Title:
Verfahren zum Nachweis von ß1-adrenergen Rezeptor-Autoantikörpern
Kind Code:
A1


Abstract:

Es wird ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegenüber β1-adrenergen Rezeptoren beansprucht, in welchem aus Blutplasma erhaltene Antikörper mit einem nativen, Fluorophor enthaltene β1-adrenerge Rezeptoren in Kontakt gebracht werden, und das Reaktionsprodukt anschließend mittels Durchflusszytometrie untersucht wird. Das Verfahren eignet sich in Prävention, Diagnostik, Therapieindikation, Therapiebegleitung sowie -kontrolle von Herzerkrankungen.




Inventors:
gleich Anmelder
Application Number:
DE102015114257A
Publication Date:
03/02/2017
Filing Date:
08/27/2015
Assignee:
Boege, Friedrich, Prof. Dr., 40589 (DE)
International Classes:



Other References:
Bornholz , Beatrice; Weidtkamp-Peters, Stefanie; Schmitmeier, Stephanie, Seidel, Claus A. M.; Herda, Lars R.; Felix, Stephan B.; Lemoine, Horst; Hescheler, Jürgen; Nguemo, Filomain; Schäfer, Christoph; Christensen, Morten O.; Mielke, Christian; Boege, Fritz:Impact of human autoantibodies on β1-adrenergic receptor conformation, activity, and internalization. Cardiovascular Research, 97 (3), 2013, S. 472-480
Bornholz, Beatrice; Roggenbuck, Dirk; Jahns, Roland; Boege, Fritz: Diagnostic and therapeutic aspects of β1-adrenergic receptor autoantibodies in human heart disease. Autoimmunity Reviews, Volume 13, Issue 9, 2014, S. 954-962
Attorney, Agent or Firm:
Bungartz Christophersen Partnerschaft mbB Patentanwälte, 40474, Düsseldorf, DE
Claims:
1. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegenüber β1-adrenergen Rezeptoren, in welchem aus Blutplasma erhaltene Antikörper mit einem nativen, Fluorophor enthaltene β1-adrenerge Rezeptoren in Kontakt gebracht werden, und das Reaktionsprodukt anschließend mittels Durchflusszytometrie untersucht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nativen β1-adrenergen Rezeptoren aus Zellen der Fibrosarkom-Zelllinie HT1080 sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass YFP-fusionierte β1-adrenerge Rezeptoren aus der Fibrosarkom-Zelllinie HT1080 über-exprimiert werden.

4. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluorophor ein Yellow fluorescent protein (YFP) ist.

5. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in der Prävention, Diagnostik, Therapieindikation, Therapiebegleitung sowie -kontrolle von Herzerkrankungen.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegenüber β1-adrenergen Rezeptoren unter Einsatz von nativen β1-adrenergen Rezeptoren und unter Verwendung der Durchflusszytometrie.

Antikörper gegen β1-adrenerge Rezeptoren (β1AR), die die kardiale cAMP-Produktion stimulieren, spielen eine kausale pathophysiologische Rolle bei verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen. Die Patienten können sich spezifischen Therapien unterziehen, wenn zuvor die Gegenwart von potentiellen herzschädlichen Antikörpern gegenüber β1-adrenergen Rezeptoren (im Folgenden β1AR-Antikörper) zuverlässig diagnostiziert wurde. Dies erfordert die Bestimmung von IgG-Interaktionen mit nativen β1AR, da β1AR-Antikörper auf ein konformatives Epitop abzielen, das nur unzureichend durch denaturierte Rezeptoren oder lineare Peptide dargestellt wird.

Es wurde festgestellt, dass agonistische β1AR-Antikörper bei Ratten, deren Gehalt durch Immunisierung erhöht wurde, Funktionsstörungen des Herzens und chronische Herzinsuffizienz verursachen. Beim Menschen werden agonistische β1AR-Autoantikörper in Verbindung gebracht mit einer Unterform der dilatativen Cardiomyopathie (im Folgenden DCM) und deren Nachweis bei DCM-Patienten ist ein starker Indikator für kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität. Agonistische β1AR-Autoantikörper wurden auch bei 10 bis 15% der Patienten mit ischämischer Cardiomyopathie und bei einer kleinen Zahl von gesunden Individuen gefunden. Die vorhandenen Studien über den Nachweis von β1AR-Autoantikörpern bei Patienten mit Herzerkrankungen und gesunden Personen zeigen sehr unterschiedliche Ergebnisse, was im Wesentlich an der Verwendung von nicht-standardisierten Nachweisverfahren liegt, die sich im Hinblick auf Sensitivität und Spezifität deutlich unterscheiden. Eine tatsächliche Prävelenz und die klinische Bedeutung von β1AR-Autoantikörpern bei Herzerkrankungen bei Menschen ist nach wie vor unbekannt.

