Title:
Bioorthogonale 3D-in situ-Hydrogele in Form eines auf einem Träger immobilisierten Netzwerks für Biosensoren sowie Verfahren zu deren Herstellung
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft ein Netzwerk zum Nachweis von Analyten, gebildet mittels Reaktion aus den drei Komponenten Netzwerkknoten, Verbindungsstücken und den zu analysierenden Gastmolekülen, wobei
a) die Netzwerkknoten jeweils ein funktionalisiertes, dendritisches oder ein sternenförmiges Polymer sind,
b) die Verbindungsstücke jeweils ein lineares, polymeres bifunktionelles Molekül sind,
c) sich das Gastmolekül in den von Netzwerkknoten und Verbindungsstücken gebildeten Maschen befindet, und
d) das Netzwerk auf einem Substrat immobilisiert als Hydrogel vorliegt, sowie
ein Verfahren zur Herstellung des auf einem Träger immobilisierten Netzwerkes




Inventors:
Haag, Rainer, Prof. Dr. (12209, Berlin, DE)
Kaufmann, Lena, Prof. Dr. (10559, Berlin, DE)
Schedler, Uwe, Dr. (15366, Neuenhagen, DE)
Application Number:
DE102017112012A
Publication Date:
11/30/2017
Filing Date:
05/31/2017
Assignee:
Freie Universität Berlin, 14195 (DE)
International Classes:



Other References:
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Attorney, Agent or Firm:
Gulde & Partner Patent- und Rechtsanwaltskanzlei mbB, 10179, Berlin, DE
Claims:
1. Netzwerk zum Nachweis von Analyten, gebildet mittels Reaktion aus den drei Komponenten Netzwerkknoten, Verbindungsstücken und den zu analysierenden Gastmolekülen, wobei
a) die Netzwerkknoten jeweils ein funktionalisiertes, dendritisches oder ein sternenförmiges Polymer sind,
b) die Verbindungsstücke jeweils ein lineares, polymeres bifunktionelles Molekül sind,
c) sich das jeweilige Gastmolekül in den von Netzwerkknoten und Verbindungsstücken gebildeten Maschen befindet, und
d) das Netzwerk auf einem Substrat immobilisiert als Hydrogel vorliegt.

2. Netzwerk nach Anspruch 1, wobei der Netzwerkknoten ein dendritisches Polyglycerol-Derivat ist.

3. Netzwerk nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Netzwerkknoten durch eine variable Anzahl an Anknüpfungspunkten, jedoch mindestens vier, gekennzeichnet ist.

4. Netzwerk nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Funktionalität des Netzwerkknotens Azid oder Cyclooctin ist, oder jedoch Cycloocten, Tetrazin, Thiol, Vinyl, Acrylat, oder Methacrylat.

5. Netzwerk nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verbindungsstück Polyethylenglycol oder ein lineares Polyglycerol ist.

6. Netzwerk nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verbindungsstück durch eine variable Länge gekennzeichnet ist.

7. Netzwerk nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Funktionalität des Verbindungsstücks vorzugsweise Azid oder Cyclooctin ist, oder jedoch Cycloocten, Tetrazin, Thiol, Vinyl, Acrylat, oder Methacrylat.

8. Netzwerk nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Gastmolekül ein aktives Biomolekül, vorzugsweise ein Protein, Saccharid, DNA, oder RNA ist.

9. Netzwerk nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Gastmoleküle Enzyme, Enzymfragmente, Antikörper, Antikörperfragmente, Oligonukleotide, Peptide, Viren, Bakterien oder Virenhüllen sind.

