Title:
VERFAHREN UND TESTKIT ZUR SCHNELLEN ISOLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN MITTELS RAUER OBERFLÄCHEN
Kind Code:
A1
Abstract:

Die Erfindung betriff ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben, dadurch gekennzeichnet, dass freie oder durch Lyse freigesetzte Nukleinsäuren – in Anwesenheit von organischen Substanzen sowie mindestens einem Bestandteil eines Lysepuffers – an eine feste Phase mit rauer Oberfläche angebunden werden, anschließend gewaschen und eluiert werden. Bei der rauen Oberfläche handelt es sich vorzugsweise um eine nicht-glatte Kunststoff- oder Gummi-Oberfläche. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Testkit und ein entsprechendes Gerät zur Isolierung von Nukleinsäuren.



Inventors:
Erfinder wird später genannt werden
Application Number:
DE102015216558A
Publication Date:
10/27/2016
Filing Date:
08/28/2015
Assignee:
AJ INNUSCREEN GMBH, 13125 (DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE20207793U1N/A2002-08-22
DE4321904A1N/A1995-01-12
DE4139664A1N/A1993-06-03
Foreign References:
52348091993-08-10
WO1995034569A11995-12-21
EP11354792001-09-26
Other References:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning"
Attorney, Agent or Firm:
Wehlan & Wehlan, Patentanwälte, 10367, Berlin, DE
Claims:
1. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben, dadurch gekennzeichnet, dass freie oder durch Lyse freigesetzte Nukleinsäuren – in Anwesenheit von organischen Substanzen sowie mindestens einem Bestandteil eines Lysepuffers – an eine feste Phase mit rauer Oberfläche angebunden werden, anschließend gewaschen und eluiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bestandteil eines Lysepuffers um
a) chaotrope oder nicht-chaotrope Salze und / oder
b) mindestens ein Detergenz und / oder
c) TRIS
handelt

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass weitere Zusätze, vorzugsweise eine Proteinase, enthalten sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der rauen Oberfläche um eine nicht-glatte Kunststoff- oder Gummi-Oberfläche handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-glatte Kunststoff-Oberfläche durch einen 3D-Druck oder durch Aufrauen eines Kunststoffs erzeugt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass raue Kompositmaterialien als feste Phase Verwendung finden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase angeraute Pipettenspitzen eingesetzt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass wasserlösliche organische Substanzen, vorzugsweise Alkohole oder Ketone, eingesetzt werden.

9. Testkit zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben, umfassend mindestens einen Bestandteil eines Lysepuffers, eine organische Substanz, mindestens eine feste Phase zur Anbindung der Nukleinsäuren mit rauer Oberfläche, sowie Wasch- und Elutionspuffer.

10. Verwendung von Materialien mit rauer Oberfläche zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben.

11. Gerät zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäure-enthaltenden Proben, dadurch gekennzeichnet, dass ein Material mit angerauter Oberfläche als feste Phase für eine Nukleinsäure-Anbindung fungiert.

Description:

Gegenstand der Erfindung ist ein völlig neuartiges, universelles, stark vereinfachtes sowie extrem schnelles Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäuren enthaltenden unterschiedlichsten Ausgangsmaterialien, welches sowohl eine sehr hohe Qualität der zu isolierenden Nukleinsäuren garantiert als auch die Isolierung extrem hoher Nukleinsäure-Ausbeuten ermöglicht. Das Verfahren kann sowohl manuell im Labor, unter Feldbedingungen als auch vollständig automatisiert durchgeführt werden. Es basiert auf der Anbindung von Nukleinsäuren an eine nicht-glatte Oberfläche.

Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/Chloroform-Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden (Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning").

Diese "klassischen Verfahren“ zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden auf Grund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.