Neue Therapieformen, die spezifisch gegen für das Herz schädliche β1AR-Autoantikörper gerichtet sind, umfassen die extrakorporale Absorption von IgG und die Neutralisation bzw. Ausschleusung von β1AR-Autoantikörpern durch systemische Verabreichung von synthetischen Epitopen. Man geht davon aus, dass DCM-Patienten mit reduzierter Herzfunktion von Therapien, die selektiv an β1AR-Autoantikörpern angreifen, nur profitieren, wenn sie β1AR-Autoantikörper in der Zirkulation aufweisen. Daher erfordert das Implementieren von Therapien, die spezifisch auf β1AR-Autoantikörper gerichtet sind, eine begleitende Diagnostik, die (i) die Selektion von Autoantikörper-positiven Patienten und (ii) das Überwachen der Gehalte an Autoantikörpern während der Therapie (Kontrolle des Therapie Ansprechens) und anschließenden Überwachung (Indikation für eine erneute Behandlung). Leider sind diagnostische Hilfsmittel für diesen Zweck derzeit nicht verfügbar, weil für das Herz schädliche β1AR-Autoantikörper an eine Unterstruktur des Rezeptormoleküls binden, die sich während der Rezeptoraktivierung verändert. β1AR-Autoantikörper binden an die aktive Form dieser Struktur und induzieren oder stabilisieren dadurch eine aktive oder aktivierte Form des Rezeptormoleküls. Aufgrund ihrer Interaktion mit einem labilen oder polymorphen Konformationsepitop reagieren β1AR-Autoantikörper nur schwach mit linearen synthetischen Peptiden oder denaturierten Formen der Zieldomäne. Demzufolge korrelieren Messungen, die auf Interaktionen zwischen linearen Peptid-Homologen der Target-Domäne beruhen kaum mit Messungen, die auf Interaktionen mit den nativen β1AR beruhen. Daher werden derzeit Peptid-basierte Immunassays nicht als verlässliche Hilfsmittel für die Bestimmung von klinisch relevanten β1AR-Autoantikörpern bei menschlichen Patienten angesehen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren für die Bestimmung von β1AR-Antikörpern zur Verfügung zu stellen, das insbesondere bei Patienten mit Herzinsuffizienz angewendet werden kann und sich als standardisiertes diagnostisches Verfahren eignet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen β1-adrenerge Rezeptoren, in welchem aus Blutplasma isolierte Antikörper mit nativen β1-adrenergen Rezeptoren in Kontakt gebracht werden und das Reaktionsprodukt anschließend mittels Durchflusszytometrie untersucht wird.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Werkzeug zur Verfügung gestellt, um tatsächliche Prävalenzen und den klinischen Einfluss von (Auto)Antikörpern gegenüber β1-adrenergen Rezeptoren zu bestimmen. Auch kann dieses Verfahren als diagnostisches Hilfsmittel für spezifische, an β1AR-Antikörpern angreifende Therapieverfahren, zur Therapieindikation und auch zur Therapiekontrolle eingesetzt werden.

Die Sensitivität und Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens für hohe Blutspiegel an β1AR-Antikörpern bei Patienten, die unter dilativer Kardiomyopathie leiden (n = 40, NYHA-Klassifikation III–IV) im Vergleich mit der gleichen Zahl von Gesunden beträgt > 90% und entspricht damit der von funktionalen Assays, die als sogenannter Goldstandard angesehen werden und ist erheblich besser als die bekannten Screening-Verfahren, in denen fixierte Zellen oder lineare Rezeptor-Peptide als Auto-Antigen-Targets eingesetzt werden. Es wurde auch festgestellt, dass zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens native β1AR eine wesentlich höhere Sensitivität zeigen als solche, in denen denaturierte oder synthetische Epitope eingesetzt werden. Als besonders geeignetes Auto-Antigen-Target haben sich native humane β1AR erwiesen, die in einer humanen Tumorzellinie (Fibrosarkom-Zelllinie HT1080, #DSMZ ACC 315, Braunschweig, Deutschland) nach stabilem Gentransfer konstitutiv überproduziert (überexprimiert) werden und durch Fusion mit einem fluoreszierenden Protein (Yellow fluorescent protein, YFP) fluoreszenzoptisch nachweisbar und quantifizierbar sind.

