Title:
Verfahren zur Bestimmung der Biodegradation von organischen Substanzen zu Kohlenstoffdioxid
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Biodegradation von organischen Substanzen zu Kohlenstoffdioxid durch Analyse der Veränderungen des 13C/12C stabilen Isotopenverhältnisses in einem geschlossenen Behälter, wobei das 13C Isotop des CO2/Carbonat-Systems angereichert ist für die Biodegradation oder das Inkubationsmedium, bevor die Degradation stattfindet.




Inventors:
gleich Anmelder
Application Number:
DE102016116767A
Publication Date:
03/08/2018
Filing Date:
09/07/2016
Assignee:
Meckenstock, Rainer, Prof. Dr., 45478 (DE)
International Classes:



Foreign References:
EP19278572008-06-04
76420942010-01-05
Other References:
MECKENSTOCK, R.U. [u.a.]: 13C/12C isotope fractionation of aromatic hydrocarbons during microbial degradation. Environ. Microbiol. (1999) 1 (5) 409-14
SELESI, D. & MECKENSTOCK, R.U.: Anaerobic degradation of the aromatic hydrocarbon biphenyl by a sulfate-reducing enrichment culture. FEMS Microbiol. Ecol. (2009) 68 (1) 86-93
Attorney, Agent or Firm:
Nobbe, Matthias, Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., 47057, Duisburg, DE
Claims:
1. Ein Verfahren zur Bestimmung der Biodegradation von organischen Substanzen, das die Schritte umfasst:
i. Bereitstellen eines Biodegradationsassaymediums, das eine Mikrobengemeinschaft, einen Elektronenakzeptor und eine Menge einer organischen Substanz, die durch die Mikrobengemeinschaft abgebaut werden kann, in einem geschlossenen Behälter enthält, wobei das Biodegradationsassaymedium darüber hinaus eine Menge einer CO2-Isotopenmischung enthält, die 13CO2 und 12CO2 in einem Verhältnis von 13/12CO2 enthält, das verglichen mit dem natürlichen Verhältnis von 13/12CO2 erhöht ist;
ii. Entnehmen einer ersten Probe aus dem Behälter und Bestimmen eines ersten Verhältnisses von 13/12CO2 in der ersten Probe;
iii. Kultivieren des Biodegradationsassaymediums, um das Voranschreiten der Biodegradation unter Bedingungen zur Biodegradation der organischen Substanz zu CO2 zu ermöglichen;
iv. Entnehmen einer zweiten Probe aus dem Behälter und Bestimmen eines zweiten Verhältnisses von 13/12CO2 in der zweiten Probe, und
v. Berechnen der Veränderung des 13/12CO2 Verhältnisses von dem 13/12CO2 Verhältnis der ersten Probe zu dem 13/12CO2 Verhältnis der zweiten Probe.

2. Das Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Biodegradationsassaymedium dadurch bereitgestellt wird, daß man die Mikrobengemeinschaft zu einem Assaymedium, das den Elektronenakzeptor, die Menge der organischen Substanz und die Menge der CO2 Isotopenmischung enthält, hinzufügt.

3. Das Verfahren wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei die Mikrobengemeinschaft in Form einer Probe aus einer ökologischen Quelle einschließlich einer Trinkwasserversorgungsanlage, einer Industrieabwasseranlage oder natürlichen Gewässern bereitgestellt wird.

4. Das Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Biodegradationsassaymedium dadurch bereitgestellt wird, daß man die organische Substanz zu einem Assaymedium, das den Elektronenakzeptor, die Mikrobengemeinschaft und die Menge der CO2 Isotopenmischung enthält, hinzugibt.

5. Das Verfahren wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei die organische Substanz in Form einer Probe aus einer ökologischen Quelle einschließlich einer Trinkwasserversorgungsanlage, einer Industrieabwasseranlage oder natürlichen Gewässern bereitgestellt wird.

6. Das Verfahren wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die CO2 Isotopenmischung in einer Menge verwendet wird, die ausreichend ist, um einen Gehalt von 1 bis 50, bevorzugt 5 bis 40 Atomprozent, besonders bevorzugt 10 bis 20 Atomprozent an 13CO2 der gesamten Menge an CO2 in dem Biodegradationsassaymedium bereitzustellen, bevor die erste Probe genommen wird.

7. Das Verfahren wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei das Biodegradationsassaymedium eine wässrige Phase und eine Gasphase umfasst.

8. Das Verfahren wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die erste Probe und die zweite Probe von derselben Art der Phase genommen werden.

9. Das Verfahren wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei die Mikrobengemeinschaft aerobe und anaerobe Mikroorganismen derselben oder unterschiedlicher Art umfasst, die fähig sind, die organischen Substanzen abzubauen, und die eine mikrobielle Kultur, autochthone Mikroorganismen, Zellkulturen oder andere Biota sein können.

10. Das Verfahren wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei Schritte iii) und iv) mindestens einmal wiederholt werden, bevor die Veränderung des 13/12CO2 Verhältnisses aus dem 13/12CO2 Verhältnis einer früheren Probe zu dem 13/12CO2 Verhältnis einer späteren Probe berechnet wird.

11. Das Verfahren wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, wobei das Verhältnis von 13/12CO2 unter Verwendung eines spektroskopischen Verfahrens, insbesondere Isotopenverhältnis-Infrarotspektroskopie, oder unter Verwendung eines massenspektrometrischen Verfahrens, insbesondere Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie, bestimmt wird.

12. Verwendung des Verfahrens wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 beansprucht zur Bestimmung der Biodegradationskapazität von Mikroorganismen.

13. Verwendung des Verfahrens wie in den Ansprüchen 1 bis 11 beansprucht zur Kontrolle des assimilierbaren oder biodegradierbaren organischen Kohlenstoffs in Wassersystemen wie in Trinkwassersystemen, Industrieabwassersystemen, oder natürlichen Gewässern.

14. Verwendung des Verfahrens wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 beansprucht zur Kontrolle der metabolischen Aktivität in lebenden Organismen, Geweben oder Zellkulturen.

15. Verwendung des Verfahrens wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 beansprucht zur Bestimmung der absoluten CO2-Konzentration in dem geschlossenen Biodegradatationsbehälter.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Biodegradation oder des Metabolismus von organischen Substanzen zu Kohlenstoffdioxid. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Biodegradation von organischen Substanzen zu Kohlenstoffdioxid durch Analysieren der Veränderungen des 13C/12C stabilen Isotopenverhältnisses des Carbonat/Biocarbonat/CO2-Systems in einem geschlossenen Behälter.

