Title:
Verfahren zum Nachweis von biologisch aktiven Pflanzenpathogenen
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von biologisch aktiven Pflanzenpathogenen in pflanzlichem Erntegut, welches die Schritte umfasst Bereitstellen einer Probe von pflanzlichem Erntegut, das vermutlich Pflanzenpathogene enthält, Bestimmen von RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogene vorliegt und Erbringen des Nachweises von Pflanzenpathogenen im Entegut in Fällen, in denen RNA bestimmt werden konnte. Die Erfindung betrifft auch einen Kit zur Durchführung des Verfahrens. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Effizienz einer Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung von pflanzlichem Erntegut umfassend Bereitstellen einer ersten Probe von pflanzlichem Erntegut vor und einer zweiten Probe von pflanzlichem Erntegut nach der Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung, Bestimmen der Menge von DNA und RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogenen vorliegt, in der ersten und in der zweiten Probe von pflanzlichem Erntegut und Bilden eines Verhältnisses der Menge von DNA zu RNA in der ersten und in der zweiten Probe und in Bezug setzen der Verhältnisse aus erster und zweiter Probe zueinander, wobei das Verhältnis der Menge von DNA zu RNA in der zweiten Probe im Vergleich zum Verhältnis der Menge von DNA zu RNA in der ersten Probe ein Indikator für den Anteil an biologisch aktiven Pflanzenpathogenen im pflanzlichem Erntegut ist.




Inventors:
Broer, Inge, Prof. Dr. (18055, Rostock, DE)
Huckauf, Jana, Dr. (18069, Rostock, DE)
Prelwitz, Andreas, Dipl.- Ing. (19374, Obere Warnow, DE)
Söffing, Roland (16945, Meyenburg, DE)
Application Number:
DE102016207147A
Publication Date:
11/02/2017
Filing Date:
04/27/2016
Assignee:
Nordkorn Saaten GmbH, 18273 (DE)
Universität Rostock, 18055 (DE)
International Classes:



Other References:
DOOHAN, F.M. [u.a.]: Development and Use of a Reverse Transcription-PCR Assay To Study Expression of Tri5 by Fusarium Species In Vitro and In Planta. Appl. Environ. Microbiol. (1999) 65 (9) 3850-4
Attorney, Agent or Firm:
Dick, Alexander, Dipl.-hum.-Biol. Dr.rer.physiol., 68167, Mannheim, DE
Claims:
1. Verfahren zum Nachweis von biologisch aktiven Pflanzenpathogenen in pflanzlichem Erntegut umfassend:
a) Bereitstellen einer Probe von pflanzlichem Erntegut, das vermutlich Pflanzenpathogene enthält;
b) Bestimmen von RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogene vorliegt; und
c) Erbringen des Nachweises von Pflanzenpathogenen im pflanzlichen Erntegut in Fällen, in denen RNA bestimmt werden konnte.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pflanzenpathogen ein Bakterium oder ein Virus ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pflanzenpathogen ein Pilz ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Pilz aus der Gattung Fusarium oder Tilletia stammt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die RNA mindestens eines Genes bestimmt wird, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Nachweis der RNA mittels Polymerase-Kettenreaktion erfolgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das pflanzliche Erntegut ein pflanzliches Lebens- oder Futtermittel oder pflanzliches Saatgut ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das pflanzliche Erntegut aus einer Nutzpflanze gewonnen wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Nutzpflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Weizen, Gerste, Hafer, Roggen, Soja, Gerste, Hirse, Dinkel, Reis und Mais.

10. Kit zur Bestimmung von Pflanzenpathogenen in pflanzlichem Erntegut umfassend mindestens ein Agens zum Nachweis der RNA mindestens eines Genes, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist.

11. Kit nach Anspruch 10, wobei das Agens (i) eine Nukleinsäuresonde umfasst, die spezifisch mit dem mindestens einen Gen hybridisiert, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist oder (ii) Nukleinsäure-Primer umfasst, die die spezifische Amplifikation eines Fragments des mindestens einen Gens erlauben, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist.

12. Verfahren zur Bestimmung der Effizienz einer Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung von pflanzlichem Erntegut umfassend:
a) Bereitstellen einer ersten Probe von pflanzlichem Erntegut vor und einer zweiten Probe von pflanzlichem Erntegut nach der Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung;
b) Bestimmen der Menge von DNA und RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogenen vorliegt, in der ersten und in der zweiten Probe von pflanzlichem Erntegut;
c) Bilden eines Verhältnisses der Menge von DNA zu RNA in der ersten und in der zweiten Probe und in Bezug setzen der Verhältnisse aus erster und zweiter Probe zueinander, wobei das Verhältnis der Menge von DNA zu RNA in der zweiten Probe im Vergleich zum Verhältnis der Menge von DNA zu RNA in der ersten Probe ein Indikator für den Anteil an biologisch aktiven Pflanzenpathogenen im pflanzlichem Erntegut ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Anteil an pflanzlichem Erntegut mit der Effizienz der Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung korreliert.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Verhältnis der Quotient aus der Menge DNA und der Menge RNA (DNA/RNA) ist und ein größerer Quotient in der zweiten im Vergleich zur ersten Probe ein Indikator für eine erfolgreiche Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung ist und ein kleiner oder unveränderter Quotient in der zweiten im Vergleich zur ersten Probe ein Indikator für eine fehlgeschlagene Anti-Pflanzenpathogen Behandlung ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 13, wobei die Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung eine Elektronenbehandlung, ein chemisches Beizverfahren und/oder eine Heißwasserbeize umfasst.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft Analyseverfahren für die Saatgut- und Lebensmittelkontrolle. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zum Nachweis von biologisch aktiven Pflanzenpathogenen in pflanzlichem Erntegut, welches die Schritte umfasst Bereitstellen einer Probe von pflanzlichem Erntegut, das vermutlich Pflanzenpathogene enthält, Bestimmen von RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogene vorliegt und Erbringen des Nachweises von Pflanzenpathogenen im Erntegut in Fällen, in denen RNA bestimmt werden konnte. Die Erfindung betrifft auch einen Kit zur Durchführung des Verfahrens. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Effizienz einer Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung von pflanzlichem Erntegut umfassend Bereitstellen einer ersten Probe von pflanzlichem Erntegut vor und einer zweiten Probe von pflanzlichem Erntegut nach der Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung, Bestimmen der Menge von DNA und RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogenen vorliegt, in der ersten und in der zweiten Probe von pflanzlichem Erntegut und Bilden eines Verhältnisses der Menge von DNA zu RNA in der ersten und in der zweiten Probe und in Bezug setzen der Verhältnisse aus erster und zweiter Probe zueinander, wobei das Verhältnis der Menge von DNA zu RNA in der zweiten Probe im Vergleich zum Verhältnis der Menge von DNA zu RNA in der ersten Probe ein Indikator für den Anteil an biologisch aktiven Pflanzenpathogenen im pflanzlichem Erntegut ist.

