Title:
System und Verfahren zur Detektion von Primärsignalen an mittels selbstassemblierenden Proteinen funktionalisierten Oberflächen
Kind Code:
B3


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein System, ein Kit und ein Verfahren zur schnellen und sensitiven Detektion von mindestens einem Primärsignal mittels oberflächenfunktionalisierter Substrate und deren Verwendung dazu, wobei ein oberflächenfunktionalisiertes Substrat bereitgestellt wird, das
i) ein oberflächenaktives Polypeptid, welches einen hydrophilen und einen hydrophoben Oberflächenbereich aufweist und
ii) ein funktionelles Polypeptid, welches, vorzugsweise über einen Linker, an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist, aufweist und
wobei ein Aktormolekül Signalmolekül-abhängig koordinativ an das funktionelle Polypeptid bindet und wobei die Bildung eines Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes ein detektierbares Signal induziert. Das System bzw. Kit weist durch den Einsatz oberflächenaktiver Proteine zur Funktionalisierung der Substratoberfläche eine hohe Stabilität auf und kann daher vorteilhaft mehrfach verwendet werden. Zudem vorteilhaft wird eine untere Nachweisgrenze von weniger als 1 nM des Signalmoleküls erreicht.




Inventors:
Hennig, Stefan (01187, Dresden, DE)
Rödel, Gerhard, Prof. Dr. (85757, Karlsfeld, DE)
Ostermann, Kai, Dr. (01187, Dresden, DE)
Application Number:
DE102015218513A
Publication Date:
01/26/2017
Filing Date:
09/25/2015
Assignee:
Technische Universität Dresden, 01069 (DE)
Domestic Patent References:
DE102013209312B3N/A2014-03-06



Foreign References:
WO2015001187A12015-01-08
Other References:
JAHN, M. [u.a.]: Temporal and spatial properties of a yeast multi-cellular amplification system based on signal molecule diffusion. Sensors (2013) 13 (11) 14511-22
ROGERS, D.W. [u.a.]: Molecular quantification of Saccharomyces cerevisiae α-pheromone secretion. FEMS Yeast Res. (2012) 12 (6) 668-74
Attorney, Agent or Firm:
Kailuweit & Uhlemann Patentanwälte Partnerschaft mbB, 01187, Dresden, DE
Claims:
1. System zur schnellen und sensitiven Detektion von mindestens einem Primärsignal umfasst:
a. ein biofunktionalisiertes Substrat, aufweisend zumindest
i. ein oberflächenaktives Polypeptid, welches einen hydrophilen und einen hydrophoben Oberflächenbereich aufweist und
ii. ein funktionelles Polypeptid, welches an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist,
iii. ein Aktormolekül, welches eine für das funktionelle Polypeptid spezifische Erkennungsstruktur aufweist und somit in der Lage ist, koordinativ an das funktionelle Polypeptid zu binden,
b. Sensor-Zellen, die das folgende Merkmal aufweisen:
ein Gen, welches zur Synthese eines Signalmoleküls führt, ist unter die Transkriptionskontrolle eines Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt.
dadurch gekennzeichnet, dass das Aktormolekül eine für das Signalmolekül spezifische Erkennungsstruktur aufweist.

2. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aktormolekül koordinativ an das funktionelle Polypeptid gebunden ist.

3. Kit zur schnellen und sensitiven Detektion von mindestens einem Primärsignal, das die folgenden Komponenten umfasst:
a. ein erstes Gefäß enthaltend:
i) ein Aktormolekül, das eine für das funktionelle Polypeptid spezifische Erkennungsstruktur aufweist und folglich dazu geeignet ist, koordinativ an das funktionelle Polypeptid zu binden,
ii) Sensor-Zellen, die das folgende Merkmal aufweisen:
ein Gen, welches zur Synthese eines Signalmoleküls führt, ist unter die Transkriptionskontrolle eines Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt.
b. ein zweites Gefäß enthaltend:
i) ein oberflächenfunktionalisiertes Substrat, aufweisend zumindest:
(1) ein oberflächenaktives Polypeptid, welches einen hydrophilen und einen hydrophoben Oberflächenbereich aufweist und
(2) ein funktionelles Polypeptid, welches an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist,
wobei das Aktormolekül eine für das Signalmolekül spezifische Erkennungsstruktur aufweist.

4. System nach Anspruch 1 oder 2 oder Kit nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Aktormolekül ein Antikörper ist.

5. System nach Anspruch 1, 2 oder 4 oder Kit nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das oberflächenfunktionalisierte Substrat oberflächenaktive Polypeptide und funktionelle Polypeptide in einem molaren Verhältnis von 100:1 bis 1:1 aufweist.

6. System oder Kit nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Verstärker-Zellen mindestens eines Typs enthalten sind, wobei die Verstärker-Zellen eines Typs folgende Merkmale aufweisen:
i. mindestens einen Rezeptor für ein Signalmolekül,
ii. mindestens ein Gen, welches zur Synthese eines Signalmoleküls führt, ist unter die Kontrolle eines Signalmolekül-abhängigen Promotors gestellt.

7. System oder Kit nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensor-Zellen und/oder Verstärker-Zellen ausgewählt sind aus Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe.

8. System oder Kit nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensor-Zellen und/oder Verstärker-Zellen mindestens ein weiteres Gen enthalten, welches zur Synthese eines zweiten Signalmoleküls führt, das sich vom ersten Signalmolekül unterscheidet, und welches unter die Transkriptionskontrolle eines weiteren Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt ist.

9. System oder Kit nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionelle Polypeptid ein Pheromon ist.

10. System oder Kit nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die von der Sensor-Zelle sekretierten Signalmoleküle Pheromone sind.

11. System oder Kit nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Primärsignal eine Nährstofflimitation und/oder das Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einer Substanz und/oder das Kontaktieren der Sensorzelle mit einem stressinduzierenden Agens darstellt.

12. System oder Kit nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensor-Zellen und/oder die Verstärker-Zellen in einem Kulturmedium vorliegen und/oder in einer porösen organischen oder anorganischen Matrix eingebettet sind.

13. System oder Kit nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensor-Zellen und/oder die Verstärker-Zellen getrennt voneinander in separaten Kammern vorliegen, wobei die Kammern miteinander verbunden sind.

14. System oder Kit nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das oberflächenaktive Polypeptid ein Hydrophobin ist.

15. System oder Kit nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat einen hydrophoben Kunststoff, Glas, Silizium und/oder Gold mit einer gegebenenfalls chemisch modifizierten Oberfläche aufweist.

16. Verfahren zur schnellen und sensitiven Detektion von mindestens einem Primärsignal, das die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellung
i. eines biofunktionalisierten Substrats, aufweisend zumindest
(1) ein oberflächenaktives Polypeptid, welches einen hydrophilen und einen hydrophoben Oberflächenbereich aufweist und
(2) ein funktionelles Polypeptid, welches an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist,
(3) ein Aktormolekül, welches eine für das funktionelle Polypeptid spezifische Erkennungsstruktur aufweist und in der Lage ist, koordinativ an das funktionelle Polypeptid zu binden,
ii. Sensor-Zellen, die das folgende Merkmal aufweisen:
ein Gen, welches zur Synthese eines Pheromons führt, ist unter die Transkriptionskontrolle eines Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt.
b) Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem Primärsignal, was zur Synthese und zur Sekretion eines Signalmoleküls durch die Sensor-Zellen führt,
c) Bildung eines Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes,
dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung des Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes ein detektierbares Signal induziert.

17. Verwendung eines Systems, Kits und/oder eines Verfahrens nach einem der vorgenannten Ansprüche zur Detektion von mindestens einem extrazellulären Primärsignal.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein System, ein Kit und ein Verfahren zur schnellen und sensitiven Detektion von mindestens einem Primärsignal mittels oberflächenfunktionalisierter Substrate und deren Verwendung dazu.

Konventionelle Ganzzellsensoren basieren meist auf Sensor-Zellen, die ein Fluoreszenzprotein exprimieren, wobei dessen Expression durch einen definierten Analyten oder Umweltreiz moduliert wird. Zur Auslesung des Signals muss die Fluoreszenz der Sensor-Zellen quantifiziert werden, wofür ein vergleichsweise hoher apparativer Aufwand (Anregung der Fluoreszenzproteine mit Licht einer definierten Anregungswellenlänge, Messung der Emission der Fluoreszenzproteine bei definierter Emissionswellenlänge, Trennung von Anregungs- und Emissionslicht durch optische Filter etc.) erforderlich ist. Die Sensor-Zellen verfügen im Allgemeinen über keine intrinsische Möglichkeit zur Verstärkung der Signale. Zudem akkumulieren Fluoreszenzproteine in der Regel intrazellulär, sodass eine räumliche Trennung der Sensor-Zellen vom optischen Transduktor nicht möglich ist.

Bisherige Verfahren zur Detektion und Quantifizierung des α-Faktor-Pheromons von Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) beruhen meist auf dessen spezifischer Aktivität gegenüber Pheromon-sensitiven Zellen. Die Quantifizierung der Pheromonantwort dieser Zellen kann jedoch nur in einem geringen Konzentrationsbereich des Pheromons sowie unter exakt definierten Umgebungsbedingungen realisiert werden. Die Sensitivität dieses Verfahrens, die von den genetischen Modifikationen der Pheromon-sensitiven Zellen bestimmt wird, ist im Vergleich zu dem neu entwickelten Verfahren deutlich geringer (Diener et al., PLoS Comput Biol. 2014, 10: e1003690; Jin et al., Sci Signal. 2011, 4: ra54; Moore et al., PLoS One. 2008, 3: e3865; Williams et al., ACS Synth Biol. 2013, 2: 136–149).

Des Weiteren wurde bereits ein Verfahren, basierend auf einem Enzyme-linked lmmunosorbent Assay (ELlSA), zur Quantifizierung des α-Faktors etabliert (Rogers et al., FEMS Yeast Res. 2012, 12: 668–674). Dieses Verfahren erfordert jedoch einen vergleichsweise hohen Zeitaufwand, der eine Quantifizierung des Pheromons innerhalb eines Tages nicht erlaubt. Zudem ermöglicht dieses Verfahren eine Quantifizierung des Pheromons nur in einem geringen Konzentrationsbereich, wobei die untere Nachweisgrenze des neu entwickelten Verfahrens nicht erreicht wird. Zusätzlich erfordert dieses Verfahren den Einsatz speziell modifizierter Kunststoffoberflächen zur Adsorption des Pheromons, die nur eine einmalige Nutzung erlauben.

Weitere Ansätze zur Detektion des Pheromons, beispielsweise unter Einsatz der Massenspektrometrie (Bener Aksam et al., FEMS Yeast Res. 2013, 13: 350–353) oder chromatographischer Verfahren, weisen eine deutlich geringere Sensitivität sowie einen höheren apparativen Aufwand auf.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein robustes System und ein Verfahren zur schnellen und sensitiven Detektion und Quantifizierung eines Primärsignals bereitzustellen.

Dabei sollen biomolekulare Oberflächenfunktionalisierungen eingesetzt werden, die aufgrund ihrer hohen Stabilität eine mehrfache Verwendung ermöglichen. Dieses System soll zudem die Möglichkeit zur Integration in die Ganzzellsensorik bieten, indem Sensor-Zellen eingesetzt werden, die als Antwort auf einen Umweltreiz ein Signalmolekül in ihre Umgebung sekretieren. Damit wird ein mobiles, intrinsisch verstärktes Signal generiert, dass mithilfe des neu entwickelten Systems mit geringem apparativem Aufwand detektiert werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein System sowie ein Verfahren zur schnellen und sensitiven Detektion von Primärsignalen, insbesondere physikalischer oder chemischer Umweltfaktoren, gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.

Das erfindungsgemäße System zur schnellen und sensitiven Detektion von mindestens einem Primärsignal umfasst:

  • a. ein oberflächenfunktionalisiertes Substrat, aufweisend zumindest:
    (1) ein oberflächenaktives Polypeptid, welches einen hydrophilen und einen hydrophoben Oberflächenbereich aufweist und
    (2) ein funktionelles Polypeptid, welches, vorzugsweise über einen Linker, an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist,
  • b. ein Aktormolekül, das eine für das funktionelle Polypeptid spezifische Erkennungsstruktur aufweist und folglich dazu geeignet ist, koordinativ an das funktionelle Polypeptid zu binden,
  • c. Sensor-Zellen, die das folgende Merkmal aufweisen: ein Gen, welches zur Synthese eines Signalmoleküls führt und unter die Transkriptionskontrolle eines Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt ist,
wobei das Aktormolekül eine für das Signalmolekül spezifische Erkennungsstruktur aufweist.

Nach einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Systems ist das Aktormolekül koordinativ an das funktionelle Polypeptid gebunden.