10. Verfahren zur Herstellung eines auf einem Träger immobilisierten Netzwerkes nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Azid-funktionalisierte dendritische Polyglycerol-Einheiten und difunktionales Poly(ethylenglycol)-Dicyclooctin in Gegenwart von Gastmolekülen in Wasser miteinander vermischt werden, anschließend wird das Gemisch auf eine Oberfläche eines Substrats aufgebracht.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat nach dem Auftragen des Gemisches ruhen gelassen wird bis sich eine Hydrogelschicht gebildet hat.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, das Ruhen in einer Atmosphäre mit einem Feuchtigkeitigkeitsgehalt > 90% relative Luftfeuchtigkeit erfolgt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat aus Siliciumdioxid oder Silicium besteht.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Substrats funktionalisiert ist, vorzugsweise durch Silanisierung.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftragen des Gemischs mittels Spincoating, Spraycoating, Rakeln oder Spotten erfolgt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftragen des Gemischs mittels Immobilisierung mittels Kern-Schale-Struktur oder kovalenter Verankerung erfolgt.

Description:

Die Erfindung betrifft ein auf einem Träger immobilisiertes Netzwerk zum Nachweis von Analyten sowie ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Träger immobilisierten Netzwerkes.

Der spezifische Nachweis von Analyten spielt eine wesentliche Rolle in der chemischen, biochemischen und klinischen Analytik.

Im analytischen Bereich erfolgt die Bindung von aktiven Biomolekülen an festen Materialien bzw. Oberflächen oft adsorptiv über elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen oder dispersive Kräfte und gilt als schwer kontrollierbar und zum Teil nur begrenzt stabil. Sowohl die große räumliche Nähe zur Oberfläche als auch der Adsorptionsprozess an sich kann dabei insbesondere die aktiven Stellen des Proteins negativ beeinflussen und somit die biologische Aktivität eines Biomoleküls wie z. B. eines Proteins herabsetzen. (V. Hlady, J. Buijs, Curr. Opin. Biotechnol. 1996, 7, 72; J. J. Gray, Curr. Opin. Struct. Biol. 2004, 14, 110; P. Jonkheim, D. Weinrich, H. Schröder, C. M. Niemeyer, H. Waldmann, Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9618.)

Alternativ erfolgt eine reaktive Immobilisierung durch kovalente Bindungsknüpfung zwischen Trägermaterial und Biomolekül. Dieser Weg verspricht eine größere Robustheit und Kontrollmöglichkeit. Gleichzeitig gilt auch hier, dass eine Beladung der Oberfläche durch den maximalen Bedeckungsgrad begrenzt ist und einer statistischen Verteilung der Proteinorientierungen auf der Oberfläche unterliegt. Da die Präsentation der aktiven Stellen bzw. der Bindungstaschen des Biomoleküls für die molekulare Erkennung wichtig ist und daher für die Assay-Performance oder auch für die Zelladhäsion entscheidend ist, sollten die jeweiligen Biomoleküle dabei idealerweise gerichtet, bzw. orientiert auf der Oberfläche gebunden sein. Die korrekte Orientierung der immobilisierten Biomoleküle auf der Oberfläche stellt daher stets eine Herausforderung dar. (W. Kusnezow, J. D. Hoheisel., J. Mol. Recognit. 2003, 16, 165)

Für eine höhere Beladung mit Biomolekülen kommen 3-dimensional beschichtete Oberflächen zum Einsatz. Hierbei kann zwischen dem Einsatz von dendritischen Polymeren oder Gelen wie z. B. Polyacrylamid-Gelen unterschieden werden. Allerdings stellen hier die zu große Diffusionsbarriere und damit verbundene zu lange Inkubationszeiten bis das thermodynamische Gleichgewischt eintritt oftmals das größte Hindernis dar. Des Weiteren kommt es auch hier in der Regel zu einer kovalenten oder nicht-kovalenten Wechselwirkung zum Biomolekül um es im Gel zu halten und ein Hinausdiffundieren zu verhindern. (S. Li, M. Yang, W. Zhou, T. G. Johnston, R. Wang, J. Zhu, Appl. Surf. Sci. 2015, 355, 570; P. Arenkov, A. Kukhtin, A. Gemmell, S. Voloshchuk, V. Chupeeva, A. Mirzabekov, Anal. Biochem. 2000, 278, 123; D. Guschin, G. Yershov, A. Zaslavsky, A. Gemmell, V. Shick, D. Proudnikov, P. Arenkov, A. Mirzabekov, Anal. Biochem. 1997, 250, 203; A. V. Vasiliskov, E. N. Timofeev, S. A. Surzhikov, A. L. Drobyshev, V. V. Shick, A. D. Mirzabekov, Biotechniques 1999, 27, 592; S. Piletsky, E. Piletska, A. Bossi, N. Turner, A. Turner, Biotechnol. Bioeng. 2003, 82, 86.)

