Title:
Kombiniertes optisch-spektroskopisches Verfahren zur Bestimmung von mikrobiellen Erregern
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers. Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Bakteriums und dessen Antibiotikaresistenz. Ferner werden Systeme, Programmelemente und computerlesbare Medien zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz umfasst.




Inventors:
Neugebauer, Ute, Dr. (07743, Jena, DE)
Stranik, Ondrej, Dr. (07743, Jena, DE)
Löffler, Bettina, Prof. Dr. (07747, Jena, DE)
Popp, Jürgen, Prof. Dr. (07751, Jena, DE)
Application Number:
DE102016113748A
Publication Date:
02/01/2018
Filing Date:
07/26/2016
Assignee:
Leibniz-Institut für Photonische Technologien e. V., 07745 (DE)
Universitätsklinikum Jena, 07743 (DE)
International Classes:



Foreign References:
74280452008-09-23
75483102009-06-16
85475502013-10-01
85537322013-10-08
200500526452005-03-10
200501239172005-06-09
200700860042007-04-19
WO2007056568A22007-05-18
Other References:
Schröder et al. Scientific Reports, 2015
Choi et al., Science Translational Medicine, 2015
Schröder et al.
Attorney, Agent or Firm:
Maiwald Patentanwaltsgesellschaft mbH, 80335, München, DE
Claims:
1. Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers in einer Probe umfassend den mikrobiellen Erreger, umfassend die Schritte:
– Bestimmen des Raman-Spektrums des mikrobiellen Erregers durch Raman-Spektroskopie der Probe,
– Bestimmen der Morphologie des mikrobiellen Erregers durch optische Detektion der Probe,
– Bestimmen des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

2. Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz umfassend die Schritte von Anspruch 1 und ferner umfassend den Schritt:
– Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers;
wobei die Probe ferner ein Antiinfektivum enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die optische Detektion durch Mikroskopie, holographische Detektion oder dynamische Lichtstreuung ist, wobei die Mikroskopie Durchlichtmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfassend die Schritte:
– Kultivierung der Probe umfassend mindestens einen mikrobiellen Erreger und ein Antiinfektivum;
– Raman-Spektroskopie der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
– optische Detektion der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, ferner umfassend den Schritt:
– Bestimmen des Zellwachstums des mikrobiellen Erregers durch optische Detektion;
wobei die Bestimmung der Antiinfektivaresistenz auf dem bestimmten Raman-Spektrum, der bestimmten Morphologie und dem bestimmten Zellwachstum des mikrobiellen Erregers basiert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei der mindestens eine mikrobielle Erreger ein Bakterium und das Antiinfektivum ein Antibiotikum ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei bei dem Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers ein erster Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum verwendet wird, wobei der erste Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum eine unveränderte Zellmorphologie des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ist und wobei optional bei dem Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers ein zweiter Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum verwendet wird, wobei der zweite Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum eine unverändertes oder eine für einen bestimmten Resistenzmechanismus charakteristisch verändertes Raman-Spektrum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ist und/oder wobei optional bei dem Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers ein dritter Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum verwendet wird, wobei der dritte Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum ein unverändertes Zellwachstum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Negativkontrolldaten von einer Probe stammen, die den mikrobiellen Erreger ohne Antiinfektivum umfasst.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei das Verfahren zusätzlich mit einer Kontrollprobe enthaltend den mindestens einen mikrobiellen Erreger ohne Antiinfektivum durchgeführt wird und/oder wobei das Verfahren weniger als 180 Minuten, bevorzugt weniger als 150 Minuten, noch mehr bevorzug weniger als 120 Minuten, am meisten bevorzugt weniger als 60 Minuten dauert.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe von einem Individuum, bevorzugt einem Säugetier, besonders bevorzugt einem Menschen entnommen ist und/oder 1·102 bis 1·105, bevorzugt 5·103 bis 1·104 mikrobielle Erreger enthält.

11. System zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers umfassend:
– Raman-Spektrometer zur Bereitstellung eines Raman-Spektrums des mikrobiellen Erregers,
– Vorrichtung zur optischen Detektion des mikrobiellen Erregers zur Bereitstellung von optischen Daten des mikrobiellen Erregers,
wobei das System zur Bestimmung der Morphologie des mikrobiellen Erregers durch Analyse der optischen Daten und zur Bestimmung des mikrobiellen Erregers basierend auf einer Kombination des Raman-Spektrums und der Morphologie des mikrobiellen Erregers ausgeführt ist;
wobei das System ferner optional zur Bestimmung der Antiinfektivaresistenz auf einer Kombination des Raman-Spektrums und der Morphologie des mikrobiellen Erregers ausgeführt ist.

12. Programmelement zur Bestimmung eines Erregers, das, wenn es auf einem Prozessor ausgeführt wird, den Prozessor anleitet, die folgenden Schritte durchzuführen:
– Bestimmen einer Morphologie des mikrobiellen Erregers basierend auf den Daten einer Vorrichtung zur optischen Detektion des Erregers, und
– Bestimmen des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers;
wobei das Programmelement ferner optional den Prozessor anleitet, den folgenden Schritt durchzuführen:
– Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

13. Computerlesbares Medium, auf dem ein Programmelement gespeichert ist, das, wenn es auf einem Prozessor ausgeführt wird, den Prozessor anleitet, die folgenden Schritte durchzuführen:
– Bestimmen einer Morphologie des mikrobiellen Erregers basierend auf den Daten einer Vorrichtung zur optischen Detektion des Erregers, und
– Bestimmen des mikrobiellen Erregers basierend auf einem Raman-Spektrum des mikrobiellen Erregers und der Morphologie des mikrobiellen Erregers;
wobei das computerlesbare Medium ferner optional den Prozessor anleitet, den folgenden Schritt durchzuführen:
– Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

Description:

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers. Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Bakteriums und dessen Antibiotikaresistenz.

Technologischer Hintergrund

Die derzeit etablierten Techniken zur phänotypischen Resistenztestung aus Patientenmaterial basieren auf mindestens zwei Kulturschritten, so dass das Analyseergebnis frühestens 48 Stunden nach Probenentnahme vorliegen kann. Der erste Kulturschritt in diesem Verfahren dient der Gewinnung einer reinen Bakterienkultur, der zweite beinhaltet die Resistenztestung selbst. Gängige Tests zur Resistenztestung sind der Agardiffusionstest, der E-Test und der Mikrodilutionstest. Die Identifizierung von Antibiotikaresistenzen mit Hilfe der Raman-Spektroskopie konnte für Vancomycin-resistente Enterokokken gezeigt werden (Schröder et al. Scientific Reports, 2015). Außerdem gibt es Algorithmen, die die Morphologie von Bakterien unter Einfluss von Antibiotika erfassen. Diese Algorithmen benötigen allerdings die vorherige Identifizierung der Bakterien und zeigten in Tests mit mehreren klinischen Isolaten noch eine Fehlerquote von fast 10% (Choi et al., Science Translational Medicine, 2015).

Automatisierte Assays benötigen größere Mengen an biologischem Material, das über eine Übernachtkultur gewonnen werden muss. Außerdem dauert die Diagnose häufig 8 bis 10 h, oder in manchen Fällen sogar länger. Neuere Ansätze, die auf einer genotypischen Identifizierung und Charakterisierung der Antibiotikaresistenz beruhen sind zwar deutlich schneller und können oft auch direkt aus dem Patientenmaterial durchgeführt werden, sie erfordern jedoch eine genaue Kenntnis der charakteristischen Nukleinsäuresequenzen und versagen daher oft bei der Identifizierung von schnell mutierenden multiresistenten Gramnegativen Erregern.

