel aufnehmen müssen, um aus der Testpopulation magnetisch isoliert werden zu können. Mit anderen Worten ist die hinreichende Menge an aufgenommen Magnetpartikeln zur magnetischen Isolierung insbesondere abhängig von der gewählten Testpopulation, vor allem in Hinblick auf Größe, Gewicht und Bewegungsfähigkeit der Testorganismen oder Testzellen, von den verwendeten Magnetpartikeln bzw. ihrer Magnetisierbarkeit und von der Stärke eines äußeren magnetischen Feldes (welches beispielsweise durch einen Pemanentmagnet gebildet werden kann, welches zur oben genannten magnetischen Isolierung verwendet werden kann.

Unter dem Begriff "magnetische Isolierung" ist im Sinne der Erfindung jeder Trennschritt gemeint, in welchem Testorganismen oder Testzellen, die Magnetpartikel aufgenommen haben, so räumlich von Testorganismen oder Testzellen, die keine Magnetpartikel aufgenommen haben, zu trennen, dass Erstgenannte separat von den Zweitgenannte ausgezählt werden können. Dies kann beispielsweise durch Entnahme der Testorganismen aus einem Probengefäße, aber auch durch lokale Fixierung der Testorganismen in einem Probengefäß wie etwa einer mikroskopierbaren Zählkammer realisiert werden.

Vorteilhafterweise wird für die jeweilige Testpopulation die Dauer des In Kontakt bringen bzw. die Inkubationszeit der Testpopulation mit der Vielzahl von Magnetpartikel in Abhängigkeit zur Konzentration und/oder Größe der Magnetpartikel so gewählt, dass die Testorganismen oder Testzellen der Testpopulation eine möglichst große Anzahl an Magnetpartikeln aufnehmen können, ohne dass es zu einer Gleichgewichtseinstellung zwischen Partikelaufnahme und Partikelausscheidung kommt. Insbesondere unter der Annahme, dass die Partikel in den jeweiligen Testorganismen oder Testzellen nach einer nicht-linearen Anlaufphase konstant mit der Zeit akkumulieren (also eine Kurve der Partikelakkumulation über die Zeit mit konstantem Anstieg), bevor die Partikelakkumulation ein Plateau erreicht (also keine weitere Partikelakkumulation über die Zeit) bzw. ggf sogar abfällt (im Falle, dass die Ausscheidung der aufgenommen Partikel größer als die Aufnahme ist), wäre eine optimale Inkubationszeit am Ende des ansteigenden Teils der Akkumulationskurve zu finden, vorteilhafterweise am Übergang vom ansteigenden zum konstanten Teil der Akkumulationskurve.

Entsprechende Daten zur optimalen Inkubationszeit können für viele für das erfindungsgemäße Verfahren in Frage kommenden Testorganismen oder Testzellen dem Stand der Technik entnommen werden. Für den Fall, dass keine Daten für die gewählte Testpopulation verfügbar sind, können solche Daten einfach aus Experimenten gewonnen werden, wobei für die gewählte Testpopulation die Partikelakkumulation für verschiedene Konzentrationen der Magnetpartikeln über die Zeit bestimmt wird, vorteilhafterweise unter den Bedingungen unter denen die Toxizität der oben genannte Probe bestimmt werden soll, wobei die Probe nicht anwesend ist. Die Partikelakkumulation kann hierbei insbesondere anhand der Anzahl der magnetisch isolierbaren Testorganismen bzw. Testzellen bestimmt werden.

Unter dem Begriff “Partikelaufnahme” ist im Sinne der vorliegenden Erfindung insbesondere jeder Prozess zu verstehen, bei dem Partikel oder Teilchen von einem lebenden Organismus oder Zelle aktiv aufgenommen werden. Dieser Prozess der Partikelaufnahme wird häufig mit verschiedenen Begriffen wie Phagozytose, Endozytose, Invagination und Ingestion bezeichnet und ist sowohl bei Einzellern als auch Vielzellern anzutreffen.

Der Begriff „zur Partikelaufnahme befähigter Testorganismus“ umfasst alle lebenden Organismen oder auch Populationen von lebenden Organismen, die zur „Partikelaufnahme“ fähig sind. Lebende Organismen können hierbei sowohl aktive Formen als auch Ruheformen, kryptobiotische oder Dauerstadien von Organismen sein.

Der Begriff „zur Partikelaufnahme befähigte Testzelle“ oder umfasst alle lebenden Testzellen oder auch Populationen von lebenden Testzellen, die zur „Partikelaufnahme“ fähig sind. Lebende Zellen können hierbei sowohl aktive Formen als auch Ruheformen, kryptobiotische oder Dauerstadien von Zellen sein.

Prinzipiell kann jeder Organismus oder jede Zelle, der zur Aufnahme partikulärer Teilchen bzw. zur Partikelaufnahme fähig ist, in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Geeignete lebende Organismen umfassen beispielsweise Einzeller wie Flagellaten, Amöben und Ciliaten, isolierte Blut- bzw. Hämolymphzellen verschiedenster Tiere (wie zum Beispiel von Muscheln, Seescheiden, Fischen oder Säugern) sowie vielzellige Organismen aus sehr unterschiedlichen taxonomischen Gruppen wie beispielsweise Nematoden (Fadenwürmer), Rotatorien (Rädertiere) und Crustaceen (Kleinkrebse). Aufgrund ihrer in der Wissenschaft weiten Verbreitung im Hinblick auf umwelttoxikologische Untersuchungen zur Partikelaufnahme sind hier für die einzelligen Organismen besonders zu nennen: Tetrahymena spec., Paramedium spec, Euplotes spec., Colpoda spec., Blepharisma spec., Dictyostelium spec., Amoeba spec., Hartmanella spec. Acanthamoeba spec., Euglena spec., Ochromonas spec., Oikomonas spec., und Bodo spec. Für Blut- oder Hämolyphzellen geeignete typische Labororganismen sind beispielweise Mytilus spec., Crassostrea spec., Ciona spec., Brachydanio rerio, Pimephales promelas, Cyprinus carpio, Oryzias latipes, Poecilia reticulate, Lepomis macrochirus und Oncorhynchus mykiss. Unter den Vielzellern sind typische Organismen, die im Labor verbreitet und zur Aufnahme partikulärer Teilchen fähig sind, z.B. Brachionus spec., Caenorhabditis elegans, Daphnia spp., Ceriodaphnia spec., Thamnocephalus spp., Bosmina spec., Notodromas spec., Artemia spec., Moina spec., Gammarus spec. und Hyallela spec.

