Title:
Verfahren und Anordnung zur Erfassung von Bilddaten
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erfassung von Bilddaten, bei dem ein Pixelbereich (PB) einer abzubildenden Probe (6) in mehreren Beleuchtungsereignissen mit Beleuchtungslicht (BL) jeweils einer ausgewählten und voneinander verschiedenen Intensität beleuchtet wird und daraufhin jeweils von dem Pixelbereich (PB) kommendes Detektionslicht (DL) für jede der Intensitäten als Bilddaten eines Subpixels (SP1 bis SP4) erfasst und resultierende Bilddaten des Pixelbereichs (PB) aus der Anzahl erfasster Bilddaten der Subpixel (SP1 bis SP4) ermittelt werden. Erfindungsgemäß werden die Beleuchtungsereignisse aufeinanderfolgend ausgelöst. Die Bilddaten aller Subpixel (SP1 bis SP4) des Pixelbereichs (PB) werden erfasst, bevor ein weiterer Pixelbereich (PB) beleuchtet wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Anordnung (1) zur Erfassung von Bilddaten sowie ein Mikroskop (0) mit einer solchen Anordnung (1).




Inventors:
Liedtke, Mirko (07745, Jena, DE)
Haarstrich, Jakob (07745, Jena, DE)
Application Number:
DE102016215177A
Publication Date:
02/15/2018
Filing Date:
08/15/2016
Assignee:
Carl Zeiss Microscopy GmbH, 07745 (DE)
International Classes:



Foreign References:
200502090122005-09-22
EP18790492008-01-16
EP28598372015-04-15
WO2011038815A12011-04-07
201002083392010-08-19
EP17610712007-03-07
Other References:
A. Bell et al.: „High Dynamic Range Images as a Basis for Detection of Argyrophilic Nucleolar Organizer Regions Under Varying Stain lntensities", Proceedings of IEEE International Conference on Image Processing, ICIP 2006, 2541–2544
Claims:
1. Verfahren zur Erfassung von Bilddaten,
bei dem ein Pixelbereich (PB) einer abzubildenden Probe (6) in mehreren Beleuchtungsereignissen mit Beleuchtungslicht (BL) jeweils einer ausgewählten und voneinander verschiedenen Intensität beleuchtet wird und daraufhin jeweils von dem Pixelbereich (PB) kommendes Detektionslicht (DL) für jede der Intensitäten als Bilddaten eines Subpixels (SP1 bis SP4) erfasst und resultierende Bilddaten des Pixelbereichs (PB) aus der Anzahl erfasster Bilddaten der Subpixel (SP1 bis SP4) ermittelt werden,
dadurch gekennzeichnet, dass
– die Beleuchtungsereignisse aufeinanderfolgend ausgelöst werden und
– die Bilddaten aller Subpixel (SP1 bis SP4) des Pixelbereichs (PB) erfasst werden, bevor ein weiterer Pixelbereich (PB) beleuchtet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die aufeinanderfolgenden Beleuchtungsereignisse entweder mit durchgehend zunehmenden oder mit durchgehend abnehmenden Intensitäten erzeugt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitäten aufeinanderfolgender Beleuchtungsereignisse eines Pixelbereichs (PB) anhand einer Stufenfunktion (SF1, SF2) ausgewählt werden, indem Funktionswerte der Stufenfunktion (SF1, SF2) ausgewählt werden, anhand der ausgewählten Funktionswerte der Stufenfunktion (SF1, SF2) Steuerbefehle generiert werden und eine Beleuchtungseinrichtung (2) mit den generierten Steuerbefehlen angesteuert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitäten aufeinanderfolgender Beleuchtungsereignisse eines Pixelbereichs (PB) anhand einer sinusförmigen Funktion (Fsin) ausgewählt werden, indem Funktionswerte der sinusförmigen Funktion (Fsin) ausgewählt werden, anhand der ausgewählten Funktionswerte der sinusförmigen Funktion (Fsin) Steuerbefehle generiert werden und eine Beleuchtungseinrichtung (2) mit den generierten Steuerbefehlen angesteuert wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung der Beleuchtungsereignisse ein Schaltelement (3) verwendet wird, dessen zeitliches Anstiegsverhalten durch eine Stufenfunktion (SF1, SF2) oder eine sinusförmige Funktion (Fsin) darstellbar ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung der Beleuchtungsereignisse ein AOTF als Schaltelement (3) verwendet wird.