Daher ist es mit den bisherigen Techniken nicht möglich, eine schnelle und zuverlässige Antibiotikaresistenz-Analyse von noch nicht identifizierten mikrobiellen Erregern wie Bakterien durchzuführen. Um die Antiinfektiva-Therapie, insbesondere die Antibiotika-Therapie, auf den Patienten und seinen mikrobiellen Erreger optimal zuzuschneiden, wären kürzere Bestimmungszeiten, insbesondere der Antibiotikaresistenzen, wünschenswert. Darüber hinaus könnte man dadurch den Einsatz von Breitbandantibiotika reduzieren sowie falsche Therapien bei unbekannten Resistenzen vermeiden.

Zusammenfassung der Erfindung

Somit kann es als Aufgabe der Erfindung angesehen werden, ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers bereitzustellen. Insbesondere ist es die Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung eines mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz bereitzustellen. Im Speziellen kann es als eine Aufgabe der Erfindung angesehen werden, ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung eines Bakteriums und dessen Antibiotikaresistenz bereitzustellen.

Die Aufgabe der Erfindung wird mittels des Verfahrens des unabhängigen Anspruches 1 gelöst. Weitere Vorteile und Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Generell betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers umfassend die Schritte Raman-Spektroskopie einer Probe umfassend mindestens einen mikrobiellen Erreger und optische Detektion der Probe.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers, umfassend die Schritte:

  • – Bestimmen des Raman-Spektrums des mikrobiellen Erregers durch Raman-Spektroskopie,
  • – Bestimmen der Morphologie des mikrobiellen Erregers durch optische Detektion,
  • – Bestimmen des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

In einer spezifischen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt:

  • – Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers;
wobei die Probe ferner ein Antiinfektivum enthält.

Die optische Detektion kann durch Mikroskopie, holographische Detektion oder dynamische Lichtstreuung erfolgen. In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die optische Detektion durch Mikroskopie. Das mikroskopische Verfahren kann beispielsweise Durchlichtmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie sein. Als bevorzugtes mikroskopisches Verfahren wird die Durchlichtmikroskopie eingesetzt.

Durch die Kombination der optisch-morphologischen und Raman-spektroskopischen Bestimmung wird eine schnelle und zuverlässige Bestimmung des mikrobiellen Erregers ermöglicht. Die Identifizierung des mikrobiellen Erregers und ggf. dessen Antiinfektivaresistenz erfolgt durch automatisierte Analyse, z. B. anhand von multivariable statistischen Methoden und Abgleich mit Datenbanken, die lokal oder zentral verfügbar sind.

Die Begriffe „Bestimmen”, „Bestimmung” und „Identifizierung” sind in dieser Anmeldung austauschbar verwendbar.

Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz umfassend die Schritte Raman-Spektroskopie einer Probe umfassend mindestens einen mikrobiellen Erreger und ein Antiinfektivum und optische Detektion der Probe, und Bestimmung der Antiinfektivaresistenz basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

In einer spezifischen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt:

  • – Bestimmen des Zellwachstums des mikrobiellen Erregers durch optische Detektion wobei die Bestimmung der Antiinfektivaresistenz auf dem bestimmten Raman-Spektrum, der bestimmten Morphologie und dem bestimmten Zellwachstum des mikrobiellen Erregers basiert.

Bei der Bestimmung der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers kann ein erster Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum verwendet werden, wobei der erste Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum eine unveränderte Zellmorphologie des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ist. Ferner, kann bei der Bestimmung der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers ein zweiter Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum verwendet werden, wobei der zweite Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum ein unverändertes oder ein für einen bestimmten Resistenzmechanismus charakteristisch verändertes Raman-Spektrum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ist. Außerdem kann bei der Bestimmung der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers ein dritter Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum verwendet werden, wobei der dritte Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum ein unverändertes oder geringfügig unverändertes Zellwachstum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ist.

Die Negativkontrolldaten können Daten von einer Probe mit dem mikrobiellen Erreger ohne Antiinfektivum sein. Die Daten dieser Probe können bereits vorliegen, z. B. als Daten einer Probe, die bereits zu einem früheren Zeitpunkt gemäß dem vorliegenden Verfahren analysiert wurden. Alternativ kann die Probe mit dem mikrobiellen Erreger ohne Antiinfektivum parallel zur Probe mit dem Antiinfektivum analysiert werden. In einer anderen Ausführungsform können die Negativkontrolldaten von derselben Probe, bevor sie in Kontakt mit dem Antiinfektivum gekommen ist, stammen.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz umfassend die Schritte: Kultivieren einer Probe umfassend mindestens einen mikrobiellen Erreger und ein Antiinfektivum; Raman-Spektroskopie der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe und optische Detektion der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe.

Durch die Kombination von optisch-morphologischen und Raman-spektroskopischen Analysen wird die gleichzeitige Identifizierung des mikrobiellen Erregers als auch die Antiinfektivaresistenz-Bestimmung in einem Test ermöglicht. Außerdem wird durch das kombinierte Verfahren eine schnellere und zugleich empfindlichere Resistenztestung ermöglicht. Das Verfahren ist einfach zu parallelisieren und kann daher in der Routinediagnostik zum Testen von mehreren Antiinfektiva (Resistogramm), insbesondere Antibiotika, eingesetzt werden. Für dieses Verfahren sind geringe Mengen von mikrobiellen Erregern, wie z. B. 100–1000 Bakterien pro Test, ausreichend. Daher können zeitaufwändige Kultivierungs- und Isolierungsschritte vermieden werden.

Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Bestimmung eines Bakteriums und dessen Antibiotikaresistenz umfassend die Schritte: Kultivieren einer Probe umfassend mindestens ein Bakterium und ein Antibiotikum; Raman-Spektroskopie der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe, und optische Detektion der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe. Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders zur Identifizierung eines multiresistenten gram-negativen Bakteriums und dessen Antibiotikaresistenz. Daher ist die vorliegende Erfindung insbesondere den molekularbiologischen Methoden, die auf der Bestimmung von bestimmten Resistenzgenen beruhen, überlegen. Denn mit diesen Methoden ist es bisher nicht möglich, die derzeit vermehrt auftretenden multiresistenten gram-negativen Erreger (MRGN) mit ihrer hohen genetischen Variabilität sicher zu erfassen. Die vorliegende Erfindung ist auch dazu geeignet, einen Pilz zu bestimmen sowie dessen Antimykotikaresistenz festzustellen.

Typischerweise, findet die Raman-Spektroskopie auf Einzelzellniveau statt. Das heißt, dass nach einer Weitfeldaufnahme, in dieser die einzelnen mikrobiellen Erreger durch Bilderkennungsalgorithmen detektiert werden, die Raman-Spektroskopie jeweils an einzelnen mikrobiellen Erregern durchgeführt wird. Alternativ kann die Raman-Spektroskopie an mehreren Bakterien im Bildfeld gleichzeitig stattfinden. Zur Identifizierung von Mischinfektionen können dazu Entmischungsalgorithmen herangezogen werden.

Die optische Detektion kann sowohl im Weitfeld zur Bestimmung der Anzahl der mikrobiellen Erreger in der Probe eingesetzt werden als auch auf Einzelzellniveau, um die Zellmorphologie des mikrobiellen Erregers zu bestimmen. In einer Ausführungsform wird das Raman-Spektrum zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kultivierung gemessen und damit Informationen über den biochemischen Fingerabdruck des mikrobiellen Erregers gewonnen. Dadurch kann der molekulare Wirkmechanismus des Antiinfektivums bestimmt werden. Somit erlaubt die Kombination des Raman-spektroskopischen Verfahrens und der optisch-morphologischen Analyse die effektive Bestimmung des Bakteriums (Identifizierung), die Bestimmung der Bakterienzahl in der Probe, die Bestimmung, ob eine Resistenz vorliegt sowie den Wirkmechanismus der Antibiotikaresistenz. Im Stand der Technik gibt es kein Verfahren, das diese Informationen innerhalb von kurzer Zeit bereitstellen kann.