Nach einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung liegen das Aktormolekül und das funktionelle Polypeptid getrennt voneinander in unterschiedlichen Gefäßen/Bereichen vor.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit zur schnellen und sensitiven Detektion von mindestens einem Primärsignal, das die folgenden Komponenten umfasst:

  • a. ein erstes Gefäß enthaltend:
    i) ein Aktormolekül, das eine für das funktionelle Polypeptid spezifische Erkennungsstruktur aufweist und folglich dazu geeignet ist, koordinativ an das funktionelle Polypeptid zu binden,
    ii) Sensor-Zellen, die das folgende Merkmal aufweisen:
    ein Gen, welches zur Synthese eines Signalmoleküls führt, ist unter die Transkriptionskontrolle eines Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt.
  • b. ein zweites Gefäß enthaltend:
    i) ein oberflächenfunktionalisiertes Substrat, aufweisend zumindest:
    (1) ein oberflächenaktives Polypeptid, welches einen hydrophilen und einen hydrophoben Oberflächenbereich aufweist und
    (2) ein funktionelles Polypeptid, welches, vorzugsweise über einen Linker, an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist,
wobei das Aktormolekül eine für das Signalmolekül spezifische Erkennungsstruktur aufweist.

Durch den erfindungsgemäßen Einsatz oberflächenaktiver Proteine zur Funktionalisierung der Substratoberfläche weist das erfindungsgemäße System bzw. Kit eine hohe Stabilität auf und kann daher mehrfach verwendet werden. Zudem bietet das erfindungsgemäße System bzw. Kit die Möglichkeit zur schnellen und sensitiven Quantifizierung des Signalmoleküls und übertrifft, sowohl hinsichtlich des Zeitbedarfs als auch der Sensitivität, bisher bestehende Systeme. Dabei wird eine untere Nachweisgrenze von 10 nM, bevorzugt von 1 nM, besonders bevorzugt von 0,1 nM des Signalmoleküls erreicht.

Gleichwohl vorteilhaft bietet das erfindungsgemäße System bzw. Kit die Möglichkeit zur Integration in die Ganzzellsensorik, indem Sensor-Zellen eingesetzt werden, die als Antwort auf einen Umweltreiz das Signalmolekül in ihre Umgebung sekretieren. Da das Signalmolekül als Teil eines Vorläufermoleküls synthetisiert wird, welches mehrere Kopien des Signalmoleküls enthält, wird eine intrinsische Signalverstärkung erzielt. Somit wird ein mobiles, intrinsisch verstärktes Signal generiert, dass mithilfe des neu entwickelten Systems bzw. Kits mit geringem apparativem Aufwand detektiert werden kann.

Vorangegangene und nachfolgende Quellennachweise sind nur insoweit aufgeführt, als dass sie für das Verständnis der Erfindung für den Fachmann notwendig sind.

Vorzugsweise ist das oberflächenaktive Protein auf dem Substrat immobilisiert. Besonders bevorzugt werden dabei Substrate eingesetzt, die eine hydrophobe Oberfläche aufweisen. Dabei können beispielsweise hydrophobe Kunststoffe, besonders bevorzugt Polystyrol, zum Einsatz kommen.

In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Systems bzw. Kits werden Substrate eingesetzt, die infolge einer chemischen Modifikation eine hydrophobe Oberfläche aufweisen. Bevorzugt können dabei Glas, Silizium oder Goldsubstrate verwendet werden, deren Oberflächen beispielsweise mithilfe von Silanisierungsreaktionen oder Thiolfunktionalisierungen modifiziert werden. Besonders bevorzugt werden dabei Funktionalisierungen mit selbst-assemblierenden Monolagen eingesetzt, beispielsweise unter Verwendung von Octadecyltrichlorsilan zur Funktionalisierung von Glas und Siliziumsubstraten.

Nach einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung weist das Substrat einen hydrophoben Kunststoff, Glas, Silizium und/oder Gold mit einer gegebenenfalls chemisch modifizierten Oberfläche (Funktionalisierung) auf.

Oberflächenaktive Polypeptide werden im erfindungsgemäßen System bzw. Kit zur Funktionalisierung der Substratoberfläche eingesetzt. Bevorzugt werden dabei selbstassemblierende Polypeptide verwendet, beispielsweise S-Layer Proteine aus Bakterien, Hydrophobine aus Pilzen oder Repellents aus Ustilago maydis sowie rekombinante Derivate davon. Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der Klasse I oder Klasse II aus filamentösen Pilzen eingesetzt, beispielsweise die Klasse I Hydrophobine EAS aus Neurospora crassa, SC3 und SC4 aus Schizophyllum commune oder HGFI aus Grifola frondosa bzw. die Klasse II Hydrophobine HFBI, HFBII und HFBIII aus Trichoderma reesei. Besonders bevorzugte S-Layer-Proteine sind SbsC aus Bacillus stearothermophilus, S13240 aus Bacillus stearothermophilus oder SslA aus Sporosarcina ureae. Insbesondere Hydrophobine der Klasse I werden bevorzugt eingesetzt, ganz besonders bevorzugt das Klasse I Hydrophobin EAS aus Neurospora crassa.

Oberflächenaktive Polypeptide sind, analog zu synthetischen Tensiden, in ausgeprägt hydrophile und hydrophobe Bereiche unterteilt. Oberflächenaktive Polypeptide, wie zum Beispiel Hydrophobine, Repellents und Surface Layer (S-Layer) Proteine, gehören zur Klasse der hochmolekularen Biotenside. Sie zeichnen sich durch die Ausbildung von hochstabilen Beschichtungen an Grenzflächen aus, die im Gegensatz zu synthetischen Tensiden eine erhöhte Biokompatibilität sowie eine sehr geringe Oberflächenreibung aufweisen (Zampieri et al., Materials. 2010, 3: 4607–4625). Aufgrund der Fähigkeit zur Selbstassemblierung an hydrophil-hydrophoben Grenzflächen existieren vielfältige Anwendungsmöglichkeiten für oberflächenaktive Polypeptide.

Hydrophobine sind kleine globuläre, amphiphile Proteine, die sich durch ihre Fähigkeit zur (Selbst-)Assemblierung auszeichnen. Sie werden vor allem von filamentösen Pilzen sekretiert und sind in der Natur für diverse Prozesse von Bedeutung. Beispielsweise dienen sie zur Reduktion der Oberflächenspannung wässriger Medien, sodass filamentöse Pilze die Luft-Wasser-Phasengrenze durchbrechen und Luftstrukturen ausbilden können. Zudem erhalten beispielsweise Sporen filamentöser Pilze durch Hydrophobine eine hydrophobe Oberfläche, wodurch ihre Verbreitung in der Luft ermöglicht wird und die Sporen vor Austrocknung und vor dem Immunsystem von Wirtsorganismen geschützt sind. Des Weiteren werden Luftkanäle, beispielsweise in Fruchtkörpern von Pilzen oder in Flechten, durch Hydrophobine beschichtet, sodass ein Eindringen von Wasser in diese Luftkanäle verhindert und der kontinuierliche Gasaustausch ermöglicht werden kann. Zudem sind Hydrophobine für die Adhäsion von Mikroorganismen an Oberflächen von Wirtsorganismen von Bedeutung. Aufgrund ihrer charakteristischen Eigenschaften sind sie in der Lage die Benetzbarkeit von Oberflächen zu invertieren. Hydrophobine weisen eine hohe Oberflächenaktivität auf, weshalb sie in der Technik zur biokompatiblen Beschichtung von Oberflächen oder zur Stabilisierung von Öl-in-Wasseremulsionen eingesetzt werden (s. u. a. WO 96/41882 A1, WO2004000880 A1, WO2006103252 A2). Beispielsweise können feste Oberflächen mit Hydrophobinen funktionalisiert werden, wobei deren Benetzbarkeit invertiert wird. Der Einsatz modifizierter Hydrophobine, die nach der Selbst-Assemblierung spezifische Liganden an der Oberfläche exponieren, erlaubt beispielsweise eine selektive Adhäsion bestimmter Zelltypen (Huang et al., Colloids Surf B Biointerfaces. 2013, 101: 361–369; Niu et al., Protein Expr Purif. 2012, 83: 92–97). Zudem ermöglicht die Hydrophobin-basierte Funktionalisierung die Adsorption von weiteren Proteinen an den Hydrophobin-Schichten, sodass beispielsweise Enzyme oder Antikörper an festen Oberflächen (z. B. von Elektroden) immobilisiert werden können. Durch den Einsatz modifizierter Hydrophobine (z. B. von Fusionsproteinen eines Enzyms und eines Hydrophobins) können Enzyme funktional und kovalent an einer Oberfläche immobilisiert werden (Zampieri et al., Materials. 2010, 3: 4607–4625).

Bevorzugt werden die oberflächenaktiven Polypeptide für den erfindungsgemäßen Einsatz von rekombinanten Mikroorganismen in hohen Konzentrationen synthetisiert. Besonders bevorzugt werden dabei rekombinante Pilze oder rekombinante Bakterien eingesetzt, ganz besonders bevorzugt werden rekombinante Bakterien verwendet. Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen (bspw. hfb1, eas, sbsC), die für oberflächenaktive Polypeptide kodieren, und die Aminosäuresequenzen, die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bestens bekannt oder können einschlägigen Datenbanken entnommen werden.

Die Methoden zur Kultivierung rekombinanter und/oder authentischer Pilze bzw. Bakterien sind dem Fachmann bekannt, wobei die Bakterienzellen kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Anzucht oder zur Expression oberflächenaktiver Polypeptide kultiviert werden.

Nach der Expression in einem heterologen Wirtsorganismus werden die oberflächenaktiven Polypeptide gereinigt, sodass sie anschließend für die Funktionalisierung des Substrates eingesetzt werden können. Bevorzugt werden dafür Affinitätstags oder Proteine mit einer Affinität zu einem spezifischen Liganden eingesetzt, die an das oberflächenaktive Polypeptid fusioniert werden und die eine schnelle Reinigung mittels Affinitätschromatographie ermöglichen. Besonders bevorzugt werden dabei Affinitätstags wie der Polyhistidin-Tag, der HA-Tag, der FLAG-Tag, der TAP-Tag oder der Streptavidin-Tag sowie Proteine mit einer hohen Affinität zu einem spezifischen Liganden wie die Glutathion-S-Transferase, das Maltose-bindende Protein, das Chitin-bindende Protein oder das Immunglobulin-bindende Protein A. Ganz besonders bevorzugt wird der Polyhistidin-Tag eingesetzt.

Als funktionelle Polypeptide werden insbesondere Affinitätstags, wie bspw. der Polyhistidin-Tag, der c-myc-Tag, der FLAG-Tag, der HA-Tag, der Avidin/Streptavidin/Strep-Tag, Antigene, Pheromone oder Hormone eingesetzt.

Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist das funktionelle Polypeptid ein Affinitätstag oder ein Pheromon, ganz besonders bevorzugt stellt das funktionelle Polypeptid ein Hefe-Pheromon dar.

Pheromone sind kleine interzelluläre Botenstoffe, die zur biochemischen Kommunikation zwischen Zellen eines Typs oder verschiedener Typen dienen. Beispielsweise kommunizieren beim Quorum Sensing Mikroorganismen mittels kleiner hormonähnlicher Signalmoleküle. Die als Autoinducer bezeichneten Signalmoleküle werden von bestimmten Bakterien mit Hilfe entsprechender Gene produziert und in das umliegende Kulturmedium abgegeben. Bakterien besitzen ein passendes Rezeptorsystem für diese Liganden und können nach Erreichen einer gewissen Konzentration an Signalmolekülen im Medium die Transkription bestimmter Gene aktivieren. Dabei gibt es speziesspezifische Autoinducer, mit denen Bakterien innerhalb der eigenen Bakterienspezies kommunizieren. Der sogenannte Autoinducer-2 hingegen ermöglicht die Kommunikation zwischen verschiedenen Bakterienspezies (Interspezies-Kommunikation).

Als Pheromone können im erfindungsgemäßen Sinn neben den natürlichen Pheromonen und Autoinducern auch davon abgeleitete homologe oder modifizierte Peptide oder Peptidanaloga, oder andere organische Signalmoleküle zum Einsatz kommen, die in der Lage sind, an entsprechende Aktormoleküle zu binden, d. h. für die die Aktormoleküle eine spezifische Erkennungsstruktur besitzen.

Bei einem authentischen Pheromon handelt es sich um ein gentechnisch hergestelltes Pheromon mit sämtlichen Eigenheiten (einschließlich posttranslationaler Modifikationen) des natürlich vorkommenden Gegenstücks.