7. Anordnung (1) zur Erfassung von Bilddaten umfassend eine Beleuchtungseinrichtung (2) zur mehrmaligen Beleuchtung eines Pixelbereichs (PB) einer abzubildenden Probe (6) mit Beleuchtungslicht (BL) jeweils unterschiedlicher Intensität, einen Detektor (7) zur Erfassung von daraufhin von dem Pixelbereich (PB) kommenden Detektionslicht (DL) für jedes Beleuchtungsereignis als Bilddaten eines Subpixels (SP1, SP2, SP3, SP4) sowie eine Steuereinheit (8) zur Ansteuerung der Beleuchtungseinrichtung (2), um den jeweiligen Pixelbereich (PB) mit der jeweiligen Intensität des Beleuchtungslichts (BL) während eines Beleuchtungsereignisses zu beleuchten, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit (8) derart konfiguriert ist, dass die jeweiligen Intensitäten anhand einer vorgegebenen Funktion (SF1, SF2, Fsin) ausgewählt werden, indem Funktionswerte der Funktion (SF1, SF2, Fsin) ausgewählt werden, anhand der ausgewählten Funktionswerte der Funktion (SF1, SF2, Fsin) Steuerbefehle generiert werden und die generierten Steuerbefehle zur Ansteuerung der Beleuchtungseinrichtung (2) bereitgestellt werden.

8. Anordnung (1) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein durch die Steuereinheit (8) ansteuerbares Schaltelement (3) vorhanden ist, dessen zeitliches Anstiegsverhalten durch eine Stufenfunktion (SF1, SF2) oder eine sinusförmige Funktion (Fsin) darstellbar ist.

9. Anordnung (1) nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Schaltelement (3) ein AOTF, ein AOM, EOM, ein AOBS oder eine direkt modulierte Lichtquelle (2.1) ist.

10. Mikroskop (0) umfassend eine Anordnung (1) nach einem der Ansprüche 7 bis 9.

Description:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur Erfassung von Bildern gemäß den Oberbegriffen der unabhängigen Ansprüche.

Zur pixelweisen Erfassung von Bilddaten werden beispielsweise Verfahren der dynamischen Bildaufnahmen eingesetzt, bei denen üblicherweise mehrere Aufnahmen einer Probe oder eines Probenbereichs mit unterschiedlichen Beleuchtungsintensitäten beleuchtet, ein von der Probe kommendes Detektionslicht erfasst und die so erfassten Bilddaten miteinander verrechnet werden.

Durch mehrfache Einzelbildaufnahme mit unterschiedlichen Belichtungszeiten lassen sich sowohl dunkle als auch helle Bildbereiche mit gutem Signal-Rausch-Verhältnis separat messen. Sie können dann zu einem Gesamtbild mit erweiterter Dynamik verrechnet werden, in dem sowohl Hell- als auch Dunkelbereiche mit hohem Kontrast wiedergegeben werden (engl. „High Dynamic Range lmaging"; HDRI; A. Bell et al.: „High Dynamic Range Images as a Basis for Detection of Argyrophilic Nucleolar Organizer Regions Under Varying Stain lntensities", Proceedings of IEEE International Conference on Image Processing, ICIP 2006, 2541–2544). Anstatt unterschiedlicher Belichtungszeiten können im Falle von angeregter Fluoreszenz als Detektionslicht unterschiedliche Anregungsintensitäten verwendet werden. Ein Beleuchtungsintervall, also eine Gesamtzeit, während der ein Pixelbereich beleuchtet wird, setzt sich bei der sequentiellen oder mehrfachen Einzelbildaufnahme aus voneinander getrennten Beleuchtungsereignissen zusammen. Zwischen den einzelnen Beleuchtungsereignissen eines Pixelbereichs werden Bilddaten weiterer Pixelbereiche erfasst.

