Title:
Verfahren und Kit zur Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition (EMT) des Peritoneums
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition (EMT), z.B. mesothelial-mesenchymaler Transition (MMT), insbesondere EMT des Peritoneums, welche oft bei peritonealer Dialyse auftritt. Die Erfindung stellt ein Verfahren und ein auf Markern basierendes Kit zur Verfügung, welches mindestens ein extrazelluläres Matrixprotein, z.B. Collagen 13, Collagen 6, und/oder Keratin 34, und mindestens ein Protein, welches bei dem Aufbau und/oder der Restrukturierung von extrazellulärer Matrix eine Rolle spielt, z.B. Matrixmetalloproteinase 1, mindestens ein Protein, welches bei Zell-Zell und/oder Zell-Matrix-Kontakten eine Rolle spielt, z.B. Cadherin 13 oder Thrombospondin 1, mindestens einen Wachstumsfaktor, z.B. VEGF, und optional mindestens einen BMP Antagonisten, z.B. Gremlin 1, umfasst.




Inventors:
Steppan, Sonja, Dr. (63263, Neu-Isenburg, DE)
Lopez-Cabrera, Manuel, Dr. (Madrid, ES)
Aguilera, Abelardo, Dr. (Madrid, ES)
Selgas, Rafael, Dr. (Madrid, ES)
Plaßlick-Deetjen, Jutta, Dr. (77960, Seelbach, DE)
Büchel, Janine, Dr. (61350, Bad Homburg, DE)
Application Number:
DE102015115158A
Publication Date:
03/09/2017
Filing Date:
09/09/2015
Assignee:
Fresenius Medical Care Deutschland GmbH, 61352 (DE)



Foreign References:
WO2014139885A22014-09-18
WO2011054893A22011-05-12
WO2012042091A22012-04-05
201303035632013-11-14
201300209402013-01-24
Other References:
Selgas et al., 2006, Nephrol Dial Transplant 21 [Suppl 2]:ii2–ii7; Aroeira et al. 2007, J Am Soc Nephrol 18:2004–2013
Aroeira et al., 2007
Wingren et al., 2009, Methods Mol Biol. 509:57–84
Chaga et al., 2008, Methods Mol Biol. 441:129–51
Selgas et al., 2006
Aroeira et al., 2004
Lee et al. (2007, Investigative Ophthalmology & Visual Science September 2007, Vol.48, 4291–4299)
Lee et al., 2007
Attorney, Agent or Firm:
df-mp Dörries Frank-Molnia & Pohlman Patentanwälte Rechtsanwälte PartG mbB, 80333, München, DE
Claims:
1. Ein Kit zur Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition (EMT), umfassend Agentien zur Detektion von Markern in einer Probe, wobei die Marker umfassen
a) ein extrazelluläres Matrixprotein,
b) ein beim Aufbau und/oder der Restrukturierung von extrazellulärer Matrix involviertes Protein,
c) ein bei Zell-Zell-Kontakten und/oder Zell-Matrix-Kontakten involviertes Protein,
d) einen Wachstumsfaktor und, optional,
e) einen BMP-Antagonisten.

2. Ein Verfahren zur Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition (EMT), Schritte umfassend, bei denen man die Abwesenheit und/oder Menge einer Vielzahl von Markern in einer Probe detektiert, wobei die Marker umfassen
a) ein extrazelluläres Matrixprotein,
b) ein beim Aufbau und/oder der Restrukturierung von extrazellulärer Matrix involviertes Protein,
c) ein bei Zell-Zell-Kontakten und/oder Zell-Matrix-Kontakten involviertes Protein,
d) einen Wachstumsfaktor und, optional,
e) einen BMP-Antagonisten.

3. Das Kit nach Anspruch 1 oder das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Agentien zur Detektion der Marker in der Probe Antikörper oder Fragmente davon sind.

4. Das Kit nach Anspruch 1 oder 3 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 2–3, wobei die Agentien zur Detektion der Marker in der Probe mit einem festen Träger verbunden sind, wobei das Kit bevorzugt einen Antikörper-Chip umfasst.

5. Das Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–4 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 2–4, wobei das extrazelluläre Matrixprotein ein Keratin, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Keratin 34, und/oder ein Collagen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Collagen 13 und Collagen 6, ist, wobei die Marker bevorzugt die extrazellulären Matrixproteine Keratin 34, Collagen 13 und Collagen 6 umfassen.

6. Das Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–5 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 2–5, wobei das beim Aufbau und/oder der Restrukturierung von extrazellulärer Matrix involvierte Protein eine Matrixmetalloproteinase ausgewählt aus der Gruppe umfassend Matrixmetalloproteinase 1 ist.

7. Das Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–6 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 2–6, wobei das bei Zell-Zell-Kontakten und/oder Zell-Matrix-Kontakten involvierte Protein ein Cadherin, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cadherin 13, und/oder ein Thrombospondin, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Thrombospondin 1, ist, wobei die Marker bevorzugt Cadherin 13 und Thrombospondin 1 umfassen.

