Title:
Pigment mit verstärkter Signalwirkung
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Pigment sowie ein Immunochromatographisches biochemisches Verfahren zum Nachweis von Analyten durch spezifische Bindung mit einem farbmarkierten Antikörper, Feststellung einer damit verbundenen Farbveränderung durch Kombination mit einem optischen Signal und Auswertung dieses Signals
Die Erfindung findet Anwendung zum Beispiel in der Medizin, oder in der Lebensmittelüberwachung, insbesondere der Lebensmittelkontrolle, in der biochemischen Analytik generell als auch in Industrie und Kosmetik.




Inventors:
Schliepe, Jürgen, Dr. (12689, Berlin, DE)
Application Number:
DE102015000391A
Publication Date:
07/14/2016
Filing Date:
01/13/2015
Assignee:
Bio TeZ Berlin-Buch GmbH, Biochemisch-Technologisches Zentrum, 13125 (DE)
International Classes:



Other References:
Janjira Panchompoo, Leigh Aldous, Richard G. Compton, New Journal of Chemistry 34, 2010, 2643–2653
Jianfeng Huang, Fei Shen, Xianhui Li, Xxuanquan Zhou, Binyao Li, Renliang Xu, chifei Wu, Journal of Colloid and Interface Science 328, 2008, 92–97
Elisângela M. Linares, Lauro T. Kubota, Jens Michaelis, Stefan Thalhammer, Journal of Immunological Methods 375, 2012, 264–270
Attorney, Agent or Firm:
Baumbach, Friedrich, Dr.rer.nat. Pat.-Ing., 13125, Berlin, DE
Claims:
1. Immunochromatographisches biochemisches Verfahren zum Nachweis von Analyten durch spezifische Bindung mit einem farbmarkierten Antikörper, Feststellung einer damit verbundenen Farbveränderung durch Kombination mit einem optischen Signal und Auswertung dieses Signals, dadurch gekennzeichnet, dass für die Signalgebung chemisch modifizierte Industrieruß-Nanopartikel eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifizierung der Industrieruß-Nanopartikel durch oxidative Vorbehandlung und nachfolgende kovalente Ankopplung anderer Farbstoffe erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die oxidative Vorbehandlung durch Behandlung mit verdünnter Schwefelsäure oder mit verdünnter Salpetersäure oder mit anderen oxidierenden Säuren oder die Erzeugung entsprechender funktioneller Gruppen durch andere Oxidationsmittel erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Ankopplung so erfolgt, dass eine Konjugation des π-Elektronensystems des Farbstoffes oder der chromatophoren Gruppen mit den Elektronen des Farbstoffs(e) erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Ankopplung über einen anderen Aromaten erfolgt.

Description:

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Pigment sowie ein allgemeines Messsystem zum Nachweis von Analyten zum Beispiel für medizinische Zwecke, oder in der Lebensmittelüberwachung, insbesondere der Lebensmittelkontrolle, in der biochemischen Analytik generell und in dekorativen und kosmetischen und industriellen Anwendungen. Mit dem veränderten Pigment kann eine intensivere Färbung erreicht werden, bzw. es ist möglich mit weniger Pigmenteinsatz eine definierte Farbintensität zu erreichen.

Hintergrund und Kontext der ErfindungDefinition und Einteilung

In der Diagnostik werden unterschiedlichste Methoden zum quantitativen oder qualitativen Nachweis spezifischer Substanzen (Analyten) eingesetzt. Eine weit verbreitete Methode sind sogenannte Schnelltests oder Teststreifen. Dabei werden die Analyten mittels chemischer Reaktionen, etwa einer Farbveränderung oder mittels spezifischer Bindung, z. B. durch Antikörper nachgewiesen. Im letztgenannten Fall ist es üblich, die Bindung oder das Vorhandensein des Analyten in einer zu bestimmenden Probe mit einem optischen Signal zu kombinieren, um es detektieren zu können. Eine häufige Anwendung ist der Schwangerschaftstest als immunchromatographischer Test.

