Title:
Triple Target HIV-1 NAT zum Nachweis aller bekannten Genotypen
Kind Code:
B4
Abstract:

Ein Primer/Probeset zum Nachweis von HIV, insbesondere HIV-1, umfassend mindestens ein Primer/Probeset 1 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 1, 2 und 3; Primer/Probeset 2 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 4, 5, 6 und 7, und Primer/Probeset 3 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 8, 9 und 10.



Inventors:
Roth, Willi Kurt, Prof. (60438, Frankfurt, DE)
De Zolt, Silke (60438, Frankfurt, DE)
Bangsow, Thorsten (60438, Frankfurt, DE)
Application Number:
DE102015009439A
Publication Date:
01/26/2017
Filing Date:
07/21/2015
Assignee:
GFE Blut mbH, 60438 (DE)
International Classes:
Foreign References:
WO2013006684A12013-01-10
WO2015058194A12015-04-23
Attorney, Agent or Firm:
BOEHMERT & BOEHMERT Anwaltspartnerschaft mbB - Patentanwälte Rechtsanwälte, 80336, München, DE
Claims:
1. Ein Primer/Probeset zum Nachweis von HIV, insbesondere HIV-1, umfassend mindestens ein Primer/Probeset 1 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 1, 2 und 3; Primer/Probeset 2 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 4, 5, 6 und 7, und Primer/Probeset 3 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 8, 9 und 10.

2. Primer/Probeset nach Anspruch 1, wobei die Primer und/oder Probes aus DNA, RNA, PNA, LNA, oder Kombinationen davon bestehen.

3. Primer/Probeset nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Primer und/oder Probes mit einer nachweisbaren Gruppe markiert sind oder mit mindestens einem oder bevorzugt 2 Quenchern versehen sind, wie z. B. eine ZENTM-Probe.

4. Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe, umfassend die Schritte von: (a) Zusammenstellen eines Reaktionsgemisches umfassend eine Probe, die möglicherweise HIV enthält, Reagenzien zur Amplifikation von Nukleinsäuren und mindestens ein Primer/Probeset nach einem der Ansprüche 1 bis 3, (b) Amplifikation von Nukleinsäuren in dem Reaktionsgemisch und (c) Nachweis von amplifizierten Nukleinsäuren, und dadurch Nachweis von HIV in der Testprobe.

5. Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe nach Anspruch 4, wobei die Amplifikation von Nukleinsäuren ein Verfahren ausgewählt aus PCR, rtPCR, Multiplex-PCR, TMA, SDA und NASBA umfasst.

6. Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Reagenzien zur Amplifikation von Nukleinsäuren eine Polymerase, reverse Transkriptase, Ribonuclease Inhibitor, Uracyl-N-Glycosylase (und/oder Ligase) umfassen.

7. Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Verfahren die Multiplexierung mit anderen Viren, z. B. HIV-2, HCV oder HBV, umfasst.

8. Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Testprobe ausgewählt ist aus Blut (Vollblut) oder Teilen davon, wie z. B. Plasma oder Serum, und einer gepoolten Testprobe.

9. Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei in dem nachzuweisenden HIV-Isolat eine der zu amplifizierenden Regionen durch mindestens eine Mutation gegenüber einer Referenzsequenz verändert ist, wobei diese Region insbesondere ausgewählt ist aus gag, pol, oder LTR.

10. Kit, umfassend (a) mindestens ein Primer/Probeset nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und (b) Reagenzien zur Amplifikation von Nukleinsäuren.

11. Kit nach Anspruch 10, wobei die Reagenzien zur Amplifikation von Nukleinsäuren eine Polymerase, reverse Transkriptase, Ribonuclease Inhibitor, Uracyl-N-Glycosylase (und/oder Ligase) umfassen.

12. Verwendung eines Primer/Probesets nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines Kits nach Anspruch 10 oder 11 zum Nachweis von HIV, insbesondere HIV-1 nach einem der Ansprüche 4 bis 9.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft Primer und Sonden zur effektiven Amplifikation von HIV-1 Sequenzen in drei verschiedenen konservierten Genomregionen mit Hilfe eines Multiplex Ansatzes der Polymerase Kettenreaktion (PCR), einschließlich heterologer interner Kontrollsequenz. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Multiplexierung mit anderen Viren, z. B. HIV-2, HCV oder HBV, einzeln oder gemeinsam.