Bei einem abgeleiteten Pheromon handelt es sich um ein gentechnisch modifiziertes Pheromon, das strukturell nicht identisch mit dem authentischen Pheromon ist und gegebenenfalls nicht sämtliche Eigenheiten des natürlich vorkommenden Gegenstücks aufweist. Ein abgeleitetes Pheromon ist in der Lage an dasselbe Aktormolekül zu binden wie das authentische Pheromon und das natürlich vorkommende Gegenstück. Derartige abgeleitete Pheromone und Methoden zu deren Herstellung sind dem Fachmann, insbesondere auf dem Gebiet der Genetik, bekannt.

Beispielsweise weist die Bäckerhefe S. cerevisiae, analog zu vielen Pilzen, einen sexuellen sowie einen asexuellen Reproduktionszyklus auf (Merlini et al., Open Biol. 2013, 3: 130008). Haploide Zellen dieser Hefe existieren in zwei verschiedenen Paarungstypen (a bzw. α), die sich unabhängig voneinander mittels mitotischer Zellteilung vermehren können (asexuelle Reproduktion). Die Zellen beider Paarungstypen nutzen ein Pheromonsystem zur Zell-Zell-Kommunikation. Dabei werden kurze Peptid-Pheromone (α-Faktor bzw. a-Faktor) von den Hefezellen in die Umgebung sekretiert, wobei α-Zellen den α-Faktor-sekretieren, während a-Zellen den a-Faktor in ihre Umgebung freisetzen. Zudem exponieren die Zellen beider Paarungstypen Pheromon-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, die spezifisch das Pheromon des anderen Paarungstyps erkennen. Die Wahrnehmung dieses Pheromons initiiert ein umfassendes genetisches Programm, das zur Fusion der haploiden Zellen zu einer diploiden Zelle führt (sexuelle Reproduktion). Die Struktur, Synthese und Sekretion der beiden Pheromone unterscheiden sich dabei sehr stark voneinander. Der a-Faktor stellt ein Peptid aus zwölf Aminosäuren dar, welches durch posttranslationale Modifikationen eine Methylierung sowie eine Lipid-Funktionalisierung aufweist (Davey et al., Semin Cell Dev Biol 1998, 9: 19–30). Dieses Pheromon wird als Teil eines größeren Propeptids synthetisiert, anschließend erfolgen die Prozessierung und die Modifikation des a-Faktors im Cytoplasma sowie die Sekretion in die Umgebung der Zelle durch einen spezifischen Transporter. Das α-Faktor Pheromon ist hingegen ein nicht modifiziertes Peptidhormon aus 13 Aminosäuren, das ebenfalls als Teil eines großen Propeptids synthetisiert wird. Dabei weist das Propeptid, welches z. B. durch das MFα1 Gen codiert wird, vier sequenzidentische Wiederholungen des α-Faktors auf, die infolge der Prozessierung des Propeptids im endoplasmatischen Retikulum freigesetzt werden. Die Sekretion des α-Faktors erfolgt durch den Standard-Sekretionsweg.

Vorzugsweise ist das funktionelle Polypeptid an den hydrophilen Oberflächenbereich des oberflächenaktiven Proteins gebunden oder bildet diesen. So kann das funktionelle Polypeptid als Teil eines Fusionsproteins mit dem hydrophilen Oberflächenbereich des oberflächenaktiven Proteins eine hydrophile Domäne bilden, wobei das funktionelle Polypeptid vorzugsweise über einen Linker mit dem oberflächenaktiven Protein verbunden ist. Besonders bevorzugt ist das funktionelle Polypeptid kovalent an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden mindestens zwei Varianten des oberflächenaktiven Polypeptids eingesetzt, wobei mindestens eine der Varianten mit dem funktionellen Polypeptid verbunden ist. Der Einsatz von oberflächenaktiven Polypeptiden, die nicht mit dem funktionellen Polypeptid verbunden sind, ermöglicht vorteilhaft, den Anteil der funktionellen Polypeptide auf der funktionalisierten Oberfläche mithilfe der Funktionalisierung einstellen zu können. Da das oberflächenaktive Polypeptid bevorzugt ein selbstassemblierendes Polypeptid darstellt, und verschiedene Varianten dieses Polypeptides auf einem gemeinsamen Substrat co-assemblieren können, kann durch das molare Verhältnis von oberflächenaktiven Polypeptiden mit bzw. ohne das funktionelle Polypeptid vorteilhaft die Dichte der Funktionalisierung mit dem funktionellen Polypeptid und somit die Sensitivität des erfindungsgemäßen Systems bzw. Kits eingestellt werden. In dieser Ausgestaltung weist das oberflächenfunktionalisierte Substrat oberflächenaktive Polypeptide und funktionelle Polypeptide in einem molaren Verhältnis von 100:1 bis 1:1, besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 100:1 bis 10:1, ganz besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 100:1 bis 50:1 auf.

Erfindungsgemäß weist das Aktormolekül mindestens eine Signalmolekül-spezifische Erkennungsstruktur und eine für ein funktionelles Polypeptid spezifische Erkennungsstruktur zur koordinativen Anbindung des Signalmoleküls bzw. funktionellen Polypeptids auf. Bevorzugt ist ein Aktormolekül ausgewählt aus der Gruppe der Antikörper oder Aptamere. Besonders bevorzugt werden Antikörper als Aktormoleküle eingesetzt, ganz besonders bevorzugt werden Antikörper aus der Klasse G (Immunglobulin G) eingesetzt.

Aptamere stellen eine Gruppe von kurzen, einzelsträngigen Nukleinsäuren (DNA oder RNA) bzw. von kurzen Peptiden dar. Durch die Sequenz der Nukleotide bzw. der Aminosäuren nehmen Aptamere eine spezifische räumliche Struktur ein, die eine spezifische Bindung eines Liganden durch diese Erkennungsstruktur ermöglicht. Aptamere können daher bevorzugt als Aktormoleküle im erfindungsgemäßen System bzw. Kit eingesetzt werden.

Definitionsgemäß versteht der Fachmann unter einer Erkennungsstruktur den Teil der Oberfläche des Aktormoleküls, welcher das Signalmolekül bzw. das funktionelle Polypeptid spezifisch erkennt und bindet. Dabei wirken der Teil der Oberfläche des Aktormoleküls und das Signalmolekül bzw. das funktionelle Polypeptid selektiv unter der Bildung eines Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes bzw. eines Komplexes aus Aktormolekül und funktionellem Polypeptid zusammen. Diese Komplexe sind durch eine hohe Affinität zwischen dem Signalmolekül bzw. dem funktionellen Polypeptid und der Erkennungsstruktur des Aktormoleküls gekennzeichnet.

Im Sinne der Erfindung sind die Signalmoleküle niedermolekulare organische Moleküle ausgewählt aus der Stoffgruppe der Pheromone, Hormone, Vitamine, Peptide und Peptidanaloga mit Affinitätstags und Antigene, deren Molekulargewicht typischerweise zwischen 0,01 und 5 kDa, bevorzugt zwischen 0,1 und 3 kDa, liegt. Vorteilhaft sind die erfindungsgemäß eingesetzten Signalmoleküle daher in der Lage eine semipermeable Membran zu passieren. Erfindungsgemäß wird ein Signalmolekül von den Sensor-Zellen, in Abhängigkeit vom Auftreten eines Primärsignals, synthetisiert und sekretiert. Dies wird durch die Wahl eines Primärsignal-abhängigen Promotors gewährleistet, der in die Sensor-Zellen eingebracht wird und der die Expression eines Gens steuert, das für die Synthese und/oder Sekretion des Signalmoleküls verantwortlich ist. Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung sind die von der Sensor-Zelle sekretierten Signalmoleküle bevorzugt authentische oder rekombinante Pheromone, Hormone oder Peptide mit Affinitätstags, besonders bevorzugt authentische oder rekombinante Pheromone von Pilzen, ganz besonders bevorzugt authentische oder rekombinante Pheromone von Hefen.

Nach einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind das funktionelle Polypeptid und das Signalmolekül hinsichtlich ihrer Primärstruktur (Sequenz der Aminosäuren) strukturell verwandt, wobei strukturell verwandt eine Identität der Primärstruktur, also der Aminosäuresequenz von mindestens 80 %, besonders bevorzugt von mindestens 90 % bedeutet. Besonders bevorzugt sind das funktionelle Polypeptid und das Signalmolekül hinsichtlich ihrer Primärstruktur identisch.

Unter Primärsignalen sind detektierbare Umweltfaktoren zu verstehen, für die die erfindungsgemäßen Sensor-Zellen geeignete Rezeptorsysteme besitzen.

Bei den detektierbaren Umweltfaktoren handelt es sich beispielsweise um Änderungen physikalischer Parameter, chemische Additive oder um Limitationen bestimmter für die erfindungsgemäß eingesetzten Sensor-Zellen essentieller Nährstoffe. Über eine Weiterentwicklung der Erfindung kann das Primärsignal durch eine Nährstofflimitation ausgelöst werden, wobei die Nährstofflimitation detektiert wird. Unter Limitationen bestimmter für die Sensor-Zellen essentieller Nährstoffe versteht man z. B. einen Mangel an verfügbaren Stickstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Eisen- oder Kupferquellen, Kohlenstoffquellen, essentieller Aminosäuren, Sauerstoff, oder andere Signale wie z. B. Temperatur, DNA-Schäden, ER-Stress oder oxidativer Stress.

Wird das Primärsignal durch eine Nährstofflimitation ausgelöst, so handelt es sich bei dem signalabhängigen Promotor der Sensor-Zellen bevorzugt um einen Stickstoff-, Phosphat- oder Schwefel-spezifisch regulierten Promotor. Das zu detektierende Primärsignal ist Stickstoff-, Phosphat- oder Schwefelmangel.

Bevorzugt wird als Promotor ein DNA-Abschnitt verwendet, der bis zu 1500 bp 5`-seitig des Startcodons des von ihm kontrollierten Gens umfasst, oder ein Teilabschnitt dieses DNA-Abschnitts, der in der Lage ist, z. B. auf die Limitierung von Stickstoff, Phosphor oder Schwefel hin das unter Kontrolle dieser Sequenz liegende Zielgen zu aktivieren oder zu unterdrücken.

Der Stickstoff-, Phosphat- bzw. Schwefel-spezifisch regulierte Promotor ist bevorzugt ausgewählt aus den Promotoren der Gene YIR028W, YJR152W, YAR071W, YHR136C, YFL055W und YLL057C von S. cerevisiae.

Gleichzeitig oder alternativ kann das Primärsignal durch das Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einer Substanz (chemisches Additiv) ausgelöst werden, wobei die Substanz detektiert wird.

Die Sensor-Zellen können dabei auch dahingehend genetisch verändert sein, dass sie ein Rezeptorsystem exprimieren, das die verwendeten Zellen natürlicherweise nicht besitzen. Die extrazellulären Primärsignale, die diese Rezeptorsysteme empfangen und verarbeiten können, sind chemische Additive, beispielsweise Ionen, anorganische und organische Verbindungen und Biomoleküle wie Proteine, Peptide, Lipide, Zucker oder Nukleinsäuren, oder auch Änderungen physikalischer Parameter, beispielsweise elektromagnetische Strahlung, Druck, Temperatur oder Leitfähigkeit.

Im Falle, dass es sich bei dem zu detektierenden Primärsignal um einen chemischen Analyten handelt, kann sowohl eine extrazelluläre Detektion über membranständige Rezeptoren, als auch eine intrazelluläre Detektion über einen nukleären Rezeptor erfolgen.

Bevorzugt kann das Primärsignal auch durch das Kontaktieren der Sensorzelle mit einem stressinduzierenden Agens ausgelöst werden.

So weisen bspw. Hefe-Zellen Rezeptoren für viele Stress-induzierende Agenzien und physikalische Faktoren auf. Dabei werden zelluläre Stressreaktionen beispielsweise durch Oxidationsmittel (z. B. Wasserstoffperoxid und Sauerstoffradikale), Schwermetallionen (z. B. Cadmium, Blei und Kupfer), DNA-schädigende Agenzien (z. B. alkylierende Agenzien), Agenzien mit stabilisierender oder destabilisierender Wirkung auf das Cytoskelett (z. B. Colchizin, Phalloidin) oder antimikrobielle Agenzien ausgelöst.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur schnellen und sensitiven Detektion von mindestens einem Primärsignal, das die folgenden Schritte umfasst:

  • a) Bereitstellung
    i. eines biofunktionalisierten Substrates, aufweisend zumindest
    (1) ein oberflächenaktives Polypeptid, welches einen hydrophilen und einen hydrophoben Oberflächenbereich aufweist und
    (2) ein funktionelles Polypeptid, welches, vorzugsweise über einen Linker, an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist,
    ii. eines Aktormoleküls, das eine für das funktionelle Polypeptid spezifische Erkennungsstruktur aufweist und folglich dazu geeignet ist, koordinativ an das funktionelle Polypeptid zu binden,
    iii. Sensor-Zellen, die das folgende Merkmal aufweisen:
    ein Gen, welches zur Synthese eines Signalmoleküls führt, ist unter die Transkriptionskontrolle eines Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt.
  • b) Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem Primärsignal, was zur Synthese und zur Sekretion eines Signalmoleküls durch die Sensor-Zellen führt,
  • c) Bildung eines Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes,
    wobei die Bildung des Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes ein detektierbares Signal, insbesondere ein Fluoreszenzsignal, die Änderung der Resonanzfrequenz des Substrats, die Änderung der Impedanz, die Änderung des Brechungsindexes und/oder die Änderung der elektrischen Feldstärke induziert.