Die Biodegradation von organischen Substanzen ist ein bedeutender Degradationsprozess, der auf natürliche Weise die organischen Verunreinigungen in Boden und Wassersystemen beseitigt. Oft muss die Biodegradation der organischen Verunreinigungen genau beobachtet werden. Die Biodegradation der organischen Verunreinigungen kann unter aeroben Bedingungen oder anaeroben Bedingungen stattfinden.

Im Stand der Technik wird die Biodegradation von aromatischen Verbindungen in der Gegenwart von oxidierenden Agentien oder Elektronenakzeptoren wie Sulfat, Nitrat, Eisen(III)-Verbindungen und anderen geeigneten nicht sauerstoffhaltigen Elektronenakzeptoren beobachtet. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um das Potenzial der intrinsischen anaeroben Biodegradation von aromatischen Komponenten durch eine Mikrobengemeinschaft, einschließlich Screening von spezifischen funktionellen Genmarkern, Bestimmung von wichtigen metabolischen Markern oder Analyse der Isotopenzusammensetzung von Kontaminanten, zu zeigen.

Wenn das Ziel jedoch ist, das Ausmaß der vollständigen Oxidation einer einzelnen Verunreinigung durch Entstehung von Kohlenstoffdioxid zu quantifizieren, sind isotopenbasierte Verfahren und zwar Verfahren, die Isotopenmarkierung verwenden, bevorzugt. Gemäß diesen Verfahren werden die biologisch abzubauenden organischen Verunreinigungen mit entweder 13C oder 14C markiert, und die Entstehung von 13CO2 oder 14CO2 kann gemessen werden, um die vollständige Mineralisierung der einzelnen Verunreinigungen zu bestimmen.

EP1927857A1 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des zirkulierenden Kohlenstoffgehalts in einer Probe durch Umwandlung des gesamten Kohlenstoffs einer Probe in Kohlenstoffdioxid und Bestimmung der Differenz des 14C Gehalts zwischen der Probe und der Umgebung in einem geschlossenen Kreisumlaufsystem. Ein wichtiger Parameter ist hier aber die genaue Bestimmung des gelösten anorganischen Kohlenstoffgehalts, der bekanntermaßen nicht sensitiv ist.

US7642094B2 beschreibt ein Verfahren zur Messung der Biodegradationsrate einer nicht natürlichen organischen Verbindung in der Gegenwart eines Biodegradationsmediums durch Messen der Differenz zwischen der Konzentration von 14C in Kohlenstoffdioxid von einem Medium, dass mit einer Messprobe für die Biodegradation gemischt ist, und einer Konzentration von 14C in derzeitigem Kohlenstoff unter Verwendung der Tatsache, dass das zerfallene radioaktive Kohlenstoffisotop 14C vollständig in nicht natürliche organische Komponenten zerfällt und kein 14C darin übrig bleibt. Dieses Verfahren ist jedoch auf das Messen von Biodegradationsraten von unnatürlichen organischen Komponenten beschränkt, wobei die unnatürliche organische Komponente eine Komponente ist, die kein 14C enthält. Ein wichtiger Parameter ist ebenso hier die genaue Bestimmung des gelösten anorganischen Kohlenstoffgehalts, was bekanntermaßen nicht sensitiv ist.

In den letzten Jahren wurde Isotopenmarkierungstechniken, die stabile Isotope verwenden, den Markierungen, die radioaktive Isotope verwenden, vorgezogen. Gemäß dem Verfahren, das durch Morasch et al. beschrieben wurde, werden 13C-markierte Substrate wie Benzol, Naphthalin oder Acenaphthen zu Sedimenten zugefügt und zu 13CO2 in der Gegenwart von Mikroorganismen abbaut. Auf Basis der Entstehung von 13CO2, das mit Hilfe von Geräten zur Analyse des Isotopenverhältnisses, wie Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS), bestimmt werden kann, ist es möglich, die Mineralisierung der Verbindung von Interesse durch die hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit der 13C/12C stabilen Isotopenanalyse zu belegen. Dieses Verfahren ist aber nicht anwendbar für höhermolekulargewichtige aromatische Verbindungen oder beispielsweise natürliches organisches Material (NOM) sowie gelöstes organisches Material (DOC) oder Öle, da 13C markierte Kontaminanten üblicherweise eine besondere Synthese erfordern, die entweder sehr teuer oder gar nicht möglich sind, da komplexe natürliche Substanzen wie DOC oder Öl nicht synthetisiert werden können.

Im Hinblick auf diese Probleme ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Bestimmung der Biodegradation von Spuren von organischen Verbindungen, wobei die Verfahren keine radioaktiven 14C Isotope verwenden und auf die Verwendung von teuren 13C angereicherten organischen Substraten verzichten, sehr wünschenswert.

Andere Verfahren zur Bestimmung der Biodegradation von organischen Komponenten sind beispielsweise das Messen des biochemischen Sauerstoffbedarfs (BOD), was die Menge des gelösten Sauerstoffs ist, der von aeroben Organismen benötigt wird, um organisches Material, das in einer gegebenen Wasserprobe vorhanden ist, bei einer spezifischen Temperatur über eine spezifische Zeitdauer zu zersetzen, oder das Messen des Abbaus von anderen Elektronenakzeptoren wie Nitrat, Sulfat, etc. Diese Verfahren sind aber gewöhnlich nicht sehr sensitiv und können geringe Mengen an Biodegradation von beispielsweise assimilierbarem organischem Kohlenstoff (AOC) im Trinkwasser nicht bestimmen. Darüber hinaus kann das Messen einer Erhöhung des gesamten CO2 in einer Probe ebenso verwendet werden, um große Anteile an Biodegradation zu bestimmen.

Um die zuvor genannten Probleme anzugehen, hat der Erfinder ein umgekehrtes stabiles Isotopenmarkierungsverfahren entwickelt, um die Biodegradation von aromatischen Komponenten oder anderen organischen Komponenten zu CO2 zu bestimmen. Dieses Verfahren spart den komplizierten Schritt des Markierens der Komponenten für die Biodegradation mit einem stabilen 13C-Isotop ein und verwendet gewöhnliche unmarkierte 12C-Verbindungen (mit dem natürlichen Vorkommen an 13C und 12C), die aufgrund der Biodegradation im gleichen Verhältnis von 13CO2 und 12CO2 mineralisiert werden.