Die aus dem Blut der Patienten isolierten Antikörper werden in einem ersten Verfahrensschritt mit den β1AR in Kontakt gebracht. Dieses Inkontaktbringen erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Inkubation der β1AR-überexprimierenden Zellen mit den zu untersuchenden Präparationen von Patientenblut. Die darin enthaltenen β1AR-Antikörper vom IgG-Typ binden an die auf den Zellen präsentierten nativen β1AR-Eptitope und können durch Gegenfärbung mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern, die gegen IgG gerichtet sind, nachgewiesen und vermessen werden. Hierfür sind können verschiedene gängige Verfahren verwendet werden, z. B. Fluoreszenzmikroskopie oder Epifluorometrie.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden die Zellen vom Kulturuntergrund abgelöst und das Reaktionsprodukt wird mittels fluoreszenzaktivierter Durchflusszytometrie (im Folgenden FACS) quantifiziert. Dabei wird als natives β1AR ein solches eingesetzt, das ebenfalls Fluorophore enthält (z. B. mit dem Fluoreszenzprotein YFP fusioniert ist). In dieser Ausgestaltung ist es möglich, die Menge des gebundenen IgG mit der vorhandenen Menge an Auto-Antigen-Target in Beziehung zu setzen und dadurch zu besonders präzisen und standardisierbaren Messergebnissen zu gelangen. Eine weitere Präzisierung des Messverfahrens wird dadurch ermöglicht dass Zellen ohne YFP-fusionierten β1AR als interne Negativkontrolle beigemischt werden.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung mag etwas aufwendiger sein als die aus dem Stand der Technik bekannten Festphasen-Immonoassays zur Bestimmung von β1AR-Autoantikörpern. Die bekannten Verfahren, insbesondere Peptid-basiertes ELISA, zeigen eine unzureichende Sensitivität und auch eine sehr viel geringere Spezifität für den Nachweis von mit DCM-assoziierten β1AR-Autoantikörpern. Das Assay gemäß der vorliegenden Erfindung, das natürlichen menschlichen β1AR in Zelllinien einsetzt, ist sehr viel verlässlicher und bietet eine Grundvoraussetzung für eine valide und aussagekräftige Beurteilung von klinisch relevanten Blutspiegeln von β1AR-Antikörpern.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung des vorliegenden Verfahrens in der Prävention, Diagnostik, Therapieindikation, Therapiebegleitung sowie -kontrolle von Herzerkrankungen.

Die beigefügten Abbildungen zeigen

1 das Prinzip der Untersuchung und die durchgeführte Analytik;

2 die Ergebnisse der Diagnostik;

3 den Einfluss des Alters auf die Menge an β1AR-Autoantikörpern;

4 den Vergleich der neuen Methode mit einem etablierten Standardverfahren.

Beispiele

Methoden: Die GLP-konforme Messung von β1AR-Antikörpern basiert auf der selektiven IgG-Bindung an native HT1080-Zellen, die biofluoreszierendes menschliches β1AR überexprimieren oder nicht. Die Rezeptor-spezifische IgG-Bindung wurde abgeleitet aus der mittleren Fluoreszenzintensität von β1AR-positiven Zellen, die in Bezug auf die Hintergrundfärbung von β1AR-negativen Zellen, die jeder Messung beigemischt wurden, korrigiert wurden. Die Steigung der IgG-Bindungskurve zwischen zwei unterschiedlichen IgG Konzentrationen wurde als Maß für den Titer bzw. die Avidität der β1AR-Antikörper verwendet.

Nachfolgend beschreiben wir ein neues GLP-konformes Assay für die genaue und präzise Messung von β1AR-Autoantikörpern, das eine diagnostische Lücke schließt, da es einerseits auf einer in diagnostischen Laboratorien etablierten Messplattform basiert (FACS von nativen Zellen) und andererseits eine sensitive und spezifische Unterscheidung von DCM-Patienten von ähnlichen gesunden Personen leistet, die der von nicht Routinetauglichen funktionellen Assays gleichkommt und deutlich besser ist als Festphasen-Immunassays, die lineare Peptid-Homologe oder denaturierte Repräsentationen der Taget-Domain als auto-antigene Targets verwenden.

Zellen: Überexpression von YFP-fusionierten β1ARs in der humanen Fibrosarkom-Zelllinie HT1080 (#DSMZ ACC 315, Braunschweig, Deutschland) und Charakterisierung der überexprimierten Rezeptoren nach bekannten Verfahren. Die für die Assays verwendeten Zellklone exprimierten 2 bis 3 Mio. β1-adrenerge Bindungsstellen/-zellen. Die Expression blieb stabil über 50 Kulturzyklen mit einer Varianz von +/–20% zwischen den einzelnen Zyklen.