8. Das Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–7 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 2–7, wobei der Wachstumsfaktor VEGF ist.

9. Das Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–8 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 2–8, wobei der BMP-Antagonist Gremlin 1 ist.

10. Das Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–9 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 2–9, wobei die Marker Marker Cadherin 13, Collagen 13, Collagen 6, Keratin 34, Matrixmetalloproteinase 1, Thrombospondin 1, VEGF und Gremlin 1 sind.

11. Das Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–10 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 2–10, wobei eine gesteigerte Menge der Marker auf eine epithelial-mesenchymale Transition (EMT) hinweist.

12. Das Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–11 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 211, wobei die epithelial-mesenchymale Transition eine epithelial-mesenchymale Transition des Peritoneums ist, wobei die Probe bevorzugt von einem Peritonealdialyse-Patienten abgeleitet ist.

13. Das Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–12 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 2–12, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend
a) eine Probe eines Patienten, umfassend peritonealen Auslauf, peritoneale Flüssigkeit, Serum, peritoneales Gewebe, und
b) Kulturmedium oder Zelllysat einer Zell- oder Gewebekultur, welche als Modell für Peritonealdialyse nützlich ist.

14. Eine Verwendung des Kits nach einem der Ansprüche 1 oder 3–13 zur Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition, bevorzugt zur Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition des Peritoneums eines Peritonealdialyse-Patienten.

15. Ein Verfahren zur Vorhersage der epithelial-mesenchymalen Transition eines Gewebes, bevorzugt des Peritoneums eines Patienten, Schritte umfassend, bei denen man den Status des Gewebes des Patienten mit einem Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–13, und/oder mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2–13 analysiert.

16. Ein Verfahren zur Optimierung der Therapie eines Peritonealdialyse-Patienten, umfassend eine Analyse des Status des Peritoneums des Patienten mit einem Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–13 und/oder mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2–13, worin die Therapie an den Status des Peritoneums des Patienten angepasst wird.

17. Verfahren zum Testen einer Peritonealdialyse-Lösung, Schritte umfassend, bei denen man
a) ein Peritoneum oder eine Zell- oder eine Gewebekultur, welche als Modell eines Peritoneums dient, mit der Lösung in Kontakt bringt, und
b) den Status des Peritoneums oder der Zell- oder der Gewebekultur mit einem Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 3–13 und/oder mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2–13 analysiert..

Description:

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition (EMT), insbesondere von mesothelial-mesenchymaler Transition (MMT), insbesondere von EMT des Peritoneums, welche oft bei peritonealer Dialyse auftritt. Die Erfindung stellt ein Verfahren und ein auf Markern basierendes Kit zur Verfügung, welches mindestens ein extrazelluläres Matrixprotein, z.B. Collagen 13, Collagen 6, und/oder Keratin 34, und mindestens ein Protein, welches bei dem Aufbau und/oder der Restrukturierung von extrazellulärer Matrix eine Rolle spielt, z.B. Matrixmetalloproteinase 1, mindestens ein Protein, welches bei Zell-Zell und/oder Zell-Matrix-Kontakten eine Rolle spielt, z.B. Cadherin 13 oder Thrombospondin 1, mindestens einen Wachstumsfaktor, z.B. VEGF, und optional mindestens einen BMP Antagonisten, z.B. Gremlin 1, umfasst.

Peritoneale Dialyse (PD) ist eine effektive und günstige Alternative zur Hämodialyse (HD) bei der Behandlung des Endstadiums von Nierenerkrankung, was etwas 10–15% der Dialyse-Population betrifft. Während der PD wirkt die Peritonealmembran oder das Peritoneum als semipermeable Membran, über die Ultrafiltration und Diffusion stattfinden. Die langfristige Nutzung von PD ist jedoch noch begrenzt. Fast 50% der Patienten sind dazu gezwungen, innerhalb von vier oder fünf Jahren nach Beginn der PD-Behandlung zur Hämodialyse zu wechseln, da verlängerte Exposition gegenüber bioinkompatibler PD-Flüssigkeit, Peritonitis und Episoden mit Hämoperitoneum degenerative Änderungen des peritonealen Gewebes induzieren, welche schließlich zu einem Versagen der Ultrafiltration führen. Diese progressiven funktionellen und morphologischen Änderungen des Peritoneums können durch hohe Konzentrationen von Glucose, geringen pH-Wert und Laktatpuffer in der PD-Flüssigkeit ausgelöst werden, und werden widergespiegelt durch inflammatorische Reaktionen, graduelle Denudation der einlagigen Schicht mesothelialer Zellen (MC), submesotheliale Fibrose und Neoangiogenese.

