Title:
Verfahren zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung, bei dem automatisiert auf eine Oberfläche (3) in einer Vertiefung (9) mindestens eines Probenaufnahmebehälters (2) ein Motorprotein (1) sowie auf das Motorprotein (1) ein zu dem jeweiligen Motorprotein (1) korrespondierendes Filament (4) eines Zytoskeletts aufgebracht wird oder auf die Oberfläche (3) der Vertiefung (9) des Probenaufnahmebehälters (2) das Filament (4) des Zytoskeletts und auf das Filament (4) des Zytoskeletts das zu dem Filament (4) des Zytoskeletts korrespondierende Motorprotein (1) aufgebracht werden. Das Filament (4) des Zytoskeletts und/oder das Motorprotein (1) ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff (5) markiert und der zu untersuchende Wirkstoff und ein Enzym zur Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften werden der Lösung zugegeben. Außerdem wird Adenosintriphosphat zum Auslösen einer Bewegung des Motorproteins (1) sowie des daran angeordneten Filaments (4) des Zytoskeletts zugegeben und eine durch das Motorprotein (1) verursachte Bewegung des Filaments (4) des Zytoskeletts durch optisches Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs (5) detektiert.




Inventors:
Korten, Till, Dr. (01309, Dresden, DE)
Tavkin, Jelena (01307, Dresden, DE)
Ruhnow, Felix (01097, Dresden, DE)
Diez, Stefan, Prof. (01277, Dresden, DE)
Application Number:
DE102015221969A
Publication Date:
05/11/2017
Filing Date:
11/09/2015
Assignee:
Technische Universität Dresden, 01069 (DE)
International Classes:



Foreign References:
67562072004-06-29
69396842005-09-06
201302963492013-11-07
201500869792015-03-26
EP19648532008-09-03
WO2004096831A22004-11-11
Attorney, Agent or Firm:
Pfenning, Meinig & Partner mbB Patentanwälte, 01067, Dresden, DE
Claims:
1. Verfahren zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung, bei dem
automatisiert auf eine Oberfläche (3) in einer Vertiefung (9) mindestens eines Probenaufnahmebehälters (2) ein Motorprotein (1) sowie auf das Motorprotein (1) ein zu dem jeweiligen Motorprotein (1) korrespondierendes Filament (4) eines Zytoskeletts aufgebracht wird
oder auf die Oberfläche (3) der Vertiefung (9) des Probenaufnahmebehälters (2) das Filament (4) des Zytoskeletts und auf das Filament (4) des Zytoskeletts das zu dem Filament (4) des Zytoskeletts korrespondierende Motorprotein (1) aufgebracht werden, wobei
das Filament (4) des Zytoskeletts und/oder das Motorprotein (1) mit einem Fluoreszenzfarbstoff (5) markiert ist, sowie
der zu untersuchende Wirkstoff und ein Enzym zur Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften der Lösung zugegeben werden, wobei
sich daran anschließend Adenosintriphosphat zum Auslösen einer Bewegung des Motorproteins (1) sowie des daran angeordneten Filaments (4) des Zytoskeletts zugegeben wird und
eine durch das Motorprotein (1) verursachte Bewegung des Filaments (4) des Zytoskeletts durch optisches Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs (5) detektiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym Glucose-Oxidase oder Pyranose-Oxidase der Lösung zugegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Filament (4) des Zytoskeletts mindestens ein Mikrotubulus eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Motorprotein (1) Kinesin eingesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Motorprotein (1) über unspezifische Absorption oder Antikörper (6) auf der Oberfläche (3) der Vertiefung (9) des Probenaufnahmebehälters (2) angeordnet wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche (3) vor dem Aufbringen des Motorproteins (1) oder des Filaments (4) des Zytoskeletts durch bereichsweises Aufbringen eines Moleküls (7), vorzugsweise Caseins, für das Motorprotein oder das Filament geblockt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Verbessern des automatisierten Durchsatzes der optischen Detektion eine Außenseite des Probenbehälters durch eine Silanisierung mit einer Silanverbindung (8), vorzugsweise Dichlordimethylsilan, beschichtet wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche (3) vor dem Aufbringen des Motorproteins (1) oder des Filaments (4) des Zytoskeletts durch Spülen mit einem alkalischen Reiniger, Ethanol und/oder destilliertem Wasser gereinigt wird.

