Title:
Nanopartikel, Verfahren zum Nachweis von bestimmten Zellen oder Zelltypen und Verwendung der Nanopartikel
Kind Code:
A1


Abstract:

Es werden Nanopartikel (10) zur Interaktion und insbesondere zum Nachweis von bestimmten Zellen oder Zelltypen bereitgestellt. Die Nanopartikel (10) weisen eine Fluoreszenz-quenchende Oberfläche (12) auf und tragen eine Oligonukleotid-Sequenz (13) mit wenigstens einer Fluorophor-Markierung (14). Weiterhin tragen die Nanopartikel wenigstens ein zellspezifisches Fängermolekül (15).




Inventors:
Brettschneider, Thomas (71229, Leonberg, DE)
Hoffmann, Jochen (71272, Renningen, DE)
Buchkremer, Anne (70193, Stuttgart, DE)
Application Number:
DE102016212848A
Publication Date:
01/18/2018
Filing Date:
07/14/2016
Assignee:
Robert Bosch GmbH, 70469 (DE)
International Classes:



Other References:
XIANG, D. [u.a.]: Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: the Next Generation of Cancer Medicine. Theranostics (2015) 5 (1) 23-42
Claims:
1. Nanopartikel (10) zur Interaktion und insbesondere zum Nachweis von bestimmten Zellen oder Zelltypen (20), dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel (10) eine Nanopartikelstruktur (11) mit einer Fluoreszenz-quenchende Oberfläche (12) aufweist und dass an der Nanopartikelstruktur (11) wenigstens eine Oligonukleotid-Sequenz (13) immobilisiert ist, die wenigstens eine Fluorophor-Markierung (14) trägt, wobei der Nanopartikel weiterhin wenigstens ein zellspezifisches Fängermolekül (15) umfasst.

2. Nanopartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Fluorophor-Markierung (14) an der von der Nanopartikelstruktur (11) abgewandten Seite der Oligonukleotid-Sequenz (13) befindet.

3. Nanopartikel nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die bestimmten Zellen (20) zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind.

4. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotid-Sequenz (13) eine Aptamersequenz, insbesondere eine CTC-spezifische Aptamersequenz, ist.

5. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fängermolekül (15) ein zellspezifischer Antikörper ist, insbesondere Anti-EpCAM.

6. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel (10) ein magnetischer Nanopartikel ist, wobei insbesondere die Nanopartikelstruktur (11) einen magnetischen Kern umfasst, der mit der Fluoreszenz-quenchenden Oberfläche (12) überzogen ist.

7. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nanopartikel (10) eine mit Gold und/oder Silber überzogene Nanopartikelstruktur (11) umfasst.

8. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in die Oligonukleotid-Sequenz (13) Interkalatoren eingelagert sind.

9. Verfahren zum Nachweis von bestimmten Zellen oder Zelltypen (20) in einer Probe unter Verwendung von Nanopartikeln (10) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
– Bereitstellen einer Probe, insbesondere einer biologischen Probe, vorzugsweise einer Blutprobe, eines Individuums,
– Einbringen der Nanopartikel (10) in die Probe,
– Inkubation der Probe,
– Detektion der Fluoreszenzintensität,
– Rückschluss auf die Konzentration der bestimmten Zellen oder Zelltypen (20) in der Probe durch Auswertung der detektierten Fluoreszenzintensität.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass nach oder während der Inkubation der Probe ein externes Magnetfeld (30) angelegt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Inkubation der Probe zusätzlich die UV- und/oder Vis- und/oder IR-spektroskopischen Aktivität der Probe detektiert wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene Nanopartikel (10) verwendet werden, die jeweils spezifisch für bestimmte Zellen oder Zelltypen (20) durch unterschiedliche, zellspezifische Fängermoleküle (15) sind und die vorzugsweise jeweils unterschiedliche Fluorophor-Markierungen (14) tragen.

13. Verwendung von Nanopartikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung von Krebserkrankungen.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel (10) zur Injektion in den Organismus eines Individuums vorgesehen sind und dass nach einer Inkubationszeit eine photothermische Behandlung des Individuums bei einer Nanopartikel-spezifischen Wellenlänge oder eine magnetische Behandlung des Individuums vorgesehen ist.

15. Pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend Nanopartikel (10) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel zum Nachweis von bestimmten Zellen oder Zelltypen, insbesondere von zirkulierenden Tumorzellen, sowie ein Verfahren zum Nachweis von bestimmten Zellen oder Zelltypen unter Verwendung der Nanopartikel und eine therapeutische Verwendung der Nanopartikel.

Stand der Technik

Es ist bereits möglich, mit verschiedenen diagnostischen Methoden eine Vielzahl von Krankheiten anhand einer kleinen Blut- oder Gewebeprobe eines Patienten nachzuweisen. Auch diagnostische Nachweisverfahren direkt am lebenden Organismus sind bekannt. Besondere Bedeutung kommt der Diagnostik im Zusammenhang mit Krebserkrankungen zu, da hier eine Früherkennung der Krebserkrankung oftmals eine entscheidende Voraussetzung für eine erfolgreiche Therapie ist. In der Onkologie spielt beispielsweise der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen (CTC – Circulating Tumor Cells) bei der Früherkennung von Krebserkrankungen als Hinweis auf eine Metastasenbildung eine große Rolle. Da CTCs jedoch oftmals nur in einer sehr geringen Zellanzahl auftreten und die Konzentration beispielsweise unterhalb von 10 Zellen/ml Blut liegt, sind für einen Nachweis von CTCs sehr sensitive und spezifische Methoden erforderlich. In diesem Zusammenhang ist es beispielsweise bekannt, eine mechanische Filtration der Blutzellen vorzunehmen. Da CTCs im Vergleich mit nicht entarteten Blutzellen in der Regel zwei- bis dreifach größer sind, können die CTCs durch eine Größenausschluss-Abtrennung aufkonzentriert und damit leichter nachgewiesen werden. Ein anderer Ansatz arbeitet mit einer Visualisierung von Zellen. Durch spezielle Farbstoffe werden Zellen im Mikroskop sichtbar gemacht und können ausgezählt werden.

Weiterhin ist eine spezifische Fixierung von bestimmten Zellen auf Protein- oder Aptamer-funktionalisierten Oberflächen bekannt. Durch spezifische Fängermoleküle, beispielsweise Antikörper oder Aptamere (Oligonukleotide oder Peptide) werden bestimmte Zielzellen spezifisch gebunden und können auf diese Weise angereichert oder nachgewiesen werden. Ein für eine Interaktion mit Krebszellen bekannter Antikörper in diesem Zusammenhang ist Anti-EpCAM, der mit dem epitelialen Zelladhäsionsmolekül EpCAM auf Epitelzellen wechselwirkt. Es ist weiterhin bekannt, dass CTCs prinzipiell DNA-Sequenzen internalisieren. Innerhalb der Zellen werden die DNA-Moleküle durch spezifische Enzyme geschnitten, was im Zusammenhang mit einer Signalgenerierung diskutiert wird.

Offenbarung der ErfindungVorteile der Erfindung

Die Erfindung stellt einen neuen Ansatz zum Nachweis von bestimmten Zellen oder Zelltypen in Zusammenhang mit der medizinischen Diagnostik und/oder Therapie bereit. Dieser neue Ansatz kann insbesondere im Bereich der Onkologie mit besonderem Vorteil eingesetzt werden und eignet sich vor allem für eine Früherkennung von Krebserkrankungen und/oder für eine Früherkennung einer Metastasenbildung eines Tumors. Der erfindungsgemäße Ansatz basiert auf Nanopartikeln, die eine Nanopartikelstruktur mit einer Fluoreszenz-quenchenden Oberfläche aufweisen. An der Nanopartikelstruktur ist wenigstens eine Oligonukleotid-Sequenz immobilisiert. Die Oligonukleotid-Sequenz trägt eine Fluorophor-Markierung, wobei sich diese Fluorophor-Markierung vorzugsweise an der Seite des Oligonukleotid-Sequenz befindet, die der Nanopartikelstruktur abgewandt ist. Es ist auch möglich, dass sich die Fluorophor-Markierung an einer anderen Position oder anderen Positionen der Oligonukleotid-Sequenz befindet. Weiterhin umfasst der Nanopartikel wenigstens ein zellspezifisches Fängermolekül. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nanopartikel ist ein diagnostischer Nachweis von bestimmten Zellen oder Zelltypen (Zielzellen) möglich, wobei beispielsweise eine Blutprobe eines Patienten mit den Nanopartikeln in Kontakt gebracht wird. Durch das zellspezifische Fängermolekül an dem Nanopartikel werden die Nanopartikel in räumliche Nähe zu den Zielzellen gebracht. Durch zelluläre Mechanismen findet daraufhin eine Internalisierung der Nanopartikel in die Zielzellen statt. Im Inneren der Zelle wird die Oligonukleotid-Sequenz des Nanopartikels durch sequenzspezifische zelluläre Enzyme, beispielsweise Restriktionsenzyme, geschnitten. Weiterhin ist ein sequenzunabhängiges Schneiden mit Hilfe von zellulären Lysosomen (unspezifische Nukleasen) möglich. Hierbei kommt es zu einer Abtrennung der Fluorophor-Markierung, die im Ausgangszustand an der Oligonukleotid-Sequenz gebunden ist. Diese Abtrennung der Fluorophor-Markierung ist detektierbar, da die Fluorophor-Markierung nur im abgetrenntem Zustand als Fluoreszenzsignal erkennbar ist. Im intakten, also ungeschnittenen Zustand der Nanopartikel tritt durch die räumliche Nähe zwischen der Fluoreszenz-quenchende Oberfläche und der Fluoreszenz-Markierung keine Fluoreszenz auf.

