Title:
Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Fructose
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von wässrigen Lösungen von D-Fructose aus einem Di-, Oligo- oder Polysaccharid.
Aktuelle Verfahren basieren auf der Generierung von D-Glucose aus Poly- oder Oligosacchariden und der anschließenden Isomerisierung dieser zu D-Fructose. Hierbei wird eine Konzentration von 42 % D-Fructose erreicht.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, welches in einer Reaktionseinheit am Beispiel von Saccharose D-Fructose mit Ausbeuten von > 53 % durch die Integration eines Schrittes, welcher einer Gleichgewichtsverschiebung zu Gunsten von D-Fructose erlaubt, generiert. embedded image




Inventors:
Sieber, Volker (85405, Nandlstadt, DE)
Rühmann, Broder (94315, Straubing, DE)
Pick, André (36179, Bebra, DE)
Application Number:
DE102017002252A
Publication Date:
09/13/2018
Filing Date:
03/08/2017
Assignee:
Pick, André, 36179 (DE)
Rühmann, Broder, 94315 (DE)
Sieber, Volker, 85405 (DE)
International Classes:



Claims:
Verfahren zur Herstellung einer D-Fructose enthaltenden Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass Di-, Oligo- oder Poly-Saccharid-Verbindungen katalytisch gespalten werden, wobei intermediär in einer Reaktionsfolge Zucker-Phosphate gebildet werden, wobei diese intermediär gebildeten Zucker-Phosphate katalytisch ineinander umgewandelt werden und wobei am Ende der Reaktionsfolge eine D-Fructose und Phosphat enthaltende Lösung erhalten wird.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Verwendung von Enzymen mit folgenden Aktivitäten
i. Phosphorylase (EC 2.4.1.x),
ii. Mutase (EC 5.4.2.x),
iii. Isomerase (EC 5.3.1.x) und
iv. Phosphatase (EC 3.1.3.x) umfasst.

Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Verwendung von
i. einer oder mehrerer Phosphorylasen aus nachstehend genannten:
Sucrose-Phosphorylase (EC 2.4.1.7), Glycogen Phosphorylase (EC 2.4.1.1), Maltose phosphorylase (EC 2.4.1.8). Cellobiose Phosphorylase (EC 2.4.1.20). 1,3-beta Oligoglucan Phosphorylase (EC 2.4.1.30), Laminaribiose Phosphorylase (EC 2.4.1.31), Cellodextrin Phosphorylase (EC 2.4.1.49), alpha, alpha Trehalose Phosphorylase (EC 2.4.1.64), 1,3-beta D-Glucan Phosphorylase (EC 2.4.1.97), Trehalose 6-Phosphat Phosphorylase (EC 2.4.1.216), Kojibiose phosphorylase (EC 2.4.1.230), alpha, alpha Trehalose Phosphorylase (EC 2.4.1.231), Nigerose Phosphorylase (EC 2.4.1.279), 3-O alpha D-glucosyl L-Rhamnose Phosphorylase (EC 2.4.1.282), Cellobionsäure Phosphorylase (EC 2.4.1.321), Sucrose 6-Phosphat Phosphorylase (EC 2.4.1.329), 1,2-alpha Glucosylglycerin Phosphorylase (EC 2.4.1.332), 1,2-beta Oligoglucan Phosphorylase (EC 2.4.1.333), 1,3-alpha Oligoglucan Phosphorylase (EC 2.4.1.334)
ii. Phosphoglucomutase (EC 5.4.2.2),
iii. Glucose-6-Phosphat Isomerase (EC 5.3.1.9),
iv. Phosphatase (EC 3.1.3.58) umfasst.

Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, welches Saccharose oder Saccharose-haltige Stoffströme der industriellen Zuckerproduktion als Saccharidquelle verwendet.

Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, welches Oligo- oder Polysaccharide aus der Stärkeproduktion oder der Biomasse-Hydrolyse enthält und als Substrat für die Bereitstellung einer mit D-Fructose angereicherten Lösung dient.

Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus, der die Enzyme enthält, oder eines Extrakts dieses Mikroorganismus oder freier Enzyme die einzeln oder kombiniert aus mehreren Mikroorganismen isoliert werden.

Verfahren nach Ansprüchench 2 bis 6, bei dem alle oder einzelne der verwendeten Enzyme immobilisiert sind oder als Fusionsprotein eingesetzt werden.

Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, bei dem die Saccharid-Verbindung, in Form eines Di-, Oligo- oder Poly-Saccharids kontinuierlich zugeführt wird

Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, worin die Umwandlungen zwischen 10 - 100 °C in einem wässrigen Reaktionsmedium mit einem pH-Wert zwischen 3-12 durchgeführt werden.

D-Fructose oder D-Fructose-Lösung, die nach einem Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 hergestellt wird.

Description:
Hintergrund der ErfindungGebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Fructose enthaltenden Lösungen aus einem Di-, Oligo- oder Polysaccharid.

Stand der Technik

Aktuelle, industrielle Herstellungsverfahren von D-Fructose basieren insbesondere auf einem zweistufigen Verfahren. Im ersten Schritt wird ein Poly- oder Oligosaccharid (z.B. Stärke) durch Hydrolyse in Monosaccharide gespalten. Im zweiten Schritt erfolgt eine Isomerisierung, durch welche D-Fructose mit einer Ausbeute (entsprechend einem prozentualen Anteil) von ca. 42 % gewonnen wird. Die anschließende Aufarbeitung zur Darstellung reiner D-Fructose erfolgt durch kostenintensive chromatographische Reinigungstechniken.

Ein alternatives industrielles Verfahren stellt die Hydrolyse von Saccharose mit dem Enzym Invertase dar. Dabei wird eine äquimolare Mischung aus D-Glucose und D-Fructose gewonnen. Zur Anreicherung der D-Fructose muss diese wiederum über kostenintensive chromatographische Verfahren gereinigt werden.

Die industriellen Verfahren weisen einen entscheidenden Nachteil auf, da nur Lösungen von D-Fructose gebildet werden, bei denen diese maximal 50 % der in der Lösung vorhandenen Saccharide ausmacht. Um Lösungen mit höherem Anteil von D-Fructose zu erhalten, muss entweder eine kostenintensive chromatographische Reinigung erfolgen oder teure reine D-Fructose zugegeben werden (z.B. HFCS55).

Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von reiner D-Fructose unter Verwendung von D-Glucose als Substrat ist bekannt und ausführlich beschrieben (EP 0028136B1, AT 513928B1). Dabei wird D-Glucose mit einer Pyranose-2-oxidase zu D-Glucoson oxidiert und dieses anschließend zu D-Fructose reduziert. Die Reduktion kann hierbei auf chemischen Weg (homogen- oder heterogen-katalytisch) oder durch Verwendung von Biokatalysatoren erfolgen.

Dieses Verfahren ist noch nicht technisch realisiert. Es hat den Nachteil, dass die Oxidation und die Reduktion voneinander getrennt ablaufen müssen und so ein zusätzlicher Prozessschritt notwendig ist. Außerdem ist für den Fall, dass die Reduktion chemisch erfolgt eine hohe Reinheit der Substrate notwendig und hohe Drücke und Temperaturen werden benötigt, wodurch es zu einer nicht gewünschten Bildung von Nebenprodukten kommen kann. Für den Fall, dass die Reduktion enzymatisch erfolgt, fallen sehr hohe Kosten für die Reduktionsmittel und die verwendeten instabilen Coenzyme (z.B. NADH) an.

Die bekannten Verfahren zur Herstellung von D-Fructose weisen verschiedene Nachteile auf. Für eine effiziente Umwandlung der Substrate werden teilweise hohe Drücke und Temperaturen benötigt. Alternativ ist nur eine maximale Ausbeute in Abhängigkeit des Substrates von 50 % möglich oder der Einsatz von sauberen Substraten zur Reduktion von Nebenprodukten unerlässlich. Die weitere Aufkonzentrierung erfordert sehr saubere Prozessströme, um eine Wiederverwendung der chromatographischen Apparaturen zu gewährleisten.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das eine D-Fructose Produktion bei nahezu theoretisch maximaler Ausbeute in Bezug auf Zuckermonomereinheiten in Verbindung mit einer vereinfachten Aufarbeitung und ohne Notwendigkeit organischer Coenzyme zulässt: Als Substrate können hierbei Di-, Oligo- und Polysaccharide verwendet werden. Die theoretisch maximale Ausbeute ergibt sich hierbei aus den durch Spaltung der Saccharide bereitstellbaren Zucker-Phosphaten und möglicherweise in den Sacchariden bereits enthaltener Fructose-Einheiten.

