Title:
Verfahren zur geeigneten Therapie- und Erkennungsmethoden beim Lungenkrebs
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln von geeigneten Therapie- und/oder Erkennungsmethoden und/oder -stoffen für oder gegen die Krebsentstehung, wobei
• Migrierende Krebszellen aus Patienten- oder Zellkulturproben selektioniert und angereichert werden oder
• gesundes Gewebe bzw. Zellen einem krebszellenerzeugenden Medium (chemisch/physikalisch) ausgesetzt wird und/oder Tumorzellen veranlasst werden, in gesundes Gewebe zu migrieren, um dort neue prä- oder neoplastische Zellen/Zellcluster zu bilden- als Nachweis für das neoplastische Potential der Zellen,
• dieses „infiltrierte“ Gewebe verschiedenen Therapie- und/oder Erkennungsmethoden und/oder -stoffen ausgesetzt und
• ermittelt wird, welche Behandlungs- und/oder Erkennungsmethode und/oder -stoff am geeignetsten zur Therapie und/oder Erkennung dieses Krebses ist.




Inventors:
Mohr, Ulrich, Prof. (30559, Hannover, DE)
Aufderheide, Michaela, Prof. (30559, Hannover, DE)
Application Number:
DE102016104212A
Publication Date:
09/14/2017
Filing Date:
03/08/2016
Assignee:
Mohr, Ulrich, Prof., 30559 (DE)
International Classes:



Foreign References:
WO2014086412A12014-06-12
Other References:
AUFDERHEIDE, M. [u.a.]: A new computer-controlled air-liquid interface cultivation system for the generation of differentiated cell cultures of the airway epithelium. Exp. Toxicol. Pathol. (Januar 2016; elektronisch veröffentlicht 24.10.2015) 68 (1) 77-87
Attorney, Agent or Firm:
Patentanwälte und Rechtsanwalt Weiß, Arat & Partner mbB, 78234, Engen, DE
Claims:
1. Verfahren zum Ermitteln von geeigneten Therapie- und/oder Erkennungsmethoden und/oder -stoffen für oder gegen die Krebsentstehung, wobei
• Migrierende Krebszellen aus Patienten- oder Zellkulturproben selektioniert und angereichert werden oder
• gesundes Gewebe bzw. Zellen einem krebszellenerzeugenden Medium (chemisch/physikalisch) ausgesetzt wird und/oder Tumorzellen veranlasst werden, in gesundes Gewebe zu migrieren, um dort neue prä- oder neoplastische Zellen/Zellcluster zu bilden- als Nachweis für das neoplastische Potential der Zellen,
• dieses „infiltrierte“ Gewebe verschiedenen Therapie- und/oder Erkennungsmethoden und/oder -stoffen ausgesetzt und
• ermittelt wird, welche Behandlungs- und/oder Erkennungsmethode und/oder -stoff am geeignetsten zur Therapie und/oder Erkennung dieses Krebses ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur kontrollierten Versorgung einer oder mehrerer Gewebe in Zellkulturbehältern mit einem Medium, z.B. des Respirationstraktes bei einer Kulturführung an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht insbesondere zur Verbesserung des Zellwachstums und der Differenzierung der Zellen in Langzeitkulturen eine Mediumumwälzung innerhalb des Zellkulturbehälters erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen respektive 3D-Kulturen auf einer mikroporösen Membran angeordnet werden, wobei
• ein Mediumlevel unter der Zellkultur über einen Zeitraum von minimal 3 Wochen auf einen vorbestimmten Referenzwert in einer Toleranz von 0,2–0,3 mm gebracht wird, indem das Medium über eine Kontrolleinrichtung zugeführt wird und Abweichungen erkannt und ausbalanciert werden
• ein Medienaustausch sowie eine Mediumzirkulation, insbesondere zur Durchmischung, durchgeführt werden.

Description:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln von geeigneten Therapie- und Erkennungsmethoden und/oder -stoffen gegen Krebs.