9. System zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit einer Befüllvorrichtung zum automatisierten Befüllen des mindestens einen Probenaufnahmebehälters (2) sowie einer optischen Aufnahmeeinrichtung (11) zum automatisierten Detektieren des Fluoreszenzfarbstoffs in der Lösung.

10. System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Aufnahmeeinrichtung (11) zum Durchführen einer internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie mit einem Immersionsobjektiv ausgebildet ist.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung.

Motorproteine sind an vielen Prozessen in der Zellbiologie beteiligt und beispielsweise essenziell für Zellteilung, Transport von Neurotransmittern, Mitochondrien, Zellorganellen, Boten-RNA oder Zellbewegung. Dementsprechend spielen Motorproteine eine zentrale Rolle bei vielen Krankheiten wie Krebs, Neuropathie oder Ciliopathie.

Um neue Medikamente zu finden bedient man sich meist sogenannter "high throughput screening"-Techniken, die Hunderttausende oder Millionen von Molekülen auf eine therapeutische Wirkung hin untersuchen. Bei Motorproteinen wird hierbei ein Verbrauch an Adenosintriphosphat (ATP) gemessen. Ist der Verbrauch an ATP niedriger als normal, geht man von einer inhibitorischen Wirkung des Wirkstoffs aus, wenn der Verbrauch höher ist, wird auf eine aktivatorische Wirkung geschlossen.

Nachteilig an dieser Lösung ist, dass nicht die eigentliche Funktion des Motorproteins gemessen wird, sondern nur eine indirekte Messung erfolgt. Hierbei können leicht Wirkstoffe übersehen oder missinterpretiert werden, die nicht direkt eine ATPaseaktivität, sondern anderweitig den molekularen Transport beeinflussen.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das die genannten Nachteile vermeidet, mit dem also eine direkte Messung der Aktivität von Wirkstoffen zeiteffizient mit hohem Durchsatz ermöglicht wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.

Ein Verfahren zur automatisierten Detektion einer Aktivität von Wirkstoffen in einer Lösung weist einen Verfahrensschritt auf, bei dem automatisiert auf eine Oberfläche in einer Vertiefung mindestens eines Probenaufnahmebehälters ein Motorprotein sowie auf das Motorprotein ein zu dem jeweiligen Motorprotein korrespondierendes Filament eines Zytoskeletts aufgebracht wird. Alternativ wird automatisiert auf die Oberfläche der Vertiefung des Probenaufnahmebehälters das Filament des Zytoskeletts und auf das Filament des Zytoskeletts das zu dem Filament des Zytoskeletts korrespondierende Motorprotein aufgebracht. Das Filament des Zytoskeletts und bzw. oder das Motorprotein sind mit einem Fluoreszenzmarker, typischerweise einem Fluoreszenzfarbstoff, markiert, außerdem werden der zu untersuchende Wirkstoff und ein Enzym der Lösung zugegeben oder sind bereits in der Lösung enthalten. Das Enzym dient hierbei einer Verbesserung der Fluoreszenzeigenschaften der Lösung. Daran anschließend wird Adenosintriphosphat (ATP) zum Auslösen einer Bewegung des Motorproteins sowie des daran angeordneten Filaments des Zytoskeletts zugegeben oder ist der Lösung bereits zugefügt sowie eine durch das Motorprotein verursachte Bewegung des Filaments des Zytoskeletts durch optisches Detektieren des Fluoreszenzmarkers detektiert.