Die Expositionsdauer bzw. die Dauer des In Kontakt bringen der Testpopulation mit der Probe und/oder die Inkubationsdauer bzw. die Dauer des in Kontaktbringen der Testpopulation mit der Vielzahl von Magnetpartikeln kann von wenigen Minuten bis zu wenigen Stunden reichen und hängt neben dem Testorganismus und den jeweiligen Versuchsbedingungen, wie etwa der Konzentration an Magnetpartikeln, der Versuchstemperatur und dem Testmedium, auch von der toxikologischen Fragestellung ab – ob etwa eine längere Einwirkzeit gewünscht ist oder die toxische Sofortreaktion erfasst werden soll.

Insbesondere kann es notwendig sein, die Probe vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu verdünnen, insbesondere in einem nicht toxischen wässrigen Medium. Dies kann insbesondere dann erforderlich sein, wenn die zu bestimmende Probe von einer solchen Toxizität gekennzeichnet ist, dass keine Testorganismen oder Testzellen magnetisch isolierbar sind, d. h. dass die Partikelaufnahme hinreichend stark bzw. vollständig durch die Probe verhindert wird. In diesem Fall wäre es vorteilhaft, die Probe so weit zu verdünnen, bis zumindest ein geringer Teil der Testpopulation die magnetischen Partikel aufnehmen und entsprechend isoliert und ausgezählt werden kann.

Die Konzentration sowie die Größe der Magnetpartikel sind entsprechend der vorliegenden Erfindung so gewählt, dass die Testorganismen oder Testzellen in einer Referenzprobe bzw. Referenzlösung während der Inkubationszeit genügend Magnetpartikel aufnehmen können, um mit einem Magneten, beispielsweise einem Permanentmagneten, separiert werden zu können. Geeignete Partikeldichten hängen hier stark von den jeweils eingesetzten Magnetpartikeln sowie den jeweiligen Testorganismen oder Testzellen ab und bewegen sich im Bereich von etwa 103 bis 108 pro mL, wobei insbesondere die Partikelgrößen im Bereich von etwa 100 nm bis 20 µm liegen.

Als „Magnetpartikel“ werden im Sinne der Erfindung insbesondere magnetisierbare oder magnetisierte Teilchen unterschiedlichster chemischer Zusammensetzung in Größenbereichen von mehreren Nanometern bis mehreren Mikrometern bezeichnet (üblicherweise mit Größen zwischen 100 nm und 100 µm), die von Einzelzellen, einzelnen Zellen oder mehrzelligen lebenden Organismen aufgenommen werden können und für die Separation an einem Magnet, insbesondere einen Permanentmagneten, geeignet sind. Sie sind unter anderem mit folgenden Matrixmaterialien erhältlich: Dextran, Vernetztes Dextran, Silikat-verstärktes Dextran, Bionisiertes NanoFerrit, Polystyrol / Polymethacrylat, Polymilchsäure, Silikat, Chitosan, Polyethylenimin, Eisenoxid-Partikel. Hinzuzuzählen sind auch magnetische Bakterien wie z.B. Magnetospirillum magnetotacticum und Magnetobacterium bavaricum, die submikroskopisch kleine Kristalle aus Magnetit (Fe3O4), sog. Magnetosomen, enthalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine Reihe von Vorteilen auf:

  • a) Durch die Aufnahme von Magnetpartikeln werden die Organismen selbst magnetisch und können leicht mit einem Magneten von denjenigen Organismen getrennt werden, die weniger oder keine Magnetpartikel aufgenommen haben. Eine aufwändige Quantifizierung der Anzahl aufgenommener Partikel ist überflüssig. Die Intensität der Schädigung lässt sich leicht anhand der – im Vergleich zu den Partikeln sehr viel größeren – Organismen ermitteln.
  • b) Der Partikel-Aufnahmevorgang durch die Organismen lässt sich stoppen, indem magnetisierbare von nicht-magnetisierbaren Organismen magnetisch getrennt werden, wodurch ein Betäuben oder Abtöten der Testorganismen hierfür nicht notwendig ist.
  • c) Durch die Verwendung von Magnetpartikeln treten keine die Auswertung störenden Wechselwirkungen mit farbigen oder trüben Probelösungen auf.
  • d) Durch die Einwirkung eines äußeren Magnetfeldes lassen sich die magnetisierbaren Organismen leicht aufkonzentrieren. Aufwändige Zentrifugationstechniken sind überflüssig. Dies hat besonders bei Testorganismen, die als Zellsuspension vorliegen, den Vorteil, dass die Proben und deren toxischer Gehalt durch die Zugabe der Zellsuspension nur geringfügig verdünnt werden.
  • e) Eine aufwändige Technik zum Nachweis der Partikelaufnahme entfällt. Nach der magnetischen Trennung der Organismen ist lediglich die Bestimmung der Anzahl abgetrennter Organismen erforderlich, die um ein Vielfaches größer als die Partikel sind und deren Anzahl sich daher auch wesentlich leichter bestimmen lässt.
  • f) Die Methode der Magnetseparation ist in der Labor-Analytik fest etabliert, so dass für praktisch jedes übliche Testgefäß auf ein kommerziell erhältliches System zurückgegriffen werden kann. Ebenso stehen Magnetpartikel für ein breites Feld an Anwendungen und in verschiedensten Größenbereichen zur Verfügung.
  • g) Durch Verwendung kommerziell erhältlicher Magnetseparatoren kann die magnetische Trennung zeitgleich und parallel für mehrere Versuchsansätze erfolgen, so dass ein hoher Probendurchsatz erreicht werden kann. Selbst für den Bereich des „High-Throughput-Screenings“ stehen Systeme in Form automatischer Separatoren zur Verfügung.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den Testorganismen um eukaryotische Organismen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den Testzellen um Zellen eines eukaryotischen Organismus.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Probe eine (chemische) Verbindung bzw. Substanz, deren Toxizität bestimmt werden soll, oder eine Umweltprobe. Vorzugweise wird die (chemische) Verbindung, deren Toxizität bestimmt werden soll, in einer definierten Konzentration im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.