Das Medium für den Biodegradationsassay enthält gewöhnlich eine wässrige Biocarbonat-Pufferlösung mit 1 bis 50%, insbesondere 5 bis 10% Atomprozent an 13C-HCO3 bezogen auf die Gesamtmenge an HCO3 in dem Medium vor Zugabe der biodegradierbaren organischen Substanz. Die andauernde Freisetzung von unmarkiertem 12CO2 aufgrund der Biodegradation der organischen Substanz ändert daher das Kohlenstoffisotopenverhältnis (13C/12C Verhältnis) des Carbonatsystems in dem Biodegradationsassay. Das 13C/12C Isotopenverhältnis der Proben kann mittels Isotopenverhältnis-Analyseinstrumenten wie IRMS oder Isotopenverhältnis-Infrarotspektrometern (IRIS) genau gemessen werden.

Der Vorteil der erfindungsgemäßen Methode liegt in der Verwendung des relativ günstigen 13CO2 anstelle der 13C-markierten organischen Verbindungen und in der sehr genauen IRIS-Analyse des 13C/12C Verhältnisses, die die Detektion von sehr geringen Mengen der CO2 Produktion ermöglicht. Darüber hinaus kann die Biodegradation von Verbindungen wie gelösten anorganischen Komponenten (DIC) gemessen werden, die nicht mit stabilen oder radioaktiven Isotopen markiert werden können.

Das Ausmaß der Mineralisierung kann quantitativ durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens berechnet werden. Die Gesamtmenge an 13CO2 in dem Biodegradationsbehälter bleibt während der Mineralisierung der organischen Verbindungen nahezu konstant, und die Masse der 13C Isotopen kann durch die Menge an NaH13CO3-Pufferlösung, die zu dem wässrigen System hinzugegeben wird, genau bestimmt werden. Das 13CO2, das von dem natürlichen Vorkommen an 13C in der organischen Verbindung freigesetzt wird, beträgt nur etwa 1%, das bei größeren Mengen der Biodegradation ignorierten werden kann oder bei geringen Ausmaßen der Biodegradation durch Berechnung berücksichtigt werden kann. Die Gesamtmasse des zu CO2 mineralisierten 12C, das durch Biodegradation produziert wurde, wird mithilfe der Veränderung des 13C Isotopenverhältnisses in dem Biodegradationsbehälter berechnet.

Daher ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zur Bestimmung der Biodegradation oder des Metabolismus von organischen Substanzen zur Mineralisierung durch Analyse der Veränderung des stabilen Isotopenverhältnisses von 13C/12C in einem System für einen Biodegradations- oder Metabolismus-Assay, zum Beispiel, durch Bereitstellen eines wässrigen Mediums von HCO3, das mit H13CO3 angereichert ist, in dem Biodegradationsbehälter, wie in den Ansprüchen definiert.

Die vorliegende Erfindung ist weiter gerichtet auf ein Verfahren zur Bestimmung des Ausmaßes der Entfernung von organischem Material bei der Wasser/ Abwasserbehandlung und/oder der Trinkwasserherstellung oder zum Beispiel bei dem Abbau von Öl oder gelöstem organischen Kohlenstoff, das nicht synthetisiert oder markiert werden kann. Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Assimilierung von organischem Kohlenstoff in einem Wassersystem wie einem Trinkwassersystem, Industrieabwassersystem, oder Gewässern in der Nature bewertet und auf eine Weise kontrolliert werden, die leicht durchzuführen ist und ökonomisch wünschenswert ist.

Die vorliegende Erfindung ist weiter gerichtet auf ein Verfahren, das Ausmaß der Mineralisierung in mikrobiellen Kulturen wie stabilen Isotopenmarkierungsexperimenten auf eine praktikable und ökonomische Weise zu bestimmen.

Die vorliegende Erfindung ist weiter gerichtet auf ein Verfahren zur Bestimmung der metabolischen Aktivitäten in lebenden Organismen, Geweben oder Zellkulturen.

Die vorliegende Erfindung ist weiter gerichtet auf ein Verfahren zur Bestimmung der CO2 freisetzenden enzymatischen Aktivität in in-vitro-Assays.

Genauer ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung der Biodegradation von organischen Substanzen gerichtet, das die Schritte umfasst:

  • – Bereitstellen eines Biodegradationsassaymediums, das eine Mikrobengemeinschaft, einen Elektronenakzeptor und eine Menge einer organischen Substanz, die durch die Mikrobengemeinschaft abgebaut werden kann, in einem geschlossenen Behälter enthält, wobei das Biodegradationsassaymedium darüber hinaus eine Menge einer CO2-Isotopenmischung enthält, die 13CO2 und 12CO2 in einem Verhältnis von 13/12CO2 enthält, das verglichen mit dem natürlichen Verhältnis von 13/12CO2 erhöht ist;
  • – Entnehmen einer ersten Probe aus dem Behälter und Bestimmen eines ersten Verhältnisses von 13/12CO2 in der ersten Probe;
  • – Kultivieren des Biodegradationsassaymediums, um die Biodegradation unter Bedingungen zur Biodegradation der organischen Substanz zu CO2 ablaufen zu lassen;
  • – Entnehmen einer zweiten Probe aus dem Behälter und Bestimmen eines zweiten Verhältnisses von 13/12CO2 in der zweiten Probe, und
  • – Berechnen der Veränderung des 13/12CO2 Verhältnisses von dem 13/12CO2 Verhältnis der ersten Probe zu dem 13/12CO2 Verhältnis der zweiten Probe.

In einer Ausführungsform wird das Biodegradationsassaymedium bereitgestellt durch Hinzufügen der Mikrobengemeinschaft zu einem Assaymedium, das den Elektronenakzeptor, die Menge der organischen Substanz und die Menge der CO2 Isotopenmischung enthält.

Vorzugsweise wird die Mikrobengemeinschaft bereitgestellt durch eine Probe einer ökologischen Quelle einschließlich eines Trinkwasserversorgungssystems, Industrieabwassersystems oder eines natürlichen Gewässers.

In einer Ausführungsform wird das Biodegradationsassaymedium bereitgestellt durch Zugabe der organischen Substanz zu einem Assaymedium, das den Elektronenakzeptor, die Mikrobengemeinschaft und die Menge der CO2-Isotopenmischung enthält.

In einer weiteren Ausführungsform werden die organischen Substanzen durch eine Probe einer ökologischen Quelle einschließlich eines Trinkwasserversorgungssystems, eines Industrieabwassersystems oder eines natürlichen Gewässers bereitgestellt.