Durch das automatisierte Einbringen der Lösung in die Vertiefung des Probenaufnahmebehälters können zeiteffizient die Lösungen vorbereitet und anschließend eingebracht und ebenfalls automatisiert die Bewegung des Motorproteins detektiert werden, da eine manuelle Vorbereitung eines Assays entfällt. Der Probenaufnahmebehälter weist hierzu typischerweise mehrere Vertiefungen auf, so dass in einem einzelnen Probenaufnahmebehälter verschiedene Wirkstoffe in den verschiedenen Vertiefungen angeordnet sein können und auf ihre Aktivität bzw. inhibitorische Wirkung untersucht werden können. Der direkte Nachweis der Bewegung des Motorproteins erfolgt hierbei durch das optische Detektieren der Fluoreszenz, also eine ortsaufgelöste Messung des Fluoreszenzmarkers. Das Enzym sorgt hierbei dafür, dass eine negative Beeinflussung der Fluoreszenz beispielsweise durch Sauerstoff gehemmt wird und somit eine Auflösung aufgrund der erhöhten Signalstärke des Fluoreszenzsignals erhöht ist. Da Sauerstoff in Verbindung mit für die Fluoreszenzmessung benötigter intensiver Beleuchtung nicht nur Farbstoffe, sondern auch Motorproteine schädigen kann, werden Verfälschungen der Messung durch Schäden an den Motorproteinen bzw. Filamenten durch Zugabe des Enzyms vermieden. Durch die automatisierte Vorbereitung der Messung kann der Probenaufnahmebehälter, der typischerweise mehrere Vertiefungen aufweist, um parallel oder nacheinander mehrere Wirkstoffe untersuchen zu können, schneller vermessen werden und ein Durchsatz des Verfahrens wird drastisch erhöht. Als Fluoreszenzmarker kann ein Quantenpunkt, der auch als "quantum dot" bezeichnet wird, verwendet werden. Typischerweise ist der Fluoreszenzmarker ein Fluoreszenzfarbstoff wie Rhodamin, Fluoreszein, Alexa 488 und bzw. oder Cy5. Zum Markieren des Motorproteins bzw. der Motorproteine kann ein fluoreszentes Protein wie grün fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein, GFP), aber auch ein Protein-Tag wie beispielsweise ein Snap-Tag verwendet werden.

Als Enzym wird vorzugsweise Glucose-Oxidase oder Pyranose-Oxidase der Lösung zugegeben. Während Glucose-Oxidase zwar ebenfalls die beabsichtige Wirkung entfaltet, jedoch einen Abfall des pH-Werts über der Zeit aufweist, bleibt der pH-Wert bei Pyranose-Oxidase über der Zeit konstant, so dass hier bei zeitlich stabilen Versuchsbedingen die Aktivität besonders gut untersucht werden kann. Pyranose-Oxidase sorgt dafür, dass Sauerstoff aus dem System entfernt wird und somit die Messumgebung gleich bleibt oder sich nur minimal ändert.

Mindestens ein Mikrotubulus oder ein Aktinfilament wird typischerweise als Filament des Zytoskeletts eingesetzt, wobei Kinesin oder Myosin als Motorprotein verwendet werden kann. Diese Kombination erlaubt eine zuverlässige Messung der Aktivität aufgrund zueinander korrespondierender Moleküle.

Das Motorprotein oder das Filament kann über unspezifische Absorption oder Antikörper auf der Oberfläche der Vertiefung des Probenaufnahmebehälters angeordnet sein. Hierbei ist aufgrund der zuverlässigeren Bindung die Verwendung von Antikörpern zwar bevorzugt, allerdings liefert auch die unspezifische Absorption den gewünschten Effekt. Alternativ oder zusätzlich können auch Polymere und eine kovalente Kopplungschemie bzw. anere Proteine verwendet werden, die spezifisch an das Filament bindet.

Um die Aktivität des Motorproteins zu verbessern, kann die Oberfläche vor dem Aufbringen des Motorproteins oder des Filaments des Zytoskeletts durch bereichsweises Aufbringen eines Moleküls, vorzugsweise Caseins, vorbehandelt werden.

Die Oberfläche kann auch mit Polymer, zum Beispiel Polyethylenglycol, PEG, bereichsweise vorbehandelt werden. Somit kann nur auf bestimmten, nicht geblockten Bereichen eine Detektion erfolgen und definierte räumliche Messbereiche gegeben sein.

Vorzugsweise wird eine der Oberfläche der Vertiefung des Probenaufnahmebehälters gegenüberliegende Außenseite des Probenbehälters oder die Oberfläche der Vertiefung selbst durch eine Silanisierung mit einer Silanverbindung, vorzugsweise Dichlordimethylsilan oder 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyltrichlorosilan, beschichtet, um eine Immersionsmikroskopie durchführen zu können, da auf silanisierten Oberflächen Flüssigkeitstropfen stabiler sind.