Insbesondere bei der Immobilisierung von großen Biomolekülen auf Oberflächen mit funktionalisierten dendritischen Polymeren können außerdem nur wenige der funktionellen Gruppen für eine chemische Reaktion erreicht werden und verbleiben nicht abreagiert in der Matrix. So wurde z. B. im Fall der kovalenten Immobilisierung von Streptavidin an eine Polyacryl-säure-Oberfläche gezeigt, dass nur 0,1 % der Carboxylgruppen erreicht werden. Durch Einführung von Copolymeren konnte dieser Wert um den Faktor 5 gesteigert werden, was jedoch noch immer sehr wenig ist. (A. Hennig, H. Borcherding, C. Jaeger, S. Hatami, C. Würth, A. Hoffmann, K. Hoffmann, T. Thiele, U. Schedler, U. Resch-Genger, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8268; A. Hennig, A. Hoffmann, H. Borcherding, T. Thiele, U. Schedler, U. Resch-Genger, Chem. Comm. 2011, 47, 7842.)

Ein weiteres Problem stellt der eigentliche Prozess der Oberflächenbeschichtung bei vorausgegangener separater Herstellung eines Hydrogels dar: Mit dieser Technik sind zwar definierte Hydrogele herstellbar, das Aufbringen auf die Oberfläche des Trägers (z. B. mittels Spincoating) gestaltet sich aber oftmals schwierig, da Schichtdickenschwankungen kaum zu vermeiden sind. Zudem sind viele Geometrien und Formate wie z. B. Mikrotiterplatten so nur schwer zugänglich. Letztendlich kann die Haftung der Hydrogele durch kovalente Verankerung (grafting to) am Träger nur durch separate Aktivierung des Trägers selbst, beispielsweise durch eine Plasmabehandlung erfolgen.

In ZHANG, X. [u. a.]: Micro- and nanogels with labile crosslinks – from synthesis to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. (2015) 44, 1948–1973, und STEINHILBER, D. [u. a.]: A Microgel Construction Kit for Bioorthogonal Encapsulation and pH-Controlled Release of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. (2013) 52: 13538–13543, wird die Herstellung eines Mikrogels mit eingeschlossenen Zellen, ausgehend von dendritischem dPG-polyazid als Netzwerkknoten und bifunktionellem PEG-DIC als Verbindungsstück beschrieben.

Hydrogel-basierte Analyt-Nachweissysteme werden in LE GOFF, G. C. [u. a.]: Hydrogel microparticles for biosensing. Eur. Polym. J. (2015) 72: 386–412, Seiten 1–49, offenbart.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Netzwerk vorzuschlagen, das die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise behebt.

Die Aufgabe wird durch ein Netzwerk mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 10 gelöst.

Es wird ein erfindungsgemäßes Netzwerk, das als Hydrogel vorliegt, bereitgestellt, das aus Netzwerkknoten, Verbindungsstücken und zu analysierenden Gastmolekülen besteht, wobei

  • a) die Netzwerkknoten aus einem funktionalisiertem, dendritischen oder einem sternenförmigen Polymer bestehen,
  • b) die Verbindungsstücke jeweils ein lineares, polymeres bifunktionelles Molekül sind,
  • c) sich die Gastmoleküle in von den Netzwerkknoten und Verbindungsstücken gebildeten Maschen befinden, und
  • d) das Netzwerk auf einem Substrat immobilisiert ist.