In spezifischen Ausführungsformen kann das Verfahren zusätzlich mit einer Kontrollprobe durchgeführt werden, die den mindestens einen mikrobiellen Erreger, jedoch kein Antiinfektivum, z. B. Antibiotikum, enthält. Natürlich kann das Verfahren auch mit mehreren Proben durchgeführt werden, die den mindestens einen mikrobiellen Erreger und jeweils ein anderes Antiinfektivum, wie z. B. ein Antibiotikum enthalten. Alternativ oder zusätzlich kann das Verfahren in mehreren Proben durchgeführt werden, die jeweils den mindestens einen mikrobiellen Erreger und ein Antiinfektivum in jeweils einer unterschiedlichen Konzentration enthalten, um so u. a. quantitative Aussagen zur minimalen Hemmkonzentration (MHK) gewinnen zu können. Außerdem kann als weitere Kontrollprobe ein Antibiotika-sensitiver Teststamm verwendet werden. Den Proben mit dem Antibiotika-sensitiven Teststamm werden die gleichen Antibiotikaverbindungen in den gleichen Konzentrationen zugesetzt wie in den Proben mit dem zu untersuchenden mikrobiellen Erreger.

Üblicherweise findet die optische Detektion zu Beginn der Kultivierung und in Zeitintervallen von höchstens 60 Minuten, bevorzugt höchstens 30 Minuten, mehr bevorzugt höchstens 15 Minuten, besonders bevorzugt höchstens 5 Minuten statt. Die Raman-Spektroskopie findet zu Beginn der Kultivierung und in Zeitintervallen von höchsten 60 Minuten, bevorzugt höchstens 30 Minuten statt.

Mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung kann die Bestimmung des mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenzen innerhalb von 180 Minuten, bevorzugt 150 Minuten, noch mehr bevorzug weniger als 120 Minuten, am meisten bevorzugt weniger als 60 Minuten abgeschlossen werden.

Typischerweise bezieht sich das Verfahren auf die Identifizierung von pathogenen mikrobiellen Erregern. Daher wird die Probe aus einem Individuum, bevorzugt einem Säugetier, besonders bevorzugt einem Menschen entnommen. Die Probe kann beispielsweise eine Körperflüssigkeit wie eine Urinprobe oder eine in einem Medium überführte Mikrokolonie sein.

Für die Verfahren gemäß der Erfindung sind lediglich 50 bis 1000, bevorzugt 100 bis 1000 mikrobielle Erreger in einer Probe notwendig. Typischerweise enthält eine Probe 5 × 101 bis 1 × 105 bevorzugt 1 × 102 bis 1 × 105, mehr bevorzugt 5 × 102 bis 1 × 105 mikrobielle Erreger. In besonders bevorzugten Ausführungsformen enthält die Probe 1 × 103 bis 1 × 104 mikrobielle Erreger.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein System zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers umfassend:

  • – Raman-Spektrometer zur Bereitstellung eines Raman-Spektrums des mikrobiellen Erregers,
  • – Vorrichtung zur optischen Detektion des mikrobiellen Erregers zur Bereitstellung von optischen Daten des mikrobiellen Erregers,
wobei das System zur Bestimmung der Morphologie des mikrobiellen Erregers durch Analyse der optischen Daten und zur Bestimmung des mikrobiellen Erregers basierend auf einer Kombination des Raman-Spektrums und der morphologischen Daten des mikrobiellen Erregers ausgeführt ist.

In einer spezifischen Ausführungsform ist das System ferner zur Bestimmung der Antiinfektivaresistenz auf einer Kombination des bestimmten Raman-Spektrums und bestimmten Morphologie des mikrobiellen Erregers ausgeführt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Programmelement zur Bestimmung eines Erregers, das, wenn es auf einem Prozessor ausgeführt wird, den Prozessor anleitet, die folgenden Schritte durchzuführen:

  • – Bestimmen einer Morphologie des mikrobiellen Erregers basierend auf den Daten einer Vorrichtung zur optischen Detektion des Erregers, und
  • – Bestimmen des mikrobiellen Erregers basierend auf einem Raman-Spektrum des mikrobiellen Erregers und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

In einer Ausführungsform leitet das Programmelement den Prozessor an ferner den folgenden Schritt auszuführen:

  • – Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein computerlesbares Medium, auf dem ein Programmelement gespeichert ist, das, wenn es auf einem Prozessor ausgeführt wird, den Prozessor anleitet, die folgenden Schritte durchzuführen:

  • – Bestimmen eines Raman-Spektrums des mikrobiellen Erregers basierend auf spektroskopischen Daten eines Raman-Spektrometers,
  • – Bestimmen einer Morphologie des mikrobiellen Erregers basierend auf den Daten einer Vorrichtung zur optischen Detektion des Erregers, und
  • – Bestimmen des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

In einer Ausführungsform kann das computerlesbare Medium den Prozessor anleiten ferner den folgenden Schritt durchzuführen: Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Es sei darauf hingewiesen, dass ”umfassend” keine anderen Elemente oder Schritte ausschließt und ”eine” oder ”ein” keine Vielzahl ausschließt. Ferner sei darauf hingewiesen, dass Merkmale oder Schritte, die im Verweis auf eines der Ausführungsbeispiele beschrieben werden, auch in Kombination mit anderen Merkmalen oder Schritten anderer beschriebener Ausführungsbeispiele verwendet werden können.

Insbesondere sei darauf hingewiesen, dass sich die Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers, auch auf die Bestimmung mehrerer mikrobieller Erreger beziehen, d. h. dass beispielsweise in einer Probe mehrere unterschiedliche Erreger enthalten sind oder mehrere Proben mit unterschiedlichen Erregern parallel untersucht werden. Ebenso können einer Probe mehr als ein Antiinfektivum zugesetzt werden oder mehrere Proben mit Antiinfektiva parallel untersucht werden. Natürlich sind auch Kombinationen von mehreren Erregern und Antiinfektiva beabsichtigt.

Insbesondere, schließen die Begriffe „Spektrum” und „Raman-Spektrum” auf mehrere Spektren ein.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des mikrobiellen Erregers umfassend die Schritte Raman-Spektroskopie einer Probe umfassend mindestens einen mikrobiellen Erreger und optische Detektion der Probe.

Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz umfassend die Schritte Raman-Spektroskopie einer Probe umfassend mindestens einen mikrobiellen Erreger und ein Antiinfektivum und optische Detektion der Probe.

Eine spezifische Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung des mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenzen, umfassend die Schritte:

  • – Kultivierung einer Probe umfassend mindestens einen mikrobiellen Erreger und ein Antiinfektivum;
  • – Raman-Spektroskopie der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
  • – optische Detektion der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;

Besonders bevorzugte Ausführungsformen beziehen sich auf Verfahren zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz umfassend die Schritte:

  • – Kultivierung einer Probe umfassend mindestens einen mikrobiellen Erreger und ein Antiinfektivum;
  • – Bestimmen des Raman-Spektrums des mikrobiellen Erregers durch Raman-Spektroskopie zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
  • – Bestimmen der Morphologie des mikrobiellen Erregers durch optische Detektion zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
  • – Bestimmen des mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

Der Begriff ”mikrobielle Erreger” umfasst Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien, Archaeen und Pilze. Insbesondere bezieht sich der Begriff auf Mikroorganismen, die pathogen sind für Tiere, bevorzugt Säugetiere, besonders bevorzugt Menschen.