Der Befall mit Pflanzenpathogenen, beispielsweise mit Pilzen, Bakterien oder Viren, stellt ein großes Problem in der Produktion und der Verwertung von pflanzlichem Erntegut dar. In der Getreideproduktion können Pilze wie Fusarium und Steinbrand vollständige Ernten vernichten, da sie nicht nur zu Ertragsverlusten führen, sondern, durch die Bildung von Mycotoxinen, das Getreide für die Verwertung als Nahrungs- und Futtermittel nicht mehr zulässig ist. Zusätzlich reduzieren Pilze auch die Lagerfähigkeit und scheinbar ebenfalls die Keimfähigkeit von Saatgut.

Die Bekämpfung von Pflanzenpathogenen in pflanzlichem Erntegut erfolgt zumeist über chemische Beizung des Saatguts oder durch die Applikation von entsprechenden Wirkstoffen, beispielsweise Fungizide oder Antibiotika, nach dem Auflaufen auf die Pflanzen. Im Ökolandbau wird zur Bekämpfung von Pflanzenpathogenen im Wesentlichen die Heißwasserbeize angewendet, die eine Menge Probleme mit sich bringt. Es ist zum einen sehr viel Energie nötig, um das Wasser zu erhitzen und somit die Pflanzenpathogenen abzutöten, zum anderen muss anschließend wiederum Energie zur Trocknung des Saatguts aufgebracht werden. Weiterhin besteht eine negative Korrelation von Behandlungserfolg, welcher stark von der von der Temperatur des Wassers abhängig ist, und der Keimfähigkeit des Saatguts. Seit einigen Jahren hat sich die Elektronenbehandlung von Saatgut immer mehr durchgesetzt. Bisher konnte der Effekt der Behandlung aber nur in Feldversuchen getestet werden. Diese sind zum einen langwierig, zum anderen wirken weitere Faktoren während des Anbaus ein, die eindeutige Zuordnungen zum Effekt der Elektronenbehandlung erschweren.

Bis heute wird die Belastung von Getreide mit Pflanzenpathogenen, insbesondere Pilzen, im Wesentlichen durch zeitraubende Keimversuche gemessen. Hierbei werden beispielsweise über Nährmedien die Sporen der Pilze zur Keimung und zum Wachstum angeregt. Nach einem definierten Zeitraum von 7 bis 10 Tagen ist eine qualitative Auswertung möglich, wobei jedoch eine Quantifizierung des Befalls nicht gegeben ist. Eine weitere Methode stellt die Filtrationsmethode dar, wobei die anhaftenden Pilzsporen durch Schütteln vom Saatkorn gelöst werden. Dabei werden die Sporen auf einem Filterpapier gesammelt und anschließend mit einem Mikroskop ausgezählt.

Die Entwicklung schneller und einfacher Verfahren zur Bestimmung von Pflanzenpathogenen, welche beispielsweise der Überprüfung des Effekts von physikalischen und chemischen Saatgutbehandlungsmethoden dienen, Anhaltspunkte liefern können, ob eine Behandlung des pflanzlichen Ernteguts überhaupt notwendig ist und auch zur Kontrolle der Belastung vom Verzehrgut im menschlichen als auch tierischen Bereich eingesetzt werden können, wäre daher wünschenswert.

Als der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe kann daher die Bereitstellung eines schnellen und einfachen Verfahrens, das biologisch aktive Pflanzenpathogene in pflanzlichem Erntegut nachweist, angesehen werden. Die Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen und nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen gelöst.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Nachweis von biologisch aktiven Pflanzenpathogenen in pflanzlichem Erntegut umfassend:

  • a) Bereitstellen einer Probe von pflanzlichem Erntegut, das vermutlich Pflanzenpathogene enthält;
  • b) Bestimmen von RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogene vorliegt; und
  • c) Erbringen des Nachweises von Pflanzenpathogenen im pflanzlichen Erntegut in Fällen, in denen RNA bestimmt werden konnte.

Das vorliegende Verfahren kann neben den zuvor genannten Schritten auch noch weitere Schritte umfassen. Diese Schritte können sein: Das Ernten von Pflanzen für die Verarbeitung der abgeernteten Pflanzen zum pflanzlichen Erntegut. Die Verarbeitung der abgeernteten Pflanzen zum pflanzlichen Erntegut. Behandlung, wie die andernorts beschriebene Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung von pflanzlichem Erntegut, vor und nach dem Nachweis von biologisch aktiven Pflanzenpathogenen. Die Lagerung von pflanzlichem Erntegut. Die Vernichtung von pflanzlichem Erntegut nach erfolgtem Nachweis von biologisch aktiven Pflanzenpathogenen.

Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren auch den Nachweis von DNA umfassen, von der die RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogene vorliegt, transkribiert wird. Der Nachweis der DNA kann vor oder nach dem Nachweis der RNA erfolgen. Sofern DNA nachgewiesen wird, ist die Anwesenheit des biologisch aktiven oder inaktiven Pflanzenpathogenen in der Probe wahrscheinlich. Sofern der Nachweis der RNA erbracht ist, ist die Anwesenheit von biologisch aktiven Pflanzenpathogenen wahrscheinlich.

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise automatisiert werden. Hierzu kann die Probenbehandlung und/oder der Nachweis durch geeignete Analyse-Roboter und Nukleinsäure-Analysegeräte, wie PCR Analysern, unterstützt werden. Die Sequenz-Auswertung und die Identifizierung des Pflanzenpathogens kann computerunterstützt durchgeführt werden.