Aufgrund der hohen Stabilität der erfindungsgemäß eingesetzten oberflächenaktiven Proteine zur Funktionalisierung der Substratoberfläche kann das biofunktionalisierte Substrat im erfindungsgemäßen Verfahren besonders vorteilhaft mehrfach verwendet werden. Vorteilhaft ändert sich die Sensitivität des Verfahrens dabei nicht.

Des Weiteren ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine schnelle und sehr sensitive Quantifizierung des von den Sensor-Zellen sekretierten Signalmoleküls, wobei untere Nachweisgrenzen erreicht werden, die mithilfe bisheriger Verfahren nicht erreicht werden können. Vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Verfahren, im Vergleich zu bisher bestehenden Verfahren, sehr robust gegenüber Veränderungen der chemischen Umgebung und somit besonders vorteilhaft für den Einsatz in der Ganzzellsensorik.

Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch die Oberflächenfunktionalisierung vorteilhaft eingestellt werden. Die Anzahl der Aktormolekül-Bindestellen auf der Oberfläche wird durch die Funktionalisierung mit funktionellen Polypeptiden definiert.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des vorliegenden Verfahrens liegen das oberflächenfunktionalisierte Substrat und die Sensor-Zellen vor dem Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem Primärsignal im Sinne eines erfindungsgemäßen Systems gemeinsam in einem Gefäß (bspw. einem Reaktionsraum) vor, wobei das funktionelle Polypeptid, vorzugsweise über einen Linker, an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist. Das Aktormolekül ist, durch die spezifische Interaktion der Erkennungsstruktur des Aktormoleküls mit dem funktionellen Polypeptid, an dem funktionalisierten Substrat immobilisiert. Infolge des Kontaktierens der Sensor-Zellen mit dem Primärsignal sekretieren die erfindungsgemäßen Sensor-Zellen das Signalmolekül, dies führt zur Bildung eines Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes. Die Bildung des Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes führt erfindungsgemäß zur kompetitiven Verdrängung des Aktormoleküls von der funktionalisierten Substratoberfläche, wobei die koordinative Bindung des Aktormoleküls an das funktionelle Polypeptid gelöst wird. Dies führt zu einem detektierbaren Signal. Besonders vorteilhaft ist dabei die Höhe des detektierbaren Signals direkt proportional zur Konzentration des von den Sensor-Zellen sekretierten Signalmoleküls.

Alternativ bevorzugt kann vorgesehen sein, dass das oberflächenfunktionalisierte Substrat und die Sensor-Zellen vor dem Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem Primärsignal getrennt voneinander vorliegen. Vorzugweise werden die Sensor-Zellen im Sinne eines erfindungsgemäßen Kits in einem ersten Gefäß (bspw. Reaktionsgefäß oder Bioreaktor) und das oberflächenfunktionalisierte Substrat in einem zweiten Gefäß vorgelegt, wobei die Aktormoleküle während oder nach dem Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem Primärsignal in dem ersten Gefäß gemeinsam mit den Sensor-Zellen vorliegen.

Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in einem ersten Schritt (b) das Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem Primärsignal, was zur Synthese eines Signalmoleküls in und zur Sekretion des Signalmoleküls aus den Sensor-Zellen führt. Das Aktormolekül, das eine für das Signalmolekül spezifische Erkennungsstruktur aufweist, bindet koordinativ an das sekretierte Signalmolekül, wobei sich ein Signalmolekül-Aktormolekül-Komplex bildet. Vorzugsweise weist der Signalmolekül-Aktormolekül-Komplex Signalmolekül und Aktormolekül in einem molaren Verhältnis von 10:1 bis 1:1, besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 2:1 bis 1:1 auf. Anschließend wird das Gemisch aus Aktormolekül, Signalmolekül-Aktormolekül-Komplex und mit einem Primärsignal kontaktierten Sensor-Zellen auf das biofunktionalisierte Substrat, aufweisend das oberflächenaktive Polypeptid und das funktionelle Polypeptid, welches vorzugsweise über einen Linker an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist, appliziert. Erfindungsgemäß binden ausschließlich die Aktormoleküle, die noch freie Erkennungsstrukturen für das funktionelle Polypeptid aufweisen, an die funktionellen Polypeptide, die auf der funktionalisierten Oberfläche immobilisiert vorliegen (durch die Bindung an das oberflächenaktive Polypeptid auf dem Substrat). Die Anzahl der Aktormoleküle, die an die Oberfläche binden, ist dabei abhängig von der Konzentration des Signalmoleküls, das von den Sensor-Zellen nach dem Kontaktieren mit dem Primärsignal sekretiert wurde und die Erkennungsstrukturen des Aktormoleküls belegt hatte. Damit wird vorteilhaft eine Quantifizierung des Signalmoleküls ermöglicht.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist das detektierbare Signal nach (c) optisch und/oder elektrisch bzw. elektrochemisch bestimmbar.

Die zum Einsatz kommenden analytischen Methoden sind dabei dem Fachmann bekannt und sind z. B. ausgewählt aus spektrophotometrischen Methoden, Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie, Quarzkristallmikrowaage und Immunoassays. Vorzugsweise ist das detektierbare Signal ein Fluoreszenzsignal, eine Änderung der Absorption bei einer definierten Wellenlänge, die Änderung der oberflächenadsorbierten Masse und/oder die Änderung der Resonanzfrequenz des Substrats, die Änderung der Impedanz, die Änderung des Brechungsindexes und/oder die Änderung der elektrischen Feldstärke.

Folglich erfolgt das Auslesen des detektierbaren Signals vorzugsweise mittels Fluoreszenzmessung, Absorptionsmessung, Ermittlung der Resonanzfrequenz des Substrats (bspw. mittels Quarzkristall-Mikrowage), Ermittlung der Impedanzänderung (bspw. mittels Impedanzspektrometer) und/oder Ermittlung der Änderung des Brechungsindex (bspw. mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie).

Die kompetitive Verdrängung des Aktormoleküls von der biofunktionalisierten Oberfläche bzw. die Bindung des Aktormoleküls an die biofunktionalisierte Oberfläche kann auch mithilfe eines sekundären Aktormoleküls nachgewiesen werden, das spezifisch an das Aktormolekül bindet.

Bevorzugt weist das sekundäre Aktormolekül eine Modifikation auf, besonders bevorzugt sind dabei Modifikationen mit Fluorophoren, Chromophoren, Nanopartikeln, Quantum Dots, Enzymen, katalytischen Zentren oder Erkennungsstrukturen für weitere Aktormoleküle. Ganz besonders bevorzugt werden Modifikationen mit Fluorophoren wie Alexa488, Cy3 oder Cy5 bzw. mit Enzymen wie Meerrettichperoxidase, β-Galactosidase, Thioredoxin, Chloramphenicolacetyltransferase, Luciferase oder alkalischer Phosphatase eingesetzt. Vorteilhaft bietet eine Modifikation des sekundären Aktormoleküls mit einem Enzym die Möglichkeit, dessen Aktivität z. B. photometrisch zu bestimmen.

Besonders vorteilhaft wird durch die Verwendung eines sekundären Aktormoleküls eine Signalverstärkung erreicht.

In einem ersten Fall erfolgt nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung durch die Bildung des Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes die Freisetzung des Aktormoleküls von dem biofunktionalisierten Substrat. Dabei liegt das biofunktionalisierte Substrat, aufweisend das oberflächenaktive Polypeptid und das funktionelle Polypeptid (vorzugsweise über einen Linker an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden) in einem gemeinsamen Gefäß mit dem Aktormolekül vor. Durch die spezifische Interaktion der Erkennungsstruktur des Aktormoleküls mit dem funktionellen Polypeptid ist das Aktormolekül an dem biofunktionalisierten Substrat immobilisiert. Die erfindungsgemäßen Sensor-Zellen werden mit einem Primärsignal kontaktiert, dies führt zur Synthese und Sekretion des Signalmoleküls durch die Sensor-Zellen. Das von den Sensor-Zellen freigesetzte Signalmolekül bildet, zusammen mit dem zuvor am biofunktionalisierten Substrat immobilisierten Aktormolekül, einen Signalmolekül-Aktormolekül-Komplex aus. Dabei werden die Aktormoleküle kompetitiv von dem biofunktionalisierten Substrat abgelöst. Die Ablösung des Aktormoleküls von dem biofunktionalisierten Substrat verursacht das detektierbare Signal. Besonders vorteilhaft ist das detektierbare Signal direkt proportional zur Konzentration des Signalmoleküls, das von den Sensor-Zellen sekretiert wurde.

In einem anderen Fall, bei Verwendung des erfindungsgemäßen Kits, erfolgt in einem ersten Schritt das Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem Primärsignal, was zur Synthese eines Pheromons in und zur Sekretion eines Signalmoleküls aus den Sensor-Zellen führt. Das sekretierte Signalmolekül bindet koordinativ an das Aktormolekül unter Bildung des Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes. Anschließend wird das Gemisch aus Aktormolekül, Signalmolekül-Aktor-Komplex und mit dem Primärsignal kontaktierten Sensor-Zellen mit der biofunktionalisierten Oberfläche in Kontakt gebracht. Erfindungsgemäß binden die Aktormoleküle, die noch freie Bindestellen aufweisen, an das immobilisierte funktionelle Polypeptid auf der biofunktionalisierten Oberfläche. Die Anzahl der Aktormoleküle, die an die biofunktionalisierte Oberfläche binden, ist dabei abhängig von der Konzentration des sekretierten Signalmoleküls, das in den Proben enthalten war und die Bindestellen des Aktormoleküls belegt haben. Damit wird vorteilhaft eine Quantifizierung des Signalmoleküls ermöglicht.

Vorteilhaft kann die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens durch die Oberflächenfunktionalisierung eingestellt werden. Das Substrat wird mit dem oberflächenaktiven Polypeptid sowie mit dem funktionellen Polypeptid funktionalisiert, wobei das funktionelle Polypeptid vorzugsweise über einen Linker an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist. Die Anzahl der funktionellen Polypeptide auf der biofunktionalisierten Oberfläche wird durch die Funktionalisierung definiert. Ein hoher Anteil der funktionellen Polypeptide führt zu einer hohen Anzahl an Aktormolekül-Bindestellen auf der biofunktionalisierten Oberfläche, da das Aktormolekül eine für das funktionelle Polypeptid spezifische Erkennungsstruktur aufweist. Bei einer sehr hohen Dichte des funktionellen Polypeptids (einem molaren Verhältnis von oberflächenaktivem Polypeptid und funktionellem Polypeptid von 10:1 bis 1:1) auf der biofunktionalisierten Oberfläche kann, aufgrund sterischer Effekte zwischen den Aktormolekülen, nicht jedes der funktionellen Polypeptide von einem Aktormolekül belegt werden. Die Anzahl der funktionellen Polypeptide auf der biofunktionalisierten Oberfläche beeinflusst jedoch die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens. In einer Ausgestaltung des Verfahrens werden die Aktormoleküle, infolge der Bildung eines Signalmolekül-Aktormolekül-Komplexes, kompetitiv von der biofunktionalisierten Oberfläche verdrängt. Die Kompetition zwischen dem funktionellen Polypeptid und dem Signalmolekül um die Bindung des Aktormoleküls wird von der Anzahl der funktionellen Polypeptide und der Anzahl der Signalmoleküle beeinflusst. Daher ermöglicht die erfindungsgemäße Funktionalisierung der Substrate, bei der die Anzahl der funktionellen Polypeptide vorteilhaft eingestellt werden kann, die gezielte Einstellung der Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bevorzugt liegen das oberflächenaktive Polypeptid und das funktionelle Polypeptid in einem molaren Verhältnis von 100:1 bis 1:1, besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 100:1 bis 10:1, ganz besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 100:1 bis 50:1 vor.