Der Begriff “Umweltprobe” bezeichnet das Material einer Probe, die den Umweltkompartimenten Wasser, Boden und Luft entnommen wurde. Der Begriff ist grundsätzlich auch nicht auf eine anfänglich flüssige Form des auf Toxizität zu untersuchenden Materials beschränkt, vielmehr reicht es aus, dass die zu untersuchende Probe in flüssige Form überführt werden kann.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Probe, deren Toxizität bestimmt werden soll, um eine wässrige Probe.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Testpopulation in einem wässrigen Medium kultivierbar bzw. lebensfähig.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das erfindungsmäße Verfahren zusätzlich folgende Schritte umfasst:

  • – In Kontakt bringen der Testpopulation mit einer Referenzprobe, deren Toxizität bekannt ist,
  • – In Kontakt bringen der Testpopulation mit einer Vielzahl von Magnetpartikeln während oder nach dem in Kontakt bringen der Testpopulation mit der Referenzprobe,
  • – Magnetische Isolierung der Testorganismen oder der Testzellen der Population, welche Magnetpartikel aufgenommen haben, und
  • – Vergleich der Menge der magnetisch isolierten Testorganismen oder Testzellen der Testpopulation, die mit der Probe in Kontakt gebracht wurde, mit der Menge der magnetisch isolierten Testorganismen oder Testzellen der Testpopulation, die in Kontakt mit der Referenzprobe gebracht wurde.

Insbesondere kann es sich bei der Referenzprobe um eine Positivkontrolle oder Negativkontrolle handelt. Beispielsweise kann die Referenzprobe durch keine Toxizität gekennzeichnet sein bzw. enthält keine toxischen Verbindungen, insbesondere in Bezug auf die verwendete Testpopulation. Die Referenzprobe kann aber auch durch eine derartige Toxizität gekennzeichnet sein, dass kein Mitglied der Testpopulation ein oder mehrere Magnetpartikel aufnehmen kann, so dass bei dieser Referenzprobe keine Mitglieder der Testpopulation magnetisch isoliert werden können.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Testpopulation mit der Vielzahl von Magnetpartikeln über einen Zeitraum von 1 min bis 10 h in Kontakt gebracht bzw. inkubiert wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Testpopulation in Gegenwart der Vielzahl von Magnetpartikeln mit der Probe in über einen Zeitraum von 1 min bis 18 h in Kontakt gebracht bzw. inkubiert wird. Eine Inkubationszeit von bis zu 18 h kann insbesondere dann erforderlich sein, wenn das erfindungsgemäßen Verfahren bei niedrigen Temperaturen, das heißt unter 20°C, insbesondere unter 10°C, durchgeführt wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Testpopulation mit der Vielzahl von Magnetpartikeln über einen Zeitraum von 5 min bis 1,5 h in Kontakt gebracht bzw. inkubiert wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Testpopulation in Gegenwart der Vielzahl von Magnetpartikeln mit der Probe in über einen Zeitraum von 1 min bis 10 h in Kontakt gebracht bzw. inkubiert wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Testpopulation in Gegenwart der Vielzahl von Magnetpartikeln mit der Probe über einen Zeitraum von 10 min bis 3 h in Kontakt gebracht bzw. inkubiert wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Testpopulation mit der Probe über einen Zeitraum von 10 min bis 3 h in Kontakt gebracht wird, und anschließend die Testpopulation mit der Vielzahl von Magnetpartikeln über einen Zeitraum von 5 min bis 1,5 h.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Testpopulation mit der Probe und/oder mit der Vielzahl von Magnetpartikeln bei einer Temperatur in Kontakt gebracht bzw. inkubiert wird, bei welcher die Mitglieder der Testpopulation bestehen bzw. wachsen können.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Vielzahl von Magnetpartikeln durch eine durchschnittliche Partikelgröße im Bereich von 100 nm bis 100 µm charakterisiert ist.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Vielzahl von Magnetpartikeln durch eine durchschnittliche Größe im Bereich von 100 nm bis 20 µm charakterisiert ist.

Der Begriff „durchschnittliche Größe“ im Sinne der Erfindung bezeichnet insbesondere das arithmetische Mittel oder den Median einer Größenverteilung der Magnetpartikel der Vielzahl. Eine solche Durchschnittsgröße kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden. In nicht beschränkender Weise seien hier Verfahren wie statische oder dynamische Lichtstreuung oder Größenausschlusschromatographie genannt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Magnetpartikel ein paramagnetisches Material, wie etwa α-Fe2O3, ein ferromagnetisches Material, insbesondere Eisen, Nickel, Cobalt, AlNiCo oder γ-Fe2O3, oder ein ferrimagnetisches Material, insbesondere ferrimagnetisches Eisenoxid wie Magnetit oder Maghemit, oder ein Ferrit wie Mangan-Zink-Ferrit, Nickel-Zink-Ferrit oder Kobaltferrit aufweisen oder daraus bestehen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Magnetpartikel eine Beschichtung aufweisen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Beschichtung eine hydrophile Verbindung aufweist oder daraus besteht. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die hydrophile Verbindung ein Polysaccharid, wie etwa Dextran, quervernetztes Dextran, Silikat-verstärktes Dextran oder Chitosan, ein hydrophiler Polyester wie etwa Polymilchsäure, oder ein Silikat ist.

Als hydrophile Verbindung wird im Sinne der Erfindung insbesondere eine Verbindung bezeichnet, die durch eine Löslichkeit in Wasser oder einer wässrigen Lösung von mindestens 10 g/l gekennzeichnet ist, insbesondere durch eine Löslichkeit von mindestens 30 g/L, vorzugsweise durch eine Löslichkeit von mindestens 100 g/L.

Solcherart mit einer hydrophilen Verbindung beschichtete Magnetpartikel eignen sich insbesondere zur Bestimmung der Toxizität von Proben, die hydrophobe oder schlecht wasserlösliche Komponenten aufweisen, wie beispielsweise ein Belebtschlamm, wobei durch die Beschichtung insbesondere ein Verklumpen der Magnetpartikel mit den Bestandteilen der Probe verhindert werden kann.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Beschichtung ein Polymer wie etwa Polystyrol, Polymethacrylat, oder Polyethylenimin aufweist oder daraus besteht.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Testorganismus ein einzelligen Organismus ist, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Flagellaten, Amöben und Ciliaten, oder ein vielzelliger Organismus, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nematoda, Rotatoria und Crustacea, vorzugsweise Daphnia.