Während langfristiger PD erfahren MC einen zunehmenden Verlust epithelialer Charakteristika und erwerben einen Myofibroblasten-artigen Phänotyp. Diese epithelial-mesenchymale Transition (EMT) ist ein komplexer und schrittweiser Prozess, welcher durch einen Verlust der apical-basolateralen Polarität, Störung von intrazellulären Verbindungen und Erwerb von migratorischen und invasiven Eigenschaften charakterisiert ist (Selgas et al., 2006, Nephrol Dial Transplant 21 [Suppl 2]:ii2–ii7; Aroeira et al. 2007, J Am Soc Nephrol 18:2004–2013). MCs, welche einer EMT unterliegen, erwerben die Fähigkeit, extrazelluläre Matrixkomponenten genau wie inflammatorische, fibrogene und angiogene Faktoren zu produzieren. Während des Ablaufs der EMT der Peritonealmembran werden peritoneale Fibrose und Angiogenese über die Hochregulation von Transformierendem Wachstumsfaktor (transforming growth factor) TGF-β1 und Vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (vascular endothelial growth factor, VEGF) ausgelöst.

Während bisher Änderungen des Peritoneum währen PD nicht vermieden werden können, kann optimierte Behandlung, z.B. mit biokompatiblen Lösungen oder einem anderen Behandlungsschema (z.B. Änderung des Füllungsvolumens und/oder der Verweilzeit) diese Änderungen zumindest verzögern. EMT ist, zumindest in frühen Stadien, ein reversibler Prozess. Ferner kann die Effizienz der PD Behandlung basierend auf dem Status des Peritoneums des Patienten optimiert werden.

EMT ist ein biologischer Prozess, welcher nicht nur bei Änderungen des Peritoneums während PD involviert ist, sondern auch bei Embryogenese und Wundheilung eine Rolle spielt. EMT kann auch Fibrose von Organen bewirken und eine Rolle bei Progression von Krebs und Metastasierung spielen. Es wurde auch gezeigt, dass EMT zur Pathogenese verschiedener Krankheiten beiträgt, z.B. Krebs oder degenerative fibrotische Störungen in unterschiedlichen Organen, einschließlich der Lunge (WO 2014/139885 A2).

WO 2014/139885 A2 lehrt, dass Matrixmetalloproteinase MMP10, zelluläres und lösliches Fibronectin, E-Cadherin und Vimentin Marker für EMT sind. Im Stand der Technik wurden mehrere weitere Marker für EMT oder allgemein Fibrose, welche mit EMT assoziiert ist, identifiziert. Zum Beispiel zeigt WO2011/054893 A2 eine Assoziation zwischen dem Niveau der TLR-9 Expression und Fibrose. WO2012/042091 lehrt ein Verfahren zum Bestimmen der Progression von Fibrose basierend auf der Bestimmung von TAK1. US 2013/0303563 A1 offenbart, dass Periostin, HSPG-Abbau, PDGF, Leptin und Dichte von CD68+ Makrophagen Marker für peritoneale Verletzung sind. US 2013/020940 A1 schlägt vor, dass eine Bestimmung von BMP9 oder BMP10 nützlich ist, um das Risiko einzuschätzen, eine fibrotische Störung zu entwickeln. Aroeira et al., 2007, lehren eine Abnahme der Expression von E-Cadherin, Cytokeratinen, Claudinen, Occludinen, Desmoplakin, ZO-1, Mucin-1, tPA und CD34, und eine Zunahme der Expression von N-Cadherin, Snail, Vimentin, TGF-β, Fibronectin, extrazellulären Matrixproteinen, insbesondere Collagen I und III, αSMA, FGF-1 und FGF-2, MMP-2 und MMP-9, FSP-1, PAI-1, VEGF und Cyclooxygenase-2 im Peritoneum von PD-Patienten.

Es bleibt jedoch ein Bedarf, Marker für EMT zur Verfügung zu stellen, welche genau mit der Funktion des Gewebes korrelieren, welches einer EMT unterliegt, z.B., mit der Filter-Kapazität des Peritoneums bei PD. Die Erfinder haben das Problem gelöst, solche Marker, ein entsprechendes Kit und ein Verfahren zur Diagnose von EMT zur Verfügung zu stellen. Der Gegenstand der Erfindung wird z.B. durch die angefügten Ansprüche beschrieben.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition (EMT) zur Verfügung, insbesondere von MMT oder, am meisten bevorzugt, EMT des Peritoneums, Schritte umfassend, bei denen man die Abwesenheit und/oder Menge einer Vielzahl von Markern in einer Probe detektiert, wobei die Marker umfassen

  • a) ein extrazelluläres Matrixprotein,
  • b) ein beim Aufbau und/oder der Restrukturierung von extrazellulärer Matrix involviertes Protein,
  • c) ein bei Zell-Zell-Kontakten und/oder Zell-Matrix-Kontakten involviertes Protein,
  • d) einen Wachstumsfaktor und, optional,
  • e) einen BMP-Antagonisten.

Im Rahmen der aktuellen Erfindung wird der Artikel “ein” so verstanden, dass er “ein oder mehr” bedeutet, sofern dies nicht explizit anders angegeben wird. Daher können z.B. die Marker auch zwei oder drei (oder mehr) extrazelluläre Matrixproteine oder zwei oder drei bei Zell-Zell-Kontakten und/oder Zell-Matrix-Kontakten involvierte Proteine umfassen.