Der Begriff „Nachweis“ wie hier verwendet umfasst die qualitative, semi-quantitative und/oder quantitative Bestimmung der Anwesenheit und/oder der Menge von biologisch aktiven Pflanzenpathogenen in der Probe. Die Bestimmung der Anwesenheit schließt im Rahmen der Erfindung auch die Bestimmung der Identität des Pflanzenpathogens ein. Aufgrund der hier beschriebenen spezifischen Nachweisverfahren für die RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogene vorliegt, können also die Anwesenheit und die Identität des Pflanzenpathogens in der Probe bestimmt werden und dessen Menge. Wie die RNA bestimmt und der Nachweis im Detail erbracht werden kann, wird andernorts genauer beschrieben.

Der Begriff „pflanzliches Erntegut“ im Sinne der Erfindung umfasst jegliche Teile einer Pflanze, die geerntet werden können. Hierzu zählen ganze Pflanzen, Sprossen oder Pflanzenteile wie Blätter, Stängel, Wurzeln, Früchte und Samen. Bevorzugt wird das Erntegut aus Nutzpflanzen bzw. Kulturpflanzen gewonnen, die unter anderem als Nahrungsmittel, Genussmittel oder Heilpflanzen für Menschen, als Viehfutter oder für technische Zwecke Verwendung finden. Der Begriff umfasst neben dem primären Erntegut im Sinne Erfindung auch aus dem zuvor beschriebenen primären Erntegut unmittelbar erhaltene, pflanzliche Produkte. Hierzu zählen z.B. Produkte wie Trockenpräparate, z.B. getrocknete Blätter, Pulver, die aus dem primären Erntegut ohne weitere Verarbeitungsschritte gewonnen werden oder Presslinge, z.B. Pellets, die als Futtermittel eingesetzt werden. Weiterhin kommen gefrorene Produkte oder gefriergetrocknete Produkte in Betracht. Bevorzugt stammt das Erntegut von einer Nutzpflanze und besonders bevorzugt von einer Nutzpflanzen ausgewählt aus folgender Gruppe: Gemüse und Salatpflanzen wie Tomaten, Salatsorte, Paprika, Kohlsorten, Leguminosen, wie Erbsen, Bohnen, Kichererbsen, Linsen, Sojabohnen, Erdnüsse oder Lupinen, Raps, Soja, Mais, Reis, Sonnenblumen, Canola, Saflor, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Borretsch, Ackerbohne, Wicken, Luzerne, Kleearten, Serradella, Phacelia, Ölrettich, Öllein, Ramtillkraut, Buchweizen, Gräser verschiedener Arten oder Bäume wie Apfel, Birne, Pflaume, Quitte, Kastanie, Kirsche, Kokosnuss, Walnuss, Haselnuss, Paranuss, Macadamia, Getreide Weizen, Gerste, Hafer, Roggen, Hirse, Triticale oder Dinkel. Daneben können aber auch weitere Nutzpflanzen wie Tabak verwendet werden.

Zur Ernte angewandte Verfahren und dazu benötigte Geräte, beispielsweise Mähdrescher, sind dem Fachmann bekannt und hängen von der Art des Ernteguts ab.

Der Begriff „biologisch aktiven Pflanzenpathogenen“ wie hier verwendet bezieht sich auf einen Krankheitserreger, der biologisch aktiv ist, und einen Schaden und/oder eine Erkrankung am Erntegut hervorrufen kann. Bevorzugt im Sinne der Erfindung ist das Pflanzenpathogen ein Bakterium, ein Virus oder ein Pilz. Besonders bevorzugt ein Pilz aus der Gattung Fusarium oder Tilletia.

Unter biologisch aktiv im Sinne der Erfindung wird die Fähigkeit zur Transkription von RNA und anschließender Translation bezeichnet, welche vom Pflanzenpathogen selbst erbracht werden kann, beispielsweise in Fällen, in denen das Pflanzenpathogen ein zellulärer Organismus ist, also ein Bakterium oder ein Pilz, durch die Benutzung eigener Enzyme oder im Fall von Viren durch die Maschinerie einer pflanzlichen Wirtszelle.

Charakteristisch für das Vorhandensein von biologisch aktiven Planzenpathogenen ist hierbei das Vorhandensein von RNA, bevorzugt von messenger RNA (mRNA). Die mRNA wird bei der Transkription von dem Enzym RNA-Polymerase synthetisiert. Während der sogenannten Translation der mRNA wird entsprechend der RNA-Sequenz ein entsprechendes Polypeptid bzw. Protein aus den in der Zelle verfügbaren Aminosäuren synthetisiert. Beide Vorgänge finden üblicherweise im Fall von Bakterien oder Pilzen in biologisch aktiven Organismen statt. Im Fall von Pilzen, kann RNA auch in vorrübergehend ruhenden Organismen, wie Sporen, vorliegen. Diese sind grundsätzlich als lebensfähig zu betrachten und gehören damit zu den biologisch aktiven Pflanzenpathogenen im Sinne der Erfindung. Bei Viren wird im Sinne der Erfindung auf Viren abgestellt, die infektiös sind, also sich entweder in geeigneten Zellen des Ernteguts akut replizieren oder dazu in der Lage sind.

Unter „Probe“ wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Teilmenge des Ernteguts verstanden, der zur Untersuchung eingesetzt wird. Diese Teilmenge soll so dimensioniert sein, dass bezogen auf ihren Umfang eine hohe Wahrscheinlichkeit dafür besteht, dass – sofern das Erntegut mit biologisch aktiven Pflanzenpathogenen belastet ist – diese auch in der Teilmenge vorliegen. Abhängig vom Erntegut kann es nötig sein, die Probe für die nachfolgende Bestimmung der RNA vorzubehandeln. Notwendige Vorbehandlungen sind dem Fachmann bekannt.

Das Bestimmen von RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogene vorliegt kann erfindungsgemäß durch alle für den Nachweis von RNA geeigneten Methoden erfolgen. Die RNA kann hierbei direkt oder nach Umwandlung in DANN durch z.B. reverse Transkription nachgewiesen werden. Methoden zum Nachweis von Nukleinsäuren, einschließlich RNA und besonders mRNA, sind dem Fachmann bekannt und beinhalten im Stand der Technik an sich bekannte Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion, die In-situ-Hybridisierung oder Nukleinsäure-Sequenzierungstechniken.