Vor dem Aufbringen des Motorproteins oder des Filaments des Zytoskeletts kann die Oberfläche durch Spülen mit einem alkalischen Reiniger, Ethanol und bzw. oder destilliertem Wasser gereinigt werden.

Ein System zum Durchführen eines zuvor beschriebenen Verfahrens weist eine Befüllvorrichtung und eine optische Aufnahmeeinrichtung auf. Die Befüllvorrichtung ist dazu ausgebildet, den mindestens einen Probenaufnahmebehälter automatisiert zu befüllen und ist vorzugsweise ein Pipettierroboter. Die optische Aufnahmeeinrichtung ist eingerichtet, den Fluoreszenzmarker in der Lösung automatisiert zu detektieren. Typischerweise ist die optische Aufnahmeeinrichtung zum Durchführen einer internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie mit einem Immersionsobjektiv ausgebildet, um eine möglichst hohe Auflösung zu erreichen und auch einzelne Moleküle abbilden zu können.

Der Probenaufnahmebehälter weist vorzugsweise mehr als eine Vertiefung zur Aufnahme der Lösung auf, so dass automatisiert mit hohem Durchsatz die Aktivität der Wirkstoffe gemessen werden kann.

Es kann auch vorgesehen sein, dass die Befüllvorrichtung in einem ersten Schritt die Vertiefungen nur mit der Lösung sowie Motorproteinen und Filamenten füllt, und nachfolgend in einem separaten zweiten Schritt den Wirkstoff sowie das Enzym zu dieser Lösung hinzugibt.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden nachfolgend anhand der 1 bis 6 erläutert.

Es zeigen:

1 eine schematische seitliche Ansicht einer mit Casein blockierten Oberfläche mit darauf aufgebrachtem Motorprotein und an einem Motorprotein angeordnetem Filament des Zytoskeletts;

2 eine 1 entsprechende Ansicht, bei dem das Motorprotein über Antikörper und ein Verbindungsprotein auf der Oberfläche angeordnet ist;

3 eine 1 entsprechende Ansicht, bei dem das Filament über Antikörper auf der Oberfläche angebracht ist und das Motorprotein an dem Filament angeordnet ist;

4 eine Mikrotiterplatte als Probenaufnahmebehälter;

5 ein schematisch dargestelltes automatisiertes Befüllen des Probenaufnahmebehälters und

6 ein schematisch dargestelltes automatisiertes optisches Vermessen des Probenaufnahmebehälters.

1 zeigt in einer schematischen seitlichen Ansicht eine Oberfläche 3 einer Vertiefung eines Probenaufnahmebehälters, die bereichsweise mit Casein 7 blockiert ist. Auf den nicht durch das Casein 7 blockierten Bereichen der Oberfläche 3 ist durch unspezifische Absorption ein Motorprotein 1, im dargestellten Ausführungsbeispiel Kinesin, angeordnet. An dem Ende des Motorproteins 1, das dem auf der Oberfläche 3 angeordneten Ende des Motorproteins 1 entgegengesetzt ist, steht das Motorprotein 1 mit einem Filament 4 eines Zytoskeletts in Kontakt. Im dargestellten Ausführungsbeispiel ist das Filament 4 ein Mikrotubulus. Das Filament 4 korrespondiert zu dem verwendeten Motorprotein 1, so dass unter Zugabe bzw. Verbrauch von Adenosintriphosphat eine durch das Motorprotein 1 initiierte Bewegung des Filaments 4 erfolgt.

Um diese Bewegung detektieren zu können, ist in dem dargestellten Ausführungsbeispiel an dem Filament 4 ein Fluoreszenzfarbstoff 5 angeordnet. Da diese Fluoreszenzfarbstoffe 5 ortsfest an ihrem jeweiligen Träger fixiert sind, kann aus der Detektion dieser fluoreszierenden Punkte auf eine Bewegung des Filaments 4 geschlossen werden. In weiteren Ausführungsbeispielen kann, wie in 1 beispielhaft ebenfalls dargestellt, der Fluoreszenzfarbstoff 5 alternativ oder zusätzlich auch an dem Motorprotein 1 angeordnet sein.