In bevorzugten Ausführungsformen ist das Bakterium ein multiresistentes gramnegatives Bakterium. Beispiele für multiresistente gramnegative Bakterien sind Enterobacteriaceae, z. B. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus spp., Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii.

Der Begriff „Antiinfektivum” umfasst Verbindungen, die gegen Mikroorganismen wirken, d. h. die Mikroorganismen abtöten oder deren Wachstum hemmen. Der Begriff umfasst z. B. Antibiotika (gegen Bakterien), Virostatika (gegen Viren), Antimykotika (gegen Pilze) und Anthelminthika (gegen Würmer). Insbesondere umfasst der Begriff „Antiinfektivum” Antibiotika und Antimykotika. Die Antiinfektiva und Antibiotika umfassen u. a. β-Lactame, Glykopeptide, Polyketide, Makrolid-Antibiotika, Aminoglycosid-Antibiotika, Polypeptid-Antibiotika, Chinolone und Sulfonamide. Antibiotika wirken beispielsweise durch Hemmung der Zellwandsynthese (z. B. Penicillin), Hemmung der Proteinbiosynthese (z. B. Kanamycin, Neomycin und Chloramphenicol), Hemmung der korrekten Nucleinsäurepolymerisation (z. B. Rifampicin und Ciprofloxacin).

Daher eignen sich die Verfahren der Erfindung besonders zur Bestimmung von Bakterien und deren Antibiotikaresistenz. Dabei wird eine Probe, die mindestens ein Bakterium und ein Antibiotikum umfasst der Raman-Spektroskopie und der optischen Detektion unterzogen.

Außerdem eignen sich die Verfahren der Erfindung zur Bestimmung von Pilzen und deren Antimykotikaresistenz, wobei eine Probe, die mindestens einen Pilz und ein Antimykotikum umfasst, der Raman-Spektroskopie und der optischen Detektion unterzogen wird.

Ein antiinfektivaresistenter Mikroorganismus ist fähig, die wachstumshemmende oder tötende Wirkung abzuschwächen oder völlig zu neutralisieren.

Bevorzugte Ausführungsformen beziehen sich auf Verfahren zur Bestimmung eines Bakteriums und dessen Antibiotikaresistenz umfassend die Schritte:

  • – Kultivierung einer Probe umfassend mindestens ein Bakterium und ein Antibiotikum;
  • – Raman-Spektroskopie der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
  • – optische Detektion der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen beziehen sich auf Verfahren zur Bestimmung eines Bakteriums und dessen Antibiotikaresistenz umfassend die Schritte:

  • – Kultivierung einer Probe umfassend mindestens ein Bakterium und ein Antibiotikum;
  • – Bestimmen des Raman-Spektrums des Bakteriums durch Raman-Spektroskopie zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
  • – Bestimmen der Morphologie des Bakteriums durch optische Detektion zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
  • – Bestimmen des Bakteriums und dessen Antibiotikaresistenz basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des Bakteriums.

Alternative Ausführungsformen beziehen sich auf Verfahren zur Bestimmung eines Pilzes und dessen Antimykotikaresistenz umfassend die Schritte:

  • – Kultivierung einer Probe umfassend mindestens einen Pilz und ein Antimykotikum;
  • – Raman-Spektroskopie der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
  • – optische Detektion der Probe zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen beziehen sich auf Verfahren zur Bestimmung eines Pilzes und dessen Antimykotikaresistenz umfassend die Schritte:

  • – Kultivierung einer Probe umfassend mindestens einen Pilz und ein Antimykotikum;
  • – Bestimmen des Raman-Spektrums des Pilzes durch Raman-Spektroskopie zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
  • – Bestimmen der Morphologie des Pilzes durch optische Detektion zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
  • – Bestimmen des Pilzes und dessen Antimykotikaresistenz basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des Pilzes.

Die Zeitintervalle zwischen den mindestens zwei Zeitpunkten werden an anderer Stelle definiert. In besonderen Ausführungsformen ist mindestens zum ersten Zeitpunkt (an dem die optische Detektion und/oder Raman-Spektroskopie stattfindet) die Probe noch nicht mit dem Antiinfektivum versetzt. Die Zugabe des Antiinfektivum erfolgt vor dem nächsten Zeitpunkt, beispielsweise dem zweiten Zeitpunkt (an dem die optische Detektion und/oder Raman-Spektroskopie stattfindet).

Eine unveränderte Zellmorphologie des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten kann ein Indikator für eine Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum sein. Darüber hinaus kann ein unverändertes Zellwachstum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ein Indikator für eine Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum sein. Außerdem, kann eine unverändertes oder ein für einen bestimmten Resistenzmechanismus charakteristisch verändertes Raman-Spektrum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ein Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum sein. In anderen Worten, kann beim Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers ein erster Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum verwendet werden, wobei der erste Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum eine unveränderte Zellmorphologie des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ist. Außerdem, kann bei der Bestimmung der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers ein zweiter Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers, gegen das Antiinfektivum verwendet werden, wobei der zweite Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum ein unverändertes oder ein für einen bestimmten Resistenzmechanismus charakteristisch verändertes Raman-Spektrum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ist. Der Begriff „ein für einen bestimmten Resistenzmechanismus charakteristisch verändertes Raman-Spektrum” umfasst charakteristische Veränderungen die dem Fachmann bekannt sind. Bei bestimmten Resistenzmechanismen kann eine veränderte Aminosäurezusammensetzung des Bakteriums detektiert werden (z. B. bei VanA, VanB, VanC, VanD, VanE, VanG, insbesondere VanA, VanB u. a. bei Vancomycin-Resistenz), bei anderen Resistenzmechanismen kann eine erhöhte Produktion bestimmter Enzyme oder der durch diese Enzyme gespaltenen Stoffen detektiert werden, wie z. B. bei einer β-Laktam-Resistenz eine erhöhte Produktion von β-Laktamasen oder eine verstärkte Hydrolyse des β-Laktamrings der eingesetzten β-Laktam-Antibiotika.

Außerdem kann bei dem Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers ein dritter Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum verwendet werden, wobei der dritte Indikator für die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum ein unverändertes Zellwachstum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ist.

Der Begriff „unverändertes Wachstum”, wie er hier verwendet wird, umfasst auch schwach verringertes Zellwachstum. Das heißt, dass das Zellwachstum um weniger als 10%, weniger als 5%, weniger als 3% oder weniger als 1% verringert ist im Vergleich zu Negativkontrolldaten. Das Zellwachstum wird in der Regel durch die Beobachtung der Zellzahl über die Zeit, d. h. über die Wachstumsrate bestimmt. Das Zellwachstum kann beispielsweise auch morphologisch detektiert werden, z. B. durch Zählen der Zellen, die eine für die Zellteilung typische Morphologie aufweisen.

Umgekehrt, kann eine veränderte Zellmorphologie des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ein Indikator für eine Sensitivität des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum sein. Insbesondere sind Veränderungen der Zellmorphologie zu berücksichtigen, die für die Sensitivität des mikrobiellen Erregers charakteristisch sind. In bestimmten Ausführungsformen können daher geringfügige initiale Formveränderungen vernachlässigt werden. Dabei sind die morphologischen Änderungen oft charakteristisch für bestimmte Antibiotikaklassen. Darüber hinaus, kann ein verändertes Zellwachstum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ein Indikator für eine Sensitivität des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum sein. Außerdem, kann ein für die Sensitivität gegen das Antiinfektivum charakteristisch verändertes Raman-Spektrum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu Negativkontrolldaten ein Indikator für die Sensitivität des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum sein.