Gemäße einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Testorganismus aus der Gruppe ausgewählt ist, die Tetrahymena spec., Paramedium spec, Euplotes spec., Colpoda spec., Blepharisma spec., Dictyostelium spec., Amoeba spec., Hartmanella spec. Acanthamoeba spec., Euglena spec., Ochromonas spec., Oikomonas spec., Bodo spec, Mytilus spec., Crassostrea spec., Ciona spec., Brachydanio rerio, Pimephales promelas, Cyprinus carpio, Oryzias latipes, Poecilia reticulate, Lepomis macrochirus, Oncorhynchus mykiss, Brachionus spec., Caenorhabditis elegans, Daphnia spp., Ceriodaphnia spec., Thamnocephalus spp., Bosmina spec., Notodromas spec., Artemia spec., Moina spec., Gammarus spec. und Hyallela spec. umfasst.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Testzellen Hämozyten sind, inbesondere Hämozyten von einem Lebewesen aus der Gruppe der Tunicata (Manteltiere), der Mollusken, oder der Chordata. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Testzellen Hämozyten von einem Lebewesen der Gruppe der Vertebraten sind, inbesondere von einem Lebewesen der Gruppe der Fische oder der Säugetiere.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Umweltprobe einem Wasserspeicher, einem Oberflächengewässer, einem Abwasser, einem Belebtschlamm, einem Sickerwasser, einem Boden- oder Sedimenteluat, oder einer wässrigen Phase einer Emulsion entnommen wurde.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Testkit zur Bestimmung der Toxizität einer Probe zur Verfügung gestellt.

Demnach umfasst das Testkit:

  • – eine Vielzahl von Magnetpartikeln, insbesondere eine Vielzahl von Magnetpartikeln mit den Merkmalen einer der vorherigen Ausführungsformen der Erfindung, und
  • – eine Testpopulation umfassend eine Vielzahl von Testorganismen oder Testzellen, die zur Aufnahme der Magnetpartikel befähigt sind, insbesondere eine Testpopulation mit den Merkmalen einer der vorherigen Ausführungsformen der Erfindung.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weist das erfindungsgemäße Testkit zusätzlich eine erste Referenzprobe auf, wobei die erste Referenzprobe keine toxische Verbindung bzw. Schadstoff aufweist. Insbesondere ist die Referenzprobe zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Testorganismen oder Testzellen geeignet bzw. ausgebildet. Vorteilhafterweise kann die erste Referenzprobe als Negativkontrolle (im Sinne von keine Toxizität) verwendet werden, d.h. insbesondere zur Darstellung der maximalen Partikelaufnahme durch die Testorganismen oder durch die Testzellen bei den jeweiligen Verfahrensbedingungen (Temperatur, Inkubationsdauer, pH-Wert oder Ähnlichem).

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die erste Referenzprobe eine wässrige Probe.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das erfindungsgemäße Testkit zusätzlich eine zweite Referenzprobe auf, wobei die zweite Referenzprobe eine bekannte toxische Verbindung bzw. einen Schadstoff in einer definierten Konzentration umfasst. Die zweite Referenzprobe ist insbesondere als Positivkontrolle vorgesehen.

Der Begriff “Schadstoff” beschreibt hier jede toxische Substanz, von der ein schädigender Einfluss auf ein biologisches System ausgehen kann. Er umfasst Einzelchemikalien, Gemische von Chemikalien, natürliche Toxine, Makromoleküle, Biochemikalien, Ionen und radioaktives Material sowie Nano- und Mikropartikel.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die zweite Referenzprobe eine wässrige Probe.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weist das erfindungsgemäße Testkit zusätzlich ein Magnetseparator auf.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weist das erfindungsgemäße Testkit zusätzlich ein Probengefäß auf, das zur Aufnahme der Population lebender Testorganismen oder Testzellen ausgebildet ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Probengefäß als ein Teströhrchen, ein PCR-Gefäß, eine Streifenplatte, eine Mikrotiterplatte, eine mikroskopierbare Zählkammer oder eine Multiwellplatte ausgebildet. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die mikroskopierbare Zählkammer mindestens einen Kanal auf, der insbesondere mit mindestens einem Probenreservoir, vorzugsweise zwei Probenreservoirs, in Verbindung steht. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die mikroskopierbare Zählkammer mindestens zwei Kanäle, die vorzugsweise mit mindestens einem Probenreservoir, vorzugsweise zwei Probenreservoirs, in Verbindung stehen.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weist das erfindungsgemäße Testkit zusätzlich eine mikroskopische Zählkammer auf.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung weist das erfindungsgemäße Testkit zusätzlich einen Mikroskopadapter für Smartphones auf, wobei der Mikroskopadapter und das Smartphone, insbesondere die Kamera des Smartphones, zur Aufnahme und Dokumentation mikroskopischer Bilder ausgebildet sind.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung sollen durch die nachfolgende Figurenbeschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Figuren erläutert werden.

Figurenbeschreibung

1 zeigt ein Schema einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, mit 1.: Beginn Partikelaufnahme bei 0 min, wofür die Testorganismen in die Probelösung überführt werden, die Nahrungspartikel hinzugegeben werden, und die Nahrungsaufnahme über 10 min bei Raumtemperatur erfolgt, und 2.: Messung der Partikelaufnahme, wobei nach 10 minütiger Inkubation die Zellen von der Probelösung getrennt werden, und die Schädigung der Testorganismen unter dem Mikroskop anhand der Suspensionsdichte quantifiziert wird.

2 zeigt eine Gegenüberstellung der 50%-Hemmkonzentrationen eines Test-Sets von 5 umweltrelevanten Chemikalien, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelt wurden, und Literaturdaten zu einem Test, der als OECD-Guideline vorgesehen ist und die Partikelaufnahme von Protozoen in Belebtschlämmen erfasst. A: Dimethylsulfoxid, B: 1-Octylamin, C: Phenylether, D: 3,5-Dichlorphenol, E: Hexachlorophen. EC50: Konzentration der Testchemikalie mit 50%igem Effekt im jeweiligen Testsystem.