Vorzugsweise wird die oben genannte CO2 Isotopenmischung in einer Menge verwendet, die ausreichend ist, um einen Gehalt von 1 bis 50 bevorzugt 5 bis 40 Atomprozent, besonders bevorzugt 10 bis 20 Atomprozent an 13CO2 der gesamten Menge an CO2 in dem Biodegradationsassaymedium vor Entnahme der ersten Probe bereitzustellen.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst das oben genannte Biodegradationsassaymedium eine wässrige Phase und eine Gasphase.

Vorzugsweise werden die oben genannte erste Probe und die zweite Probe von derselben Art von Phase genommen.

In einer noch weiteren Ausführungsform umfasst die Mikrobengemeinschaft aerobe und anaerobe Mikroorganismen derselben oder einer unterschiedlichen Art, die fähig sind die organischen Substanzen abzubauen und die eine mikrobielle Kultur, autochthone Mikroorganismen, Zellkulturen oder andere Biota sein können.

In einer noch weiteren Ausführungsform werden die Schritte iii. und iv. mindestens einmal vor Berechnung der Veränderung des 13/12CO2 Verhältnisses aus dem 13/12CO2 Verhältnis einer früher entnommenen Probe zu dem 13/12CO2 Verhältnis einer später entnommenen Probe wiederholt.

Vorzugsweise wird das Verhältnis von 13/12CO2 in dem oben genannten Verfahren durch Verwendung eines spektroskopischen Verfahrens, insbesondere Isotopenverhältnis-Infrarotspektroskopie oder unter Verwendung eines massenspektrometrischen Verfahrens insbesondere Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie bestimmt.

Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der zuvor genannten Verfahren zur Bestimmung der Biodegradationskapazität von Mikroorganismen gerichtet.

Weiterhin ist die vorliegende Erfindung auf die Verwendung des oben genannten Verfahrens zur Messung des assimilierbaren oder biodegradierbaren organischen Kohlenstoffs in einem Wassersystem, wie einem Trinkwasserversorgungssystem, einem Industrieabwassersystem oder Gewässern in der Natur gerichtet.

Die vorliegende Erfindung ist weiter auf die Verwendung des oben genannten Verfahrens zur Bestimmung der metabolischen Aktivität in lebenden Organismen, Geweben oder Zellkulturen gerichtet.

Die vorliegende Erfindung ist weiter auf die Verwendung des oben genannten Verfahrens zur Bestimmung der absoluten CO2 Konzentration in dem geschlossenen Biodegradationsbehälter gerichtet.

Wie oben angemerkt, umfasst die Mikrobengemeinschaft aerobe oder anaerobe Mikroorganismen derselben oder unterschiedlicher Art, die in der Lage sind, die organischen Substanzen abzubauen, und die eine mikrobielle Kultur, autochthone Mikroorganismen, Zellkulturen oder andere Biota sein können.

Der Begriff „Biodegradation“ wie im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet, ist als Metabolismus der organischen Substanz zu verstehen.

Beispielsweise enthält eine Ausführungsform eine anaerobe Anreicherungskultur der Mikroorganismen, die aromatische Komponenten abbauen können und die nicht sauerstoffhaltige Oxidationsmittel oder Elektronenakzeptoren wie Nitrat, Eisencitrat oder Sulfat reduzieren.

Geeignete Oxidationsmittel oder Elektronenakzeptoren sind solche, die durch eine passende Mikrobengemeinschaft reduziert werden. Sulfate, Nitrat, Eisen (III) oder nicht sauerstoffhaltige Oxidationsmittel können diesem Zweck dienen.

Für eine genaue Analyse des 13C/12C Isotopenverhältnisses wird der Assay in einem geschlossenen Behälter ausgeführt, so dass die Kohlenstoffdioxidmoleküle während des Biodegradationsprozesses und zum Zeitpunkt der Probenentnahme darin eingeschlossen sind.

In einer beispielhaften Ausführungsform umfasst der Behälter für den Biodegradationsessay ein Medium, das eine Bicarbonatpufferlösung enthält, wobei die H13CO3 und H12CO3 Lösungen in den geschlossenen Behälter als Festkörper oder Lösung gegeben werden und die Menge des H13CO3 genau bestimmt wird. Wasser kann zu dem System hinzugegeben werden, um die Konzentration des H13/12CO3 in dem Bereich von 1–50 mM einzustellen. Für anaerobe Kulturen wird der Kopfraum des Systems mit CO2/N2 oder anderen sauerstofffreien Gasen wie N2 gespült. Falls die Mikroben aerob sind, ist ein Spülen des Kopfraums nicht notwendig. Das 13C/12C Isotopenverhältnis des CO2 in der flüssigen Phase wird in dem Bereich von etwa 0,01–1 eingestellt, aber andere Verhältnisse, die von dem natürlichen Vorkommen des 13C/12C Isotopenverhältnisses der organischen Substanzen abweichen, können ebenso verwendet werden. Das Volumenverhältnis von Kopfraum zu Flüssigkeit liegt im Bereich von 1:10 bis 10:1. Vorzugsweise wird ein Verhältnis von 1:1 verwendet.

Das anfängliche Isotopenverhältnis von 13C/12C wird durch ein Gerät zur Bestimmung des Isotopenverhältnisses genau gemessen. Der anfängliche 13C Isotopenatomprozentsatz, ausgedrückt als AP (13C)initial, wird durch folgende Formel definiert: AP(13C)initial = {(13C)initial/[(12C)initial + (13C)initial]} × 100%(1),wobei (13C)initial und (12C)initial für die Menge der entsprechenden Isotope des Mediums stehen.

Während des Degradationsprozesses der nicht-markierten Substanzen tritt Mineralisierung auf und die Menge des 12CO2 erhöht sich sowohl in der Flüssigkeit als auch in der Gasphase, was zu einer Abnahme des Verhältnisses von 13CO2/12CO2 im gesamten Behälter führt. Der Erfinder hat die Kohlenstoffisotopen-Signatur durch Entnahme entweder der Kopfraumproben oder der Flüssigkeitsproben auf Basis des Prinzips des Kohlenstoffisotopengleichgewichts in dem Kopfraum und der flüssigen Phase gemessen. Sowohl die Kopfraumprobe als auch die Flüssigkeitsprobe sollten praktisch das gleiche 13C/12C Isotopenverhältnis aufweisen, das einzig durch einen bekannten kleinen Gleichgewichtsisotopeneffekt beeinflusst wird, welcher berücksichtigt werden kann. Die Flüssigkeitsprobe ist leicht zu handhaben und gut entwickelte Verfahren zur Messung der Kohlenstoffisotopen-Signatur in Flüssigkeitsproben sind etabliert. Beispielsweise kann hier die Anwendung des Delta RayTM Isotopenverhältnis-Mittel-Infrarot-Spektrometers (IRIS) erfolgen, um eine wesentlich leichtere und günstigere Analyse bereitzustellen. Die IRIS-Analyse zieht ihren Vorteil aus der Tatsache, dass Moleküle Absorptionslinien bei spezifischen Wellenlängen aufgrund der quantenmechanischen Rotations- und Vibrationszustände aufweisen. Das Spektrum der verschiedenen Isotopologen ist relativ zueinander verschoben und ermöglicht, ihre jeweiligen Häufigkeiten durch Messung der Intensitäten der Absorptionslinien der Isotopologen quantitativ zu bestimmen. Die Intensitäten der Absorptionslinien sind proportional zu der Menge der entsprechenden Moleküle. Hierdurch kann das Isotopenverhältnis der Probe quantitativ analysiert werden.