Die Negativkontrolldaten können von einer Probe mit dem mikrobiellen Erreger ohne Antiinfektivum stammen. Die Daten dieser Probe können bereits vorliegen, z. B. als Daten einer Probe, die bereits zu einem früheren Zeitpunkt gemäß dem vorliegenden Verfahren analysiert wurden. Alternativ kann die Probe mit dem mikrobiellen Erreger ohne Antiinfektivum parallel zur Probe mit dem Antiinfektivum analysiert werden. In einer anderen Ausführungsform können die Negativkontrolldaten von derselben Probe, bevor diese in Kontakt mit dem Antiinfektivum gekommen ist, stammen. Außerdem könnten die Negativkontrolldaten von einer Probe eines antiinfektivaresistenten Stammes mit oder ohne Antiinfektivum stammen, insbesondere von einer Probe eines antiinfektivaresistenten Stammes.

Als Positivkontrolle könnte eine Probe eines Antiinfektivums mit einem mikrobiellen Erreger dienen, der sensitiv ist für dieses Antiinfektivum. Dann kann eine unveränderte Zellmorphologie des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu den Positivkontrolldaten ein Indikator für eine Sensitivität des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum sein. Darüber hinaus kann ein unverändertes Zellwachstum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu den Positivkontrolldaten ein Indikator für eine Sensitivität des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum sein. Außerdem, kann ein unverändertes Raman-Spektrum des mikrobiellen Erregers im Vergleich zu den Positivkontrolldaten ein Indikator für die Sensitivität des mikrobiellen Erregers gegen das Antiinfektivum sein.

Die optische Detektion kann durch Mikroskopie, holographische Detektion oder dynamische Lichtstreuung, bevorzugt Mikroskopie erfolgen. Typischerweise ist die Mikroskopie Lichtmikroskopie. Der Begriff ”Lichtmikroskopie” ist dem Fachmann bekannt und umfasst u. a. Durchlichtmikroskopie, Auflichtmikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Holographie, Interferenzkontrastmikroskopie, Polarisationsmikroskopie und Konfokalmikroskopie oder Kombinationen davon. In bevorzugten Ausführungsformen wird Durchlichtmikroskopie zur optischen Detektion verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein konfokales Mikroskop im Durchlichtmodus verwendet.

Daher eignen sich zur Ausführung des Verfahrens der Erfindung Ramanspektrometer mit integrierten Vorrichtungen zur optischen Detektion, insbesondere Mikroskope wie Durchlichtmikroskope oder konfokale Mikroskope. Insbesondere eignen sich Raman-Spektrometer mit integriertem Durchlicht- und/oder Fluoreszenzmikroskop (z. B. alpha300 von WiTEC, Ulm, Germany, inVia confocal Raman microscope von RENISHAW, United Kingdom oder XploRATMPLUS von HORIBA). Ein derartiges Durchlicht- und/oder Fluoreszenzmikroskop ist bevorzugt ein Konfokalmikroskop. Außerdem ist es vorteilhaft, wenn eine Weißlichtquelle für die optische Detektion integriert ist. Eine Laserquelle ist insbesondere für die Raman-Spektroskopie benötigt. Das Raman-Spektrometer verfügt über einen Detektor, ein Spektrometer und üblicherweise mindestens einen Filter.

Zur Einzelzellanalyse ist ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur, d. h. mit einer numerischen Apertur von größer oder gleich 0.8, bevorzugt größer oder gleich 0.9 verwendet.

Raman-spektroskopische Verfahren zur Bestimmung von Antiinfektivaresistenzen sind dem Fachmann bekannt (Schröder et al.). Bei der Raman-Spektroskopie wird eine Probe durch monochromatisches Licht (Laser) angeregt. Dadurch entsteht an der Probe auch unelastisch gestreutes Licht, das sich in der Frequenz von der des anregenden Lichts unterscheidet. Diese Frequenzunterschiede, die sog. Raman-Verschiebung, enthalten Informationen über die Schwingungszustände der Moleküle und damit über die chemische Zusammensetzung des Mikroorganismus.

Typischerweise erfolgt die Raman-spektroskopische Bestimmung auf Einzelzellniveau. Dazu wird beispielsweise im Weißlicht eine Weitfeldaufnahme der Mikrolochkammer durchgeführt. Durch einen Bilderkennungsalgorithmus, der an die Hardware des Gerätes gekoppelt ist, werden die einzelnen Bakterien detektiert. Diese können automatisch, beispielsweise durch die Bewegung des Probentisches oder durch die Bewegung der Optik angefahren werden. Die Raman-Messung wird dann an einem einzelnen Bakterium durchgeführt. Das Signal wird in der Z-Fokusebene optimiert. Im reinen Medium kann zusätzlich der Effekt der optischen Fallen ausgenutzt werden, um einen optimalen Fokus zu erzielen. Bei optimaler Fokussierung spielt die Hintergrundfluoreszenz des Mediums kaum eine Rolle. Für eine robuste Datenanalyse können zusätzlich Wellenlängen-modulierte Anregung angewandt werden.

Durch die optische Detektion können die Zellzahl, die Wachstumsrate und/oder die Zellmorphologie des mikrobiellen Erregers in der Probe bestimmt werden. Dadurch lassen sich beispielsweise morphologische Veränderungen, die durch den Einfluss des Antiinfektivums hervorgerufen werden, detektieren.

Der Begriff „Morphologie” bezieht sich auf Parameter, die die Form des mikrobiellen Erregers beschreiben, z. B. Größe, Rundigkeit, Flächeninhalt, Verhältnis Flächeninhalt zu Umfang, Verhältnis längste Ausdehnung (Länge) zu kürzester Ausdehnung (Breite). Bevorzugte Parameter sind Größe, Rundigkeit und Flächeninhalt. Durch automatische Bilderkennungsalgorithmen können diese Parameter oder daraus abgeleitete Kenngrößen (z. B. Parameter von Zernike-Polynomen) aus den Daten der optischen Detektion extrahiert werden.

Zur Bestimmung der quantitativen Informationen über die morphologische Änderung erfolgt die Mikroskopie auf Einzelzellniveau. Dazu wird zu jedem Zeitintervall zuerst eine Weitfeldaufnahme im Weißlicht durchgeführt und durch entsprechende Bilderkennungsalgorithmen die verschiedenen Bakterien automatisch erkannt und charakterisiert (siehe oben).

Die Bestimmung der Antiinfektivaresistenz erfolgt durch die optische Detektion und durch Raman-Spektroskopie. Das bedeutet, dass für die Auswertung die Daten der optischen Detektion, insbesondere die Mikroskopiebilddaten und die Raman-Spektren verwendet werden.

Bei der Verwendung von holographischen Ansätzen oder dynamischer Lichtstreuung können auf den Bildausschnitt gemittelte Daten erfasst werden. Insbesondere bei holographischen Ansätzen können auch durch Datenauswertung die Charakteristiken der einzelnen Mikroben bestimmt werden.

Es kann zusätzlich die Bestimmung der Wachstumsrate der mikrobiellen Erreger erfolgen. Dazu werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kultivierung der Probe Weitfeldaufnahmen getätigt. Durch automatische Bilderkennungsalgorithmen wird die Anzahl der Mikroorganismen in der Probe ermittelt. Die Wachstumsrate wird anhand der Veränderung der Anzahl der Mikroorganismen über die Zeit in der Probe ermittelt.

Die Bestimmung des mikrobiellen Erregers und ggf. dessen Antiinfektivaresistenz erfolgt durch automatisierte Analyse anhand von multivariaten statistischen Methoden, wie Hauptkomponentenanalyse, Neurale Netzwerke oder Support Vector Machine und verschiedene Korrelationsalgorithmen. Diese automatisierten Analysemethoden werden mit Bilddaten und Raman-Spektren von verschiedenen Mikroorganismen (insbesondere Bakterien) mit unterschiedlichen Antiinfektiva (insbesondere Antibiotika) trainiert. Die optischen und spektralen Daten sind unabhängig, spiegeln aber die gleichen Veränderungen in den Mikroorganismen zurück. Dadurch erhöht sich durch eine Kombination der Informationen die Genauigkeit. Damit können kürzere Analysenzeiten bei hoher Genauigkeit erreicht werden.