3 zeigt einen Vergleich von EC50-Werten ermittelt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Literaturdaten zu einem Zellvermehrungshemmtest mit T. thermophila. Dargestellt sind die logarithmierten EC50-Werte (log EC50) für die fünf Testchemikalien: A: Dimethylsulfoxid, B: 1-Octylamin, C: Phenylether, D: 3,5-Dichlorphenol, E: Hexachlorophen. Die gestrichelte Linie gibt die Winkelhalbierende (gleiche Hemmwirkung in beiden Testsystemen), die durchgezogene Linie die Regressionsgerade zwischen beiden Testsystemen wieder. Die Punkte repräsentieren Mittelwerte aus Duplikaten (vorliegende Erfindung) bzw. Triplikaten (Protozoentest entspr. OECD-Guidelineentwurf).

4 zeigt beispielhaft die Partikelakkumulation bei verschiedenen Partikeldichten und Inkubationszeiten zur Bestimmung der optimalen Inkubationszeit, worin die Partikeldichte gegen die Partikelakkumulation bzw. Magnetisierbarkeit aufgetragen ist.

Detaillierte Beschreibung einiger ausgewählter Ausführungsformen der Erfindung

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Nachweis toxischer Wirkungen von Chemikalien oder von toxischen Substanzen in Umweltproben unter Verwendung von Änderungen der Fähigkeit zur Partikelaufnahme biologischer Organismen oder Zellen als Indikator. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Test-Kit zur Verfügung zu stellen, mit dem Messungen entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden können.

In erster Linie betrifft die Erfindung ein bioanalytisches Testverfahren zum Nachweis toxischer Wirkungen von wässrigen Lösungen, das vorzugweise folgende Komponenten aufweist:

  • 1. Einen Negativ-Kontrollansatz, bestehend aus:
    a) einer wässrigen Referenzlösung, die keine toxischen Stoffe enthält und die geeignet ist, die biologische Aktivität der Testorganismen oder Testzellen über die Dauer der Verfahrensdurchführung zu erhalten,
    b) einer Konzentration an lebenden Testorganismen oder Testzellen, die zur Aufnahme der Magnetpartikel imstande sind und die durch die Partikel selbst magnetisierbar werden, und
    c) einer Konzentration magnetischer Partikel oder Magnetpartikel, die ausreicht, um die Testorganismen dieses Kontrollansatzes nach einer bestimmten Inkubationszeit zu magnetisieren, und
  • 2. Einen Probenansatz, bestehend aus:
    a) einem wässrigen Testgut, das einen potentiell toxischen Stoff enthält, der auf seine Wirkung hin getestet werden soll,
    b) einer identischen Konzentration an lebenden Testorganismen oder Testzellen wie bei 1. b) und
    c) einer identischen Konzentration magnetischer Partikel oder Magnetpartikel wie bei 1. c) beschrieben

Das erfindungsgemäße Verfahren weist typischerweise folgende Verfahrensschritte auf: Zuerst werden die zur Partikelaufnahme befähigten Organismen oder Zellen bereitgestellt. Dann werden die Organismen oder Zellen für eine Expositionsdauer der Referenzlösung sowie der Probelösung ausgesetzt. Im Anschluss an diese Expositionsphase werden magnetische Partikel oder Magnetpartikel zu diesen Versuchsansätzen hinzugegeben und den Organismen oder Zellen für eine Inkubationsdauer die Möglichkeit gegeben, die magnetischen Partikel aufzunehmen. Durch die Aufnahme von Magnetpartikeln werden die Organismen oder Zellen selbst magnetisch. Wird diese Aufnahme durch toxische Stoffe in der Probelösung gehemmt, werden weniger Magnetpartikel von den Organismen oder Zellen aufgenommen. Ist die Aufnahme vollständig inhibiert, bleiben die Organismen partikelfrei und sind damit nicht magnetisierbar. Mit zunehmender Stärke der toxischen Wirkung ergibt sich so ein abgestuftes Bild der Partikelaufnahme und zugleich auch der Magnetisierbarkeit der Organismen oder Zellen. Nach Ablauf der Inkubationsdauer werden die Organismen oder Zellen durch einen Magneten von den Versuchsansätzen abgetrennt, wobei sich entsprechend der Intensität der Schädigung und damit abhängig von der Menge aufgenommener Magnetpartikel eine geringe bis hohe Anzahl von Organismen oder Zellen abtrennen lässt: viele Organismen oder Zellen lassen sich in der Kontrolllösung abtrennen, weniger bis keine Organismen oder Zellen in den toxischen Probelösungen. Aus der Anzahl abgetrennter Organismen oder Zellen wird im Vergleich zur Kontrolle der Schädigungsgrad prozentual berechnet und die festgestellte Änderung als Anzeige des Toxizitätsgehalts der untersuchten Probe ausgewertet.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jede wässrige Probe zur Bestimmung ihrer Toxizität eingesetzt werden. Als Quellen für die Proben kommen Wasserspeicher, Oberflächengewässer, Abwässer, Belebtschlamm, Sickerwasser, Boden- und Sedimenteluate, die Wasserphase von Emulsionen sowie wässrige Lösungen von chemischen Reinsubstanzen oder Stoffgemischen in Frage. Das Verfahren ist anwendbar sowohl für Süßwasser als auch für Salzwasser. Jede Probe wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt in mehreren Verdünnungsstufen eingesetzt. Von jeder dieser Verdünnungsstufen der Probenansätze sowie dem Kontrollansatz werden bevorzugt ein bis mehrere Parallelansätze im Test eingesetzt. Jeder dieser Testansätze, die Probenverdünnungen sowie die Negativ-Kontrollansätze, enthalten bei der Testdurchführung eine identische Anzahl an Testorganismen sowie eine identische Konzentration magnetischer Partikel.

Die Magnetpartikel werden hierbei bevorzugt in der Referenzlösung suspendiert zu den Testansätzen gegeben. Um eine gleichförmige Verteilung zu gewährleisten, wird die Magnetpartikelsuspension vorher i.d.R. ultraschallbehandelt (im Allgemeinen für 30 Sekunden bis wenige Minuten). Sind die Magnetpartikel hinzugefügt, bleiben sie so lange in den Testansätzen, bis die Organismen oder Zellen in der Referenzlösung genügend Partikel aufgenommen haben, um selbst magnetisierbar zu werden. Die Inkubationszeit variiert hier von wenigen Minuten bis zu einigen Stunden. Die Inkubationszeit hängt dabei wesentlich von dem jeweiligen Testorganismus oder Testzelle, der Versuchstemperatur, der Art der im Test eingesetzten Magnetpartikel und dem zum Abtrennen eingesetzten Magneten ab. Üblich sind Versuchstemperaturen zwischen 10°C und 35°C, obwohl auch niedrigere und höhere Temperaturen angewendet werden können.