Die zu untersuchende Probe wird auf den Probenbereich auf einem Teststreifen aus porösem Papier oder gesintertem Polymer aufgetragen. Die Probe beginnt nach Zugabe des Laufmittels mit der Ausbreitung über den Teststreifen aufgrund von Kapillarkräften (Dünnschichtchromatographie). Die Probe wandert mit der Flüssigkeit zu einem Bereich, wo sich getrocknete Immunkonjugate mit Salzen und Kohlenhydraten befinden. Die Flüssigkeit löst das Immunkonjugat, wodurch es an den Analyten in der Probe binden kann, sofern vorhanden. Die Flüssigkeit wandert weiter in den Kapillarbereich, wo in einem kleinen Feld oder auf einer Linie ein Antikörper immobilisiert wurde, der den nachzuweisenden Analyten ebenfalls bindet und in diesem Bereich akkumuliert, während die Flüssigkeit vorbei fließt. Durch die Akkumulation des nachzuweisenden Moleküls entsteht anhand des gebundenen Immunkonjugats je nach Immunkonjugat z. B. eine Färbung, eine Fluoreszenzfärbung oder eine magnetische Markierung. Meistens existiert nebenbei ein zweiter Teststreifen, der als Negativkontrolle ohne Probe verwendet wird und falsch-positive Ergebnisse ausschließt.

Im Fall des Schwangerschaftstests wird der Teststreifen mit dem Urin der Patientin benetzt, so bindet das im Urin enthaltene hCG (Hormon, dass im Fall einer Schwangerschaft stark erhöht vorkommt und der Analyt ist) (grün), an einen im Teststreifen enthaltenen Antikörper (spezifisch hCG bindendes Protein), das mit Farbstoff-markiert ist (rosa). Der Analyt-Antikörper-Farbstoff-Komplex (grün und rosa) wandert zur Testzone, in der ein zweiter hCG-Antikörper (hellgrau) fixiert ist. Dieser immobilisierte Antikörper (hellgrau) bindet den wandernden Analyt-Antikörper-Farbstoff-Komplex (grün und rosa) in dieser Zone und färbt diese an. Überschüssiger Farbstoff-markierter hCG-Antikörper (rosa) wandert weiter zur Kontrollzone, in der ein verschiedener Antikörper (dunkelgrau) fixiert ist. Dieser immobilisiert den Antikörper-Farbstoff-Komplex (dunkelgrau) an einer anderen Stelle und bindet den überschüssigen Farbstoff-markierten hCG-Antikörper (rosa) in dieser Zone und färbt diese auch an. Der letzte Prozess kann nur stattfinden, wenn ausreichend Flüssigkeit in den Teststreifen gelangt ist, um die Farbstoff-markierten hCG-Antikörper (rosa) ausreichend beweglich zu machen. Damit stellt die Kontrollzone sicher, dass das im ersten Streifen angezeigte Ergebnis korrekt ist (1).

Die Auswertung des Teststreifens kann mit dem Auge oder mittels elektronischer Geräte (sogenannter Reader) erfolgen. Als Hilfsmittel bei manueller Auswertung werden häufig Muster zum Farbvergleich verwendet, die entweder auf separaten Karten oder auch direkt auf der Verpackung des jeweiligen Produkts aufgebracht werden. Als Farbstoff wird zum Beispiel kolloidales Gold verwendet. Als kolloidales Gold bezeichnet man Sole (Kolloide) oder Gele aus winzigen Goldpartikeln mit einem Durchmesser von 2 bis 100 nm. Charakteristisch für kolloidales Gold ist die tiefrote Farbe, die durch die kleine Goldpartikelgröße zustande kommt.

Bei Goldkolloiden kann die Plasmonenschwingung beobachtet werden, also das kollektive Schwingen der Goldelektronen gegen die Goldatomrümpfe. Die Wellenlänge des dabei absorbierten Lichtes hängt von der Partikelgröße und Partikeldichte ab: je größer und dichter beieinander die Partikel sind, desto größer ist die absorbierte Wellenlänge. Dabei ist die Dichte entscheidend, da es zu induzierter Dipolwechselwirkung zwischen den Goldpartikeln kommen kann. Deswegen sind Goldkolloide wesentlich farbiger als ein kompakter Goldbarren.