Endogene β1-adrenerge Bindungsstellen waren ausschließlich vom β2-Subtyp und trugen < 0,01% zum Komplementrezeptor bei.

Patienten/Proben: N = 49 DCM-Patienten (36 männliche, 4 weibliche, im Alter zwischen 35 und 73 Jahren, Durchschnittsalter 54 Jahre, NYHA-Klassen III–IV) wurden zufällig aus ambulanten Patienten während regelmäßiger Nachuntersuchungen ausgewählt. Zum Zeitpunkt der Entnahme der Blutproben befanden sich die Patienten unter Standard-Therapiebedingungen gemäß der aktuellen ESC/AHA-Richtlinien mehr als > 3 Monate in einem stabilen Zustand. Der LVEF betrug von 18 bis 38% (Mittelwert 30%) und der linksventrikuläre enddiastolische Durchmesser betrug zwischen 52 und 75 mm (Mittelwert 69 mm). Aktive Infektionen, bekannte Autoimmunerkrankungen, Krebs, chronischer Alkoholismus und/oder Herzerkrankungen mit bekannter Herkunft wurden ausgeschlossen, koronare Herzerkrankungen und akute Myokarditis wurden durch Angiografie ausgeschlossen und, wenn dies angezeigt war, durch endo-myokardiale Biopsie (bestimmt nach den Dallas-Kriterien). Gesunde Personen mit N = 40 sowie entsprechend Alter und Geschlecht angepasst oder jedwede klinische Symptome einer Herzerkrankung, normaler Echokardiografie oder Elektrokardiografie und/oder normalen Plasmaspiegel mit Troponin I und BNPs dienten als Vergleich. Die diagnostische Studie wurde durch die Ethikkommission der Universität Kreiswald anerkannt (Reg. Nr. III UV 34/04), alle Teilnehmer hatten ihr Einverständnis schriftlich erklärt.

Proben/Standards/Kontrollen

Proben von menschlichem Plasma oder Serum wurden bei –20°C gelagert. Für die Assays wurde IgG durch Mikro-Affinitätschromatografie (Protein A/G Agarose +, Peerce, Rockford, USA) extrahiert, auf einen pH 8 eingestellt und bei –20°C gelagert. Peptid-Antikörper von Kaninchen, die Kreuzreaktionen mit der N-terminalen Domain von menschlichem β1AR (BIOSS, Biotrend, Köln, Deutschland) dienten als Referenz für IgG gegen ein extra-zelluläres Epitop von menschlicher β1AR. Bona-fide-Kalibrator für das Herz schädigende β1AR-Autoantikörper wurden erhalten aus polyklonalen IgG von anti-β1AR-positiven Ratten, die einen kardiomyopathischen Phenotypen nach Immunisierung mit fusionierten Proteinen, die E. coli Glutation-S-Transferase umfassen und die extrazelluläre Schleife humanen β1AR. Sammelproben IgG von DCM-Patienten, die vorher einen hohen Level von agonistischen β1AR-Autoantikörpern zeigten, dienten als Positivkontrolle für DCM-assoziierte humane β1AR-Autoantikörper. Sammelproben von IgG von gesunden Personen (Privigen, CSL Plasma, Marburg, Deutschland), bei denen vorher nachgewiesen war, dass sie keine β1AR-Autoantikörper enthielten, wurden als Negativkontrolle verwendet.

Assays: Für die Messung der IgG-Bindung an native β1ARs wurden Zellen, die YFP-fusionierte humane β1AR überexprimieren, in 24-Wellplatten bis zu einer 80%igen Substratbedeckung angezüchtet und anschließend mit den zu untersuchenden IgG-Präparationen inkubiert (20 Minuten bei 37°C). Nach Ablösen der Zellen mit Accutase (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) wurde gebundenes IgG mit Alexa647-markierten sekundären Antikörpern (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) angefärbt und durch FACS quantifiziert (FACS CANTO II und FACS DIVA 6.0, Becton & Dickinson, Heidelberg, Deutschland). Grüne und rote Fluoreszenz wurde bei 488 und 633 nm angeregt und bei 515 bzw. 647 nm aufgezeichnet. In jeder Messung wurde die mittlere Fluoreszenzintensität von mehr als 105 Einzelzellen aufgenommen. Die Messungen bezogen sich auf intakte Einzelzellen (definiert unter Verwendung von Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht) und auf Zellpopulationen, die positiv und negativ innerhalb der 99%-Konfidenzintervalle der bimodalen logarythmisch-normalen Verteilungskurve der grünen Fluoreszenz reagieren (s. ). Die IgG-Bindung an zwei Zellpopulationen wurde aus der mittleren roten Fluoreszenz, die als kontinuierliche Variable eingesetzt wurde, abgeleitet. Für die Bestimmung der β1AR-Autoantikörper durch Peptid-ELISA wurde ein lineares Peptidhomologe der zweiten extra-zellulären Schleife des menschlichen β1AR (LMHWWRAESDEARRCYNDPKCCD) wurde auf eine 96-Well-Platte aufgebracht und die IgG-Bindung des immobilisierten Peptids wurde wie voranstehend beschrieben gemessen. Alternativ wurde ein handelsübliches Kit, das das gleiche Prinzip nutzt (CUSABIO Biotech, Wuhan, PR China) gemäß den Herstelleranweisungen verwendet. Die Konzentrationen von IgG, Troponin I und BNPs wurden durch anerkannte (akkreditierte) diagnostische Verfahren bestimmt.