Überraschend wurde ein alternatives Herstellungsverfahren für D-Fructose gefunden, welches ohne hohe Drücke und Temperaturen auskommt und die Anwesenheit von prozessinternen Verunreinigungen besser toleriert. Die Auswahl der Katalysatoren ermöglicht es durch die Bildung intermediärer Zucker-Phosphate eine höhere Ausbeute an D-Fructose im Prozess zu erhalten. Hierdurch kann ein höherer Anteil bezogen auf die Substrate (Saccharide) als bei den aktuell verwendeten industriellen Herstellungsverfahren erreicht werden und eine Aufarbeitung überflüssig gemacht werden. Somit entfallen kostenintensive Reinigungsverfahren. Saccharide können hierbei Di-, Oligo- und Polysaccharide sein. Diese können aus der Zucker- oder Stärkeproduktion stammen oder durch Hydrolyse von Biomasse, z.B. in der Zellstoffproduktion oder bei der Aufarbeitung von Stroh, bereitgestellt werden.

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, das durch mehrere katalytische Schritte die Umwandlung von Di-, Oligo- und Polysacchariden zu D-Fructose ermöglicht. Dabei entstehen Intermediate in Form von Zucker-Phosphaten, welche letztlich zu D-Fructose und Phosphat gespalten werden.

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein enzymatisches Verfahren, welches in einer Reaktionsabfolge, die Abspaltung einzelner D-Glucosemoleküle in Form von D-Glucose-1-phosphat ermöglicht. Im Anschluss werden diese freigesetzten D-Glucose-1-phosphat Moleküle über weitere Zucker-Phosphat Zwischenstufen in D-Fructose-6-phosphat überführt. D-Fructose-6-phosphat wird anschließend gespalten und mal erhält D-Fructose und Phosphat. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

  1. a) Von einem Saccharidmolekül wird enzymatisch D-Glucose-1-phosphat abgespalten, und
  2. b) D-Glucose-1-phosphat wird enzymatisch zu D-Glucose-6-phosphat umgesetzt, und
  3. c) D-Glucose-6-phosphat wird enzymatisch zu D-Fructose-6-phosphat umgesetzt, und
  4. d) D-Fructose-6-phosphat wird enzymatisch gespalten in D-Fructose und Phosphat

Phosphat wird nur in geringen katalytischen Mengen eingesetzt, um intermediär Zucker-Phosphate (z.B. D-Glucose-1-phosphat, D-Glucose-6-phosphat, D-Fructose-6-phosphat) zu bilden. In Schritt a) wird Phosphat an D-Glucose angefügt und in Schritt d) wird Phosphat abgespalten und wieder für Schritt a) zur Verfügung gestellt.

Dieses Verfahren nach vorliegender Erfindung stellt eine enzymatische Alternative zur Produktion von D-Fructose dar, bei der die Notwendigkeit zur Abtrennung und Reinigung restlicher Zwischenprodukte stark vereinfacht wird. Damit stellt die vorliegende Erfindung eine wesentliche Verbesserung zur Herstellung von D-Fructose aus Sacchariden gegenüber aktuell angewandten Techniken dar. Im Gegensatz zu bestehenden Verfahren wird durch das verwendete Biokatalysatorsystem verstärkte Anreicherung des Produkts D-Fructose erreicht.

Das Verfahren eignet sich grundsätzlich bei der Verwendung von Di-, Oligo- und Polysacchariden. So kann aus Cellobiose, Maltose oder Stärke ein Hydrolysat hergestellt werden, dass reich an D-Fructose ist. Dabei wird Schritt a) unter Verwendung von Cellobiosephosphorylase, Maltosephosphorylase oder Stärkephosphorylase durchgeführt. Die Schritte b) bis d) erfolgen analog wie oben beschrieben. Das Verfahren eignet sich besonders bei der Verwendung von Saccharose als Substrat, welches aus Zuckerrüben oder -rohr gewonnen werden kann. Dabei wird Schritt a) unter Verwendung von Sucrosephosphorylase durchgeführt. Die Schritte b) bis d) erfolgen analog wie oben beschrieben. Dabei kann D-Fructose mit Ausbeuten von > 53 % (bezogen auf die Masse) bzw. > 1 mol D-Fructose pro mol Saccharose bereitstellt

