Title:
Hämatologische Diagnose suspendierter Erythrozyten mit Hilfe des rollenden Bewegungsmodus in laminarer Strömung
Kind Code:
A1


Abstract:

Verfahren und Vorrichtung zur mikroskopischen Diagnose suspendierter roter Blutkörperchen (Erythrozyten) in laminarer Strömung durch eine Durchflussküvette mit rechteckigem Strömungsquerschnitt und mindestens einer transparenten Wand für die Mikroskopie, mit den zusätzlichen Eigenschaften, dass
- der rollende Bewegungsmodus („rolling mode“) gesunder Erythrozyten (Diskozyten) in zwei Schichten des Strömungskanals mit maximaler Häufung auftritt,
- dass die Silhouetten der rollenden Diskozyten durch die transparente Küvettenwand hindurch als Ovale erscheinen, die längs der Strömungsrichtung orientiert sind, und dass
- die orientierten Ovale sichtbar und gemacht werden durch ein vertikal zur transparenten Küvettenwand gerichtetes In-situ-Mikroskop, dessen Fokusbereich mit einer der Suspensionschichten überlappt, in welcher rollende Diskozyten auftreten. embedded image




Inventors:
Erfinder wird später genannt werden
Application Number:
DE102016013095A
Publication Date:
05/09/2018
Filing Date:
11/09/2016
Assignee:
Suhr, Hajo, 69120 (DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE10027044A1N/A2001-12-06
DE19726518A1N/A1999-02-04
DE4032002C2N/A1997-05-22



Other References:
NZ et al, Quantifying morphological heterogeneity, Vox Sang. 2015; 109(3): 221-230
Albertini MC, et al, Automated Analysis of morphometric parameters for accurate definition of erythrocyte cell shape, Cytometry. 2013; 52A: 12-18
Dupire J, et al, Full dynamics of a red blood cell in shear flow. Proceedings oft he National Academy of Sciences oft the USA. 2012; 109(51): 20808-20813
Claims:
Verfahren und Vorrichtung zur mikroskopischen Diagnose suspendierter roter Blutkörperchen (Erythrozyten) in laminarer Strömung durch eine Durchflussküvette mit rechteckigem Strömungsquerschnitt und mindestens einer transparenten Wand für die Mikroskopie, mit den zusätzlichen Eigenschaften, dass
- der rollende Bewegungsmodus („rolling mode“) gesunder Erythrozyten (Diskozyten) in zwei Schichten des Strömungskanals mit maximaler Häufung auftritt,
- dass die Silhouetten der rollenden Diskozyten durch die transparente Küvettenwand hindurch als Ovale erscheinen, die längs der Strömungsrichtung orientiert sind, und dass
- die orientierten Ovale sichtbar und gemacht werden durch ein vertikal zur transparenten Küvettenwand gerichtetes In-situ-Mikroskop, dessen Fokusbereich mit einer der Suspensionschichten überlappt, in welcher rollende Diskozyten auftreten.

Verfahren nach Anspruch 1 mit der zusätzlichen Eigenschaft, dass die orientierten ovalen Silhouetten durch automatische Bildverarbeitung detektiert und gezählt werden.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 mit der zusätzlichen Eigenschaft, dass die Anzahl detektierter orientierter Ovale als Messparameter zur hämatologischen Diagnose beiträgt.

Eine mögliche vorteilhafte Vorrichtung (gemäß ) für das Verfahren nach Anspruch 1, wobei
- durch eine Spritzenpumpe eine 1000fach verdünnte Blutprobe mit 0,5ml/min Volumenstrom hin und her durch eine Durchflusszelle mit den Maßen 50×5×0,1 (in mm) gepumpt wird und
- mit Pulsen von 3µs Dauer die strömende Suspension zur Mikroskopie mit einem Objektiv x40, NA=0,75 belichtet wird, und
- durch eine Mikrometerschraube die Durchflusszelle so positioniert wird, dass die untere der beiden Suspensionsschichten, welche rollende Diskozyten enthalten, mit dem Fokusbereich (Schärfentiefe) des Objektivs überlappt.