Die Oligonukleotid-Sequenz des Nanopartikels ist vorzugsweise an die jeweilige Zielzelle angepasst bzw. entsprechend ausgewählt. Es kann sich um einen Doppelstrang oder um einen Einzelstrang handeln. In besonders bevorzugter Weise handelt es sich um eine Aptamersequenz, deren Wechselwirkung mit der Zielzelle bekannt ist. Als Oligonukleotid-Sequenzen können vor allem DNA-Sequenzen eingesetzt werden, aber auch die Verwendung von RNA-Sequenzen ist möglich. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist der Nanopartikel für eine Interaktion mit CTCs eingerichtet, wobei vorzugsweise eine CTC-spezifische Aptamersequenz eingesetzt wird.

Das Fängermolekül ist zielzellspezifisch. Bei dem Fängermolekül kann es sich insbesondere um einen zellspezifischen Antikörper handeln, der spezifisch gegen eine bestimmte Zellspezies oder gegen einen bestimmten Zelltyp gerichtet ist. Als spezifisches Fängermolekül für CTCs kann mit besonderem Vorteil beispielsweise der Antikörper Anti-EpCAM eingesetzt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Ansatz ist es dabei möglich, CTCs im Blut eines Patienten in sehr sensitiver Weise nachzuweisen und zu quantifizieren. Der erfindungsgemäße Ansatz ist nicht auf CTCs oder andere Krebszellen als Zielzellen beschränkt. Beispielsweise kann das Design der Nanopartikel auch auf eine Interaktion mit Bakterien oder Pilzzellen ausgerichtet werden.

Bei dem Design des Nanopartikels im Hinblick auf die Fluoreszenzeigenschaften wird zweckmäßigerweise berücksichtigt, dass der Abstand zwischen der Fluorophor-Markierung und der Fluoreszenz-quenchenden Oberfläche des Partikels bei einer intakten Oligonukleotid-Sequenz nur so groß ist, dass die Fluoreszenz-quenchenden Eigenschaften erhalten bleiben. Hierbei wird insbesondere der Durchmesser der Nanopartikelstruktur und/oder die Dicke der Beschichtung und/oder die Beschaffenheit des Partikels und/oder die Länge der Oligonukleotid-Sequenz bei dem Design des Partikels berücksichtigt.

Durch das Fängermolekül wird eine räumliche Nähe zwischen den Zielzellen und dem Nanopartikel hergestellt, damit eine Internalisierung des Nanopartikels durch zelluläre Mechanismen stattfinden kann. Im Prinzip kann sich das Fängermolekül an irgendeiner Stelle des Nanopartikels befinden. In besonders bevorzugter Weise ist das Fängermolekül auf der von dem Nanopartikel abgewandten Seite der Oligonukleotid-Sequenz angeordnet.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Nanopartikels ist der Nanopartikel magnetisch. Insbesondere kann die Nanopartikelstruktur einen magnetischen Kern aufweisen, der von einer Fluoreszenz-quenchenden Oberfläche überzogen ist. In dieser Ausführungsform können die Zielzellen, die die Nanopartikel internalisiert haben, durch Anlegen eines magnetischen Feldes aufkonzentriert werden, wodurch sich die Signalstärke erhöht und die Nachweisbarkeit der Fluoreszenz verbessert.