Die Durchführung des Verfahrens nach vorliegender Erfindung kann in verschiedenen Lösungsmittelsystemen durchgeführt werden. Bevorzugt werden wässrige Lösungsmittelsysteme. Es ist dabei ebenso möglich, das wässrige System durch ein Puffersystem zu ergänzen. Geeignete Puffer(systeme) sind bekannt und schließen übliche Puffer(systeme), zum Beispiel Acetat-, Kaliumphosphat-, Tris-HCI-, Glycylglycin- und Glycin-Puffer oder Mischungen von diesen ein. Bevorzugt weist ein Puffer, der in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt wird, einen pH-Wert von 3 bis 12, bevorzugt 4 bis 12, bevorzugter 4 bis 11 auf. Dem wässrigen System können für eine optimale Aktivität der Biokatalysatoren Ionen, z.B. Mg2+, zugesetzt werden. Der Einsatz von Stabilisatoren, Glycerin und etc., kann eine längere Nutzung der Biokatalysatoren ermöglichen.

In einem Verfahren nach vorliegender Erfindung wird Phosphat benötigt. Um eine ausreichende Menge an Phosphat im Verfahren zu gewährleisten, erfolgt eine externe Zugabe in Form von Phosphorsäure, Salzen der Phosphorsäure, Polyphosphat oder Kombinationen hieraus.

Ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird bei geeigneten Temperaturen durchgeführt, die z.B. von den verwendeten Enzymen abhängig sein können. Geeignete Temperaturen schließen 10°C bis 100°C, bevorzugt 10-90°C, bevorzugter 20-90°C, noch bevorzugter 20-80°C, ein.

Ein Vorteil des Verfahrens liegt in der Durchführung aller katalytischen Schritte im selben Reaktionsansatz ohne die Notwendigkeit, Zwischenprodukte zu isolieren. Das Verfahren kann sowohl satzweise als auch kontinuierlich betrieben werden. Dabei können entweder alle beteiligten Enzyme gleichzeitig zugegeben werden oder es wird erst ein Teil der Enzyme zugegeben, z.B. das/die Enzym(e) für Schritt a und b) und mit zeitlicher oder örtlicher Verzögerung ein anderer Teil der Enzyme, z.B. das/die Enzym(e) für Schritt c-d). Vor der Zugabe des zweiten Teils der Enzyme können die bereits im Reaktionsansatz vorhandenen Enzyme beispielsweise physikalisch entfernt (Filtration oder über Immobilisierung) oder inaktiviert werden. Letzteres kann durch eine kurzfristige Erhöhung der Temperatur auf beispielsweise 80°C für 10 min erfolgen. Alternativ kann die Reaktionslösung den Reaktionsansatz für erhöhten Umsatz und Ausbeuten auch mehrmals durchlaufen.

Die Spaltung von Sacchariden zu D-Glucose-1-phosphat in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung erfolgt enzymatisch, nämlich durch enzymatische Katalyse, und kann gemäß einem bekannten Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Spaltung durch Katalyse mit einer Phosphorylase.

Geeignete Phosphorylasen sind bekannt und schließen übliche Phosphorylasen, wie beispielsweise Saccharose-Phosphorylase ein. Saccharose-Phosphorylasen sind z.B. erhältlich aus Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus mutans oder Bifidobacterium adolescentis.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung von Saccharose zu D-Glucose-1-phosphat und D-Fructose durch eine Saccharose-Phosphorylase katalysiert wird.

Die enzymatische Umwandlung von D-Glucose-1-phosphat zu D-Glucose-6-phosphat in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann nach einem geeigneten Verfahren, z.B. nach einem üblichen Verfahren, oder wie hier beschrieben erfolgen. Als Enzym zur Umwandlung können geeignete, z.B. übliche Enzyme, die zur Umwandlung von Substraten geeignet sind, eingesetzt werden. Geeignete Enzyme umfassen beispielsweise Mutasen, insbesondere Phosphoglucosemutasen.

Geeignete Phosphoglucosemutasen sind bekannt und zum Beispiel erhältlich aus Lactococcus sp., Gallus gallus domesticus oder Oryctolagus cuniculus.