Goldkolloide werden zur Rotfärbung von Gläsern verwendet, aggregierte Goldkolloide vergolden Porzellan und Gläser. In der Biochemie dient kolloidales Gold zum Markieren von Proteinen, zum Beispiel zum direkten Färben von Western Blots. Vorteil der Färbung ist ihre hohe Sensitivität und einfache Durchführung. Nachteilig ist, dass eine anschließende Immundetektion nicht mehr möglich ist und die Färbung nur unter recht harschen Bedingungen wieder entfärbt (unsichtbar gemacht) werden kann.

Außerdem können goldmarkierte Antikörper zur Elektronenmikroskopie verwendet werden. Antikörpermarkierte Bereiche der Probe fallen durch die elektronendichten Goldpartikel auf. Weiterhin werden goldmarkierte Antikörper häufig im Schnelltestbereich eingesetzt.

Zudem werden kolloidale Goldpartikel als Hochauflösungs- und Ultrahochauflösungs-Testobjekte für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM), die Feldemmissionselektronenmikroskopie (FESEM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet.

Ein weiterer häufig verwendeter Farbstoff ist Ruß (von ahd. ruos, dunkel-, schmutzfarben) ein schwarzer, pulverförmiger Feststoff, der je nach Qualität und Verwendung zu 80 bis 99,5 Prozent aus Kohlenstoff besteht. Ruß bezeichnet im Deutschen umgangssprachlich sowohl industrielle Produkte als auch unerwünschte, schädliche Nebenprodukte von Verbrennungsprozessen. Zur Unterscheidung wird für den gezielt hergestellten Industrie-Grundstoff die deutsche Bezeichnung Industrieruß oder der englische Begriff Carbon Black gebraucht. Beide Begriffe werden hier synonym verwendet. Industrieruß ist eine Modifikation des Kohlenstoffs mit sehr hoher Oberfläche und wird als Schwarzpigment verwendet.

Zwei fundamentale Eigenschaften des Industrierußes bestimmen die zwei Hauptanwendungsgebiete: Seine Verstärkungswirkung in Gummi (Natur- und Synthesekautschuk), und seine Farbe, die ihn zu dem am meisten verbreiteten Schwarzpigment machen. Darüber hinaus spielen in Spezialanwendungen seine thermische und elektrische Leitfähigkeit und seine Beständigkeit gegen UV-Strahlung eine Rolle. Je nach Anwendungsgebiet besitzt Industrieruß spezielle Eigenschaftsprofile, die durch die Art des Herstellungsverfahrens und durch Variation der Prozessparameter gezielt beeinflusst werden. Industrieruß besteht aus kleinsten, meist kugelförmigen Teilchen, die auch Primärpartikel genannt werden. Diese haben meist eine Größe von 10 bis 300 Nanometern, das ist weniger als ein tausendstel des Durchmessers eines Haars. Diese Primärpartikel sind zu kettenförmigen, teilweise klumpenartigen Aggregaten zusammengewachsen. Viele dieser Aggregate lagern sich zusammen und bilden so die Agglomerate. Durch Variation der Herstellbedingungen können sowohl die Größe der Primärteilchen als auch deren Aggregierung gezielt eingestellt werden. Bei diesen Dimensionen ist es nicht mehr nur die chemische Zusammensetzung allein, sondern auch die Größe und Form der Partikel, die die Eigenschaften bestimmen. Optische, elektrische und magnetische Eigenschaften, aber auch Härte, Zähigkeit oder Schmelzpunkt von Nanomaterialien unterscheiden sich deutlich von denen der makroskopischen Festkörper, darin lassen sich besondere Eigenschaften des Rußes begründen. Die spezifische Oberfläche von Industrieruß beträgt etwa 10–1000 m2/g. Die Begriffe Nanopartikel und Partikel werden hier synonym verwendet.