In weiteren bekannten Verfahren wird eine Belichtungsintensität in Abhängigkeit von erfassten Signalstärken des Detektionslichts geregelt. Bei Nutzung des sogenannten CLEM-Verfahrens (Controlled Light-Exposure Microscopy) erfolgt ein Dunkeltasten in Abhängigkeit von erfassten Signalstärken des Detektionslichts.

Verfahren mit sequentiellen Aufnahmen ermöglichen zwar eine separate Messung sowohl dunkler als auch heller Bildbereiche mit gutem Signal/Rausch-Verhältnis und diese zu einem Gesamtbild mit erweiterter Dynamik verrechnen, allerdings sind diese Verfahren aufwendig und langsam.

Alternativ zur sequentiellen Aufnahme von Einzelbildern ist beispielsweise aus EP 1 761 071 A1 die simultane Aufnahme von Einzelbildern unterschiedlichen Kontrastumfangs mittels asymmetrischer optischer Strahlteilung bekannt. Dies erfordert jedoch zwangsläufig eine Aufteilung des Lichtsignals auf mehrere Kanäle und mehrere optoelektronische Detektoren, die zusätzliche Rauschquellen darstellen. Durch die wegen der Aufteilung geringere Signalstärke in den Einzelkanälen wird das Signal-Rausch-Verhältnis (signal-to-noise ratio; SNR) weiter reduziert.

Ein weiteres Verfahren ist in der WO 2011/038815 A1 beschrieben. Um eine Alternative für die aufwendige und langsame sequentielle Aufnahme vorzuschlagen, wird zum Erzeugen des Gesamtbildes für verschiedene Probenbereiche eines von mehreren Auswerteverfahren (SPC1 ADC, 2D-PC) in Abhängigkeit eines der Ergebnissignale und/oder in Abhängigkeit eines Zwischenergebnissignals eines von mehreren parallelen Auswertekanälen ausgewählt. Die bereichsindividuelle Auswahl aus verschiedenen Signalauswertungen ermöglicht es, jeweils die Signalauswertung mit dem für den betreffenden Probenbereich optimalen Dynamikumfang zu verwenden. Das resultierende Bild erhält dadurch einen erweiterten Dynamikumfang, der sich aus der Vereinigungsmenge der Dynamikumfänge der einzelnen Bildelemente ergibt.

Aus der US 2010/0208339 A1 ist ein Verfahren zum Betrieb eines Mikroskops bekannt, bei dem Anregungslicht auf unterschiedliche Punkte einer Probe geleitet wird. Dabei wird eine Intensität des Anregungslichts in jedem dieser Punkte variiert und eine Intensität des Detektionslichts in wenigstens einem spektralen Bereich quantitativ und für jeden Punkt erfasst. Die Intensität und/oder die spektrale Zusammensetzung des Anregungslichts ist mittels einer Regelungsvorrichtung automatisch geregelt. Als Basisdaten der Regelung dienen zuvor erhobenen Messdaten einer Intensität des Detektionslichts, wobei eine über die Dauer eines Belichtungsereignisses integrierte Intensität einen vorgegebenen Wert nicht überschreitet. Bei dieser auch als DIM bezeichneten Vorgehensweise wird eine Belichtungsintensität während einer Belichtungsdauer geregelt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Verfahren zur Erfassung von Bilddaten vorzuschlagen, das zudem einfach umzusetzen ist. Der Erfindung liegt zudem die Aufgabe zugrunde, eine alternative Anordnung zur Erfassung von Bilddaten vorzuschlagen.

Die Aufgabe wird hinsichtlich des Verfahrens durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Hinsichtlich der Anordnung wird die Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 7 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

In dem vorgeschlagenen Verfahren zur Erfassung von Bilddaten wird ein Pixelbereich einer abzubildenden Probe mehrmals, mindestens zweimal, mit Beleuchtungslicht jeweils unterschiedlicher Intensität beleuchtet. Infolge der Beleuchtung von dem Pixelbereich kommendes Detektionslicht wird für jedes Beleuchtungsereignis als Bilddaten eines Subpixels erfasst. Aus der Anzahl erfasster Bilddaten der Subpixel des betreffenden Pixelbereichs werden resultierende Bilddaten des Pixelbereichs ermittelt.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsereignisse für einen Pixelbereich aufeinanderfolgend ausgelöst werden und dass die Bilddaten aller Subpixel des Pixelbereichs erfasst werden, bevor ein weiterer Pixelbereich beleuchtet wird.