Statistik: Ergebnisse der kontinuierlichen Variablen sind als Mittelwert ± SEM wiedergegeben. GraphPad PRISM Version 5.0f (GraphPad Software Inc., USA) wurde für die lineare Regression, für Sender/Empfänger-Beziehungen (ROC-Kurven) und entsprechende C-Statistiken, normale Datenverteilungsanalyse (Shapiro-Wilk-Test) und die Berechnung der Signifikanzen (Mann-Whitney-U-Test) verwendet. P-Werte < 0.05 wurden als signifikant angesehen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den 1 bis 4 dargestellt.

ist die mikroskopische Darstellung einer Mischung von HT1080 Wildtypzellen und HT1080-Zellen, die 5 Millionen YFP-fusionierte β1AR exprimieren. Die Zellmischung wurde mit 0,3 g/L einer β1AR-Autoantikörper-haltigen IgG-Präparation aus DCM-Patienten gefärbt. β1AR sind grün und β1AR-gebundenes IgG ist rot dargestellt. Der Maßstabsbalken im linken Bild (20 μm) gilt für alle drei Bilder.

1B) stellt ein repräsentatives Diagramm der FACS-Rohdaten von Zellen dar wie in (A). Horizontallinie: Trennungschwelle β1AR-positiver und -negativer Zellpopulationen entsprechend den Konfidenzintervallen (99%) der bimodalen log-normalen Intensitätsverteilung der Grünfluoreszenz. Pfeile: Prinzip der Bestimmung von ΔFg und ΔFr.

1C) zeigt ΔFr/g-Werte der Titrationskurven verschiedener IgG (Mittelwerte ± Standardfehler, n = 3). Gefüllte Quadrate: IgG von Kaninchen, das mit einem Peptidanalogon der N-terminalen Rezeptordomäne immunisiert worden ist; gefüllte Kreise: IgG von β1AR-Autoantikörper-positiven DCM-Patienten; ungefüllte Kreise: IgG von Gesunden; ungefüllte Quadrate: IgG, das eindeutig frei von β1AR-Autoantikörpern ist; Pfeil: nur Sekundärantikörper.

1D) gibt die Streuung von Tag zu Tag des Steigungskoeffizienten Δm(F) für IgG von β1AR-Autoantikörper-positiven DCM-Patienten (gefüllte Kreise) oder Gesunden (ungefüllte Kreise) oder für IgG frei von β1AR-Autoantikörpern (Quadrate). Gestrichelte Linien: Mittelwerte ± 10%.

1E) zeigt die Verdünnungslinearität: Δm(F) wurde mit Gesamtserum-IgG von Ratten kalibriert, die gene den zweiten Extrazellulärloop des menschlichen β1AR immunisiert waren. Der Kalibrator wurde in verschiedenen Konzentratioen einer Matrix von 0.3 g/L menschlichem IgG beigemischt, das frei von β1AR-Autoantikörpern ist (vergl. Quadrate in C and D), und mit FACS nachgemessen (gefüllte Kreise). Die gestrichelten Linien kennzeichnen den Erwartungskorridor (Mittelwert ±15%).

Die diagnostische Leistungsfähigkeit ist in 2 dargestellt. 2A und 2B) stellen die Bestimmung von β1AR-Autoantikörpern in IgG-Präparationen von DCM-Patienten (n = 40, gefüllte Kreise) und Gesunden (n = 40, ungefüllte Kreise) dar; gestrichelte Linien: Konfidenzintervall (95%) der Gesunden. A.) Δm(F)-Werte der Bindung von IgG an native β1AR bestimmt durch FACS.