Das erfindungsgemäße Netzwerk zeichnet sich vorteilhafterweise dadurch aus, dass sowohl die Knotenpunkte des Netzwerkes als auch die Verbindungsstücke bioorthogonal sind und daher keinen Einfluss auf die Struktur und Funktion von Gastmolekülen ausüben. Das auf dem Substrat immobilisierte Netzwerk weist eine räumliche Ausdehnung auf, die durch die Dimensionierung des Substrats und die Schichtdicke des Netzwerkes bestimmt wird.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die Schichtdicke vorzugsweise im Bereich von 50 bis 500 nm, besonders bevorzugt bei 300 nm.

Bei den bevorzugten Schichtdicken und insbesondere bei 300 nm wird bei Verwendung des Netzwerkes als Biosensor ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis erhalten.

Die erfindungsgemäßen Netzwerke stellen somit bioorthogonale 3D-in situ-Hydrogele, insbesondere für Biosensoren dar.

Knotenpunkte und Verbindungsstücke sind dabei vorzugsweise so funktionalisiert, dass eine Verknüpfung bei Raumtemperatur in wässriger Lösung und in Gegenwart der Gastmoleküle ohne weitere Zugabe eines Katalysators stattfindet.

Als Netzwerkknoten wird vorzugsweise ein dendritisches Polyglycerol-Derivat, deren Mn vorzugsweise 5000–10000 kDa beträgt, verwendet, die eine variable Anzahl an Anknüpfungspunkten aufweisen können, jedoch müssen mindestens vier Anknüpfungspunkte pro Netzwerknoten gegeben sein. Vorzugsweise sind bis zu 20, besonders bevorzugt bis 15, und am bevorzugtesten bis zu 10 Anknüpfungspunkte vorgesehen.

Die Netzwerkknoten weisen vorzugsweise eine Funktionalität als Azid, Cyclooctin, Cycloocten, Tetrazin, Thiol, Vinyl, Acrylat und/oder Methacrylat auf, besonders bevorzugt Azid und Cyclooctin.

Der Funktionalisierungsgrad der Netzwerkknoten liegt vorzugsweise bei 2 bis 30 %, besonders bevorzugt vorzugsweise 5 bis 20 % und am bevorzugtesten bei 10%.

Vorzugsweise sind die Verbindungsstücke Polyethylenglycol oder ein lineares Polyglycerol, die eine in Abhängigkeit vom Gastmolekül gewählte Kettenlänge aufweisen. Als geeignet für einen breiten Anwendungsbereich haben sich PEG 3000, PEG 6000 und PEG 10000 erwiesen. Daher bewegen sich bevorzugte Kettenlängen im Rahmen dieser Beispiele.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines auf einem Träger immobilisierten Netzwerkes ist dadurch gekennzeichnet, dass Azid-funktionalisierte dendritische Polyglycerol-Einheiten und difunktionales Poly(ethylenglycol)-Dicyclooctin in Gegenwart von Gastmolekülen in Wasser miteinander vermischt werden und anschließend das Gemisch auf eine Oberfläche eines Substrats aufgebracht wird, wobei sich eine Hydrogelschicht ausbildet.

Die Umsetzung von Azid-funktionalisierten dendritischen Polyglycerol-Einheiten und difunktionalen Poly(ethylenglycol)-Dicyclooctin erfolgt mittels spannungsvermittelter Azid-Alkin-Cycloaddition in Gegenwart in Wasser.

Das mit dem Gemisch versehene Substrat kann gegebenenfalls über einen vorgegebenen Zeitraum (Minuten), der sich durch die Geschwindigkeit der Vernetzung und der Schichtdicke des Netzwerkes bestimmt, ruhen gelassen werden oder bis die Bildung einer Hydrogelschicht festgestellt wird.

Damit das im Netzwerk befindliche Wasser nicht verdunstet, erfolgt dies vorzugsweise in einer Atmosphäre mit einem Feuchtigkeitigkeitsgehalt von vorzugsweise > 90% relative Luftfeuchtigkeit.