Die an der funktionalisierten Oberfläche immobilisierten Aktormoleküle können selektiv denaturiert werden. Derartige Methoden gehören zum Stand der Technik und sind dem Fachmann daher bekannt. Dem gegenüber verbleiben die erfindungsgemäß zum Einsatz kommenden biofunktionalisierten Substrate, bestehend aus dem oberflächenaktiven Polypeptid und dem funktionellen Polypeptid, nach dieser Behandlung intakt und funktionell, sodass sie für mehrfache Messungen eingesetzt werden können. Vorteilhaft ändert sich dabei die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht. Bevorzugt wird dabei ein Verfahren eingesetzt, das die Einwirkung von Hitze auf die biofunktionalisierten Oberflächen umfasst. Besonders bevorzugt umfasst das Verfahren zur selektiven Denaturierung der Aktormoleküle die Einwirkung von Hitze, Detergenzien und Reduktionsmitteln auf die biofunktionalisierten Substrate.

Das erfindungsgemäße System bzw. das Kit umfasst Sensor-Zellen, die aus der Gruppe der Mikroorganismen, insbesondere Pilze, Bakterien, Archaeen und Mikroalgen, oder aus vereinzelten tierischen und/oder pflanzlichen Zellen ausgewählt sind.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sind die Sensor-Zellen Pilze, Bakterien, Archaeen oder Mikroalgen. Ganz besonders bevorzugt werden die Sensor-Zellen aus dem Reich der Pilze oder der Bakterien ausgewählt.

Die Sensor-Zellen des erfindungsgemäßen Systems bzw. Kits sind besonders bevorzugt genetisch modifiziert. Dabei wird in die Sensor-Zellen mindestens ein genetisches Element eingebracht, welches bevorzugt auf einem Plasmid kodiert vorliegt oder in das Genom der Sensor-Zellen integriert wird. Dieses genetische Element umfasst erfindungsgemäß mindestens einen Primärsignal-abhängigen Promotor, der als Antwort auf das Primärsignal die Expression eines Zielgens moduliert. Erfindungsgemäß umfasst das eingebrachte genetische Element weiterhin mindestens ein Zielgen unter der Kontrolle des Primärsignal-abhängigen Promotors. Dieses Zielgen kodiert für ein Protein, das für die Synthese und/oder die Sekretion des Signalmoleküls verantwortlich ist. Dieses Zielgen kodiert bevorzugt für ein Protein, das für die Sekretion oder die Prozessierung des Signalmoleküls von Bedeutung ist, besonders bevorzugt für ein Protein, das für die Synthese des Signalmoleküls von Bedeutung ist.

Weiterhin können die Sensor-Zellen mindestens ein weiteres Gen enthalten, das zur Synthese weiterer Signalmoleküle führt, die sich von dem ersten Signalmolekül der Sensor-Zellen unterscheiden, und das unter die Transkriptionskontrolle eines weiteren Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt ist.

Die Signalmoleküle, die von den erfindungsgemäßen Sensor-Zellen synthetisiert und sekretiert werden können, sind dabei bevorzugt authentische und/oder rekombinante Pheromone, die sich untereinander unterscheiden. Besonders bevorzugt sind die weiteren Pheromone Hefe-Pheromone anderer Hefespezies.

Bevorzugt unterscheiden sich die Primärsignal-abhängigen Promotoren voneinander. Die spezifisch regulierbaren Promotoren können somit getrennt voneinander durch (sich unterscheidende) Primärsignale aktiviert werden, wodurch die Expression der Gene, die zur Synthese von Signalmolekülen führen, getrennt voneinander induziert wird. Durch das Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem und/oder weiteren Primärsignalen werden die einzelnen Primärsignale spezifisch synthetisiert und von den Sensor-Zellen sekretiert.

Über eine Weiterentwicklung der Erfindung unterscheiden sich die signalabhängigen Promotoren voneinander, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind.

Vorteilhaft kann somit die Anwesenheit unterschiedlicher Primärsignale in den Sensor-Zellen eines Typs zur Synthese und Sekretion unterschiedlicher Signalmoleküle führen. Somit ist die Freisetzung eines Signalmoleküls von der Anwesenheit des Primärsignals und der Wahl des Promotors abhängig, welcher ausschließlich nach der Wahrnehmung eines Primärsignals aktiviert wird.

Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung können die Gene, die für die Synthese sich unterscheidender Signalmoleküle vermitteln, chimäre Leserahmen sein. Nach einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung umfasst das erfindungsgemäße System bzw. das Kit Sensor-Zellen, die als Antwort auf ein Primärsignal ein Signalmolekül, bevorzugt ein Hefe-Pheromon, besonders bevorzugt den α-Faktor von S. cerevisiae sekretieren. Dafür wird beispielsweise ein Gen eingesetzt, welches für das Propeptid eines Pheromons, vorzugsweise des α-Faktors aus S. cerevisiae, codiert (z. B. das Gen MFα1 aus S. cerevisiae). Bevorzugt kodieren die enthaltenen Gensequenzen das Propeptid eines Sensor-Zell-spezifischen Hefe-Pheromons sowie die kodierende Sequenz eines Hefe-Pheromons, welches identisch zu einem Pheromon der Sensor-Zelle ist oder ein Hefe-Pheromon einer anderen Hefespezies darstellt. Dadurch kann vorteilhaft sichergestellt werden, dass das entsprechende Hefe-Pheromon effizient in den Sensor-Zellen synthetisiert und sekretiert wird.

Erfindungsgemäß wird die Expression des Gens, das für die Synthese und/oder die Sekretion des Signalmoleküls verantwortlich ist, ausschließlich nach der Wahrnehmung des Primärsignals aktiviert, dies kann durch die Wahl eines entsprechenden Promoters gewährleistet werden. Vorteilhaft ermöglicht dieses System die Nutzung verschiedener Spezies als Sensor-Zellen, da beispielsweise haploide Zellen der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) genetisch so modifiziert werden können, sodass sie den α-Faktor sekretieren (Hennig et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2015, 99: 1299–1308).

Weiterhin können die Sensor-Zellen mindestens ein weiteres Gen enthalten, das zur Synthese weiterer Signalmoleküle führt, die sich von dem ersten Signalmolekül der Sensor-Zellen unterscheiden, und das unter die Transkriptionskontrolle eines weiteren Primärsignal-abhängigen Promotors gestellt ist.

Die Signalmoleküle, die von der Sensor-Zelle synthetisiert und sekretiert werden können, sind dabei bevorzugt authentische und/oder rekombinante Pheromone, die sich untereinander unterscheiden. Besonders bevorzugt sind die weiteren Pheromone Hefe-Pheromone anderer Hefespezies.

Bevorzugt unterscheiden sich die Primärsignal-abhängigen Promotoren voneinander. Die spezifisch regulierbaren Promotoren können somit getrennt voneinander durch Primärsignale aktiviert werden, wodurch die Expression der Gene, die zur Synthese von Signalmolekülen führen, getrennt voneinander induziert wird. Durch das Kontaktieren der Sensor-Zellen mit einem und/oder weiteren Primärsignalen werden die einzelnen Signalmoleküle Primärsignal-spezifisch synthetisiert und von den Sensor-Zellen sekretiert.

Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung können in dem erfindungsgemäßen System bzw. Kit zusätzlich zu den Sensor-Zellen Verstärker-Zellen mindestens eines Typs enthalten sein, wobei die Verstärker-Zellen eines Typs folgende Merkmale aufweisen:

  • i. mindestens einen Rezeptor für ein Signalmolekül,
  • ii. mindestens ein Gen, welches zur Synthese eines Signalmoleküls führt, ist unter die Kontrolle eines Signalmolekül-abhängigen Promotors gestellt.

Ein Typ Verstärker-Zellen weist vorteilhaft mindestens ein Gen auf, das zur Synthese und Sekretion mindestens eines authentischen Signalmoleküls oder eines davon abgeleiteten Signalmoleküls führt. Dabei reagieren die Verstärker-Zellen auf ein Signalmolekül, das von den Sensor-Zellen, in Abhängigkeit von der Anwesenheit eines Primärsignals, sekretiert wird. Die Wahrnehmung dieses Signalmoleküls führt zur Synthese und Sekretion eines Signalmoleküls durch die Verstärkerzellen. Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind die Signalmoleküle, die von den Sensor-Zellen und von den Verstärker-Zellen sekretiert werden, strukturell identisch.

Die Verstärker-Zellen sind dabei besonders bevorzugt genetisch modifiziert. In die Verstärker-Zellen wird dabei mindestens ein genetisches Element eingebracht, das auf einem Plasmid kodiert vorliegt oder in das Genom der Verstärker-Zellen integriert wird. Dieses genetische Element umfasst mindestens einen Signalmolekül-abhängigen Promotor. Dieser ist in der Lage, infolge der Antwort der Verstärker-Zellen auf das Signalmolekül, das von den Sensor-Zellen sekretiert wurde, die Expression eines Zielgens zu modulieren. Das genetische Element umfasst erfindungsgemäß weiterhin mindestens ein Zielgen, welches unter der Kontrolle des Signalmolekül-abhängigen Promotors steht. Dieses Zielgen kodiert für ein Protein, welches für die Synthese und/oder Sekretion eines Signalmoleküls durch die Verstärker-Zellen von Bedeutung ist.

Nach einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Systems bzw. Kits enthält das Gen, welches die Synthese des Signalmoleküls durch die Sensor- und/oder Verstärker-Zellen vermittelt, die kodierenden Bereiche für mehr als ein Signalmolekül. Nach einer Ausgestaltung der Erfindung sind die kodierten Signalmoleküle strukturell identisch, wodurch besonders vorteilhaft eine Signalverstärkung erreicht werden kann, In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung unterscheiden sich die Signalmoleküle, die von einem dieser Gene kodiert werden, untereinander. Dadurch kann vorteilhaft sichergestellt werden, dass verschiedene Signalmoleküle von einer Sensor- und/oder Verstärker-Zelle als Antwort auf ein Primärsignal bzw. auf ein Signalmolekül sekretiert werden.

Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung sind die Sensor- und/oder Verstärker-Zellen bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der Bakterien und Pilze, besonders bevorzugt aus Hefen wie beispielsweise S. cerevisiae und/oder S. pombe.

Die Signalmolekül-abhängigen Promotoren, die die Expression des Zielgens in den Verstärker-Zellen modulieren, sind nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung beispielsweise ausgewählt aus den Promotoren der Gene 1 aus S. cerevisiae oder der Gene rep1 oder sxa2 aus S. pombe.

S. pombe weist ebenfalls ein System der Paarungstypen zur sexuellen Vermehrung auf. Haploide Zellen der Spezies S. pombe existieren in zwei verschiedenen Paarungstypen, die als Plus (P) und Minus (M) bezeichnet werden. Haploide Zellen von S. pombe besitzen das Potential zur mitotischen Teilung (asexuelle Reproduktion). Zudem können die haploiden Zellen dieser Spezies Paarungstyp-spezifische Pheromone und entsprechende Rezeptoren synthetisieren, wobei P-Zellen den P-Faktor sowie einen Rezeptor für den M-Faktor produzieren, während Zellen des Paarungstyps M den M-Faktor sekretieren und einen Rezeptor für den P-Faktor auf der Zelloberfläche exponieren. Im Gegensatz zu S. cerevisiae erfolgt die sexuelle Reproduktion der Spalthefe ausschließlich unter Bedingungen, die keine weitere mitotische Teilung der haploiden Zellen erlauben - vorrangig ein Mangel verfügbarer Stickstoffquellen. Während der asexuellen Reproduktion werden weder die Pheromone noch die entsprechenden Rezeptoren gebildet.

Nach einer Ausgestaltung der Erfindung liegen die Sensor-Zellen und die Verstärker-Zellen in einem Kulturmedium vor, über das der Austausch von Signalmolekülen zwischen den Zellen erfolgt. Die Zellen liegen dabei entweder suspendiert in Lösung, immobilisiert auf einem Träger oder in voneinander getrennten Kammern in einem mikrofluiden System vor. Vorzugsweise handelt es sich beim Kulturmedium um ein flüssiges, vorzugsweise wässriges Nährmedium, über das der Austausch von Signalmolekülen zwischen den Zellen erfolgt. Das Nährmedium weist dabei eine dem Fachmann bekannte Zusammensetzung auf. Beispielsweise ist das Kulturmedium für die Kultivierung von Bakterien oder Hefezellen geeignet, wobei derartige Medien dem Fachmann aus dem Stand der Technik bestens bekannt sind.

Dem Kulturmedium können dabei auch noch andere Additive wie z. B. Antibiotika oder Pufferkomponenten zugesetzt sein. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung verschiedener Additive wie lösliche organische Salze, d. h. Metallsalze organischer Carbon- oder Sulfonsäuren bzw. offenkettige oder cyclische Ammoniumsalze und Quartärsalze von N-Heterocyclen sowie niedermolekulare Polyanionen oder Polykationen, oder wasserlösliche organische Verbindungen wie Polycarbonsäuren, Harnstoff-Derivate, Kohlenhydrate, Polyole, wie Glycerin, Polyethylenglycol und Polyvinylalkohol, oder Gelatine, die als Weichmacher, Feuchthaltemittel und Porenbildner wirken, die Zelllyse hemmen und die Überlebensfähigkeit der eingebetteten Zellen beträchtlich verlängern. Diese Additive führen nicht zu einem detektierbaren Signal.