2B) stellt die Bindung von IgG an ein immobilisiertes Peptidanalogon des zweiten Extrazellulärloops des humanen β1AR gemessen mit einem handelsüblichen ELISA (CusaBio Biotech, Wuhan, VR China) dar, dargestellt als optische Dichte korrigiert für Hintergrundfärbung in Abwesenheit von menschlichem IgG (OD-Probe – OD-Leerwert, Mittelwerte von Doppelmessungen).

2C) zeigt die Receiver Operator Characteristika (ROC) der Daten in (A) und (B) für die Unterscheidung von DCM-Patienten und Gesunden. Gefüllte Symbole: IgG-Bindung an native β1AR bestimmt durch FACS (Δm(F)-Werte wie in A). Ungefüllte Symbole: IgG-Bindung an immobilisierte Peptidanaloga des β1AR bestimmt durch ELISA (wie in B). Gestrichelte Linie: keine Unterscheidung. Einsatzdiagramm: Flächen unter den ROC-Kurven ± Konfidenzintervall (95%).

2D) zeigt den Einfluss von Proteindenaturierung (bzw. -Fixierung) auf die FACS Messung der IgG-Bindung an native β1AR (Δm(F)-Werte). Die Zellen wurden entweder native in den Test eingesetzt (links) oder mit 2% Paraformaldehyd vorbehandelt (10 min, 20°C) (right). Gefüllte Symbole: IgG von β1AR-Autoantikörper-positiven DCM-Patienten; ungefüllte Symbole: IgG von Gesunden; grau schattierte Symbole: menschliches IgG frei von β1AR-autoantikörpern. Mittelwerte ± Standardfehler, n = 3.

3 zeigt den Alterseinfluss auf die Spiegel von β1AR-Autoantiköpern. In 3A) sind die Δm(F)-Werte von DCM-Patienten (n = 40, gefüllte Kreise) und Gesunden (n = 40, ungefüllte Kreise) aufgetragen über das chronologische Alter der Donoren.

3B) zeigt ROC-Kurven der Unterscheidung von DCM-Patienten von Gesunden in den Alterskohorten 30–45 Jahre (ungefüllte Kreise), 46–60 Jahre (halb gefüllte Kreise) und 61–75 Jahre (gefüllte Kreise). Gestrichelte Linie bedeutet: keine Unterscheidung, In bedeuten die Flächen unter den ROC-Kurven ± Konfidenzintervall (95%). Die Unterschiede zwischen den drei Alterskohorten sind nicht signifikant.

4 zeigt den Vergleich von FACS und ELISA. β1AR. Autoantikörper wurden in DCM Patienten (n = 40, gefüllte Kreise) und Gesunden (n = 40, ungefüllte Kreise) bestimmt durch FACS (IgG Bindung an to native receptors, Δm(F)-Werte, y-Achse) oder Peptid-basierten ELISA (OD-Probe – OD-Leerwert, x-Achse). Es zeigt sich keine signifikante Korrelation der Werte.

zeigt repräsentative zweifarbige fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen eines Gemisches von HT1080-Zellen, die stabil 2–3 Millionen YFP-fusionierte β1AR/Zelle exprimieren und von der β1AR-negative Ausgangszelllinie HT1080. Das Zellgemisch wurde mit IgG von DCM-Patienten, bei denen man zuvor β1AR-Autoantikörper festgestellt hatte, eingefärbt. In den Zellen, die YFP-fusionierte β1AR überexprimierten, ist das Antikörper-abhängige Fluoreszenzsignal (rot) an allen Stellen mit dem YFP-Fluoreszenzsignal der überexprimierten β1AR (grün) co-lokalisiert, und beide Signale sind auf die Zelloberfläche beschränkt. Im Gegensatz dazu zeigen die β1AR-negativen HT1080-Zellen (Pfeile) keine YFP-Fluoreszenz auf der Zelloberfläche, die sich auf β1AR zurückführen lässt und zeigen lediglich eine schwache Hintergrundfärbung durch die β1AR-Autoantikörper aus DCM.