Das verfahrensgemäß eingesetzte Substrat besteht vorzugsweise aus Siliciumdioxid oder Silicium, dessen Oberfläche funktionalisiert sein kann, vorzugsweise erfolgt dies durch Silanisierung.

Das Auftragen des Gemischs erfolgt vorzugsweise mittels Spincoating, Spraycoating, Rakeln oder Spotten. Alternativ kann dies auch durch Immobilisierung mittels Kern-Schale-Struktur oder kovalenter Verankerung auf Partikeln erfolgen.

Das erfindungsgemäße Netzwerk hat die Vorteile:

  • a) Aufgrund der 3D-Struktur eine hohe Beladungsmöglichkeit zu garantieren. Durch die Immobilisierung auf entsprechenden Oberflächen (die als äußere Grenzfläche eines makroskopischen Feststoffes verstanden werden), wird der sonst begrenzte Bedeckungsgrad der Oberfläche aufgehoben und eine höhere Beladung erreicht.
  • b) Keine langen Diffusionszeiten zu haben, da die Gastmoleküle bereits vor Ausbildung des Netzwerkes beigemischt werden und sich so direkt bei Netzwerkbildung verteilen.
  • c) Eine optimale Verteilung des Gastmoleküls zu gewährleisten.
  • d) Keine störenden Wechselwirkungen der Netzwerkkomponenten zum Gastmolekül aufgrund der gewährleisteten Bioorthogonalität.
  • e) Vollständige Erhaltung der Funktionalität des Gastmoleküls und Zugänglichkeit aller Bindungsstellen.
  • f) Kein „Ausbluten“ des Gastmoleküls aus dem Netzwerk.
  • g) Anpassungsmöglichkeit der Maschenweite des Netzwerkes zum optimalen Einschluss eines Gastmoleküls.
  • h) Automatische Vorfilterfunktion durch die Gelmatrix.
  • i) Variationsmöglichkeit der Schichtdicke.

Es kann jeweils mindestens eine Art aber auch verschiedene Gastmoleküle in das Netzwerk eingeschlossen werden. Diese sind vorzugsweise aus der Gruppe der aktiven Biomoleküle ausgewählt, nämlich:

  • – Proteine, darunter fallen auch Enzyme, Enzymfragmente, Antikörper, Antikörperfragmente, Peptide,
  • – Viren, Virenhüllen,
  • – Bakterien,
  • – Saccharide sowie deren Oligo- und Polymere,
  • – DNA oder RNA, darunter fallen auch Oligonukleotide, miRNA,
  • – oder Kombinationen aus oben genannten Biomolekülen.

Das erfindungsgemäße Netzwerk zeichnet sich u. a. durch folgende Eigenschaften aus.

  • – Das Netzwerk stellt ein Hydrogel mit vorherrschender gleichmäßiger wässriger Umgebung dar, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur und damit die Funktionalität und Bindungsstellen des Gastmoleküls durch die Bioorthogonalität des Netzwerkknotens und Verbindungsstücks nicht beeinflusst wird.
  • – Das Netzwerk stellt sich als in-situ-Reaktion bevorzugt bei Raumtemperatur innerhalb weniger Minuten durch Reaktion der Netzwerkknoten und Verbindungsstücke überraschenderweise unter gleichzeitigem Einschluss oder kovalenter Verknüpfung des Gastmoleküls dar.
  • – Das Netzwerk ist dadurch gekennzeichnet, dass das Gastmolekül das Netzwerk durch Diffusion nicht verlassen kann, aber jedoch die Diffusion von kleineren Molekülen möglich ist
  • – Das Netzwerk ist dadurch gekennzeichnet, dass es in Abhängigkeit des Gastmoleküls temperaturstabil mindestens bis 90°C ist.
  • – Das Netzwerk ist dadurch gekennzeichnet, dass es in Abhängigkeit des Gastmoleküls in wässrigen Medien in einem Bereich von mindestens pH 4 bis mindestens pH 11 stabil ist
  • – Das Netzwerk ist dadurch gekennzeichnet, dass es als Filter wirken kann, da größere Moleküle nicht hinein diffundieren können.