Description:
Kontext der Erfindung:

Der aerobe Stoffwechsel des Menschen hängt maßgeblich von der Qualität der Erythrozyten im Blutkreislauf (und gegebenfalls in Blutkonserven) ab. Insbesondere die extreme Flexibilität der Erythrozyten ermöglicht ihnen einen Zugang zu feinsten Gefäßverästelungen, auch solchen mit sehr geringem Durchmesser (< 1 µm, Kapillaren), um dort die Versorgung des Körpergewebes mit Sauerstoff sicherzustellen. Wenn die Qualität und dabei insbesondere die Flexibilität der roten Blutkörperchen vermindert ist, so verschlechtert sich die Sauerstoffversorgung des Gewebes. Daher ist es wichtig, rote Blutkörperchen in entnommenen Blutproben oder in Blutkonserven schnell und unkompliziert hinsichtlich ihrer Qualität beurteilen zu können. Außer aufwändigen biochemischen Tests (ATP-Konzentration, Hämolyse, etc) bieten sich hierzu optisch mikroskopische Diagnosen an. Bestimmte morphologische Veränderungen am Zellkörper sind charakteristisch für Erythrozyten mit verminderter Funktionsfähigkeit. Als Probentechnik für eine mikroskopische morphologische Diagnose an mikroskopierten Blutzellen ist es üblich, einen „Blutausstrich“ anzufertigen, also ein Präparat mit fixierten Blutzellen auf einem Objektträger. Auch Präparate mit beweglichen und durchlaufenden Monolagen von Blutzellen wurden schon mikroskopisch analysiert, allerdings bisher nur in wissenschaftlichen Untersuchungen, nicht in der medizinischen Diagnostik. Hierbei ist die im Vergleich zu statischen Blutausstrichen stark erhöhte Anzahl vermessener Erythrozyten eine verbesserte statistische Basis für empfindliche Messungen morphologischer Veränderungen im Zellensemble (z.B. Piety NZ et al, Quantifying morphological heterogeneity, Vox Sang. 2015; 109(3): 221-230). Zur automatischen Klassifizierung der Zellen in bestimmte morphologische Klassen wird automatische Bildverarbeitung mit spezialisierten Algorithmen angewendet (siehe Albertini MC, et al, Automated Analysis of morphometric parameters for accurate definition of erythrocyte cell shape, Cytometry. 2013; 52A: 12-18.).

Typische im Blutausstrich erkennbare Morphologieklassen sind:

  1. 1. Diskozyten (bikonkave Scheiben, glatt, sehr flexibel, der gesundeste Zustand)
  2. 2. Echinozyten (zunehmend sphärische aber mit unregelmäßiger Oberfläche durch zapfenartigen Ausbuchtungen)
  3. 3. Sphärozyten (sphärische Zellen mit glatter kugeliger Oberfläche, sehr geringe Deformierbarkeit, schlechte Funktionalität für den Sauerstofftransport. )

In der Reihenfolge von 1 bis 3 nimmt die funktionelle Qualität der Erythrozyten ab. Dabei werden die Erythrozyten umso rigider und unfähiger zum Transport durch kapillaren Gefäße, je mehr sie sich der inflexiblen kugeligen Form der Sphärozyten annähern. Im Blutausstrich kann man durchaus eine stärkere Schädigung daran erkennen, dass tendenziell vermehrt Sphärozyten und verringert Diskozyten zu sehen sind. Wegen der statistischen Natur dieser Daignose hängt aber ihre Empfindlichkeit direkt von der Anzahl untersuchter Zellen ab, die bei Blutausstrichen naturgemäß sehr begrenzt ist.