Pflanzenpathogene können daher bevorzugt durch die Anwesenheit von RNA, die von Genen transkribiert wird, die für das Pflanzenpathogen charakteristisch sind, also in anderen Pflanzenpathogenen nicht vorkommen. Solche spezifischen Gene können hierbei entweder spezifisch für eine Art sein, d.h. sie sind nur in dieser vorhanden (z.B. E. coli oder Tilletia indica) oder spezifisch für eine Gattung sein, d.h. sie sind beispielsweise in allen Enterobakterien oder allen Spezies der Gattung Tilletia vorhanden oder spezifisch für eine ganze Klasse, beispielsweise für Viren, sein. Methoden zur Bestimmung von Genen, die spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen sind, sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise, die Polymeraseketten-Reaktion, die Sequenzierung (Kettenabbruch-Synthese, Halbleitersequenzierung etc.), die Sequenzanalyse einzelner Organismen oder den Sequenzvergleich evolutionär konservierter Gene innerhalb einer Gattung. Bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren die RNA mindestens eines Genes bestimmt, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist. Besonders bevorzugt erfolgt der Nachweis der RNA des mindestens einen Pflanzenpathogen-spezifischen Gens mittels Polymerase-Kettenreaktion. Unter Polymerase-Kettenreaktion (PCR) im Sinne der Erfindung wird eine Methode verstanden, um DNA in vitro mittels des Enzyms DNA-Polymerase zu vervielfältigen. Einzelheiten zur PCR sind dem Fachmann bekannt. Der Begriff Polymerase-Kettenreaktion beinhaltet auch Verfahren zur Vervielfältigung und Quantifizierung von DNA und RNA, auch quantitative Echtzeit-PCR genannt. Die quantitative Echtzeit-PCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht, und zusätzlich die Quantifizierung der gewonnenen DNA bzw. RNA ermöglicht. Für die Quantifizierung von RNA erfolgt eine reverse Transkription mit nachfolgender quantitativer PCR (im selben Ansatz), was korrekterweise als qRT-PCR oder RT-qPCR bezeichnet wird. Die notwendigen Geräte und Verfahrensschritte zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR, sowie entsprechende Berechnungsmodelle sind dem Fachmann bekannt. Die quantitative Echtzeit-PCR wird oftmals auch als Real Time Detection PCR, kurz RTD-PCR, oder einfach als qPCR für die Quantifizierung von DNA beziehungsweise als qRT-PCR für die Quantifizierung von RNA bezeichnet. Für den Nachweis von DNA bzw. RNA können verschiedene Agentien herangezogen werden. Die Quantifizierung der PCR-Produkte der PCR-Produkte kann beispielsweise durch die Nutzung von DNA-Farbstoffen (z. B. Ethidiumbromid oder SYBR Green I) oder der Nutzung des Förster-Resonanzenergietransfer (FRET). Als FRET Sonden können beispielsweise zwei verschiedene, jeweils mit einem FRET-Donor bzw. FRET-Akzeptor („Reporter“) markierte Oligonukleotide dienen, die nebeneinander an die Ziel-Sequenz binden und damit die Fluorochrome in eine für den FRET ausreichende Nähe bringen (oftmals auch Hybridisierungs- oder LightCycler-Sonden genannt). Weitere Beispiele zur Quantifizierung der PCR-Produkte unter Ausnutzung des FRET-Prinzips beinhalten LoopTag-Sonden, TaqMan-Sonden (oft auch als Hydrolyse-Sonden bezeichnet); Molecular Beacons, Scorpion-Primer, Lux-Primer oder Lanthanid-markierte Sonden. Zur Berechnung bzw. der absoluten oder relativen Quantifizierung der eingesetzten DNA bzw. RNA Menge können verschiedene Rechenmodelle herangezogen werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispielsweise kann ein Referenz-Gen mitgemessen wird, um einen relativen Menge-Vergleich durchzuführen (relative Quantifizierung). Zumeist wird eine relative Quantifizierung unter Einbeziehung des sogenannten Ct-Wert (engl. cycle threshold für Schwellenwert-Zyklus) oder Cp-Wert (engl. crossing point), der den Zyklus beschreibt, an dem die Fluoreszenz erstmals signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt, errechnet. Andere Methoden ermöglichen eine absolute Quantifizierung, bei der die genaue Anzahl der in der Probe vorhandenen Templates bestimmt werden kann. Die Methoden zur absoluten Quantifizierung sind allerdings deutlich komplexer und beinhalten beispielsweise die Berechnung der Effizienz der reversen Transkription durch zusätzliche Verwendung synthetisierter RNA mit bekannter Menge.

Bevorzugt wird als Polymerase-Kettenreaktion im Sinne der Erfindung die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) eingesetzt und besonders bevorzugt die qRT-PCR, bei der RNA mittels reverser Transkription zunächst in DNA umgewandelt wird und diese DNA anschließend quantifiziert wird.

Die oben beschriebenen Bestimmungsmethoden für RNA basieren alle darauf, dass Nukleinsäuremoleküle als Agens zur Detektion einer bestimmten RNA eingesetzt werden, die Nukleotidsequenzen aufweisen, die komplementär zu denen der RNA oder einer davon abgeleiteten DNA sind und die mit den RNA oder abgeleiteten DNA Molekülen hybridisieren können. Die Struktur (Sequenz) der zur Detektion eingesetzten Nukleinsäuremoleküle wird also durch die Struktur (Sequenz) der zu detektierenden RNA Moleküle vorgegeben. Gegebenenfalls können erfindungsgemäß auch Teilabschnitte der Sequenz der zu detektierenden RNA als Zielsequenzen verwendet werden. Wie geeignete Zielsequenzen, also z.B. für das RNA oder DNA Molekül spezifische Sequenzbereiche, in einem zu detektierenden RNA oder DNA Molekül identifiziert werden können, ist dem Fachmann bekannt.