Der in 1 dargestellte Gleitassay kann in dem dargestellten Ausführungsbeispiel für eine ganze Mikrotiterplatte mit 384 Näpfchen erhalten werden, indem zum Aufbringen der Caseinbeschichtung zunächst 288 µl von 10 mg/ml Casein 7, 57,80 µl von 100mM Adenosintriphosphat sowie 5414,40 µl von 80 mM PIPES pH 6.9, 1 mM EGTA, 1mM MgCl2 (BRB80, Brinkley's Reconstitution Buffer) als Puffer auf die Oberfläche 3 aufgebracht werden. Die gesamten 15 µl dieser Caseinlösung werden in ein einzelnes Näpfchen der Mikrotiterplatte gegeben und verbleiben für eine Inkubationszeit von 3 Minuten darin. Anschließend wird die Caseinlösung aus den Näpfchen entfernt. Die hier und im Folgenden wiedergegebenen Konzentrationsangaben beziehen sich auf eine Mikrotiterplatte mit 384 Näpfchen ohne Berücksichtigung des Totvolumens.

Kinesin als Motorprotein 1 wird aufgebracht, indem 11,5 µl von 10 mg/ml Casein 7, 115,2 µl von 0,2 mg/ml Kinesin-1, 115,2 µl von 1M Dithiotreitol (DTT), 57,6 µl von 1mM Adenosintriphosphat und 5460,5 µl BRB80 aufgebracht werden. Diese Kinesinlösung wird ebenfalls in jedes der Näpfchen eingebracht und verbleibt dort für 3 Minuten, bevor sie entfernt wird. Anschließend kann nochmals je 16512 µl Caseinlösung zweimal in die Näpfchen eingebracht werden und wird ohne Inkubationszeit aus diesen wieder entfernt.

Durch Aufbringen einer "motility solution" wird schließlich das Filament 4 des Zytoskeletts auf dem Motorprotein 1 angeordnet. Hierzu wird 115,2 µl von 10 mg/ml Casein 7, 292,3 µl 0,67 µM Mikrotubuli, 230,4 µl 2M Glucose, 28,8 µl 2 mg/ml Catalase, 230,4 µl 1M Dithiotreitol, 57,6 µl 1mM Taxol, 9ß7,7 µl BRB80 und 57,6 µl von 100 mM Adenosintriphosphat aufgebracht. Nach dem Einbringen in die Näpfchen verbleibt diese Lösung auch darin.

Schließlich wird in dem gezeigten Ausführungsbeispiel noch Pyranose-Oxidase (PO) beigefügt, indem 147,2 µl 27 mg/ml PO, 3116,8 µl BRB80 und 576 µl insgesamt oder 1,5 µl in jedes der Näpfchen von verschiedenen Konzentrationen eines Inhibitors als Wirkstoff zugefügt werden. Auch die Inhibitorlösung verbleibt zusammen mit der Beweglichkeitslösung oder "motility solution" in den Näpfchen. Zusätzlich wird abschließend noch Mineralöl in die Näpfchen pipettiert. Alle Pipettierschritte werden automatisiert durchgeführt.

In 2 ist in einer 1 entsprechenden Darstellung ein weiteres Ausführungsbeispiel gezeigt, bei dem nun das Motorprotein 1 nicht direkt, also in unmittelbarem berührendem Kontakt auf der Oberfläche 3 angeordnet ist, sondern auf der Oberfläche 3 ein Verbindungsprotein 12, nämlich Protein A/G, und darauf ein Antikörper 6 angeordnet ist. Das Motorprotein 1 selbst ist an den Antikörper 6 gebunden. Wiederkehrende Merkmale sind in dieser Figur wie auch in den folgenden Figuren mit identischen Bezugszeichen versehen.

Diese Konfiguration kann beispielsweise für eine Mikrotiterplatte mit 384 Näpfchen erreicht werden, indem zunächst die Näpfchen mit 5760 µl BRB 80 gefüllt und dieses wieder daraus entfernt wird sowie anschließend eine Protein A/G-Lösung aus 5644,8 µl BRB80 und 115,2 µl Protein A/G für 3 Minuten Inkubationszeit in den Näpfchen verbleibt. In einem nächsten Schritt wird mit der bereits beschriebenen Caseinlösung zwei Mal gespült und eine Antikörperlösung aus 5356,8 µl BRB80 und 288 µl Anti-his-Antikörper sowie 115,2 µl Casein 7 für 3 Minuten einwirken gelassen.