Stand der Technik

In der Medizin wird Krebs als eine bösartige Gewebeneubildung (Neoplasie) bzw. ein maligner (bösartiger) Tumor (Krebsgeschwulst, syn. Malignom) bezeichnet. Im engeren Sinn sind damit sowohl die malignen epithelialen Tumoren (Karzinome), als auch die malignen mesenchymalen Neubildungen (Sarkome) gemeint. Weiter werden bösartige Hämoblastosen als Krebs bezeichnet, wie beispielsweise die Leukämien als „Blutkrebs“. Die benignen (gutartigen) Neoplasien, sind kein Krebs; hier handelt es sich um eine Gewebevermehrung oder Raumforderung im Körper, die keine Metastasen bilden. Demnach sind gutartige Neoplasien z.B. Neubildungen von Körpergewebe durch Fehlregulation des Zellwachstums.

Gutartige Gewebeneubildungen, wie Papillome und Fettgeschwülste (Lipome), werden in der Fachsprache nicht als Krebs bezeichnet, obwohl sie entarten können, so dass die Funktion lebenswichtiger Organe gestört wird. In der allgemeinen Fachsprache ist Krebs der Sammelbegriff für Körperzellen die unkontrolliert wachsen, sich teilen, gesundes Gewebe verdrängen und dabei zerstören. Krebs hat unterschiedliche Auslöser, die letztlich zur Störung des genetisch geregelten Gleichgewichts hinsichtlich Zellzyklus (Wachstum und Teilung) und Zelltod (Apoptose) führen (Wikipedia).

Unter dem Begriff Krebs soll, gemäß der vorliegenden Erfindung, jede Form von unkontrolliertem Wachstum der Körperzellen verstanden werden, wenn diese spontan durch genetische Transformation, durch einen beliebigen Wirkstoff oder äußere nachvollziehbare Einflüsse ausgelöst wird.

Beispielhaft bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das Plattenepithel- und Adenokarzinom der Lunge und insbesondere auf den nicht-kleinzelligen Lungenkrebs – abgekürzt NSCLC (non small cell lung carcinom). 80 % aller Patienten mit diesem nachgewiesenem Lungenkarzinom haben eine Überlebensrate von nur 5 Jahren.

Wenn möglich, wird nach chirurgischer Entfernung der Geschwulst die prä- und postoperative Chemotherapie zur Behandlung von Rezidiven heute häufig angewendet. Das heißt, die Chemotherapie dient hier zur Vorbeugung eines Rückfalls. Damit will man verhindern, dass mögliche nicht entfernte oder ausgewanderte Tumorzellen erneut einen Tumor ausbilden.

Das Progressionsmodell für diese Erkrankung ist die schrittweise Umwandlung unspezifischer Veränderungen über Meta- und Dysplasien in ein Carcinoma in situ (CIS), das zur invasiven Krebserkrankung führen kann. Als Carcinoma in situ wird das Frühstadium eines epithelialen Tumors noch ohne invasives Wachstum beschrieben. Mit dem Begriff Metaplasie wird die Umwandlung einer differenzierten Gewebeart und mit Dysplasie die Veränderung von Zellen durch atypische Wachstumsvorgänge bezeichnet.

Untersuchungen von Pipinikas et al. (2014) sowie Baccelli und Trump (2014) an Biopsiematerial zeigten, im Gegensatz zur klassischen Vorstellung der Metastasenbildung, dass Tumorzellen in normale gesunde Lungenepithelzellschichten migrieren und dort neue prä- bzw. neoplastische Zellcluster bilden. Unter Zellcluster werden Zellaggregate von mehr als zwei Zellen verstanden und solche Zellen sind häufig genetisch verändert. Deshalb kann im Vergleich zum Primärtumor eine andere Empfindlichkeit der Zellen gegenüber den angewandten Chemotherapeutika bestehen. Gezielte in vitro-Untersuchungen mit einer Auswahl von Zytostatika könnten bei positiven Befunden an den Zellen oder der Zellcluster zur erfolgreichen Behandlung des Patienten führen.