Unter einem Pixel (picture element, Bildelement) wird die kleinste Einheit verstanden, aus der ein Bild zusammengesetzt ist. In der vorliegenden Beschreibung soll ein Pixelbereich der abzubildenden Probe ein Bereich der Probe sein, der bei einer bestimmten Vergrößerung in einem Pixel abgebildet wird, also zu einem Pixel des Bilds korrespondiert.

Da jeder Pixelbereich mehrmals beleuchtet wird, bevor aus den während der jeweiligen Beleuchtungsereignisse erfassten Bilddaten die resultierenden Bilddaten des betreffenden Pixelbereichs und somit des betreffenden Pixels ermittelt, beispielsweise berechnet, werden, liegen zu jedem Pixelbereich einer jeweiligen Intensität zugeordnete Bilddaten vor.

Jede Beleuchtung des Pixelbereichs mit Beleuchtungslicht einer der ausgewählten Intensitäten stellt ein Beleuchtungsereignis dar. Die jeweils mit einer ausgewählten Intensität beleuchteten Pixelbereiche werden als Subpixel bezeichnet. Ein Beleuchtungsintervall (engl. Pixel dwell time) ist aus mindestens zwei Beleuchtungsereignissen beziehungsweise deren jeweiligen Zeitdauern, zusammengesetzt. Zur Vereinfachung wird nachfolgend ein Subpixel einem Beleuchtungsereignis gleichgesetzt. Ein Beleuchtungsintervall ist daher aus mindestens zwei Subpixeln beziehungsweise deren jeweiligen Zeitdauern, zusammengesetzt.

Als Beleuchtungslicht wird Licht verwendet, das durch die Probe wenigstens anteilig als Detektionslicht reflektiert wird und/oder durch das in der Probe befindliche Moleküle zur Emission von Licht, beispielsweise von Fluoreszenzlicht, als Detektionslicht angeregt werden. Das Beleuchtungslicht ist vorteilhaft Laserlicht, insbesondere wenn eine punktförmige Abtastung der Pixelbereiche (Scannen, Abrastern) erfolgt.

Das Detektionslicht kann daher Fluoreszenzlicht und/oder reflektierte spektrale Anteile des Beleuchtungslichts sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von bekannten Verfahren dadurch, dass die Erfassung der Bilddaten eines Pixelbereichs innerhalb kürzest möglicher Zeit vollständig abgeschlossen ist. Dadurch wird vorteilhaft verhindert, dass ein Pixelbereich beispielsweise bei dessen sequentieller Aufnahme bei einer erneuten Beleuchtung nicht exakt getroffen wird und/oder dass sich die Eigenschaften des Pixelbereichs zeitabhängig bereits verändert haben, bevor eine erneute Beleuchtung und Erfassung der Bilddaten erfolgt. Letzteres ist insbesondere bei biologischen Proben relevant. Es werden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhaft zur Erfassung des Detektionslichts verwendete Detektors geschont sowie die Belastung der Probe deutlich reduziert. Desweiteren werden bei einer quasi modulierten Beleuchtung der Probe gegebenenfalls in und/oder auf der Probe vorhandene Fluorophore günstig beeinflusst.

Die Aussage, dass die Bilddaten aller Subpixel des Pixelbereichs erfasst werden, bevor ein weiterer Pixelbereich beleuchtet wird bezieht sich auf eine verwendete Beleuchtungseinrichtung beziehungsweise einen Beleuchtungsstrahlengang. Werden in möglichen Ausgestaltungen des Verfahrens mehrere Beleuchtungseinrichtungen und/oder mehrere Beleuchtungsstrahlengänge, beispielsweise für eine multispot-Abtastung der Probe verwendet, werden mittels jeder Beleuchtungseinrichtung beziehungsweise jeden Beleuchtungsstrahlengangs alle Subpixel eines Pixelbereichs beleuchtet und erfasst, bevor ein nächster Pixelbereich beleuchtet wird.