Wenn die Proben aus der Flüssigphase des Biodegradationsbehälters entnommen werden, hat der Erfinder ein ähnliches Verfahren übernommen, das verwendet wird, um die Isotopen-Signaturen des gelösten anorganischen Kohlenstoffs in natürlichen Gewässerproben zu analysieren. Kurz zusammengefasst werden 0,5 mL Flüssigkeitsproben direkt aus dem geschlossenen Degradationsbehälter entnommen und sofort in eine gläserne anaerobe Ampulle (15 mL Volumen) injiziert, die mit einem Butylkautschukstopfen verschlossen ist. Die Ampulle ist mit 50–250 μl Phosphorsäure (1M) vorgefüllt und mit Stickstoff, Heliumgas oder CO2-freier Luft gespült. Die Phosphorsäure reagiert mit den Flüssigkeitsproben und konvertiert alle gelösten anorganischen Kohlenstoffspezies in flüssiges und gasförmiges CO2. Der Kohlenstoffisotopenfraktionierungseffekt, der mit der CO2(g)-CO2(aq) Teilung assoziiert ist, wurde bereits ausführlich diskutiert. Es wird festgehalten, dass die Unterschiede in den Kohlenstoffisotopen-Signaturen zwischen den ursprünglichen Flüssigkeitsproben, die mit 13C (d. h. gelöstem anorganischen Kohlenstoff) hoch angereichert sind, und dem CO2(g) relativ gering sind, verglichen mit den ursprünglichen Flüssigkeitsproben. Es ist begründet anzunehmen, dass diese Unterschiede vernachlässigbar sind, und der Erfinder kann daher den Kopfraum der anaeroben Glasampulle, welche mit einem Butylkautschukstopfen verschlossen ist, mit IRMS oder IRIS analysieren. Im Falle von geringfügigen Änderungen des 13C/12C Verhältnisses im Prozentsatz pro Millionenmaßstab muss der Gleichgewichtsisotopeneffekt zwischen dem wässrigen Bicarbonat und dem gasförmigen CO2 unter Umständen berücksichtigt werden. Die Kohlenstoffisotopen-Signaturen der angesäuerten Proben sind bis zu 6 Monaten stabil.

Der 13C Isotopenprozentsatz der Probe, AP(13C)final, wird durch die folgende Formel definiert: AP(13C)final = {(13C)final/[(12C)final + (13C)final]} × 100%(2),wobei (13C)final und (12C)final für die Mengen der 13C und 12C Isotope in dem Biodegradationsbehälter zum Zeitpunkt der Probennahme stehen. Die Menge des durch Degradation entwickelten CO2 wird durch die folgende Formel berechnet: 12C = (12C)final – (12C)initial = [1/AP(13C)final – 1/AP(13C)initial] × (13C)initial(3),wobei (13C)final, (12C)final für die Endmenge der entsprechenden Isotopen in dem Medium stehen und die Menge des (13C)initial während des Biodegradationsprozesses konstant bleibt.

In bestimmten Zeitabständen werden Proben für die Analyse, wie oben erwähnt, genommen.

Für eine routinemäßige Analyse des Isotopenverhältnisses, bei der das 13C/12C mit dem natürlichen 13C/12C Isotopenverhältnis verglichen wird, können analytische Instrumente wie IRMS verwendet werden. Üblicherweise wird IRMS vielfach verwendet, um das relative Vorkommen der Isotopen in einer gegebenen Probe zu messen. Die Anwendung von IRMS zur Analyse von „stabilen Isotopen“ ist normalerweise mit der Messung von Isotopenvariationen, welche auf massenabhängigen Isotopenfraktionierungen in natürlichen Systemen beruhen, verbunden.

In einer typischen Probenmessung unter Verwendung eines IRMS Massenspektrometers werden Gasproben durch ein Probeneinführungssystem injiziert und in der Ionenquelle des Massenspektrometers ionisiert. Die geladenen Ionen werden fokussiert und durch eine hohe Spannung beschleunigt. Das Massenspektrometer selbst ist ein magnetischer Bereichsanalysator und die Ionen durchlaufen das magnetische Feld bevor sie die Faraday-Kollektordetektoren erreichen. Die Stärke des magnetischen Feldes und die Beschleunigungsspannung bestimmen die Flugbahn der Ionen und daher welche Ionen in den Faraday-Kollektor eintreten. Die Verwendung von Mehrfach-Kollektoren erlaubt die gleichzeitige Messung von Ionenintensitätsverhältnissen, wodurch Schwankungen in der Intensität des Ionenstrahls ausgeglichen werden. Für die Messung des Kohlenstoffisotopenverhältnisses sind zwei Kollektoren notwendig, die beabstandet sind, um die ionisierten Moleküle, die das Masse-Ladungsverhältnis 44 (12CO2) und 45 (13CO2) haben, einzufangen. Jeder Kollektor ist mit seinem eigenen Verstärker verbunden, dessen Verstärkung durch einen präzisen hochohmigen Widerstand definiert ist. Jeder Verstärker hat eine andere Verstärkung, sodass Ionenverhältnisse im natürlichen Häufigkeitsbereich ähnliche Signale produzieren werden. Typische relative Verstärkungszunahmen für 12CO2 und 13CO2 sind 3 bzw. 300. Die absolute Verstärkung des Kollektors zum Sammeln von 12CO2 ist typischerweise 3 × 108. Einige Instrumente stellen die Fähigkeit bereit, die Verstärkung der bestimmten Verstärker zu verändern, um die Messung der Proben zu erleichtern, die mit bestimmten stabilen Isotopen markiert wurden, d.h., das relative Vorkommen der Haupt- und Nebenisotope kann fast gleich sein.