Weiterhin kann es sich bei den erfindungsgemäßen Nanopartikeln um mit Gold und/oder Silber überzogene Nanopartikel handeln, die eine besonders gute Biokompatibilität und damit Verträglichkeit zeigen. Der Gold- oder der Silberüberzug hat hierbei die Fluoreszenz-quenchenden Eigenschaften. Weiterhin sind derartige Nanopartikel auch im Hinblick auf ihre optischen Eigenschaften (Plasmoneneffekte) besonders vorteilhaft. Hierbei sind je nach Größe der Gold- bzw. Silber-Nanopartikel und in Abhängigkeit von der Schichtdicke der Gold- oder Silberschicht die jeweiligen Proben, die mit diesen

Partikeln versetzt werden, unterschiedlich gefärbt, was beispielsweise bei einer spektrometrischen Analyse ausgewertet werden kann (z. B. Goldpartikel – rote Signatur, Silberpartikel – gelbe Signatur). Dieses Signal kann zusätzlich als Kontrollmechanismus bei der Auswertung der Fluoreszenz einbezogen werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Ansatzes sind in die Oligonukleotid-Sequenz Interkalatoren eingelagert, die insbesondere für therapeutische Zwecke genutzt werden können. Hierbei werden diese Interkalatoren während der Spaltung der Oligonukleotid-Sequenz nach der Internalisierung des erfindungsgemäßen Nanopartikels in der Zielzelle freigesetzt. Sie interagieren daraufhin mit der zellulären DNA oder RNA und stören damit die zellulären Prozesse beispielsweise bei der Teilung, sodass dadurch eine Schädigung der jeweiligen Zielzellen eintritt. Beispiele für geeignete Interkalatoren sind Ethidiumbromid oder Dapi (4‘,6-Diamidin-2-phenylindol). Die Interkalatoren können selbst Fluorophore sein. Dies sollte bei der Fluoreszenzauswertung des erfindungsgemäßen Ansatzes durch entsprechende Wahl der eigentlichen Fluorophor-Markierung und der Auswertungswellenlängen berücksichtigt werden. Sofern die Interkalatoren selbst Fluorophore sind, ist es auch möglich, dass die Interkalatoren als Fluorophor-Markierung verwendet werden.

Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis, insbesondere zum diagnostischen Nachweis, von bestimmten Zellen oder Zelltypen (z. B. CTCs) in einer Probe, insbesondere einer biologischen Probe, unter Verwendung der beschriebenen Nanopartikel. Hierbei wird zunächst eine Probe bereitgestellt, beispielsweise eine Blutprobe eines Patienten. In die Probe werden die erfindungsgemäßen Nanopartikel eingebracht. Während einer nachfolgenden Inkubationszeit der Probe werden die Nanopartikel in der oben beschriebenen Weise von den Zielzellen internalisiert. In der Folge werden die Oligonukleotid-Sequenzen der Nanopartikel in den Zielzellen spezifisch oder unspezifisch geschnitten. Anschließend erfolgt eine Detektion der Fluoreszenzintensität, die nur auftritt, wenn es tatsächlich zu einem Schneiden der Oligonukleotid-Sequenzen und damit zu einer Abtrennung der Fluorophor-Markierung bzw. zu einem Freisetzen der fluoreszierenden Interkalatoren, die als Fluorophor-Markierung genutzt werden können, gekommen ist. Die messbare Fluoreszenzintensität erlaubt dabei einen Rückschluss auf die Anwesenheit und/oder die Konzentration der Zielzellen in der Probe, sodass durch eine Auswertung der Fluoreszenzintensität unter Berücksichtigung der verwendeten Probenmenge bzw. des Ausgangsvolumens der Probe im Prinzip eine Bestimmung der spezifischen Zellkonzentration, beispielsweise semiquantitativ, in der Probe und damit ein diagnostischer Nachweis geführt werden kann. Unter „Rückschluss auf die Konzentration der Zielzellen“ ist beispielsweise auch zu verstehen, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren festgestellt werden kann, ob eine bestimmte Zellspezies, z. B. bestimmte Krebszellen, in der Probe vorhanden ist oder nicht. Dieses diagnostische Verfahren erfolgt vorzugsweise in vitro nach Entnahme einer Probe, beispielsweise einer Blutprobe. Prinzipiell ist es aber auch möglich, einen diagnostischen Nachweis in vivo durchzuführen, wobei eine geeignete Menge der Nanopartikel in die Blutbahn eines Patienten injiziert wird.