Hintergrund der Erfindung

Ende der 1990er Jahre wurde, beginnend in Deutschland und nachfolgend weltweit, die Nukleinsäure Amplifikationstechnologie (NAT), zu der die PCR gehört, als zusätzliches Verfahren zur serologischen Testung von Blutspenden eingeführt. Ziel war, die diagnostische Fensterphase zu verkürzen, in der ein Blutspender infektiöse Viren in seinem Blut trägt, ohne dass Antikörper oder Antigene nachgewiesen werden können. Vor Einführung der NAT Testung ereigneten sich in Deutschland bis zu 15 HCV und mehrere HIV-1 Infektionen pro Jahr durch Virus-kontaminierte Blutspenden, die mit Hilfe der serologischen Tests nicht nachzuweisen waren.

Trotz flächendeckender freiwilliger NAT Testung aller Blutspenden bei den großen Blutspendediensten ab 1997 ereigneten sich immer noch zahlreiche Übertragungen durch Blutspenden, die nicht NAT getestet waren. Aus diesem Grunde ordnete das Paul-Ehrlich-Institut (PEI) als zuständige Bundesoberbehörde die NAT für HCV ab 1999 als Pflichttest für ganz Deutschland an, mit dem Ergebnis, dass es danach bis heute nur noch zu einer einzigen Übertragung von HCV durch Blutprodukte kam. Ursache war eine Spende, deren Viruskonzentration unter der Nachweisgrenze des NAT Testes lag.

Ab 2004 wurde auch die HIV-1 NAT in Deutschland verpflichtend eingeführt, nachdem die anfänglichen technischen Schwierigkeiten überwunden waren. Seither gab es zwei Übertragungen, die jedoch, anders als bei HCV, nicht auf eine zu niedrige Viruskonzentration, sondern auf Mutationen im Virusgenom zurückzuführen waren. Primer bzw. Sonden konnten auf Grund der Basenfehlpaarung nicht mehr binden und der Test versagte trotz hoher Viruskonzentration. Weitere Testversager auf Grund von Mutationen in den konservierten HIV-1 Regionen gag und LTR, in denen die gängigen Mono Target NAT Teste für die Blutspenderdiagnostik lokalisiert sind, wurden bekannt, ohne dass es zu Übertragungen kann.

Daher wurde vom Paul-Ehrlich-Institut ein Stufenplan initiiert, um das Restrisiko durch unerwartete Mutationen selbst in den konservierten Bereichen des HIV-1 für die Blutspendentestung zu minimieren. Nach Anhörung der Unternehmen, die in-vitro Diagnostika für die Blutspendentestung herstellen, wurde 2012 angeordnet, dass ab dem 1. Januar 2015 Blutkomponenten nur noch mit solchen HIV-1 Testsystemen untersucht werden dürfen, die geeignet sind, die mögliche Nichterkennung bzw. Unterbestimmung einer Zielregion auszugleichen oder auszuschließen.

Als ein möglicher Ansatz wird die Verwendung eines sogenannten Dual-Target NAT-Tests, bei dem zwei (oder mehrere) verschiedene Abschnitte des HIV-Genoms amplifiziert und nachgewiesen werden, empfohlen.

Tabelle 1 zeigt, dass bei den bekannten Fällen die jeweilig eingesetzte Mono-Target NAT versagt hatte, während andere konservierte Regionen amplifiziert werden konnten. Nur die Dual Target Teste CAP CTM V1.2 und Ultrio plus detektierten das HIV-1 Isolat, da jeweils nur eine Region mutiert war und die intakte Region amplifiziert werden konnte. Doch es ist zu sehen, dass auch die bereits existierenden Dual Target Tests in ihrer Sensitivität betroffen sind, und deren Nachweiseffizienz um einen Faktor < 10 reduziert sein kann.

Drexler et al. (in Rates of and reasons for failure of commercial human immunodeficiency virus type 1 viral load assays in Brazil. J Clin Microbiol. 2007 Jun; 45(6): 2061–3. Epub 2007 Mar 28) beschreiben Untersuchungen über falsche Analyseergebnisse bei HIV-1 unter der Verwendung von kommerziellen Tests. Die Versagensraten lagen für die Tests Bayer Versant bDNA 3.0, Roche Amplicor Monitor v1.5 und bioMerieux NucliSens QT bei jeweils 0,68, 0,47 und 4,33%. Die Autoren schlagen deshalb vor, bestimmte Tests in Brasilien nicht zu benutzen.