zeigt einen repräsentativen Ausdruck der Rohdaten einer entsprechenden FACS-Analyse. Rezeptor-positive und -negative Zellpopulationen sind entlang der Y-Achse aufgrund der β1AR-bezogenen YFP-Fluoreszenz (1B, P3 bzw. P4) getrennt und werden entlang der X-Achse in unterschiedlicher Weise durch die Intensität der roten Fluoreszenz, die auf die Menge der Zell-gebundenen IgG zurückzuführen ist, verschoben. Mittlere rote Fluoreszenzintensität der β1AR-positiven Zellpopulationen korrigiert durch Subtraktion der mittleren roten Fluoreszenzintensität der β1AR-negativen Zellpopulationen (ΔFr) dient als Maß für die Menge von IgG, die in einer β1AR-spezifischen Art an die Zellen gebunden ist. Mit anderen Worten wurde die rote Fluoreszenzintensität als kontinuierliche Variable verwendet, um die IgG-Bindung an β1AR-positive und -negative Zellpopulationen zu quantifizieren, die gemäß der bimodalen logarythmischen Normalverteilung der grünen Fluoreszenzintensität (, P3 und P4) unterschieden wurden. Der quantitative Unterschied in der mittleren grünen Fluoreszenzintensität (ΔFg) zwischen β1AR-positiven und -negativen Zellpopulationen wurde als interne Referenz für die mittlere Dichte der β1AR auf der Oberfläche der transfizierten Zellen verwendet. Auf diese Weise lieferte das Verhältnis von mittlerer roter und grüner Fluoreszenzintensität (ΔFr/g) ein Maß für die β1AR-spezifische IgG-Bindung, die unbeeinflusst ist durch die täglichen Schwankungen der Rezeptorexpression. Die Linearität von (ΔFr/g) wurde unter Verwendung von Kaninchen-Antikörpern gegenüber Peptidhomologen der N-endständigen Domain von menschlicher β1AR, gemischter IgG aus β1AR-Autoantikörper-positiven DCM-Patienten und zusammengefasster IgG von gesunden Personen. Eine handelsübliche Zubereitung von menschlicher IgG, die zuvor daraufhin überprüft wurde, dass sie keine β1AR-Autoantikörper enthielt, diente als Negativkontrolle. Die Negativkontrolle (, offene Quadrate) zeigte keine Konzentrations-abhängige Erhöhung des (ΔFr/g), während die anderen drei IgG-Zubereitungen einen Konzentrations-abhängigen Anstieg von ΔFr/g zeigten. Der Anstieg war sehr viel deutlicher für β1AR-spezifische Antikörper aus immunisierten Kaninchen (, vollflächige Quadrate) oder DCM-zugeordnete bona fide β1AR-Autoantikörper (, vollflächige Kreise) als bei IgG der gesunden Personen (, offene Kreise). Die unterschiedlichen Steigungen der IgG-Bindungs-Isothermen zeigen, dass IgG von gesunden Personen eine sehr viel geringere Avidität gegenüber der β1AR aufweist als die bona fide β1AR-Antikörper, die in DCM-Patienten oder immunisierten Nagetieren nachgewiesen werden können, was unsere vorherigen Beobachtungen bestätigt. Also wurden die Signale der IgG von Autoantikörper-positiven DCM-Patienten und voraussichtlich Autoantikörper-negative gesunden Personen deutlich voneinander bei 0.3 g IgG/L (und höheren Konzentrationen) getrennt, während bei Konzentrationen < 0.1 g IgG/L die beiden Kurven zusammenstießen. Der Assay-interne Streuungskoeffizient der Varianz ΔFr/g betrug 15% (n = 10). Jedoch war der Koeffizient der Varianz zwischen den Assays deutlich höher (> 40%), was auf die Schwankungen in der Stärke des Laserstrahls und in der Empfindlichkeit des Detektors zurückzuführen war. Zur Verringerung der Messstreuung von Tag zu Tag wurden die Messungen normalisiert auf einen Blindwert, der bei 0.01 g IgG/L erhalten wurde. Dieser Blindwert unterscheidet sich unwesentlich von der Negativkontrolle, die mit dem zweiten Antikörper allein (, ausgefüllter Kreis am Nullpunkt) erhalten wurde. Es wurde daraufhin der Anstieg von ΔFr/g zwischen 0.01 und 0.3 g IgG/L anstatt des absoluten ΔFr/g-Wertes bestimmt. Der Koeffizient Δm(F), der diesen Anstieg beschreibt, wurde aus den mittleren roten und grünen Fluoreszenzintensitäten der Rezeptor-positiven Zellen (β1AR) und der Rezeptor-negativen Mutterzellen (WT) bei 0.01 und 0.3 g IgG/L wie folgt bestimmt: mit ΔFr,g = mF(β1AR=Fig.1B,P3) – mF(WT=Fig.1B,P4)