Der Nachweis solcher Zellen, auch „Schläferzellen“ genannt, und ihre selektive Anreicherung kann die Grundlage für individuelle Behandlungsmethoden werden. Das Zell-basierte Monitoring am Patientenmaterial hinsichtlich solcher Zellen wäre dann die Basis für die Entwicklung eines Prädiktionstestes zur Abschätzung des Risikos der Rezidivbildung. Ein derartiger Test könnte dann als diagnostische Dienstleistung (z.B. in Kliniken) zur gezielten Behandlung des betreffenden Patienten mit vorab geprüften Chemotherapeutika angeboten werden. Dieser Ansatz wäre auch ein Weg zur Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung migrierender neoplastischer Zellen.

Bisher mussten die Krebszellen erst isoliert werden, um mit ihnen entsprechende Tests durchzuführen, wie die Prüfung der Reaktion auf bestimmte Chemotherapeutika zur Änderung des Therapiekonzeptes oder aber auch der Medikamente. Der Nachteil bei einer solchen Vorgehensweise besteht darin, dass man zuerst die Zellen des ursprünglichen Tumors des Patienten untersuchen muss, nicht jedoch die ausgewanderten Krebszellen, die für das Rezidiv verantwortlich sind.

Die Methode der Selektion und Anreicherung von Krebszellen kann darüberhinaus auch auf entartete Zellen angewendet werden, die durch chemische oder physikalische Einwirkung entstanden sind.

Aufgabe

Die Etablierung eines solchen innovativen Screening-Verfahrens für Krebs-Patienten (insbesondere NSCLC Patienten), als diagnostische Dienstleistung zur Unterstützung der prä- und postoperativen Chemotherapie bei einem Rezidiv ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung.

Weiterhin ist die Selektion und Anreicherung von Zellen, die durch chemische und/oder physikalische Behandlung entstanden sind, eine wichtige Aufgabe, um das krebserzeugende Potential des wirksamen Mediums zu erkennen.

Lösung der Aufgabe

Zur Lösung dieser Aufgaben dienen 2 Ansätze:

  • • Zum einen wird gesundes Gewebe einem Medium (chemisch/physikalisch) das Krebszellen erzeugt (Induktion von Tumorzellen) ausgesetzt, um dessen krebserzeugendes Potential zu erkennen.
  • • Zum anderen wird weiterhin geprüft, ob die Tumorzellen in gesundes Gewebe migrieren und dort neue prä- oder neoplastische Zellen/Zellcluster bilden.
  • • Anhand dieser Zell-basierten Ansätze wird ermittelt, welche Therapie- und Erkennungsmethoden sich für das jeweilige Medium beziehungsweise für das betroffene Patientenmaterial zur Behandlung und Erkennung des vorliegenden Tumortyps am besten eignen.

Ein Zell-basiertes Monitoring am Patientenmaterial hinsichtlich solcher Tumorzellen ist die Basis für die Entwicklung eines Prädiktionstestes zur Abschätzung des Rezidivrisikos. Ein solcher Test kann dann als diagnostische Dienstleistung (z.B. in Kliniken) zur möglichen Verbesserung der Chemotherapie angeboten werden. Die Pharmaindustrie könnte dann den vorgeschlagenen Ansatz zur Entwicklung neuer Chemotherapeutika für die Behandlung migrierender neoplastischer Zellen nutzen.

Es wurde gezeigt, dass man die Tumorzellen in einem neuen in vitro-Langzeitkulturverfahren selektiv in den Gewebekulturen anreichern, erfassen und die Wirksamkeit verschiedener Chemotherapeutika oder spezieller Erkennungsverfahren an ihnen prüfen kann. Die Bestimmung des wirksamen individuellen Chemotherapie-Spektrums, als Dienstleistung für Kliniken, dient der Optimierung einer erfolgreichen Behandlung der betroffenen Patienten. Die Anreicherung der Tumorzellen in einem Computer-gesteuerten Langzeitkultivierungssystem, (CULTEX®LTC Modul) bietet die Möglichkeit, ein standardisiertes Kulturverfahren routinemäßig für die Diagnostik und Behandlung einzusetzen.

Für die Pharmaindustrie dürfte das beschriebene Vorgehen von großem Interesse sein, insbesondere dann wenn die Entwicklung neuer Chemotherapeutika für genetisch veränderten Tumorzellen erforderlich wird. Ein neuer innovativer Anwendungsbereich wäre mit diesem experimentellen Ansatz möglich, auch für chemisch und/oder physikalisch induzierte Tumorzellen.

