Title:
Neue Glutaminylcyclase-lnhibitoren
Document Type and Number:
Kind Code:
A1

Abstract:

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel (I) zur Verwendung als Glutaminylcyclase-Inhibitor, eine die Verbindung enthaltende Zusammensetzung zur Verwendung als QC-Inhibitor sowie Verfahren zur Herstellung.





Inventors:
Hielscher-Michael, Stephanie (06420, Könnern, DE)
Griehl, Carola (06112, Halle, DE)
Demuth, Hans-Ulrich (06120, Halle, DE)
Schilling, Stephan (06130, Halle, DE)
Wessjohann, Ludger (06120, Halle, DE)
Arnold, Norbert (06120, Halle, DE)
Application Number:
DE102015011780A
Publication Date:
03/16/2017
Filing Date:
09/16/2015
Assignee:
Hochschule Anhalt, 06366 (DE)
Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie (IPB), 06120 (DE)
International Classes:
C07H5/10; C12P19/02; A61K31/7024; A61K35/748; A61P25/28
Foreign References:
WO2014199297A12014-12-18
Other References:
BANSKOTA, Arjun H.; STEFANOVA, Roumiana; SPERKER, Sandra ; LALL, Santosh P.; CRAIGIE, James S.; HAFTING, Jeff T.; CRITCHLEY, Alan T.: Polar lipids from the marine macroalga Palmaria palmata inhibitlipopolysaccharide-induced nitric oxide production in RAW264.7macrophage cells. In: Phytochemistry 101 (2014), S. 101–108.
GUSTAFSON, Kirk R; CARDELLINA, John H.; FULLER, Richard W.; WEISLOW, Owen S.; KISER, Rebecca F.; SNADER, Kenneth M.; PATTERSON, Gregory M.; BOYD, Michael R.: AIDS-Antiviral Sulfolipids From Cyanobacteria (Blue-Green Algae). In: Journal of the National Cancer Institute 1989 81(16), S. 1254-1258.
OHTA, Keisuke [u.a.]: Action of a new mammalian DNA polymerase inhibitor,sulfoquinovosyldiacylglycerol.. In: Biological and Pharmaceutical Bulletin. 1999, Bd. 22, H. 2, S. 111-116. ISSN 1347-5215 (e); 0918-6158 (p).
OHTA, Keisuke [u.a.]: Sulfoquinovosyldiacylglycerol, KM043, a new potent inhibitor of eukaryotic DNA polymerases and HIV-reverse transcriptase type 1 from a marine red alga, Gigartina tenella. In: Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1998, Bd. 46, H. 4, S. 684-686. ISSN 1347-5223 (e); 0009-2363 (p). DOI: 10.1248/cpb.46.684.
PLOUGUERNE, Erwan; DE SOUZA, Lauro M.; SASSIKI, Guilherme L.; FIGUEIREDO CAVALCANTI, Jéssica; VILLELA ROMANOS, Maria Teresa; DA GAMA, Bernardo A. P.; CRESPO PEREIRA, Renato; BARRETO-BERGTER, Eliana: Antiviral Sulfoquinovosyldiacylglycerols (SQDGs) from the Brazilian Brown Seaweed Sargassum vulgare. In : Mar. Drugs 2013, 11, 4628-4640. - ISSN 1660-3397
WANG, Hui; LI, Yao-Lan; SHEN, Wei-Zai;RUI, Wen; MA, Xia-Jun; CEN, Ying-Zhou: Antiviral activity of a sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) compound isolated from the green alga Caulerpa racemosa. In: Botanica Marina 50 (2007), S. 185–190.
Attorney, Agent or Firm:
Boeters & Lieck, 80331, München, DE
Claims:
1. Verbindung der Formel (I): oder ein Salz derselben, zur Verwendung als Glutaminylcyclase(QC)-Inhibitor, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C1-C26 alkyl oder -C(=O)C2-C26 alkenyl ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C1-C26 alkyl oder -C(=O)C2-C26 alkenyl ist.

2. Die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C13-C20 alkyl oder -C(=O)C13-C21 alkenyl ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C13-C21 alkyl oder -C(=O)C13-C21 alkenyl ist.

3. Die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Eicosatetraenoyl- oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Eicosatetraenoyl- oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist.

4. Die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe: 1,2-di-O-palmitoyl -3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl, 1-O-palmitoyl-2-O-linolenyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl, 1-O-linolyl-2-O-palmitoyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl, 1-O-palmitoyl-3-O(6'-sulpho-α-quinovopyranosyl)-glycerol und 1-O-(6-Deoxy-6-sulphoglucopyranosyl)-glycerol.

5. Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung der Formel (I): oder ein Salz derselben, zur Verwendung als QC-Inhibitor, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C1-C26 alkyl oder -C(=O)C2-C26 alkenyl ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C1-C26 alkyl oder -C(=O)C2-C26 alkenyl ist.

6. Die Zusammensetzung zur Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die Zusammensetzung ein Extrakt aus einer Mikroalge ist.

7. Die Zusammensetzung zur Verwendung gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei die Zusammensetzung ferner ein Lösungsmittel enthält.

8. Die Zusammensetzung zur Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus: Methanol, Ethanol, Isopropanol, Wasser, Chloroform, Ethylacetat, Dichlormethan, Aceton, Diethylether, Hexan und Mischungen derselben.

9. Verfahren zur Herstellung einer in den Ansprüchen 1 bis 4 beschriebenen Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes derselben, umfassend:
(a) Kultivierung von mindestens einer Mikroalge;
(b) Gewinnung der Algenbiomasse und Aufschluss der Algenzellen;
(c) Extraktion der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) mit Methanol, umfassend die Suspension der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) in Methanol, das Rühren der Suspension, und die Abtrennung der flüssigen Methanol-Extraktphase von der Zellmasse;
(d1) Isolierung einer Verbindung der Formel (I), oder eines Salzes derselben, aus dem in Schritt (c) gewonnenen Extraktionsprodukt.

10. Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus einer Mikroalge, der mindestens eine in den Ansprüchen 1 bis 4 beschriebene Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, enthält, wobei das Verfahren umfasst:
(a) Kultivierung der Mikroalge;
(b) Gewinnung der Algenbiomasse und Aufschluss der Algenzellen;
(c) Extraktion der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) mit Methanol, umfassend die Suspension der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) in Methanol, das Rühren der Suspension, und die Abtrennung der flüssigen Methanol-Extraktphase von der Zellmasse;
(d2) Entfernung von Chlorophyll aus dem in Schritt (c) gewonnenen Extraktionsprodukt.

Description:
Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Verbindung zur Verwendung als Glutaminylcyclase(QC)-Inhibitor, eine die Verbindung enthaltende Zusammensetzung zur Verwendung als QC-Inhibitor sowie Verfahren zur Herstellung.

Stand der Technik

Die Glutaminylcyclasen (QCs) (EC 2.3.2.5) gehören zur Klasse der Acyltransferasen (EC 2.3.2). QC katalysiert die intramolekulare Zyklisierung N-terminaler L-Glutaminreste von Peptiden und Proteinen zu Pyroglutaminsäure (pGlu) unter Freisetzung von Ammoniak und die intramolekulare Zyklisierung von N-terminalem Glutamat zu Pyroglutaminsäure unter Freisetzung von Wasser. QC ist an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt und es konnte gezeigt werden, dass QC pathophysiologisch bei verschiedenen Krankheiten involviert ist. Entsprechend stellt QC ein pharmakologisch interessantes Target dar, da die Hemmung von QC als vielversprechende Möglichkeit zur Behandlung dieser QC-assoziierten Erkrankungen/Zustände angesehen wird.

Es sind bereits verschiedene QC-Inhibitoren bekannt. Beispielsweise wurden Thioharnstoff-Derivate und Imidazol-Propyl-Thioamide von Buchholz et al. (J Med Chem (52), 7069–7080; 2006) als effektive QC-Inhibitoren identifiziert. Weitere QC-Inhibitoren sind beispielsweise in WO 2011/029920; WO 2011/101433; WO 2011/107530; und WO 2011/110613 beschrieben. QC-Inhibitoren aus natürlichen Quellen sind bisher nicht bekannt.

Sulfolipide sind als biologisch aktive Naturstoffe bekannt. Die bisher für Sulfolipide beschriebenen Bioaktivitäten umfassen: immunosuppressive Wirkungen, antivirale Wirkungen (z. B. gegen HIV), antineoplastische Wirkungen, eine inhibierende Wirkung der enzymatischen Aktivitäten der DNA-Polymerasen pol α und pol β, der α-Glucosidase und der Caspase, anti-inflammatorische Aktivitäten (z. B. eine Wirkung bei entzündlichen Hauterkrankungen oder Erkrankungen wie insbesondere Psoriasis) und anti-proliferative Wirkungen auf verschiedene humane Krebszelllinien, eine prophylaktische Wirkung gegen eine Mykobakterium tuberculosum-Infektion, und eine antiprotozale Aktivität.

Ein häufiges Problem von Inhibitoren sind ihre Nebenwirkungen, wie beispielsweise Zytotoxizität. Auch das zunehmende Auftreten von Unverträglichkeiten gegenüber bestimmten Wirkstoffen oder Molekülbestandteilen stellt ein großes Problem dar. Entsprechend besteht ein großes Bedürfnis für Inhibitoren ohne zytotoxische Wirkung.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung neuer QC-Inhibitoren, die aus natürlichen Quellen stammen, keine zytotoxischen Wirkungen besitzen und in der Regel gut verträglich sind.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Verbindung zur Verwendung als Glutaminylcyclase-Inhibitor, eine die Verbindung enthaltende Zusammensetzung zur Verwendung als QC-Inhibitor sowie Verfahren zur Herstellung.

Hierzu stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (I): oder ein Salz derselben, zur Verwendung als Glutaminylcyclase(QC)-Inhibitor bereit, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C1-C26alkyl oder -C(=O)C2-C26 alkenyl ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C1-C26 alkyl oder -C(=O)C2-C26 alkenyl ist.

Der Ausdruck ”C1-C26 alkyl”, wie er hierin verwendet wird, steht für eine Alkylgruppe und bezeichnet eine gesättigte, geradkettige oder verzweigte, optional substituierte, Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 26 Kohlenstoffatome aufweist. Repräsentative ”C1-C26 alkyl” Reste sind, z. B. die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl- (oder Valeryl-), Hexyl- (oder Capron-), Heptyl- (oder Önanthyl-), Octyl- (oder Capryl-), Nonyl- (oder Pelargonyl-), Decyl- (oder Caprin-), Undecyl-; Dodecyl- (oder Lauryl-), Tridecyl-, Tetradecyl- (oder Myristyl-), Pentadecyl-, Hexadecyl- (oder Cetyl-), Heptadecyl-, Octadecyl- (oder Stearyl-); Nonadecyl-, Eicosyl-, Heneicosyl-, Doeicosyl-, Tricosyl-, Tetracosyl-, Pentacosyl-, Hexacosyl-, Isopropyl-, sec-Butyl-, Isobutyl-, tert-Butyl-, Isopentyl-, 2-Methylbutyl- und die 2-Methylhexyl-Gruppe.