Die enzymatische Isomerisierung von D-Glucose-6-phosphat zu D-Fructose-6-phosphat in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann nach einem geeigneten Verfahren, z.B. nach einem üblichen Verfahren, oder wie hier beschrieben erfolgen. Als Enzym zur Umwandlung können geeignete, z.B. übliche Enzyme, die zur Umwandlung von Substraten geeignet sind, eingesetzt werden. Geeignete Enzyme umfassen beispielsweise Isomerasen, insbesondere Phosphoglucoseisomerase.

Geeignete Phosphoglucoseisomerasen sind bekannt und zum Beispiel erhältlich aus Bacillus stearothermophilus, Saccharomyces cerevisiae oder Oryctolagus cuniculus.

Die enzymatische Spaltung von D-Fructose-6-phosphat zu D-Fructose und Phosphat in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung darf nur mit einer ausreichend hohen Selektivität erfolgen. Geeignete Enzyme können beispielsweise Phosphatasen umfassen. Eine notwendige Voraussetzung für die Eignung einer Phosphatase ist deren Substratspezifität. Die meisten Phosphatasen zeigen jedoch eine sehr breite Substratspezifität, weshalb sie für die hier beschriebene Reaktion ungeeignet sind.

Geeignete Phosphatasen zeichnen sich durch eine hohe Spezifität gegenüber D-Fructose-6-phosphat, d.h. geringer Aktivität für Glucosephosphate aus. Phosphatasen mit diesem Anforderungsprofil sind nicht kommerziell erhältlich. In der wissenschaftlichen Literatur wurde kürzlich eine erste Phosphatase beschrieben, die eine geringfügig höhere Aktivität für D-Fruktose-6-Phosphat als für D-Glucose-1-Phosphat und D-Glucose-6-Phosphat zusammen aufweist (Kutznetsova, E., Proudfoot, M., Sanders, S.A., Reinking, J., Savchenko, A., Arrowsmith, C.H., Edwards, A.M., Yakunin, A.F., (2005): Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiology Reviews, 29,263-279). Überraschender Weise reichte der geringe Unterschied in der Aktivität bei der Verwendung eines homologen Enzyms aus, eine hohe Anreicherung der Fruktose zu erreichen, wie im Ausführungsbeispiel beschrieben wird. Eine verbesserte Spezifität der Phosphatase für das Substrat D-Fructose-6-Phosphat gegenüber anderen Zucker-Phosphaten ermöglicht eine weitere Erhöhung der Ausbeute.

Eine wichtige Voraussetzung für die Durchführung des hier beschriebenen Verfahrens ist die gleichzeitige Nutzung mehrerer enzymatisch katalysierter Umwandlungsschritte. Hierdurch kann der Phosphateinsatz sehr niedrig gehalten werden und es erfolgt eine Verschiebung des Gleichgewichts zu Gunsten einer Akkumulation von D-Fructose. Nur bei gleichzeitiger Verwendung aller vier enzymatisch katalysierter Umwandlungsschritte ist eine effiziente Gleichgewichtsverschiebung im Prozess gewährleistet.

Enzyme können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung als solche, gegebenenfalls in der Form von Zell-Lysaten, gegebenenfalls als rekombinant überexprimierte Proteine, beispielsweise als in E. coli rekombinant überexprimierte Proteine verwendet werden, wobei bevorzugt die entsprechenden Zell-Lysate ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden können. Je nach dem zu produzierenden Enzym können auch andere Mikroorganismen zur Expression eingesetzt werden, z.B. Mikroorganismen, die dem Fachmann bekannt sind. Feste Bestandteile der jeweiligen Mikroorganismen können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung entweder abgetrennt werden oder in der Reaktion mit eingesetzt werden (z.B. Ganzzell-Biokatalysatoren). Es können auch Kulturüberstände oder Lysate von Mikroorganismen eingesetzt werden, die ohne rekombinante DNA-Technologie bereits ausreichende Enzym- Aktivitäten aufweisen. Die Enzym-Einheit 1 U entspricht dabei derjenigen Enzymmenge, die benötigt wird, um 1 µmol Substrat pro Minute umzusetzen. In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können sowohl eines oder mehrere Enzyme entweder in löslicher Form oder an Träger (Feststoffe) immobilisiert, eingesetzt werden.