Es werden nun verschiedene Lösungswege der vorgelegten Erfindung beispielhaft anhand der Verwendung von Bronchialepithelzellen beschrieben:
Am Anfang steht die Isolierung von Bronchialepithelzellen verschiedener NSCLC Patienten und die Etablierung von 2D Kulturen aus diesen isolierten Zellen. Die Isolierung von Bronchialepithelzellen bzw. deren Vorläuferzellen erfolgt aus Klinikproben, die sowohl aus Tumor-nahem als auch „gesunden“ Gewebeanteilen stammen (Operationsmaterial von Tumorpatienten).

Das Verfahren wird unter Verwendung etablierter Isolierungskontrolle (Standardarbeitsanweisungen – SAAs) angewendet. In der Regel sind drei Wochen für die Isolierung nötig, wobei die angelegten Zellkulturen täglich hinsichtlich ihres Zellwachsums geprüft und Fortschritte dokumentiert werden. Die Zellpopulationen werden dann charakterisiert (immunhistochemische Charakterisierung und genetische Untersuchungen der isolierten Zellen).

Ein zweiter Verfahrensschritt ist die Erstellung differenzierter 3D Kulturen aus isolierten Bronchialepithelzellen. Aus diesen werden sogenannte ALI(Air liquid Interface)-Kulturen hergestellt, die auf mikroporösen Membranen wachsen und basal über die Membranporen mit Nährstoffen versorgt werden. Apikal stehen sie – in Analogie zur Lunge – mit der umgebenden Atmosphäre bzw. Atemluft in Kontakt. ALI-Kulturen bedeutet, dass solche Zellen unmittelbar an der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht kultiviert werden. Enthalten die Zellproben neoplastische Zellen oder Zellklone, so finden sich diese meist nur in geringer Anzahl in einer Gesamtpopulation und entgehen deshalb routinemäßigen Zellkontrollen. Dies gilt auch für Zellkulturen, die einem chemischen oder physikalischen Medium ausgesetzt wurden.

Insbesondere unter den ALI-Bedingungen bilden die Zellen nach einer Inkubationszeit von ca. 28 Tagen pseudostratifizierte, differenzierte 3D Konstrukte, d.h., die Kulturen zeigen jetzt Zilien-tragende sowie Mucus-produzierende Zellen, vergleichbar mit dem in vivo Zustand hinsichtlich Organisation und Struktur. In vivo bedeutet: die Morphologie und Physiologie der Zellen ist mit den Befunden im lebenden Organismus vergleichbar.

Im dritten Schritt erfolgt die Selektion und Anreicherung von neoplastischen Zellen/Zellclustern mit einem speziell für diese Fragen geeigneten Langzeitkulturverfahren. Nach einer Inkubationsphase von 14 Tagen, d.h., nach vollständiger Anlage der differenzierten Zellen, werden die Zellkulturen für mindestens weitere 14 Tage in das CULTEX®LTC Modul für eine Computer-gesteuerte Langzeitkultivierung bei optimaler Nährstoffversorgung gebracht. Unter solchen Bedingungen kommt es dann zur Selektion und Anreicherung möglicher neoplastischer Zellen. Dies beruht darauf, dass sich normale epitheliale Zellen aufgrund ihrer fortgeschrittenen Differenzierung nicht weiter vermehren, während omnipotente neoplastische Zellen bei entsprechender Nährstoffversorgung eine rege Teilungsaktivität zeigen und sich in den basalen und mittleren Zellschichten anreichern. Für Zellen, die mit einem chemischen und/oder physikalischen Medium behandelt wurden, bedeutet dies, dass man für das Wirkmedium ein krebserzeugendes Potential nachweisen kann.

In einem CULTEX®LTC Modul lassen sich maximal 24 ALI-Kulturen unterbringen und maximal 4 Module in einem dazugehörenden Brutschrank. Der Einsatz dieser Technik erlaubt sowohl den Nachweis von migrierenden Tumorzellen als auch eine gezielte Prüfung an angereicherten Tumorzellen auf ihre Sensitivität gegenüber ausgewählten Chemotherapeutika.