Eine bessere Empfindlichkeit ist nur erzielbar durch erhöhte Statistik beispielsweise durch Anwendung von Pipettierrobotern oder von fließenden Zellsuspensionen mit automatisierter Bildauswertung. Richtungsweisend wäre dabei auch die Hinzunahme dynamischer Messgrößen, die hochempfindlich die Flexibilität der Erythrozyten anzeigen. In der Tat treten bei Erythrozyten in einer strömenden Suspension typische Bewegungsmuster auf, die direkt mit ihrer Morphologie und Flexibilität zusammenhängen. Rote Blutkörperchen - wenn sie flexible Diskozyten sind - reagieren auf das Geschwindigkeitgefälle in einer laminaren Strömung, indem sie bestimmte Orientierungen und Bewegungsarten einnehmen, die spezifisch den Parametern der Strömung angepasst sind. Insbesondere gehen flexible Diskozyten in laminarer Strömung mit nicht zu starkem Geschwindigkeitsgefälle in einen rollende Bewegungsmodus (rolling mode) über. Sofern die Scherspannung durch die laminare Umströmung der Zellen in einem bestimmten Wertebereich liegt, reagieren die Diskozyten, indem sie in Strömungsrichtung rollen wie ein rollendes Rad, allerdings freischwebend in der Suspension, ohne feste Unterlage. (Siehe Dupire J, et al, Full dynamics of a red blood cell in shear flow. Proceedings oft he National Academy of Sciences oft the USA. 2012; 109(51): 20808-20813).

Dieser Effekt wird bisher in der medizinischen Diagnostik nicht angewendet, denn bei einem Blutausstrich wird Bewegung offensichtlich nicht erfasst. Die wissenschaftlichen Untersuchungen, die den rollenden Bewegungsmodus (rolling mode) zu Tage fördern, basieren bisher auf ausgeklügelten Versuchsapparaturen zur Präparation eines definierten Geschwindigkeitsgefälles sowie auf adaptierter konventioneller Mikroskopiertechnik. Die hier verwendeten Versuchsanordnungen haben aufgrund ihrer Komplexität für die hämatologische Diagnostik bislang keine Bedeutung.

Dieser Mangel an Praxistauglichkeit ist umso bedauerlicher, als die statistische Häufigkeit rollender Erythrozyten potentiell ein empfindliches Kriterium für die Blutqualität wäre, denn nur flexible Diskozyten können sich in dieser Weise bewegen, siehe obige Referenz von Dupire et al. Für die hämatologische Diagnostik wäre es daher vorteilhaft, über eine einfache apparative Ausrüstung zur Bestimmung der statistischen Häufigkeit rollfähiger Erythrozyten zu verfügen.

Konzept der Erfindung:

Diese Erfindung hat ein einfaches Verfahren zum Gegenstand, mit dessen Hilfe der rollende Bewegungsmodus in kleinen Blutproben statistisch erfasst wird. Das Verfahren beruht auf einer Kombination handelsüblicher Mikroskopie-Durchflusszellen mit einem nichtinvasiven In-situ-Mikroskop.

Grundlage des Verfahrens ist die erstmalig im Labor der Erfinder entdeckte Tatsache, dass der Rollmodus auch in einfachen handelsüblichen Mikroskopier-Durchflusszellen beobachtbar ist, z.B. in der „I0.1 flow chamber“ der Firma IBIDI GmbH, Martinsried mit einem Strömungskanal von 50 mm Länge bei einem Querschnitt von 5mm Breite x 0.1mm Höhe.

Zum Beispiel kann die Rollbewegung der gesunden Diskozyten wie folgt hervorgerufen werden: Eine Erythrozytensuspension wird in tausendfacher Verdünnung in einer wässrigen Salzlösung (0.9% NaCl) präpariert und mit Hilfe einer handelsüblichen Spritzenpumpe mit einem Volumenstrom von etwa 0,5ml/min durch die oben beschriebene Durchflusszelle gepumpt. Dann tritt in genau zwei schmalen Höhenabschnitten innerhalb des laminaren Geschwindigkeitsprofils der Strömung genau das Maß an Scherspannung auf, das den rollenden Bewegungsmodus bei flexiblen Diskozyten induziert. Diese Abschnitte sind zentriert etwa 10 µm unter der oberen und 10µm über der oberen Kanalwand. Entsprechend gibt es zwei Suspensionsschichten mit rollenden Diskozyten. Ihre Dicke beträgt einige Mikrometer.