Die Erfindung stellt auch ein entsprechendes Kit zur Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition (EMT) zur Verfügung, umfassend Agentien zur Detektion von Markern in einer Probe, wobei die Marker umfassen

  • a) ein extrazelluläres Matrixprotein,
  • b) ein beim Aufbau und/oder der Restrukturierung von extrazellulärer Matrix involviertes Protein,
  • c) ein bei Zell-Zell-Kontakten und/oder Zell-Matrix-Kontakten involviertes Protein,
  • d) einen Wachstumsfaktor und, optional,
  • e) einen BMP-Antagonisten.

Bevorzugt sind, wenn die Marker in Proteinform sind, die Agentien zur Detektion der Marker in der Probe Antikörper oder Fragmente davon. Antikörper sind zur Detektion der Marker in Proteinform geeignet.. Antikörper oder Fragmente davon können von humanem, Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Meerschweinchen-, Ziegen-, Katzen-, Vogel-, z.B., Huhn, oder chimärem Ursprung sein. Sie können polyklonal oder monoklonal oder durch Gentechnik hergestellt sein. Antikörperfragmente umfassen z.B. Fab-Fragmente, Fab2-Fragmente, scFv.

Alternativ können die Agentien zur Detektion der Marker in der Probe Nukleinsäuren sein, z.B., RNA oder DNA, welche zur Detektion der Marker in Nukleinsäureform geeignet sind, insbesondere zur Detektion von RNA Transkripten der Marker oder davon abgeleiteter cDNA. Die Nukleinsäuren sind bevorzugt zumindest teilweise einzelsträngig und sind dazu in der Lage, unter stringenten Bedingungen mit für die Marker kodierenden Nukleinsäuren zu hybridisieren.

Bevorzugt sind die Agentien zur Detektion der Marker in der Probe mit einem festen Träger verbunden, z.B. einem Chip, Kügelchen unterschiedlicher Größen, welche magnetisch sein können usw. Bevorzugt umfasst das Kit ein Mikroarray, insbesondere ein Mikroarray von Antikörpern, welches auch als Antikörper-Chip bezeichnet wird. Geeignete Antikörper-Chip-Formate, die an die Erfindung angepasst werden können, sind z.B. in Wingren et al., 2009, Methods Mol Biol. 509:57–84; Chaga et al., 2008, Methods Mol Biol. 441:129–51 offenbart oder können durch Firmen wie Abnova Corporation, R&D Systems, Full Moon BioSystems, Raybiotech, Inc., BioSims und andere maßgefertigt werden.

Die Erfinder haben die Genexpression von gesunden mesothelialen Zellen (erhalten aus dem Omentum von Patienten ohne Nierenversagen), epithelioiden Zellen (d.h. Zellen in den ersten Schritten einer EMT mesothelialer Zellen/MMT, mit einem Phänotyp ähnlich dem mesothelialer Zellen, erhalten aus dem Dialyse-Auslauf von PD-Patienten), und Zellen in einem fortgeschrittenen Stadium der EMT (d.h. Zellen, die ihren Phänotyp geändert haben, auch als nicht-epithelioide oder non-epithelioide Zellen bezeichnet). Es wurden mehrere Gene identifiziert, die signifikant und spezifisch hochreguliert wurden, sobald die Zellen den nicht-epithelioiden Phänotyp erworben haben. Ihre Expression und Korrelation mit Funktion wurde verifiziert, wobei die jeweiligen Protein-Niveaus in verschiedenen Körperflüssigkeiten, einschließlich Serum und Auslauf, getestet wurden. Die Erfinder fanden überraschenderweise, dass Marker aus mehreren funktionellen Gruppen eine wichtige Rolle bei der EMT spielen. Die Erfinder fanden ferner, dass sowohl RNA als auch Protein-Niveaus dieser Marker mit klinischen Parametern, die von den Patienten zur Verfügung stehen, korrelieren, und dass ihre Regulation funktionelle Schlussfolgerungen erlaubt. Insbesondere ermöglichen es die erfindungsgemäßen Marker, zwischen frühen und fortgeschrittenen Phasen der EMT zu unterscheiden. Z.B. erlauben die mRNA-Niveaus von CDH13, COL6A3, COL13A1, THBS1 und MMP1 eine Unterscheidung zwischen einer frühen und fortgeschrittenen Phase der EMT und korrelieren mit den klinischen Daten zu peritonealem Wassertransport / Ultrafiltration.

Mindestens einer, bevorzugt zwei oder drei der erfindungsgemäß analysierten Marker ist/sind ein extrazelluläres Matrixprotein. Es kann ein Keratin sein, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Keratin 34 (KRT34), und/oder ein Collagen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Collagen 13 (COL13A1) und Collagen 6 (COL6A1). Bevorzugt umfassen die Marker die extrazellulären Matrixproteine Keratin 34, Collagen 13 und Collagen 6. Alternative oder zusätzliche Marker aus der Grupper der extrazellulären Matrixproteine umfassen Collagen 1 und/oder 3 (Selgas et al., 2006, Aroeira et al., 2007).