Besonders bevorzugt umfasst das Agens zum Nachweis der RNA im erfindungsgemäßen Verfahren eine Nukleinsäuresonde, die spezifisch mit der RNA des mindestens einen Gens das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist oder einer davon abgeleiteten Nukleinsäure hybridisiert. Unter abgeleiteten Nukleinsäuren können im Rahmen der Erfindung Amplifikationsprodukte verstanden werden, aber auch modifizierte Nukleinsäuren, wie von der RNA reverse transkribierte DNA. Geeignete Sonden haben üblicherweise eine Länge von 50 bis 500 Basenpaaren, bevorzugt von 100–400 Basenpaaren oder 200 bis 300 Basenpaaren. Sie weisen eine Sequenz auf, die im Wesentlichen komplementär zu der der nachzuweisenden Nukleinsäure ist.

Besonders bevorzugt umfasst das Agens zum Nachweis der RNA im erfindungsgemäßen Verfahren Nukleinsäure-Primer, die spezifisch die Amplifikation eines Nukleinsäure-Fragmentes erlauben, das von der RNA des mindestens einen Gens das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist abgeleitet wurde. Als Nukleinsäure-Primer werden vorzugsweise ein stromaufwärts- und ein stromabwärts-orientiertes Oligonukleotide verwendet (sogenannte 5´- und 3´- oder forward- und reverse-Primer). Als Primer geeignete Oligonukleotide haben vorzugsweise eine Länge von 8 bis 30 Basenpaaren, besonders bevorzugt von 10 bis 25 Basenpaare, 12 bis 20 Basenpaare oder 15 bis 18 Basenpaaren. Sie weisen eine Sequenz auf, die im Wesentlichen komplementär zu der der nachzuweisenden Nukleinsäure ist im Bindungsbereich des Primers ist. Zu beachten ist, dass im Fall der für die PCR eingesetzten Primer sich einer der Bindungsbereiche auf dem revers komplementären Strang der nachzuweisenden DNA befindet. Diese Umstände sind dem Fachmann jedoch allesamt bekannt und im Stand der Technik sind geeignete Verfahren beschrieben, um Primersequenzen zu ermitteln.

Erfindungsgemäß kann die RNA von einem biologisch aktiven Pflanzenpathogen bestimmt werden. Alternativ können mehrere RNAs desselben Pflanzenpathogens bestimmt werden. Dies erlaubt in der Regel einen zuverlässigeren Nachweis. soll mindestens eine RNA. Schließlich können aber auch jeweils eine RNA von verschiedenen Pflanzenpathogenen oder verschiedenen RNAs von verschiedenen Pflanzenpathogenen bestimmt werden, so dass diese verschiedenen Pflanzenpathogene in der Probe vorteilhaferweise in einer Nachweisreaktion bestimmt werten können. Besonders bevorzugt soll erfindungsgemäß also die RNA mindestens eines Genes bestimmt wird, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen.

Sofern die RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogene vorliegt, bestimmt werden konnte, ist der Nachweis des Vorhandenseins des biologisch aktiven Pflanzenpathogens erbracht. Der Nachweis im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens kann zusätzlich noch den Nachweis der Menge an biologisch aktivem Pflanzenpathogen umfassen. Die Menge an biologisch aktivem Pflanzenpathogen korreliert direkt mit der Menge an nachgewiesener RNA, insbesondere wenn als Bestimmungsverfahren qPCR oder qRT-PCR eingesetzt wird.

Bevorzugt können RNAs der nachfolgend aufgeführten Gene für die jeweiligen Pflanzenpathogene im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden:

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt vorteilhafterweise biologisch aktive Pflanzenpathogene in pflanzlichem Erntegut anhand der Menge der RNA mindestens eines Genes, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist, nachzuweisen. Obwohl die für diesen Nachweis notwendigen Geräte und Methoden seit vielen Jahren etabliert sind, wurden sie bisher nicht zu diesem Zweck eingesetzt. Zudem wird bei den bekannten molekularbiologischen Methoden vor allem die DNA bestimmt und nicht die RNA bzw. es findet auch keine Korrelation von DNA zu RNA statt. Der Nachweis biologisch aktiver Pflanzenpathogene kann nur durch die Bestimmung von RNA erbracht werden.

Gegenüber den im Stand der Technik bekannten Verfahren ist das erfindungsgemäße Verfahren schnell, effizient, kostengünstig und kann ohne besondere infrastrukturelle Voraussetzungen auch unterwegs eingesetzt werden. Bis heute wird die Belastung von pflanzlichem Erntegut mit Pflanzenpathogenen im Wesentlichen durch zeitraubende Keimversuche im Labor gemessen. Hierbei werden über Nährmedien beispielsweise Sporen von Pilzen zur Keimung und zum Wachstum angeregt. Nach einem definierten Zeitraum von 7 bis 10 Tagen ist eine qualitative Auswertung möglich, wobei jedoch eine Quantifizierung des Befalls nicht gegeben ist. Eine weitere Methode stellt die Filtrationsmethode dar, wobei beispielsweise anhaftende Pilzsporen durch Schütteln vom Saatkorn gelöst werden. Dabei werden die Sporen auf einem Filterpapier gesammelt und anschließend mit einem Mikroskop ausgezählt. Diese Methoden sind sehr zeitaufwändig, ungenau, erfordern hohen manuellen Aufwand und eine immobile Laborumgebung.

Die zuvor getroffenen Definitionen und gemachten Erklärungen der Begriffe gelten für die nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen entsprechend.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Pflanzenpathogen ein Bakterium oder ein Virus.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das Pflanzenpathogen ein Pilz. Bevorzugt stammt der Pilz aus der Gattung Fusarium oder Tilletia.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die RNA mindestens eines Genes bestimmt wird, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt der Nachweis der RNA mittels Polymerase-Kettenreaktion.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das pflanzliche Erntegut ein pflanzliches Lebens- oder Futtermittel oder pflanzliches Saatgut.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das pflanzliche Erntegut aus einer Nutzpflanze gewonnen wird. Bevorzugt ist die Nutzpflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Weizen, Gerste, Hafer, Roggen, Soja, Gerste, Hirse, Dinkel, Reis und Mais.

Die Erfindung betrifft auch einen Kit zur Bestimmung von Pflanzenpathogenen in pflanzlichem Erntegut umfassend mindestens ein Agens zum Nachweis der RNA mindestens eines Genes, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist.