Da der rollende Bewegungsmodus nicht im gesamten Strömungsquerschnitt auftritt, sondern nur in den beschriebenen zwei dünnen Schichten, ist das Phänomen im Mikroskop normalerweise nicht sichtbar. Bringt man allerdings die sehr begrenzte Schärfentiefe eines hochauflösenden Mikroskops zur räumlichen Koinzidenz mit der Schicht rollender Diskozyten, so kann man diese Schicht selektiv mikroskopieren. Den restlichen und damit den größten Teil der Suspension hält man so aus der Abbildung heraus. Dies ist erwünscht, denn die dortigen Diskozyten bewegen sich taumelnd und chaotisch. Vor diesem chaotischen Hintergrund wäre die Detektion der selteneren orientiert rollenden Zellen sehr erschwert wenn nicht unmöglich.

Daher ist die Beobachtung der rollenden Zellen in einer gewöhnlichen Durchflusszelle nur möglich mit einem hochauflösenden nichtinvasiven In-situ-Mikroskop, dessen Schärfentiefebereich so gering ist, dass man damit die verschiedenen Strömungsschichten entlang ihrer Höhe im Strömungskanal selektiv abbilden kann. Ein solches Instrument wird beschrieben in DE 403 20 02 C2, DE 197 26 518 A1 und DE 100 27 044 A1 sowie in wissenschaftlichen Publikationen, die unter http://www.inftech.hs-mannheim.de/ism aufgelistet sind. Insbesondere können auch bewegte suspendierte Partikel in durchströmten Küvetten durch Anwendung kurzer Lichtblitze mikroskopiert werden. Mit „nichtinvasiv“ ist gemeint, dass die Suspension direkt beobachtet wird, ohne dass die Strömung mechanisch gestoppt wird. Es geht also um die Mikroskopie bewegter Partikel direkt durch die transparente Küvettenwand hindurch, ohne die sonst übliche Fixierung der Partikel in statischen Präparaten. Entscheidend ist außerdem die Definition des Probenvolumens allein durch die Schärfentiefe der Optik. Diese ist bei einem hochauflösenden Mikroskopobjektiv nur etwa 7 Mikrometer dick, so dass es sich ideal eignet zur selektiven Beobachtung bestimmter Höhenschichten in der laminaren Strömung von Mikroskopier-Durchflusszellen.

Die gesamte Anordnung mit Durchflusszelle und Mikroskop wird gezeigt in .

In der Art eines invertierten Mikroskops fokussiert das In-situ-Mikroskop von unten in den waagerechten Strömungskanal genau in diejenige Höhenebene, in der die meisten Diskozyten sich bewegen wie rollende Räder. Mikrometerschrauben an der Befestigung der Durchflusszelle ermöglichen eine mikrometergenaue Feinjustierung der korrekten Höheneinstellung.

Da es zwei solcher Schichten im Strömungskanal gibt, wird in die untere von beiden - 10µm oberhalb der unteren Kanalbegrenzung - fokussiert. Auf diese Weise wird der optische Weg durch die Suspension verkürzt, und die Kontrastminderung durch Streuung an Zellen wird minimiert.