Enzyme können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung als einzelne Proteine hergestellt werden. Alternativ können Enzyme in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung auch als Fusionsproteine hergestellt werden. Die Herstellung von Fusionsproteinen ist Stand der Technik und in der Literatur bekannt (Bülow, L., Mosbach, K., (1991): Multienzyme systems obtained by gene fusion. Trends Biotechnol 9.1, 226-231, Elleuche, S., (2015): Bringing functions together with fusion enzymes-from nature's inventions to biotechnological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 99.4, 1545-1556). So kann beispielsweise das Enzym für Schritt a) mit dem Enzym für Schritt b) fusioniert oder alternativ alle Enzyme aller Schritte zu einem Polypeptid fusioniert werden. Jegliche Kombination aus zwei, drei oder mehr Proteinen ist denkbar. Mit Fusionsproteinen kann beispielsweise eine erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit durch verbesserten Substrattransport erreicht werden oder die Produktion der Enzyme kann verbessert sein.

Die Enzyme können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung für einen kontinuierlichen Prozess oder für eine verbesserte Rückführung und Stabilisierung immobilisiert werden. Beispielsweise kann die Immobilisierung der Enzyme durch adsorptive oder kovalente Bindung oder in Form von Fusionsproteinen über spezifische Affinität an Trägermaterial erfolgen. Alternativ können Enzyme auch in Matrices eingehüllt (z.B. Alginat) oder als Aggregate gefällt und mit Quervernetzern stabilisiert werden. Sowohl einzelne Enzyme als auch ganze Zellen, die die Enzyme enthalten, können immobilisiert werden. Diese und weitere Methoden zur Immobilisierung sind Stand der Technik und in der Literatur beschrieben (Sheldon, R. A., (2007): Enzyme immobilization: the quest for optimum performance. Adv. Synth. Catal. 349.8-9, 1289-1307)..

Die Enzyme in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können Wildtyp-Enzyme sein, also eine Sequenzen besitzen, mit der sie auch in der Natur existieren und von dieser isoliert werden können. Alternativ können die Enzyme in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung auch über Methoden des Enzymengineerings so verändert werden, dass sie über eine erhöhte Aktivität, Spezifität und/oder Stabilität verfügen und/oder billiger produziert werden können. Dazu wird die Gensequenz der Enzyme so verändert, dass eine neue Aminosäuresequenz entsteht, die zu den verbesserten Enzymeigenschaften führt. So kann in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung beispielsweise eine Phosphatase eingesetzt werden, die D-Fructose-6-Phosphat mehr als 100x besser als Substrat erkennt als D-Glucose-6-Phosphat oder D-Glucose-1-Phosphat und/oder es können Enzyme eingesetzt werden, die bei 80 °C stabil sind und Halbwertszeiten von mehreren Wochen haben. Methoden zum Enzymengineering sind Stand der Technik und in der Literatur bekannt (Bornscheuer, U. T., Huisman, G. W., Kazlauskas, R. J., Lutz, S., Moore, J. C., & Robins, K. (2012): Engineering the third wave of biocatalysis. Nature, 485, 185-194.)

Als Substrat in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann eine reine wässrige Saccharid-Substratlösung oder alternativ eine wässrige Saccharid-Substratlösung, die Verunreinigungen enthält verwendet werden. So können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung auch technische, verdünnte Saccharoselösungen wie Rohsaft, Dünnsaft, Dicksaft oder Melasse aus dem Prozess der Saccharoseproduktion beispielsweise aus Zuckerrüben oder Zuckerrohr verwendet werden.

D-Fructose, die gemäß vorliegender Erfindung gewonnen wurde, kann aus dem Reaktionsgemisch, z.B. nach einem üblichen Verfahren, beispielsweise mittels Kristallisation isoliert werden.