Ein „Kit“ im Sinne der Erfindung ist eine Zusammenstellung von Komponenten, die zur Bestimmung von Pflanzenpathogenen in pflanzlichem Erntegut vorzugsweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren notwendig sind. Insbesondere umfasst der erfindungsgemäße Kit mindestens ein Agens zum Nachweis der RNA mindestens eines Genes, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist. Bei diesem Agens kann es sich um Nukleinsäuresonden oder Primer handeln, die den spezifischen Nachweis der RNA erlauben. Wie diese ausgestaltet sein müssen, hängt von der nachzuweisenden RNA und damit von dem nachzuweisenden Pflanzenpathogen ab. Der Fachmann ist in der Lage, geeignete Nukleinsäuresonden oder Primer ohne weiteres bereitzustellen. Daneben kann der Kit weitere Komponenten z.B. zur Durchführung von PCR Reaktionen oder Hybridisierungen enthalten. Zu diesen weiteren Komponenten zählen beispielsweise Puffer, Enzyme oder Detektionskomponenten, wie Farbstoffe, Chromophore, FRET Komponenten oder ähnliches. Zusätzlich kann der Kit Informationen zur Durchführung des Verfahrens allgemein und zur Bestimmung der Menge an biologisch aktivem Pflanzenpathogen in einer Probe enthalten. Hierzu gehören auch Kalibrierungsmittel, wie Kalibrierungskurven etc.. Der Kit kann darüber hinaus auch Standards zur Erstellung von Kalibrierungskurven enthalten, z.B. Proben mit definierter Zahl an biologisch aktiven Pflanzenpathogenen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits umfasst ist das Agens (i) eine Nukleinsäuresonde, die spezifisch mit dem mindestens einen Gen hybridisiert, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist, oder (ii) Nukleinsäure-Primer, die die spezifische Amplifikation eines Fragments des mindestens einen Gens erlauben, das spezifisch für ein bestimmtes Pflanzenpathogen ist.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung der Effizienz einer Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung von pflanzlichem Erntegut umfassend:

  • a) Bereitstellen einer ersten Probe von pflanzlichem Erntegut vor und einer zweiten Probe von pflanzlichem Erntegut nach der Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung;
  • b) Bestimmen der Menge von DNA und RNA, die in biologisch aktiven Pflanzenpathogenen vorliegt, in der ersten und in der zweiten Probe von pflanzlichem Erntegut;
  • c) Bilden eines Verhältnisses der Menge von DNA zu RNA in der ersten und in der zweiten Probe und in Bezug setzen der Verhältnisse aus erster und zweiter Probe zueinander, wobei das Verhältnis der Menge von DNA zu RNA in der zweiten Probe im Vergleich zum Verhältnis der Menge von DNA zu RNA in der ersten Probe ein Indikator für den Anteil an biologisch aktiven Pflanzenpathogenen im pflanzlichem Erntegut ist.

Das vorliegende Verfahren kann neben den zuvor genannten Schritten auch noch weitere Schritte umfassen. Diese Schritte können insbesondere die Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung von pflanzlichem Erntegut umfassen, aber auch die Vernichtung von pflanzlichem Erntegut nach ineffizienter Anti-Pflanzepathogen Behandlung.

Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise automatisiert werden wie bereits zuvor beschrieben. Hierzu kann die Probenbehandlung und/oder der Nachweis durch geeignete Analyse-Roboter und Nukleinsäure-Analysegeräte, wie PCR Analysern, unterstützt werden. Die Sequenz-Auswertung und die Identifizierung des Pflanzenpathogens kann computerunterstützt durchgeführt werden.

Die sogenannte „Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung“ im Sinne der Erfindung dient der Dekontamination von pflanzlichem Erntegut bzw. der Inaktivierung von Pflanzenpathogen, die möglicherweise im pflanzlichen Erntegut enthalten sind. Die Behandlung kann dabei chemischen oder physikalischen Ursprungs sein. Verfahren zur Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise könnten hier chemische Beizverfahren, die Heißwasserbeize oder eine Elektronenbehandlung von pflanzlichem Erntegut, wie Saatgut, genannt werden. Bei der elektronischen Saatgutbehandlung wird die Energie der Elektronen so dosiert, dass sie nur geringfügig in das Saatgut eindringen können. Beim Eindringen in das Korn gibt das Elektron einen Großteil seiner Energie ab. Somit werden die auf der Oberfläche und in der Samenschale haftenden Pathogene, beispielsweise Pilzsporen, Bakterien oder Viren, abgetötet, während der weiter innen liegende Embryo nicht geschädigt wird und die Keimfähigkeit des Saatguts erhalten bleibt.

Unter den Wirkstoffen, die in den chemischen Beizverfahren eingesetzt werden, finden sich verschiedene zugelassene chemische Verbindungen. Wie dem Fachmann bekannt ist, werden diese je nach Einsatzbereich und Pflanzensorte gewählt. Beispielsweise könnten hier folgende Wirkstoffe, die in chemischen Beizverfahren eingesetzt werden, genannt werden:
Tebuconazol, Fludixonil, Fluoxastrobin, Prothioconazol, Triazoxide, Difenoconazol, Silthiofam, Prochloraz, Triticonazol, Pyrimethanil, Triadimenol, Fuberidazol, Imazalil oder Cyproconazol.

Bakterielle Pflanzenkrankheiten werden häufig mit Antibiotika, beispielsweise mit Plantomycin oder Streptomycinsulfat, behandelt. Der Einsatz von Antibiotika ist allerdings stark reguliert und oftmals nur in streng kontrollierten Fällen zulässig.

Bei der Warm- beziehungsweise Heißwasserbeize, die oftmals im Ökolandbau zur Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung angewendet wird, wirkt erhitztes Wasser auf das Saatgut ein und Pflanzenpathogene wie Pilze, Bakterien oder Viren werden dadurch abgetötet. Beispielsweise kann eine Heißwasserbeize für Weizen-Saatgut für mindestens 10 Minuten bei einer Wassertemperatur von circa 51 °C bis 52 °C erfolgen.

Vorzugsweise erfolgt die Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung durch eine Elektronenbehandlung, ein chemisches Beizverfahren und/oder eine Heißwasserbeize. Dem Fachmann ist hierbei klar, dass die Effizienz einer Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung von diversen Faktoren abhängen kann, beispielsweise im Falle einer Heißwasserbeize von der exakten Wassertemperatur und der eingesetzten Menge an Saatgut oder im Falle der Elektronenbehandlung von der Energie der Elektronen. Gemäß der Erfindung korreliert der Anteil an pflanzlichem Erntegut bevorzugter Weise mit der Effizienz der Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung.