Die Herstellung von Rußen als Schwarzpigment für Tinten und Tuschen geht bis in die frühen Hochkulturen der Menschheit zurück. Die industrielle Anwendung beginnt mit der Entdeckung der Verstärkerwirkung in Naturkautschuk um das Jahr 1900, die eine wesentliche Voraussetzung für die wesentlich verbesserten Eigenschaften von Autoreifen und damit für den Aufschwung der Automobilindustrie war. Die ersten größeren Anlagen wurden als Channel-Black-Anlagen auf den Ölfeldern in den USA gebaut, um einen Teil des bei der Ölförderung auftretenden Erdgases zu verwerten. Die Ausbeuten waren gering (2%), was wegen des Überschusses an Erdgas keine Rolle spielte. Der stark steigende Bedarf der Reifenindustrie sorgte jedoch in den 20er und 30er Jahren in den USA für die Entwicklung des Furnacerußverfahrens, das eine Ausbeute je nach Produkteigenschaft von 50 bis 70% erreicht. Technisch verlief die Entwicklung der Furnaceruße in etwa vier Wellen: Eine erste Generation von Produkten unterschied sich hauptsächlich in der Größe der Primärpartikel und damit der spezifischen Oberfläche (N110, N220, ... N990), in einer zweiten Generation wurde dann auch das Aggregierungsverhalten, also der Verwachsungsgrad der Primärpartikel, die sogenannte Struktur, variiert. In den 70er und 80er Jahren begann man, z. B. über die Verweilzeit direkt anwendungstechnische Eigenschaften des Gummis zu beeinflussen. In den 90er Jahren schließlich kamen andere Füllstoffe auf den Markt, so das Kieselsäure-Silan-System in dem von Michelin patentierten Grünen Reifen, mit dem der Rollwiderstand und damit der Benzinverbrauch gesenkt wurde. Als Antwort wurden die nanostrukturierten Industrieruße als vierte Innovationsgeneration von Reifenrußen entwickelt.

In Deutschland wurde parallel zu dem amerikanischen Furnacerußverfahren das Gasrußverfahren entwickelt. Ruß wird als Schwarz-Pigment (C. I. Pigment Black 7) für Druckfarben, Tuschen, Lacke zur Einfärbung von Kunststoffen (insbesondere als UV-Schutz) genutzt. Auch in Spezialitäten wie Maskara, Graberde, Dekorpapier und Fasern dient er als Schwarzpigment. Farbruße sind nanoteilige Ruße, die durch ihre Feinheit zunehmend den braunen Grundton verlieren. Ihre Verwendung erfolgt insbesondere bei der Herstellung von schwarzen Druckfarben der unterschiedlichsten Druckverfahren. Da die gedruckten Schichten sehr dünn und teilweise transparent sind, ist eine besondere Rußqualität erforderlich. Für eine ausreichende Farbtiefe (Schwarzton) von preiswerteren Rußqualitäten, insbesondere bei Zeitungsdruckfarben, wird oft mit Blaupigmenten geschönt. Ruße für hochfarbtiefe Lacke werden durch nachträgliche Oxidation des Basisrußes hergestellt. Die oxidischen Gruppen ergeben eine bessere Kompatibilität mit den Bindemitteln und Harzen.

Eine weitere häufige Anwendung von Farbpigmenten als Signalgeber finden sich in der Diagnostik, etwa bei Bestimmung des Blutzuckergehalts oder einem Schwangerschaftstest, in der Medizin für den Nachweis von Krankheitserregern und der Pharmazie, aber z. B. auch in der Gebäude-Messtechnik und bei der Nahrungsmittelherstellung. Die Messziele sind sehr vielfältig, die Anwendung teils sehr verschieden. [5]