Typischerweise werden die Bakterien als reine Suspension im Verfahren der Erfindung eingesetzt. Dazu werden die Bakterien in die zur Analyse bestimmten Kammern einer Mikrolochplatte als Aliquote der Suspension eingebracht. Da stets das gleiche Volumen und die gleiche Konzentration für alle Kammern benötigt werden, kann die Befüllung automatisch durch entsprechende Vorrichtungen erfolgen. Durch die Gravitation sinken die Bakterien auf den Boden. Alternativ könnte auch eine Einbettung der Mikroorganismen in ein geeignetes Einbettungsmedium, z. B. Agarose, erfolgen. Dabei müssen entsprechende Diffusionszeiten des Antiinfektivums beachtet werden. Alternativ kann die Bakteriensuspension durch eine geeignete Mikrofluidplatte geleitet werden.

Der Begriffe „Mikrolochplatte” und „Mikrotiterplatte” können austauschbar verwendet werden und beziehen sich auf Titerplatten mit einem Füllvolumen von 0,1 μl bis 2000 μl, bevorzugt 0,5 μl bis 1000 μl, mehr bevorzugt 1 μl bis 500 μl, noch mehr bevorzugt 2 μl bis 200 μl, am meisten bevorzugt 5 μl bis 100 μl, zum Beispiel 10 μl. Mikrolochplatten sind üblicherweise aus Kunststoff. Bevorzugt sind Mikrolochplatten die einen Glasboden aufweisen. Der Boden kann eine dünne Beschichtung aus Agarose oder Poly-L-lysin aufweisen. Dies kann die Anreicherung der Bakterien in Glasbodennähe begünstigen. In bevorzugten Ausführungsformen werden Lochkammerplatten verwendet, die das Wachstum der mikrobiellen Erreger nicht beeinflussen. Durch die Verwendung von Mikrolochplatten wird nur wenig Bakterienmaterial benötigt. Mikrolochplatten sind preiswert, und damit geeignet für kostengünstige Routinediagnostikanwendungen. Der Boden der Kammer der Lochplatte sollte durch die Erreger-Suspension benetzt sein. Die Größe der Kammer kann an das Bildfeld des verwendeten Mikroskops angepasst werden.

Für die Kultivierung der Mikroorganismen, sind Medien geeignet, die zur Anzucht eines breiten Spektrums von Mikroorganismen geeignet sind, beispielsweise Herz-Hirn-Bouillon (typische Zusammensetzung: Kalbshirninfusion 12,5 g/l; Rinderherzinfusion 5,0 g/l; Proteose-Pepton 10,0 g/l; Glucose 2,0 g/l; Natriumchlorid 5,0 g/l; Dinatriumhydrogenphosphat 2,5 g/l; pH 7,4 ± 0,2; z. B. von Carl Roth, Deutschland).

Die Kultivierung der mikrobiellen Erreger erfolgt bei einer Temperatur, die für die Zellteilung des Erregers möglichst optimal ist. In der Regel erfolgt die Kultivierung zwischen 25°C bis 39°C, bevorzugt zwischen 30°C und 38°C, besonders bevorzugt bei 37°C. Für die kontinuierliche Erhaltung der Temperatur kann beispielsweise eine Probenkammer eingesetzt werden, die auf die gewünschte Temperatur eingestellt ist, beispielsweise auf 37°C. Da die Raman-Spektroskopie und die optische Detektion parallel zur Kultivierung erfolgen, ist in der Vorrichtung die Probenkammer am oder um das Raman-Spektrometer mit integrierter optischer Detektionsvorrichtung so angeordnet, dass die Probe während der Raman-Spektroskopie und der optischen Detektion auf der gewünschten Temperatur gehalten werden kann.

In einer besonderen Ausführungsform besitzt die Vorrichtung zwei unterschiedlich temperierte Probenkammern. Beispielsweise kann eine Probenkammer auf 30°C und die zweite Probenkammer auf 37°C eingestellt sein. Die Probe wird zunächst in eine der beiden Kammern, beispielsweise in die 37°C temperierte Kammer eingeführt und die mikrobiellen Erreger durch optische Detektion und/oder Raman-Spektroskopie identifiziert. Wenn von dem identifizierten Erreger bekannt ist, dass dieser besser bei 30°C wächst, wird die Mikrolochplatte in die zweite Kammer eingeführt. Die Einführung der Probe in die Kammer kann automatisch erfolgen. Alternativ könnte eine Probenkammer verwendet werden und die Temperatur der Probenkammer nach der Identifizierung des mikrobiellen Erregers an die optimale Wachstumstemperatur des Erregers angepasst werden. In einer weiteren Ausführungsform, werden parallel zwei Proben, die bezüglich dem mikrobiellen Erregers und (ggf.) dem Antibiotikum gleich sind, parallel in zwei unterschiedlich temperierten Kammern, z. B. in einer auf 37°C und einer auf 30°C temperierten Kammer, kultiviert.

Das beschriebene Verfahren ist prinzipiell für alle Antiinfektiva (insbesondere Antibiotika) geeignet. Typischerweise wird als Kontrolle eine reine Probe ohne Antiinfektiva-Zusatz oder eine reine Probe ohne Antiinfektivaresistenz verwendet. Alternativ können Vergleichsdatensätze verwendet werden, die für den entsprechenden Erreger in Kombination mit den entsprechenden Antiinfektiva bereits vorhanden sind. In einer Ausführungsform werden Vergleichsdatensätze verwendet, bei denen das gleiche Antiinfektivum wie der zu untersuchenden Probe zugesetzt ist, sich aber bezüglich des mikrobiellen Erregers von der zu untersuchenden Probe unterscheiden. Das Antiinfektivum kann bereits lyophilisiert in den Kammern der Lochplatte vorliegen. Je nach Herkunft des Probenmaterials (Blutkultur, Atemwege, Harnwege etc.) kann eine entsprechende Kartusche ausgewählt und befüllt werden.

Das Antiinfektivum wird nach der Raman-spektroskopischen Identifizierung der Keime in die Kammern dosiert. Dazu können beispielsweise Vorratsgefäße mit Injektionsanschlüssen in das Gerät eingebaut werden. Es wird empfohlen bei dieser Version einen Teststamm mit bekannter Empfindlichkeit in einer Kammerreihe mitlaufen zu lassen, um gleichzeitig eine Kontrolle über die Wirksamkeit des Antiinfektivums zu haben.

In einer spezifischen Ausführungsform wird eine große Menge der Bakteriensuspension (ausreichend für die benötigten Antibiotikatestungen plus Kontrolle) in eine zentrale Kammer eingefüllt. Nach Raman-spektroskopischer Identifizierung der Erreger im Gerät wird eine Mikrolochplatte ausgewählt, die die relevanten Antibiotika in den relevanten Konzentrationen enthält, und die Bakteriensuspension mikrofluidisch in die entsprechenden Kammern geleitet.

In einer Ausführungsform, wird das Verfahren mit mindestens einer Kontrollprobe durchgeführt. Diese Kontrollprobe kann den mindestens einen mikrobiellen Erreger ohne Antiinfektivum enthalten. Dadurch kann die Wachstumsrate und die Zellmorphologie der Probe(n) umfassend den mikrobiellen Erreger und ein Antiinfektivum mit der Wachstumsrate und der Zellmorphologie der Kontrollprobe(n) umfassend den mikrobiellen Erreger ohne Antiinfektivum verglichen werden.