Von einer effektiven Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung wird ausgegangen, wenn eine statistisch signifikante Menge der Pflanzenpathogen, die im pflanzlichen Erntegut enthalten waren, inaktiviert wurde. Ob die Menge an Pflanzenpathogen, die inaktiviert werden konnte, statistisch signifikant ist, lässt sich leicht mit Standartmethoden der Statistik bestimmen, siehe z.B. p-Wert Bestimmungen, Student´s t-Test, Mann-Whitney Test, etc., siehe Standartliteratur, z.B. Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983 für weitere Details.

Die DNA und/oder RNA Mengenbestimmung kann mittels Verfahren erfolgen, die andernorts hier bereits beschrieben wurde.

Die Bildung eines Verhältnisses aus den beiden Mengen in erster und zweiter Probe kann mit allen geeigneten mathematischen Operationen erfolgen, die es Erlauben den Anteil an RNA bezogen auf DNA oder Gesamtmenge an Nukleinsäuren (also die Summe der Menge DNA und Menge RNA) auszudrücken. Bevorzugt wird das Verhältnis für die Mengen der ersten mit derselben Methode gebildet wie für die Mengen der zweiten Proben. Besonders geeignet ist hier die Bildung eines Quotienten aus DNA Menge zu RNA Menge oder umgekehrt. Beide Verhältnisse können dann vorzugsweise durch Vergleich miteinander in Bezug gesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens korreliert der Anteil an pflanzlichem Erntegut mit der Effizienz der Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Verhältnis der Quotient aus der Menge DNA und der Menge RNA (DNA/RNA) und ein größerer Quotient in der zweiten im Vergleich zur ersten Probe ist ein Indikator für eine erfolgreiche Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung und ein kleiner oder unveränderter Quotient in der zweiten im Vergleich zur ersten Probe ist ein Indikator für eine fehlgeschlagene Anti-Pflanzenpathogen Behandlung.

Erfindungsgemäß bezeichnet der Quotient das Verhältnis von zwei Größen zueinander, also das Ergebnis einer Division. Bevorzugt im Sinne der Erfindung ist das Verhältnis der Quotient aus der Menge DNA und der Menge RNA (DNA/RNA). Ein größerer Quotient in der zweiten im Vergleich zur ersten Probe ist hierbei ein Indikator für eine erfolgreiche Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung, da die Menge RNA bezogen zur Menge DNA kleiner wird. In diesem Fall ist keine signifikante Menge an biologisch aktiven Pflanzenpathogenen nach Behandlung verblieben, die noch RNA produzieren könnten. Ein kleiner oder unveränderter Quotient in der zweiten im Vergleich zur ersten Probe ist dagegen ein Indikator für eine fehlgeschlagene Anti-Pflanzenpathogen Behandlung, da die Anteile unverändert bleiben oder sich der Anteil an RNA sogar erhöht. Dies ist nur dann möglich, wenn biologisch aktive Pflanzenpathogene nach der Behandlung in signifikantem Ausmaß zurückbleiben.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens schließlich umfasst die Anti-Pflanzenpathogen-Behandlung eine Elektronenbehandlung, ein chemisches Beizverfahren und/oder eine Heißwasserbeize.

Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen ist hiermit durch Bezugnahme auf den jeweiligen speziellen Offenbarungsgehalt und in ihrer Gesamtheit aufgenommen.

BEISPIELE

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung. Sie dürfen im Hinblick auf den Schutzumfang nicht in einschränkender Weise ausgelegt werden.

Beispiel 1: Etablierung eines quantitativen Nachweissystems von Fusarium-RNA an Weizenkörnern

Die Behandlung von Saatgut mit Elektronen führt in der Regel zum Absterben von Pflanzenpathogenen, beispielsweise von Pilzen, und verhindert damit ein späteres Auftreten von Erkrankungen am keimenden Samen. Die Behandlung führt allerdings nicht zu einer Entfernung der abgetöteten Pathogene, beispielsweise der Pilzsporen. Auf DNA-Ebene sind die Sporen also nach wie vor in ähnlicher Menge nachweisbar. Die Lebensfähigkeit eines Organismus zeigt sich in der Fähigkeit der Proteinbiosynthese, das heißt der Transkription von RNA und der anschließenden Translation. Die Anwesenheit von RNA ist also ein wichtiger Hinweis dass ein Organismus lebt. Das Verhältnis von DNA zu RNA eines Pilz Gens vor und nach einer Behandlung ermöglicht somit Aussagen über die Effektivität der Sterilisation. Für Fusarium graminearum werden beispielsweise der Elongation factor 1α und Calmodulin als Targetgene ausgewählt. Für Weizen erscheinen verschiedene Haushaltsgene geeignet wie α Tubulin, Ubiquitin, Elongation factor 1α. Die Quantifizierung der DNA und RNA erfolgt mit Hilfe der quantitative Echtzeit-PCR (auch als qPCR für DNA und qRT-PCR für RNA bezeichnet).

Analyse der Prozessvariablen Ankeimdauer und Konzentration Pflanzenextrakt

In einem ersten Arbeitsschritt wurde der Einfluss der Variablen des Prozesses überprüft. Hierzu zählen zum einen die notwendige Ankeimzeit des Samens um die RNA der Pilze zu detektieren und zum andern die Konzentrationen an Pflanzenextrakt, der für die Reaktion eingesetzt werden muss. Darüber hinaus muss ausgeschlossen werden, dass nicht bereits aus dem getrockneten Samen RNA isoliert werden kann und wenn ja, muss diese sich quantitativ deutlich von der RNA im gekeimten Zustand unterscheiden. Beide Parameter wurden sowohl für Fusarien als auch für den Steinbrand getestet.

Identifizierung von Genen, die in der Ankeimphase exprimiert werden

Der Nachweis der Pilze auf DNA und RNA Ebene erfordert die Identifizierung eines Gens, welches außerhalb der Dauerstadien (Sporenbildung) immer transkribiert wird. Gleichzeitig sollte dieses Gen in allen Fusarien oder allen Steinbrand Isolaten zu finden sein, um eine Artspezifische Identifizierung in der PCR zu ermöglichen. Beispielsweise kann für Fusarien das Gen Elongation factor 1α oder calmodulin verwendet werden.