Die Abbildungen zeigen eine Übersicht über den enzymatischen Prozess, Einzelansicht der jeweiligen Schritte mit verwendeten (Bio-)Katalysatoren sowie experimentelle Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Es zeigt:

  • : Übersicht über einen mehrstufigen katalysierten Prozess ausgehend von Saccharose.
  • : Erster katalysierter Schritt ausgehend von dem Beispielsubstrat Saccharose. Spaltung durch eine Phosphorylase in D-Glucose-1-phosphat und D-Fructose.
  • : Zweiter Schritt in der Prozessabfolge katalysiert durch eine Mutase ist die Umlagerung der Phosphat-Gruppe, es erfolgt eine Umwandlung von D-Glucose-1-phosphat zu D-Glucose-6-phosphat.
  • : Im dritten Schritt erfolgt die Isomerisierung von D-Glucose-6-phosphat zu D-Fructose-6-phosphat unter Einsatz einer Isomerase.
  • : Im letzten Schritt erfolgt die Spaltung von D-Fructose-6-phosphat zu D-Fructose und Phosphat. Das freigesetzte Phosphat steht damit wieder für den ersten Schritt im Prozess bereit.
  • : Darstellung einer Aufreinigung für die Phosphatase. Es zeigt ein 12 % SDS Gel einer Aufreinigung der Phosphatase. M ist der Marker (PageRuler unstained protein ladder (ThermoFisher)), Spalte 1 Zellen mit DNase, Spalte 2 Überstand nach Zellaufschluss, Spalte 3 Elution der Phosphatase, Spalte 4 nach der Entsalzung. Molekulargewicht der Phosphatase 24629 Da.
  • : Zeitlicher Verlauf des Prozesses unter Einsatz von 4 Enzymen. Es zeigt den zeitlichen Verlauf des Prozesses mit allen auftretenden Zwischenstufen. Die Analytik wurde mittels HPLC-ELSD durchgeführt. Folgende Abkürzungen werden in der Abbildung verwendet: D-Glucose-6-Phosphat (G6P), D-Glucose-1-Phosphat (G1P), D-Fructose-6-Phosphat (F6P), Saccharose (Suc), D-Glucose (Glc) und D-Fructose (Fru). Die Konzentration der Saccharose wurde in der Darstellung verdoppelt auf Grund des Disaccharid-Charakters. : Darstellung der Messungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten mittels HPLC. Es zeigt mehrere HPLC-ELSD Messungen, welche den zeitlichen Verlauf wiedergeben und die Produktbildung aufzeigen.
  • Tabelle 1: Auflistung der einzelnen Komponenten, welche für den Prozess eingesetzt wurden.

Im Folgenden werden die Abbildungen und Tabellen näher erläutert:

zeigt die schematische Darstellung von D-Fructose ausgehend von Saccharose. Es ist gezeigt, wie durch den Einsatz von vier Katalysatoren und einer katalytischen Menge Phosphat aus einem Substratmolekül zwei Produktmoleküle D-Fructose gewonnen werden können.

Die bis zeigen die Umsetzung von Saccharose zu D-Fructose, wobei Saccharose zu alpha D-Glucose-1-Phosphat und D-Fructose umgesetzt wird. Daran schließt sich die Umsetzung von alpha D-Glucose-1-Phosphat zu alpha D-Glucose-6-Phosphat an, siehe . Im Weiteren erfolgt die Isomerisierung von alpha D-Glucose-6-Phosphat zu D-Fructose-6-Phosphat, siehe . Im letzten Schritt, , erfolgt die katalytische Spaltung von D-Fructose-6-Phosphat zu D-Fructose und Phosphat.

zeigt einen beispielhaften Prozess unter Verwendung von 4 Katalysatoren und Phosphat mit Saccharose als Substrat. Innerhalb von einem Zeitraum von 20 Stunden konnte eine Fructoseausbeute von mehr als 60 % (bezogen auf die Zuckermonomereinheiten) erzielt werden. Folgende Abkürzungen werden in der Abbildung verwendet: D-Glucose-6-Phosphat (G6P), D-Glucose-1-Phosphat (G1P), D-Fructose-6-Phosphat (F6P), Saccharose (Suc), D-Glucose (Glc) und D-Fructose (Fru). Die Konzentration der Saccharose wurde in der Darstellung verdoppelt auf Grund des Disaccharid-Charakters (zwei Zuckermonomereinheiten pro Saccharosemolekül). Es kommt auf Grund der Auswahl an Katalysatoren zu einer Akkumulation von D-Fructose von mehr als 50 %, was nur durch die gezielte Kombination dieser 4 Katalysatoren möglich wird.

Im Folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden.

Alle im Nachfolgenden aufgeführten Chemikalien wurden über die Carl Roth GmbH & Co. KG oder Sigma-Aldrich Corporation bezogen und für die Verwendung nicht weiter aufgereinigt. Die beschriebenen Primer wurden von der Firma biomers.net GmbH bezogen.