Die voranstehenden Ausführungen betreffen das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Netzwerk gleichermaßen.

Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den übrigen, in den Unteransprüchen genannten Merkmalen.

Die Erfindung wird nachfolgend in Ausführungsbeispielen anhand der zugehörigen Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen

1 eine schematische Darstellung der in-situ Netzwerkbildung als 3D-Matrix zur Einlagerung von aktiven Biomolekülen. Die 3D-Matrix dient zudem gleichzeitig als Filter, der große, störende Komponenten nicht hineinlässt,

2A die verwendeten Netzwerkkomponenten: Knotenpunkte und Verbindungsstücke für Beispiel 1: den Einschluss von Streptavidin,

2B die Verknüfung der Netzwerkomponenten mittels spannungsvermittelter Azid-Alkin-Cycloaddition unter Ausbildung eines Triazolrings,

2C die schematische Darstellung der so ausgebildeten Netzstruktur zwischen den Gelbausteinen,

2D eine schematische Darstellung der in Gegenwart von Gastmolekülen ausgebildeten Netzstruktur, bei der die Gastmoleküle in den Maschen sitzen,

3 die kovalente Anbindung von Oligonukleotidsequenzen durch spannungsvermittelte Azid-Alkin-Cycloaddition an die Netzwerkknotenpunkte,

4 den Vergleich eines kommerziellen Streptavidin-Slides mit unserem neu entwickelten Netzwerk-Slide mit eingeschlossenem Streptavidin, und

5 Beladung des in situ Hydrogels mit unterschiedlichen Mengen Anti-FLAG Antikörper; 1: 1 μg/cm2; 2: 2 μg/cm2; 3: 3 μg/cm2.

1 zeigt die schematische Struktur der Netzwerkbildung und des fertigen Netzwerkes. Die Gastmoleküle sitzen in den von den Knotenpunkten und Verbindungsstücken aufgespannten Maschen. Die Diffusion kleinere Moleküle ist uneingeschränkt möglich, während das Netzwerk gleichzeitig als Filter wirkt, der zu große Moleküle nicht hineinlässt. Die Größe der Maschen kann durch Variation der Länge des Verbindungsstücks angepasst werden.

3 zeigt die schematische Darstellung der kovalenten Anbindung eines Oligonukleotids. Diese Methode eignet sich für kleine Moleküle wie kurze DNA-Stränge um ein hinausdiffundieren zu verhindern.

Beispiel 1:

Ein konkretes Beispiel für eine deutlich höhere Beladung eines mit dem Netzwerk, in welches Streptavidin eingeschlossen wurde, beschichteten Slides gegenüber eines kommerziellen Streptavidin-Slides zeigt 4. Beide Slides wurden mit Fluoreszenz-markiertem Biotin versetzt und nach geeignetem Waschprozess die Fluoreszenz gemessen. Durch Vergleich zum Netzwerk ohne Streptavidin und der dabei nicht Detektion von Fluoreszenz wurde eine unspezifische Wechselwirkung des Fluoreszenz-markierten Biotins an das Netzwerk ausgeschlossen. Der Netzwerk-Slide zeigt dabei eine mindestens um den Faktor 8 erhöhte Beladung.

Die verwendeten Knotenpunkte und Verbindungsstücke zur Darstellung des Netzwerkes mit Streptavidin zeigt 2A.