Nach einer Inkubationsperiode, in der die Organismen oder Zellen in der Referenzlösung genügend Magnetpartikel aufgenommen haben, um selbst magnetisierbar zu sein, werden die Testorganismen oder Testzellen aller Kontroll- und Probenansätze mit Hilfe gebräuchlicher Magnetseparationsmethoden positiv selektioniert.

Durch den Vergleich der Anzahl positiv selektionierter Testorganismen oder Testzellen der jeweiligen Probenansätze mit den Kontrollansätzen kann die prozentuale Schädigung bestimmt und toxikologische Kenngrößen wie der G-Wert oder die NOEC, die LOEC oder der EC50-Wert ermittelt werden.

Die Begriffe “NOEC”, “LOEC” and “EC50" sind toxikologische Kenngrößen, die im Allgemeinen als Bewertungsmaß für die toxische Wirkung von chemischen Reinsubstanzen herangezogen werden. Sie bezeichnen Konzentrationen oder Verdünnungsstufen der Probenlösung, die im Test gerade keinen (NOEC), den geringsten statistisch messbaren (LOEC) bzw. einen 50%igen Effekt hervorrufen. G-Werte sind ebenfalls ökotoxikologische Maßzahlen, die überwiegend zur Charakterisierung der Giftigkeit von Abwässern herangezogen werden. Der G-Wert bezeichnet hier die Grenzkonzentration bzw. die Verdünnungsstufe einer Probe, ab der kein toxischer Effekt auf den betreffenden Testorganismus beobachtet wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein zusätzlicher Positiv-Kontrollansatz im Test mitgeführt, bestehend aus:

  • a) der Referenzlösung (wie unter (1)a) beschrieben), die aber zusätzlich eine bekannte Konzentration eines toxischen Stoffes enthält,
  • b) einer identischen Konzentration an lebenden Testorganismen oder Testzellen wie bei 1. b)
  • c) einer identischen Konzentration magnetischer Partikel wie bei 1. c).

Eine solche Positiv-Kontrolle wird gewöhnlich zur Validierung des Testsystems mitgeführt, wenn ein Test zum ersten Mal durchführt wird oder eine neue Kultur, Population oder Charge von Testorganismen oder Testzellen im Biotest eingesetzt wird. Ebenso wird häufig die Zuverlässigkeit des Testsystems durch Positivkontrollen überprüft, wenn Tests in größeren zeitlichen Abständen durchgeführt werden.

In einer weiteren Ausführung werden die Magnetpartikel bereits zu Beginn der Expositionsphase hinzugegeben und Probe, Organismen oder Zellen, und Magnetpartikel zeitgleich ko-inkubiert. Dies verkürzt die gesamte Testdauer und kann zudem vorteilhaft im Hinblick auf die Erfassung einer Sofortwirkung toxischer Substanzen in der Probe sein.

In einer Weiterentwicklung des Erfindungsgedankens werden die Organismen oder Zellen der Probelösung in unterschiedlichen Konzentrationen bzw. Verdünnungsstufen ausgesetzt. Dies ermöglicht die Erstellung von Konzentrationswirkungskurven und die Ableitung von ökotoxikologischen Kenngrößen wie etwa von G-Werten oder von NOEC-, LOEC- und EC50-Werten.

Vorteilhaft ist außerdem, für den Kontrollansatz und jede Verdünnungsstufe mehrere Parallelansätze durchzuführen. Damit lässt sich die Reproduzierbarkeit der Methode überprüfen und eine statistische Streubreite der Parallelansätze ableiten.

Weiter vorteilhaft ist, während der Dauer der Exposition und Inkubation eine definierte, gleichbleibende Versuchstemperatur einzuhalten, die eine optimale Partikelaufnahme während der gesamten Verfahrensdauer für den jeweiligen Testorganismus oder Testzellen gewährleistet.

In einer Weiterentwicklung des Erfindungsgedankens werden die Testorganismen oder Testzellen zur Verfahrensdurchführung in eine geeignete Lösung überführt, die auch im eigentlichen Test als Lösung Verwendung findet (Testmedium). Dies ist manchmal – besonders bei Suspensionen von sehr kleinen oder einzelligen Testorganismen, die in aller Regel durch Pipettieren mit ihrem Suspensionsmedium überführt werden – aus toxikologischer Sicht wünschenswert, da zur Verfahrensdurchführung Bestandteile der ursprünglichen Kultivierungslösung (d.h. des Kulturmediums) stören können, und die Zellen vorzugsweise in einer chemisch definierten Lösung vorliegen sollten, die beispielsweise pH-gepuffert ist oder eine bestimmte anorganische Salzzusammensetzung aufweist. Für diese Zwecke geeignete und zugleich die biologische Aktivität der Testorganismen oder Testzellen über die Dauer der Verfahrensdurchführung erhaltende Lösungen sind dem Fachmann bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Test-Kit zur Verfügung zu stellen, das Magnetpartikel in einer geeigneten Konzentration von etwa 108/mL bis 1010/mL sowie eine Versuchsbeschreibung zu deren Einsatz enthält. Bestimmte Kits können zusätzlich lebende Organismen oder Zellen (oder deren kryptobiotische Lebensformen) enthalten, mit denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann. Zusätzlich zu Magnetpartikeln und Organismen kann das Kit der vorliegenden Erfindung noch folgende weitere Bestandteile einzeln oder in Kombination umfassen:

  • 1) Expositionskammern wie etwa Teströhrchen, PCR-Gefäße, Streifen-, Mikrotiter- oder Multiwellplatten,
  • 2) Referenzlösungen, Verdünnungsmedien,
  • 3) Pipetten,
  • 4) Magnetseparatoren,
  • 5) mikroskopische Zählkammern sowie
  • 6) Mikroskopadapter für Smartphones zur Aufnahme und Dokumentation mikroskopischer Bilder. Die Verwendung von Smartphones bietet hier besondere Vorteile: Smartphones sind allgemein weit verbreitet, mobil und handlich. Sie besitzen in aller Regel bereits hochauflösende Kameras, fungieren wie ein selbständiger Computer, auf dem viele Apps zur Dokumentation und Auswertung zur Verfügung stehen, außerdem gestatten Smartphones zur Weiterbearbeitung eine leichte Datensynchronisation mit PC-Systemen.
  • 7) statistische Auswertesoftware,
  • 8) detaillierte Versuchsanleitungen und Auswerteprotokolle

Nachstehend wird die vorliegende Erfindung weiter anhand des folgenden nichteinschränkenden Beispiels näher erläutert.