Der Ausdruck ”-C2-C26 alkenyl”, wie er hierin verwendet wird, steht für eine Alkenylgruppe und bezeichnet eine zumindest teilweise ungesättigte, geradkettige oder verzweigte, optional substituierte Kohlenwasserstoffgruppe, die 2 bis 26 Kohlenstoffatome aufweist. Repräsentative ”-C2-C26 alkenyl” Reste sind, z. B. die Vinyl-, Allyl-, 1-Butenyl, 2-Butenyl-, -Isobutylenyl-, 1-Pentenyl-, 2-Pentenyl-, 3-Methyl-1-butenyl-, 2-Methyl-2-butenyl-, 2,3-Dimethyl-2-butenyl-ethenyl-, Hex-2-enyl-, 9-Hexadecenyl- (oder Palmitoleyl-), 9-Octadecenyl(Oleyl-), 11-Octadecenyl-, 9,12-Octadecadienyl (oder Linoleyl-), 6,9,12-Octadecatrienyl- (oder Linolenyl-), 5,8,11,14-Eicosatetraenyl oder 5,8,11,14,17-Eicosapentaenyl. Die Alkenylgruppen enthalten eine oder mehrere Doppelbindung(en), vorzugsweise 1, 2, 3, 4 oder 5 Doppelbindung(en).

Der Ausdruck ”optional substituiert”, wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Gruppen, in denen ein oder mehrere Wasserstoffatom(e) durch ein oder mehrere Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom (e), OH, =O, SH, =S, NH2, =NH, NO2, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2- -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -N3, -NH(R'), -N(R')2 oder -CN ersetzt ist/sind, vorzugsweise durch ein oder mehrere Fluor-, oder Chloratom(e), OH, C(O)R', -OC(O)R', oder -C(O)OR', stärker bevorzugt durch ein oder mehrere Fluor-, oder Chloratom(e), oder OH, wobei R' jeweils unabhängig ausgewählt ist aus unsubstituiertem C1-C3 alkyl.

Die Verbindung der Formel (I) kann in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung umfasst deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren sowie Mischungen derselben. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise, z. B. mittels Säulenchromatographie, isolieren.

Sofern die Verbindung der Formel (I) in tautomerer Form vorkommen kann, umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomere Formen.

Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindung der Formel (I) bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für physiologische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise als Forschungswerkzeug, in kosmetischen Anwendungen, oder für die Isolierung oder Reinigung der Verbindung oder anderer Moleküle verwendet werden können.

Physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindung der Formel (I) können Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z. B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure sein. Ferner können physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindung der Formel (I) auch Salze üblicher Basen umfassen, wie zum Beispiel Alkalimetallsalze (z. B. Natrium- und Kaliumsalze); Erdalkalisalze (z. B. Calcium- und Magnesiumsalze); und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.

Bevorzugt ist eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung als QC-Inhibitor, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C13-C20 alkyl oder -C(=O)C13-C21 alkenyl ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C13-C21 alkyl oder -C(=O)C13-C21 alkenyl ist.

Weiterhin bevorzugt ist eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung als QC-Inhibitor, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Eicosatetraenoyl- oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Eicosatetraenoyl- oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist.

Erfindungsgemäß bevorzugt kann die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung als QC-Inhibitor ausgewählt sein aus der Gruppe: 1,2-di-O-palmitoyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl, 1-O-palmitoyl-2-O-linolenyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl, 1-O-linolyl-2-O-palmitoyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl, 1-O-palmitoyl-3-O(6'-sulpho-α-quinovopyranosyl)-glycerol und 1-O-(6-Deoxy-6-sulphoglucopyranosyl)-glycerol.

Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung der Verbindung gemäß der Formel (I) oder einem Salz derselben, als QC-Inhibitor, wobei R1 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C1-C26 alkyl; oder -C(=O)C2-C26 alkenyl ist; und R2 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C1-C26 alkyl; oder -C(=O)C2-C26 alkenyl ist. Dabei kann bevorzugt eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, wobei R1 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C13-C20 alkyl, oder -C(=O)C13-C21 alkenyl; insbesondere ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Eicosatetraenoyl-, oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist; und R2 ein Wasserstoffatom, -C(=O)C13-C20 alkyl, oder -C(=O)C13-C21 alkenyl; insbesondere ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Eicosatetraenoyl-, oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist; als QC-Inhibitor verwendet werden. Insbesondere kann 1,2-di-O-palmitoyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl, 1-O-palmitoyl-2-O-linolenyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl, 1-O-linolyl-2-O-palmitoyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl, 1-O-palmitoyl-3-O(6'-sulpho-α-quinovopyranosyl)-glycerol, oder 1-O-(6-Deoxy-6-sulphoglucopyranosyl)-glycerol als QC-Inhibitor verwendet werden. Die Verwendung kann in vitro oder in vivo erfolgen. Eine Verwendung in vivo betrifft beispielsweise die Verbindung gemäß der Formel (I) oder einem Salz derselben, zur Verwendung bei der Prophylaxe oder Behandlung einer mit QC-assoziierten Krankheit. Jedoch sind bei der Verwendung in vivo Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers und Diagnostizierverfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen werden ausgeschlossen. Umfasst ist hingegen die Verwendung der Verbindung gemäß der Formel (I) oder einem Salz derselben, zur Herstellung eines Arzneimittels für eine Anwendung zur Prophylaxe oder Behandlung einer mit QC-assoziierten Krankheit.