Foglieni et al. (in A cluster of human immunodeficiency virus Type 1 recombinant form escaping detection by commercial genomic amplification assays. Transfusion. 2011 Apr; 51(4): 719–30) beschreiben eine neue Form von HIV-1, die sich mit herkömmlichen Tests (z. B. Routine-NAT) nicht nachweisen ließ. Bei weiteren Nachforschungen wurden weitere Varianten identifiziert, die sich mit herkömmlichen Tests nicht aufspüren ließen.

Die folgende Tabelle 1 fasst problematische Fälle des Nachweises von HIV-1 aus der Blutspendendiagnostik in Deutschland („break-through-Fälle”) zusammen.

Das HIV-Virusgenom besteht aus zwei Kopien einer Plusstrang-RNA-Kette, die im Core mit Proteinen assoziiert vorliegt, jedoch bei der Transkription nicht direkt als mRNA fungieren kann. Am 5'- und 3'-Ende der RNA befinden sich sogenannte LTR-Regionen (long terminal repeats), die bei der Bildung viraler Genprodukte als starke Promotoren wirken; dazwischen befinden sich die Gene des HI-Virus, die für alle strukturellen und enzymatisch wirksamen Proteine kodieren.

Die RNA des HI-Virus weist nach bisherigen Erkenntnissen neun Gene auf; davon kodieren lediglich drei Gene (gag, pol, env) für weitergegebene Proteine. Das gag-Gen (gag (group specific antigen)) kodiert für die Proteine des Kapsods, p7, p24 und p17. Die Information für alle enzymatischen Proteine des Virus, für reverse Transkriptase, Protease und Integrase, befindet sich im Bereich des pol-Gens (pol (polymerase)). Das env-Gen (env (envelope)) beinhaltet die Erbinformation für die beiden Glykoproteine der Virushülle, gp 41 und gp 120.

Mit dem Kürzel NAT wird eine Gruppe gentechnischer Verfahren umschrieben, mit deren Hilfe Nukleinsäuren vervielfältigt werden können. NAT steht für „Nukleinsäure amplifizierende Technik” oder „Nukleinsäure amplifizierender Test”. Im Englischen Endet man oft auch das Kürzel NAAT, was dann analog für „Nucleic Acid Amplification Technique” oder „Nucleic Acid Amplification Test” steht. Alternative, nicht PCR-basierte NAT heißen SDA (Strand Displacement Amplification), NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) oder TMA (Transkription Mediated Amplification). Die TMA erkennt RNA direkt als Target. Die PCR erkennt DNA direkt als Target und kann RNA-Targets nur über den Umweg der reversen Transkription nachweisen.

Bisher wurden sowohl die gag als auch die pol Region für eine Dual Target NAT jeweils zusammen mit der LTR Region eingesetzt.

US 5962665 A beschreibt Nukleinsäureprimer und Sonden zum Nachweis von HIV-1 und HIV-2.

Niemz et al. (in: Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends in Biotechnology, (2011), 29(5), 240–250) stellen eine Übersicht von NAT-Technologien, insbesondere im Point-of care-(POC)Bereich, vor.

Das Paul-Ehrlich-Institut hat zudem bestimmte Anforderungen an die Validierung bzw. den Routinebetrieb von Nukleinsäure-Amplifikations-Techniken (NATs) zum Nachweis von Virusnukleinsäuren in Spenderblut erstellt, die z. B. auf der Homepage des Paul-Ehrlich-Instituts zu finden sind.

Es ist somit eine Aufgabe der Erfindung, verbesserte Nachweissysteme zum Nachweis von HIV in Blutproben bzw. Teilen davon zur Verfügung zu stellen, mit denen erhöhte Nachweisgenauigkeiten erreicht werden können und das Risiko eines falschen Ergebnisses vermindert wird. Zudem sollen die Systeme für die Praxis robust sein, z. B. für den POC-Einsatz.

In einem ersten Aspekt der Erfindung wird diese Aufgabe gelöst durch ein Primer/Probeset zum Nachweis von HIV, insbesondere HIV-1, umfassend mindestens ein Primer/Probeset 1 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 1, 2 und 3; Primer/Probeset 2 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 4, 5 oder 6 und 7, und Primer/Probeset 3 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 8, 9 und 10. Ein „Probeset” kann auch als „Sondenset” bezeichnet werden.