Nach weiterem zweimaligem Spülen mit je 16512 µl Casein 7 wird eine Kinesinlösung für wiederum 3 Minuten in die Näpfchen aufgebracht und mit Caseinlösung zwei Mal gespült. Diese Kinesinlösung umfasst im beschriebenen Ausführungsbeispiel 11,5 µl Casein 7, 91 µl 0,76 mg/ml gekürztes Kines-1, 115,2 µl Dithiotreitol, 57,6 µl von 1mM Adenosintriphosphat und 5484,7 µl BRB80.

Schließlich wird auch hier wiederum die "motility solution", dann der Inhibitor samt Pyranose-Oxidase und Mineralöl zum Verhindern einer Verdampfung in die Näpfchen pipettiert und untersucht.

Statt des gentechnisch hergestellten Fusionsproteins A/G können auch die bakteriellen Proteine A und G verwendet werden. Diese Proteine haben die Funktion, antikörperspezifisch zu binden und so Bakterien vor dem Immunsystem zu tarnen. In weiteren Ausführungsbeispielen kann das Verbindungsprotein auch weggelassen werden und die Antikörper 6 direkt an die Oberfläche 3 gebunden werden. Durch die Verwendung von Protein A/G wird jedoch die Dichte der Antikörper und somit der Motorproteine auf der Oberfläche 3 erhöht.

In dem in 2 dargestellten Ausführungsbeispiel ist ein Fluoreszenzfarbstoff 5' wie in dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel an dem Filament 4, also dem Mikrotubulus, angebracht, während ein Fluoreszenzfarbstoff 5'' an dem Motorprotein befestigt ist.

Während die in den 1 und 2 dargestellten Anordnungen als sogenannte "Gleitassays" oder "gliding assays" bezeichnet werden, kann auch ein "Schrittassay" oder "stepping assay" realisiert werden und ist in 3 in einer 1 entsprechenden Ansicht dargestellt. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel ist das Filament 4 über direkt auf der Oberfläche 3 angeordnete Antikörper 6 mit der Oberfläche 3 verbunden, die aus Glas oder einem im optischen Wellenlängenbereich transparenten Kunststoff sein kann. Auf dem Filament 4 ist das Motorprotein 1 mit daran angebrachtem Fluoreszenzfarbstoff 5 angeordnet, wobei verschiedene Farbstoffe für Kinesin und das Motorprotein 1 verwendet werden. Kinesin ist im dargestellten Ausführungsbeispiel mit GFP markiert, während das Motorprotein 1 mit Rhodamin versehen ist. Dieses Motorprotein 1 "schreitet" nun nach Zugabe von Adenosintriphosphat entlang des Filaments 4. Zur Vorbereitung der ganzen Mikrotiterplatte wird auf der Oberfläche 3 eine Silanschicht 8 abgeschieden. Nachfolgend die bereits beschriebene Antikörperlösung für 3 Minuten Inkubationszeit in die Näpfchen eingebracht und mit BRB80 nach Entfernen der Antikörperlösung gespült. Zum Blockieren der Oberfläche 3 wird nun eine Blockierlösung aus 5760 µl BRB80 und 0,58 g F127, einem Polyol, hergestellt und in die Näpfchen eingebracht. F127 scheidet sich dann als zusätzliche Schicht 16 auf der Silanschicht 8 ab. Nach 20 Minuten wird diese Blockierlösung entfernt und nach Waschen mit 16347 µl BRB80 samt 165 µl 1M Taxol eine Lösung der Mikrotubuli für 5 Minuten eingebracht. Die letztgenannte Lösung ist nun jedoch aus 292,3 µl Mikrotubuli als Filamente 4, 57,6 µl 1M Taxol und 5410,1 µl BRB80 hergestellt. Nachdem diese Lösung entfernt wurde und wiederum mit 16347 µl BRB80 samt 165 µl 1M Taxol gespült wurde, wird eine Beweglichkeits-Kinesin-Lösung und die bereits beschriebene Inhibitorlösung sowie Mineralöl eingebracht. Die Beweglichkeits-Kinesin-Lösung setzt sich zusammen aus 76,8 µ Casein 7, 0,13 µl 0,076 mg/ml gekürztem Kinesin-1, 230,4 µl Glukose, 38,4 µl Catalase, 38,4 µl Dithiotreitol, 38,4 µl Taxol, 38,4 µl von 100mM Adenosintriphosphat und 3417,47 µl BRB80.