Auch eine Zusammensetzung, umfassend eine der vorstehend genannten Verbindungen gemäß der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung als QC-Inhibitor ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise kann die Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß der Formel (I) oder ein Salz derselben, umfasst, ein Extrakt aus einer Mikroalge sein. Zur Gewinnung des Extrakts eignen sich beispielsweise Mikroalgen der Spezies: Scenedesmus sp., z. B. Scenedesmus productocapitatus, Scenedesmus rubescens, Scenedesmus acuminatus Scenedesmus vacuolatus und Scenedesmus pectinatus sowie Tetradesmus wisconsinensis; Eustigmatos sp., z. B. Eustigmatos magnus, Cyclotella sp., Odontella sp., Synechocystis sp., Spirulina sp., z. B. Spirulina maxima und Spirulina platensis; Prochlorococcus sp., Synechococcus sp., Trichodesmium erythraeum, Arthrospira platensis, Scytonema hofmanni, Nostoc punctiforme, Microcystis aeruguinosa, Stephanodiscus sp., Skeletonema costatum, Phaeodactylum tricornutum, Heterosigma carterae, Nannochloropsis sp., z. B. Nannochloropsis oculata, Porphyridium sp., z. B. Porphyridium cruentum und Porphyridium purpureum; Chilomonas paramecium, Bumilleriopsis filiformis, Emiliana huxleyi, Chlorella sp., z. B. Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana, Chlorella variegate, Chlorella kessleri, Chlorella minutissima und Muriella zofingiensis; Chloroidium saccharophilum, Parietochloris incisa, Prototheca portoricensis, Dictyochloris fragrans, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliella parva, Tetraselmis chuii und Deasonia sp. z. B. Deasonia punctata und Deasonia granata; und besonders bevorzugte Beispiele für den Mikroalgen-Extrakt umfassen Extrakte, die aus einer Spezies, welche ausgewählt ist aus Scenedesmus acuminatus, Scenedesmus pectinatus, Chlorella vulgaris und Spirulina platensis, gewonnen werden können.

Die Zusammensetzung bzw. der Mikroalgen-Extrakt zur Verwendung als QC-Inhibitor kann ferner ein Lösungsmittel enthalten. Das Lösungsmittel kann beispielsweise ausgewählt sein aus: Methanol, Ethanol, Isopropanol, Wasser, Chloroform, Ethylacetat, Dichlormethan, Aceton, Diethylether, Hexan, und Mischungen derselben; vorzugsweise Methanol.

Die Zusammensetzung bzw. der Mikroalgen-Extrakt zur Verwendung als QC-Inhibitor kann auch eine pharmakologisch inerte, anorganische oder organische Arzneimittelträgersubstanz enthalten, wie z. B. Mannit, Lactose, Sucrose, Glucose, Gelatine, Malz, Silicagel, Stärke oder Derivaten derselben, Talkum, Stearinsäure oder ihre Salze, Trockenmagermilch, pflanzliche öle, Petroleum, tierische oder synthetische öle, Wachse, Fette, Polyole. Ferner kann die Zusammensetzung bzw. der Mikroalgen-Extrakt zur Verwendung als QC-Inhibitor auch Zusatzstoffe zur Konservierung, Stabilisierung, Emulgatoren, Süßstoffe, Aromastoffe, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks, Puffer, Umhüllungszusatzstoffe und Antioxidantien enthalten.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) gemäß den vorstehenden Ausführungen, oder eines Salzes derselben, umfassend:

  • (a) Kultivierung von mindestens einer Mikroalge;
  • (b) Gewinnung der Algenbiomasse und Aufschluss der Algenzellen;
  • (c) Extraktion der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) mit Methanol, umfassend die Suspension der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) in Methanol, das Rühren der Suspension, und die Abtrennung der flüssigen Methanol-Extraktphase von der Zellmasse;
  • (d1) Isolierung einer Verbindung der Formel (I), oder eines Salzes derselben, aus dem in Schritt (c) gewonnenen Extraktionsprodukt.

In dem Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) kann als Mikroalge jede Mikroalge, die Verbindungen der Formel (I) als Sekundärmetabolit oder Sekundärmetaboliten produziert, oder eine Mischung von derartigen Mikroalgen eingesetzt werden, beispielsweise eine Mikroalge der Phyla Bacillariophyta, Chlorophyta, Ochrophyta und Cyanobacteria, und vorzugsweise der Spezies: Scenedesmus sp., z. B. Scenedesmus producto-capitatus, Scenedesmus rubescens, Scenedesmus acuminatus Scenedesmus vacuolatus und Scenedesmus pectinatus sowie Tetradesmus wisconsinensis; Eustigmatos sp., z. B. Eustigmatos magnus, Cyclotella sp., Odontella sp., Synechocystis sp., Spirulina sp., z. B. Spirulina maxima und Spirulina platensis; Prochlorococcus sp., Synechococcus sp., Trichodesmium erythraeum, Arthrospira platensis, Scytonema hofmanni, Nostoc punctiforme, Microcystis aeruguinosa, Stephanodiscus sp., Skeletonema costatum, Phaeodactylum tricornutum, Heterosigma carterae, Nannochloropsis sp., z. B. Nannochloropsis oculata, Porphyridium sp., z. B. Porphyridium cruentum und Porphyridium purpureum; Chilomonas paramecium, Bumilleriopsis filiformis, Emiliana huxleyi, Chlorella sp., z. B. Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana, Chlorella variegate, Chlorella kessleri, Chlorella minutissima und Muriella zofingiensis; Chloroidium saccharophilum, Parietochloris incisa, Prototheca portoricensis, Dictyochloris fragrans, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliella parva, Tetraselmis chuii und Deasonia sp. z. B. Deasonia punctata und Deasonia granata; und besonders bevorzugt Scenedesmus acuminatus, Scenedesmus pectinatus, Chlorella vulgaris und Spirulina platensis.

Die Kultivierung der Mikroalge(n) gemäß Schritt (a) kann unter bekannten Bedingungen erfolgen, beispielsweise in einem Photobioreaktor, pH 5–8 (vorzugsweise pH 7), und einer Temperatur von 10–45°C, vorzugsweise 20–40°C, stärker bevorzugt 23–35°C, und besonders bevorzugt 25–31°C. Als Medium für die Kultivierung der Mikroalge eignen sich bekannte Medien, wie beispielsweise Setlik-Medium (KNO3 (2020,00 mg/L), KH2PO4 (340,00 mg/L), MgSO4·7H2O (990,00 mg/L), Fe-EDTA (18,50 mg/L), Ca(NO3)2·4H2O (10,00 mg/L), H3BO3 (3,09 mg/L), MnSO4·4H2O (1,20 mg/L), CoSO4 (1,40 mg/L), CuSO4·5H2O (1,24 mg/L), ZnSO4 (1,43 mg/L), (NH4)6Mo7O24·4H2O (1,84 mg/L)).