In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe, umfassend die Schritte von: (a) Zusammenstellen eines Reaktionsgemisches umfassend eine Probe, die möglicherweise HIV enthält, Reagenzien zur Amplifikation von Nukleinsäuren und mindestens ein Primer/Probeset gemäß der Erfindung, (b) Amplifikation von Nukleinsäuren in dem Reaktionsgemisch und (c) Nachweis von amplifizierten Nukleinsäuren, und dadurch Nachweis von HIV in der Testprobe.

In einem dritten Aspekt der Erfindung wird diese Aufgabe gelöst durch ein Kit, umfassend (a) mindestens ein Primer/Probeset gemäß der Erfindung und (b) Reagenzien zur Amplifikation von Nukleinsäuren.

In einem vierten Aspekt der Erfindung wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines Primer/Probesets gemäß der Erfindung oder eines Kits gemäß der Erfindung zum Nachweis von HIV, insbesondere HIV-1 gemäß der Erfindung.

Die obigen beunruhigenden Daten haben die Erfinder veranlasst zu untersuchen, ob eine Triple (Dreifach) Target NAT, die gleichzeitig drei verschiedene konservierte Regionen amplifiziert, ebenso von einer reduzierten Amplifikationseffizienz betroffen ist, wenn eine Region durch Mutationen ausfällt. Die Erfinder konnten zeigen, dass bei einem Ausfall einer einzigen Region die beiden verbleibenden amplifizierbaren Regionen den Ausfall nahezu komplett kompensieren können. Ferner konnten die Erfinder zusätzlich für die genetisch weit entfernten HIV-1 Gruppen O, N und P wenigstens zwei Zielregionen realisieren, womit auch für diese die Anforderungen (z. B. des PEI) erfüllt werden.

Im HIV-1 Genom sind nur drei Regionen hinreichend konserviert, um diagnostisch ausreichend sensitive NAT Teste für alle bekannten Varianten zu etablieren. Selbst diese sind einem hohen Mutationsdruck unterworfen, wie die beschriebenen Testversager aufgezeigt haben. Die bisherigen Mono Target Teste lagen zu Beginn vorzugsweise in der gag Region, von der die meisten Sequenzen bekannt sind. Nach dem Auftreten der ersten Testversager haben die Hersteller ihre Teste in die vermeintlich höher konservierte LTR Region verlagert, bis auch hier erste Testversager auf Grund von Mutationen aufgetreten sind. Beim letzten bekannt gewordenen Fall trat sogar eine Deletion von 55 Basen auf, die fast alle Möglichkeiten genommen hat, in diesem Bereich eine umfassende diagnostische NAT zu etablieren, ohne von vorne herein Testversager befürchten zu müssen. Dieser Befund hat die Erfinder weiter genötigt, mehr als zwei Regionen in einer NAT zu vereinigen. Neben den genannten Regionen kommt bei HIV-1 nur noch die pol Region als dritte konservierte Region in Frage, die auch von einigen Herstellern sowohl für eine Mono- als auch Dual-Target NAT genutzt wird (siehe Tabelle 1 und 1).

Im Detail stellt die vorliegende Erfindung verbesserte Primer/Probesets zum Nachweis von HIV, insbesondere HIV-1, zur Verfügung. Diese sind robuster im Nachweis und umfassen mindestens ein Primer/Probeset 1 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 1, 2 und 3; Primer/Probeset 2 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 4, 5, 6 und 7, und Primer/Probeset 3 bestehend aus Oligonukleotiden umfassend SEQ ID NOs 8, 9 und 10.

Das erfindungsgemäße Verfahren setzt erstmalig die gag und pol Region wie auch die gag, pol und LTR Region zusammen ein, um eine diagnostische NAT zu etablieren. Die Vorteile, insbesondere der Triple Target NAT, ergeben sich aus den folgenden Tabellen 2, 3 und 4. Es ist hier deutlich zu erkennen, dass die Mono-Target PCRs der einzelnen konservierten Genombereiche (LTR, pol, gag) teilweise für ein Amplikon versagen (Tabelle 2: 1/2012 für LTR) oder sogar zwei Amplikonbereiche stark unterrepräsentiert amplifiziert werden (Tabelle 2: 1/2010 und 2/2010 für pol und gag). Tabelle 3 verdeutlich nochmals die unterschiedliche Detektionssicherheit der Einzelamplikons für verschiedene publizierte Sequenzen unterschiedlicher Subtypen und des Break-Through Falls 1/2010, wobei Tabelle 4 verdeutlicht, dass die Sensitivität, wenn ein Amplikonbereich nicht amplifiziert wird, erst mit der Triple Target PCR nicht beeinträchtigt wird, wobei die Dual-Target Assays einen Sensitivitätsverlust um den Faktor 2,7 erfahren. Tabelle 2: Dual-Target versus Triple-Target-PCR; HIV-Subtyp B Isolate aus falsch-negativen Tests und Referenzmaterial aus Gewebekultur (t. c. sup.)