In 4 ist in einer perspektivischen Ansicht der Probenaufnahmebehälter 2 gezeigt. Der Probenaufnahmebehälter 2 ist eine Mikrotiterplatte oder "microwell plate", die auch "microtiter plate" bezeichnet wird, und die typischerweise zwischen 6 und 1536 Näpfchen als Vertiefungen 9 zur Aufnahme einer einen zu untersuchenden Wirkstoff enthaltenden Lösung aufweist. Die Vertiefungen 9 haben hierbei ein Füllvolumen von zwischen 0,01 ml und 5 ml. Der Probenaufnahmebehälter 2 ist aus Kunststoff, der vorzugsweise zumindest an seiner Unterseite oder auch insgesamt transparent in dem Wellenlängenbereich des elektromagnetischen Spektrums ist, der zur Fluoreszenzanregung und Detektion verwendet wird. Typischerweise ist dies ein sichtbarer Bereich mit Wellenlängen zwischen 400 nm und 780 nm. Auf einer den Öffnungen der Vertiefungen 9 entgegengesetzten Außenseite des Probenaufnahmebehälters 2 ist die Silanschicht 8 aus Dichlordimethylsilan oder 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyltrichlorosilan aufgebracht, um einen Tropfen einer Immersionsflüssigkeit darauf aufbringen und stabil halten zu können.

Bevor die Näpfchen des dargestellten Probenaufnahmebehälters 2 mit der zu untersuchenden Lösung gefüllt werden, kann eine Reinigung derselben vorgesehen sein. In einem möglichen Beispiel dieser Reinigung werden alle Vertiefungen 9, d. h. die Näpfchen, mit Mucasol®, einem alkalischen Reiniger, gefüllt, der im Verhältnis 1:20 in destilliertem Wasser (dH2O) verdünnt wurde. Nachfolgend wird der gefüllte Probenaufnahmebehälter 2 für 15 Minuten mit Ultraschall behandelt und mit destilliertem Wasser gespült. Die Vertiefungen 9 werden danach mit reinem Ethanol gefüllt und wiederum für 10 Minuten dem Ultraschall ausgesetzt. Durch zweiminütiges Spülen mit destilliertem Wasser und zweiminütiges Spülen mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) wird eine hinreichende Reinigung für die nachfolgende automatisierte Untersuchung der Wirkstofflösung erlangt.

5 zeigt den in 4 dargestellten Probenaufnahmebehälter 2, während er automatisiert von einem Pipettierroboter 10 mit einer Lösung befüllt wird. Der Pipettierroboter 10 fährt hierbei mit einer Pipette oberhalb der Öffnungen der Vertiefungen 9 über den Probenaufnahmebehälter 2 und nacheinander einzelne der Vertiefungen 9, sobald er Ihnen fluchtend gegenüber steht, mit der Lösung, die den zu untersuchenden Wirkstoff sowie Adenosintriphosphat und ein Enzym enthält. Dabei können in der Lösung bereits vor dem Befüllen die genannten Bestandteile enthalten sein, es können aber auch sequenziell nacheinender einzelne Bestandteile in die Vertiefungen 9 eingebracht werden.

Der Pipettierroboter 10 fährt typischerweise parallel, also mit gleichbleibendem Abstand, über den Probenaufnahmebehälter 2, kann aber auch zum Befüllen näher an den Probenaufnahmebehälter 2 bewegt werden. Das Enzym in der Lösung ist Glucose-Oxidase oder Pyranose-Oxidase, um während der nachfolgenden Detektion der Bewegung des Filaments 4 gleichbleibende Bedingungen, insbesondere eine Sauerstoffreduzierung und bzw. oder bei der Verwendung von Pyranose-Oxidase einen stabilen pH-Wert gewährleisten zu können. An einer Unterseite des Probenaufnahmebehälters 2 ist ein Glasboden 16 angebracht, auf dem die Silanschicht 8 angeordnet ist.