Beispiel 2:

Mit den gleichen Netzwerkkomponenten wie in Beispiel 1 benannt und in 2A gezeigt kann auch ein Anti-FLAG Antikörper in das Gel eingeschlossen werden, die Bindungsstelle für das FLAG-Peptid bleibt vollständig zugänglich, so dass dieses mittels Diffusion an den eingeschlossenen Antikörper binden kann. Unterschiedliche Zugaben an Antikörper vor der Netzwerkbildung führt zu einer unterschiedlichen Beladung des anschließend gebildeteren Netzwerks wie 5 zeigt. Die Beladung des Netzwerkes erfolgte mit 1: 1 μg/cm2; 2: 2 μg/cm2; 3: 3 μg/cm2 Antikörper. Anschließend wurde Peptid-Lösung hinzugegeben und nach geeignetem Waschprozess die Fluoreszenz bestimmt. Es zeigt sich eine deutliche Abhängigkeit zur hinzugegebenen und damit im Gel eingeschlossenen Menge an Antikörper.

Beispiel 3:

Mit den gleichen Netzwerkkomponenten wie in Beispiel 1 benannt und in 2A gezeigt können auch Oligonukleotidstränge wie in 3 gezeigt in das Gel implementiert werden. Zur Vermeidung eines einfachen Hinausdiffundieren dieser kurzen Sequenzen wird hierbei auf eine kovalente Verknüpfung der Oligonukleotidstränge an die Netzwerkknotenpunkte gesetzt. Hierzu tragen die Oligonukleotidstränge eine geeignete Funktionalität, im konkreten Beispiel eine Cyclooctin-Einheit wie in 3 zu sehen. Prinzipiell lassen sich Oligonukleotidstränge dieser Art auch im Anschluss in das bereits fertig gebildete Netzwerk binden. Der in-situ Ansatz gewährleistet jedoch eine deutlich bessere Verteilung der Oligonukleotidstränge im Netzwerk und führt zu einer wesentlich höheren Beladung. Passende Gegenstränge können zur Hybridisierung problemlos in das Netzwerk hineindiffundieren.

Synthesevorschrift

Erfindungsgemäße Netzwerke zum hochsensitiven Nachweis von Analyten bestehend aus Azid-funktionalisierten dendritischen Polyglycerol-Einheiten und difunktionalem Poly(ethylenglycol)-Dicyclooctin gemäß , die gemäß spannungsvermittelter Azid-Alkin-Cycloaddition miteinander reagieren, in Gegenwart von Gastmolekülen, aber ohne dass diese an der Netzwerk-Bildungs Reaktion teilhaben oder von der Reaktion in anderer Form als dem bloßen Einschluss oder der kovalenten Anknüpfung beeinflusst werden.

Streptavidin-Einschluss:

0,0017 mmol des PEG3000-Dicyclooctin, 0,0001 mmol des azidfunktionalisierten dendritischen Polyglycerols, 0,000005 mmol Streptavidin werden in 100 µl Wasser gegeben, 30 Sekunden geschüttelt auf dem Vortex und nach 8 Minuten Wartezeit per Spincoating, 120 Sekunden 200 Umdrehungen pro Minute, 60 Sekunden 1500 Umdrehungen pro Minute, auf einer 2 × 2cm2 großen Oberfläche aufgebracht. Es bildet sich eine Hydrogelschicht mit der Schichtdicke 300 nm. 0,000017 mmol des PEG3000-Dicyclooctin, 0,000001 mmol des azidfunktionalisierten dendritischen Polyglycerols, 0,00000005 mmol Streptavidin werden in 10 µl Wasser gegeben, 30 Sekunden geschüttelt auf dem Vortex und auf einer 1 × 1cm2 großen Oberfläche aufgetragen und über Nacht zur Netzwerkbildung in einer Feuchtekammer aufbewahrt.

Antikörper-Einschluss:

0,000017 mmol des PEG3000-Dicyclooctin, 0,000001 mmol des azidfunktionalisierten dendritischen Polyglycerols, 1 μg, 2 μg oder 3 μg Anti-FLAG Antikörper werden in 10 µl Wasser gegeben, 30 Sekunden geschüttelt auf dem Vortex und auf einer 1 × 1cm2 großen Oberfläche aufgetragen und über Nacht zur Netzwerkbildung in einer Feuchtekammer aufbewahrt.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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