Der vierte und nunmehr letzte Verfahrensschritt ist das Screening von Chemotherapeutika. 3D Kulturen von den Patientenproben werden nun unter der Voraussetzung der Anreicherung von neoplastischen Zellen, in Anlehnung an das Patienten-spezifische Therapiekonzept mit Chemotherapeutika behandelt. Die Zellkulturen werden schließlich histologisch beurteilt und Veränderungen photographisch dokumentiert.

Solche Studien geben Aufschluss, ob die eingesetzten Therapeutika an den Zellen Wirkungen zeigen, oder ob für den Patienten eine neue Behandlungsstrategie entwickelt werden muss, um das Risiko hinsichtlich der Bildung eines Rezidivs zu minimieren.

In gleicher Weise gilt dies für chemisch/physikalisch induzierte Tumorzellen, d.h. ihre Empfindlichkeit gegen entsprechende Erkennungs- und Therapiemethoden kann auch hier überprüft beziehungsweise bestimmt werden.

Erfindungsgemäß sollte das beschriebene Verfahren natürlich nicht nur bei Bronchialepithelzellen Anwendung finden, sondern bei möglichst allen Zell- und Gewebestrukturen eines Lebewesens, bei dem unkontrolliertes Wachstum von Zellen stattfindet.

Figurenbeschreibung

Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele sowie anhand der Abbildungen; diese zeigen in

isolierte primäre Bronchialepithelzellen aus einer Patientenprobe (Resektion; ), die für 28 bzw. 38 Tage unter konventionellen (IC: Inkubatorkulturen) und Langzeitkulturbedingungen (LTC – Langzeitkultivierung im LTC-C Modul) an der Luft-Flüssigkeitsgrenzschicht (ALI = Air-Liquid-Interface) gezüchtet wurden. Vergrößerung: 630x.

Isolierte Bronchialepithelzellen einer Patietenprobe nach 23tägiger Kultivierung an der Luft-Flüssigkeitsgrenzschicht (ALI) unter statischen Bedingungen im Inkubator (manueller Mediumwechsel) als Voraussetzung für eine vergleichbare in vivo Differenzierung. A. Hämatoxilin/eosin gefärbter Schnitt der Kultur. Die oberste Zellschicht besteht aus Zilien-tragenden und Mukus-produzierenden Zellen, vergleichbar mit normalem Bronchialepithel der Lunge. B. und C. Immunhistochemische Darstellung Cytokeratin 13 (CK13) positiver Zellen als Marker für präneoplastische Zellen. Die Kulturen zeigen neben unauffälligen Epithelabschnitten (B.) in den unteren und mittleren Zelllagen CK13 positive Zellen. Vergrößerung: 630x.

Histologischer Schnitt von 3D-Kulturen isolierter primärer Bronchialepithelzellen, die nach Kultvierung in der Computer-gesteuerten Langzeitkultur (LTC-C Modul mit dynamischen Mediumwechsel – zirkulation und -mischung) eine Selektion und Anreicherung von präneoplastischen Zellen (CK13 positiven Zellen) zeigen. Vergrößerung: 630x.

Intermediäre Zellmetaplasie in Zellkulturen von primären Bronchialepithelzellen vom Menschen, die innerhalb einer 43tägigen Kulturperiode die ersten 3 Wochen mit Benzo(a)pyren in nichttoxischen Konzentrationen behandelt wurden. Die Zellen wurden mit CK13 Antikörpern immunhistochemisch markiert, um die Selektion und Anreicherung von metaplastischen Zellen in den LTC-Kulturen nach Behandlung mit einer krebserzeugenden Substanz zu demonstrieren. Vergrößerung: 630x.

Gemäss werden histologische Schnitte von 3D-Kulturen gezeigt, die aus isolierten primären Bronchialepithelzellen einer Resektionsprobe etabliert wurden, wobei Abbildungsteil A das Originalgewebe der Patientenprobe darstellt und die Abbildungsteile B–E die Etablierung.