Durch die Verwendung von magnetischen Nanopartikeln kann das diagnostische Verfahren weiter verbessert werden, indem nach oder während der Inkubation der Probe ein externes Magnetfeld angelegt wird. Hierdurch können die Zielzellen, die die magnetischen Nanopartikel internalisiert haben, aufkonzentriert werden, wodurch sich die Nachweisbarkeit insbesondere bei geringer Zellkonzentration in der Probe weiter verbessert.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt neben einer Auswertung der Fluoreszenzintensität auch eine Vermessung der UV- und/oder Vis- und /oder IR-spektroskopischen Aktivität der Probe. Hierdurch können weitere Informationen erhalten werden, beispielsweise zum allgemeinen Proteingehalt der Probe, die für eine Referenzierung verwendet werden kann. Weiterhin können beispielsweise bei der Verwendung von Gold- oder Silbernanopartikeln durch eine weitergehende spektroskopische Auswertung der Probe Informationen über das Ausmaß einer erfolgten Internalisierung der Nanopartikel erhalten werden. Insbesondere ist durch eine zusätzliche Analyse der US/Vis/IR-spektroskopischen Aktivität, mit der gewissermaßen die Farbe der Nanopartikel ausgewertet wird, ein weiterer Kontrollmechanismus bzw. eine Referenz möglich, sodass die Auslesung der Fluoreszenzaktivität sehr genaue Ergebnisse liefert.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. des erfindungsgemäßen Ansatzes ist, dass der diagnostische Nachweis kontaktfrei und bis auf die Entnahme beispielsweise der Blutprobe nicht invasiv erfolgt. In der Regel ist hierfür kein besonders geschultes Personal erforderlich, sodass der Nachweis kostengünstig und mit wenig Zeit durchgeführt werden kann. Aufgrund der hohen Spezifität des erfindungsgemäßen Ansatzes kann ein Nachweis selbst bei sehr geringer Konzentration der Zielzellen durchgeführt werden, sodass für die erfindungsgemäße Diagnose selbst Kleinstmengen einer Probe bei nur geringer Konzentration der Zielzellen ausreichend sein können. Durch die hohe Spezifität des Ansatzes können vor allem auch falsch-positive Ergebnisse nahezu ausgeschlossen und Querkontaminationen vermieden werden.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens werden verschiedene Nanopartikel oder verschiedene Varianten der Nanopartikel gleichzeitig bzw. in einem Ansatz verwendet, wobei die verschiedenen Nanopartikel jeweils spezifisch für bestimmte Zielzellen sind und wobei die verschiedenen Nanopartikel vorzugsweise jeweils unterschiedliche Fluorophor-Markierungen tragen. Hierdurch können in einem Ansatz mehrere unterschiedliche Zellen oder Zelltypen (z. B. unterschiedliche Krebszellen oder Bakterien oder Pilze oder anderes) parallel analysiert werden, sodass durch Auswertung von verschiedenen Emissionswellenlängen bei der Fluoreszenzanalyse ein Multiplexing mit parallelem Nachweis von unterschiedlichen Zielzellen durchgeführt werden kann.