Zusätzlich kann das Verfahren in einer Probe, die einen antiinfektivasensitiven Teststamm umfasst, durchgeführt werden.

In einer Ausführungsform wird das Verfahren an mehreren Proben, die jeweils einen mikrobiellen Erreger und jeweils ein anderes Antiinfektivum enthalten durchgeführt. Da das Verfahren der vorliegenden Erfindung leicht parallelisiert werden kann, ist es somit möglich gleichzeitig die Resistenz des mikrobiellen Erregers gegen mehrere Antiinfektiva zu testen. Dies ist aufgrund der immer häufiger auftretenden multiresistenten mikrobiellen Erreger, insbesondere von multiresistenten Bakterien (z. B. Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA), Multiresistenter Pseudomonas aeruginosa, Clostridium difficile) von enormer Wichtigkeit.

In einer Ausführungsform wird das Verfahren an mehreren Proben, die jeweils einen mikrobiellen Erreger und ein Antiinfektivum in jeweils unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, durchgeführt. Damit kann auf einfache Weise die minimale Hemmkonzentration bestimmt werden.

Es ist offensichtlich, dass sich die vorliegende Erfindung ebenso so zur parallelen Analyse von unterschiedlichen Antiinfektiva jeweils in unterschiedlichen Konzentrationen eignet.

In spezifischen Ausführungsformen findet die optische Detektion zu Beginn der Kultivierung und in Zeitintervallen von höchstens 120 Minuten, bevorzugt 60 Minuten, besonders bevorzugt höchstens 30 Minuten, mehr bevorzugt höchstens 15 Minuten, noch mehr bevorzugt höchstens 5 Minuten statt. Die Raman-Spektroskopie findet zu Beginn der Kultivierung und in Zeitintervallen von höchsten 120 Minuten, bevorzugt höchstens 60 Minuten, besonders bevorzugt höchstens 30 Minuten statt.

Mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung kann die Bestimmung des mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz innerhalb von 180 Minuten, bevorzugt 150 Minuten, mehr bevorzugt 120 Minuten, besonders bevorzugt 60 Minuten abgeschlossen werden.

Typischerweise bezieht sich das Verfahren auf die Identifizierung von pathogenen mikrobiellen Erregern. Daher wird die Probe aus einem Individuum, bevorzugt einem Säugetier, besonders bevorzugt einem Menschen entnommen. Die Probe kann eine Körperflüssigkeit, z. B. eine Urinprobe, oder eine in ein Medium überführte Mikrokolonie sei. Die Urinprobe wird typischerweise filtriert, mit Hilfe eines Filters, der Verunreinigungen absondert, jedoch mikrobielle Erreger passieren lässt. Komplexe Proben, die üblicherweise viele Bestandteile, wie beispielsweise Blutproben, oder auch Besiedlungsflora aufweisen, wie beispielsweise, aspiratorisches Material, werden, wie in den mikrobiologischen Laboren etabliert und für den Fachmann bekannt, ausgestrichen und für kurze Zeit, z. B. weniger als 6 h, bevorzugt weniger als 4 h, mehr bevorzugt weniger als 3 h, besonders bevorzugt weniger aus 2 h kultiviert. Da nur wenig Bakterienmaterial benötigt wird, sind kurze Inkubationszeiten von ca. 2–3 h ausreichend, um genug Probenmaterial zu erhalten. Alternativ sind auch mikrofluidische Aufreinigungsschritte denkbar.

Für die Verfahren gemäß der Erfindung sind lediglich 50 bis 1000, bevorzugt 100 bis 1000 mikrobielle Erreger in einer Probe notwendig. Typischerweise enthält eine Probe 5 × 101 bis 1 × 105 bevorzugt 1 × 102 bis 1 × 105, mehr bevorzugt 5 × 102 bis 1 × 105 mikrobielle Erreger. In besonders bevorzugten Ausführungsformen enthält die Probe 1 × 103 bis 1 × 104 mikrobielle Erreger. Da nur eine geringe Anzahl von Erregern sowohl zur Bestimmung der Erreger als auch zur Bestimmung derer Antiinfektivaresistenz notwendig ist, kann auf einen oder mehrere Vorkulturschritte, die bei den Verfahren im Stand der Technik nötig sind, verzichtet werden. Da diese Vorkulturschritte üblicherweise zwischen 6 und 24 Stunden dauern, kann im vorliegenden Verfahren das Ergebnis ab Probennahme wesentlich schneller erzielt werden. Die Dauer des Verfahrens der Erfindung zur Bestimmung der Erreger und/oder deren Antiinfektivaresistenzen kann entsprechend verkürzt werden. Somit ist eine Bestimmung des mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenz innerhalb von 180 Minuten, bevorzugt 150 Minuten, besonders bevorzugt 120 Minuten nach Probenentnahme möglich.

Eine spezifische Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des mikrobiellen Erregers und dessen Antiinfektivaresistenzen, umfassend die Schritte:

  • – Kultivierung einer Probe umfassend mindestens einen mikrobiellen Erreger und ein Antiinfektivum;
  • – Kultivierung einer Kontrollprobe umfassend mindestens einen mikrobiellen Erreger ohne Antiinfektivum;
  • – Raman-Spektroskopie der Proben zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;
  • – optische Detektion der Proben zu mindestens zwei Zeitpunkten während der Kultivierung der Probe;

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein System zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers umfassend:

  • – Raman-Spektrometer zur Bereitstellung von spektroskopischen Daten des mikrobiellen Erregers,
  • – Vorrichtung zur optischen Detektion des mikrobiellen Erregers zur Bereitstellung von optischen Daten des mikrobiellen Erregers,
wobei das System zur Bestimmung der Morphologie des mikrobiellen Erregers durch Analyse der optischen Daten und zur Bestimmung des mikrobiellen Erregers basierend auf einer Kombination dem Raman-Spektrum und der morphologischen Daten des mikrobiellen Erregers ausgeführt ist.

Eine Ausführungsform bezieht sich auf ein System zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers umfassend:

  • – Raman-Spektrometer zur Bereitstellung von spektroskopischen Daten des mikrobiellen Erregers,
  • – Vorrichtung zur optischen Detektion des mikrobiellen Erregers zur Bereitstellung von optischen Daten des mikrobiellen Erregers,
wobei das System zur Bearbeitung eines Raman-Spektrums des mikrobiellen Erregers, zur Bestimmung der Morphologie des mikrobiellen Erregers durch Analyse der optischen Daten und zur Bestimmung des mikrobiellen Erregers basierend auf einer Kombination des Raman-Spektrums und der morphologischen Daten des mikrobiellen Erregers ausgeführt ist.

In einer spezifischen Ausführungsform, ist das System ferner zur Bestimmung der Antiinfektivaresistenz basierend auf einer Kombination des bestimmten Raman-Spektrums und der bestimmten Morphologie des mikrobiellen Erregers ausgeführt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Programmelement zur Bestimmung eines Erregers, das, wenn es auf einem Prozessor ausgeführt wird, den Prozessor anleitet, die folgenden Schritte durchzuführen:

  • – Bestimmen einer Morphologie des mikrobiellen Erregers basierend auf den Daten einer Vorrichtung zur optischen Detektion des mikrobiellen Erregers, und
  • – Bestimmen des mikrobiellen Erregers basierend auf einem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

Eine andere Ausführungsform bezieht sich auf ein Programmelement zur Bestimmung eines Erregers, das, wenn es auf einem Prozessor ausgeführt wird, den Prozessor anleitet, die folgenden Schritte durchzuführen:

  • – Bearbeitung eines Raman-Spektrums des mikrobiellen Erregers,
  • – Bestimmen einer Morphologie des mikrobiellen Erregers basierend auf den Daten einer Vorrichtung zur optischen Detektion des mikrobiellen Erregers, und
  • – Bestimmen des mikrobiellen Erregers basierend auf dem bearbeiteten Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

Der Begriff „Bearbeitung des Raman-Spektrums” umfasst gängige dem Fachmann bekannte Methoden zur Signaloptimierung des Raman-Spektrums, wie beispielsweise Untergrundkorrektur, Normalisierung oder Wellenzahlkorrektur.