Die Bereitstellung des Biokatalysators erfolgte wie im Anschluss geschildert. Das Gen für die Phosphatase wurde mittels Polymerase-Ketten-Reaktion aus der genomischen DNS von Thermotoga naphthophila DSM 13996 amplifiziert (Primer fwd-CGACAGCATATGGAAGCGGTGATTTTCGACATG und Primer rev-CTACTTCCGAGCTCTTAAAGAACCTCTTTGAGAACGTTCAG) und zusätzlich die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Ndel und Sacl eingebracht. Das Gen wurde in das Expressionsplasmid pET28b (Kanamycin Resistenz), über die Restriktionsendonukleasenschnittstellen Ndel und Sacl, integriert. Die Enzymproduktion erfolgte mittels Autoinduktions-Medium nach F.W. Studier (F. W. Studier, (2005), Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures, Protein Expr Purif, 41, 207-234) bei 37°C für 24 h in Schüttelkolben bei 180 rpm. Im Anschluss daran wurden die Zellen durch Zentrifugation vom Medium getrennt und in Bindepuffer (50 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 8, 20 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin) resuspendiert. Ein Gramm Zellmasse wurde in 10 ml Bindepuffer resuspendiert und anschließend durch Ultraschall aufgeschlossen. Im Anschluss erfolgte ein weiterer Zentrifugationsschritt zur Abtrennung von Zelltrümmern. Im Anschluss wurde die Phosphatase aus dem Überstand mittels FPLC-System und dem Einsatz einer HisTrap FF (5 ml) von GE Healthcare (Ni-Sepharose Material) aufgereinigt. Nach dem Auftragen und Waschen mit Bindepuffer wurde das Enzym durch einen Elutionspuffer (50 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 8, 500 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin) von der Säule gespült und aufgefangen. Im Anschluss wurde das Enzym in 50 mM TRIS-HCI pH 7,5 umgepuffert, hierfür wurde eine Größenauschlusssäule (HiPrep Desalting 26/10, GE Healthcare) verwendet. Im Anschluss erfolgte die Konzentrationsbestimmung mittels Bradford-Nachweis.

Sucrosephosphorylase (S0937; CAS: 9074-06-0), Phosphoglucomutase (P3397; CAS: 9001-81-4) und Phosphoglucose Isomerase (P5381; CAS: 9001-41-6) wurden von Sigma-Aldrich erworben. Die ausgewählte Phosphatase stammt aus Thermotoga naphthophila DSM 13996. Ein Homolog dieser Phosphatase wurde von Kutznetsova et al. (Kutznetsova, E., Proudfoot, M., Sanders, S.A., Reinking, J., Savchenko, A., Arrowsmith, C.H., Edwards, A.M., Yakunin, A.F., (2005): Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiology Reviews, 29,263-279) beschrieben.

Der Prozess bestand aus vier Enzymen. Der Gesamtprozess wurde mit einem Volumen von 0,2 ml durchgeführt. Es wurde ein 50 mM Glycylglycin-Puffer mit einem pH 7,4 verwendet. Für die gesamte Prozesslaufzeit wurde bei 30 °C gearbeitet. Die Ausgangskonzentration von D-Glucose betrug 50 mM und es wurden jeweils 0,8 Units/ml der kommerziell erhältlichen Enzyme eingesetzt. Eine Beprobung erfolgte in regelmäßigen Abständen. Der Prozess wurde für 1200 min durchgeführt. embedded image

SEQ ID NO. 1:

Phosphatase aus Thermotoga naphthophila DSM 13996embedded image

SEQ ID NO 2:

Nukleinsäuresequenz codierend für die Phosphatase aus Thermotoga naphthophila DSM 13996 embedded image

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • EP 0028136 B1 [0005]
  • AT 513928 B1 [0005]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Kutznetsova, E., Proudfoot, M., Sanders, S.A., Reinking, J., Savchenko, A., Arrowsmith, C.H., Edwards, A.M., Yakunin, A.F., (2005) [0027]
  • Bülow, L., Mosbach, K., (1991 [0030]
  • Kutznetsova et al. (Kutznetsova, E., Proudfoot, M., Sanders, S.A., Reinking, J., Savchenko, A., Arrowsmith, C.H., Edwards, A.M., Yakunin, A.F., (2005) [0044]