In möglichen Ausgestaltungen des Verfahrens werden die aufeinanderfolgenden Beleuchtungsereignisse entweder mit durchgehend zunehmenden oder mit durchgehend abnehmenden Intensitäten erzeugt. Mit dieser Ausgestaltung des Verfahrens kann vorteilhaft ein zeitliches Anstiegsverhalten eines zur Ausführung des Verfahrens verwendeten Schaltelements ausgenutzt werden, indem die zunehmenden beziehungsweise abnehmenden Intensitäten anhand des bekannten zeitlichen Anstiegsverhaltens des Schaltelements gewählt werden.

In einer möglichen Ausgestaltung des Verfahrens werden die Intensitäten aufeinanderfolgender Beleuchtungsereignisse oder Subpixel eines Pixelbereichs anhand einer Stufenfunktion ausgewählt, indem Funktionswerte der Stufenfunktion ausgewählt werden. Dabei können vorteilhaft Funktionswerte je einer der Stufen der Stufenfunktion ausgewählt werden, da diese über einen Zeitraum konstant sind.

Anhand der ausgewählten Funktionswerte der Stufenfunktion werden Steuerbefehle generiert, mit denen die Beleuchtungseinrichtung beziehungsweise die Beleuchtungseinrichtungen angesteuert wird beziehungsweise werden.

Es ist dabei sehr vorteilhaft, wenn die Stufen der Stufenfunktion hinsichtlich ihrer zeitlichen Abfolge und Dauer mit den Beleuchtungsereignissen oder Subpixeln korrespondieren. Dies ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn eine dynamische, also eine periodische oder fortlaufende Auswahl der Funktionswerte erfolgt. Dabei können periodisch oder fortlaufend Steuerbefehle generiert werden und/oder es wird periodisch oder fortlaufend überprüft, ob die ausgewählten Funktionswerte innerhalb zulässiger Toleranzgrenzen liegen.

Wenn die Beleuchtungsereignisse von sehr kurzer Dauer sind, d.h. kurze Pixelverweilzeiten realisiert werden, sind die Stufen entsprechend inkremental klein. In solchen Fällen können sinusförmige Funktionen verwendet werden, wobei eine daraus resultierende Nichtlinearität der Beleuchtung und der Intensitäten während eines Beleuchtungsereignisses oder Subpixels in einer nachfolgenden Auswertung der Bilddaten berücksichtigt werden muss.

Daher können in einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens die Intensitäten aufeinanderfolgender Beleuchtungsereignisse eines Pixelbereichs anhand einer sinusförmigen Funktion ausgewählt werden, indem Funktionswerte der sinusförmigen Funktion ausgewählt werden, anhand der ausgewählten Funktionswerte der sinusförmigen Funktion Steuerbefehle generiert werden und eine Beleuchtungseinrichtung mit den generierten Steuerbefehlen angesteuert wird. Diese Ausgestaltung des Verfahrens ermöglicht beispielsweise Modulationsfrequenzen von 500 kHz für Beleuchtungsintervallen von 1 µs (Mikrosekunde), wenn beispielsweise ein AOTF beziehungsweise eine AOTF-Kristall als modulierendes Schaltelement verwendet wird.

Werden in weiteren Ausgestaltung des Verfahrens andere Methoden gewählt, sind auch andere Modulationsfrequenzen möglich, die höher oder niedriger als 500 kHz liegen können. Weitere Methoden bedienen sich beispielsweise direkt modulierender Lichtquellen, insbesondere Laser, akustooptischer Modulatoren (AOM), elektrooptischer Modulatoren (EOM) oder akustooptischer Strahlteiler (acusto-optical beam splitter, AOBS).

Die Stufenfunktionen beziehungsweise die sinusförmige Funktion stellen Ansteuerungskurven oder Ansteuerungsfunktionen dar. Die Steuerbefehle sind Befehle in einer geeigneten Maschinensprache.