Nichtsdestotrotz soll erwähnt werden, dass IRMS in den meisten Fällen für die Messung von schwereren Isotopen in einem geringen natürlichen Häufigkeitsbereich konzipiert ist und daher die Isotopen-Signaturen der hochangereicherten Proben außerhalb des linearen Bereichs liegen können.

In dieser Hinsicht kann IRIS eine Alternative sein, um dieses Linearitätsproblem zu lösen, wenn die Erfinder 13C-Isotop-angereicherte Proben mit dem 13C/12C Verhältnis >> gegenüber dem Verhältnis von 13/12C in der Natur messen.

Ein Thermo ScientificTM Delta RayTM Isotopenverhältnis-Infrarotspektrometer mit Universal Referencing Interface (URI) Connect kann hier verwendet werden und stellt eine Lösung bereit, die über die kontinuierliche Messung der Isotopenverhältnisse und Konzentrationen von CO2 in der Luft zu diskreten Proben wie Kopfraumanalysen oder einer direkten Injektion von kleinen Mengen von CO2 hinausgeht. Die URI gewährleistet kalibrierte und nachprüfbare CO2 Messungen über einen großen Bereich von experimentellen Zeitskalen und erstreckt sich auf die Analyse von diskreten Proben wie dem Kopfraum von Ampullen in einem Autosampler oder eines Aliquots, das durch einen multifunktionalen Injektionsport eingeführt wurde. Darüber hinaus ermöglicht es einem das URI Connect System, sich leicht mit Proben, die nur in Mengen von 80 μg CO2 erhältlich sind, wie in Ampullen, Spritzen oder Taschen zu verbinden und um dann in dem Delta Ray Analysator analysiert zu werden. Der Delta Ray IRIS kann Genauigkeiten erreichen so niedrig wie 0,05 ‰ für δ13C und δ18O des CO2. Dies wird durch eine Kombination der Vorteile des Mittel-Infrarot, des genau kontrollierten Drucks und der Rückkopplungsschleifen für die Temperatur innerhalb des optischen Kerns erreicht. Um belastbare analytische Resultate sicherzustellen, gleicht die URI Connect Schnittstelle die Konzentration der Referenzgase gegen die der Probe intelligent aus und stellt eine überlegene Genauigkeit sicher. Das URI bewirkt, dass klassische Doppeleingangs-IRMS-Analysekonzepte auf IRIS beruhen.

Proben in Spritzen, Flaschen oder Taschen werden bequem durch den Injektionsport auf der URI Connect Schnittstelle analysiert.

Im Kern des URI Connect Systems ist ein variables Volumen, das das Probengas beispielsweise einer Ampulle in einem Autosampler sammelt oder durch einen Frontport injiziert. Das System kann automatisch die Konzentration der Proben bestimmen und die Verdünnung anpassen, um die Isotopenanalyse in dem Delta Ray IRIS bei einer optimalen konstanten Konzentration durchzuführen, um eine ausgezeichnete Wiederholbarkeit in einem im Feld einsetzbaren Setup zu erreichen.

Im Zentrum des URI steht MITCH (Mix and swiTCH), eine einzigartige mit Präzision konstruierte Misch- und Schaltvorrichtung, um verbesserte Referenzschemata zu unterstützen. Es ist so ausgelegt, eine Vielzahl von Kalibrierungs- und Probengasen zu verdünnen und zu wechseln, eine zentrale Anforderung für eine zuverlässige Isotopenanalyse. Bevor das Probengas den Laseranalysator erreicht, wird es durch ein wartungsfreies Membrantrocknungssystem getrocknet, um den Sauerstoffisotopenaustausch und irgendwelche Matrixeffekte des Wassers zu verhindern, mit dem Zusatznutzen, dass Konzentrationsdaten für den trockenen Molanteil bereitgestellt werden.

Entstandenes CO2 ist in dem Biodegradationsbehälter in der flüssigen Phase als DIC und als gasförmiges CO2 in dem Kopfraum vorhanden. Der Erfinder kann die Kohlenstoffisotopen-Signaturen in der flüssigen Phase wie zuvor diskutiert analysieren, aber der Unterschied zwischen dem 13C/12C Isotopenverhältnis in der flüssigen Phase und dem 13C/12C Isotopenverhältnis des gasförmigen CO2 in dem Kopfraum aufgrund der Kohlenstoffkinetik und Gleichgewichtsfraktionierungseffekten sollte bei kleinen Ausmaßen der Biodegradation berücksichtigt werden.

Gelöster anorganischer Kohlenstoff kann in drei Arten existieren: CO2(aq), HCO3 und CO32–. Daher wird das Gleichgewicht zwischen gelöstem anorganischen Kohlenstoff und gasförmigem CO2 durch die Kohlenstoffspeziation der Lösung, d.h. den Anteil an CO2(aq), HCO3 und CO32– und den individuellen Fraktionierungsfaktor jeder Art im Hinblick auf das gasförmige CO2 entschieden. Die Anteile des CO2(aq), HCO3 und CO32– werden durch den pH Wert der Flüssigkeitsprobe bestimmt. In einem pH-gepufferten Biodegradationsprozess ändert sich der pH Wert nicht signifikant und kann daher als konstant angesehen werden. Gemäß den im Stand der Technik bekannten Berechnungen liegt der Fraktionierungseffekt bei einer Temperatur von 25°C zwischen HCO3 und CO2 Gas, zwischen CO32– und CO2 Gas und zwischen wässrigem und gasförmigem CO2 bei unter 0,01 Atomprozent. Daher ist der Unterschied zwischen den 13C/12C Isotopenverhältnissen der flüssigen Phase und der gasförmigen Phase verglichen mit dem 13C/12C Isotopenverhältnis des geschlossenen Behälters hier relativ klein. Daher kann das Fraktionsverhältnis der Kohlenstoffisotope zwischen den Carbonat-Arten für die Dateninterpretation vernachlässigt werden, und die Kohlenstoffisotopen-Signatur der flüssigen Phase des Behälters ist repräsentativ für das Gleichgewicht in dem Behälter bei größerem Ausmaß der Biodegradation. Wenn die Veränderungen des 13C/12C Verhältnisses klein sind, muss der Gleichgewichstisotopeneffekt berücksichtigt werden.

Zusammenfassend ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren dadurch die quantitative Analyse des Ausmaßes der Biodegradation von organischen Substanzen zu CO2, daß man den Degradationsbehälter mit relativ günstigem 13CO2 anreichert und die Veränderung des Isotopenverhältnisses, die durch den Abbau der organischen Substanz zur vollständigen Mineralisierung zu CO2 begründet ist, analysiert. Verglichen mit dem herkömmlichen Verfahren zur Isotopenanalyse vermeidet die vorliegende Erfindung die Verwendung sehr teurer Isotopen-markierter organischer Substanzen und stellt ein Verfahren zur Analyse des Degradationsausmaßes auf einem leicht handhabbaren und ökonomisch vorteilhaftem Weg zur Verfügung.