Die beschriebenen Nanopartikel können auch therapeutisch, insbesondere zur Behandlung von Krebserkrankungen, genutzt werden. Hierbei dienen die durch die Zielzellen internalisierten Nanopartikel als Aktuatoren, die beispielsweise durch eine Laserbestrahlung oder durch externe Magnetfelder angeregt werden, um die jeweiligen Zielzellen gewissermaßen von innen her vor allem durch das Einbringen von thermischer Energie anzugreifen und zu zerstören. In diesem Zusammenhang können auch Interkalatoren, die in der Oligonukleotid-Sequenz der Nanopartikel gegebenenfalls eingelagert sind, zum Einsatz kommen. Die Interkalatoren werden nach der Internalisierung der Nanopartikel in der Zielzelle z. B. durch enzymatische Spaltung oder durch photothermische oder magnetothermische Hitze freigesetzt und stören dann die zellulären Abläufe durch Einlagerung in zelluläre DNA oder RNA, sodass die Zielzellen geschwächt werden. Die Erfindung umfasst daher auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel zur therapeutischen Behandlung von Krebserkrankungen. Hierbei werden die Nanopartikel beispielsweise in die Blutbahn oder in ein betroffenes Organ oder direkt in einen Tumor eines Individuums injiziert. Nach einer gewissen Inkubationszeit kann dann beispielsweise eine photothermische Behandlung bei einer Nanopartikel-spezifischen Wellenlänge oder eine magnetische Behandlung des Patienten erfolgen. Die Erfindung bezieht sich hierbei insbesondere auf die Verwendung der Nanopartikel für die Herstellung einer entsprechenden therapeutischen Applikationsform (pharmazeutische Zusammensetzung) der Nanopartikel und auf eine entsprechende therapeutische Zusammensetzung, die neben den Nanopartikeln auch einen geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Je nach Spezifität der Nanopartikel ist dieser therapeutische Ansatz für die Behandlung verschiedener Krebserkrankungen prinzipiell geeignet. Wenn die erfindungsgemäßen Nanopartikel beispielsweise in der oben beschriebenen Weise für eine Interaktion mit CTCs eingerichtet sind, können hiermit Krebserkrankungen behandelt werden, bei denen derartige zirkulierende Tumorzellen auftreten. Das Gleiche gilt für die diagnostische Anwendung. Die diagnostische Anwendung und die therapeutische Anwendung der Nanopartikel können gegebenenfalls auch miteinander kombiniert werden.

Schließlich umfasst die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die beschriebenen erfindungsgemäßen Nanopartikel sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.

In den Zeichnungen zeigen:

1 schematische Darstellung der Komponenten eines erfindungsgemäßen Nanopartikels;

2A–C schematische Darstellung der Interaktion eines erfindungsgemäßen Nanopartikels mit einer Zielzelle zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Ansatzes; und

3 schematische Darstellung der Einwirkung eines elektromagnetischen Feldes auf Zielzellen mit internalisierten Nanopartikeln.

Beschreibung von Ausführungsbeispielen

1 illustriert in schematischer Weise den Aufbau bzw. das Design eines erfindungsgemäßen Nanopartikels 10. Der eigentliche Nanopartikel im engeren Sinne oder die Nanopartikelstruktur 11 wird von einem Kern gebildet, insbesondere einem magnetischen Kern, der von einer Schale, z. B. einer Goldschale, umgeben ist. Eine wesentliche Eigenschaft der umgebenden Schale ist, dass diese Schale eine Fluoreszenz-quenchende Oberfläche 12 bildet. Vorzugsweise ist der Nanopartikelstruktur 11 mit der Schale bzw. Oberfläche 12 kompatibel mit einer einfachen Oberflächenchemie, sodass die Immobilisierung oder Fixierung der übrigen Komponenten des Nanopartikels mit an sich üblichen Methoden erfolgen kann. An der Oberfläche 12 des Nanopartikels ist eine Oligonukleotid-Sequenz 13 (z. B. DNA-Sequenz) immobilisiert, beispielsweise eine CTC-spezifische DNA-Aptamer-Sequenz. Die Oligonukleotid-Sequenz 13 liegt bei physiologischen Bedingungen beispielsweise als Doppelstrang in hybridisierter Form oder als durchgängiger Einzelstrang vor. An dem Ende der Oligonukleotid-Sequenz 13, das der Partikelstruktur 11 abgewandt ist, ist eine Fluorophor-Markierung 14, also ein Fluoreszenzmarker, gebunden. Aufgrund der räumlichen Nähe zu der Fluoreszenz-quenchenden Oberfläche 12 wird die Fluoreszenz bei der hier gezeigten intakten Form des Nanopartikels 10 gequencht bzw. ausgelöscht, so dass keine Fluoreszenzaktivität messbar ist. Weiterhin umfasst der Nanopartikel 10 ein zellspezifisches Fängermolekül 15, z. B. Anti-EpCAM. Das Fängermolekül 15 ist in dieser Ausgestaltung an die Fluorophor-Markierung 14 angebunden, kann aber auch an einer anderen Stelle des Nanopartikels immobilisiert sein. Durch das Fängermolekül 15 wird eine spezifische Anbindung des Nanopartikels 10 an eine Zielzelle und damit eine enge räumliche Nähe bewirkt, die zu einer Internalisierung des Nanopartikels 10 in die Zellzelle führt. Durch das zellspezifische Fängermolekül wird dabei gewissermaßen eine zellspezifische Funktionalisierung des Nanopartikels 10 vorgenommen.