Die Suspension befindet sich in einem geeigneten Behältnis, das die Erfassung des detektierbaren Signals an der biofunktionalisierten Oberflächegewährleistet. Der Träger ist ebenfalls so gestaltet, dass diese Signale durch ein Detektionssystem erfasst werden können.

Bevorzugt können die Sensor-Zellen und/oder die Verstärker-Zellen in einer porösen und optisch transparenten organischen oder anorganischen Matrix eingebettet vorliegen.

Vorteilhaft sind die Zellen in inerten Xerogelen immobilisiert. Xerogele sind Gele, die ihre Flüssigkeit beispielsweise durch Verdampfen oder Absaugen verloren haben. Gele sind formbeständige, leicht deformierbare disperse Systeme aus mindestens zwei Komponenten, die zumeist aus einem festen Stoff mit langen oder stark verzweigten Teilchen (z. B. Kieselsäure, Gelatine, Kollagene, Polysaccharide, Pektine, spezielle Polymere, wie z. B. Polyacrylate, und andere, oft als Verdickungsmittel bezeichnete Geliermittel) und einer Flüssigkeit (meist Wasser) als Dispersionsmittel bestehen. Dabei bildet die feste Substanz im Dispersionsmittel ein räumliches Netzwerk. Bei der Entstehung von Xerogelen verändert sich die räumliche Anordnung des Netzes.

Die vorteilhafte Verwendung von anorganischen oder biologisch inerten organischen Xerogelen zur Einbettung der Zellen erlaubt vorteilhaft das Überleben der Zellen bei gleichzeitiger Stabilität der erzeugten Strukturen, denn sie sind toxikologisch und biologisch inert und werden im Allgemeinen nicht durch die Zellen abgebaut. Sie ermöglichen weiterhin vorteilhaft die Einlagerung von Nährstoffen und Feuchthaltemitteln, die das Überleben der Zellen sichern.

Bevorzugt können die erfindungsgemäß eingesetzten Zellen in ein Gefüge mit einer hierarchischen Porenstruktur eingebettet sein, sodass neben der für anorganische Gele typischen Nanoporosität das Gefüge zusätzlich von miteinander verbundenen Mesoporen durchzogen wird, deren Durchmesser typischerweise zwischen 100 nm bis 100 µm variiert und die einen Stoffaustausch zwischen der Umgebung und den eingebetteten Zellen sowie deren Reaktionsprodukten wie den Enzymen ermöglichen.

Dadurch können vorteilhaft die erfindungsgemäß eingesetzten Zellen in verschiedenen Schichten auf das Substrat aufgebracht werden. Durch die Nanoporosität können sowohl die spezifischen Primärsignale an die Zellen des ersten Typs gelangen, die sich in der äußeren Schicht des Sensors befinden, als auch die von diesen Zellen sezernierten Pheromone an die Zellen des zweiten und/oder dritten Typs gelangen, die sich in der darunter befindlichen Schicht befinden, die direkten Kontakt zum Signaldetektor hat.

Durch eine erfindungsgemäße Ausgestaltung liegen die Sensor-Zellen und/oder die Verstärker-Zellen sowie die biofunktionalisierten Substrate in separaten Kammern vor, die durch eine semipermeable Membran und/oder einen Sterilfilter und/oder eine Flüssigkeitsbrücke miteinander verbunden sind.

Besonders bevorzugt eignen sich semipermeable Membranen und/oder Sterilfilter, die eine Porengröße von 10–500 nm, besonders bevorzugt 50–250 nm aufweisen.

Sind die Sensor-Zellen und die Verstärker-Zellen aus verschiedenen Spezies ausgewählt, so stehen diese verschiedenen Spezies im Normalfall in Konkurrenz zueinander, was im Extremfall zum Überwachsen von Zellen einer Spezies führen kann. Durch die erfindungsgemäße Ausgestaltung kann vorteilhaft verhindert werden, dass sich Zellen unterschiedlicher Spezies vermischen. Ein Überwachsen der Zellen verschiedener Spezies kann somit unterbunden werden.

Da die erfindungsgemäßen Signalmoleküle, insbesondere Pheromone, Vitamine, Peptide und Peptidanaloga sowie Antigene kleine organische Moleküle darstellen, deren Molekulargewicht typischerweise zwischen 0,01 und 5 kDa, bevorzugt zwischen 0,1 und 3 kDa, liegt, sind sie weiterhin in der Lage eine semipermeable Membran zu passieren und diffundieren so in die separierten Kammern. Damit wird vorteilhaft sichergestellt, dass eine räumliche Trennung der Sensor-Zellen und/oder der Verstärker-Zellen von der biofunktionalisierten Oberfläche erfolgen kann, während das Signalmolekül, welches das detektierbare Signal an der biofunktionalisierten Oberfläche verursacht, ungehindert zwischen den verschiedenen Kammern transportiert werden kann. Da das Signalmolekül von den Sensor-Zellen in ihre Umgebung sekretiert wird, kann vorteilhaft sichergestellt werden, dass das Signalmolekül z. B. in einem Flüssigkeitsstrom in eine zweite Kammer transportiert werden kann, während die Sensor-Zellen durch einen entsprechenden Filter zurückgehalten werden.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden das erfindungsgemäße System und das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion eines Primärsignals genutzt, um:

  • – die Limitierung von Stoffen wie z. B. Phosphat, Schwefel, Stickstoff oder einer Kohlenstoffquelle wie z. B. Glucose in Kulturmedien frühzeitig zu detektieren,
  • – eine Belastung von Zellen durch Stressoren wie z. B. Strahlung oder chemische Agenzien effektiver nachzuweisen,
  • – das Auftreten von Zielmolekülen wie beispielsweise bestimmten Stoffwechselintermediaten frühzeitig zu detektieren,
  • – Bioassays zum Nachweis von Substanzen in wässrigen Lösungen effektiver zu gestalten.

Vorteilhaft erlaubt das erfindungsgemäße Kit und das erfindungsgemäße Verfahren die Online-Detektion von einem oder mehreren Primärsignalen in einem gemeinsamen System. Dafür werden eine oder mehrere Populationen von Sensor-Zellen eingesetzt, die als Antwort auf ein definiertes Primärsignal ein erfindungsgemäßes Signalmolekül sekretieren. Bei Verwendung mehrerer, verschiedener Populationen von Sensor-Zellen wird dabei vorteilhaft die Detektion mehrerer Primärsignale ermöglicht. Dafür wird jede Population von Sensor-Zellen spezifisch genetisch modifiziert, sodass jede Population der Sensor-Zellen auf ein anderes Primärsignal reagiert und ein Signalmolekül sekretiert. Dies kann durch die Wahl des Primärsignal-abhängigen Promotors, der sich zwischen den Populationen der Sensor-Zellen unterscheidet, gewährleistet werden. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung werden dabei ein Mangel an Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Phosphatquellen als Primärsignale eingesetzt, wobei jede Population an Sensor-Zellen spezifisch auf eines dieser Primärsignale reagiert.

In einer Ausgestaltung der Erfindung werden eine oder mehrere Populationen von Sensor-Zellen und/oder Verstärker-Zellen in verschiedene Kammern in ein mikrofluides System eingebracht. Vorteilhaft werden die Kammern des mikrofluiden Systems durch Sterilfilter und/oder semipermeable Membranen voneinander getrennt, sodass die Sensor-Zellen und/oder Verstärker-Zellen in den entsprechenden Kammern immobilisiert werden. Des Weiteren umfasst die erfindungsgemäße Ausgestaltung mindestens eine weitere Kammer im mikrofluiden System, enthaltend die biofunktionalisierte Oberfläche bestehend aus dem oberflächenaktiven Polypeptid und dem funktionellen Polypeptid, welches vorzugsweise über einen Linker an das oberflächenaktive Polypeptid gebunden ist. In dieser Ausgestaltung liegt das Aktormolekül, bedingt durch die spezifische Interaktion der Erkennungsstruktur des Aktormoleküls mit dem funktionellen Polypeptid, immobilisiert an der biofunktionalisierten Oberfläche vor. Die biofunktionalisierte Oberfläche ist mit einem entsprechenden Transduktor gekoppelt, der eine Auslesung des erfindungsgemäß detektierbaren Signals ermöglicht.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung liegen die verschiedenen Populationen der Sensor-Zellen und/oder Verstärker-Zellen in getrennten mikrofluiden Kanälen vor, die jeweils mindestens eine Kammer mit immobilisierten Sensor-Zellen und mindestens eine Kammer mit dem biofunktionalisierten Substrat, gekoppelt an einen Transduktor, umfassen. Besonders bevorzugt umfassen die mikrofluiden Kanäle mindestens eine weitere Kammer, die erfindungsgemäße Verstärker-Zellen enthält. In der erfindungsgemäßen Ausgestaltung werden die Sensor-Zellen mit einem oder mehreren Primärsignalen kontaktiert. Dabei reagiert jede Population der Sensor-Zellen auf ein spezifisches Primärsignal und moduliert erfindungsgemäß die Expression des Gens, das für die Synthese und/oder Sekretion des Signalmoleküls verantwortlich ist. Sofern das Primärsignal vorliegt, wird somit die Konzentration des Signalmoleküls im entsprechenden mikrofluiden Kanal moduliert. Dies kann durch das erfindungsgemäße System bzw. Kit in ein detektierbares Signal umgewandelt werden. Diese Ausgestaltung erlaubt somit vorteilhaft, mehrere Kulturparameter, z. B. in einem Bioreaktor-basierten Verfahren, mithilfe des erfindungsgemäßen Systems bzw. Kits simultan zu überwachen.

Es sei angemerkt, dass die erfindungsgemäßen Ausgestaltungen in jeder Anordnung miteinander kombinierbar sind.

Ausführungsbeispiele

Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden schematischen Zeichnungen und Ausführungsbeispielen, anhand derer die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden soll, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.

Dabei zeigt:

1: die Abhängigkeit der Antikörperbelegung von der Hydrophobin-basierten Funktionalisierung der Oberfläche,

2: die Abhängigkeit der Antikörperbelegung von der Hydrophobin-basierten Oberflächenfunktionalisierung und der applizierten Pheromonkonzentration,

3: die mehrfache Verwendbarkeit der Hydrophobin-basierten Oberflächenfunktionalisierung,

4: die Abhängigkeit der Antikörperbelegung von der Hydrophobin-basierten Oberflächenfunktionalisierung und der applizierten Pheromonkonzentration im inversen Verfahren,

5: die Analyse der Sekretion des α-Faktors durch S. cerevisiae,

6: die Analyse der Sekretion des α-Faktors durch modifizierte Zellen von S. pombe,

7: die Thiamin-regulierte Sekretion des α-Faktors durch Sensor-Zellen von S. pombe,

8: eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur schnellen und sensitiven Detektion von mindestens einem Primärsignal mittels oberflächenfunktionalisierter Substrate.

In 1 wurden hydrophobe Polystyrol-Oberflächen mit den Hydrophobinen EAS und EAS-α in verschiedenen Anteilen funktionalisiert und anschließend mit dem Antikörper, der gegen den α-Faktor gerichtet ist, behandelt. Die Anzahl der pro Flächeneinheit immobilisierten Antikörper (Antikörperbelegung) wurde mithilfe eines sekundären Antikörpers, der mit der Meerrettichperoxidase gekoppelt ist, quantifiziert. (linke Abbildung) Ermittelte Antikörperbelegung in Abhängigkeit des Anteils an EAS-α in der Hydrophobin-Funktionalisierung. (rechte Abbildung) Vergrößerung der linken Abbildung zur besseren Visualisierung der Antikörperbelegung im Bereich von 0–6 % EAS-α.

In 2 wurden hydrophobe Polystyrol-Oberflächen mit den Hydrophobinen EAS und EAS-α in verschiedenen Anteilen funktionalisiert und für den kompetitiven ELISA eingesetzt. Verschiedene Konzentrationen des α-Faktors wurden verwendet, um eine Kompetition zwischen dem an der Oberfläche immobilisierten und dem applizierten Pheromon zu initiieren. Der Kompetitionsschritt erfolgte bei 40 °C. Die Antikörperbelegung wurde mithilfe eines sekundären Antikörpers, der mit der Meerrettichperoxidase gekoppelt ist, quantifiziert.