HIV-1
1/2010
Ct*
HIV-1
2/2010
Ct*
HIV-1
1/2012
Ct*
HIV-1
t. c. sup.
Ct*
LTR26,0532,8730,34pol31,1341,0030,1032,25gag31,3040,3632,7231,76LTR-pol27,8733,5629,9831,00LTR-gag26,1932,532,6630,04pol-gag30,8435,4529,7831,32triple28,4234,0929,9031,17
*Cycle threshold: Zyklus, bei dem das erste messbare Signal auftritt Tabelle 3: Nachweis von HIV-1 Subtypen auf synthetischem Material (gBlocks®) mittels einzelner Amplikons-LOD: limit of detectionGentypCt*95% LODLTRgagpolLTRgagpolB29,9726,1023,214,87,01,5C25,6823,2822,942,07,01,0A123,3223,2724,665,12,22,601AE23,3624,7125,452,62,42,602AG23,7824,8425,312,20,82,606cpx23,8324,5124,463,42,23,1G23,8422,9524,254,83,32,3N25,2026,64neg.2,03,5neg.O26,2125,02neg.2,62,0neg.P24,2624,25neg.1,32,0neg.HIV-1
1/2010
23,1225,9726,782,42,03,1
*Cycle threshold: Zyklus, bei dem das erste messbare Signal auftritt Tabelle 4: Dual-Target versus Triple-Target PCR; bei vollständigem Versagen der Sonden eines Amplikons-LOD in IU/ml: 12,5 ul eingesetztes Volumen in der PCR, gemäß IVD ValidierungdualDual ohne LTRDual ohne polTripleTriple ohne gagTriple ohne LTRTriple ohne pol95%
LOD
257695702274266240300
Delta max. 2,7 xDelta max. 1,1 x

Bevorzugt ist ein Primer/Probeset gemäß der Erfindung, wobei die Primer und/oder Probes aus DNA, RNA, PNA, LNA, oder Kombinationen davon bestehen. Solche Kombinationen sind besonders für TMA- oder andere Verfahren vorgesehen, in denen unterschiedliche Nukleinsäuren in einem Oligonukleotid benötigt werden.

Bevorzugt weisen die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung eine Länge von zwischen 20 und 50 Nukleotiden auf, weiter bevorzugt zwischen 30 und 40 Nukleotiden. Besonders bevorzugt bestehen die Oligonukleotide des Primer/Probesets gemäß der Erfindung aus den SEQ ID NOs 1, 2 und 3; den SEQ ID NOs 4, 5, 6 und 7, und den SEQ ID NOs 8, 9 und 10, gegebenenfalls verlängert um weitere Abschnitte, die für die Nukleinsäure-Amplifakationsverfahren, wie PCR, rtPCR, Multiplex-PCR, TMA, SDA und NASBA benötigt werden.

Weiter bevorzugt ist ein Primer/Probeset gemäß der Erfindung, wobei die Primer und/oder Probes mit einer nachweisbaren Gruppe markiert sind, z. B. einem Farbstoff, Radionuklid, Antigen für Antikörper-Nachweis, einer Bindungsgruppe oder mit einem Quencher (einer Fluoreszenz-beeinflussenden Gruppe) oder mehr als einem Quencher versehen sind, wie z. B. eine ZENTM-Probe. Die Verwendung der speziellen ZENTM-Sonden Technologie zeigt insbesondere ein zufriedenstellendes Zusammenspiel ohne gegenseitige Inhibition oder das Auftreten von unspezifischen Reaktionen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist dann ein Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe, umfassend die Schritte von: (a) Zusammenstellen eines Reaktionsgemisches umfassend eine Probe, die möglicherweise HIV enthält, Reagenzien zur Amplifikation von Nukleinsäuren und mindestens ein Primer/Probeset gemäß der Erfindung, (b) Amplifikation von Nukleinsäuren in dem Reaktionsgemisch und (c) Nachweis von amplifizierten Nukleinsäuren, und dadurch Nachweis von HIV in der Testprobe.