Für die Ausführung des Verfahrens wird vorteilhaft ein Schaltelement zur Steuerung der Beleuchtungsereignisse verwendet, dessen zeitliches Anstiegsverhalten durch eine Stufenfunktion oder eine sinusförmige Funktion darstellbar ist.

Ein solches Schaltelement kann beispielsweise ein AOTF (akustooptisches Filter), ein EOM, ein AOBS oder direkt modulierender Laser sein.

Die Aufgabe wird hinsichtlich der Anordnung zur Erfassung von Bilddaten durch eine Anordnung gelöst, die eine Beleuchtungseinrichtung zur mehrmaligen Beleuchtung des Pixelbereichs der abzubildenden Probe mit Beleuchtungslicht jeweils unterschiedlicher Intensität umfasst. Ferner weist die Anordnung einen Detektor zur Erfassung von daraufhin von dem Pixelbereich kommenden Detektionslichts für jedes Beleuchtungsereignis als Bilddaten des Subpixels sowie eine Steuereinheit zur Ansteuerung der Beleuchtungseinrichtung auf. Die Steuereinheit dient dazu und ist dazu ausgelegt, den jeweiligen Pixelbereich mit der jeweiligen gewählten Intensität des Beleuchtungslichts während eines Beleuchtungsereignisses oder Subpixels zu beleuchten.

Die Anordnung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit derart konfiguriert ist, dass die jeweiligen ausgewählten und verwendeten Intensitäten anhand einer vorgegebenen Funktion ausgewählt werden, indem Funktionswerte der Funktion ausgewählt werden, anhand der ausgewählten Funktionswerte der Funktion Steuerbefehle generiert werden und die generierten Steuerbefehlen zur Ansteuerung der Beleuchtungseinrichtung bereitgestellt werden.

Die Steuerbefehle können durch einen Generator erzeugt werden, der Bestandteil der Steuereinheit ist oder mit dieser in einer zum Austausch von Daten geeigneten Weise verbunden ist.

In einer weiteren Ausführung der Anordnung umfasst die Steuereinheit ein Schaltelement, dessen zeitliches Anstiegsverhalten durch eine Stufenfunktion oder durch eine sinusförmige Funktion darstellbar ist. Darstellbar ist eine Funktion beispielsweise graphisch oder mittels einer mathematischen Berechnungsvorschrift. Das Schaltelement ist vorteilhaft ein AOTF.

Die erfindungsgemäße Anordnung kann vorteilhaft in einem Laser-Scanning-Mikroskop vorhanden sein.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert.

Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung der drei aufeinanderfolgenden Beleuchtungsereignisse, deren Subpixel sowie Beispiele zweier Stufenfunktionen und einer sinusförmigen Funktion und,

2 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines Mikroskops mit einer Anordnung zur Erfassung von Bilddaten.

In der 1 sind schematisch in einem Diagramm mit einer X-Achse als Zeitachse drei aufeinanderfolgende Beleuchtungsintervalle B1 bis B3 dargestellt. Während jedes Beleuchtungsintervalls B1 bis B3 (engl. pixel dwell time) wird ein Pixelbereich PB mit Beleuchtungslicht BL (siehe 2) mit jeweils vier unterschiedlichen Intensitäten über gleichlange Zeitdauern beleuchtet, die für das erste Beleuchtungsintervall B1 als erstes bis viertes Subpixel SP1 bis SP4 (engl. sub pixel) bezeichnet sind.

In der 1 sind beispielhaft drei mögliche Typen von Funktionen im Überblick dargestellt, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind. Die Funktionswerte der Funktionen sind in Richtung der Y-Achse Y aufgetragen.

Eine erste Stufenfunktion SF1 steigt über die Dauer eines Beleuchtungsintervalls B1 bis B3 jeweils stufenweise an, wobei jede Stufe mit je einem Subpixel SP1 bis SP4 des betreffenden Beleuchtungsintervalls B1 bis B3 hinsichtlich seiner zeitlichen Lage und Dauer korrespondiert. Am Ende eines jeden Beleuchtungsintervalls B1 bis B3 springt die erste Stufenfunktion SF1 wieder auf einen Ausgangswert zurück. Die erste Stufenfunktion SF1 nimmt daher während jeden Beleuchtungsintervalls B1 bis B3 in diskreten Stufen zu.