2A–C illustriert die wesentlichen Schritte bei der Interaktion des Nanopartikels 10 mit einer Zielzelle 20. 2A zeigt die Zielzelle 20 (z. B. CTC), die ein spezifisches Oberflächenmolekül 21 (z. B. EpCAM oder einen anderen zellulären Rezeptor) trägt, das mit dem spezifischen Fängermolekül 15 (z. B. Anti-EpCAM) des Nanopartikels 10 interagiert. Durch die spezifische Wechselwirkung des Oberflächenmoleküls 21 mit dem Fängermolekül 15 des Nanopartikels 10 kommt es zu einer Anbindung des Nanopartikels 10 an die Zielzelle 20 und zu einer Internalisierung des Nanopartikels 10 in das Innere der Zielzelle 20 (2B) durch zelluläre Mechanismen, die hier im Einzelnen nicht dargestellt sind. Innerhalb der Zelle 20 kommt es zu einer enzymatischen sequenzspezifischen oder unspezifischen Spaltung der Oligonukleotid-Sequenz 13 (2C). Durch die Spaltung der Oligonukleotid-Sequenz 13 wird die Fluorophor-Markierung 14 von der quenchenden Oberfläche 12 getrennt. In der Zelle 20 liegen nun nebeneinander auf der einen Seite die Nanopartikelstruktur 11, 12, gegebenenfalls mit einem Fragment der Oligonukleotid-Sequenz 13, und auf der anderen Seite in davon getrennter Weise die Fluorophor-Markierung 14, gegebenenfalls mit einem weiteren Fragment der Oligonukleotid-Sequenz 13, vor. In diesem Zustand fluoresziert die Fluorophor-Markierung 14 in messbarer Weise, sodass mit einer hohen Spezifität eine entsprechende Zielzelle nachgewiesen werden kann.

Wenn der Nanopartikels 10 einen Kern aus einem magnetischen Material aufweist, beispielsweise aus Fe3O4, kann durch Anlegen eines externen magnetischen Feldes 30 eine Separierung und Aufkonzentrierung der markierten Zielzellen 20 erfolgen (3), sodass die Nachweisgrenze für die Auswertung der Fluoreszenzaktivität weiter verbessert werden kann. Ein entsprechender Nanopartikel 10 kann im Hinblick auf die Kern-Schale-Struktur beispielsweise im Prinzip hergestellt werden, wie es von I. Robinson (Nanoscale 2 (2010) 2624–2630) beschrieben ist, wobei ein Kern aus Eisenoxid mit einer Fluoreszenz-quenchenden Oberfläche überzogen wird. Wenn solche magnetischen Nanopartikel, die auf dieser Basis und durch Immobilisierung der weiteren erfindungswesentlichen Komponenten in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurden, mit den Zielzellen 20 in Kontakt gebracht werden, und nach der Internalisierung der erfindungsgemäßen Nanopartikel 10 ein Magnetfeld 30 angelegt wird, konzentrieren sich die Nanopartikel 10 mit den magnetischen Kernen 11 im Bereich des Magnetfeldes. Dies gilt sowohl für die internalisierten Nanopartikel als auch für die nicht-internalisierten Nanopartikel. Da aber nur bei den internalisierten Nanopartikeln die Fluorophor-Markierung von der quenchenden Oberfläche getrennt ist, entwickeln nur die internalisierten Nanopartikel eine Fluoreszenz. Insgesamt kann mittels des magnetischen Feldes durch eine lokale Aufkonzentrierung der Nanopartikel die Signalstärke deutlich erhöht werden. Wenn der erfindungsgemäße Ansatz beispielsweise in einem üblichen Reaktionsgefäß durchgeführt wird, können durch ein seitlich angelegtes Magnetfeld die Nanopartikel (mit und ohne Zellen) an den Rand des Reaktionsgefäßes gezogen werden, wodurch sich der Abstand zu einem Fluoreszenzdetektor verringert und sich das Messsignal erhöht, sodass die Nachweisbarkeit verbessert wird.