In 6 ist die optische Aufnahmeeinrichtung 11 dargestellt, die die in den einzelnen Vertiefungen 9 enthaltene Lösung untersucht. Auf dem Probenaufnahmebehälter 2 ist ein Tropfen 13 einer Immersionsflüssigkeit angeordnet, und die optische Aufnahmeeinrichtung 11, im dargestellten Ausführungsbeispiel ein Mikroskop, das interne Totalreflexionsmikroskopie durchführt, misst nacheinander jede der in den einzelnen Vertiefungen 9 enthaltene Flüssigkeit. Hierzu wird, beispielsweise über einen Laser, zunächst der Fluoreszenzfarbstoff 5 zur Fluoreszenz angeregt und nachfolgend die Bewegung des Farbstoffs örtlich und zeitlich aufgelöst detektiert. 6 gibt den Messvorgang nur schematisch wieder, es kann im Gegensatz zur Darstellung auch eine Inversionsmikroskopie angewandt werden. Die erhaltenen Daten werden von der optischen Aufnahmeeinrichtung 11 an eine Steuer- und Auswerteeinheit 14 weitergeleitet, die die optische Aufnahmeeinrichtung 11 zum automatisierten Messen ansteuert. Außerdem werden die ausgewerteten Daten von der Steuer- und Auswerteeinheit 14 an eine Anzeigeeinheit 15 übergeben und dort für einen Benutzer dargestellt. Die Steuer- und Auswerteeinheit 14 ist typischerweise ein einzelner Computer, es kann aber auch vorgesehen sein, dass eine einzelne Steuereinheit zum Steuern der optischen Aufnahmeeinrichtung 11 und eine davon separierte Auswerteeinheit, typischerweise ein Rechencluster mehrerer Rechner, vorgesehen ist.

Die Silanschicht 8 kann beispielsweise aufgebracht werden, indem zunächst zum Reinigen eine Lösung aus Ammoniumhydroxid, Wasser und Wasserstoffperoxid (Verhältnis 1:1:1) für 30 Minuten auf einer Rückseite, beispielsweise dem Glasboden 16, des Probenaufnahmebehälters 2 einwirkt, nachfolgend mit doppelt destilliertem Wasser abgespült wird und Flüssigkeitsrückstände mit Stickstoff beseitigt werden. Zur Beschichtung werden entweder: 25 ml Trichlorethylen samt 12,5 µl Dichlorodimethylsilan auf die zu beschichtende Rückseite des Probenaufnahmebehälters 2 aufgebracht und für 60 Minuten dort belassen, oder: 20µl 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyltrichlorosilan neben den Probenaufnahmebehälter in einen Exsikkator gegeben und im Vakuum (vorzugsweise < 50 mBar) für 3 h inkubiert. Anschließend erfolgt ein erstes Spülen mit Methanol für 5 Minuten sowie ein zweites Spülen mit Methanol für 15 Minuten. Der Probenaufnahmebehälter 2 wird wiederum mit doppelt destilliertem Wasser zwei Minuten gespült und mit Stickstoff durch Blasen restliche Flüssigkeit entfernt.

Die optische Aufnahmeeinrichtung 11 kann hierbei eine CCD(charge coupled device)-Kamera aufweisen mit einer Pixelgröße von 161 nm und mit einer Belichtungszeit von 300 ms und einer Objektivlinse mit 40-facher Vergrößerung Bilder mit einer Rate von 1,6 Bildern/Sekunde aufnehmen.

Die angegebenen Werte zum Herstellen der genannten Lösungen können natürlich, falls kleinere oder größere Mengen hergestellt werden sollen, entsprechend umgerechnet werden, geben mithin also in erster Linie Mengenverhältnisse zwischen den Ausgangsstoffen der Lösungen an.

Lediglich in den Ausführungsbeispielen offenbarte Merkmale der verschiedenen Ausführungsformen können miteinander kombiniert und einzeln beansprucht werden.