Die Schwierigkeit, die es dabei im Rahmen der Erfindung insbesondere zu lösen galt, war das reibungslose Zusammenspiel der Vielzahl an Primern und Sonden, die in einem einzigen Reaktionsansatz zusammen mit den Primern und der Sonde für die interne Kontrolle vereinigt sind. Dabei haben sich nur die obigen Primer- und Sondenkombinationen als vereinbar erwiesen, ohne dass es zu wechselseitigen Inhibitionen gekommen ist.

Weiter bevorzugt ist dann ein Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe gemäß der Erfindung, wobei die Amplifikation von Nukleinsäuren ein Verfahren ausgewählt aus NAT, wie z. B. PCR, rtPCR, Multiplex-PCR, TMA, SDA und NASBA umfasst. Dabei können die Reagenzien zur Amplifikation von Nukleinsäuren in dem Verfahren eine Polymerase, reverse Transkriptase, RNAse, z. B. RNAse H und/oder Ligase umfassen.

Noch weiter bevorzugt ist dann ein Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe gemäß der Erfindung, wobei das Verfahren die Multiplexierung mit anderen Viren, z. B. HIV-2, HCV oder HBV, umfasst.

In dem Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe gemäß der Erfindung kann die Testprobe jede geeignete Probe sein, die ggf. HIV-Nukleinsäure enthält. Bevorzugt ist diese ausgewählt aus Blut oder Teilen davon, wie z. B. Plasma oder Serum, und einer gepoolten Testprobe, d. h. einer Variante, wo mehrere Proben gemeinsam untersucht werden.

Das vorliegende Verfahren gemäß der Erfindung sowie die hier beschriebenen Bestandteile (Primersets und Kits) können in der Patientendiagnostik sowohl für qualitative als auch quantitative viral load assays Anwendung finden, besonders bevorzugt ist das Blutspendensceening.

Einen besonderen Vorteil bietet das Verfahren zum Nachweis von HIV in einer Testprobe gemäß der Erfindung, wenn in dem nachzuweisenden HIV eine der zu amplifizierenden Regionen durch mindestens eine Mutation gegenüber einer Referenzsequenz verändert ist, wobei diese Region insbesondere ausgewählt ist aus gag, pol, oder LTR. Hier zeigt das Verfahren seine Robustheit und Zuverlässigkeit.

Das Verfahren kann auch ein Pooling umfassen oder ein Point-of-care Verfahren sein.

Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung ist dann ein. Kit, umfassend (a) mindestens ein Primer/Probeset gemäß der Erfindung und (b) Reagenzien zur Amplifikation von Nukleinsäuren. Solche diagnostischen Kits sind im Stand der Technik bekannt und können in einem oder auch mehreren Behältern getrennt oder gemeinsam vorliegen. Auch kann das Kit entsprechende Puffer, Gerätschaften (z. B. Pipetten und Teströhrchen) und Gebrauchsanweisungen umfassen. Bevorzugt ist ein Kit gemäß der Erfindung, wobei die Reagenzien zur Amplifikation von Nukleinsäuren mindestens eine Polymerase, reverse Transkriptase, Uracyl-N-Glycosylase, Ribonuclease Inhibitor (und/oder Ligase) umfassen.

Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft dann die Verwendung eines Primer/Probesets gemäß der Erfindung oder eines Kits gemäß der Erfindung zum Nachweis von HIV, insbesondere HIV-1 gemäß der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung soll nun im folgenden weiter in den Beispielen beschreiben werden, ohne darauf beschränkt zu werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind alle zitierten Publikationen durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.

1 zeigt eine schematische Übersicht über das HIV-1 Genom mit den neun bekannten Genregionen. Für die drei CE-IVD zertifizierten Multitarget NAT Assays der verschiedenen Hersteller sind die jeweiligen Amplikonregionen blau hinterlegt.

Beispiele

Alle Primer und Sonden wurden anhand internationaler Sequenzdatenbanken und unter Einsatz entsprechender Software zur Primer und Sondenselektion ausgewählt. Die folgenden Sonden wurden als ZENTM-Sonden Technologie angewendet, was ein zufriedenstellendes Zusammenspiel ohne gegenseitige Inhibition oder dem Auftreten von unspezifischen Reaktionen ergab. Oligonukleotidsequenzen

Die Nomenklatur ist wie folgt: ”as” und ”s” stehen für Antisense und Sense Primer, ”pr” für Probe bzw. Sonde. ”Y” steht für C oder T und ”R” für A oder G, ”I” ist Inosin. Bevorzugt sind die modifizierten Primer und Sonden gemäß der SEQ ID Nos.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.