Die Gewinnung der Algenbiomasse in Schritt (b) kann durch eines der zahlreichen bekannten physikalischen oder chemischen Verfahren für die Abtrennung von Biomasse aus einem Kulturmedium erfolgen, beispielsweise durch Abzentrifugieren des Mediums für die Kultivierung und/oder Lyophilisierung gewonnen werden. Der Aufschluss der Algenzellen in Schritt (b) kann in geeigneter Weise unter Verwendung eines der zahlreichen bekannten physikalischen oder chemischen Verfahren für den Zellaufschluss von Mikroorganismen erfolgen, wie sie z. B. in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 2003, Band 5, Biochemical Separations, Tabelle 3 beschrieben sind. Eine Möglichkeit ist beispielsweise Zermahlen, z. B. mit Mörser und Pistill unter Verwendung von Seesand (Verhältnis Algenbiomasse:Seesand 1:2) und Lösungsmittel (z. B. Wasser). Der Zellaufschluss kann bei einer beliebigen geeigneten Temperatur, z. B. Raumtemperatur, erfolgen.

Für die Extraktion der aufgeschlossenen Algenzellen mit Methanol gemäß Schritt (c) wird vorzugsweise eine Fest-Flüssig-Extraktion angewendet, wobei die Extraktion unter Rühren erfolgt und jeweils 100 mL Methanol/1 g der aufgeschlossenen Algenzellen eingesetzt werden. Die Abtrennung der flüssigen Methanol-Extraktphase von der Biomasse kann mittels Zentrifugation, z. B. 1000–5000 rpm, vorzugsweise 1500–3000 rpm, stärker bevorzugt 2000–2500 rpm, und insbesondere bei etwa 2000 rpm, erfolgen. Vorzugsweise kann die Biomasse jeweils drei Mal mit Methanol extrahiert werden. Die flüssigen Methanol-Extraktphasen der Extraktionen der Biomasse können vereinigt werden. Die vereinigten flüssigen Methanol-Extraktphasen können im Vakuum zur Trockne eingeengt werden, z. B. mit Hilfe eines Vakuum-Rotationsverdampfer.

Die Isolierung einer Verbindung der Formel (I) aus dem in Schritt (c) gewonnenen Extraktionsprodukt gemäß Schritt (d1) kann durch eines der zahlreichen bekannten physikalischen oder chemischen Verfahren für die Isolierung von Verbindungen aus einem Extrakt erfolgen, beispielsweise durch Festphasenextraktion (SPE). Für die SPE sind zahlreiche Sorbentien bekannt, beispielsweise kann eine Aminopropyl-modifizierte Kieselgelphase eingesetzt werden. Als Lösungsmittel zur Elution können bei der SPE bekannte geeignete Lösungsmittel verwendet werden, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Isopropanol, Wasser, Chloroform, Ethylacetat, Dichlormethan, Aceton, Diethylether, Hexan, und Mischungen derselben; vorzugsweise Methanol. Zur Entfernung von nicht-Lipid-Verunreinigungen kann das Produkt der SPE weiter gereinigt werden, beispielsweise mittels Chromatographie oder anderer bekannter Reinigungsverfahren; vorzugsweise kann das Produkt der SPE gemäß dem Verfahren von Folch et al. (J. Biol. Chem., 226, 497–509 (1957)) weiter gereinigt werden.

Gegenstand der Erfindung ist ferner auch ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus einer Mikroalge, der eine Verbindung der Formel (I) gemäß den vorstehenden Ausführungen, oder eines Salzes derselben, enthält, wobei das Verfahren umfasst:

  • (a) Kultivierung der Mikroalge;
  • (b) Gewinnung der Algenbiomasse und Aufschluss der Algenzellen;
  • (c) Extraktion der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) mit Methanol, umfassend die Suspension der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) in Methanol, das Rühren der Suspension, und die Abtrennung der flüssigen Methanol-Extraktphase von der Zellmasse;
  • (d2) Entfernung von Chlorophyll aus dem in Schritt (c) gewonnenen Extraktionsprodukt.

Die Schritte (a), (b) und (c) des Verfahrens zur Herstellung eines Extrakts aus einer Mikroalge können dabei analog zu den Schritten (a), (b) und (c) des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) ausgeführt werden.

Die Entfernung von Chlorophyll aus dem gewonnenen Extraktionsprodukt kann unter Verwendung eines bekannten Verfahrens erfolgen, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatograpie, z. B. unter Verwendung kommerziell erhältlicher Säulen zum Austausch von Kationen. Als Lösungsmittel für die Ionenaustauschchromatographie können bekannte geeignete Lösungsmittel eingesetzt werden, beispielsweise Methanol. Zur weiteren Reinigung des Extrakts kann eine Festphasenextraktion durchgeführt werden. Für die Festphasenextraktion sind zahlreiche Sorbentien bekannt, beispielsweise kann eine Octadecyl-modifizierte Kieselgelphase eingesetzt werden. Als Lösungsmittel zur Elution können bei der Festphasenextraktion bekannte geeignete Lösungsmittel verwendet werden, vorzugsweise Methanol.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

: Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) mit QC-inhibierender Wirkung bzw. zur Herstellung eines Extrakts aus einer Mikroalge, der mindestens eine Verbindung der Formel (I) mit QC-inhibierender Wirkung enthält.