Die nächste Verfahrensgeneration zur Isolierung von Nukleinsäuren basiert auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA-Bande enthaltenden Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln abgelöst. Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften angewendet und ist letztlich die Basis für fast alle kommerziell verfügbaren Kits zur manuellen wie auch automatisierten Isolierung von Nukleinsäuren. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von Patenten und Veröffentlichungen, die sich auf das Basisprinzip der Isolierung von Nukleinsäuren beziehen, welches von Vogelstein und Gillespie erstmals publiziert wurde und ggf. weitere Vorteile innehaben. Diese Varianten betreffen sowohl die Verwendung unterschiedlicher mineralischer Trägermaterialien als auch die Art der für die Bindung der Nukleinsäuren eingesetzten Puffer. Beispiele sind u.a. die Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze, bei welchen als Trägermaterial feingemahlene Glaspulver (BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa.Sigma) oder auch Silicagele bzw. Silcasuspensionen oder Glasfaserfilter oder mineralische Erden (DE 41 39 664 A1; US 5,234,809; WO-A 95/34569DE 4321904; DE 20207793) zum Einsatz kommen. All diese Patente basieren auf der Anbindung von Nukleinsäuren an ein mineralisches Trägermaterial auf der Basis von Glas oder Silizium unter Anwesenheit chaotroper Salzlösungen. In neueren Patentschriften wird offenbart, dass für die Adsorption von Nukleinsäuren an die dem Fachmann bekannten und eingesetzten mineralischen Materialien auch sogenannte antichaotrope Salze als Bestandteil von Lyse-/Bindungspuffer-Systemen sehr effizient und erfolgreich eingesetzt werden können (EP 1135479). Zusammenfassend kann man den Stand der Technik also dahingehend beschreiben, dass Nukleinsäuren an mineralische Materialien in Anwesenheit von Puffern, die chaotrope oder antichaotrope Salze enthalten oder auch in Anwesenheit von Puffern die Mischungen chaotroper und antichaotroper Salze enthalten, binden und auf diesem Wege dann auch isoliert werden können. Dabei gibt es auch Vorzugsvarianten, bei denen zusätzlich aliphatische Alkohole zur Bindungsvermittlung eingesetzt werden. Dem Fachmann ist auch bekannt, dass alle gängigen kommerziellen Produkte zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren auf dieser Grundlage basieren. Die eingesetzten mineralischen Träger liegen dabei in Form von losen Schüttungen, in Form von Filtermembranen oder auch in Form von Suspensionen vor. Für die Durchführung von automatisierten Extraktionsabläufen werden häufig paramagnetische oder magnetische Partikel eingesetzt. Dabei handelt es sich z.B. um silikatische Materialien, die einen magnetischen oder paramagnetischen Kern besitzen oder aber auch um Eisenoxydpartikel, deren Oberfläche so modifiziert wird, dass diese die für die Anbindung der Nukleinsäuren notwendigen Funktionalitäten tragen. Die Extraktionsabläufe zur Isolierung von Nukleinsäuren basieren dabei auch nach prinzipiell gleichen Schemata: Lyse der Ausgangsprobe zur Freisetzung der Nukleinsäure, binden der Nukleinsäure an das entsprechende mineralische Trägermaterial, waschen der gebundenen Nukleinsäure, Trocknung des Trägermaterials und finale Elution der gebundenen Nukleinsäure vom Trägermaterial. Auch wenn sich diese Verfahren bewährt haben, gibt es doch auch eine Reihe von Nachteilen. So ist die Bindungskapazität der eingesetzten Materialien begrenzt, insbesondere bei der Verwendung von Spinfiltermembranen. Wenn die Ausgangsprobe zu viel Nukleinsäure enthält, verstopfen Membranen auch oftmals. Die automatisierten Prozessabläufe unter Verwendung von magnetischen Partikeln sind relativ aufwendig und benötigen je nach Anwendung auch einen relativ hohen Zeitaufwand. Die einfache Durchführung einer Nukleinsäure-Isolierung unter Feldbedingungen ist nicht gegeben.

Aufgabe der Erfindung

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zu Grunde, die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen technischen Lösungen zu beseitigen.

Lösung der Aufgabe

Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren bereitgestellt, welches deutlich einfacher in der Durchführung ist als die bekannten Verfahren; welches es erlaubt, eine Nukleinsäure-Isolierung auch unter Feldbedingungen (und durch Nichtspezialisten) durchführen zu können, welches extrem schnell in der Durchführung ist – insbesondere im Kontext mit einer automatisierten Extraktion – und welches es erlaubt, extrem hohe Ausbeuten an Nukleinsäuren mit hoher Qualität zu isolieren. Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgaben in all den definierten Punkten. Der Kern der Erfindung ist, dass freie oder durch Lyse freigesetzte Nukleinsäuren, die mindestens einen Bestandteil eines Lysepuffers enthalten, vorzugsweise Salze – in Anwesenheit von organischen Substanzen – an eine feste Phase mit rauer Oberfläche angebunden werden, anschließend gewaschen und eluiert werden. De Begriff „raue Oberfläche“ ist so zu verstehen, dass durch Berühren der Oberfläche erkennbar ist, dass diese nicht glatt ist.

Der Erfindung lag folgende Beobachtung zu Grunde. Wenn man eine Nukleinsäure enthaltende Proben mit Extraktionsreagenzien von kommerziell verfügbaren Kits (z.B. innuPREP Blood DNA Kit/IPC16, Analytik Jena AG; DNeasy Blood & Tissue Kit; Fa. Qiagen) bearbeitet und man anstelle eines mineralischen Trägermaterials ein beliebiges nicht-glattes Plastikmaterial (beispielsweise angerautes Polypropylen) einsetzt und dieses in Kontakt mit der in Bearbeitung befindlichen Probe bringt, bindet Nukleinsäure an das Plastikmaterial. Die nachfolgenden Schritte des Waschens können mit bekannten alkoholhaltigen Waschpuffern oder auch nur mit einem Alkohol durchgeführt werden, ebenso können für die Elution bekannte Niedrigsalzpuffer oder auch Wasser eingesetzt werden. Der einzige Unterschied ist, dass anstelle des mineralischen Trägermaterials ein Plastikmaterial eingesetzt wird. Es zeigte sich schon nach den ersten Experimenten, dass damit alle Prozessschritte viel einfacher und schneller umgesetzt werden können. Es zeigt sich auch, dass dieser Effekt mit allen eingesetzten Plastikmaterialien zu beobachten war. Die Besonderheit bei all den durchgeführten Versuchen bestand aber anfangs darin, dass die verwendeten Plastikmaterialien auf einem 3D-Drucker gefertigt wurden. Dadurch wird die Oberfläche nicht glatt, sondern geriffelt – also rau, da sich beim 3D-Druck ein Körper bildet, der schichtförmig aufgebaut ist. Durchgeführt wurden die ersten Experimente dabei unter Nutzung eines Extraktionsautomaten (Thermo Electron), dem sog. Magnetpartikelprozessor KingFisher ml. Es handelt sich dabei um ein Gerät zur Extraktion von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel. Das Gerät verwendet dabei Plastikkämme, in welche Magnetstäbe einfahren, welche dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen und in die für eine Standardextraktion notwendigen Puffer eintauchen. Diese Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren zweckentfremdet eingesetzt. Dazu wurden mittels eines 3D-Druckers Hülsen aus verschiedenen Materialien gedruckt, welche dann auf die Plastikkämme aufgesteckt wurden. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzten Reagenzien wurden dabei z.B. teilweise aus dem kommerziell verfügbaren Extraktionskit (innuPREP Blood DNA Mini Kit/IPC16; Analytik Jena AG) genommen. Der Ablauf der Extraktion folgte folgendem workflow. Unter Verwendung des Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min. lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen vorbefüllt:

  • Kavität 1: 400 µl Isopropanol
  • Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit)
  • Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit)

Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zum dort schon vorliegenden Isopropanol gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Bei diesem Prozess bewegen sich die Plastikkämme sukzessive von Kavität 1 bis Kavität 5. Dabei erfolgt in jeder Kavität eine vertikale Bewegung der Plastikkämme in die jeweils vorliegende Pufferlösung. Der Extraktionsprozess basiert dabei auf den klassischen Prinzipien der Nukleinsäure-Isolierung unter Verwendung von magnetischen Partikeln. Es werden aber keine Partikel eingesetzt. In der Kavität 1 erfolgt die Bindung der Nukleinsäuren an den Plastikkamm mit den aufgesteckten Hülsen. Die gebundene Nukleinsäure wird sukzessive durch die Kavitäten 2–4 bewegt. Hier erfolgen die Waschschritte. Danach folgt ein kurzer Trocknungsschritt zur Entfernung von Ethanol. Final wird die Nukleinsäure in der Kavität 5 von den Plastikkämmen mit Hülsen abgelöst. Der Ablauf ist dabei deutlich vereinfacht, da keine Magnetpartikel prozessiert wurden. Das notwendige Sammeln der Magnetpartikel entfällt als Schritt, da ja keine Partikel für die Extraktion eingesetzt wurden. Dadurch war das Verfahren in ca. 15 min beendet. Wie schon aufgeführt, zeigte sich, dass mit allen eingesetzten Plastikmaterialien unter Verwendung einer kommerziell verfügbaren Extraktionschemie und unter Anwendung eines Standard-Extraktionsprotokolls Nukleinsäuren über die Anbindung an das eingesetzte Plastikmaterial isoliert werden können. Diese Beobachtungen waren überraschend. Es war zwar bekannt, dass Biomoleküle unspezifisch an Plastikmaterialien adsorbieren, dies aber aus wässrigen Lösungen, in denen sie vorliegen und dies auch nur in extrem geringen Mengen. Auch gibt es Beschreibungen, Plastikmaterialien für die Isolierung von Nukleinsäuren einzusetzen. Dies aber dadurch, dass man Plastikmaterialien chemisch an ihren Oberflächen so modifiziert, dass sie dieselben funktionalen Gruppen wie silikatische Materialien tragen (OH-Gruppen) oder auch andere funktionale Gruppen an Plastikoberflächen synthetisiert wurden (COOH-Gruppen). Dies ist z.B. in der Patentschrift EP 1135479 aufgeführt. Dem Fachmann ist aber auch bekannt, dass sich solche Mittel zur Isolierung von Nukleinsäuren nicht in der Praxis bewährt haben, da insbesondere die Bindungskapazität viel zu gering ist. Nach diesen ersten Experimenten konnte damit gezeigt werden, dass es möglich ist, mit den gedruckten Plastikhülsen Nukleinsäuren zu isolieren. Allerdings war nicht ersichtlich, warum dies möglich ist. Überraschenderweise konnte die Erklärung mit einem ganz einfachen Experiment gefunden werden. Verwendet wurde wiederum der KingFisher ml. Allerdings wurden bei diesem Versuch keine gedruckten Plastikhülsen eingesetzt. Die Standard-Plastikkämme, welche für die Magnetpartikelprozessierung eingesetzt werden, wurden eingesetzt. Dabei wurden einige Plastikkämme so verwendet, wie sie vorlagen und andere Kämme wurden mittels eines Graviergerätes an der Oberfläche aufgeraut. Es wurde – wie schon beschrieben – eine Extraktion aus Zellen mit denselben beschriebenen Reagenzien und demselben Ablauf durchgeführt. Die detaillierten Ergebnisse sind im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Das Experiment zeigt eindrucksvoll, dass an die unbehandelten Kämme keine Nukleinsäure bindet. Im Gegensatz dazu bindet Nukleinsäure hocheffizient an den aufgerauten Kämmen. Damit konnte der Beweis erbracht werden, dass man lediglich die Oberfläche von Plastikmaterialien aufrauen muss, um hocheffizient und unter Verwendung von Standard-Extraktionsreagenzien Nukleinsäuren zu isolieren. Die vorliegende Erfindung ermöglicht damit in idealster Weise die Umsetzung der schon aufgeführten Zielstellung. Für die Extraktion benötigt man lediglich ein Plastikmaterial, dessen Oberfläche aufgeraut ist. Als Extraktionsreagenzien können klassische Kitreagenzien unterschiedlicher Art verwendet werden. Ebenso arbeitet das Extraktionsprotokoll nach dem bekanntem Schema Lysieren-Binden-Waschen-Eluieren. Das Verfahren ist aber nunmehr extrem einfach und schnell in der Durchführung. Folgende Schritte sind notwendig:

  • 1. Lysieren einer Nukleinsäure enthaltenden Probe (oder Bereitstellen einer Nukleinsäure enthaltenden Probe). Dazu wird die Probe mit einem klassischen Lysepuffer oder einem Puffer versetzt, die man bisher aus Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren kennt. Diese Puffer können chaotrope Salze oder nichtchaotrope Salze oder Mischungen dieser beiden Gruppen enthalten. Darüber hinaus können diese Puffer weitere Komponenten enthalten wie Chealtbildner, Trispuffer, Netz- und Dispergiermittel etc. Das Verfahren funktioniert aber auch mit Puffern, welche keine Salze enthalten und z.B. nur aus einem Detergenz, Tris und EDTA bestehen. Zusätzlich können auch noch proteolytische Enzyme eingesetzt werden.
  • 2. Zugabe eines Bindungspuffers, welcher eine alkoholische Komponente und weitere Zusätze enthält oder Zugabe eines Alkohols allein oder auch Zugabe von Aceton oder Benzin.
  • 3. Inkontaktbringen dieser Mischung mit einem Plastikmaterial, dessen Oberfläche angeraut ist.
  • 4. Entfernen des Plastikmaterials aus der Mischung oder Entfernen der Mischung vom Plastikmaterial.
  • 5. Ggf. Waschen des Plastikmaterials.
  • 6. Ggf. Trocknung des Plastikmaterials.
  • 7. Ablösen der Nukleinsäure vom Plastikmaterial mit einem Elutionspuffer (Niedrigsalzpuffer oder Wasser).

Das Verfahren ist universell einsetzbar und kann sowohl automatisiert als auch manuell durchgeführt werden. Damit ist es auch in idealster Weise für den Einsatz einer Nukleinsäure-Extraktion unter Feldbedingungen nutzbar, da die notwendigen Schritte einfach durchführbar sind. Die einzusetzenden Plastikmaterialien sind ebenfalls nicht limitierend. Eingesetzt werden können auch sogenannte Kompositmaterialien, die Mischungen aus Polymeren und z.B. organischen Komponenten oder metallischen Komponenten darstellen. Wesentlich ist nur die Bereitstellung einer angerauten Oberfläche. Die Architektur des Plastikmaterials ist ebenfalls nicht limitierend. Beispielsweise kann auch eine Standardpipettenspitze an ihrer Innenseite gemäß der Erfindung aufgeraut werden und für die Extraktion von Nukleinsäuren manuell oder automatisiert eingesetzt werden. Dazu wird entsprechend des beschriebenen Extraktions-workflows mittels multipler Pipettierschritte das Extraktionsprotokoll sukzessive abgearbeitet. Dem Fachmann wird damit deutlich, wie extrem einfach mittels der vorliegenden Erfindung nunmehr eine Extraktion von Nukleinsäuren durchgeführt werden kann. Die vorliegende Erfindung zeigt einen weiteren enormen Vorteil. Enthält eine biologische Probe große Mengen an Nukleinsäuren, so kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Plastik eine extrem große Menge an Nukleinsäuren extrahiert werden. Dies Ausbeuten übersteigen dabei die erzielbaren Ausbeuten mit bekannten Extraktionsverfahren unter Verwendung von mineralischen Trägermaterialien um ein Vielfaches. Damit ist das Verfahren auch ideal für die Bearbeitung von großen Probenvolumina geeignet. Auch zeigt sich, dass sowohl genomische DNA, RNA als auch Plasmid DNA isoliert werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann als automatisierter Extraktionsprozess multiple Proben extrem schnell bearbeiten. Beispielhaft können mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter der zweckentfremdeten Verwendung des KingFisher ml, 15 Proben in 15 Minuten gleichzeitig bearbeitet werden. Auch kann dieses Verfahren ohne Verlust an Quantität und Qualität der zu isolierenden Nukleinsäure weiter verkürzt werden. Dies kann dann auch auf andere Automatenstationen übertragen werden. Z.B. kann die Extraktion auch in aufgerauten Pipettenspitzen mit allen gängigen Pipettierautomaten umgesetzt werden. Mit der Erfindung steht damit eine völlig neuartige Plattformtechnologie für die Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren zur Verfügung, welche eine Vielzahl von ganz deutlichen Vorteilen gegenüber den bekannten Extraktionsverfahren zeigt. Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Gerät zur Isolierung von Nukleinsäuren, umfassend angeraute Pipettenspitzen.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele stellen dabei keine Limitierung der Erfindung dar.