Stand der Technik

Industrieruß-Nanopartikel werden für die immunchromatographische Anwendung häufig oxidativ vorbehandelt [1] [2]. Auch andere chemische Modifizierungen sind bekannt [3]. Nach oxidativer Vorbehandlung sind weitere chemische Modifizierungen beschrieben [2]. Der Vergleich von Industrieruß-Nanopartikel mit anderen Nanopartikeln (Gold-Nanopartikel, silberbeschichtete Gold-Nanopartikeln, Latexblue-Nanopartikel), die für immunchromatographische Anwendungen verwendet werden, zeigt, dass Industrieruß-Nanopartikel die höchste Nachweisempfindlichkeit haben [4]. Dennoch finden Industrieruß-Nanopartikel gegenwärtig nur wenig Anwendung, da die chromatographischen Eigenschaften nicht unproblematisch sind. Insbesondere neigen Industrieruß-Nanopartikel zu schlechten Laufeigenschaften auf der Nitrozellulose, d. h. sie neigen dazu, sich zu schnell auf der Membran abzulagern.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung beruht auf der chemischen Veränderung von Industrieruß-Partikeln. Völlig überraschend stellte sich heraus, dass der Schwärzungsgrad bzw. die Farbintensität durch die Durchführung chemischer Prozesse noch weiter erhöht werden konnte. Die chemische Prozedur geht von konventionellen Industrieruß-Partikeln aus. Diese werden oxidativ vorbehandelt, z. B. durch Schwefelsäure oder Salpetersäure. In einem Beispiel wurde Salpetersäure verwendet. Dadurch entstehen an den Industrieruß-Partikeln oxidierte Gruppen. Die oxidierten Gruppen wurden verwendet, um dort andere Farbstoffe wie z. B. Fluoreszein oder chromophore Gruppen kovalent anzukuppeln, z. B. durch Knüpfen einer C=C-Doppelbindung zum Farbstoff (z. B. Fluoreszein) oder den chromophoren Gruppen oder durch Konjugation des Farbstoffes (z. B. Fluoreszein) oder der chromophoren Gruppen über einen anderen Aromaten. Das chromophore System der Industrieruß-Partikel wurde durch die zusätzlich angebrachten chromophoren Gruppen, bzw. Farbstoffe nicht nur verändert, sondern sogar erweitert und führte zu einem neuen chromophoren Spektrum, das mit dem UV-Spektrometer nachgewiesen werden konnte. Weiterhin erlangen die erfindungsgemäß modifizierten Industrieruß-Partikel verbesserte chromatographische Eigenschaften, bzw. verbesserte Laufeigenschaften auf Membranen wie Nitrozellulose. Dies zeigt sich darin, dass die Partikel, bzw. ein Konjugat mit modifizierten Industrieruß-Partikeln stetiger, ohne auf der Membran Ablagerungen zu bilden, durch Kapillarkräfte befördert werden kann.

Wesen der Erfindung

Das Wesen der Erfindung besteht in der Erweiterung des chromophoren Systems der Industrieruß Partikel durch Farbstoffe oder chromophore Gruppen infolge von Konjugation der beteiligten π-Elektronen. Die chemische Veränderung von üblichen Industrieruß-Nanopartikeln gemäß der Erfindung führt zur Verbesserung ihrer Farbintensität und ihrer Laufeigenschaften in Lösung.

Die Erfindung wird nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert.

Beispiel

Für den Schnelltest als Sandwich Immunoassay auf einem Nitrozellulose Streifen wurden folgende Materialien verwendet:

  • 1. Modifizierte Industrieruß-Nanopartikel gemäß der Erfindung
  • 2. Nachweiskonjugat (Antikörper gegen IgE markiert mit BioTeZ-Carbon-Black Partikeln) AK1-CB-Konjugat
  • 3. Biotinylierten Fänger-Antikörper, der IgE an einem anderen Epitop bindet als der AK1: Biotin-AK2
  • 4. Humanes IgE (nachzuweisender Analyt)
  • 5. PBS-Puffer mit BSA (Phosphat buffer saline mit bovine serum albumin)
  • 6. Schnelltest Membran bestehend aus einem Conjugate release Pad, einer Nitrozellulose-Membran und einem Saugpad.
  • 7. Polystreptavidin (Hersteller: BioTeZ GmbH)