Erkennung rollender Diskozyten:

Zur eigentlichen Erkennung der rollenden Diskozyten ist folgendes zu beachten: Aus der Sicht des invertierten Mikroskops erscheint ein rollender Diskozyt in einer schmalen ovalen Silhouette mit seitlichen Eindellungen. Siehe . Das Oval ist entlang der Strömungsrichtung ausrichtet. Zur weiteren Auswertung wird durch automatische Bildverarbeitung dem Oval numerisch eine Ellipse angepasst, deren lange Halbachse die Orientierung des Ovals repräsentiert. Die Halbachse steht im Winkel φ zur Strömungsrichtung. Bei einem rollenden Diskozyten ist der Winkel φ entweder Null oder nahezu Null. Wenn der Winkel stark von Null abweicht, so befindet sich diese Zelle nicht im rollenden Modus. Die Bildverarbeitung passt unterschiedslos jeder Zelle, also auch den chaotisch taumelnden, eine Ellipse an. Taumelnde Diskozyten oder auch alle Echinozyten und Sphärozyten weisen jedoch keine Vorzugsrichtung auf, so dass die Häufigkeitsverteilung (Histogramm) ihrer Orientierungswinkel φ kein Maximum hat. Somit beweist ein statistisch gehäuftes Auftreten von Winkelwerten nahe Null immer eine reale statistische Häufung rollender Zellen und demnach das Vorhandensein flexibler Diskozyten. Als ein Maß für die Qualität der roten Blutkörperchen kann daher das prozentuale Gewicht des Winkels Null (also seine Wahrscheinlichkeit) im Histogramm aller gemessenen Winkel gewertet werden. Wenn diese Wahrscheinlichkeit bei hundert Prozent liegt, so bestehen nahezu alle roten Blutkörperchen aus flexiblen Diskozyten. Wenn aber die Wahrscheinlichkeit für alle Winkel gleich ist, so sind nahezu alle roten Blutkörperchen deformiert und/oder rigide.

Die zeigt eine Messung von Winkelhistogrammen in verschiedenen Höhen des Strömungskanals durch entsprechende Höheneinstellung des Schärfentiefebereichs. Diese Messung wurde an einer Probe aus einer Blutkonserve durchgeführt, die vorher eine Woche lang in einer Blutbank gelagert worden war, bei der man also noch eine hohe Qualität der roten Blutkörperchen erwarten würde. In der Tat erkennt man deutlich die hohen Konzentrationen rollender Diskozyten in den zwei symmetrischen Ebenen etwa 10µm oberhalb des Kanalbodens und 10µm unterhalb der Kanaldecke. In der mittleren Höhe von 50µm des 100µm hohen Kanals ist das Histogramm dagegen fast homogen, d.h. es gibt dort kaum Diskozyten im rollenden Modus. Diese einfache Messung beweist die der Erfindung zugrundeliegende Entdeckung.

Eine vorteilhafte Vorrichtung:

Eine mögliche und erfolgreich getestete Apparatur zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in gezeigt. Durch eine Spritzenpumpe wird eine 1000fach verdünnte Blutprobe mit 0,5ml/min Volumenstrom hin und her durch eine Durchflusszelle mit den Maßen 50x5x0,1 (in mm) gepumpt. Die Abbildung geschieht durch ein Wasserimmersionsobjektiv mit 40-facher Vergrößerung und einer numerischen Apertur von 0,75. Mit Pulsen von 3µs Dauer wird die strömende Suspension mit etwa 10 Pulsen Sekunde belichtet, so dass in wenigen Minuten etwa tausend Erythrozyten abgebildet werden. Durch eine Mikrometerschraube wird die Durchflusszelle so positioniert, dass die untere der beiden Suspensionsschichten, welche rollende Diskozyten enthalten, mit dem Fokusbereich (Schärfentiefe) des Objektivs überlappt.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

  • DE 4032002 C2 [0011]
  • DE 19726518 A1 [0011]
  • DE 10027044 A1 [0011]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • NZ et al, Quantifying morphological heterogeneity, Vox Sang. 2015; 109(3): 221-230 [0001]
  • Albertini MC, et al, Automated Analysis of morphometric parameters for accurate definition of erythrocyte cell shape, Cytometry. 2013; 52A: 12-18 [0001]
  • Dupire J, et al, Full dynamics of a red blood cell in shear flow. Proceedings oft he National Academy of Sciences oft the USA. 2012; 109(51): 20808-20813 [0004]