AusführungsbeispieleBeispiel 1. Nachweis der Bindung von Nukleinsäuren an rauen Oberflächen unter Nutzung einer kommerziell verfügbaren Extraktionschemie

Der Nachweis, dass Nukleinsäuren an raue Oberflächen binden und isoliert werden können, wurde wie folgt durchgeführt. Die Extraktion wurde dabei automatisiert umgesetzt. Zum Einsatz kam ein Magnetpartikelprozessor (KingFisher ml; Thermo Electron). Das Gerät verwendet Plastikkämme, in welche Magnetstäbe einfahren, welche dann in einem walk-away-Prozess Magnetpartikel bewegen, die für die Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Diese Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren zweckentfremdet eingesetzt und sollten der Bindung und nachfolgenden Extraktion der Nukleinsäure dienen. Das Plastikmaterial ist Polypropylen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die Plastikkämme mittels eines Schleifgerätes angeraut. Eingesetzt wurden ebenfalls unbehandelte Plastikkämme. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzte Extraktionschemie wurde dabei teilweise aus dem kommerziellen Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16X (Analytik Jena AG) genommen. Mittels eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen befüllt:

  • Kavität 1: 400 µl Isopropanol
  • Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit)
  • Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit)

Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zum dort schon vorliegenden Isopropanol gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Bei diesem Prozess bewegen sich die Plastikkämme sukzessive von Kavität 1 bis Kavität 5. Dabei erfolgt in jeder Kavität eine vertikale Bewegung der Plastikkämme innerhalb der jeweils vorliegenden Pufferlösung. Der Extraktionsprozess basiert dabei auf den klassischen Prinzipien der Nukleinsäureisolierung unter Verwendung von magnetischen Partikeln. Es werden aber keine Partikel eingesetzt. In der Kavität 1 erfolgt die Bindung der Nukleinsäuren an den Plastikkamm. Die gebundene Nukleinsäure wird sukzessive durch die Kavitäten 2–4 bewegt. Hier erfolgen die Waschschritte. Danach folgt ein kurzer Trocknungsschritt zur Entfernung von Ethanol. Final wird die Nukleinsäure in der Kavität 5 von den Plastikkämmen abgelöst. Wie schon aufgeführt, wurden dabei Plastikkämme eingesetzt, deren Oberfläche aufgeraut wurden sowie die ursprünglichen unbehandelten Plastikkämme. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben der Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:

Probe Konzentration (ng/µl) Ausbeute (µg) Ratio A260:A280Ratio A260:A230unbehandelter Plastikkamm 10 nicht messbar nicht messbar nicht messbarunbehandelter Plastikkamm 20 nicht messbar nicht messbar nicht messbaraufgerauter Plastikkamm 156 11,2 1,90 2,46aufgerauter Plastikkamm 260 12 1,86 2,30aufgerauter Plastikkamm 363 12,6 1,96 2,39

1 zeigt den Nachweis der DNA auf einem Agarosegel. Je Spur wurden 4 µl Nukleinsäure vom Gesamteluat von 200 µl eingesetzt. Die Spuren bedeuten:

  • 1. DNA Leiter (1b Leiter)
  • 2. unbehandelter Plastikkamm
  • 3. unbehandelter Plastikkamm
  • 4. aufgerauter Plastikkamm 1
  • 5. aufgerauter Plastikkamm 2
  • 6. Aufgerauter Plastikkamm 3

Wie die Ergebnisse eindrucksvoll zeigen, bindet die Nukleinsäure (sowohl DNA als auch RNA) an den unbehandelten Kämmen nicht. Sie bindet aber hocheffizient an den aufgerauten Kämmen und kann nachfolgend mit klassischen Waschpuffern gewaschen und final wieder von den Kämmen abgelöst werden. Damit entspricht der Prozess exakt den klassischen Abläufen der Isolierung von Nukleinsäuren mittels magnetischer Partikel oder mittels dem Fachmann bekannter mineralischer Trägermaterialien. Der Prozess ist aber sehr viel schneller und einfacher in der Durchführung. Mit diesem Beispiel wurde damit gezeigt, dass allein durch ein Anrauen einer Plastikoberfläche dieses Material für die Extraktion von Nukleinsäuren unter Verwendung bekannter Extraktionsreagenzien eingesetzt werden kann.

Beispiel 2: Testung unterschiedlicher Plastikmaterialien mit rauen Oberflächen für die Extraktion von Nukleinsäuren unter Nutzung einer kommerziell verfügbaren Extraktionschemie

Der Nachweis, dass Nukleinsäuren an raue Oberflächen von unterschiedlichen Plastikmaterialien binden und isoliert werden können, wurde wie folgt durchgeführt. Die Extraktion wurde dabei automatisiert umgesetzt. Zum Einsatz kam wieder der Magnetpartikelprozessor KingFisher ml. Die Plastikkämme wurden für das erfindungsgemäße Verfahren wieder zweckentfremdet eingesetzt. Als Material zur Bindung der Nukleinsäure diente wie im Ausführungsbeispiel 1 ein angerauter Plastikkamm. Als Kontrolle wurde ein nicht behandelter Kamm eingesetzt. Zur Testung anderer Materialien wurden mittels eines 3-D-Druckers Plastikringe aus unterschiedlichen Materialien hergestellt, welche wiederum auf die Kämme des KingFisher ml Gerätes gesteckt wurden. Auch diese Ringe wurden wieder mit einem Schleifgerät angeraut. Bei den unterschiedlichen Materialien handelte es sich um angeraute Kämme der Plastik des KingFisher ml (Polypropylen), des Weiteren um das Material Biofila Linen (Fa. TwoBEars), einem Kompositmaterial bestehend aus Lignin und einem Komplexpolymer aus aromatischen Alkoholen, um das Material Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS), das Material aus Polylaktit (PLA), um das Material Polycarbonat (PC) sowie das Material Polystyrol (PS). Die Kämme vom KingFisher ml wurden dabei unterschiedlich angeraut (Typ A: ca. 3 cm des Kammes, Typ B: ca. 1 cm des Kammes; C. nur die Spitze des Kammes). Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die für die Isolierung der Nukleinsäuren eingesetzte Extraktionschemie wurde wiederum teilwiese aus dem kommerziellen Extraktionskit innuPREP Blood DANN Kit/IPC16 (Analytik Jena AG) genommen. Unter Verwendung eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV) sowie von Proteinase K wurden die Zellen bei 60°C für 15 min lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen befüllt:

  • Kavität 1: 400 µl Isopropanol
  • Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit)
  • Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit)

Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zum dort schon vorliegenden Isopropanol gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Der Ablauf der Extraktion erfolgte wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Die Plastikkämme (unbehandelt bzw. angeraut) sowie die Plastikkämme mit den aufgesteckten Plastikringen wurden wiederum sukzessive durch die einzelnen Kavitäten mit den vorgelegten Pufferlösungen bewegt. Final wurde die Nukleinsäure in der Kavität 5 von den Plastikkämmen abgelöst. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben der Konzentration sowie Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:

Probe Konzentration (ng/ µl) Ausbeute (µg) Ratio A260:A280Ratio A260:A230unbehandelter Plastikkammkeine Nukleinsäure messbarnicht bestimmbarnicht bestimmbarnicht bestimmbaraufgerauter Plastikkamm Typ A84 16,8 1,91 1,98aufgerauter Plastikkamm Typ B95 19 1,92 2,01aufgerauter Plastikkamm Typ C75 15 1,90 2,11Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus BioFila178 35,6 1,95 2,22Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus ABS179 35,8 2,03 2,30Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA 205 41 1,94 1,98Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PC185 37 1,99 2,28Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PS157 31,4 1,96 2,32

2 zeigt den Nachweis der DNA auf einem Agarosegel. Je Spur wurden 4 µl Nukleinsäure vom Gesamteluat von 200 µl eingesetzt. Die Spuren zeigen:

  • 1. DNA Leiter (1b Leiter)
  • 2. unbehandelter Plastikkamm
  • 3. aufgerauter Plastikkamm Typ A
  • 4. aufgerauter Plastikkamm Typ B
  • 5. aufgerauter Plastikkamm Typ C
  • 6. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus BioFila
  • 7. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus ABS
  • 8. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA
  • 9. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PC
  • 10. Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PS

Wie die Ergebnisse zeigen, bindet die Nukleinsäure an den unbehandelten Kämmen nicht. Sie bindet aber hocheffizient an den aufgerauten Kämmen und den aufgerauten Ringen. Damit ist gezeigt, dass die Bindung unabhängig von der Materialart ist. Alle angerauten Materialien binden hocheffizient Nukleinsäuren. Es zeigt sich ebenfalls, dass die angeraute Fläche (im Falle der Kämme) sogar nur sehr gering sein muss, um Nukleinsäuren zu binden. Es zeigt sich aber auch, dass größere Flächen auch noch höhere Mengen an Nukleinsäuren binden (die Flächen bei den eingesetzten Ringen ist größer als die angerauten Oberflächen der Kämme). Die Qualität der Nukleinsäuren ist exzellent.

Beispiel 3: Vergleich eines klassischen Kits zur Isolierung von Nukleinsäuren mit dem erfindungsgemäßen Verfahren

Mit diesem Beispiel sollte der Vergleich zwischen einem klassischen Kit zur Isolierung von Nukleinsäuren mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Als Vergleichs Kit wurde der Kit DNeasy Blood&Tissue Kit der Fa. Qiagen eingesetzt. Dieser basiert auf der Lyse der Zellen, der Bindung der Nukleinsäuren an die Oberfläche einer Spin Filtersäule mit einer Silikamembran, dem nachfolgenden Waschen der gebundenen Nukleinsäure und der finalen Elution der Nukleinsäure von der Silikamembran. Dieses Kit ist ein Standard Kit zur Extraktion von Nukleinsäuren und wird weltweit dafür eingesetzt. Es wurde nach vorliegendem Manual gearbeitet.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wurde wiederum der KingFisher ml eingesetzt. Als raue Oberfläche wurden ein aufgerauter Kamm sowie ein auf den Kamm gesteckter Ring aus angerautem PLA eingesetzt. Der Ablauf der Extraktion mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgte wie in den beiden Ausführungsbeispielen 1 und 2 aufgeführt. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 bzw. 2 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben der Konzentration sowie Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:

Probe Konzentration (ng/ µl) Ausbeute (µg)Ratio A260:A280Ratio A260:A230Qiagen Kit (1 × 106 Zellen) 49 9,8 1,88 2,15Qiagen Kit(2 × 106 Zellen) 57 11,4 1,84 2,21aufgerauter Plastikkamm (1 × 106 Zellen)101 20,2 1,87 2,04aufgerauter Plastikkamm (2 × 106 Zellen)147 29,4 1,98 2,15Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA (1 × 106 Zellen)240 48 1,96 2,20Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA (2 × 106 Zellen)503 100,6 1,96 2,20