Die Kulturen wurden hierzu unter konventionellen Bedingungen im Brutschrank, auch abgekürzt IC genannt, und parallel unter Langzeitkulturbedingungen in einem CULTEX®LTC Modul für 28 beziehungsweise 38 Tagen kultiviert, als Voraussetzung für eine in vivo vergleichbare Differenzierung. Die Vergrößerung der Abbildung hat den Faktor 630.

Mittels der oben beschriebenen Technologie zur Langzeitkultivierung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht, sprich ALI-Kulturen, können sowohl normale als auch genetisch veränderte Zellen des Respirationstraktes vom Menschen wie z.B. Bronchialzellen in der Art gezüchtet werden, dass sie histologisch als auch immunhistologisch sehr große Homologie mit der natürlichen Bronchialschleimhaut aufweisen.

In der wird eine ALI-Kultur von isolierten Bronchialepithelzellen nach einer Kulturperiode von 23 Tagen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht unter konventionellen Bedingungen im Brutschrank gezeigt.

In Abbildungsteil A wird ein Hämatoxylin/Eosin gefärbter Schnitt der Kultur dargestellt. Es ist deutlich zu erkennen, dass die oberste Zellschicht aus Zilien-tragenden und Mukus-produzierenden Zellen besteht, die vergleichbar sind mit normalem Bronchialepithel der Lunge.

Die Abbildungsteile B und C sind immunhistochemische Markierungen von Cylokeratin 13, weiterhin mit CK13 abgekürzt, positive Zellen als Marker für präneoplastische Zellen. Die Kulturen zeigen, neben unauffälligen Epithelabschnitten gemäss Abbildungsteil B, in den unteren und mittleren Zelllagen CK13 positive Zellen 1 gemäss Abbildungsteil C.

Diese Untersuchungen mit isolierten Bronchialepithelzellen, also Primärzellen, aus Resektionsmaterial von NSCLC- Patienten ergaben, dass selbst im Bereich klinisch "gesunder" Gewebeanteile mit präneoplastischen Zellen zu rechnen ist, welche darstellt.

In wird eine ALI-Kultur der in beschriebenen isolierten Bronchialepithelzellen nach einer Kulturperiode von 23 Tagen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht unter dynamischen Kulturbedingungen im CULTEX®LTC Modul gezeigt. Unter diesen Bedingungen kommt es zu einer Selektion und Anreicherung der präneoplastischen Zellen, verdeutlicht durch die massiv durch CK13 markierten Zellen.

Differenzierte Zellkulturen, d.h., Zilien-tragende und Mukus-produzierende Zellen, die aus solchen Gewebeproben im sogenannten Langzeitverfahren im CULTEX®LTC Modul kultiviert wurden, zeigen mit fortschreitender Kultivierung innerhalb von vier Wochen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht die Anreicherung von präneoplastischen Zellen in den basalen und mittleren Zellschichten. Diese Befunde deuten darauf hin, dass diese Patienten ein erhöhtes Risiko zur Bildung von Rezidiven aufweisen und hinsichtlich einer wirksamen Chemotherapie speziell eingestellt werden müssen.

Dieser technologische und experimentelle Ansatz ist von Bedeutung sowohl für die grundlagenorientierte als auch anwenderorientierte Forschung, da sie vergleichbare toxikologische Untersuchungen von Wirkstoffen (z.B. Pharmazeutika, Wachstumsfaktoren, Zytokine) und Schadstoffen (Zigarettenrauch, Partikel, Aerosole) auf spezifische Zellpopulationen innerhalb des Epithelzellverbandes zur Risikoabschätzung und zur Herstellung von Ausgangsmaterial für zell- bzw. molekularbiologische Anschlussuntersuchungen erlaubt.

Gemäss wird eine intermediäre Zellmetaplasie in Zellkulturen von primären Bronchialepithelzellen vom Menschen dargestellt, die innerhalb einer 43-tägigen Kulturperiode die ersten 3 Wochen mit einem krebserzeugenden Stoff (Benzo(a)pyren) in nichttoxischen Konzentrationen behandelt wurden. Die Zellen wurden mit CK13 Antikörpern immunhistochemisch markiert, um die Selektion und Anreicherung von metaplastischen Zellen in den Kulturen nach Behandlung mit einer krebserzeugenden Substanz zu demonstrieren. Vergrößerungsfaktor ist hier ebenfalls 630x.