Gemäß 3 wurden hydrophobe Polystyrol-Oberflächen mit Hydrophobinen (1,6 % EAS-α) funktionalisiert und für den kompetitiven ELISA eingesetzt, wobei verschiedene Pheromonkonzentrationen appliziert wurden. Anschließend wurden die immobilisierten Antikörper selektiv denaturiert und die funktionalisierten Oberflächen erneut für den kompetitiven ELISA unter identischen Bedingungen eingesetzt. Die funktionalisierten Oberflächen wurden insgesamt 6× verwendet.

In 4 wurden hydrophobe Polystyrol-Oberflächen mit den Hydrophobinen EAS und EAS-α in verschiedenen Anteilen funktionalisiert und für den inversen ELISA eingesetzt. Verschiedene Konzentrationen des α-Faktors wurden verwendet, um die Bindestellen der eingesetzten Antikörper vor der Applikation auf die funktionalisierten Oberflächen zu belegen. Die Antikörperbelegung wurde mithilfe eines sekundären Antikörpers, der mit der Meerrettichperoxidase gekoppelt ist, quantifiziert.

Zur Bestimmung der Pheromonsekretion wurden in 5 Hefezellen von S. cerevisiae in Minimalmedium bei 30°C inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurden Kulturüberstände gewonnen und mithilfe des inversen Verfahrens die Konzentration des α-Faktors in diesen Kulturüberständen ermittelt. Dabei wurde die Sekretion des α-Faktors durch Zellen vom Paarungstyp a (♦) sowie vom Paarungstyp α (Δ) analysiert. Zudem wurden Zellen vom Paarungstyp α eingesetzt, die das Gen MFα1 überexprimierten (∎). Jeweils ein repräsentativer Datensatz wurde dargestellt.

Zur Bestimmung der Pheromonsekretion wurden in 6 modifizierte Hefezellen von S. pombe in Minimalmedium bei 30°C inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurden Kulturüberstände gewonnen und mithilfe des inversen Verfahrens die Konzentration des α-Faktors in diesen Kulturüberständen ermittelt. Dabei wurde die Sekretion des α-Faktors durch S. pombe Zellen mit leerem Vektor (pJR1-3XL) sowie durch Zellen, die MFα1 (pJR1-MFα1) bzw. das chimäre Gen map2/MFα1 (pJR1-map2/MFα1) überexprimierten, analysiert. Jeweils ein repräsentativer Datensatz wurde dargestellt.

Zur Etablierung eines Ganzzellsensors für Thiamin wurden gemäß 7 Hefezellen von S. pombe mit einem Plasmid transformiert, welches das MFα1-Gen unter der Kontrolle des Thiaminregulierten nmt1-Promotors enthielt. Die Sensor-Zellen wurden in Minimalmedium mit verschiedenen Thiamin-Konzentrationen (0–0,5 µM) bei 30°C inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurden Kulturüberstände gewonnen und mithilfe des inversen Verfahrens die Konzentration des α-Faktors in diesen Kulturüberständen ermittelt.

Ausführungsbeispiel 1: Kompetitiver ELISA

Um die Hydrophobine in Escherichia (E.) coli exprimieren zu können, wurden die codierenden Bereiche des Klasse l Hydrophobins EAS aus Neurospora (N.) crassa in den Expressionsvektor pET28b (Novagen, Deutschland) eingebracht. Dabei wurde die Sequenz für das N-terminale Signalpeptid, das in N. crassa zur Sekretion des Hydrophobins führt, durch die Sequenz für einen (His)6-Tag ersetzt, wobei die Sequenz für die erste Hydrophobin-Variante (EAS) generiert wurde. Der (His)6-Tag dient der anschließenden Reinigung der Proteine. Zudem wurde eine zweite Hydrophobin-Variante (EAS-α) erstellt, die zusätzlich zum N-terminalen (His)6-Tag eine C-terminale Modifikation aufweist. Am C-Terminus des EAS-Gens wurde in dieser Variante die Sequenz für einen dreifachen Glycin-Serin-Linker sowie die Sequenz für den α-Faktor angefügt. Die Sequenzen für beide Hydrophobin-Varianten wurden in den Expressionsvektor pET28b eingebracht und die resultierenden Vektoren in den E. coli Expressionsstamm SHuffle T7 Express lysY (New England Biolabs, USA) transformiert. Durch den Einsatz dieses Expressionsstammes, der ein oxidatives Milieu im Cytoplasma aufweist, wird vorteilhaft sichergestellt, dass die Disulfidbrücken der Hydrophobine korrekt ausgebildet werden.

Die Expression der Hydrophobine wurde durch Zugabe von 0,4 mM lsopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG) zu exponentiell wachsenden Zellen induziert. Nach weiteren 4 h Inkubation bei 30°C wurden die Zellen geerntet und die Hydrophobine mittels Nickel-Affinitätschromatographie unter denaturierenden Bedingungen nach Herstellerangaben (Novagen, Deutschland) gereinigt. Final wurden die Hydrophobine mittels Ultrazentrifugation konzentriert und gegen einen Redoxpuffer (10 mM Glutathion reduziert, 1 mM Glutathion oxidiert, pH 5,4) dialysiert, der eine korrekte Faltung der Hydrophobine ermöglicht. Die gereinigten Hydrophobine wurden für die Funktionalisierung von hydrophoben Polystyrol-Oberflächen eingesetzt. Dafür wurden die Hydrophobine EAS und EAS-α in definiertem Verhältnis zueinander gemischt, wobei eine Endkonzentration von 2 μM der Hydrophobinmischung eingestellt wurde. Die Selbst-Assemblierung der Hydrophobine erfolgte bei 80°C für 10 min.

Die Zusammensetzung der Hydrophobine (das Verhältnis zwischen EAS und EAS-α), die für die Funktionalisierung der Oberflächen eingesetzt werden, beeinflusst das entwickelte Verfahren hinsichtlich der Antikörperbelegung und der Sensitivität. Die Antikörperbelegung ist ein Maß für die Anzahl der Antikörper, die pro Flächeneinheit spezifisch immobilisiert werden können, und damit ein Maß für die maximal erreichbare Signalhöhe. Ein hoher Anteil an EAS-α führt zu einer hohen Anzahl an Antikörper-Bindestellen auf der Oberfläche und somit zur maximalen Antikörperbelegung, wobei vermutlich aufgrund sterischer Effekte zwischen den Antikörpern nicht alle Bindestellen besetzt werden können. Bei einem sehr geringen Anteil an EAS-α hingegen können nur sehr wenige Antikörper pro Flächeneinheit immobilisiert werden. Die Anzahl der Bindestellen auf der Oberfläche beeinflusst jedoch auch die Kompetition zwischen dem Pheromon in der Lösung und dem Pheromon auf der Oberfläche. Ein Überschuss an Bindestellen auf der funktionalisierten Oberfläche (hoher Anteil an EAS-α) reduziert dabei die Effizienz der Kompetition und somit die Sensitivität des Verfahrens für den α-Faktor. Eine geeignete Oberfläche, die eine sensitive und robuste Detektion und Quantifizierung des Pheromons ermöglicht, sollte daher, mit einem relativ geringen Anteil an EAS-α, eine möglichst hohe Antikörperbelegung erzielen.

Um eine geeignete Zusammensetzung der Oberfläche zu ermitteln, wurden die Hydrophobine in verschiedenen Verhältnissen zur Funktionalisierung von Oberflächen eingesetzt. Anschließend wurde der Antikörper appliziert, der spezifisch an den α-Faktor bindet, sodass dieser Antikörper an der funktionalisierten Oberfläche immobilisiert wird. Die Quantifizierung der Antikörperbelegung erfolgte mithilfe eines sekundären Antikörpers, der spezifisch an den primären Antikörper bindet (1). Der sekundäre Antikörper ist zudem mit der Meerrettichperoxidase gekoppelt, deren Aktivität photometrisch nachgewiesen werden kann. Zur Ermittlung der Antikörperbelegung wurden die bestimmten Messwerte, in Bezug auf eine mit 100 % EAS-α funktionalisierte Oberfläche, normalisiert.

Ein steigender Anteil von EAS-α in der Oberflächenfunktionalisierung führte zu einer steigenden Antikörperbelegung (1). Dabei wurde bereits bei einem geringen Anteil von EAS-α (1,6 %) eine relativ hohe Antikörperbelegung von etwa 72 % des Maximalwertes ermittelt, während eine weitere Steigerung des Anteils von EAS-α nur in einer geringen Steigerung der Antikörperbelegung resultierte. Daher wird diese Zusammensetzung nachfolgend als besonders geeignet angenommen. Eine Funktionalisierung der Polystyrol-Oberflächen mit Kontrollproteinen oder dem α-Faktor führte nur zu einer sehr geringen Antikörperbelegung (Daten nicht gezeigt). Dies unterstreicht den vorteilhaften Einsatz der Hydrophobin-basierten Oberflächenfunktionalisierung.

Zur Detektion und Quantifizierung des α-Faktors wurde das zuvor eingesetzte Verfahren um einen Reaktionsschritt erweitert. Nach der Funktionalisierung und der Applikation des primären Antikörpers wurden Pheromon-haltige Lösungen zugegeben, sodass eine Kompetition zwischen dem gelösten und dem immobilisierten Pheromon initiiert wurde, in deren Folge ein Teil der zuvor immobilisierten Antikörper abgelöst wurde. Die verbliebenen Antikörper wurden erneut mithilfe des sekundären Antikörpers quantifiziert (2). Dieses Verfahren ist an die Methode des Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) angelehnt und wird nachfolgend als kompetitiver ELISA bezeichnet.

Bei steigender Konzentration des Pheromons, das auf die funktionalisierten Oberflächen appliziert wurde, wurde eine Reduktion der Antikörperbelegung nachgewiesen, da mit steigender Pheromonkonzentration mehr Antikörper kompetitiv von der Oberfläche verdrängt werden (2). Dabei konnte, unter Einsatz einer besonders geeigneten Oberflächenfunktionalisierung (1,6 % EAS-α), eine untere Nachweisgrenze von 0,2 μM des Pheromons bestimmt werden. Bei Einsatz funktionalisierter Oberflächen mit einem höheren Anteil an EAS-α wurden hingegen höhere Nachweisgrenzen ermittelt (2). Dies ermöglicht vorteilhaft die Sensitivität des Verfahrens im Vorfeld mithilfe der Hydrophobin-basierten Oberflächenfunktionalisierung einzustellen.

Diese Effizienz der Kompetition erwies sich als sehr robust gegenüber Veränderungen der chemischen Umgebung während der Kompetition. Weder der pH-Wert der Lösung, in der das Pheromon appliziert wurde, noch deren lonenstärke oder Detergenzkonzentration beeinflussten die Kompetition (Daten nicht gezeigt). Die Effizienz der Kompetition konnte hingegen gesteigert werden, indem die Kompetition bei erhöhter Temperatur (40°C) durchgeführt wurde. Eine erhöhte Viskosität der Pheromon-haltigen Lösung reduzierte jedoch die Effizienz der Kompetition (Daten nicht gezeigt). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Effizienz der Kompetition hauptsächlich von der Diffusion des Pheromons zur funktionalisierten Oberfläche beeinflusst wird.

Klasse I Hydrophobine assemblieren selbstständig an hydrophil-hydrophoben Grenzflächen und bilden dabei chemisch sehr robuste Monolagen aus (Zampieri et al., Materials. 2010, 3: 4607–4625). Daher besteht vorteilhaft die Möglichkeit, die funktionalisierten Oberflächen mehrfach für die Quantifizierung von Pheromonen zu verwenden. Nach der Detektion und Quantifizierung der Antikörperbelegung wurden die Antikörper, die an der funktionalisierten Oberfläche immobilisiert vorlagen, selektiv denaturiert. Dazu wurden die Oberflächen mit einem Denaturierungspuffer (1 % (w/v) Natriumdodecylsulfat, 50 mM β-Mercaptoethanol, 50 mM Tris/HCI pH 7,0) versetzt und für 15 min bei 55°C inkubiert. Durch die Kombination von Hitze, Detergenz und Reduktionsmittel wurden die Antikörper vollständig denaturiert, während die funktionalisierten Oberflächen intakt blieben. lm Anschluss an die selektive Denaturierung der immobilisierten Antikörper konnten die funktionalisierten Oberflächen erneut mit primärem Antikörper, Pheromon-haltigen Lösungen sowie dem sekundären Antikörper behandelt werden, wobei im Vergleich zu frisch beschichteten Oberflächen nur sehr geringe, nicht signifikante Unterschiede hinsichtlich der Sensitivität für den α-Faktor nachgewiesen wurden (3). Die funktionalisierten Oberflächen konnten somit mehrfach eingesetzt werden, während die Sensitivität vorteilhaft erhalten blieb.