: QC-inhibierende Wirkung von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen. Konzentration-Wirkungsdiagramm für die Aktivität von Extrakten aus Eustigmatos magnus, Tetradesmus wisconsinensis, Scenedesmus pectinatus, Scenedesmus acuminatus, Scenedesmus rubescens, und Scenedesmus productocapitatus. Wie der zu entnehmen ist, inhibieren die Extrakte, welche aus Mikroalgen in der exponentiellen Wachstumsphase gewonnen wurden, QC stärker als die Extrakte, welche aus Mikroalgen in der der stationären Wachstumsphase gewonnen wurden. Ferner ist aus ersichtlich, dass die QC-Hemmung spezifisch und konzentrationsabhängig erfolgt.

: Base-Peak Chromatogram und MS1Massenspektrum der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten Verbindungen gemäß der Formel (I) mit QC-inhibierender Wirkung. Diese Verbindungen sind auch in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bzw. Mikroalgen-Extrakten enthalten. Das MS1 Massenspektrum zeigt hierbei für die Retentionszeit von 6,9 min ein Molekülion [M-H] bei m/z 555, welches einem SQMG zugeordnet werden kann. Der Peak bei der Retentionszeit von 9,9–10 min zeigt im MS1 Massenspektrum die Molekülionen [M-H] bei m/z 794 und 815. Es handelt sich somit um den Peak der SQDG. Als Hauptverbindungen sind somit die Sulfolipide 1,2-di-O-palmitoyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl) mit [M-H] bei m/z 793 sowie 1-O-palmitoyl-2-O-linolenyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl) mit [M-H] bei m/z 815 enthalten. Weiterhin konnte als Nebenverbindung das SQMG 1-O-palmitoyl-3-O(6'-sulpho-α-quinovopyranosyl)-glycerol detektiert werden.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen erläutert.

BeispieleGewinnung der Algenbiomasse

Mikroalgen der Spezies Eustigmatos magnus, Tetradesmus wisconsinensis, Scenedesmus pectinatus, Scenedesmus acuminatus, Scenedesmus rubescens, und Scenedesmus productocapitatus wurden zur Gewinnung von hinreichend Biomasse in einem tubularen Photobioreaktor PBR 100 GS/PL der Firma IGV GmbH mit einem Reaktorvolumen von 100 L kultiviert. Die Steuerung der Pumpendrehzahl, der Temperatur sowie des pH-Wertes erfolgte mittels einer Biostat Steuereinheit der Firma Braun, wobei folgende Parameter:Temperatur 28°C +/– 3°C; pH = 7, Pumpendrehzahl 1750 rpm gesetzt wurden. Das Reaktorsystem besitzt eine Durchflusszelle, in welcher sowohl eine Temperatur- und pH-Sonde als auch eine Sonde zur Messung der optischen Dichte (OD) und eine pO2-Sonde integriert waren. Es erfolgte eine inline Messung folgender Parameter: Temperatur, pH-Wert, OD und Pumpendrehzahl. Diese wurden mittels der Software MFSC win über den gesamten Kultivierungszeitraum aufgezeichnet. Die Kultivierungen im 100 L PBR erfolgten ebenfalls bei einer Temperatur von 28°C +/– 3°C. Es wurde mit einer Lichtintensität von 60 μmol/m2·s bei OD < 20 und einer Lichtintensität von 150 μmol/m2·s des Lichtmoduls bei OD > 20 kultiviert. Die Kultivierung wurde im modifizierten fed-batch Verfahren durchgeführt.

Für die Kultivierung der Mikroalgen wurde Setlik-Medium (Tab. 1) verwendet. Tab. 1: Zusammensetzung des Setlik-Mediums

NährsalzEingesetzte Menge [mg/L]KNO32020,00KH2PO4340,00MgSO4·7H2O990,00Fe-EDTA18,50Ca(NO3)2·4H2O10,00H3BO33,09MnSO4·4H2O1,20CoSO41,40CuSO4·5H2O1,24ZnSO41,43(NH4)6Mo7O24·4H2O1,84

Die Nährsalze wurden in 1 L destilliertem Wasser gelöst und 20 min bei 121°C autoklaviert.

Untersucht wurden die Biomassen der exponentiellen und stationären Wachstumsphase der genannten Mikroalgen.

Extraktion der Algenbiomasse – Methanol-Extrakt

Die lyophilisierten Algenbiomassen der exponentiellen und stationären Wachstumsphase jeder untersuchten Mikroalge wurde mit Seesand im Verhältnis 1:2 mit Mörser und Pistill unter Verwendung von Lösungsmittel aufgeschlossen. Der Zellaufschluss erfolgte 10 min bei RT.

Zur Extraktion wurde eine einstufige Extraktionsmethode auf Basis einer Fest-Flüssig-Extraktion angewendet. Hierbei wurden jeweils 10 g Algenbiomasse nach Zellaufschluss mit dem Lösungsmittel Methanol extrahiert. In drei Schritten erfolgte die Extraktion mit jeweils 100 mL Lsm./1 g BM unter Rühren auf dem Magnetrührer bei RT für 1 h. Die Abtrennung der flüssigen Extraktphase von der Biomasse erfolgte mittels Zentrifugation bei 2000 rpm und RT, so dass die Biomasse im 2. und 3. Extraktionsschritt analog extrahiert werden konnte. Die Extrakte aus den drei Extraktionsschritten wurden vereint und mittels Vakuum-Rotationsverdampfer der Firma Büchi bis zur absoluten Trockne eingeengt.

Chlorophyll Eliminierung

Die Eliminierung des Farbstoffes Chlorophyll erfolgte unter der Verwendung von CHROMABOND® SA (SCX) der Firma Macherey&Nagel aus den Methanol-Extrakten. Die SA-Kartuschen wurden mit 0,5 g Na2SO4 beschichtet und mit 1 VE Dichlormethan/Aceton (3:1, v/v) konditioniert. Anschließend erfolgte jeweils die Aufgabe des Methanol-Extraktes. Das chlorophyllfreie Fluat wurde in Glasprobengefäßen aufgefangen.