Beispiele:

1 illustriert ein mögliches Testdesign des erfindungsgemäßen Verfahrens: Zuerst werden die Testorganismen in die Probelösung überführt (dies können wässrige Chemikalienlösungen, Oberflächenwässer, wässrige Eluate von Böden, Abfall und Altlasten oder kommunales und industrielles Abwasser sein). Anschließend werden den Organismen 10 Min. lang magnetische Partikel zum Fraß angeboten.

Bei den Organismen handelt es sich vorzugsweise um Tetrahymena (Ciliaten, Protozoen) und die „Nahrung“ besteht aus vorzugsweise einer Mischung paramagnetischer Partikel:

  • – Streptavidin MagneSphere® Paramagnetic Particles (Fa. Promega) und
  • – Red Iron Oxide Particles, 0.3–0.8μm, ©Polysciences, Inc.

Zur Untersuchung der Wirkung einer Umweltprobe oder einer Chemikalien-Verdünnungsreihe werden mehrere Parallelansätze gleichzeitig untersucht. Nach dem 10-minütigen Zeitraum der Partikelaufnahme (Phagozytose) werden die Zellen aus der Probelösung mit Hilfe eines Magneten entfernt. Dabei werden die Zellen aller Parallelansätze zum gleichen Zeitpunkt entnommen. Zellen, die normale Nahrungsaufnahme zeigen, haben Magnetpartikel aufgenommen, sind damit magnetisierbar und mit Hilfe eines Magneten von der Probelösung zu trennen; durch die zeitgleiche Entnahme wird die Partikelaufnahme für alle Testansätze gleichzeitig gestoppt. Im Resultat werden mit Hilfe des Magneten nur die Zellen entnommen, die genügend Magnetpartikel aufgenommen haben. Geschädigten Zellen ist sozusagen der Appetit vergangen. Sie haben weniger oder keine Magnetpartikel aufgenommen und bleiben somit auch nicht an dem Magneten bei der Entnahme haften.

Ein Gerät, welches sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren eignet, ist als Magnetic Bead Extractor for 96 Well Microplates unter http://www.vp-scientific.com/Magnetic_Bead_Separation_Extractor.php zu finden, vorzugweise nur unter Verwendung eines „6er Kamms“, d.h. wobei vorteilhafterweise statt 96 nur 6 Parallelansätze zum Einsatz kommen.

Sind die Organismen erst einmal von der Probe mittels des „Magnet-Extraktors“ getrennt, werden sie mit Hilfe digitaler Bildanalyse unter dem Mikroskop gezählt. Viele Zellen entsprechen keiner schädlichen Wirkung, wenige Zellen deuten auf ein Schädigungspotential der Untersuchungslösung hin.

In einem weiteren Beispiel wurden EC50-Werte für eine Reihe umweltrelevanter Chemikalien anhand des Ciliaten Tetrahymena thermophila ermittelt (2). Dabei wurde eine Zellsuspension der Testorganismen mit einer Konzentration von 105 Zellen/mL eingesetzt. Aus dieser Zellsuspension wurden jeweils 10 µL entnommen und zu jeweils 80 µL einer Verdünnungsreihe (Verdünnung mit H2O) der Probelösung, bestehend aus 5 Verdünnungsstufen (Verdünnung im Verhältnis 1:3 mit H2O), sowie einer Kontrolle, die ausschließlich H2O als Referenzmedium enthielt, pipettiert.

Der gesamte Ansatz erfolgte in PCR-Gefäßen als Doppelansatz. Unmittelbar nach Zellzugabe wurden zu diesen Ansätzen jeweils 10 µL Magnetpartikellösung (rote Eisenoxidpartikel, Partikelgröße 0,3–0,8 µm, Polysciences Inc., gelöst in H2O) in einer Konzentration von 500 mg/L (≈ 1 × 109/mL; ≈ 1 × 108/mL im Ansatz) gegeben und die Testansätze über einen Zeitraum von 10 Minuten bei einer Temperatur von 28°C inkubiert. Nach der 10-minütigen Expositions- bzw. zeitgleichen Inkubationszeit wurden die magnetisierbaren Zellen mit Hilfe eines Magnetseparators (MagnetoPURE-Micro, chemicell GmbH) positiv selektioniert, in 20 µL H2O aufgenommen und unter dem Mikroskop ausgezählt. Anhand der so ermittelten Zelldichte wurde der prozentuale Schädigungsgrad für jede Verdünnungsstufe im Vergleich zur Kontrolle bestimmt.

Getestet wurden Probelösungen der fünf folgenden, in H2O gelösten Chemikalien: Dimethylsulfoxid, 1-Octylamin, Phenylether, 3,5-Dichlorphenol und Hexachlorophen. Anhand der gemessenen Effekte wurden für jede Chemikalie Konzentrations-Wirkungskurven erstellt und hieraus mit konventionellen statistischen Methoden der EC50-Wert berechnet.

Beim Vergleich dieser so ermittelten EC50-Werte mit EC50-Literaturdaten für einen Test, der als OECD-Test etabliert werden soll und die Partikelaufnahme von Ciliaten-Mischpopulationen in Belebtschlämmen über einen Zeitraum von 22 Stunden misst, ergibt sich eine sehr hohe Korrelation (r2 = 0,99; p < 0,01), wobei der Biotest der vorliegenden Erfindung in 3 Fällen etwas sensitiver und in 2 Fällen gering unempfindlicher auf die Testchemikalien reagiert (2). Dieses Resultat weist darauf hin, dass sich der als OECD-Guideline vorgesehene, in seiner Durchführung vergleichsweise komplexe Test mit der vorliegenden Erfindung in extrem verkürzter Zeit (10 Minuten statt 22 Stunden) nachstellen lässt.