Ausführungsbeispiel 2: lnverser ELISA

Das Verfahren kann auch mit einer modifizierten Reihenfolge der Reaktionsschritte durchgeführt werden, wobei die Sensitivität des Verfahrens für den α-Faktor vorteilhaft deutlich gesteigert werden kann. Die Expression und Reinigung der Hydrophobine EAS und EAS-α erfolgte analog zum in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren. Die gereinigten Hydrophobine wurden analog zur Funktionalisierung hydrophober Polystyrol-Oberflächen eingesetzt. Da das nachfolgend beschriebene Verfahren einige Reaktionsschritte des kompetitiven ELISA in modifizierter Reihenfolge enthält, wird es nachfolgend als inverser ELISA bezeichnet.

Zunächst wurden die Pheromon-haltigen Proben mit dem Antikörper versetzt, der spezifisch an den α-Faktor bindet. Das Pheromon belegte dabei einen Teil der Bindestellen, die die Antikörper aufwiesen. Anschließend wurden diese Proben auf die funktionalisierte Oberfläche aufgetragen. Dabei sollten erfindungsgemäß ausschließlich Antikörper an der Oberfläche immobilisiert werden, die noch freie Bindestellen aufweisen. Die Kompetition zwischen Pheromonen in der Lösung und den immobilisierten Pheromonen wurde dabei durch die Wahl geringer Temperaturen (4°C) während dieses Reaktionsschrittes reduziert. Anschließend wurden die an der Oberfläche immobilisierten Antikörper, analog zum in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren, mithilfe eines sekundären Antikörpers detektiert (4).

Mit steigender Konzentration des α-Faktors, der für die Belegung der Antikörper-Bindestellen eingesetzt wurde, wurde die Antikörperbelegung an der funktionalisierten Oberfläche reduziert (4). Dies ist wahrscheinlich auf eine geringere Anzahl unbesetzter Bindestellen an den Antikörpern zurückzuführen, da bei steigender Konzentration des Pheromons mehr Antikörper-Bindestellen belegt werden. Bei Einsatz einer besonders geeigneten Oberflächenfunktionalisierung (1,6 % EAS-α) wurde dabei eine untere Nachweisgrenze von etwa 0,1 nM des α-Faktors ermittelt. Bei Einsatz funktionalisierter Oberflächen mit einem höheren Anteil an EAS-α wurde eine modifizierte Sensitivität festgestellt, die auf eine Kompetition zwischen dem gelösten und dem immobilisierten Pheromon hindeutet (4). Dies ermöglicht vorteilhaft, die Sensitivität für den α-Faktor mithilfe der Hydrophobin-basierten Oberflächenfunktionalisierung einzustellen.

Analog zum kompetitiven ELISA (Ausführungsbeispiel 1) erwies sich das inverse Verfahren als sehr robust gegenüber Veränderungen der chemischen Umgebung (pH-Wert, Ionenstärke, Detergenz-Konzentration) während der Bindung der Antikörper an die funktionalisierte Oberfläche (Daten nicht gezeigt). Dieses Verfahren bietet ebenfalls die Möglichkeit, mithilfe des Denaturierungspuffers an die Oberfläche gebundene Antikörper selektiv zu denaturieren, sodass die funktionalisierten Oberflächen ohne signifikanten Sensitivitätsverlust mehrfach verwendet werden können (Daten nicht gezeigt).

Mithilfe des modifizierten Verfahrens konnten Pheromon-Konzentrationen in den Kulturüberständen von Hefen bestimmt werden. Dafür wurden Kulturen der entsprechenden Hefe-Stämme in Minimalmedium bei 30°C inkubiert. Zum jeweils angegebenen Zeitpunkt wurden die intakten Zellen mittels Zentrifugation entfernt, sodass die Kulturüberstände erhalten wurden. Diese Kulturüberstände wurden zunächst mit 10 mM Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure (EGTA) versetzt, wobei vorrangig Calcium-Ionen komplexiert werden. Anschließend wurden die Kulturüberstände mit 200 mM Tris/HCl pH 8,0 versetzt, sodass die Proben final einen pH-Wert von 8,0 aufwiesen. Dadurch konnte vorteilhaft gewährleistet werden, dass keine Denaturierung der Antikörper infolge des pH-Wertes der Kulturüberstände (pH 2,0 bis pH 3,0) auftrat. Die Zugabe von EGTA im Vorfeld verhinderte dabei vorteilhaft die Bildung von Niederschlägen, die aufgrund der Unlöslichkeit von einigen Calcium-Salzen in diesem pH-Wert-Bereich auftreten können. Zudem wurden die Proben mit Protease-Inhibitoren versetzt um eine Degradierung der Antikörper durch Proteasen, die von Hefezellen sekretiert oder von lysierten Hefezellen freigesetzt werden, zu unterbinden. Zuletzt wurde der Antikörper zugegeben, der spezifisch an den α-Faktor bindet, und die Proben wurden für das inverse Verfahren eingesetzt. Mithilfe dieses Verfahrens konnte somit die Pheromon-Konzentration in Kulturüberständen ermittelt werden (5).

Bei Einsatz von Hefezellen des Paarungstyps α, die natürlicherweise den α-Faktor sekretieren, wurde eine steigende Pheromonkonzentration mit steigender Inkubationszeit bis zu 10 h nachgewiesen, während bei weiterer Inkubation eine Abnahme der Pheromonkonzentration auftrat (5). Diese kann möglicherweise auf eine unspezifische Degradierung des Peptidpheromons zurückgeführt werden, das somit als Nährstoffquelle für die wachsenden Zellen dienen kann.

Dabei akkumulierten etwa 25–50 nM des Pheromons innerhalb von 10 h in den Kulturüberständen dieser Hefen. Bei Einsatz von Hefezellen des Paarungstyps a, die keinen α-Faktor sekretieren, wurde kein Pheromon detektiert (5), wodurch die Selektivität des Verfahrens für den α-Faktor nachgewiesen werden konnte. Zudem wurden Hefezellen vom Paarungstyp α eingesetzt, die mit einem Plasmid (p426GPD-MFα1) transformiert wurden. Dies führte zu einer starken Überexpression des MFα1-Gens und somit zu einer höheren Pheromonsynthese. In den Kulturüberständen dieser Zellen akkumulierten etwa 1–2 µM des Pheromons innerhalb von 10 h (5).

Bestehende Verfahren zur Detektion und Quantifizierung des α-Faktors beruhen meist auf der spezifischen Aktivität des Pheromons. Dabei werden Pheromon-hypersensitive Aktor-Zellen mit dem Pheromon behandelt und die Pheromonantwort der Aktorzellen quantifiziert. Dies ist jedoch nur in einem sehr limitierten Konzentrationsbereich des Pheromons möglich und erfordert eine sehr exakte Einhaltung der definierten Umgebungsbedingungen. Mit diesem Verfahren werden untere Nachweisgrenzen von etwa 5–10 nM erreicht (Diener et al., PLoS Comput Biol. 2014, 10: e1003690; Jin et al., Sci Signal. 2011, 4: ra54; Moore et al., PLoS One. 2008, 3: e3865; Williams et al., ACS Synth Biol. 2013, 2: 136–149). Eine alternative Möglichkeit zur Quantifizierung des α-Faktors beruht auf einem ELISA-basierten Verfahren (Rogers et al., FEMS Yeast Res. 2012, 12: 668–674.). Dabei wird das Pheromon unspezifisch an Polystyrol-Oberflächen immobilisiert und anschließend mithilfe spezifischer Antikörper nachgewiesen. Dieses Verfahren erfordert einen hohen Zeitaufwand, der eine Quantifizierung des Pheromons innerhalb eines Tages nicht ermöglicht. Zudem werden speziell modifizierte Polystyrol-Oberflächen benötigt, eine mehrfache Verwendbarkeit dieser Oberflächen ist nicht möglich. Mithilfe dieses Verfahrens wurden untere Nachweisgrenzen von etwa 1,2 nM erreicht, wobei das Verfahren für Pheromonkonzentrationen bis zu 0,6 µM geeignet ist. Weitere Verfahren zur Detektion und Quantifizierung des Pheromons, basierend auf der Massenspektroskopie (Bener Aksam et al., FEMS Yeast Res. 2013, 13: 350–353) oder der Hochdruck-Flüssigchromatographie (Daten nicht gezeigt), erfordern einen sehr hohen apparativen Aufwand und erreichen eine deutlich geringere Sensitivität.

Mithilfe der beiden Verfahren (kompetitiver und inverser ELISA) kann im Vergleich zu den bestehenden Verfahren ein deutlich größerer Konzentrationsbereich des Pheromons detektiert werden. Zudem kann die Sensitivität des Verfahrens, durch die Wahl des Anteils an EAS-α für die Hydrophobin-Funktionalisierung, vorteilhaft eingestellt werden. Dabei kann eine untere Nachweisgrenze erreicht werden, die mithilfe bisheriger Verfahren nicht realisiert werden konnte. Zudem ermöglicht die Stabilität der Hydrophobin-basierten Funktionalisierung eine mehrfache Verwendung der funktionalisierten Oberflächen.

Ausführungsbeispiel 3: Einsatz des inversen ELISA für die Ganzzellsensorik

Die Spalthefe S. pombe weist, analog zu S. cerevisiae, ein Pheromonsystem auf, das für die Initiation sexueller Prozesse von Bedeutung ist (Merlini et al., Open Biol. 2013, 3: 130008). Diese Hefe kann vorteilhaft genetisch modifiziert werden, sodass sie den α-Faktor als Pheromon von S. cerevisiae sekretiert (Hennig et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2015, 99: 1299–1308). Dabei wurden S. cerevisiae MFα1 (authentisches Gen) oder ein synthetisches map2/MFα1 (chimäres Gen) heterolog in S. pombe exprimiert und die Kulturüberstände dieser Hefezellen gewonnen. Die Pheromonsekretion konnte mithilfe von Pheromon-sensitiven Aktor-Zellen von S. cerevisiae nachgewiesen werden, die eine Pheromonantwort in diesen Kulturüberständen ausführten. Mithilfe des neu entwickelten Systems konnte die Pheromonsekretion der modifizierten Hefezellen ermittelt werden (6).

Bei Expression von MFα1 in S. pombe wurden Pheromonkonzentrationen im Bereich von 150–300 nM in den Kulturüberständen nachgewiesen, die innerhalb von 12 h Inkubation der Hefezellen akkumulierten (6). Nach 24 h Inkubation der Hefezellen in Minimalmedium wurden Pheromonkonzentrationen von etwa 0,9–1,5 µM ermittelt (Daten nicht gezeigt). Die Expression des chimären Gens map2/MFα1 in S. pombe hingegen führte zur Akkumulation von etwa 30–50 nM des α-Faktors innerhalb von 12 h bzw. von etwa 400–600 nM innerhalb von 24 h, während S. pombe Zellen, die einen leeren Vektor enthielten, keine Sekretion des α-Faktors aufwiesen (6). Damit konnte auch in den Kulturüberständen von S. pombe eine sensitive und selektive Detektion und Quantifizierung des α-Faktors gewährleistet werden.

Das modifizierte Verfahren konnte, zur Etablierung eines Ganzzellsensors, mit Sensor-Zellen von S. pombe kombiniert werden. Der nmt1-Promotor wird in S. pombe durch Thiamin (Vitamin B1) negativ reguliert, d. h. durch die Anwesenheit von Thiamin im Medium wird die Aktivität dieses Promotors unterdrückt. Dabei kann die Aktivität des nmt1-Promotors durch die exogene Zugabe von definierten Thiamin-Konzentrationen eingestellt werden. Diese Regulation konnte daher vorteilhaft eingesetzt werden um einen Ganzzellsensor für Thiamin zu entwickeln. Durch die Transformation mit einem Plasmid, welches das Gen MFα1 unter der Kontrolle des nmt1-Promotors enthielt, wurden Sensor-Zellen von S. pombe generiert. Die Sensor-Zellen wurden in Minimalmedium ohne Thiamin inkubiert, anschließend wurden die Zellen in frisches Minimalmedium mit Thiamin in verschiedenen Konzentrationen transferiert. Diese Kulturen wurden hinsichtlich der Pheromonsekretion mithilfe des inversen ELISA analysiert (7).

Durch die exogene Zugabe von Thiamin zu den Sensor-Zellen von S. pombe wurde die Sekretion des α-Faktors reduziert (7). Mit steigender Thiamin-Konzentration wurde dabei die Konzentration des sekretierten α-Faktors stärker reduziert. Dies kann auf die negative Regulation des nmt1-Promotors durch Thiamin zurückgeführt werden. Dieses Verfahren ermöglicht somit vorteilhaft eine sensitive Quantifizierung von Thiamin mithilfe eines Ganzzellsensors mit einem mobilen, intrinsisch verstärkten Signalmolekül.

Die 8 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur schnellen und sensitiven Detektion von mindestens einem Primärsignal mittels oberflächenfunktionalisierter Substrate.