Gewinnung Mikroalgen-Extrakt mit Verbindung der Formel (I)

Die chlorophyllfreien Extrakte wurden anschließend über Chromabond® C18ec Kartusche (500 mg/3 mL bzw. 1000 mg/6 mL, Macherey&Nagel) aufgereinigt. Die Elution erfolgte hierbei mit 100% MeCH.

QC inhibierende Wirkung der Mikroalgen-Extrakte

Die chlorophyll-freien über Chromabond® C18ec Kartuschen aufgereinigten Mikroalgen-Extrakte wurden auf ihre QC-inhibierende Aktivität untersucht. Hierzu können bekannte Nachweisverfahren der QC-Katalyse benutzt werden. Beispielsweise kann das von Schilling et al. (Anal. Biochem. 303, 49–56 (2002); Biol. Chem. 384, 1583–1592 (2003)) entwickelte kontinuierliche Testverfahren, das auf dem Umsatz des freien Ammoniaks durch die Zyklisierung der N-terminalen Glutaminreste beruht (loc. cit. 2003) und zum anderen das gebildete Pyroglutamatpeptid mit Pyroglutaminylaminopeptidase (pGAP) umsetzt (loc. cit. 2002), siehe Reaktionsschema 1 unten, eingesetzt werden. Bei diesem Verfahren werden durch das Hilfsenzym pGAP fluorogene Gruppen abgespalten, was zu einem Anstieg der Fluoreszenz führt. Reaktionsschema 1

Die QC-inhibierende Aktivität der erfindungsgemäßen chlorophyll-freien über Chromabond® C18ec Kartuschen aufgereinigten Mikroalgen-Extrakte wurde mit dem vorstehenden Testverfahren von Schilling et al. in zwei Konzentrationen (2 mg/mL und 0,2 mg/mL) ermittelt. Das Testverfahren wurde in transparenten 96-Well-Mikrotiterplatten (NUNC, Costar Corning Incorporated, Acton, MA, USA) als Dreifachbestimmung durchgeführt. Die Messansätze wiesen ein Gesamtvolumen von 250 μL pro Well auf. Diese setzten sich aus 100 μL 0.25 mM Substrat, 50 μL 0,2 mg/mL Probe und 25 μL Hilfsenzyme pGAP zusammen. Da die QC-Aktivität pH-abhängig ist, wurden jedem Messansatz 50 μL Tris-Puffer (0.1 M; pH 8) zugesetzt. Der Start der Reaktion erfolgte nach 10 minütiger Inkubation bei 30°C durch Zugabe von 25 μL QC. Die Messungen bzw. die Zunahme des freien AMC wurde kontinuierlich über einen Zeitraum von 12 min (~27 Zyklen) bei einer Temperatur von 30°C an einem FluoStar Multiplate Reader der Firma BMG-Labtech gemessen.

Die Ergebnisse der Messung sind in gezeigt. Wie aus ersichtlich, inhibierten die erfindungsgemäßen Mikroalgen-Extrakte die Aktivität von QC spezifisch und konzentrationsabhängig.

Identifizierung der QC-Inhibitoren in den Mikroalgen-Extrakten

Zur Identifizierung der QC-Inhibitoren wurden die erfindungsgemäßen Mikroalgen-Extrakte massenspektrometrisch analysiert.

Die massenspektrometrischen Analysen erfolgten mittels eines API-150EX Massenspektrometer mit einer „Turbo Ion Spray”-Ionenquelle der Firma Applied Biosystems. Die Probeninjektion (10 μL) erfolgte über Direkteinlass in einen kontinuierlichen Fluss eines MeOH/H2O-Gemisches (6:4; v/v) bei einer Fließgeschwindigkeit von 400 μL/min.

Weiterhin wurden die erfindungsgemäßen Mikroalgen-Extrakte mittels UPLC-ESI-Ion trap MSn an einer Acquity UPLC-Anlage der Firma Waters unter Verwendung einer RP18-Säule (Acquity UPLC HSS T3 1,8 μm, 1 × 100 mm, Waters) untersucht. Die Proben wurden mit negativer Ionisierung mittels Elektrospray Ionisation (ESI) bei einer Sprayspannung von 4 kV, einer Kapillartemperatur von 275°C und einer Kapillarspannung von 27 V unter Verwendung von Stickstoff als Schutzgas (Flussrate 35–40 arb. units) analysiert.

Die massenspektrometrischen Analysen der untersuchten Extrakte ergaben, dass die Verbindungen der Formel (I) für die QC-inhibierende Wirkung verantwortlich sind. Bei den massenspektrometrisch identifizierten Verbindungen handelte es sich um die SQDG's 1,2-di-O-palmitoyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl mit [M-HF bei m/z 793, 1-O-palmitoyl-2-O-linolenyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl mit [M-HF bei m/z 815 und 1-O-linolyl-2-O-palmitoyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl mit [M-H] bei m/z 817 sowie um das SQMG 1-O-palmitoyl-3-O(6'-sulpho-α-quinovopyranosyl)-glycerol mit [M-HF bei m/z 555 und 1-O-(6-Deoxy-6-sulphoglucopyranosyl)-glycerol mit [M-HF bei m/z 317.

Gewinnung von Verbindungen der Formel (I)

Zur Gewinnung der QC-inhibierenden Verbindungen aus den bei der vorstehend beschriebenen Extraktion aus der Algenbiomasse gewonnenen Methanol-Extrakten wurde eine Festphasenextraktion mit anschließendem ”Folch Wash” eingesetzt.