Mindestens einer der erfindungsgemäß analysierten Marker ist ein beim Aufbau und/oder der Restrukturierung von extrazellulärer Matrix involviertes Protein. Es kann eine Matrix-Metalloproteinase sein, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Matrixmetalloproteinase 1 (MMP1). Alternative oder zusätzliche Marker aus der Gruppe von Proteinen, die beim Aufbau und/oder der Restrukturierung von extrazellulärer Matrix involviert sind, umfassen MMP2, MMP9 und/oder MMP10 (Selgas et al., 2006, Aroeira et al., 2007, US2013/0303563 A1, WO 2014/139885 A2).

Mindestens einer, bevorzugt zwei der erfindungsgemäß analysierten Marker ist/sind ein bei Zell-Zell-Kontakten und/oder Zell-Matrix-Kontakten involviertes Protein. Es kann sich um ein Cadherin handeln, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cadherin 13 (CDH13) und/oder ein Thrombospondin ausgewählt aus der Gruppe umfassend Thrombospondin 1 (THBS1 oder TPS1). Bevorzugt umfassen die Marker Cadherin 13 und Thrombospondin 1.

Alternative oder zusätzliche Markers aus der Gruppe von bei Zell-Zell-Kontakten und/oder Zell-Matrix-Kontakten involvierten Proteinen sind N-Cadherin, E-Cadherin (CDH1), CD44, Vimentin oder Fibronectin (Selgas et al., 2006, Aroeira et al., 2007).

Mindestens einer der erfindungsgemäß analysierten Marker ist ein Wachstumsfaktor, z.B. ein Angiogenese fördernder Wachstumsfaktor, wobei der Wachstumsfaktor bevorzugt Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (vascular endothelial growth factor), VEGF, ist. Selgas et al., 2006, und Aroeira et al., 2004 lehren eine Rolle für VEGF bei EMT. Alternative oder zusätzliche Markers aus der Gruppe von Wachstumsfaktoren sind TGF-β, FGF-1, FGF-2 (Aroeira et al., 2007).

Optional ist ein Marker, der erfindungsgemäß analysiert wird, ein BMP-Antagonist, bevorzugt, Gremlin 1 (auch bezeichnet als DAN Familien BMP Antagonist oder GREM). Lee et al. (2007, Investigative Ophthalmology & Visual Science September 2007, Vol.48, 4291–4299) lehrt, dass Gremlin 1 bei EMT in Bezug auf proliferative Vitreoretinopathie eine Rolle spielt. Bevorzugt wird der BMP-Antagonist, z.B. GREM in dem Überstand von Zellen bestimmt, die möglicherweise einer EMT unterliegen, insbesondere, Zellen aus dem Auslauf von PD Patienten. Die Erfinder haben gezeigt, dass die Expression von GREM in Auslauf nicht signifikant mit EMT assoziiert ist, so dass Analyse des Auslaufs keine Analyse eines BMP Antagonisten wie GREM einschließen muss.

Optionale weitere Marker schließen Gewebsfaktor-Weg-Inhibitor (Tissue Factor Pathway Inhibitor, TFI2), Thrombomodulin (THBD), Aquaporin 1 (AQP1) und/oder Kinase-Insert-Domänen-Rezeptor (Kinase Insert Domain Receptor, KDR) ein.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Marker Cadherin 13, Collagen 13, Collagen 6, Keratin 34, Matrixmetalloproteinase 1, Thrombospondin 1, VEGF und optional Gremlin 1.

Die Erfinder haben gezeigt, dass eine erhöhte Menge der oben diskutierten Marker auf eine epithelial-mesenchymale Transition (EMT) hinweist. Die Menge der Marker kann mit einer Kontrollprobe verglichen werden, z.B. eine von einem gesunden Subjekt genommenen Probe, z.B. einem nicht PD unterliegenden Menschen, bevorzugt einem Pool solcher Kontrollproben, welches Proben von mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 10 oder mindestens 20 gesunden Subjekten umfasst. Alternativ kann die Menge an Marker in der Probe unter Verwendung von Standards analysiert werden, und die Ergebnisse können mit von Kontrollproben oder einem Pool davon erhaltenen Ergebnissen verglichen werden.

Es ist auch möglich, die Menge an Marker des gleichen Subjekts zu zwei oder mehr Zeitpunkten zu analysieren, z.B. vor Behandlung (z.B. vor PD, wenn der Status des Peritoneums analysiert werden soll), nach Behandlung z.B. mit PD für bestimmte Zeiten, z.B. nach mindestens 1 Monat, nach mindestens 6 Monaten, nach mindestens 1 Jahr, nach mindestens 2 Jahren, mindestens 3 Jahren, mindestens 4 Jahren, mindestens 5 Jahren, mindestens 6 Jahren, mindestens 7 Jahren, mindestens 8 Jahren, mindestens 9 Jahren, mindestens 10 Jahren, mindestens 11 Jahren, mindestens 12 Jahren, mindestens 13 Jahren, mindestens 14 Jahren, mindestens 15 Jahren, oder mindestens 20 Jahren,. Da EMT reversible sein kann, kann eine Analyse auch nach einer Änderung in dem Behandlungsschema oder einer Änderung in der verwendeten PD-Flüssigkeit ausgeführt werden.