Ableitung der idealen Primer und Etablierung einer multiplex PCR

Um die Varianz der isolierten DNA Menge und der Effektivität der cDNA-Synthese auszugleichen wurden zwei Gene aus Weizen identifiziert, die eine möglichst gleichmäßige Expression zeigen, aber sich von der Menge deutlich unterscheiden. Die von diesen Genen exprimierte RNA dient als Standard um die RNA aus Pilzen zu quantifizieren. Zur Überprüfung und Quantifizierung der Polymerase-Ketten-Reaktion wird ein Plasmid-standard verwendet. Für die oben identifizierten Keimphasenspezifischen Gene wurden Primer abgeleitet, die eine möglichst optimale Reaktion erlauben. Die Primer wurden so entworfen, dass die gegen Steinbrand und Fusarien gerichteten Primer möglichst keinen Homologien untereinander aufweisen. So kann die Reaktion gegen beide Pilze in einer Multiplex PCR erfolgen.

Identifizierung der Nachweisgrenze der Methode

Weizensamen werden mit definierten, aufsteigenden Konzentrationen von Pilzsporen gemischt. Die DNA der Gemische wird isoliert und mit Hilfe der oben entwickelten PCR auf DNA und RNA Ebenen analysiert. Ziel des Versuches ist es die niedrigste noch nachweisbare keimfähige Kontamination des Saatgutes zu ermitteln. Gleichzeitig soll in diesem Ansatz die Reproduzierbarkeit des Verfahrens bestimmt werden.

Beispiel 2: Entwicklung eines repräsentativen Probennahmeschemas

Die Beprobung sollte eine verlässliche Aussage über eine möglichst große Saatgutcharge erlauben, um den Probenumfang möglichst gering zu halten. Es ist aber damit zu rechnen, dass die Pilzsporen in der Charge ungleichmäßig verteilt sind. Daher wurde ein Probennahme-Schema entwickelt, das mit einem hohen Probenaufkommen beginnt und dann entsprechend der gemessenen Variabilität eine Reduktion bis zu einem Probenaufkommen ermöglicht, das noch eine signifikante Aussage erlaubt. Dazu wurden aus einer Saatgutcharge 30 Proben a 1kg entnommen und die Proben gründlich gemischt. Aus jeder Probe wurden 10g entnommen und zu einer Mischprobe vereinigt, die wiederum gründlich gemischt wurde. Aus dieser Probe wurden 5 mal 10 g entnommen, die DNA und RNA isoliert und die Mengen über PCR amplifiziert. Dieser Vorgang wurde für die gleiche Charge neun Mal wiederholt. Anhand der Variabilität der Proben lässt sich nun bestimmen, welches Probennahme-Schema bzw. welche Probenumfänge nötig sind, um repräsentative und statistisch signifikante Ergebnissen zu erhalten.

Beispiel 3: Nachweis der Effizienz der Elektronbehandlung

Entsprechend dem oben entwickelten Probennahme-Schema werden von behandeltem und unbehandeltem Saatgut Proben entnommen und mit der oben entwickelten qPCR für die DNA und einer qRT-PCR für die RNA analysiert. Aus dem Verhältnis DNA zu RNA in der behandelten Probe im Vergleich zum Verhältnis DNA zu RNA in der unbehandelten Probe lässt sich der Anteil der keimungsfähigen Sporen ermitteln.

Elektronenbehandlung zur Dekontamination mittels niederenergetischer Elektronen

In Deutschland existieren zwei Anlagen zur Elektronenbehandlung von Saatgut, wobei eine mobile Anlage in Jüterbog (Produktionsstandort der Nordkorn Saaten GmbH) und eine feste Anlage in Güstrow (Stammsitz Nordkorn Saaten GmbH) installiert ist. Hier wird die Anlage in Güstrow genutzt. Bevor eine Behandlung durchgeführt werden kann, muss die Anlage auf das zu behandelnde Gut eingestellt werden. Dafür wird vor der Behandlung die Samenschalendicke mit einem Drauflicht-Mikroskop bestimmt. Anhand der Samenschalen-Dicke kann die erforderliche Eindringtiefe der Elektronen berechnet werden. Dieser Schritt ist notwendig, da der letale Effekt der Elektronen auf die DNA der Pathogene unspezifisch ist und bei zu tiefem Eindringen der Elektronen die DNA des Saatkeimlings geschädigt werden könnte. Hier wird die Behandlung von Weizen mit einer Mindestprobengröße von 3 kg durchgeführt.

Bereitstellung von kontrolliert infiziertem Saatgut

Die Bereitstellung von kontrolliert infiziertem Saatgut erfolgt durch Inokulation von Weizen mit den Modelpathogenen Fusarium und Weizensteinbrand. Frisches Inokulationsmaterial wird jährlich durch gezielt infizierten Weizenanbau gewonnen.

Pilznachweis der Pathogene im Plattentest und Mikroskop

Der Nachweis der Pathogene Fusarium und Weizensteinbrand erfolgt auch mittels Plattentest und Mikrokopie („klassischen Nachweise“ im Vergleich zur hier entwickelten qPCR Methode). Ein Mikroskop mit 120-facher Vergrößerung wird zur Bestimmung der Samenschalendicke genutzt. Mit dem gleichen Mikroskop können gekeimte Sporen der Pathogene Fusarium und Weizensteinbrand identifiziert werden. Vor der Mikroskopie müssen die Sporen beider Pathogene zum Keimen und Wachstum angeregt werden. Dies geschieht über Nährmedien mit dem sogenannten Plattentest. Ebenfalls soll künstlich inokuliertes Saatgut mit einem Wachstumsschrank zum Auflaufen/ Keimen angeregt und bis ins 3- bzw. 4-Blattstadium unter kontrollierten Bedingungen im Wachstum gefördert werden. Anschließend werden die Modelpathogene ebenfalls mikroskopiert und im Plattentest analysiert. Dieser Test liefert Auskunft über eventuelle Wechselwirkungen zwischen Pathogen und Wirtspflanze, da der natürliche Prozess von Keimung und Wachstum unter kontrollierten Bedingungen abläuft.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983 [0047]