3 zeigt den Nachweis der DNA auf einem Agarosegel. Je Spur wurden 2 µl Nukleinsäure vom Gesamteluat von 200 µl eingesetzt. Die Spuren zeigen:

  • 1. DNA Leiter (1b Leiter)
  • 2. Qiagen Kit (ca. 1 × 106 Zellen)
  • 3. Qiagen Kit (ca. 2 × 106 Zellen)
  • 4. erfindungsgemäßes Verfahren; aufgerauter Plastikkamm (ca. 1 × 106 Zellen)
  • 5. erfindungsgemäßes Verfahren; aufgerauter Plastikkamm (ca. 2 × 106 Zellen)
  • 6. erfindungsgemäßes Verfahren; Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA (ca. 1 × 106 Zellen)
  • 7. erfindungsgemäßes Verfahren; Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA (ca. 2 × 106 Zellen)

Wie die Ergebnisse zeigen, kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine sehr viel höhere Menge an Nukleinsäuren gebunden und isoliert werden, als mit einem klassischen Kit. Damit sind die Bindungskapazitäten deutlich höher, als die Bindungskapazitäten eines kommerziell verfügbaren Silikamembran-Verfahrens. Dies unterstreicht den enormen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 4: Extraktion von Nukleinsäure aus Blut

Mit diesem Beispiel wird gezeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens auch aus Blutproben DNA isoliert werden kann und dabei die Ausbeuten extrem hoch sind. Eingesetzt wurden 3 ml Vollblutproben. Nach Lyse der Erythrozyten wurden die kernhaltigen Zellen pelletiert und wiederum nach Zugabe eines Lysepuffers (Lysepuffer CBV) aus dem kommerziell verfügbaren Kit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16 (Analytik Jena AG) sowie unter Zugabe von Proteinase K bei 60°C für 30 min lysiert. Eluiert wurde in 300 µl Elution Buffer.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wurde wiederum der KingFisher ml eingesetzt. Als raue Oberflächen wurde ein auf den Kamm gesteckter Ring aus angerautem Material BioFila sowie PLA eingesetzt. Der Ablauf der Extraktion mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgte wie in den Ausführungsbeispielen 1 bis 3 aufgeführt.

Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:

Probe Konzentration (ng/ µl) Ausbeute (µg)Ratio A260:A280Ratio A260:A230Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus Biofila270 81 1,78 2,22Plastikkamm mit aufgerautem Ring aus PLA306 91,8 1,80 2,22

Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, auch aus Vollblutproben zu isolieren, wobei die erzielbaren Ausbeuten extrem hoch sind.

Beispiel 5: Extraktion von Nukleinsäure aus NIH 3T3 Zellen sowie aus Vollblutproben mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung einer modifizierten Pipettenspitze

Mit diesem Beispiel wird gezeigt, dass mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens extrem einfach und schnell Nukleinsäuren mittels einer modifizierten Pipettenspitze isoliert werden können.

Als Pipettenspitze wurde eine 1ml Pipettenspitze der Fa. Sarstedt eingesetzt. Diese Pipettenspitze wurde um ca. 5 mm gekürzt. Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde dann die Innenseite der Pipettenspitze mittels eines Schleifgerätes aufgeraut.

Eingesetzt wurden 1 × 106 NIH 3T3 Zellen sowie 2 ml Vollblut (die Erythrozyten wurden lysiert und die kernhaltigen Zellen pelletiert und diese Zellen dann eingesetzt). Sowohl die Zellen als auch die pelletierten kernhaltigen Blutzellen wurden wie in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen behandelt und mit dem Lysepuffer CBV lysiert. Das Lysat wurde in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 400 µl Isopropanol versetzt. Nachfolgend wurde die aufgeraute Pipettenspitze eingesetzt und mittels einer Pipette wurde der Ansatz 20× auf- und abpipettiert. Danach wurden 3 weitere 2 ml-Reaktionsgefäße mit den bekannten alkoholischen Waschpuffern (LS, 80%iger Ethanol, 80%iger Ethanol) befüllt. Die Pipettenspitze wurde dann sukzessive in die jeweiligen Waschpuffer getaucht und es wurde jeweils 5× auf- und abpipettiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Spitze getrocknet und damit der restliche Ethanol entfernt. Die Elution der gebundenen Nukleinsäure erfolgte mit 200 µl Elution Buffer für die NIH 3T3 Zellen sowie mit 400 µl für die Vollblutprobe. Dieser wurde wiederum in ein 2 ml-Reaktionsgefäß gegeben. Es wurde 20× auf- und abpipettiert. Nach Entfernung der Pipettenspitze liegt die isolierte Nukleinsäure im Reaktionsgefäß vor. Das Verfahren ist extrem einfach und schnell.

Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:

Probe Konzentration (ng/ µl) Ausbeute (µg)Ratio A260:A280Ratio A260:A230ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen; unbehandelte Pipettenspitzekeine Nukleinsäure messbarnicht bestimmbarnicht bestimmbarnicht bestimmbarca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen; angeraute Pipettenspitze84 16,8 1,97 1,882 ml Vollblut (Lymphozytenpellet); unbehandelte Pipettenspitzekeine Nukleinsäure messbarnicht bestimmbarnicht bestimmbarnicht bestimmbar2ml Vollblut (Lymphozytenpellet); angeraute Pipettenspitze235 94,0 1,79 2,17

Wie die Ergebnisse zeigen, ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, allein unter Verwendung einer Pipettenspitze, deren Innenseite erfindungsgemäß aufgeraut wurde, Nukleinsäure zu Binden und zu isolieren. Auch hier zeigt sich, dass die Ausbeuten extrem hoch sind. Mittels der unbehandelten Pipettenspitze können keine Nukleinsäuren isoliert werden.

Beispiel 6: Testung unterschiedlicher Lysepuffer in Kombination mit unterschiedlichen alkoholischen bzw. nichtalkoholischen Lösungen zur Extraktion von Nukleinsäuren mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens

Eingesetzt wurde wiederum der Magnetpartikelprozessor KingFisher ml. Als Material zur Bindung der Nukleinsäure diente ein mit einem Schleifgerät angerauter Ring aus BioFila Material, welcher auf die Kämme der Plastik des KingFisher ml aufgesteckt wurden. Als Probe wurden jeweils ca. 1 × 106 NIH 3T3 Zellen verwendet. Die Lyse der Zellen wurde mit drei verschiedenen Puffern durchgeführt:

  • 1. Puffer A, enthaltend ein chaotropes Salz: Harnstoff, SDS, Tris HCl, EDTA
  • 2. Puffer B, enthaltend kein Salz: SDS; Tris HCl; EDTA
  • 3. Puffer C enthaltend ein nichtchaotropes Salz: Natriumchlorid, CTAB; Tris HCl, EDTA

Die Zellen wurden in 200 µl H2O resuspendiert und mit 200 µl des jeweiligen Lysepuffers sowie 20 µl versetzt und bei 60°C für 15 min lysiert. Während der Lyse wurde die Reaktionsplastik des KingFisher ml mit folgenden Lösungen befüllt:

  • Kavität 1: 400 µl Isopropanol oder absoluter Ethanol oder Aceton
  • Kavität 2: 800 µl Washing Solution LS (aus dem Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16)
  • Kavität 3: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 4: 800 µl 80% Ethanol
  • Kavität 5: 200 µl Elution Buffer (aus dem Extraktionskit innuPREP Blood DNA Kit/IPC16)

Nach erfolgter Lyse wurde das Lysat (400 µl) in die Kavität 1 zu dort schon vorliegenden verschiedenen Lösungen (Isopropanol; absoluter Ethanol bzw. Aceton) gegeben und der Extraktionsprozess gestartet. Der Ablauf der Extraktion erfolgte wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Der Nachweis der isolierten Nukleinsäure erfolgte mittels spektrophotometrischer Messung sowie auf einem Agarosegel. Neben Konzentration und Ausbeute wurde auch die Reinheit der isolierten Nukleinsäure bestimmt. Ergebnisse der spektrophotometrischen Vermessung:

Probe Konzentration (ng/ µl) Ausbeute (µg) Ratio A260:A280Ratio A260:A230Lysepuffer A + Isopropanol174 34,8 1,90 2,10Lysepuffer A + abs. Ethanol213 42,6 1,89 2,11Lysepuffer A + Aceton220 44 1,92 2,17Lysepuffer B + Isopropanol150 30 1,90 2,11Lysepuffer B + abs. Ethanol106 21,2 1,80 1,99Lysepuffer B + Aceton128 25,6 1,87 1,97Lysepuffer C + Isopropanol112 22,4 1,85 1,97Lysepuffer C + abs. Ethanol98 19,6 1,86 2,00Lysepuffer C + Aceton89 17,8 1,87 1,99

4 zeigt den Nachweis der DNA auf einem Agarosegel. Je Spur wurden 4 µl Nukleinsäure vom Gesamteluat von 200 µl eingesetzt. Die Spuren zeigen:

  • 1. DNA Leiter (1b Leiter)
  • 2. Lysepuffer A + Isopropanol
  • 3. Lysepuffer A + abs. Ethanol
  • 4. Lysepuffer A + Aceton
  • 5. Lysepuffer B + Isopropanol
  • 6. Lysepuffer B + abs. Ethanol
  • 7. Lysepuffer B + Aceton
  • 8. Lysepuffer C + Isopropanol
  • 9. Lysepuffer C + abs. Ethanol
  • 10. Lysepuffer C + Aceton

Wie die Ergebnisse zeigen, können für das erfindungsgemäße Verfahren unterschiedlich zusammengesetzte Lysepuffer wie auch Kombination dieser Lysepuffer mit Alkoholen bzw. auch mit einem Nichtalkohol eingesetzt werden. Dabei können im Lysepuffer chaotrope Salze, kein Salz oder aber nichtchaotrope Salze enthalten sein.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

  • DE 4139664 A1 [0004]
  • US 5234809 [0004]
  • WO 95/34569 A [0004]
  • DE 4321904 [0004]
  • DE 20207793 [0004]
  • EP 1135479 [0004, 0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, CSH, "Molecular Cloning" [0002]
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619 [0004]