In einer Ausführungsform leitet das Programmelement den Prozessor an, ferner den folgenden Schritt auszuführen:

  • – Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers nach Interaktion mit dem Antiinfektivum.

Das Programmelement kann ein Teil eines Computerprogrammes sein, aber es kann auch eigenständig sein. Beispielsweise kann das Programmelement zum Aktualisieren eines bereits existierenden Programmelements verwendet werden, um zur vorliegenden Erfindung zu gelangen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein computerlesbares Medium, auf dem ein Programmelement gespeichert ist, das, wenn es auf einem Prozessor ausgeführt wird, den Prozessor anleitet, die folgenden Schritte durchzuführen:

  • – Bestimmen einer Morphologie des mikrobiellen Erregers basierend auf den Daten einer Vorrichtung zur optischen Detektion des Erregers, und
  • – Bestimmen des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

Eine weitere Ausführungsform bezieht sich auf ein computerlesbares Medium, auf dem ein Programmelement gespeichert ist, das, wenn es auf einem Prozessor ausgeführt wird, den Prozessor anleitet, die folgenden Schritte durchzuführen:

  • – Bearbeitung eines Raman-Spektrums des mikrobiellen Erregers,
  • – Bestimmen einer Morphologie des mikrobiellen Erregers basierend auf den Daten einer Vorrichtung zur optischen Detektion des Erregers, und
  • – Bestimmen des mikrobiellen Erregers basierend auf dem bearbeiteten Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

In einer Ausführungsform kann das computerlesbares Medium den Prozessor anleiten ferner den folgenden Schritt durchzuführen: Bestimmen der Antiinfektivaresistenz des mikrobiellen Erregers basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers. Das computerlesbare Medium kann als Speichermedium, z. B. als USB-Stick, CD oder DVD, Datenspeichergerät, Festplatte oder jedes beliebige andere Medium, auf dem ein wie oben beschriebenes Programmelement gespeichert werden kann, betrachtet werden.

Ausführungsbeispiel

  • – Erstellung einer Bakteriensuspension und Einbringung dieser in Kammern einer Mikrolochkammerplatte (Füllvolumen der Kammer ≤ 100 μl, Aliquot 10 μl): Eine Mikrolochkammer enthält kein Antibiotikum, die anderen Mikrolochkammern enthalten eines bzw. jeweils verschiedene Antibiotika.
  • – Raman-spektroskopische Identifizierung der Erreger durch Aufnahme von Einzelspektren von mehreren einzelnen Erregern in der Messkammer und Abgleich der Spektren mit einer Datenbank zur Bestimmung der Bakterienart: Durch entsprechende Bilderkennungsalgorithmen, die an die Hardware des Gerätes gekoppelt sind, können verschiedene Bakterien automatisch angefahren werden. Inkubation der Bakterien bei 37°C.
  • – Verfolgen des Bakterienwachstums mit Hilfe von Weißlichtmikroskopie und anschließender Bildauswertung: Dazu wird alle ca. 15 min. eine Weitfeldaufnahme jeder Lochkammer gemacht. Durch Bilderkennungsalgorithmen werden quantitative Informationen über die morphologischen Änderungen gewonnen. In der Auswertung werden diese Informationen relativ zur Kontrolle ohne Antibiotikum ausgewertet.
  • – Raman-spektroskopische Charakterisierung: Nach 60 und nach 120 Minuten wird eine Raman-spektroskopische Charakterisierung anhand von ca. 10–20 Bakterien in den einzelnen Kammern durchgeführt. Durch die Analyse der Raman-Spektren werden quantitative Informationen über den biochemischen Fingerabdruck, d. h. Informationen zur biochemischen Zusammensetzung der Bakterien, gewonnen. In der Auswertung werden diese Informationen relativ zur Kontrolle ohne Antibiotikum bestimmt. Die Bakterien werden dabei, basierend auf den Bildinformationen, durch automatisiertes Verfahren des Probentisches automatisch angefahren.
  • – Automatisierte Analyse der Antibiotikaresistenz durch Integration der Daten bezüglich der Wachstumskurven, der quantitativen Informationen über morphologische Änderungen sowie der Raman-spektroskopischen Charakterisierung: Dazu werden die spektralen Veränderungen der Bakterien-Raman-Spektren in den Kammern mit Antibiotikumzusatz mit denen in der Kontrollkammer ohne Antibiotikumzusatz verglichen. Treten die für den Wirkmechanismus des Antibiotikums charakteristischen Veränderungen auf, so ist dies ein Indikator für Sensitivität. Sind keine Unterschiede feststellbar bzw. die für einen bestimmten Resistenzmechanismus charakteristischen Unterschiede, so ist dies ein Indikator für Resistenz. Der Vergleich erfolgt dabei durch statistische Auswertung der (vorbehandelten) Raman-Spektren unter Verwendung multivariater Methoden (z. B. Hauptkomponentenanalyse, Limare Diskriminanzanalyse, Support-Vektor-Analyse oder andere). Analog werden aus der Analyse der Wachstumscharakteristik und der morphologischen Änderungen Indikatoren für Resistenz und Sensitivität erhalten. Diese drei Indikatoren werden mit Hilfe eines gewichteten statistischen Verfahrens dazu verwandt, Aussagen über die Resistenz bzw. Sensitivität des untersuchten Bakteriums gegenüber den verschiedenen Antibiotika zu treffen.

Die optische Detektion erfolgt an einem Raman-Spektrometer mit integriertem Konfokalmikroskop mit Weißlichbeleuchtung, (z. B. inVia confocal Raman microscope von RENISHAW, United Kingdom oder XploRATMPLUS von HORIBA).

Nachfolgend wird anhand der beigefügten Zeichnung näher auf ein Ausführungsbeispiel der Erfindung eingegangen:

1: Übersicht über ein System zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers

In 1 ist ein System zur Bestimmung eines mikrobiellen Erregers (1) gezeigt, das eine Kamera zur optischen Detektion aufweist. Die zu bestimmenden Erreger (5) befinden sich in einer Lochkammer einer Lochkammerplatte (3), die mehrere Lochkammern (4) aufweist. Die optisch-morphologische Detektion erfolgt über eine Kamera (2). Zur Beleuchtung dient dabei eine Weisslichtquelle (9), die durch das Objektiv (8) die Probe beleuchtet. Laser (6) und dispersives Element mit Detektor (7) bildend das Raman-Spektrometer. Der Anregungslichtweg, sowie der Detektionslichtweg passieren das Objektiv (8). Der Detektor (7) dient der Raman-spektroskopischen Detektion. Die Recheneinheit (10) dient der Bestimmung der Erreger und ggf. deren Antiinfektivaresistenz durch Bestimmen einer Morphologie der Erreger basierend auf den Daten der Kamera und Bestimmen der Erreger (und ggf. deren Antiinfektivaresistenz) basierend auf dem Raman-Spektrum und der Morphologie des mikrobiellen Erregers.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Schröder et al. Scientific Reports, 2015 [0002]
  • Choi et al., Science Translational Medicine, 2015 [0002]
  • Schröder et al. [0060]