Eine zweite Stufenfunktion SF2 steigt über die Dauer des ersten Beleuchtungsintervalls B1 stufenweise an, nimmt über die Dauer des zweiten Beleuchtungsintervalls B2 stufenweise ab und steigt über die Dauer des dritten Beleuchtungsintervalls B3 erneut stufenweise an.

Eine sinusförmige Funktion Fsin durchläuft je Beleuchtungsintervall B1 bis B3 eine halbe Schwingungsperiode.

Ein Ausführungsbeispiel einer Anordnung 1 zur Bilderfassung ist schematisch in 2 gezeigt. Die Anordnung 1 ist Bestandteil eines nicht näher dargestellten Mikroskops 0 und umfasst eine Beleuchtungseinrichtung 2 zur mehrmaligen Beleuchtung eines Pixelbereichs PB einer abzubildenden Probe 6 mit Beleuchtungslicht BL jeweils unterschiedlicher Intensität. Die Beleuchtungseinrichtung 2 umfasst eine Lichtquelle 2.1 für Laserlicht sowie ein Schaltelement 3 zur gesteuerten Beeinflussung der Intensität des Beleuchtungslichts BL. Das Beleuchtungslicht BL wird in dem Schaltelement 2, das hier als ein AOTF ausgebildet ist, hinsichtlich seiner Intensität moduliert. Das modulierte Beleuchtungslicht BL trifft auf einen Farbteiler in Form eines halbdurchlässigen Spiegels 4 und wird mittels des halbdurchlässigen Spiegels 4 durch ein Objektiv 5 in den Pixelbereich PB auf die Probe 6 reflektiert. In dem beleuchteten Pixelbereich PB wird durch Wirkung des Beleuchtungslichts BL ein Detektionslicht DL erzeugt. Beispielsweise werden Moleküle der Probe 6 zur Emission von Fluoreszenzstrahlung als Detektionslicht DL angeregt. Das Detektionslicht DL gelangt durch das Objektiv 5 zum halbdurchlässigen Spiegel 4, der für die Wellenlänge des Detektionslichts DL transmissiv ist. Das transmittierte Detektionslicht DL wird mit einem Detektor 7 erfasst.

Das Schaltelement 3 und der Detektor 7 stehen über, schematisch gezeigte, Datenkanäle mit einer Steuereinheit 8 in Verbindung und sind durch diese ansteuerbar. Zusätzlich ist der Detektor 7 durch die Steuereinheit 8 auslesbar.

Um die von dem Detektor 7 ausgelesenen Daten an eine Rechner- und Speichereinheit 9 übermitteln zu können, ist die Steuereinheit 8 ist mit der Rechner- und Speichereinheit 9 verbunden.

In weiteren möglichen Ausführungen steht die Steuereinheit 8 zusätzlich oder alternativ mit der Lichtquelle 2.1 in einer zur Übermittlung von Daten und Steuerbefehlen geeigneten Verbindung.

Solche Verbindungen oder Datenkanäle sind beispielsweise durch Kabel, Leiterbahnen, Funk- und/oder Lichtübertragungsstrecken realisiert.

Zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine der in 1 gezeigten Funktionen SF1, SF2 beziehungsweise Fsin ausgewählt und der Steuereinheit 8 zur Verfügung gestellt. Ferner ist voreingestellt, dass je Beleuchtungsintervall B1 bis B3 Bilddaten vier gleichlanger Subpixel SP1 bis SP4 ermittelt werden sollen.

Die weitere Erläuterung nimmt beispielhaft auf die erste Stufenfunktion SF1 Bezug. Die Steuereinheit 8 ist derart konfiguriert, dass die Intensitäten anhand der vorgegebenen ersten Stufenfunktion SF1 ausgewählt werden, indem Funktionswerte der ersten Stufenfunktion SF1 ausgewählt werden. Die über der Zeit (X-Achse X) aufgetragenen Funktionswerte (Y-Achse Y) repräsentieren die einem Zeitpunkt zugeordnete Intensität des Beleuchtungslichts BL.