Für die Festphasenextraktion der Methanol-Extrakte wurden Aminopropyl-modifizierte Kieselgel-Kartuschen (NH2-Kartuschen) der Firma Macherey&Nagel (3 mL/500 mg bzw. 6 mL/1000 mg) verwendet. Die Konditionierung der NH2-Kartuschen erfolgte in mehreren Schritten unter der Verwendung von 2 mL MeOH, 2 mL dest. H2O, 4 mL 0,1 M HCL (für 1 h auf Säule), 2 mL dest. H2O, 2 mL MeOH, 2 mL DCM/Isopropanol/MeOH (15:30:50 v/v/v). Pro NH2-Kartusche erfolgte ein Probenauftrag von 20 mg methanolischem Extrakt, gelöst in DCM/MeOH (1:1; v/v). Bei Verwendung von 6 mL/1000 mg NH2-Kartuschen wurden die Volumina der verwendeten Lösungsmittel sowie der aufgetragenen Probe verdoppelt.

Die Elution erfolgte in 2 Schritten. In Schritt 1 wurde zunächst die ungeladene Substanz mit 9 ml DCM/Isopropanol/MeOH 15:30:50 (v/v/v) eluiert. In Schritt 2 wurden die Verbindungen gemäß der Formel (I) mit 5 mL DCM/ACN/Isoprop/MeOH/ 0,1 M NH4Ac (10:10:10:50:15; v/v/v/v/v) eluiert; Fraktion 2.

Der Fraktion 2 wurde mittels Vakuum-Rotationsverdampfer das Lösungsmittel entzogen und anschließend unter Zugabe von DCM/MeOH/0,1 NaAc-Puffer pH = 4,0 (8:4:3, v/v/v) durch kräftiges, mehrminütiges Schütteln rückgelöst. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C reicherten sich die Verbindungen gemäß der Formel (I) in der unteren, lipophilen Phase an. Die lipophile Phase mit den Verbindungen gemäß der Formel (I) wurde mit einer Pasteurpipette abgenommen, in einen Rundkolben überführt und bis zur Trockne mittels Vakuum-Rotationsverdampfer eingeengt.

Die Ausbeuten der Verbindungen gemäß der Formel (I) variierten in Abhängigkeit der verwendeten Biomasse (Algenspezies und Wachstumsphase) zwischen 3–26%. Beispielsweise konnten aus 25 mg des methanolischen Extraktes aus Scenedesmus acuminatus (stationäre Phase) Verbindungen gemäß der Formel (I) mit einer Ausbeute von 26% gewonnen werden, d. h. es konnten 6,5 mg isoliert werden.

Identifizierung der gewonnen Verbindungen

Zur Identifizierung wurden die isolierten Verbindungen massenspektrometrisch analysiert.

Die massenspektrometrischen Untersuchungen der isolierten Verbindungen erfolgten wie bei den erfindungsgemäßen Mikroalgen-Extrakten mittels ESI-API-MS und UPLC-MS im negativen Ionenmodus. Das Base-Peak Chromatogramm sowie das zugehörige MS1-Spektrum ist in gezeigt mit den für Verbindungen gemäß der Formel (I) charakteristischen Peaks bei 9,9 – 10,0 min sowie bei 6,9 min.

Bei den isolierten Verbindungen handelt es sich um Verbindungen gemäß der Formel (I), nämlich um die SQDG-Sulfolipide 1,2-di-O-palmitoyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl) mit [M-H] bei m/z 793 und 1-O-palmitoyl-2-O-linolenyl-3-O-(6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl) mit [M-H] bei m/z 815, sowie um das SQMG-Sulfolipid 1-O-palmitoyl-3-O(6'-sulpho-α-quinovopyranosyl)-glycerol mit [M-H] bei m/z 555.

QC-inhibierende Wirkung

Um zu bestätigen, dass die aus der Mikroalge Scenedesmus acuminatus isolierten Sulfolipide QC inhibieren, wurden sie in zwei Konzentrationen (0,25 mg/mL und 0,025 mg/mL i. A.) mit dem oben beschriebenen Testverfahren von Schilling et al. untersucht. Dabei wurde gefunden, dass die aus der Mikroalge isolierten Sulfolipide QC mit 81% (0,25 mg/mL) bzw. 76 (0,025 mg/mL) inhibieren.

Als Positivkontrolle für die QC-inhibierende Wirkung der als aktivitätsrelevant identifizierten Verbindungen gemäß der Formel (I) wurde ein SQDG-Standard der Firma Lipid Products in den Konzentrationen 0,25 mg/mL und 0,025 mg/mL i. A. im Testverfahren von Schilling et al. untersucht. Der SQDG-Standard hemmte die QC um 77% (0,25 mg/mL) bzw. 76% (0,025 mg/mL). Der für den SQDG-Standard ermittelte IC50-Wert betrug 10,9 μM und liegt damit sogar unterhalb des Bereichs (stärkere Wirksamkeit) der aus US 7,304,086 B2 bekannten QC-Inhibitoren mit IC50-Werten von 0,22 μM–14 μM.

Da der SQDG-Standard als Referenzsubstanz für die Verbindungen gemäß der Formel (I) die QC inhibiert, ist damit eindeutig nachgewiesen, dass Verbindungen gemäß der Formel (I) QC-Inhibitoren sind.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • WO 2011/029920 [0003]
  • WO 2011/101433 [0003]
  • WO 2011/107530 [0003]
  • WO 2011/110613 [0003]
  • US 7304086 B2 [0060]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

  • Folch et al. (J. Biol. Chem., 226, 497–509 (1957)) [0028]
  • Schilling et al. (Anal. Biochem. 303, 49–56 (2002); Biol. Chem. 384, 1583–1592 (2003)) [0044]
  • et al. in zwei Konzentrationen [0045]
  • Schilling et al. [0059]