Bevorzugt ist im Rahmen der Erfindung epithelial-mesenchymale Transition epithelial-mesenchymale Transition des Peritoneums, wobei bevorzugt die Probe von einem Peritonealdialyse-Patienten stammt, z.B. einem PD-Patienten mit chronischer Nierenerkrankung. Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass der erfindungsgemäße Markersatz eine enge Assoziation mit der Funktion des Peritoneums zeigt, insbesondere der Effizienz der Filtration durch das Peritoneum.

Die PD kann z.B. CAPD (kontinuierliche ambulante Peritonealdialyse, continuous ambulatory peritoneal dialysis), oder CCPD (kontinuierliche zyklische PD, continuous cyclic PD), IPD (intermittierende PD, intermittent PD), oder NIPD (nächtliche intermittierende PD, nightly intermittent PD) sein.

Es kann auch von Interesse sein, EMT zu analysieren, welche eine Rolle bei der Embryogenese oder Wundheilung spielt. Eine Diagnose von EMT ist, zusätzlich zu PD, auch bei Krebs-Progression und Metastase von klinischer Relevanz, insbesondere bei Progression von Unterleibskrebs und peritonealer Metastasierung, oder bei degenerativen fibrotischen Störungen in verschiedenen Organen, einschließlich der Lunge (wie in WO 2014/139885 A2 offenbart), oder bei Bildung von nach-operativen peritonealen Verwachsungen. Allgemein kann EMT ein Marker für peritoneale Erkrankungen sein.

Die Probe kann von jeder biologischen Probe abgeleitet sein, welche potentiell einer EMT unterliegt. Zum Beispiel kann es eine Probe sein, die von einem Organ oder Gewebe abgeleitet ist, welches einer degenerativen fibrotischen Störung unterliegt. Sie kann eine Körperflüssigkeit eines Patienten sein, z.B., peritoneale Flüssigkeit, Blut, Serum oder Plasma eines Patienten. Wenn die Probe von einem PD Patienten stammt, ist die Probe bevorzugt ausgewählt aus peritonealem Auslauf (d.h. verwendetes peritoneales Dialysat), peritonealer Flüssigkeit, Serum, Plasma oder peritonealem Gewebe, oder sie kann davon abgeleitet sein, z.B., Überstand kultivierter Zellen aus dem peritonealen Auslauf. Die Erfinder haben gezeigt, dass unter Verwendung von peritonealem Auslauf hervorragende Ergebnisse erzielt werden können.

Die Probe kann auch ausgewählt sein aus Kulturmedium oder Zelllysat einer Zelle oder eines Gewebemodells, welche als Modell für EMT nützlich sind, z.B. als Modell für peritoneale Dialysis. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass ARPE-19 Zellen ein nützliches Modell für EMT sind (Lee et al., 2007). Ein alternatives Modell wäre z.B. ein Mausmodell der PD.

Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kits zur Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition zur Verfügung, bevorzugt zur Diagnose von epithelial-mesenchymaler Transition des Peritoneums eines Peritonealdialyse-Patienten. Der Status der EMT, insbesondere der Status des Peritoneums, kann unter Verwendung des Kits und des Verfahrens der Erfindung bestimmt werden, wobei es möglich ist, zwischen frühen und fortgeschrittenen Phasen zu unterscheiden.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Vorhersage der Progression von epithelial-mesenchymaler Transition eines Gewebes, bevorzugt des Peritoneums, eines Patienten zur Verfügung, umfassend eine Analyse des Status des Gewebes des Patienten mit einem Kit und/oder dem Verfahren der Erfindung. Das Gewebe kann auch ein Krebs sein, was damit eine Vorhersage der Progression und/oder Metastasierung des Krebses erlaubt.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Optimierung der Therapie eines Peritonealdialyse-Patienten zur Verfügung, umfassend eine Analyse des Status des Peritoneums des Patienten mit einem Kit und/oder dem Verfahren der Erfindung, worin die Therapie an den Status des Peritoneums des Patienten angepasst wird. Die Therapie kann auf eine Art angepasst werden, die eine längstmögliche Verwendung von Peritonealdialyse erlaubt, und/oder auf eine Art, welche die Effizienz der Peritonealdialyse optimiert.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Testen einer PD Lösung zur Verfügung, Schritte umfassend, bei denen man

  • a) ein Peritoneum oder eine Zell- oder eine Gewebekultur, welche als Modell eines Peritoneums dient, mit der PD Lösung in Kontakt bringt, und
  • b) den Status des Peritoneums oder der Zell- oder der Gewebekultur mit einem Kit und/oder Verfahren der Erfindung analysiert.