Darüber hinaus stellt das erfindungsgemäße Verfahren einen Weg zur schnellen Bewertung und Kontrolle des assimilierbaren organischen Kohlenstoffs in Wassersystemen, wie einer Trinkwasserversorgungsanlage, Industriewasser, Abwasserbehandlung oder natürlichen Gewässern bereit.

Darüber hinaus stellt das erfindungsgemäße Verfahren einen Weg zur Evaluierung des Metabolismus von anderen nichtmikrobischen Biota wie Respiration von Tieren oder Pflanzen oder metabolischen Aktivitäten von Zellkulturen bereit.

Die vorliegende Erfindung wird ebenso durch die beigefügten Figuren verdeutlicht:

Die Figuren zeigen:

1) Anaerobe Degradation von 2-Methynaphthalinen durch die sulfatreduzierende Anreicherungskultur N47 in einer Behälterkultur mit 34% (Atomprozent) H13CO3.

2) Anaerobe Degradation von Toluol durch Geobacter metallireducens mit Eisencitrat als Elektronenakzeptor in einer Behälterkultur mit 34% (Atomprozent) H13CO3.

Die vorliegende Erfindung wird weiter verdeutlicht durch die folgenden nicht-limitierenden Beispiele.

Experimenteller Teil Kulturen und Kultivierung

Als Mikroorganismen wurden Thauera aromatica (Stamm K172/DSM 6984) und Geobacter metallireducens (Stamm GS-15/ATCC 53774/DSM 7210) von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland) erworben. Beide wurden unter anoxischen Bedingungen in einem carbonat-gepufferten Frischwassermineralmedium bei pH 7,2 bis 7,2 versetzt mit Toluol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland), kultiviert, unter Verwendung von 5 mM Nitrat und 50mM Eisenzitrat als Eletronenakzeptoren (Oxidationsmittel).

Die sulfatreduzierende, 2-Methylnaphthalin-abbauende Anreicherungskultur N47 wurde, wie zuvor beschrieben, kultiviert. Beispielsweise wurde die 2-Methylnaphthalin-abbauende Anreicherungskultur N47 angereichert mit Bodenmaterial von einem kontaminierten Grundwasserleiter nahe Stuttgart, Deutschland mit Naphthalin als der einzigen Kohlenstoff- und Energiequelle in der Gegenwart des festen Adsorberharzes Amberlite-XAD7 (Fluka, Buchs, Schweiz). XAD7 dient als ein Substratpuffer, der die Kulturen mit ausreichenden Mengen an Hydrogencarbonat versorgt und die Konzentration auf einem konstanten niedrigem Level von etwa 50 mM hält. XAD7 wurde vorsichtig fünfmal mit Ethanol (99,8%) und fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Spuren von Ethanol wurden durch Trocknung für 2 bis 3 Tage bei 90°C entfernt. Eine 0,3 g Portion von XAD7 wurde in einer leeren 100 ml Serumflasche autoklaviert und die Flasche wurde mit 50 ml Biocarbonat-gepuffertem Frischwassermedium, pH 7,2 bis 7,4, das mit 1 mM Sulfid reduziert wurde, gefüllt. Subkulturen wurden mit einem 10%-igen Volumen der Flüssigphase in einem 4-Wochen Zeitraum mit 10 mM Sulfat als Elektronenakzeptor geimpft. Die Flaschen wurden mit N2-CO2 (80:20) gespült, mit einem Viton-Gummistopfen (Maag Technik, Dübendorf, Schweiz) verschlossen und bei 30°C im Dunkeln inkubiert. Nach fünf bis sechs Übertragungen waren die Kulturen fähig in Abwesenheit von XAD7 zu wachsen. Naphthalin und andere polyzyklische aromatische Komponenten wurden als Flüssigkeiten oder als feste Kristalle (2 bis 4 mg/50 ml) hinzugegeben und mit monoaromatischen Konzentrationen von 0,5 bis 1 mM. Für die Kultur N47 wurde 1 mL von 1,5% 2-Methynaphthalin in 2,2,4,4,6,8,8-Heptamethylnonan (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) zu den Kultivierungsflaschen nach dem Autoklavieren hinzugegeben.

Für jede Kultur wurden umgekehrte stabile (reverse stable) Isotopenexperimente unter Verwendung von 5 separaten Serumflaschen, die mit 150 mL Medium gefüllt und deren Kopfraum mit 100 mL von CO2/N2 (20:80, v/v) gespült wurde, durchgeführt. Drei Flaschen wurden mit 10% (v/v) aktiven Elternkulturen geimpft, wobei die anderen beiden mit getöteten Kulturen (dreimal autoklaviert) geimpft wurden und als Kontrollen dienten. NaH13CO3 und Na12CO3 wurden aus 1M autoklavierten Stocklösungen hinzugegeben. Die NaHCO3-Gesamtkonzentration betrug 30 mM. Alle Kulturflaschen wurden bei 30 °C im Dunkeln inkubiert.

Analytische Methoden

Zur Bestimmung des Abbaus durch G. metallireducens wurden die Toluolkonzentrationen unter Verwendung von 1mL Flüssigproben durch GC/MS (GC, Trace-DSQ; MS, Thermo Finnigan, San Jose, CA) im selektiven Ionenmonitoringmodus mit einer Quarzglaskapillarsäule DB-5 wie zuvor beschrieben quantifiziert. Ethylbenzol wurde als interner Standard hinzugegeben. Die Gesamtkonzentration von Toluol in den Kulturen wurde von den summierten Konzentrationen in der Flüssigphase und in dem Kopfraum bestimmt, berechnet mit Henry`s law (H = 0.235 bei 25 °C).

Für die sulfatreduzierende Kultur N47 wurde der Sulfatverbrauch unter Verwendung der Barium-Gelatin Methode aufgezeichnet. Für eisenreduzierende Kulturen wurde die Eisen II Produktion mit dem Ferrozin-Assay gemessen.