Der Inter-Assay-Varianzkoeffizient von Δm(F) (bestimmt durch zehn aufeinanderfolgende Messungen an unterschiedlichen Tagen) betrug 15% innerhalb des pathologischen Bereiches, 7% am pathologisch/physiologischen Übergang (zur Definition wird auf verwiesen), und 17% an der unteren Nachweisgrenze (). Um die Verdünnungs-Linearität zu bestimmen, wurde Δm(F) in Bezug auf das Gesamtserum IgG von Ratten, in denen die kardio-pathogenen Mengen an β1AR-Antikörper durch Immunisierung induziert wurden, kalibriert. Unterschiedliche Konzentrationen dieser bona fide Herz-schädlichen Anti-β1AR IgG wurden in die β1AR-Autoantikörper-negative menschliche IgG-Matrix (Privigen) eingebracht und gemessen, wobei die Messergebnisse weniger als 10% von den erwarteten Werten abwischen (). Um den vorausgesagten Wert Δm(F) für die klinischen Bedingungen (”human chronical heart failure due to DCM”) zu bestimmen, wurden die Werte, die mit von DCM-Patienten (n = 40) isolierten IgG erhalten wurden, mit denen von entsprechend angepasst an Alter und Geschlecht von gesunden Personen (n = 40) verglichen. Alle Patienten waren klinisch in dem NYHA-Stadium III–IV und hatten linksventrikuläre Dilatation mit anderen Herzerkrankungen, die DCM ausschließt. In der an Alter und Geschlecht angepassten Kontrollgruppe wurden Herzfehler ausgeschlossen durch das Fehlen von herzspezifischen klinischen Symptomen, normaler Echokardiografie und/oder normalen Laborwerten der Herzmarker (Troponin I und BNPs). 70% (28/40) der DCM-Patienten hatten Δm(F)-Werte oberhalb der 95-%-Konfidenzgrenze der gesunden Kontrollgruppe, die als Cut-Off angesetzt wurde (p < 0,0001, ). ROC-Analyse (, D) zeigte, dass Δm(F) DCM-Patienten von der gesunden Kontrollgruppe abgrenzte mit einer Sensitivität und Spezifität von 80 bis 90% (Bereich 0.08938 ± 0.03779, p < 0,0001).

Zum Vergleich wurden die IgG-Präparate der DCM-Patienten und der gesunden Personen mit einem im Handel erhältlichen ELISA-Kit gemessen, das ein Peptid-homologes der zweiten extra-zellulären Schleife des menschlichen β1AR als antiautogenes Target verwendet. In diesem Fall zeigt nur einer von 40 DCM-Patienten eine IgG-Bindung an das synthetische β1AR-Autoepitop, die oberhalb der 95-%-Konfidenzgrenze der gesunden Kontrollgruppe lag (vgl. und ). Die ROC-Analyse (, D) zeigte, dass die Sensitivität und Spezifität des Peptid-basierten ELISA-Verfahren für β1AR-gerichtete IgG assoziiert mit DCM nur 50–60% (Fläche = 0,5561 ± 0,06595, p = 0,3975) betrug. Eine ähnlich geringe Unterscheidung zwischen DCM-Patienten und gesunden Personen wurde mit einem vergleichbaren Peptid-basierten ELISA erzielt, das nach eigenen publizierten Verfahren frisch hergestellt worden war (nicht gezeigt). Daher beruht die nicht zufriedenstellende Performance der Peptid-basierten ELISA höchstwahrscheinlich nicht auf falscher Handhabung oder auf alten nicht mehr aktiven Reagenzien, sondern auf der fehlenden Spezifität und/oder Sensitivität, die diesem Assay-Prinzip innewohnt. Unterstützt wird diese Vermutung durch die Feststellung, dass die quantitativen Daten der β1AR-Autoantikörper, die durch Peptid-basiertes ELISA bestimmt wurden, nur wenig mit den Bindungsdaten der gleichen IgG-Fraktionen, die mit FACS mit nativen β1AR-exprimierenden Zellen gemessen wurden, korrelierten (). Insbesondere, wenn Zellen vor der Inkubation mit menschlichem IgG mit 2% Para-Formaldehyd denaturiert wurden, wurden ähnlich geringe Δm(F)-Werte von DCM-Patienten und der gesunden Kontrollgruppe erzielt, die sich nicht signifikant von den Werten unterschieden, die mit IgG ohne β1AR-Autoantikörper erhalten wurden (). Ähnliche Effekte wurden beobachtet nach Zell-Fixierung mit 50% Methanol oder eiskaltem Aceton (nicht gezeigt).

Von vielen Autoimmunreaktionen ist bekannt, dass sie mit dem Alter zunehmen. Die Level der zirkulierenden β1AR-Autoantikörper, die bei unseren Patienten und der entsprechend angepassten Kontrollgruppe mittels Δm(F) untersucht wurden, zeigten keine signifikanten altersabhängigen Werte (). Das bedeutet, die Aussagekraft von Δm(F) in Bezug auf ausgewählte DCM-Patienten gegenüber gesunden Personen unterschied sich nicht signifikant innerhalb der Gruppen 31–45, 46–60 und 61–75 Jahre ( und C).