Das Verfahren zum Testen einer PD Lösung kann in vivo oder in vitro durchgeführt werden. Die Erfinder haben gezeigt, dass Expression von Aquaporin 1 (AQP1) mit der Verwendung von bioinkompatiblen PD Lösungen korreliert, so dass eine Analyse dieses Markers bevorzugt beim Testen von PD Lösungen eingeschlossen ist.

Die zitierte Literature wird durch die Bezugnahme hierin voll aufgenommen. Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Abbildungen, Beispiele und beispielhafte Ausführungsformen illustriert, welche die Erfindung beschränken nicht sollen.

Abbildungen

1 zeigt Expression von VEGF in Auslauf von Patienten, welche als E (Epithelioid) und NE (Non-Epithelioid) kategorisiert wurden, wobei das Protein mit Antikörpern quantifiziert wurde. Die Kategorisierung erfolgte auf Grundlage von Elliptischem Faktor (Elliptical Factor). Zwei Photographien wurden von jeder Zellkultur aufgenomen. Zehn Zellen wurden zufällig ausgewählt und die längste und kürzeste Achse der Zelle wurden gemessen und ein Verhältnis bestimmt. Der Durchschnitt jeder Kultur wurde berechnet, und wenn dieser Durchschnitt höher oder gleich 2 war (die Zelle also doppelt so lang wie breit war), wurde die Kultur als non-epitelioid klassifiziert, und ansonsten als epitelioid. Epithelioid = 12.73 ± 12.81 pg/ml (N = 20); Non-Epithelioid = 43.70 ± 6.181 pg/ml (N = 20)

2 zeigt Expression von GREM1 in Auslauf von Patienten, welche wie oben als E (Epithelioid) und NE (Non-Epithelioid) kategorisiert wurden, wobei das Protein mit Antikörpern quantifiziert wurde. Epithelioid = 0.4405 ± 0.3598 ng/ml (N = 20); Non-Epithelioid = 0.3555 ± 0.3756 ng/ml (N = 20)

3 zeigt Expression von Thrombospondin 1 in Auslauf von Patienten, welche wie oben als E (Epithelioid) und NE (Non-Epithelioid) kategorisiert wurden, wobei das Protein mit Antikörpern quantifiziert wurde. Epithelioid = 5.791 ± 7.669 ng/ml (N = 20); Non-Epithelioid = 66.62 ± 42.18 ng/ml (N = 20)

4 zeigt Expression von Thrombospondin 1 in Auslauf von Patienten, welche anhand Massen Transfer Koeffizienten von Creatinin (Cr-MTC) kategorisiert wurden, d.h., einem Parameter, um den Transport über das Bauchfell zu bestimmen, wobei das Protein mit Antikörpern quantifiziert wurde. Cr-MTC < 11 = 19.19 ± 26.11 ng/ml (N = 26); Cr-MTC > 11 = 67.81 ± 50.66 ng/ml (N = 14)

5 zeigt Expression von COL13 in Auslauf von Patienten, welche anhand von Elliptischem Faktor kategorisiert wurden, wobei das Protein mit Antikörpern quantifiziert wurde. Epithelioid = 166.4 ± 120.1 ng/ml, N = 33; Non-Epithelioid = 228.0 ± 132.4 ng/ml, N = 43

6 zeigt Expression von COL13 welche anhand Massen Transfer Koeffizienten von Creatinin (Cr-MTC) kategorisiert wurden, wobei das Protein mit Antikörpern quantifiziert wurde. Cr-MTC < 11 = 189.8 ± 132.8 ng/ml, N = 51; Cr-MTC > 11 = 243.8 ± 108.6 ng/ml, N = 23

Beispiele Beispiel 1

Differentielle Gen expressions-Studien wurden mit kultivierten mesothelialen Zellen durchgeführt, welche aus dem Auslauf von PD-Patienten abgeleitet waren. 9 Proben mit epithelioidem und 8 Proben mit non-epithelioidem Phänotyp, abgeleitet von PD Patienten, wurden mit einem Kontroll-Pool (mesotheliale Zellen, abgeleitet aus dem Omentum von vier verschiedenen gesunden Spendern) verglichen. Verschiedene Gruppen von induzierten oder unterdrückten Genen wurden erhalten und 40 Gene wurden mit RT-qPCR validiert. Ergebnisse für Untergruppen von 15 Genen sind in Tabelle 1 gezeigt. Ferner wurden Ergebnisse nach der Verwendung von biokompatiblen (z.B. BicaVera) und weniger biokompatiblen (“bioincompatible”) PD Flüssigkeiten (z.B. Stay-safe) gruppiert, wie in Tabelle II gezeigt. Tabelle III zeigt, dass die Verwendung von bioinkompatiblen PD Flüssigkeiten zu einer höheren Rate an EMT führt als die Verwendung von biokompatiblen PD Flüssigkeiten. Die Ergebnisse in Tabellen I und II zeigen die hohe funktionelle Signifikanz der erfindungsgemäßen Marker.