Der Test wird wie folgt durchgeführt:
Es wird ein Nachweiskonjugat hergestellt, indem erfindungsgemäß modifizierter Industrieruß an den Antikörper 1 (AK1) gekuppelt wird. Das Nachweiskonjugat und der biotinylierte Fängerantikörper werden auf dem Conjugate Release Pad deponiert und dehydriert. In trockener Form sind die Substanzen inaktiv. Auf der Nitrozellulose-Membran wird eine Testlinie aus Polystreptavidin aufgespottet und eine Kontrolllinie aus humanem IgE. Beide Substanzen werden getrocknet (dehydriert).

Anschließend wird die Probe mit dem Analyten aufgegeben. Dazu wird der Analyt (humanes IgE) in PBS-Puffer mit BSA Zusatz gelöst und auf das Conjugate Release Pad gegeben. Dort inkubiert es und reagiert mit den dort dehydrierten Substanzen, die durch den Puffer wieder in Lösung gehen und aktiv werden. Die Kapillarkräfte auf der Membran sorgen dafür, dass die Probe in Richtung Saugpad transportiert werden und dabei sowohl die Testlinie mit dem aufgetragenen Polystreptavidin als auch die Kontrolllinie mit dem aufgetragenen humanen IgE passieren.

Auf der Testlinie immobilisiert das Polystreptavidin den biotinylierten AK2, der während der Inkubation den Analyten gebunden hat, an den sich wiederum der Nachweisantikörper AK1 mit den Industrieruß-Partikeln gebunden hat. Auf der Testlinie zeichnet sich ein je nach Konzentration des Analyten mehr oder weniger dunkler bis schwarzer Streifen ab. Auf der Kontrolllinie zeichnet sich ebenfalls je nach Konzentration des Nachweiskonjugates ein dunkler bis schwarzer Streifen ab. Der AK1 bindet an dem aufgetragenen IgE.

Die Signalintensität des veränderten Industrierußes ist bei gleicher Konzentration des Analyten und des Nachweisantikörpers wesentlich stärker als bei den bisher bekannten Verfahren. Ferner sind die Laufeigenschaften auf der Membran verbessert und der Industrieruß neigt nicht mehr dazu, sich an ungewünschter Stelle auf der Membran abzulagern, sondern fließt mit dem Strom zum Saugpad.

Ein Beispiel ist die Herstellung eines Konjugates mit einem Antikörper gegen humanes IgE. Dieses Konjugat ist vorteilhaft für die immunchromatographische Anwendung geeignet.

Referenzen/Literatur

  • [1] Haipeng Liu, Tao Ye, Chengde Mao, Angewandte Chemie International Edition 46 (34), 2007, 6473–6475
  • [2] Janjira Panchompoo, Leigh Aldous, Richard G. Compton, New Journal of Chemistry 34, 2010, 2643–2653
  • [3] Jianfeng Huang, Fei Shen, Xianhui Li, Xxuanquan Zhou, Binyao Li, Renliang Xu, chifei Wu, Journal of Colloid and Interface Science 328, 2008, 92–97
  • [4] Elisângela M. Linares, Lauro T. Kubota, Jens Michaelis, Stefan Thalhammer, Journal of Immunological Methods 375, 2012, 264–270
  • [5] Wikipedia (www.wikipedia.de); Streifentest; Carbon Black; Industrie Ruß

Legende zur Abbildung

1: Schema Schwangerschaftstest

Bezugszeichen

  • (A)
    Conjugate release Pad mit AK1-CB-Konjugat und Biotin-AK2)
    (B)
    Nitrozellulose Membran
    (C)
    Saugpad
    (D)
    Aufgabe der Probe mit Puffer
    (E)
    Testlinie mit Polystreptavidin
    (F)
    Kontrolllinie (humanes IgE)
    (G)
    Situation auf der Testlinie nach Durchführung des Tests
    (H)
    Situation auf der Kontrolllinie nach Durchführung des Tests