Im Ausführungsbeispiel werden alle Funktionswerte der ersten Stufenfunkton SF1 dynamisch ausgewählt, die Funktionswerte werden also zeitlich fortlaufend anhand der ersten Stufenfunktion SF1 ermittelt, beispielsweise berechnet oder abgelesen. Jeder der ausgewählten Funktionswerte wird in einen Steuerbefehl übersetzt, der für die Ansteuerung des Schaltelements 3 geeignet ist. Die generierten Steuerbefehle werden zur Ansteuerung der Beleuchtungseinrichtung 2, im Ausführungsbeispiel insbesondere zur Ansteuerung des Schaltelements 3, bereitgestellt und die Beleuchtungseinrichtung 2 wird mit ihnen angesteuert.

Während des ersten Beleuchtungsintervalls B1 wird ein Pixelbereich PB über die Zeitdauer des ersten Subpixels SP1 mit Beleuchtungslicht BL einer ersten Intensität beleuchtet, wobei die erste Intensität durch den Funktionswert der zu dem ersten Subpixel SP1 zeitlich korrespondierenden Stufe der ersten Stufenfunktion SF1 gegeben ist. Das aufgrund des Beleuchtungslichts BL mit der ersten Intensität in dem Pixelbereich PB bewirkte Detektionslicht DL wird mittels des Objektivs 5 gesammelt und auf den Detektor 7 gelenkt, durch den das Detektionslicht DL in Form mindestens eines Messwerts (Bilddaten) erfasst und dieser dem Pixelbereich PB und dem ersten Subpixel SP1 zugeordnet gespeichert wird.

Wie oben beschrieben, wird auch für jedes der Subpixel SP2 bis SP4 verfahren. Am Ende des ersten Beleuchtungsereignisses B1 werden aus den Bilddaten der Subpixel SP1 bis SP4 resultierende Bilddaten des Pixelbereichs PB ermittelt.

Das Speichern der Bilddaten der Subpixel SP1 bis SP4 kann auch in der Steuereinheit 8 erfolgen, die zusätzlich als Auswerteeinheit konfiguriert sein kann.

Anschließend werden die resultierenden Bilddaten für weitere Pixelbereiche PB zu den beispielhaft dargestellten Beleuchtungsintervallen B2 und B3 mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelt. Aus den resultierenden Bilddaten einer Vielzahl von Pixelbereichen PB kann in der Folge eine Bilddatei der Probe 6 erstellt werden. Auch diese Schritte können mittels der Steuereinheit 8 ausgeführt werden.

Um Datenmengen beispielsweise einer Bilddatei, die an die Rechner- und Speichereinheit 9 übertragen werden, gering zu halten, wird das erfindungsgemäße Verfahren möglichst lokal, insbesondere mittels der dafür konfigurierten und ausgestatteten Steuereinheit 9, durchgeführt.

Bezugszeichenliste

0
Mikroskop
1
Anordnung
2
Beleuchtungseinrichtung
2.1
Lichtquelle
3
Schaltelement
4
halbdurchlässiger Spiegel
5
Objektiv
6
Probe
7
Detektor
8
Steuereinheit
9
Rechner- und Speichereinheit
SF1
erste Funktion
SF2
zweite Funktion
Fsin
sinusförmige Funktion
BL
Beleuchtungslicht
DL
Detektionslicht
PB
Pixelbereich
SP1
erstes Subpixel
SP2
zweites Subpixel
SP3
drittes Subpixel
SP4
viertes Subpixel
B1 bis B3
erstes bis drittes Beleuchtungsintervall
X
X-Achse
Y
Y-Achse

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • EP 1761071 A1 [0006]
  • WO 2011/038815 A1 [0007]
  • US 2010/0208339 A1 [0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • A. Bell et al.: „High Dynamic Range Images as a Basis for Detection of Argyrophilic Nucleolar Organizer Regions Under Varying Stain lntensities", Proceedings of IEEE International Conference on Image Processing, ICIP 2006, 2541–2544 [0003]