mRNA von CDH13, COL6A3, COL13A1, KRT34, MMP1, THBS1 (auch bezeichnet als TPS1), VEGFA und CDH1 zeigten einen statistischen Unterschied zwischen epithelioidem und non-epithelioidem Phänotypen und zwischen den charakteristischen bio-kompatiblen und bio-inkompatiblen PD Flüssigkeiten. CD44, TFI2, KDR und THBD zeigten einen signifikanten Unterschied zwischen epithelioidem und non-epithelioidem Phänotypen, und AQP1 unterschied sich zwischen bio-kompatiblen und bio-inkompatiblen PD Flüssigkeiten. Tabelle I: (mean: Durchschnitt, p-value: p-Wert)Tabelle II: (biocompatible: biokompatibel, bioincompatible: bioinkompatibel)Tabelle III: (total: gesamt)

Beispiel 2

Durch Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) wurde Protein in Überständen bestimmt, welche aus Kulturen mesothelialer Zellen abgeleitet aus Ausflüssen von 26 PD-Patienten erhalten wurden, verteilt wie folgt: 26 Proben genommen bei Beginn der PD Behandlung, 26 Proben genommen nach 12 Monaten, 20 Proben genommen nach 18 Monaten und 11 Proben genommen nach 24 Monaten (Daten nicht gezeigt). Mesotheliale Zellen wurden in Earle’s M199 Medium ergänzt mit 20% FBS und 50 U/ml Penicillin, 50 µg/ml Streptomycin und 2% Biogro-2 kultiviert. Wenn die Zellen Konfluenz erreichten, wurde das Medium für 24 Stunden durch frisches Medium ersetzt. Überstand wurde gesammelt und bis zur Verwendung bei –80ºC gelagert. Zur Analyse der Überständer wurde das Protein in dem Überstand mit dem Gesamtprotein in dem Zelllysat normalisiert. Ausgewählte Marker wurden mit ELISA analysiert. TSP1, VEGF, MMP2, CDH13 und GREM1 zeigten eine unterschiedliche Expression zwischen epithelioiden und non-epithelioiden Phänotypen, mit einer größeren Menge aller dieser Proteine bei der non-epithelioiden Gruppe.

Beispiel 3

40 Ausflüsse von PD-Patienten wurden mit ELISA analysiert und beispielhafte Daten für verschiedene Marker auf Proteinniveau werden hierin aufgenommen.

VEGF in Auslauf zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen epithelioiden und non-epithelioiden Phänotypen (1). Dies weist darauf hin, dass VEGF entsprechend dem Fortschreiten von EMT mesothelialer Zellen ansteigt. Massen Transfer Koeffizient (MTC) von Creatinin (Cr) ist ein klinischer Parameter, der den peritonealen Transportstatus beschreibt. Ein MTC über 11 ist charakteristisch für einen pathologischen peritonealen Transport. Wenn die Ergebnisse für VEGF in Auslauf nach MTC gruppiert wurden, wurde ein statistischer Unterschied zwischen Patienten mit einem MTC größer oder kleiner 11 beobachtet, und VEGF war in der Gruppe mit MTC > 11 höher. Somit kann VEGF in Auslauf verwendet werden, um den funktionellen Status der Peritonealmembran zu bestimmen. VEGF in Auslauf zeigte nach Gruppierung nach bio-inkompatiblen (aggressiveren Flüssigkeiten) und bio-kompatiblen PD Flüssigkeiten auch einen signifikanten Unterschied zwischen diesen Gruppen, mit mehr VEGF bei bio-inkompatibler Flüssigkeit.

GREM1 in Auslauf zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen epithelioiden und non-epithelioiden Phänotypen (2), mit einer größeren Proteinmenge in der epithelioiden Gruppe, aber der Unterschied in Überstand war signifikant, wobei beim non-epithelioide Phänotyp die größere Proteinmange vorlag. GREM1 in Auslauf zeigte einen statistischen Unterschied, wenn es nach MTC klassifiziert wurde, mit dem höheren Proteinniveau in der Gruppe mit MTC < 11. GREM1 zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen bio-inkompatiblen und bio-kompatiblen PD Flüssigkeiten.

TSP1 in Auslauf zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen epithelioiden und non-epithelioiden Phänotypen (3) und zwischen Gruppen mit MTC < 11 oder MTC > 11 (4). Somit weist TSP1 eine Beziehung zu dem Prozess der EMT von mesothelialen Zellen/MMT und dem Transport in der peritonealen Membran auf. TSP1 Protein in Auslauf zeigte keine Unterschiede zwischen bio-inkompatiblen und bio-kompatiblen PD Flüssigkeiten, aber der p-Wert (p = 0.16) weist auf eine Tendenz zur Signifikanz hin.

COL13 in Auslauf wurde auch analysiert und zeigte abhängig von Phänotypen und Creatinin-Transport Unterschiede.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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