Weiterhin sagt aus, dass ein derartiges Zellmodell auch Aussagen zum krebserzeugenden Potential von Wirkstoffen liefern kann. Experimente mit Benzo(a)pyren, einem bekanntermaßen krebserzeugenden, polyzyklischen Kohlenwasserstoff, führten nach einer Langzeitbelastung von Bronchialepithelzellen im nichttoxischen Bereich zur Induktion von Krebszellen, die sich in der Langzeitkultur, analog zu den primären Tumorzellen, selektionieren und anreichern lassen.

Eine Limitierung dieser Zellmodelle besteht in der hohen Variabilität zwischen den Spendern und der Verfügbarkeit der Zellkulturen, da sie nach wenigen Passagen ihre in vivo Eigenschaften verlieren. Hier bietet eine immortalisierte Zelllinie (z.B. CL-1548; Cultex Laboratories GmbH), die im Vergleich zu den normalen Ausgangszellen einen vergleichbaren Phenotyp aufweist, jederzeit verfügbar ist und ihre Differenzierungseigenschaften über einen langen Kultivierungszeitraum behält, die einzigartige Möglichkeit ein reproduzierbares und jederzeit verfügbares Tumormodell zu etablieren.

Speziell die Langzeitkultivierung von derartigen 3D-Zellmodellen über mehrere Wochen führt zu einer Anreicherung von transformierten Zellen (Tumorzellen), die sich in einem voll differenzierten 3D-Bronchialepithel vermehren und ausbreiten können, während das Epithel an sich seinen Phenotyp beibehält. Diese Kombination gestattet die Etablierung eines 3D-Tumormodels, welches in folgender Hinsicht zur gesundheitlichen Vorsorge des Verbrauchers und Patienten eingesetzt werden kann:

  • 1. Toxikologische Untersuchung von Wirk- und Schadstoffen zur Risikoabschätzung
  • 2. Testung des kanzerogenen (krebserzeugenden) Potentials von Wirkstoffen (Expositionspellets) an artifizieller Bronchialschleimhaut zur lokal begrenzten Induktion transformierter Zellen.
  • 3. Überprüfung der Wirksamkeit von Chemotherapeutika auf derart induzierte neoplastische Läsionen oder migrierende Tumorzellen/-cluster aus Patientenproben.
  • 4. Plattform für die Entwicklung neuer Behandlungsansätze, insbesondere chemotherapeutischer Ansätze.

Eine kurze Erklärung zum CULTEX®LTC Modul, wie dies in der WO 2014/086412 A1 beschrieben wurde, vorweg. Das CUTEX®LTC Modul wurde für die Langzeitkultivierung von Lungenzellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht entwickelt. Es garantiert die optimale und standardisierte Nährstoffversorgung unter dynamischen Bedingungen. Unter solchen Kulturbedingungen differenzieren normale Bronchialepithelzellen besonders gut in Zilientragende und Mukus-produzierende Zellen. Sie bilden einen kompakten Zellverband ohne weitere Proliferationsaktivität, während neoplastische Zellen sich durch verstärkte Teilungsaktivitäten in den Kulturen anreichern.

Die Selektion und Anreicherung von Tumorzellen in einem Computergesteuerten Langzeitkultivierungssystem (CULTEX®LTC Modul) bietet die Möglichkeit ein solches standardisiertes Kulturverfahren routinemäßig für die Diagnostik einzusetzen, um die Wirksamkeit verschiedener Chemotherapeutika an den Tumorzellen zu prüfen. Die Bestimmung des wirksamen individuellen Chemotherapiespektrums, als Dienstleistung für Kliniken, dient der Optimierung für eine erfolgreiche Behandlung der Patienten.

Für die Pharmaindustrie müssten die beschriebenen Zellmodelle von großem Interesse sein, da diese für die Entwicklung von neuen Chemotherapeutika vor allem bei genetisch veränderten Tumorzellen herangezogen werden könnten. Bezugszeichenliste

1positive Zellen

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • WO 2014/086412 A1 [0047]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Pipinikas et al. (2014) sowie Baccelli und Trump (2014) [0008]