Im Hinblick auf eine therapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel können die Nanopartikel nach deren Internalisierung in die Zielzellen beispielsweise durch Einkopplung von Licht erhitzt werden, um thermische Energie in das System einzubringen und damit die Zielzellen zu schädigen. Zur Illustrierung dieses Aspektes der Erfindung kann in 3 der Pfeil 30 auch als Energiequelle, beispielsweise als Lichtquelle, interpretiert werden. Hierfür besonders geeignet sind Nanopartikel mit einem Kern-Schale-Aufbau, wobei beispielsweise ein Kern aus magnetischem Material mit einer Schale aus einer Gold- oder Silberschicht besonders geeignet ist. Derartige Partikel können photothermisch mittels Laserlicht mit einer partikelspezifischen Wellenlänge bestrahlt werden, um die Zielzellen gezielt und spezifisch im Rahmen einer Therapie zu zerstören. Aufgrund der plasmonischen Eigenschaften beispielsweise der Goldschicht wird dieses Licht in Form von Wärme an die direkte Umgebung des Partikels abgegeben, sodass bei geeigneten Laserparametern die Zellmembranen der jeweiligen Zielzellen thermisch zerstört werden. Wenn die Nanopartikel beispielsweise auf CTCs ausgerichtet sind, kann mit diesem Ansatz in sehr spezifischer Weise eine Metastasenbildung bekämpft werden.

Für einen therapeutischen Einsatz der Nanopartikel kann beispielsweise auch ein externes magnetisches Wechselfeld für eine thermische Erhitzung der mit Hilfe der Nanopartikel gewissermaßen markierten Zielzellen genutzt werden. Dies ist beispielsweise durch die Induktion von Wirbelströmen und der daraus folgenden Abgabe Joulescher Wärme möglich. Alternativ kann beispielsweise eine Bewegung der internalisierten Nanopartikel im externen Wechselfeld genutzt werden, um die Zellmembranen der Zielzellen mechanisch zu zerstören.

Auch im Hinblick auf eine therapeutische Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel ist ein Multiplexing möglich, indem beispielsweise verschiedene Nanopartikel eingesetzt werden, die jeweils spezifisch für bestimmte Zielzellen sind. Diese verschiedenen Nanopartikel können durch unterschiedliche Plasmonresonanzfrequenzen gekennzeichnet sein, was beispielsweise durch eine Variation des Partikeldurchmessers und/oder der Dicke der metallischen Schale erreicht wird. Dadurch ist es möglich, verschiedene Zielzellen über diese verschiedenen Nanopartikel mit unterschiedlichen Resonanzfrequenzen gezielt therapeutisch zu adressieren.

Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können beispielsweise durch Reduktion von Eisenacetat mittels Oleylamin und Ölsäure zur Bildung eines Kerns aus Eisenoxid (z. B. Fe3O4) und anschließender Reduktion von Goldsalzen in an sich bekannter Weise hergestellt werden, bevor eine Immobilisierung der weiteren erfindungsgemäßen Komponenten der Nanopartikel erfolgt. Eine geeignete Größe der Nanopartikel liegt beispielsweise in einem Bereich des Durchmessers zwischen circa 10 nm und 100 µm, wobei der Durchmesser vorzugsweise unterhalb von 500 nm liegt. Die Schichtdicke beispielsweise einer Gold- oder Silberschale kann beispielsweise zwischen 2 und 50 nm liegen, vorzugsweise unterhalb 20 nm. Geeignete Fluorophore für die Fluorophor-Markierung sind beispielsweise Cyanin-Farbstoffe, beispielsweise Cy3 oder Cy5, oder Fluorescein (FAM) oder fluoreszierende Interkalatoren, z. B. Ethidiumbromid oder Dapi (4',6'-Diamidin-2 phenylindol).

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • I. Robinson (Nanoscale 2 (2010) 2624–2630) [0027]