Für die Kohlenstoff-stabile-Isotopenanalyse wurden 100 μL der Kopfraumproben manuell in ein GC/C/IRMS System injiziert, welches aus einem TRACE GC Ultra Gaschromatographen mit geteilten/ungeteilten Injektor (GC) (Thermo Fisher Scientific Corporation, Milan, Italien) gekoppelt an einen Finnigan MAT 253 Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (IRMS) über eine Finnigan GC Combustion III Schnittstelle (Thermo Fisher Scientific Corporation, Bremen, Deutschland) gekoppelt ist. Die Temperatur des Injektors wurde für 350 Sekunden bei 150 °C gehalten. Helium wurde als Trägergas mit einer konstanten Flussrate von 1,6 ML min–1 verwendet. Der Split-Flow wurde auf 160 mL min–1 eingestellt. Die Werte sind als Mittel von Dreifachanalysen angegeben.

Mit 30% 13C-markiertem Natriumbicarbonat durchgeführte Versuche

Zwei Experimente wurden mit 30% 13C-markiertem Natriumbicarbonat durchgeführt, d.h. (1) anaerobe Toluoldegradation durch Geobacter metallireducens und (2) anarobe 2-Methynaphatlindegradation durch die N47 Anreicherungskultur. Während des Zeitverlaufes der anaeroben Degradation von Toluol verringerten sich die Kohlenstoffisotopenwerte (Atomprozent) schrittweise von 33,16 % zu 28,62 % (13C AP) für Geobacter metallireducens, was mit dem Verbrauch von Toluol übereinstimmt. Keine signifikanten Veränderungen wurden für Toluolkonzentrationen und Kohlenstoffisotopenverhältnissen in dem Referenzbehälter beobachtet. Während des Zeitverlaufs der anaeroben Degradation von 2-Methynaphalin durch die Anreicherungskultur N47 haben die Kohlenstoffisotopenverhältnisse schrittweise von 34,01 % zu 28,58 % (13C-Atomprozent) abgenommen, was der Reduktion des Sulfates entspricht. Keine signifikanten Änderungen wurden für Sulfatkonzentrationen und Kohlenstoffisotopenverhältnisse in den Referenzbehältern beobachtet. Die zwei Experimente stellen gute Beweise dar, dass die umgekehrte stabile Isotopenmarkierungsmethode verwendet werden kann, um die Mineralisierung der aromatischen Komponenten unter anaeroben Bedingungen zu quantifizieren.

Berechnung des Ausmaßes der Mineralisierung zu CO2 Während der Mineralisierung der aromatischen Verbindungen erhöhte sich die Gesamtmenge des 13CO2 in dem geschlossenen Biodegradationsbehälter (einschließlich Kopfraum und wässriger Phase) leicht. Zu Beginn wurde eine bekannte Menge von 30 mM NaHCO3 Pufferlösung zu dem Behälter gegeben. Frischwasser wurde hinzugegeben, um das Flüssigkeitsvolumen auf etwa 150 mL in der Flüssigphase einzustellen. Die Gesamtmenge des 13CO2 war 30 mM × 33.16 % = 9.9 mM (Geobacter) und 30 mM × 34.01% = 10.2 mM in dem geschlossen Behälter. Die Gesamtmenge des 12CO2 war 30 mM × 66.84 % = 20.1 mM (Geobacter) und 30 mM × 65.99% = 19.8 mM (N47) in dem geschlossen Behälter.

Zum Ende der Experimente wird das gesamtproduzierte 12C in dem geschlossenen Biodegradationsbehälter durch folgende Formel erhalten: Gesamtproduziertes 12C = 12Cfinal12Cinitial = [1/AP (13C)final – 1/AP (13C)initial] × (13C)initialEq (3)

Unter Verwendung dieser Gleichung wird das Mineralisationsausmaß der aromatischen Verbindungen berechnet und in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1. Berechnung der Mineralisierung auf Grundlage der 12C Produktion

Mirkoorganismen Geobacter metallireducens Anreicherungskultur N47 NaH13CO3(13C)initial (mM) 9.9 10.2 NaH12CO3(12C)initial (mM) 20.1 19.8 AP(13C)initial (%) 33.16 34.01 AP(12C)initial (%) 66.84 65.99 AP(13C)final (%) 28.62 29.58 AP(12C)final (%) 71.38 70.42 NaH12CO3 final (mM) 24.8 24.3 CO2 durch Degradation (mM) 4.7 4.5

Für den Toluolabbau durch Geobacter metallireducens wurde die anfänglich hinzugefügte Toluolmenge zu 4,7 mM CO2 mineralisiert, was 0,68 mM Toluol entspricht. Für den 2-Methylnaphthalinabbau durch N47 wurde 4,5 mM CO2 produziert, was 0,4 mM Methylnaphthalin entspricht.

Die Charakterisierung des Bioabbaus von aromatischen Verbindungen unter anaeroben Bedingungen dürfte eine Genauigkeit von 0,01 % 13CO2 erfordern. IRMS ist gewöhnlich das Standardverfahren für die Isotopenvorkommensanalyse aufgrund seiner hohen Genauigkeit (< 0,01 %). IRMS ist aber nicht geeignet für die Bestimmung von Atomprozent 13CO2– Werten in hochangereicherten Proben (zum Beispiel 10–50 Atomprozent 13CO2). Für die Kohlenstoffisotopenanalyse durch IRMS sind Faraday-Cup-Kollektoren ausgelegt, um die Signale bei m/z 44, 45 und 46 zu erfassen. Jeder Faraday Cup ist mit seinem eigenen hochohmigen Widerstand verbunden, der das einkommende Isotopensignal invers verstärkt, so dass alle Isotopen in demselben Bereich gemessen werden können. Wenn Messproben mit 13C hochangereichert sind, ist die Verstärkung der Signale von m/z 45 und 46 zu stark, um die Isotopensignale in demselben Bereich zu halten, wie bei den Messungen deutlich gezeigt ist. Auf diese Weise kann IRMS nicht die richtigen Werte des Kohlenstoffisotopenverhältnisses angeben.

Verglichen mit IRMS zeigt das Delta Ray IRIS mit URI Connect exzellente Linearität bis zu 25 % AP 13CO2. CO2-Gasmischungen werden aus Gasstandards hergestellt. Unter Verwendung der Ein-Punkt-Kalibration bei einem Verhältnis von 9,9%, wurde die unerreichte Linearität des Delta Ray zwischen einem 13CO2/12CO2 Verhältnis von 1,9 % und 25 % gezeigt. Dies bestätigt, dass das Delta Ray IRIS das Instrument der Wahl ist, um hohe 13C/12C-Isotopenverhältnisse in umgekehrten Isotopenmarkierungsexperimenten zu messen.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • EP 1927857 A1 [0005]
  • US 7642094 B2 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Morasch et al. [0007]