3 zeigt die Gegenüberstellung der EC50-Werte der Erfindung mit EC50-Werten aus der Literatur, die Hemmeffekte auf die Zellvermehrung von Tetrahymena thermophila wiedergeben. Auch hier lässt sich eine klare Tendenz der Übereinstimmung beider Testsysteme erkennen (r2 = 0,93; P < 0,01): Mit einer Zunahme der Schädlichkeit einer chemischen Substanz im Biotest der vorliegenden Erfindung geht auch eine Zunahme der Giftigkeit, wie sie mit der Vermehrungshemmung erfasst wird, einher. Erkennbar ist dies in 2 anhand der eingezeichneten durchgezogenen Regressionsgeraden. Dabei weichen die EC50-Werte nur geringfügig voneinander ab. Alle Punkte liegen nahe an der Winkelhalbierenden (gestrichelt), die für identische Empfindlichkeit beider Testsysteme steht. Mit dem Biotest der vorliegenden Erfindung, der die Fähigkeit zur Partikelaufnahme erfasst, werden für die hier untersuchten Chemikalien in nur 10 Minuten Schädigungen sichtbar, die sich auch auf die Vermehrungsfähigkeit auswirken, mit letzterem Testsystem aber erst nach einer Testphase von vielen Stunden oder Tagen nachweisbar sind.

Für eine Variation der in 3 gezeigten Ausführungsformen, beispielsweise mit anderen Testorganismen oder Testzellen, kann es erforderlich sein, die Parameter des erfindungsgemäßen Verfahrens anzupassen.

In den vorhergehenden Beispielen wurden die Zellen zur Zählung mittels eines Magnetseparators aus der Probelösung entnommen. Es wurde jedoch festgestellt, dass sich Probeninkubation, Magnetseparation und Zellzählung in ein und demselben Gefäß durchführen lassen. Der gesamte Ansatz erfolgte hierbei in mikroskopierbaren Kammern vom Typ µ-slide VI0.4 der Firma ibidi GmbH (zu finden unter: http://ibidi.com/xtproducts/en/ibidi-Labware/Channel-Slides/m-Slide-VI-0.4). Diese besitzen die Abmessung von Standardobjektträgern und bestehen aus 6 flachen Kanälen, die jeweils zwei Probenreservoirs verbinden (4). Nach Befüllen jedes der 6 Reservoir-Paare mit jeweils 80 µL der zu untersuchenden Probelösungen werden – wie oben beschrieben – die Testorganismen und anschließend die Magnetpartikellösung hinzugegeben. Nach erfolgter 10-minütiger Inkubation der Testansätze bei 28°C werden die magnetisierbaren Zellen allerdings nicht wie bereits beschrieben aus den Probelösungen mit einem Magneten entnommen, sondern durch Anbringen jeweils eines Magneten unter jeweils einem der Mikroskopkammer-Kanäle und mehrmaliges Kippen Hin- und her-Kippen der ganzen Kammer von den Probelösungen getrennt, indem die magnetisierbaren Zellen an der Stelle der Kanalwand, unter der sich der Magnet befindet, abgeschieden und aufkonzentriert werden (vgl. hierzu auch 4.). Beim anschließenden mikroskopischen Auszählen der magnetisch getrennten Zellen verbleibt die Mikroskopkammer auf den Magneten, damit die an der Stelle des Magneten abgeschiedenen Zellen beim Mikroskopieren auch weiterhin fixiert bleiben. Ein besonderer Vorteil dieses Messvorgehens ist der geringe Handlings- und technische Aufwand: Alles, vom Probenansatz, über die Inkubation bis hin zur Trennung und Messung der Zellen erfolgt in einem „Probengefäß“. Die Trennung erfolgt durch mehrmaliges Hin- und her-Kippen des Probengefäßes, wobei sich die magnetisierbaren Zellen an der Gefäßwand über dem Magneten abscheiden.

Vorteilhafterweise werden die magnetisch getrennten Zellen unmittelbar und zügig nach der Separation ausgezählt.

Für viele Organismen (typische Labororganismen) kann auf Literaturwerte bzgl. der optimalen Partikeldichte und -größe sowie der benötigten Inkubationszeit (Zeitspanne zur Partikelaufnahme) zurückgegriffen werden.

Für den Fall, dass für den gewählten Testorganismus oder für die gewählte Testzelle keinerlei Daten vorhanden sind, können geeignete Partikeldichten und Inkubationszeiten (Grenzwerte) leicht selbst ermittelt werden, indem

  • a) Versuche mit Kontrollansätzen bei verschiedenen Partikelkonzentrationen und unterschiedlichen Inkubationszeiten durchgeführt werden (Inkubation der Testorganismen oder Testzellen in Referenzlösungen mit unterschiedlichen Partikelkonzentrationen und Messung der Magnetisierbarkeit, d.h. positiven Selektionierbarkeit, nach verschiedenen Inkubationszeiten = Variation der Partikeldichte und Inkubationszeit),
  • b) aus diesen Messungen die für eine maximale Magnetisierung erforderliche Inkubationszeit sowie Partikeldichte als Grenzwerte ermittelt werden,
  • c) die Messwerte der positiv selektionierbaren Organismen/Testzellen für jede Inkubationsdauer in Abhängigkeit der Partikeldichte grafisch gegenübergestellt werden, und
  • d) aus der Grafik die Grenzwerte der Partikeldichte und Inkubationsdauer bestimmt werden, bei deren Unterschreiten keine maximale Magnetisierbarkeit (hier: gezählte selektionierte Testorganismen oder Testzellen) mehr beobachtet werden kann.

5 zeigt beispielhaft Kurven, welche die prinzipielle Vorgehensweise zur Bestimmung der optimalen Inkubationszeit veranschaulichen sollen. Die Pfeile zeigen die erforderliche Partikelkonzentration für die jeweilige Inkubationsdauer an. Bei 5-minütiger Inkubationsdauer wird die maximale Zellzahl nicht erreicht, so dass hier kein Grenzwert ermittelt werden kann und auf längere Inkubationszeiten oder höhere Partikelkonzentrationen ausgewichen werden muss.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • http://www.vp-scientific.com/Magnetic_Bead_Separation_Extractor.php [0091]
  • http://ibidi.com/xtproducts/en/ibidi-Labware/Channel-Slides/m-Slide-VI-0.4) [0099]